DD208372A5 - Verfahren zur herstellung eines multifunktionellen rekombinierenden dna-klonierungsvektors, zur isolierung des plasmids phi-16 - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines multifunktionellen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors, indem man wenigstens zwei der folgenden Fragmente miteinander verknuepft: 1) ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Streptomyces funktionell ist, als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthaelt, die eine Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Streptomyces transformiert sind, 2) ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Bacillus funktionell ist, als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthaelt, die eine Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Bacillus transformiert sind, 3) ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Escherichia coli funktionell ist, als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthaelt, die eine Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Escherichia coli transformiert sind, mit der Massgabe, dass keiner der Replikationsstartpunkte in Escherichia coli funktionellist, wenn der Vektor auf zwei funktionell unterschiedliche Replikationsstartpunkte beschraenkt ist.

Description

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Altenzeichen: AP C 12 N/247 550/8 X-5863

Anmelder:

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

Vertreter:

Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung eines multifunktionellen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer multifunktioneller rekombinierender Klonierungsvektoren, die einen funktioneilen Streptornyces-Replikationsstartpunkt, einen' funktionellen Bacillus-Replikations-Startpunkt, einen funktioneilen Escherichia coli-Replika-

tionsstartpunkt _%und ein oder mehr DNA-Segmente enthalten, die für eine Antibiotikaresistenz sorgen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung:

Die Entwicklung und Ausnutzung der rekombinierenden DNA-Technologie in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coli hat sich bisher zum Teil dadurch verzögert und besonders schwierig gestaltet, weil es allgemein keine selek-

tierbareh multifunktionellen Klonierungsvektoren gab.

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] Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung neuer Vektoren, die in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coli funktionell und selektierbar sind und daher einen beachtlichen technischen Fortschritt darstellen.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Vektoren sind vor allem deshalb besonders brauchbar, weil sie klein und versatil' sind und in Zellen von Streptomyces, Bacillus oder Escherichia coli transformiert und selektiert werden · können, die gegenüber einem Antibiotikum sensitiv sind, gegenüber welchem für eine Resistenz gesorgt wird. Mehr als die Hälfte der klinisch wichtigen Antibiotika werden durch Stämme von Streptomyces gebildet, so daß die Entwicklung von Klonierungssystemen und Klonierungsvektoren wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Die Vektoren sind ferner auch in Bacillus, und Escherichia coli funktionell,- so daß auch der -intergenerische Transfer und die Expression an genetischein Material erleichtert sind. Die vorliegenden Vektoren sorgen daher für eine Flexibilität bei der Selektion von Wirtszellen für die Bildung von Produkten durch rekombinierende DMA-Techniken. Dies ist von kritischer Wichtigkeit, weil eine Genexpression- vektorgeborener Gene vom zellularen genetischen Material begrenzt und beeinflußt ist, in das die Gene transformiert sind. Diese unterschiede in den Wirtszellen werden durch Schaffung von Vektoren ausgenutzt, die intergenerisch verwendet werden können. Die Vektoren lassen sich daher zur Klonierung von Genen für eine Erhöhung der Ausbeuten an bekannten Antibiotika - und auch zur Produktion neuer Antibiotika und Antibiotikaderivate in einer Vielfalt von Wirtszellen verwenden, zu denen insbesondere Streptomyces und/oder Bacillus gehören.

'

Die erfindungsgemäß herstellbaren multifunktionellen rekombinierenden DNA-Klonisrungsvektoren können nicht nur in Wirtszellen von Streptomyces, Bacillus und

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] Escherichia coli kloniert werden, sondern erlauben auch eine einfache Selektion von Transformanten. Bei einer Transformation handelt es sich um ein Ereignis mit sehr niedriger Häufigkeit, so daß ein solcher Funktionstest c eine praktische Notwendigkeit zur Bestimmung derjenigen Zellen darstellt, die von den Millionen Zellen die Plasmid-DNA aufgenommen haben. Dies ist wichtig, weil DNA-Sequenzen, die nicht selektierbar sind, in die-Vektoren inseriert werden können und weil sich - nach ]Q Transf orination in einen Wirt - Zellen, die den Vektor und die jeweils interessierende DNA-Sequenz enthalten, durch geeignete Antibiotikaselektion isolieren lassen.

Im. Zusammenhang mit der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden bestimmte Begriffe verwendet, die wie folgt definiert sind:

Rekombinierender DNA-Klonierungsvektor - jedes, sich autonom replizierende Mittel, zu dem auch Plasmide gehören, das ein DNA-Molekül enthält, an welches ein oder mehr weitere DNA-Segmente gebunden sein oder gebunden worden sein können.

Transformation - die Einführung von DNA in eine äufnehmende Wirtszelle, die den Genotyp verändert und hierdurch zu einer stabilen und vererbbaren Veränderung in der aufnehmenden Zelle führt.

Transformant - eine aufnehmende Wirtszelle, die eine Tranformation erfahren hat.

Multifunktionell - eine intergenerische Funktionalität.

Sensitive Wirtszelle - eine Wirtszelle, die in Anwesenheit eines bestimmten Antibiotikums ohne ein DNA-Segment, das ihr eine Resistenz verleiht, nicht wachsen kann.

L· H / J U U O - 4 -

j Restriktionsfragment - irgendein „lineares Teilstück oder Gesamt3tuck eines Plasmids, das durch Einwirkung eines oder mehrerer Restriktionsenzyme auf das Plasmid gebil-. det worden ist.

Insertionsisomeres - eines der zwei oder mehr möglichen' rekombinierenden DNA-Moleküle, die durch Insertion eines DNA-Fragments an eine von zwei oder mehr verträgliche Punkte an der aufnehmenden DNA gebildet werden.

. Plasmid-pLR2 1.,6 kb BamHI-Restriktionsfragment das gleiche 1,6 kb BamHI-Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, das auch im Plasmid-pIJS enthalten ist.

]5 Plasmid-pLRI 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment -

das gleiche 3,4 kb BamHI-Neomycinresistenz verleihende Fragment, das auch im ?lasmid-pIJ2 enthalten ist.

Amp - der ampicillinresistente Phenotyp 20

Tet - der tetracyclinsensitive Phenotyp

R Thio - der thiostreptcnresistsnte Phenotyp

R

Neo - der neomycinresistente Phenotyp

TJ '

Cm - der chloramphenicolresistente Phenotyp . ' R

Kn - der kanamycinresistente Phenotyp. Darlegung des Wesens der. Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines multifunktionellen

'rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors aus

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a) zwei oder mehr funktionell unterschiedlichen Replikationsstartpunkten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus irgendeinem Replikationsstartpunkt, der in Streptomyces funktionell ist, irgendeinem Replikationsstartpunkt, der in Bacillus funktionell ist, und/oder irgendeinem Replikationsstartpunkt, der in Escherichia coli funktionell ist, und

b) ein oder mehr DNA-Segmenten, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, in der der Replikationsstartpunkt aus einem solchen Vektor funktionell ist, wobei solche Wirtszellen einer Transformation, Zellteilung und Züchtung zugänglich sind,

mit der Maßgabe, daß keiner, der Replikationsstartpunktein Escherichia coli funktionell ist, wenn der Vektor auf zwei funktionell unterschiedliche -Replikationsstartpunkte beschränkt ist,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens zwei der folgenden Fragmente miteinander verknüpft 25

1. ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikationsstartpunkt,.der in Streptomyces funktionell ist, als auch ein oder mehr DNA- Segmente erhält, die eine Resistenz gegenüber

^JU wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Streptomyces transformiert sind,

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2. ein Restriktionsf raginent, das sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Bacillus funktionell, ist, als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthält, die eine Resistenz gegenüber wenigstens

r einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Bacillus tranformiert sind,

3. ein-ein Replikon enthaltendes und Antibiotika--

resistenz.verleihendes Restriktionsfragment eines IQ Escherichia coli-Plasmids.

Die Verknüpfung von (1) mit (2) führt zu einem Plasmid, das sowohl in Streptomyces als auch in Bacillus funktionell ist. Durch Verknüpfung von (3) mit dem Plasmid, das sich durch Verknüpfung von (1) mit (2) ergibt, erhält man ein Plasmid, das jeweils in Streptomyces', Bacillus und Escherichia coli funktionell ist.

Ein bevorzugtes erstes Fragment, bei dem es sich um das beispielsmäßig erläuterte etwa 4,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pELTOS handelt, wird aufgebaut durch Verknüpfung des eine Thiostreptonresistenz v.erlei-· henden etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids.pLR2 mit dem etwa 2,8 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pEL103. Das letztgenannte Fragment enthält einen Replikationsstartpunkt, der in Streptomyces funktionell ist und sich somit besonders zum Aufbau'.der vorliegenden Erfindung eignet. Ein zweites bevorzugtes Fragment ist das etwa 4,β kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-T6. Dieses Fragment des Plasmids ρΗΙ-Ί.β enthält einen in Bacillus funktioneilen Replikationspunkt und ferner auch- DNA-Segnente, die eine Antibiotikare-" sistenz in Bacillus verleihen. Durch Verknüpfung des ersten Restriktionsfragments mit dem zweiten Restriktionsfragment gelangt man zum neuen multifunktionellen Plasmid pBS2. Durch Verknüpfung des BamHI restriktierten Plasmids pBS2 mit dem BamHI restriktierten Plasmid pBR3 2 2 erhält man das neue multifunktionelle Plasmid p3.S4 9. Plasmide

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] der letztgenannten Art sind hochversatil und können jeweils in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coli angewandt werden.

c Das Plasmid pEL103, das einen Repiikationsstartpunxt; enthält, der in Streptomyces funktionell ist, hat eine Moleküllänge von etwa 20,0 kb (Kilobasen) und enthält mehrere Restriktionsstellen, die sich für eine Molekülklonierung besonders eignen. Der Replikationsstartpunkt des Plasmids pEL10 3 ist innerhalb des etwa 2,8 kb BamHI-Restriktionsfragments lokalisiert worden, so daß sich durch Verdauung dieses Plasmids mit Restriktionsenzymen, die außerhalb des etwa 2,8 kb BamHI-Bereichs schneiden können, eine Reihe von Fragmenten mit unterschiedlichen

]5 Replikationsstartpunkten herstellen läßt. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan und Funktionsplan für das Plasmid pEL103 geht aus Figur 1 der Zeichnung hervor. Diese Figur 1 stellt genauso wie die sich daran anschliessenden Figuren keine maßstabsgerechte Zeichnung dar,

Das Plasmid pEL103 läßt sich in herkömmlicher Weis-e aus Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pEL103 isolieren, nämlich einem Stamm, der beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois hinterlegt und Teil der 25' dortigen ständigen Kulturensammlung ist. Er kann von.dort als bevorzugte Quelle und Stammvorrat für das Plasmid unter der Nummer NRRL 12549 frei bezogen werden.

Es lassen sich zwar Fragmente des Plasmids pEL103 mit einer Reihe unterschiedlicher Replikationsstartpunkte aufbauen, wobei zum Zwecke des Aufbaus der vorliegenden Erfindung das etwa 2,8 kb BamHI-Restriktionsfragment jedoch am meisten bevorzugt ist. Das etwa 2.8 kb Fragment ist an ein oder-mehr, eine Antibiotikaresistenz verleihende DNA-Fragmente gebunden, und Beispiele hierfür sind das die Thiostreptonresistsnz verleihende etwa 1,6 kb 3amHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 und das die Meomycinresistenz verleihende etwa 3,4 kb BamHI-Restrik-

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tionsfragment des Plasmids pLRi.

Das Plasmid pLR2, nämlich der Startpunkt für die das Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, hat eine c Moleküllänge von etwa 18,7 kb und wird aufgebaut durch Verknüpfung des mit HindiII behandelten Plasmids pIJ6 (Nature 286, 525 (1980)) mit dem mit HindiII behandelten Plasmid pBR322. Das Plasmid pLR1, nämlich der Startpunkt für das die Neomycinresistenz verleihende Fragment, hat

IQ eine Moleküllänge von etwa 14,8 kb und v/ird in ähnlicher Weise mit der Ausnahme aufgebaut, daß hierzu anstelle des Plasmids pIJ6 das Plasmid pIJ2 (Nature 286, 525 (1980)) verwendet wird. Beide Plasmide pLR2 und pLRi sind in Escherichia coli funktionell und lassen sich daher für eine anschließende Manipulation ohne weiteres amplifizieren und isolieren- Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für die Plasmide pLR1 und pLR2 gehen aus den Figuren 2 und 3 der Zeichnung hervor.

Durch Verknüpfung des die Thiostreptonresistenz verleihenden etwa 1,6 kb BamHI-Fragments und des die Neomycinresistenz verleihenden etwa 3,4 kb 3amHI-Fragments mit dem etwa 2,8 kb ReplikationsStartpunkt, der das BamHI-Fragment des Plasmids pELiO3 enthält, gelangt man zu Plasmiden, die sich als- Ausgangsmaterialien zum Aufbau der vorliegenden Erfindung verwenden 'lassen. Die als Ausgangsmaterialien· .benötigten Plasmide verfügen je nach der Orientierung des die jeweilige Resistenz verleihenden DNA-Fragments über zwei Orientierungen. Durch Verknüpfung des- etwa 1,6 kb BamHI-Fragments des Plasmids pLR2 mit dem etwa 2,8 kb BamHI-Fragment des Plasmids P.EL1.0 3. gelangt man zu den als Ausgangsmaterialien brauchbaren Plasmiden pEL107 und pELiQ5, während man durch entsprechende Verknüpfung des etwa 3,4 kb BamHI-Fragments des Plasmids pLRI die als Ausgangsmaterialien brauchbaren Plasmide pEL109 und pELTIO erhält, und durch Verknüpfung mit beiden Fragmenten zu den als Ausgangsmaterialien geeigneten'Plasmiden pEL1'13, pEL114, pEL115 und pELi16

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— Q —

j gelangt. Durch teilweise Verdauung der oben als Ausgangsmaterialien genannten Plasmide mit BamHT lassen sich Restriktionsfragmente erzeugen, die zum Aufbau der vorliegenden Vektoren brauchbar sind, wie dies im folgenden

5 beschrieben wird.

Das Plasmid pHI-16 enthält sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Bacillus funktionell ist, als auch DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Chloramphenicol und Kanamycin verleihen. Das Plasmid pHI-16 ist daher ein hervorragendes Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäßen Zwecke Das Plasmid pHI-16 weist ein Moleküllänge von etwa 4,6 kb auf, ergibt sich durch eine in vivo Auslöschung des bekannten chimeren Plasmids pBD12 (J. Bacteriology 141 (1) 246 (1980)) und kann in herkömmlicher Weise aus Bacillus subtilis MI112/pHI-16 isoliert werden, nämlich einem aufgebauten Stamm, der beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensaxnmlung ist. Er kann von dort als bevorzugte Quelle und Grundvorrat für dieses Plasmid unter der Nummer NRRL B12597 frei bezogen werden. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan und Funktionsplan des Plasmids pHI-16 geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Der Einfachheit halber sind darin nur drei MboII- und Taxjl-Restriktionsstellen für das Plasmid pHI-16 und die pHI-16-'.· Fragmente angegeben.

Als Ausgangsmaterialien lassen sich ferner auch verschiedene Derivate des Plasmids pHI-16 verwenden. Durch Auslöschung des etwa 0,7 kb Hpall-Restriktionsframents des Plasmids pHI-16 gelangt man beispielsweise zum neuen Plasmid pHT-18. Das Plasmid pHI-18 hat eine Moleküllänge von etwa 3,9 kb und enthält sowohl ein eine Chloramphenicolresistenz verleihendes DNA-Segment als auch einen Replikationsstartpunkt, der in Bacillus funktionell ist. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funktionsplan für das

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] Plasmid pHI-18 geht aus Figur 5 der Zeichnung hervor. Der Einfachheit halber sind darin lediglich drei MboII- und Tagl-Restriktionsstellen für Plasmid pHI-18 und die pHI-18-Fragmente angegeben.

Durch Verdauung der Plasmide pHI-16 und pHI-18 mit BamHI gelangt man zu den Fragmenten mit Moleküllängen von etwa 4,6 kb und etwa 3,9 kb, die in Bezug auf Bacillus jeweils sowohl einen Replikationsstartpunkt als

]Q auch eine DNA enthalten, die eine Antibiotikaresistenz verleiht. Erfindungsgemäße multifunktionelle Klonierungsvektoren lassen sich daher ohne weiteres aufbauen, indem man das etwa .3,9 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-18 oder das etwa 4,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-16 mit dem oben erwähnten etwa 4,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pEL105 verknüpft. Die dabei erhaltenen' multifunktionellen Plasmide werden hierin als Plasmide pBS1 und pBS2 bezeichnet. Durch Verknüpfung des etwa 4,6 kb BamHI-Restriktionsfragments des Plasmids pHI-16 mit dem etwa 6,2 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pEL110 gelangt man zum neuen multifunktionellen Plasmid .pBS5..'-"' In ähnlicher Weise erhält man durch Verknüpfung des BamHI-Fragment s des. Plasmids ρ.ΗΙ-ίδ mit dem etwa 7,8 kb

25' BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pEL113 das multifunktionelle Plasmid pBS7. Detaillierte Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für die Plasmide pBSI, pBS2, pBS5 und pBS.7 gehen jeweils aus den Figuren

6, 7,13 und 14 der Zeichnung, hervor.' 30

Die vorliegenden Vektoren, wie beispielsweise die Plasmide pBS1 , pBS2, pBS5 und pBS7 lassen sich mit einem ein funktionelles Replikon enthaltenden und eine Antibiotikaresistenz verleihenden Restriktionsfragment eines . Plasmids von Escherichia coli verknüpft, wie beispielsweise an die Plasmide. pBR322 ,. pBR324 (Gene 4, 121 (1978))/ DBR325 (Gene 4, 121 (1978)), PBR328 (Gene 9, 287 (1980)) oder ähnliche Plasmide, wodurch man zu neuen multifunk-

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tionellen Plasmiden gelangt, die in Escherichia coli,

Streptomyces und Bacillus verwendet werden können. Diese Aufbauten, die durch die Plasinide p3S9 und pBS10 beispielsmäßig erläutert werden, sind besonders vorteilhaft, r da sich eine Amplifizierung und Manipulierung rascher

und einfacher in Escherichia coli als entweder in Strep-. tomyces oder in Bacillus bewerkstelligen läßt. Nach erfolgter Durchführung der gewünschten rekombinierenden DNA-Verfahren im Wirtssystem aus Escherichia coli kann man in . die jeweilige DNA entfernen, erforderlichenfalls wieder zur Plasmidform aufbauen und dann in eine Wirtszelle von Streptomyces oder Bacillus transformieren.

Der in Streptomyces funktioneile Replikationsstartpunkt, der durch die vorliegenden multifunktionellen pBS-Plasmide beispielsmäßig erläutert ist, ist zwar im etwa 2,8 kb BamHI-Fragment des Plasmids pEL103 vorhanden, doch können auch analoge pEL103-Fragmente verwendet werden, sofern sie den Replikationsstartpunkt enthalten. Zu solchen analogen Restriktionsfragmenten des Plasmids- pEL103.

gehören unter anderem die Fragmente von Psti, Sphl, BhIII, CIaI, XhoI und andere BamHI-Fragmente. Ferner ist ein : eine besondere Antibiotikaresistenz verleihendes DNA-Segment nicht auf eine einzelne Stelle eines Restriktionsfragments eines Plasmids pEL103 beschränkt, sondern sie kann an verschiedene Stellen gebunden oder inseriert werden, sofern der Replikationsstartpunkt oder andere kritische plasmidgesteuerts physiologische Funktionen nicht gestört werden. Man kann daher eine Reihe verschie-.dener Restriktionsfragmente des Plasmids pEL103 und von Derivaten hiervon anstelle der beispielsmäßig erläuterten Fragmente verwenden. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres bestimmen, welche Stellen für eine Verknüpfung oder Insertion eines bestimmten DNA-Segments geeignet

sind. .

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Die etwa 4,6 und 3,9 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-16 und pHI-18 sind zum Aufbau der vorliegenden multifunktionellen Plasmide zwar bevorzugt, doch lassen sich genausogut auch noch eine Reihe anderer Replikationsstartpunkte enthaltende und Antibiotikaresistenz verleihende Fragmente der Plasmide pHI-16 und pHI-18 verwenden. Zu analogen Einzelschnittrestriktionsfragmenten der Plasmide pHI-16 und pHI-18.gehören beispielsweise die Fragmente BgIlI, Xbal, EcoRI, PvuII und Aval des Plasmids pHI-16 und die Fragmente Xbal, EcoRI, PvuII und Aval des Plasmids pHI-18. Ferner sind, die Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Segmente, die in den Fragmenten der Plasmide pHI-16 und pHI-18 enthalten sind, nicht auf eine einzige Stelle beschränkt. Die Segmente lassen sich daher an verschiedenen.Stellen positionieren, inserieren und verknüpfen, sofern der Replikationsstartpunkt oder sonstige kritische plasmidgesteuerte physiologische Funktionen nicht gestört werden. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres diejenigen Stellen ermitteln, die für eine. Verknüpfung oder Insertion eines bestimmten DNA-Fragments geeignet sind. Infolgedessen., läßt sich eine große Anzahl an Restriktionsfragmenten aufbauen, die sowohl eine Antibiotikaresistenz exprirnieren als auch einen Replikationsstartpunkt enthalten, der in Bacillus funktionell ist. Solche Fragmente können anstelle der

beispielsmäßig erläuterten Fragmente zum Aufbau weiterer ; multifunktioneller Vektoren verwendet werden, die ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.

on Die eine Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Segmente können auch mit anderen in Bacillus funktioneilen Plasmiden verknüpft werden, wie beispielsweise dem Plasmid pBD15 und den in der NIH Publikation Nr, . 82 bis 99 (1981) Recombinant DNA Technical Bulletin 4 (4 ) ,143 beschriebenen Plasmiden pPL 1 0 , pPL7065, pIM1 3 , pPLS76, pBC16, pAM77, pC194, pC221,- pC223/ pE194, pSA2100, pSA0501, TP.2, pUB110, püB1.12, pBD6 , pBD8 , pBD9, pBD10, P3D11, pBD12, pBD20,.pBD35, p3D64, pOG1196, pHV12, pHV14,

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pHV3.3, pOG2165 und pGrTI. Die hierdurch erhaltenen

Plasmide verleihen eine Antibiotikaresistenz und enthalten einen in Bacillus funktioneilen Replikationsstartpunkt, so daß sie anstelle der Plasmide pHI-16 und

c pHI-18 für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht auf die beispielsmäßig erläuterten multifunktionellen Vektoren beschränkt, zu deren Aufbau die Plasmide pHI-16 oder pHI-18 benötigt werden.

Die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Thiostrepton, Neomycin, Kanamycin und Chloramphenicol verleihenden DNA-Segmente sind zwar vorliegend beispielsmäßig lediglich erläutert durch das etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des plasmids pLR2, das etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRi, das etwa 4,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-16 und das etwa 3,9 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-18, doch kann der Fachmann daraus durch einzelnen Ersatz oder geeignete Kombination auch andere DNA-Segmente aufbauen, die gegenüber den oben erwähnten Antibiotika ebenfalls eine Resistenz verleihen. Zu anderen eine Thiostreptonresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pLR2 gehören beispielsweise das etwa 13 kb PstI-Restriktionsfragment und ferner auch das Bell-Subfragment des etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragments.Zu anderen eine Neomycinresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pLR1 gehören beispielsweise das etwa 3,5 kb PstI-Restriktionsfragment und ferner auch das größere der Sstl-Kpnl-Subfragmente des etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragments. Zu anderen eine Kanamycinresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pHI-16 gehören beispielsweise das etwa 0,74 kb HpalI-Fragment und ferner auch das größere der Xbal-PvuII-, Aval-EcoRI-, EcoRI-PvuII- und BamHI-ScoRI-Fragmente. Zu anderen eine Chloramphenicolresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pKI-18 gehören beispielsweise das etwa 0,84 kb

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HpaII-Fragment und ferner auch das größere der EcoRI-EcoRI-PvuII-, -BämHI-EcoRI- und Xbal-PvulI-Fragmente.

Für die erfindungsgemäßen Zwecke können auch weitere DNA-Segmente verwendet werden, die eine Resistenz gegenüber den obigen oder anderen Antibiotika verleihen, wie beispielsweise gegenüber Hygromycin, Bacteriocin, Viamycin, Streptomycin, TyIosin oder Erythromycin. Ferner lassen sich auch verschiedene funktioneile Derivate der oben beschriebenen und eine Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Segmente aufbauen, indem man Nucleotide ihrem genetischen Code entsprechend addiert, eliminiert oder substituiert. Der Fachmann weiß nämlich, daß die Verknüpfung solcher oder irgendwelcher anderer eine Antibiotikaresistenz verleihender DNA-Segmente mit Restriktionsfragmenten, die Replikationsstartpunkte von Streptomyces oder Bacillus enthalten, zu multifunktloneIlen Vektoren führen, die innerhalb des Scnutz-

umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. 20

Die oben beschriebenen, Replikationsstartpunkte enthaltenden Restriktionsfragmente und ferner auch die eine Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Fragmente können in einfacher Weise so modifiziert werden, daß sich die

^Z-J anschließende Verknüpfung leichter durchführen läßt.

Eine Addition von Molekülverknüpfern .führt beispielsweise zum Aufbau spezieller Restriktionsstellen, die sich für eine Verknüpfung .oder"sonstige bekannte Zwecke verwenden

lassen. Die verschiedenen Restr'iktionsfragmente können 30

ferner auch durch Addition-, Eliminierung oder Ersatz

von Nucleotiden so modifiziert werden, daß es hierdurch zu einer Veränderung ihrer Eigenschaften und Bildung einer Vielfalt an einzigartigen oder zusätzlichen Restriktionsstellen kommt. Der mit der Nucleotidchemie

·

und dem genetischen Code vertraute Fachmann weiß, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar sind und durch welche Abwandlungen von DNA sich jeweils ein bestimmter Zweck erreichen läßt. ,

4 7 5 5 0

Die erfindungsgemäßen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren sind nicht auf eine Anwendung in einer einzelnen Spezies oder einem einzelnen Stamm von Strepomyces oder Bacillus beschränkt. Die Vektoren lassen sich vielmehr ganz breit anwenden und können in Wirtszellen mancher Gattungen von Bacillus und Streptomyces transformiert werden, und insbesondere in den restriktionslosen Stämmen hiervon. Von Streptomyces gibt es im übrigen eine Reihe technisch wichtiger Stämme ,die Antibiotika bilden, wie Amincgly-

kosidantibiotika, Makrolidantibiotika ,ß-Lactamantibiotika, Polyetherantibiotika und Glykopeptidantibiotika. Aus den Gattungen Streptomyces und Bacillus lassen sich unter Anwendung herkömmlicher Verfahren und Heranziehung bekannter Methoden (Microbiological Reviews 44, 206 (1980))

ohne weiteres restriktionslose Stämme selektieren und isolieren. Wirtszellen restriktionsloser Stämme enthalten keine Restriktionsenzyme, so daß sie Plasmid-DNA nach Tranformation daher nicht schneiden oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine

^ Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren schneiden, werden daher vorliegend ebenfalls als restriktionslos angesehen.

Zu bevorzugten Wirtszallen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Aminoglykosidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. kanarnyceticus (Kanamycine) , S. chresto-

myceticus (Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. microsporeus (Antibiotikum SF-767). , S. ribosidificus (Antibiotikum SF733), S. flavopersicus (Spectinomyein), S. spectabilis (Actinospectacin),S. rimosus forma paromomycinus (Paromomycine, Catenuliri), S. fradiae var. italicus (Aminosidin), S. bluensis var. bluensis Blu ensomycin) , S. catenulae (Catenuiin) ,S. olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin A), S. tenebrarius (Tobramycin, Apramycin), S. lavendulae

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] (Neomycin)/ S. albogriseolus (Neomycine), S. albus var. metamycinus (Metamycin), S. hygroscopicus var. sagamiensis (Spectinomyein), S. bikiniensis (Streptomycin), S. griseus (Streptomycin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (Streptomycin), S. poolensis (Streptomycin), S. galbus (Streptomycin), S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomycin), S.. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var. limoneus (VaIidamycine), S. rimofaciens (Destomycine), S. hygroscopicus forma glebosus

]Q (Glebomycin). S. fradiae (Hybrimycine, Neomycine), S-eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), S. aquacanus (N-Methylhygromycin B), S. crystallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S, hygroscopicus (Hygromycine), S. atrofaciens (Hygromycin), S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis " (Kasugamycine) / S.

netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Lividomycine), S. hofuensis (Seldomycin-Komplex) und S. canus (Ribosylparomamin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Makrolidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauch-. bar sind und transformiert werden können, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. caelestis (Antibiotikum M188), S, platensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin) , S. fungicidicus (Antibiotikum NA-181)., S.

griseofaciens (Antibiotikum PA133A, 3), S· roseocitreus: (Älbocyclin) , S. bruneogriseus (Albocyclin) , S.. roseochromogenes (Albocyclin), S.. cinerochromogenes (Cinero- mycin B), S. albus (Albomycetin), S. felleus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Lankacidin, Borrelidin), S,

^ violaceoniger (Lankacidin), S. griseus (Borrelidin), S. maizeus (Ingramycin), S. albus var. coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (Acetylleukomycin, Espinomycin), S. hygroscopicus {Turimycin, Relomycin,

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^Λ" h /^KII U

Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), S. griseospiralis (Relomycin), S. lavendulae (Aldgamycin), S. rimosus (Neutramycin), S. deltae (Deltamycine), S. fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomycine), S- furdicidicus (Mydecamycin), S. ambofaciens (Foromacidin D), S. eurocidicus (Methymycin), S. griseolus (Griseomycin) , S. flavochromogenes (Amaromycin, Shincomycine) , S. fimbriatus (Amaromycin), S. fasciculus (Amaromycin), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleandomycins, S. olivochromogenes (Oleandomycin), S. spinichromogenes var. suragaoensis (Kujimycine), S. kitasatoensis (Leucomycin), S. narbonensis var. josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), S. albogriseolus (Mikonomycin), S. bikiniensis (Chalcomycin), S. cirratus (Cirramycin), S-I^ djakartensis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae (Tylosin, Lactenocin, Macrocin), S. goshikiensis (Bandamycin), S. griseoflavus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin), S. tendae (Carbomycin), S- macro-

sporeus (Carbomycin), S. thermotolerans (Carbomycin) und on

S. albireticuli (Carbomycin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die ß-Lactamantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauch-

,bar sind und transformiert werden können, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S- lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), S. clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), S. lactamdurans (Cephamycin C), S. griseus (Cephamycin A, B), S. hygros-

copicus (Desacetoxycephalosporin C), S. wadayamensis (wS-3442-D), S. chartreusis (SF 1623), S. heteromorphus und S- panayensis (C2081X), S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viridochromogenes (CephalomycineA, B), S. cattleya (Thienamycin) und S. olivaceus, S. flavovirens, S- flavus, S. fuivoviridis, S. argenteolus sowie 3. sioyaensis (Mi-I 4550 und MM 13902)

4755

Ί Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Polyetherantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören c restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), S. hygroscopicus (A218, Emericid, DE3936 , Α120Α, A 28695A und B,.Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. conglobatus (Ionomycin), S. eurocidicus

-ιη . var. asterocidicus (Laidlomycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosidificus . (Lonomycin), S. cacaoi var. asoensis (Lysocellin)., S. cinnamonensis (Monensin) , S. aureofaciens (Narasin), S.-gallinarius (RP 30504), S-longwoodensis (Lysocellin), S. flaveolus (CP38936), S.

mutabilis (S-11743a) und S. violaceoniger (Nigericin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktiosloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Glykopeptidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. orientalis und S. haranomachiensis ^: (Vancomycin), S- candidus (A-35512, Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374).

25 .

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme anderer Streptomyces, in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. coelicolory S .granuloruber, S. roseosporus, S. lividans, S. espinosus und S. azureus.

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Bacillus, in denen die vorliegenden Vektoren besonders - brauchbar sind'und transformiert werden können, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: B-. subtilis",. B.subtilis MI112, B. thuringiensis, B. thuringiensis var. israeliensis, 3-cereus,

4755

ι B. anthracis, B. piliformis, B. tropicus, B. alvei, B.

megaterium, B. pumilus, B. licheniformis, B. polymyxa, B- macerans, B. circulans, B. stearothermophilus, B.

coagulans, B. firmus, B. brevis, B. sphaericus, B. _ς pasteurii, B. fastidiosus, B. larvae, B. lentimorbus,

B. apiarus, B. amyloliquifaciens, B. laterosporus und

B. popillae.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Wirtszellen von IQ Streptomyces und Bacillus"sind die vorliegenden Vektoren auch brauchbar und in Zellen restriktionsloser Stämme anderer Gattungen transformierbar, wie beispielsweise folgender Organismen: Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Streptococcus, damit verwandter Actinomyceten J5 unter Einschluß von Streptosporangium, Actinoplanes,

,,Nocardia und Micromonospora, sowie Lactobacillus. Weiter können die multifunktionellen Vektoren, die ein Escherichia coli-Replikon enthalten, auch in Escherichia coli transformiert werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher breit anwendbar und geeignet, und sie können in Wirtszellen einer Vielfalt von Organismen transformiert werden.

Im allgemeinen sind alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung brauchbar. Einige der vorliegenden rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren und Tranformanten sind jedoch stärker bevorzugt als andere. Bevorzugte Vektoren sind daher die Plasmide pBS1, pBS2, pBS5, pBS7 und p3S9, und zu bevorzugten Transformanten gehören demnach Streptomyces ambofaciens/pBSI, S. ambofaciens/pBS2, S. ambofaciens/pBS5, S. ambofaciens/pBS7, S. ambofaciens/ pBS9, Bacillus subtilis MI112/pBSl, B. subtilis/MHI2/pBS2, 3. subtilis/MI112/pBS5, 3. subtilis/MH12/pBS7, B. subtilis/MI112/pBS9 und E. coli K1 2 HB101/pBS9. 35

Die erfindungsgemäßen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten verfügen über eine breite' Brauchbarkeit und tragen zur Auffüllung des Bedarfs an

D {J Q - 20 -

geeigneten multifunktionellen Klonierungsträgern bei, die in Streptomyces, Bacillus, Escherichia coli und damit verwandten Organismen verwendet werden können. Die-Fähigkeit der vorliegenden Vektoren, eine Resistenz gegenüber Antibiotika zu verleihen, die für nichttransformierte Wirtszellen toxisch sind, sorgt ferner für ein funktionelles Werkzeug zur Selektierung von Transformanten. Dies ist wichtig, weil in der Praxis die Notwendigkeit zur Bestimmung und Selektierung der jeweiligen Zellen besteht, die Vektor-DNA aufgenommen haben. Zusätzliche DNA-Segmente, für deren Gegenwart es keine funktionellen Tests gibt, können in die vorliegenden Vektoren ebenfalls inseriert werden, wobei sich dann durch geeignete antibiotische Selektion Transformanten isolieren lassen, die die nichtselektierbare DNA enthalten. Solche 'nichtselektierbare DNA-Segmente können an jeder Stelle mit Ausnahme der Bereiche inseriert werden, die für die Funktion und Implikation des Plasmids erforderlich sind, und hierzu gehören unter anderem Gene, bei denen es sich um Aritibiotikamodifikationsenzyme und Regulationsgene jeglicher Art handelt.

Ein nichtselektierbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, kann vor allem in ein Plasrnid, beispielsweise das Plasmid

nc _

^ZJ pBS9 , an der zentralen S al χ-Re strikt ions st eile des resistenzverleihenden etwa 1,6 kb BamHI-Fragments inseriert werden. Eine solche Insertion führt.zu einer Inaktivierung des Gens für die Thiostreptonresistenz und ermöglicht so eine leichte Identifizierung der Strepo-

myces-Transformanten, die das rekombinierende Plasmid enthalten. Hierzu führt man zuerst eine Selektion bezüglich Neomycinresistenz durch und identifiziert dann diejenigen neomycinresistenten Streptomyces-Transf orraan-'ten, die gegenüber Thiostrepton,nicht resistent sind. In ähnlicher weise führt eine Insertion eines jeweils interessierenden DNA-Segments.an beispielsweise der inneren BamHI-Restriktionsstelle des resistenzverleihenden' etwa 3,4 kb BamHI-Fragments zu einer Inaktivierung des Gens

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für die Neomycinresistenz. Streptomyces-Transformanten, die dieses rekombinierende Plasmid enthalten, lassen sich daher ebenfalls leicht identifizieren, indem man zuerst eine Selektion bezüglich Tniostreptonresistenz durchführt und dann diejenigen thiostreptonresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Neomycin nicht resistent sind. Die Selektierbarkeit bezüglich Antibiotikaresistenz in Streptomyces erlaubt daher eine wirkungsvolle Isolierung der äußerst seltenen Zellen, die die jeweils interessierende nichtselektierbare DNA enthalten.

Ein nichtselektierbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, kann zusätzlich auch in ein Plasmid, beispielsweise das Plasmid pBS9, an der BgIII-Restriktionsstelle des die Kanamycinresistenz übertragenden Fragments inseriert werden. Eine solche Insertion führt zu einer Inaktivierung des Gens für die Kanamycinresistenz und ermöglicht so .eine leichte Identifizierung der Bacillus-Tranformanten, die das rekombinierende Plasmid enthalten. Hierzu führt man zuerst eine Selektion bezüglich Chloramphenicolresistenz durch und identifiziert dann diejenigen chloramphenicolresistentsn Bacillus-Tranformanten, die gegenüber Kanamycin nicht resistent sind. In ähnlicher Weise führt eine Insertion eines jeweils interessierenden

ad DNA-Segments an beispielsweise der inneren MboII-Restriktionsstelle des chloramphenicolresistenzverleihendenFragments zu einer Inaktivierung des Gens für die Chloranrphenicolresistenz . 3acillus-Tranformanten, die dieses rekombinierende Plasmid enthalten, lassen sich

daher ebenfalls leicht identifizieren, indem man zuerst eine Selektion bezüglich Kanamycinresistenz durchführt und dann diejenigen kanamycinresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Chloramphenicolnicht resistent sind. Die Selektierbarkeit geaenüber Antibiotikaresistenz in - " ^:

Bacillus erlaubt daher eine wirkungsvolle Isolierung der äußerst seltenen Zellen, die die jeweils interessierende nichtselektierbare DNA enthalten.Ähnliche Selektionen lassen sich auch in Escherichia coli durchführen.

47

] Der oben beschriebene funktioneile Test bezüglich Antibiotikaresistenz wird ferner auch zur Lokalisierung von DNA-Segmenten verwendet, die die Kopienanzahl erhöhen oder als Steuerelemente wirken und eine Expression eines einzelnen Gens für eine Antibiotikaresistenz lenken. Solche Segmente,.zu denen unter anderem auch Promotoren, Abschwächer, Repressoren, Induktoren, ribosomale .Bindestellen und der gleichen gehören, werden zur

Steuerung der Expression anderer Gene in Zellen von ]0 Streptomyces, Bacillus, Escherichia coil und damit verwandten Organismen verwendet.

Die erfindungsgemäßen Vektoren, die eine Resistenz gegenüber Thiostrepton, Neomycin, Kanamycin und Chloramphenicol verleihen, eignen sich auch zur Sicherstellung dafür, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszellen über eine Reihe von Generationen stabil gehalten werden. Diese Gene oder DNA-Fragmente, die an das eine Resistenz gegenüber Thiostrepton, Neomycin, Kanamycin oder Chloramphenicol übertragende Fragment kovalent gebunden sind und in Streptomyces, 'Bacillus, Escherichia coli. oder in den Zellen verwandter Organismen propagiert werden, werden aufrechterhalten, indem man die Tranformaten solchen Konzentrationen an Thiostrepton, Neomycin, Kanamycin oder Chloramphenicol aussetzt., die für die nichttransformierten Zellen toxisch sinä.Transformanten, die den Vektor und infolgedessen eine kovalent gebundene DNA-verlieren, können daher nicht wachsen und werden aus der Kultur eliminiert. Durch die erfindungsgemäSen Vektoren läßt

^ sich daher irgendeine jeweils interessierende DNA-Sequenz stabilisieren und aufrecherhalten, und zwar insbesondere in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coli.

Die erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren und Tranforman- ° ten sorgen für die Klonierung von Ge'nen zur Verbesserung der Ausbeuten verschiedener Produkte, die derzeit in Streptomyces und damit verwandten Zellen gebildet werden.

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Zu Beispielen für solche Produkte gehören unter anderem Streptomycin, Tylosin, Cephalosporins, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin, Tobramycin, Erythromycin und dergleichen. Die Erfindung sorgt ferner für selektierbare Vektoren, die geeignet sind für eine Klonierung, Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen, welche für kommerziell wichtige Proteine codieren, wie beispielsweise für Humaninsulin, Humanproinsulin, Glucagon, Interferon, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon und dergleichen, für enzymatisch^ Funktionen in metabolischen Reaktionen, die zu technisch wichtigen Verfahren und Verbindungen führen, oder als Steuerelemente zur Verbesserung einer Genexpression. Zu diesen gewünschten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme, welche eine Synthese von Antibiotikaderivaten, wie Streptomycin, Cephalosporin, Tylosin, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin, Tobramycin und Erythromycinderivaten, katalysiert, oder für Enzyme codiert, die eine Bioproduktion von Antibiotika oder sonstigen Produkten vermittelt und verbessert. Die Fähigkeit zur Insertion, und Stabilisierung solcher DNA-Segmente ermöglicht daher eine Erhöhung der Ausbeute und Verfügbarkeit an Antibiotika.

Die vorliegenden multifunktionellen Klonierungsvektoren ermöglichen ferner die Bildung von Produkten durch Genexpression in Streptomyces, die bisher, durch Bioproduktion in Escherichia coli und Bacillus gebildet werden. Dies ist besonders vorteilhaft, weil man die großtech-

^ou nische Fermentation in Streptomyces bis heute besser im Griff hat als eine Fermentation entweder in Bacillus oder in Escherichia coli. Eine großtechnische Fermentation von Escherichia coli ist nämlich immer noch mit einem hohen experimentellen Aufwand verbunden und gelegentlich auch schwierig. Die vorliegende Erfindung umgeht dieses Problem nun durch Schaffung der Alternative einer Bildung von Verbindungen in Streptomyces, die bisher nur durch Biosynthese in Escherichia coli hergestellt

24 7 5

werden, wie beispielsweise Hurnaninsulin, Humanproinsulin, Glucagon, Interferon, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon und dergleichen. Dies läßt sich erreichen, weil die vorliegenden Vektoren hochversatil sind und eine oder beide DNA-Sequenzen akkomodieren können, die die oben erwähnten Produkte oder Sequenzen exprimieren, welche das gesamte Produkt enthalten, das Escherichia coli-Plasmide bildet. Die vorliegende Erfindung sorgt daher für eine Flexibilität in der Auswahl von Wirten und schafft ein Werkzeug zur Bioproduktion von Polypeptiden und sonstigen Produkten in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coli. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres ermitteln, welcher Wirt sowohl zur Bildung eines bestimmten Produkts als auch für eine vorgegebene Fermentation am günstigsten ist.

Stre ptomyces granuloruber - Nr. A3 9 91 2 ., 1 3/pEL1 0 3 und Bacillus subtilis/MII12/pHI-16 lassen sich jeweils als Quell'en für die Plasmide pELiO3 und.pHI-16- in einer Anzahl von Wegen unter Verwendung irgendeines von mehreren verschiedenen-, Medien züchten. Zu Kohlenhydratquellen, die in einem Kulturmedium bevorzugt sind, gehören beispielsweise Melasse, Glucose, Dextrin oder Glycerin, während zu Stickstoffquellen beispielsweise Sojamehl, ' Aminosäuregemische und Peptone gehören. Anorganische Nährsalze sind ebenfalls vorhanden, und hierzu gehören die üblichen Salze, die für Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium,.Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat und ähnlichem sorgen. Genauso wie dies für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, werden auch im vorliegenden Fall essentielle Spurenelemente zugesetzt. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich in Form von Verunreinigungen zugeführt, die in den zugesetzten anderen Bestandteilen des Mediums

zufällig vorhanden sind.

24755

] Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pEL103 wächst unter aeroben Züchtungsbedingungen über einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen, die von etwa 15 bis 4O⁰C reichen. Zur Bildung c des Plasmids pEL103 in höchster Kopienzahl geht man

zweckmäßigerweise jedoch von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 7,2 aus und hält die Züchtungstemperatur auf etwa 30⁰C- Durch Züchtung von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pEL103 unter den oben erwähnten ]Q Bedingungen gelangt man zu einem Zellvorrat, aus welchem sich das Plasmid pEL103 ohne weiteres unter Anwendung herkömmlicher Techniken isolieren läßt.

Bacillus subtilis Mlll2/pHI-l6 wächst unter aeroben Züchtungsbedingungen über einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich von etwa 5,0 bis 8,5 bei Temperaturen, die von etwa 25°C bis 45°C reichen. Zur Bildung des Plasmids pHI-16 in höchster Kopienzahl geht man zweckmäßigerweise jedoch von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 7 aus und hält die Züchtungstemperatur bei etwa 37^QC. Durch Züchtung von Bacillus subtilis Mlll2/pHI-l6 unter den oben erwähnten Bedingungen gelangt man zu- einem Zellvorrat, aus welchem sich das Plasmid pHI-16 ohne weiteres unter Anwendung herkömmlicher Techniken isolieren 1'ä.S.t.

Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen weiter erläutert. Erforderlichenfalls werden darin sowohl Erläuterungen als auch tatsächliche Verfahren zum Aufbau der Erfindung beschrieben.

24 7

*J %J U - 25 -

Beispiel 1

Isolierung des Plasmids pELlQ3

A, Züchtung von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELl03

Man stellt in herkömmlicher Weise ein vegetatives Inokulum von Streptomvces. granuloruber.Mr. A39912.13/pELlO3 (NRRL 12549) her, indem man den Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilisierter Trypticase-So j a-brühe* in einer Konzentration von 35 g/l in deionisiertem Wasser wachsen läßt.

Das Inokulum aus Trypticase-Sojabrühe wird 48 Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C bebrütet. Nach Inkubation überträgt man etwa 10 ml des' Inokulums in 500;ml der sterilisierten Brühe und inkubiert etwa 20 Stunden bei 30⁰C. Der pH-Wert wird nicht* eingestellt. Nach dieser Inkubation sind die' Zellen von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELlO3 fertig zur Ernte und nachfolgenden Isolierung der Plasmid-DNA.

* Die' Trypticase-Sojabrühe ist erhältlich von BBL Divi-_: , sion, Becton-Dickinson & Company, Cockeysville, Maryland 2103 0 V.St.A.

B. Isolierung des Plasmids

Etwa .12 g (Naßgewicht) an Zellen von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELl0 3 werden zentrifugiert (10 Minuten, 4°C, 10 000 U/Mir.ute) , in 10 %-igem Glycerin gewaschen und dann durch Zentrifugieren unter den oben er- wähnten Bedingungen geerntet. Die Zellen.werden zuerst mit etwa 50 ml TES-Puffer (Q,01' Mol Tris(hydroxymethyl)-aminoethan (Tris), 0,001 Hol EDTA, 34 % Saccharose, pH 8) und dann mit etwa 0,25 g Lysozym in 10 ml 0,25molarer EDTA versetzt. Das Gemisch wird etwa 15 Minuten bei 37⁰C in-

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kubiert und dann mit etwa 0,5 ml 10 %-igem Triton X-100 in TE-Puffer (0,01 Mol Tris, 0,001 Mol EDTA, pH 8) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird hierauf etwa 15.Minuten bei 65°C inkubiert. Die nach Zentrifugieren (45 Minuten, 4°C, 18 000 U/Minute) des Lysats erhaltene überstehende Flüssigkeit wird viermal mit Isoamylalkohol und einmal mit einer Lösung aus Chloroform und Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Die wäßrige Schicht wird mit 0,1 Volumina an 3 molarem Natriumacetat und dann mit 3 Volumina an kaltem (-2O⁰C) 95 %-igem Ethanol versetzt. Die Ausfällung mit Ethanol wird rasch in einem Bad aus Trockeneis und Ethanol durchgeführt, und der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugieren (15 Minuten, 4⁰C, 10 000 U/Minute) gesammelt. Der Niederschlag wird vakuumgetrocknet und dann in 1,1 ml STE-Puffer (0,01 Mol Tris, 0,001 Mol EDTA, 0,01 Mol Natriumchlorid) resuspendiert. Zur Reinigung wird die Plasmid-DNA hierauf unter Anwendung von Cäsiumchloridgradienten mit Ethidiumbromid zentrifugiert (40 Stunden, 15°C, 35 000 U/Minute). Nach der Zentrifugation wird die gewünschte Plasmid-pELlO3-DNA-Bande entfernt und das Ethidiumbromid in herkömmlicher Weise extrahiert. Nach Ausfällung der DNA in 3 Volumina Ethanol wird die so isolierte Plasmid-pELlO3-DNA in 1 ml 10-fach verdünntem TE-Puffer gelöst und dann bei -20⁰C aufbewahrt.

Beispiel2

Aufbau des Plasmids oLR2

A. . Hindi11-Verdauung des Plasmids pIJ6 .

Man inkubiert etwa 20 μΐ (20 μα) Plasmid pIJ6 DMA (Nature 286, 525 (1980)), 5 ul BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ HindiII-Restriktionsenzym* (das 3 New England Bio Labs-Einheiten enthält) und 5 μΐ Reaktionsmischung ** 2 Stunden bei 37 °.C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 ul 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhal-

·"* υ O- - 28 -

tene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und bei -2O⁰C aufbewahrt.

* Die Restriktionsenzyme sind' von folgenden Firmen erhältlich: · New England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, ^; Indianapolis, Indiana 46250, V.St.A.

** Die Reaktionsmischung für das Hindlll- Restriktionsenzym

wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: . 6 00 mMol NaCl,

100 mMol Tris-HCl, pH 7,9 70 mMol MgCl₉ 10 mMol Dithiothreit

B. · HindllI-Verdauung des Plasmids p3R322 .

Man inkubiert etwa 8 μΐ (4^g) an Plasmid pBR322 DNA*, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA' (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37⁰C. Nach weiterem 10 Minuten langem Inkubiefen bei 6O⁰C wird die Reaktion durch Zugabe von etwa 50 μΐ Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum, getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert-.

* Das Plasmid pBR3 2 2 kann von Boehringer-Mannheim Biochemicals unter der in Beispiel 2 A. angegebenen Adresse erhalten werden.

C. Verknüpfung der mit Hindlll verdauten Plasmide

pIJ6 und pBR322 .

Man inkubiert etwa 20 ul mit Hindlll behandeltes Plasmid

247550

pIJ6 (von Beispiel 2 A.), 20 μΐ mit HindiII behandeltes Plasmid pBR322 (von Beispiel 2 B.), 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 1 μΐ T4 DNA-Ligase* und 5 μΐ Verknüpfungsmischung** 4 Stunden bei 16⁰C. Sodann wird die Reaktion durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 7 0 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die suspendierte DNA bildet das gewünschte Plasmid pLR2. .

* Die T4 DNA Ligase ist von folgender Firma erhältlich: New England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Rd., Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

** Die Verknüpfungsmischung wird mit folgender Zusammen-Setzung hergestellt:

500 mMol Tris-HCl, pH 7,8 200 mMol Dithiotreit 100 mMol MgCl₂

10 mMol ATP 20

B e i s ρ ie I 3

Aufbau von Escherichia coli K12 HBlQl/pLR2.

Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von Escherichia coli K12 HBlOl (Gene 2, 75 bis 93 (1977)) werden durch Zentrifugation pelletisiert und dann in etwa 10 ml 0,01 molarem Natriumchlorid suspendiert. Hierauf werden die Zellen erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03 molarem Calciumchlorid resuspendiert, 20 Minuten auf Eis i.nkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich abermals in 1,25 ml 0,03 molarem Calciumchlorid suspendiert. Die erhaltene ZeI1 suspension ist für eine anschließende Transformation leistungsfähig.

Das Plasmid pLR2 in-TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2 C.) wird in Ethanol ausgefällt, in 150 μΐ 30 millimolarer Calciumchloridlösung suspendiert und in einem

75

' Testrohrchen mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia coli K12 HBlOl leicht vermischt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42°C inkubiert. Hierauf gibt man etwa 3 ml L-Brühe (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) zu, die 50 μg/ ml Ampicillin enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37°C inkubiert°und dann auf L-Agar (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) aufgezogen, der Ampicillin enthält. Die überlebenden Kolonien werden se-

lektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht und sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 HBl01/pLR2-Transformanten dar.

Beispiel 4

Aufbau des Plasmids pLRl

Das- Plasmid pLRl wird praktisch wie in Beispiel 2 A. bisc. beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme', daß. man anstelle des' Plasmids pIJ6 hier das Plasmid pIJ2 (Nature 286, 525 (1980 )); verwendet. Das gewünschte Plasmid pLRl wird in TE-Puffer suspendiert.

25· Beispiel 5

Aufbau von Escherichia coli K12 HBlOl/pLRl

Der gewünschte Aufbau wird praktisch wie in Beispiel 3 ^O beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle des Plasmids pLR2 hier zur Transformation das

. Plasmid pLRl verwendet. Die überlebenden Kolonien werden

R selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp ,

S Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Escherichia coli Kl2 HBlOl/pLRl-Transformanten dar.

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ö " ³¹ ~

Beispiel 6

Aufbau der Plasmide pELl07 und pELlOS

A. BamHI-Verdauung des Plasmids pLR2 und Isolierung des die Thiostreptonresistenz verleihenden ~1₇6 kb-Fragments

Etwa 5 0 μg Plasmid pLR2 DMA, 10 μΐ Reaktionsmischung*, 10 μΐ 3SA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser und 1 μ'1 (4 Einheiten/ μΐ) BamHI-Restriktionsenzym inkubiert man 2 Stunden bei 37°C. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von 2,5 Volumina 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden '5 bei -2O⁰C gekühlt. Der DNA-Miederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt "und dann in etwa 50 μΐ TE—Puffer suspendiert. Das gewünschte —1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment wird in herkömmlicher Weise aus der DNA-Suspension durch Gelelektrophorese isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment in etwa 20 μΐ TE-Puffer zur anschließenden Verknüpfung resuspendiert.

* Die Reaktionsmischung für das 3amHI-Restrictionsenzym wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 mMol NaCl

60 mMol Tris-HCl, pH 7,9 6 0 mMol MgCl₇

B. BamHI-Teilverdauung des- Plasmids pEL103 30

Etwa 20 μg Plasmid pELlO3 DNA, 10 μι Reaktionsmischung, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ BamHI-Restriktionsenzym (hergestellt durch Verdünnung von 2 μΐ Enzym in 8 μι Wasser) werden etwa Γ5 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von 2 Volumina 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden bei -2O⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird

/ D ü U Ό -.32 -

] durch Zentrifugation gesammelt, in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer susoendiert.

C. Verknüpfung

Ein Gemisch aus etwa 20 μg der teilverdauten Plasmid pELlO3-DNA, 10 μg des -^1, 6 kb BamHI-Restriktionsfragments des Plasmids pLR2, 5 μΐ. Verknüpfungsmischung, 5 μΐ

]0 BSA 'Cl mg/ml), 10 μΐ Wasser und 1 μΐ T4 DNA-Ligase inkubiert man etwa 4 Stunden bei etwa 16⁰C. Nach Zugabe von 40 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ kaltem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zen-

]5 trifugation gesammelt, mit 70- %-igem Ethanol gewaschen, erneut gesammelt und dann in 50 μΐ Medium P (J. Molecular and General Genetics 162, 307 (1978)) zur anschließenden Transformation suspendiert.

Abhängig davon, welchesder möglichen pELl03-Restriktionsfragmente an das die Thiostreptonresistenz verleihende --' 1,6 kb BamHI-Fragment geknüpft "wird , ergeben sich verschiedenartige rekombinierende Plasmide. Durch Verknüpfung mit dem ^2,8 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 erhält man die gewünschten ^4,4 kb Plasmide pEL10 7 und pELlOS. Es ergeben sich rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das resistenzver lei-' hende ^1,5 kb BamHI-Fragment jeweils in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellanplane und Funktionspiäne für jedes der Plasmide p£LlO7' und pEL105 gehen, aus Fig. 8 der Zeichnung hervor.

Die BamHI-Teilverdauung des Plasmids pELl03 ergibt selbstverständlich ein Gemisch verschiedener Restriktionsfragmente, die miteinander oder auch mit ein oder mehr resistenzverleihenden DNA-Fragmenten verknüpft sein können, wodurch mehrere weitere rekombinierende Plasmide gebildet werden. Jedes dieser weiteren Plasmide, das das

^2,8 kb BamHI-Fragment für den Replikationsstartpunkt enthält, kann zur weiteren beispielsmäßigen Erläuterung des Aufbaus der Erfindung verwendet werden. Die erwähnten weiteren Piasmide lassen sich in üblicher Weise in geeignete Wirtszellen transformieren und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese identifizieren.

Beispiel 7

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pELlO7 und Streptomyces ambofaciens pELlOS

unter Verwendung von etwa 2 0 μg der DNA von Beispiel 6 C.

9 und 1 χ 10 Protoplasten (hergestellt nach J. of General Microbiology 107, 93 (1978)) von Streptomyces ambofaciens, nämlich einem beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois hinterlegten und Teil der" dortigen ständigen KuItürenSammlung bildenden Stamm, der von dort unter der Nr. NRRL 2420 frei bezogen werden kann, werden die gewünschten Aufbauten im wesentlichen nach Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/0116 9 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB79/00095) . durchgeführt. Die gewünschten Transformanten werden hinsichtlich einer Thiostreptonresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit einem mit R2-Medium (J. of General Microbiology 107, 93 (1978)) modifizierten Ober agar überschichtet", der so viel Tniostrepton enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 50 ,ug/ml ergibt. Die dabei erhaltenen thiostreptonresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/ pELlO7 und Streptomyces ambofaciens/pELl0 5 werden in bekannter Weise isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophore.se hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut sind, identifiziert.

Dementsprechend werden vegetative Inokula (10 ml) verschiedener isolierter Kolonien in herkömmlicher Weise

24755 0

hergestellt/ indem man Trypticase-Sojabrühe inokuliert, die so viel Thiostrepton enthält, daß sich eine Endkonzentration von 50 pg/ml ergibt. Zur Herstellung mehrerer Inokula führt man das folgende Verfahren so lange durch, bis alle gewünschten Transformanten und aufbauenden Plasmide isoliert sind. Nachdem die bei 30⁰C inkubierten Zellen vollständig ausgewachsen sind, zentrifugiert man 6 ml der zellhaltigen Brühe. Das entstandene Pellet wird in TE-Puffer gewaschen, erneut pelletisiert und dann in 400 μΐ 50 mmolarem Tris von pH 8,0 suspendiert. Sodann gibt man etwa 80 μΐ 0,25 molare EDTA, 20 μΐ RNase und 100 μΐ (10 mg/ml in TE-Puffer) Lysozym zu. Nach etwa 15 Minuten langer Inkubation des Gemisches bei 37°C gibt man etwa 10 μΐ 10 %-iges Triton X-100 und 150 μΐ 5 molares NaCl. zu und inkubiert das Ganze abschließend 15 Minuten bei 60⁰C. Das erhaltene Lysat wird zentrifugiert (15 Minuten, 4⁰C, 15 000 U/Minute) und die angefallene überstehende Flüssigkeit dann in üblicher Weise zweimal mit Phenol und dann einmal einer Lösung aus Chloroform und Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert und anschließend mit Ethanol gefällt. Die Identität der jeweiligen Plasir-ide und somit der Transformanten wird in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyseund Gelelektrophorese ermittelt.

Beispiel' 8 Aufbau der Plasmide pELlQ9 und pELllO

A. BamHI-Teilverdauung des Plasitiids pLRl und Isolierung des die Neomycinresistenz verleihenden ~> 3 ,4 kb Fragments

Die gewünschte Teilverdauung und Isolierung führt man' . praktisch wie in Beispiel 6 B. beschrieben durch. Das dabei erhaltene ~3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment wird in etwa 20 μΐ TE-Puffer zur anschließenden Verknüpfung suspendiert.

4755

U - 35 B. Verknüpfung

Das die Neomycinresistenz verleihende ·~ 3 ,4 kb BamHI-Restriktionsfragment wird mit durch EamHI teilverdautem Plasmid pELlO3 {hergestellt gemäß Beispiel 6 B.) praktisch unter Anwendung des in Beispiel 6 C. beschriebenen Verfahrens verknüpft.

Abhängig davon, welchesder möglichen pELl03-Restriktionsfragmente an das die Neomycinresistenz verleihende --^3,4 kb BamHI-Fragment geknüpft wird , ergeben sich verschiedenartige rekombinierende Plasmide. Durch Verknüpfung mit dem ^2,8 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pEL103 erhält man das gewünschte ~ 6,2 kb Plasmid pELiO9 und pELllO. Es ergeben sich rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das resistenzverleihende ~3,4 kb BamHI-Fragment jeweils in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pELl09 und pELllO gehen aus Fig. 9 der Zeichnung hervor.

Unter Anwendung des obigen Verfahrens lassen sich wie in Beispiel 6 C. beschrieben selbstverständlich weitere rekombinierende Plasmide herstellen, die das ~2,8 kb BamHI-Fragment für den Replikationsstartpunkt enthalten. Diese Plasmide können zur weiteren beispielsmäßigen Erläuterung des Aufbaus der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die oben erwähnten weiteren Plasmide- können in herkömmlicher Weise transformiert und dann durch Restriktionsenzyrrr analyse und Gelelektrophorese identifiziert werden.

Beispiel 9

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pELlO.9 und Streptomy-' ces ambofaciens/pELl10

Unter Verwendung von etwa 20 ug der DNA von Beispiel 8 und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens

' (NRRL 2420) führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 2 .der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB79/ 00095) durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich einer Neoinycinresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit einem mit R2-Medium modifizierten Oberagar überschichtet, der so viel Neomycin* enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 1 pg/nil ergibt

10

Die erhaltenen neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pELlO9 und Streptomyces ambofaciens/ pELllO werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut· sind, identifiziert. Die Identität der einzelnen Plasmide und somit der Transformanten wird praktisch gemäß Beispiel 7 ermittelt, wobei man die Trypticase-Sojabrühe anstelle von Thiostrepton hierzu jedoch mit Neomyein (L μ g/ml) versetzt-.

* Das Antibiotikum Neomycin ist von Sigma, St. Louis, Missouri erhältlich.

Beispiel 10

Aufbau der Plasmide pELll3 und pELll4

Das Plasmid pSLlO7' wird aus Streptomyces ambofaciens/

° pEL.1.0 7 (hergestellt gemäß Beispiel 7) unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens isoliert und dann praktisch nach dem- in Beispiel 6 3. beschriebenen Verfahren einer Teilverdauung mit BamHI-Restriktionsenzym unterzogen. Anschließend wird das erhaltene BamHI-Teilverdauungsprodukt praktisch nach dem in Beispiel 6 C. beschriebenen Verfahren mit dem eine Neoinycinresistenz verleihenden .—3,4 kb BamHI-Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 8- A.) des Plasmids pLRl verknüpft, wodurch man

4755

zu den gewünschten Plasmiden gelangt. Hierbei werden ferner auch die Insertionsisomeren der Plasmide pEL113 und pEL114 gebildet, da das Plasmid pELlO7 über mehr als eine BamHI-Restriktionsstelle für die Insertion des Fragments für die Neomycinresistenz verfügt. Es entstehen rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, weil das die Neomycinresistenz verleihende ~3,4 kb BamHI-Fragment in je eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pELll3 und pEL114 gehen aus Fig. 10 der Zeichnung hervor.

Beispiel 11

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pEL113 und Streptomyces ambofaciens/pELl14

Unter Verwendung von etwa 2 0 μg der DNA von Beispiel 10 und von 1 χ 10 Protoplasteh von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung Mr. PCT/G379/ 000 95) durch. Die gewünschten Transformanten werden zuerst hinsichtlich der Thiostreptonresistenz und dann bezüglich ' der Neomycinresistenz nach den in den obigen Beispielen 7 und 9 beschriebenen Verfahren selektiert. Die dabei erhaltenen thiostreptonresistenten und neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pELl13 und Streptomyces ambofaciens/pELl14 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut- sind. Die Identität dieser Plasmide und somit der Transformanten wird praktisch nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Ver-

^ fahren ermittelt, wobei man die Trypticase-Sojabrühe hierzu jedoch sowohl mit 'Neomycin (1 ug/ml) als auch mit Thiostrepton (50 μg/ml) versetzt.

^l j P) «· » j,

!Beispiel 12

Aufbau der Plasmide pELll5 und pELll6

Die gewünschten Plasmide werden praktisch wie in Beispiel 10 beschrieben aufgebaut, wobei man anstelle des Plasmids pELlO7 bei der BamHI-Teilverdauung hier jedoch das Plasmid pELlO5 verwendet. Hierbei werden die Insertionsisomeren der Plasmide pELllS und pEL116 ebenfalls gebildet, weil das Plasmid pELlOS über mehr als eine BamHI-Restriktionsstelle für die Insertion des Fragments für die Neomycinresistenz verfügt. Es entstehen rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, weil das die Neomycinresistenz verleihende und ~ 3,4 kb BamHI-Fragment in jeweils eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pELllS und pELllö gehen aus Fig. 11 der Zeichnung hervor.

B e i s ρ 1 e 1 13

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pELl15 und Streptornyces ambof aciens/pELl 16 ' '

25' Unter Verwendung von 20 μg der DNA von Beispiel 12 führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 11. beschrieben durch. Die erhaltenen thiostreptonresistenten und' neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pELl15 und Streptomyces ambofaciens/pELllö werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gel-elektrophorese praktisch wie in Beispiel 11 beschrieben hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind,

24755 0

U - 39 Beispiel 14

Aufbau der Plasmide pSLl21 und pEL122

Die gewünschten Plasmide werden hergestellt durch Verknüpfung eines BamHI-Teilverdauungsprodukts des Plasmids pELlO7 mit einem mit BamHI verdauten Plasmid pBR322 praktisch unter Anwendung des in Beispiel 6 C. beschriebenen Verknüpfungsverfahrens. Das Plasmid pEL107 wird aus Streptomyces ambofaciens/pELlO7 (hergestellt gemäß Beispiel 7) praktisch nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert und dann unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 6 3. einer Teilverdauung mit BamHI unterzogen. Das mit BamHI verdaute Plasmid pBR322 wird

praktisch wie in Beispiel 2 B- beschrieben hergestellt, wobei statt Hindlll hier jedoch BamHI-Restriktionsenzym, verwendet wird. Die gewünschte Plasmid-DNA wird durch Zentrifugation gesammelt, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann in 50 μΐ ΤΞ-Puffer suspendiert. Zusätzlich werden dabei auch die Insertionsiso—"' meren der Plasmide pELl21 und pELl22 gebildet, weil das Plasmid pELlO7 über mehr als eine BamHI-Restriktionsstel-Ie für die Insertion des restriktierten Plasmids pBR322 verfügt. Es entstehen rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das restriktierte Plasmid pBR3 22 in jeweils eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pELl21 und pEL122 gehen aus Fig. 12 der Zeichnung hervor.

Beispiel 15

Aufbau von Escherichia coii Kl2 HBl01/pELl21 und Esche-

richia coIi Kl2 HBlOl/pELl2 2

. ;

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pLR2 hier zur Transformation jedoch die Plasmide

•J "J U Q - 4 0. -

' pELl21 und pELl22 verwendet. Die überlebenden Kolonien werden zuerst selektiert, bezüglich des erwarteten Pheno-

R S typs (Amp , Tet ) untersucht und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut . sind, als die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 HBl01/pEL121 und Escherichia coli K12 HBlOl/ pELl22 identifiziert.

Beispiel 16

Isolierung des Plasmids pHI-16

A. Züchtung von Bacillus subtilis MI112/pHI-16 15

Eine vegetative Kultur von Bacillus subtilis MI112/pHI-16 (NRRL B-12597) wird in - herkömmlicher Weise durch Beschichtung von PAB-Agar hergestellt (dieser Agar enthält PAB* (Penassay-Brühe) in einer Menge von-15 g/l und Chloramphenicol in einer Menge von 10 μ9/πι1) . Nach etwa 18 Stunden langer Inkubation der inokulierten Platte bei 3 7°C selektiert man eine einzelne Kolonie und inokuliert damit 500 ml steriles PAB-Medium, das, lQ^g/ml Chloramphenicol enthält. Die erhaltene inokulierte Brühe wird etwa 18 Stunden bei 37°C inkubiert, worauf die entstandenen Zellen von Bacillus subtilis MIl12/pHI-16 fertig sind zur Ernte und anschließenden Isolierung der. Plasmid-DNA. ·

^uu * Die PAB ist von Dir co Laboratories, Detroit, Michigan ' V.St.A.- erhältlich.

B. , Isolierung des Plasmids

*" Etwa 10 g (Naßgewicht) Zellen von Bacillus subtilis , MIl'12/ρΗΙ-Ιβ werden zuerst durch Zentrifugation (10 Minuten, 4 ⁰C,. 10. 000 U/Minute) geerntet, dann in etwa 50 ml

24/5

] TES-Puffer gewaschen und schließlich erneut durch Zentrifugation gesammelt. Das erhaltene Pellet wird zuerst mit' etwa 20 ml TE-Puffer mit 25 % Saccharose und dann mit etwa 10 mg Lysozym in 250 μΐ Wasser versetzt. Das Gemisch "wird etwa 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert und darauf mit etwa 100 Einheiten RNase versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert und nach Einstellung auf einen Gehalt von 1 % und 1 Mol an SDS (Natriumdode- . cylsulfat) und Natriumchlorid etwa 3 Stunden in einem Eisbad gekühlt. Die nach Zentrifugieren (30 Minuten, 4°C, 19 000 U/Minute) des Lysats erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch Zugabe von TE-Puffer auf ein Volumen von 31,8 ml gebracht, worauf man 28,7 g Cäsiumchlorid und 0,4 ml (10 mg/ml) Ethidiumbromid zusetzt. Durch Zentrifu-

"15 gation bei 49500 U/Minute über eine Zeitdauer von 16 Stunden wird für einen Cäsiumchloridgradienten gesorgt. Die Plasmidbande wird gesammelt und 16 Stunden bei 55 000 U/ Minute zentrifugiert, worauf man sie erneut sammelt, dreimal mit gleichen Volumina an Isoamylalkohol extrahiert, gegen verdünnten TE-Puffer dialysiert, mit Ethanol ausfällt und in 400 μΐ TE-Puffer resuspendiert. Die erhaltene Plasmid-pHI-16-DNA wird bis zur weiteren Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.

Das Gen für die Kanamycinresistenz ist im ~0-,74 kb' Hpall-Fragment des Plasmids pHI-16 enthalten. Durch Behandlung mit HpaII-Restriktionsenzym und anschließende Verknüpfung gelangt man daher zu einem -^ 3 , 9 kb Plasmid, das hierin als pHI-18 bezeichnet wird und das kein Gen für eine Kanamycinresistenz enthält. Ein detailliertes Verfahren zum Aufbau des Plasmids pKI-18 wird im folgenden beschrieben.

WWW %J _ 42 -

' Beispiel 17

Aufbau des Plasmids pHI-lS A. HpalI-Teilverdauung des Plasmids pHI-16

Etwa 5 μΐ (2,5 μ9) 'Plasmid pHI-16 DNA, 1 μΐ (2 mg/ml) BSA, 37 μΐ Wasser, 2 μΐ HpalI-Restriktionsenzym (das zwei New England Bio Labs-Einheiten enthält) und'.5 μΐ

10 Reaktionsmischung*inkubiert man 1 Stunde bei 37°C. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erhitzen auf 65⁰C beendet und die DNA dann durch Zugabe von 2 Volumina 95 %-igem "Ethanol ausgefällt. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 5 μΐ TE-Puffer suspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4°G aufbewahrt.

* Die Reaktionsmischung für das HpaTI-Restriktionsenzym wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

6 0 mMol KCl '

100 mMol Tris-HCl, pH 7,4

100 mMol MgCl₂ .

10 mMol Dithiothreit

B. Verknüpfung von Plasmid pHI-16 HpalJ-Verdäuungsprodukt '

• Etwa 5 μ1~Plasmid pHl-16 HpalI-Verdauungsprodukt (hergestellt nach Beispiel 17 A.), 2 μΐ T.4 DNA-Ligase und

on "

° 43 μΐ Ligationsmischung* inkubiert man etwa 18 Stunden' bei etwa 16⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 5 μΐ 3 molarem Natriumacetat und 150 μΐ 95 %-igem Ethanolbeendet. Der gewünschte DNA-Niederschlag wird in 70.%-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in

10.· μΐ TE-Puffer suspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4 ⁰C aufbewahrt-,

* Die Ligationsmischung wird mit folgender Zusammenset-

4 7 5 5

' zung hergestellt:

6 6 mMol Tris-HCl, pH 7,3 10 ituMoI Dithiothreit 6,6 mMol MgCl-4 mMol ATP

Beispiel 18

Aufbau von Bacillus subtilis MI112/p.HI-18 10

Bacillus subtilis MI112 läßt sich erhalten durch übliche Züchtung von Bacillus subtilis MI112/pHI-16 (NRRL B-12597) in Anwesenheit von Chloramphenicol. Unter den erwähnten Züchtungsbedingungen verlieren die Zellen von Bacillus subtilis MJll2/pHT-16 spontan das Plasmid pHI-16, so daß der gewünschte chloramphenicolsensitive Stamm von Bacillus subtilis MI112 gebildet wird. Die Sensitivität gegenüber Chloramphenicol läßt sich selbstverständlich zur Untersuchung und Sicherstellung verwenden, daß lediglieh die Zellen von Bacillus subtilis MIl12, denen das Plasmid fehlt, selektiert und bei den hierin beschriebenen Bacillus-Transformationsverfahren verwendet werden.

Man inokuliert etwa 50 ml sterile PAB mit Bacillus subti-1 is ^MIl12 und inkubiert dann so lange bei 37⁰C, bis eine

g Zelldichte von 2 χ 10 Zellen pro ml erreicht ist. Die Zellen werden dann unter sterilen Bedingungen in Protoplasten überführt, indem man sie pelletisiert und die Zellen anschließend in etwa 5 ml SMMP (gleiche Volumina aus jeweils 4x PA3 und einer Lösung, die 1,0 Mol Saccharose, 0,04 Mol Maleinsäure und 0,04 Mol MgCl₂ enthält und mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt ist) resuspendiert. Sodann gibt man unter Anwendung einer Filtersterilisation etwa 250 al Lysozym zu (20 mg/ml in SMM,

⁰^ nämlich 0,5 Mol Saccharose, 0,02 Mol Maleinsäure und 0,02 Mol MgCl-, mit einem mit NaOH auf 6,5-. eingestellten pH-Wert). Die Zellen werden hierauf etwa 2 Stunden unter leichtem Schütteln bei 37⁰C inkubiert. Die erhaltenen

«J V ö - 44 -

Protoplasten werden pelletisiert, mit 5 ml SMMP gewaschen und dann in 5 ml SMMP- resuspendiert. Nach erfolgter Zentrifugation (25⁰C, 12 Minuten, 2600 U/Minute) transformiert man etwa 0,1 ml der Protoplasten durch Zugabe 5 von etwa.20 μΐ eines 1 : 1 Gemisches aus Plasmid pHI-18 DNA (hergestellt nach Beispiel 17) und 2x SMM. Anschließend gibt man sofort etwa 1,5 ml PEG-Lösung (40' g PEG 6000 (Polyethylenglykol), 50 ml 2x SMM und Wasser bis auf 100 ml) zu und versetzt das Ganze nach etwa 2 Minuten auch noch.mit 5 ml SMMP. Hierauf pelletisiert man die Protoplasten, suspendiert sie in 1 ml SMMP und inkubiert das Ganze etwa 2 Stunden bei 3O⁰C unter leichtem Schütteln. Teilmengen der so hergestellten Suspension werden auf ein Chloramphenicol enthaltendes DM3-Regenerationsmedium aufgezogen, das pro.Liter folgende Zusammensetzung hat:

91 g-D-Mannit in 555 ml deionisiertem Wasser, das 12 g Agar enthält,

10 % Casaminosäuren, 5 0 ml, 10 % Hefeextrakt, 50 ml 20 % Glucose, 25 ml,

5 %^:Dikaliumphosphat, 100 ml, 1 Mol MgCl₃₇ 20 ml

10 % Gelatine, 200 ml,

10 mg Chloramphenicol,,

D-Mannit, Casaminosäuren und Hefeextrakt werden zusammen autoklaviert. Unmittelbar nach der Autoklavierung wird die Gelatine zugesetzt, und die restlichen Bestandteile werden nach Abkühlen des Gemisches zugegeben. Das Medium hat eine Endkonzentration an Chloramphenicol von 10

Die erhaltenen chloramphenicolresistenten Kolonien werden hinsichtlich einer Kanamycinsensitivität untersucht, Eine chloramphenicolresistente und kanamycinsensitive Kolonie wird als der Gewünschte Stamm Bacillus subtilis

475

MI112/pHI-18 selektiert. Der Stamm wird gezüchtet und zur weiteren Bestätigung seiner Identität einer herkömmlichen Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich des Plasmids, aus dem er aufgebaut ist, unterzogen.

Beispiel 19

Aufbau der Plasmide pBSl und pBS3 10

A. BamHI-Teilverdauung des Plasmids pELlOS

Etwa 10 μΐ (5 μg) Plasmid pELlOS (in herkömmlicher Weise isoliert aus Streptomyces ambofaciens/pELlOS (hergestellt gemäß Beispiel 7) praktisch unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens), 2 μΐ BSA (1 mg/ ml), 29 μΐ wasser, 1 μΐ BamHI-Restriktionsenzym (mit Wasser 1 : 4 verdünnt) und 5 μΐ Reaktionsmischung* werden 15 Minuten bei 25⁰C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und. 300 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der nach etwa 2-stündigeirr Kühlen auf -2O⁰C erhaltene DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in 7 0 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 10 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das Plasmid pELlO5 hat zwei BamHI-Restriktionsstellen, so daß sich ein Gemisch aus verschiedenen Fragmenten ergibt.

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym ^ou wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 mMor NaCl, 6 0 mMol Tris-HCl, pH 7,9 6 0 mMol MgCl^

3^ B. BamHI-Verdauung des Plasmids pHI-18

Etwa 5 μΐ (5 ag) Plasmid pHI-18, 2 μΐ BSA (1 mg/ml), 9 μΐ Wasser, 1 ul BamHI-Restriktionsenzym (4 Einheiten/μΐ) und

2475

1,5 μ 1 Reaktionsmischung werden etv/a 2 Stunden.bei 37⁰C inkubiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von 2,5 Volumina 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, in 70 %-igem Ethanol gewaschen und dann in etwa 10 μΐ TE-Puffer suspendiert.

C. Verknüpfung

Etwa 5 μΐ von mit BamHI verdautem Plasmid pHI-18 (hergestellt gemäß Beispiel 18 B.), 8 μΐ BamHI-Teilverdauungsprodukt des Plasmids pELlO5 (hergestellt gemäß Beispiel 18 A.), 27 μΐ Wasser, 5 μΐ (4 itiMol ) ATP, 5 μΐ Ligationsmischung und 2 μΐ T4 DNA Ligase inkubiert man etwa 18 Stunden bei 16⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Nach etwa 2-stündiger Inkubation bei -20⁰C wird der gewünschte Miederschlag an Plasmid pBSl und pBS3 DNA durch Zentrifugation gesammelt, in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 10 μΐ TE-Puffer suspendiert und bis" zum weiteren Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.

Das Plasmid pEL105 hat -zwei BamHI-Restriktionsste11en, se daß eine BamHI-Teilverdauung zu zwei ^4,4 kb BamHI-Fragmenten führt. Beim obigen Verfahren werden daher auch die Insertionsisomeren der Plasmide pBSl und pBS3 gebildet. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da die mit BamHI restriktierte DNA jeweils an eine von- zwei Richtungen gebunden sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pBSl und pBS3 gehen.aus Fig. 6 der Zeichnung hervor.

Beisp.iel20 '

Aufbau der Plasmide pBS2 und pBS4

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Bei-

24755

spiel 19 A. bis C. beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pHI-18 hier jedoch das mit BamHI verdaute Plasmid pHI-16 verwendet.

Das Plasmid pELlOS hat zwei BamHI-Restriktionsstellen, so daß eine BamHI-Teilverdauung zu zwei *-M,4 kb BamHI-Fragmenten führt. Beim obigen Verfahren werden daher auch die Insertionsisomeren der Plasmide pBS2 und'pBS4 gebildet. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierun-'0 gen, da die mit BamHI restriktierte DNA jeweils an eine von zwei Richtungen gebunden sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pBS2 und pBS4 gehen aus Fig. 7 der Zeichnung hervor.

^ Beispiel 21

Aufbau der Plasmide pBS5 und pBS6

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Bei-

spiel 19 A. bis C. beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der Pläsmide pELlOS und pHI-18 hier jedoch die Plasmide pELllO und pHI-16 verwendet. Das Plasmid pELll.O-wird in herkömmlicher Weise aus Streptomyces ambofaciens/ pELllO (hergestellt gemäß Beispiel 9) praktisch unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens isoliert.

Das Plasmid pELllO hat zwei BainHI-Restriktionsstellen, so daß eine BamHI-Teil verdauunc zu zwei ~^r 6 , 2 kb BamHI-Fr ag-

menten führt. Beim obigen Verfahren werden daher auch die

Insertions isomeren der Plasmide -pBS5 und pBS6 gebildet. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da die mit BamHI restriktierte DNA jeweils an eine

von zwei Richtungen gebunden sein kann. Die Restriktions-35

Stellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pBS5 und pBS6 gehen aus Fig. 13 der Zeichnung hervor.

755

ft

Beispiel 22

Aufbau der Plasmide pBS7 und pBS8

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 19 A. bis C. beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der Plasmide pELlO5 und pHI-18 hier jedoch die Plasmide pEL113 und pHI-16 verwendet. Das Plasmid pEL113 wird in herkömmlicher Weise aus Streptomyces ambofaciens/ 10. pELl33 (hergestellt- gemäß. Beispiel 11) praktisch unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens isoliert.

Das Plasmid pEL113 hat drei BamHI-Restriktionsstellen, so daß eine BamHI-Teilverdauung zu drei ^7,8 kb BamHI-Fragmenten führt. Beim obigen Verfahren werden daher auch die Insertionsi'someren der Plasmide pBS7 und p3S8 gebildet. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da die mit BamHI restriktierte DNA jeweils an eine von zwei Richtungen gebunden sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pBS7 und pBS8 gehen aus Fig. 14 der Zeichnung hervor.

Beispiel 23 *

Aufbau der-Plasmide pBS9 und pBSlQ

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 19 A. bis C. beschrieben durchgeführt, wobei man ' anstelle der Plasmide pELlO5 und pHI-18 hier jedoch die Plasmide pELl22 und pHI-16 verwendet. Das Plasmid pELl22 wird unter Anwendung bekannter Verfahren aus Escherichia coli Kl2 HB101/PEL122 (hergestellt gemäß Beispiel 15} isoliert.

Das Plasmid pELl22 hat drei BarnHI-Restriktionsstel len, so, daß eine BamHI-Teilverdauung zu drei ^8,7 kb BamHI-Frag- menten führt. Beim obigen Verfahren werden daher auch die

24755

Insertionsisomeren der Plasmide pBS9 und pBSlO gebildet. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da die mit BamHI restriktierte DNA jeweils an eine von zwei Richtungen gebunden sein kann. Die Restriktions-Stellenpläne und Funktionspläne für jedes der Plasmide pBS9 und pBSlO gehen aus Fig. 15 der Zeichnung hervor.

Beispiel 24

Aufbau von Bacillus subtilis MI112/pBSl und Bacillus subtilis MI112/pBS3 _;

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 18 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch eine DNA verwendet, die die Plasmide pBSl und pBS3 (her-'gestellt gemäß Beispiel 19) anstelle des Plasmids pHI-18 enthält. Die erhaltenen chloramphenicolresistenten und kanamycinsensitiven Transformantenkolonien von Bacillus subtilis- MI112/pBSl und Bacillus subtilis MI112/pBS3 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert,- gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind,

-" 3eispiel25

Aufbau von Bacillus subtilis MI112/pBS2 und Bacillus subtilis MII12

οη Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 18 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch eine DNA verwendet, die die Plasmide pBS2 und pBS4 (hergestellt gemäß Beispiel 20) anstelle des Plasmids pHI-18 enthält- Die erhaltenen chloramphenicolresistenten Kolonien werden selektiert und in üblicher Weise hinsichtlich einer

ης Kanamycinresistenz untersucht. Die chloramphenicolresistenten und kanamycinresistenten Transforraanten von Bacillus subtilis MI112/pBS2 und Bacillus subtilis MI112/pBS4 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch

475

' Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

Beispiel 2 6 ' .

Aufbau von Bacillus subtilis MI112/pBS5 und Bacillus subtilis MI112/pBS6

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 18 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch eine DNA verwendet, die die Plasmide pBS5 und pBS6 (hergestellt gemäß Beispiel 21) anstelle des Plasmids pHI-18 enthält. Die erhaltenen chloramphenicolresistenten Kolonien werden selektiert und in herkömmlicher Weise hinsichtlich einer Kanamycinresistenz untersucht. Die chloramphenicolresistenten und kanamycinresistenten Transformanten von Bacillus subtilis MI112/pBS5 und Bacillus, subtilis MI112/pBS6 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise· durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

Beispiel 27 25

Aufbau von Bacillus subtilis MI112/pBS7 und Bacillus subtilis MI112/P3S8

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 18 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch eine DNA verwendet, die die Plasmide pBS7 und pBS8 {hergestellt gemäß Beispiel 22) anstelle des'Plasmids pHI-18 enthält. Die erhaltenen chloramphenicolresistenten Kolonien werden selektiert und in herkömmlicher Weise hinsichtlich einer Kanamycinresistenz untersucht. Die chloramphenicol resistentan und kanamycinresistenten Transformanten von Bacillus subtilis MIl"12/p3S7 und Bacillus subtilis MI112/pBS8 werden unter Anwendung bekannter Verfah-

24755

] ren isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Geiaiektrophorese- hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

Beispiel 28

Aufbau von Bacillus subtilis MI112/pBS9 und Bacillus.subtilis MI112/PBS10

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 18 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch eine DNA verwendet, die die Plasmide pBS9 und PBSlO (hergestellt gemäß Beispiel 23) anstelle des Plasmids pHI-18 enthält. Die erhaltenen chloramphenicolresistenten Kolonien werden selektiert und in herkömmlicher Weise hinsichtlich einer Kanamycinresistenz untersucht. Die chloramphenicolresistenten und kanamycinresistenten Transformanten von Bacillus subtilis MI112/pBS9 und Bacillus sub— tilis MI112/p3Sl0 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

25

Beispiel 29

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pBSi und Streptomy-

ces ambofaciens/p3S3

30

Unter Verwendung von etwa 20 ug der DNA von Beispiel 19

8 und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB79/ 00095) durch. Die gewünschten Transformanten werden hin-' sichtlich einer Thiostreptonresistenz selektiert, indem man die reaenerierenden Protoplasten mit durch R2-Medium

47 55 0

T modifiziertem Oberagar überschichtet, der so viel Thiostrepton enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 50 μg/ml ergibt.

Die erhaltenen thiostreptonresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pBSl und Streptomyces ambofaciens/pBS3 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gel'elektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut sind, im wesentlichen nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren identifiziert.

Beispiel 30

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pBS2 und Streptomyces ambofaciens/pBS4

Unter Verwendung von etwa 20 μg der DNA .von Beispiel 20 und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofäciens (NRRL 2'42O) führt man die gewünschten Auf bauten ^: praktisch wie in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB7 9/ 00095) durch. Die gewünschten Transformanten werden hinsichtlich einer.Thiostreptonresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit durch R2-Medium· modifiziertem Oberagar überschichtet, der so viel Thiostrepton enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 50 μg/ml ergibt.

Die erhaltenen resistenten Kolonien von Streptomyces ambof aciens/pBS2- werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann.durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut sind, im wesentlichen nach dem·

^~· in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren identifiziert.

247550

U - 53 !Beispiel 31

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pBS5 und Streptomyces

ambof aciens/pBS6 '

Unter Verwendung von etwa 2 0 μ^ der DNA von Beispiel 21

und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens

. (NRRL 2420) führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift

10' WO79/01169 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/G379/ 00095) durch. Die gewünschten Transformanten werden hinsichtlich einer Neomycinresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit durch R2-Medium modifiziertem Oberagar überschichtet, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 1 μg/ml ergibt.

Die erhaltenen neomycinresistenten Kolonien von Strepto- myces ambofaciens/pBS5 und Streptomyces ambofaciens/pBSo .

werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut sind, im wesentlichen nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren identifiziert.

. .

Beispiel 32

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pBS7 und Streptomy-

ces ambofaciens/pBSB

Unter Verwendung "von etwa 20 μα der DNA von Beispiel 22

q und von 1x10 Protoplasten von "Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB79/

00095) durch. Die gewünschten Transformanten werden zuerst hinsichtlich der Thiostreptonresistenz und dann bezüglich ihrer Neomycinresistenz unter Anwendung der in

24755

' den obigen Beispielen 7 und 9 beschriebenen Verfahren selektiert.

Die erhaltenen thiostreptonresistenten und neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pBS-7 und Streptomyces ambofaciens/pBS8 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Re- striktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut sind, im wesentlichen nach dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren identifiziert.

Beispiel 33

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pBS9 und Streptomyces ambofaciens/pBSlO

Unter Verwendung von etwa 20 μg der DNA von Beispiel 23

und .1x10 Protoplasten von S'treptornyces ambofaciens {NRRL'2420) führt man die gewünschten Aufbauten praktisch wie in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/001 169(internationale Patentanmeldung Nr, PCT/GB79/00095 ) durch. Die- gewünschten Transf o-rmanten werden hinsichtlich einer Thios.treptonresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit durch R2-Medium- modifiziertem Oberagar überschichtet, der so viel- Thiostrepton enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 50 ug/ml ergibt.·

^ Die erhaltenen thiostreptonresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pBS9 und Streptomyces ambofaciens/pBS-10 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und Geleiektrophorese hinsichtlich der Plasmide,

aus denen sie aufgebaut sind, im wesentlichen nach dem in Beispiel -7 beschriebenen Verfahren identifiziert.

4755

1 Beispiel 34

Aufbau von Escherichia coli K12 HBl01/pBS9 und

Escherichia coli K12 HBlOl/pBSlO

..

Die gewünschten Aufbauten werden praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des . Plasrnids pLR2 für die Transformation hier jedoch die nach Beispiel 23 hergestellte DNA verwendet. Die überlebenden Kolonien werden zuerst selektiert, hinsichtlich des er-

R S warteten Phenotyps {Amp , Tet ) untersucht und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese hinsichtlich der Plasmide, aus denen sie aufgebaut sind, als die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 HB101/pBS9 und Escherichia coli K12 HBlOl/pBSlO identifiziert..

Beispiele für weitere Plasmide und Transformanten, die unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren aufgebaut werden können, gehen aus den folgenden Tabellen I und-II hervor. Die in Tabelle I namentlich genannten pBS-Plasmide können erfindungsgemäß auch· irgendwelche Insertions isomeren einschließen, die sich bei einem· bestimmten Aufbau ergeben..

TABELLE I Beispiele, für Plasmide

Beispiel Bezeichnung des Nr. Plasmids *

Aufbau durch Verknüpfung mit BamHI-Fragmenten

3 5 pBSll und pBSl2

3 6 p3Sl3 und pBSl4

37 pBSlS und pBSlö

38 pBS17 und pBSIS

39 PBS19 und pBS2 0

40 p3S21 und pBS22

41 pBS23 und p3S24

pHI-16-und pEL10 7 pHI-16 und pELlO9 pHI-16 und pELll4 pHI-16 und pELllS pHI-16 und pELllö pHI-16 und pELl2i pHI-18 und' pELlO7

755

TABELLE I (Fortsetzung)

Beispiel Nr.

Bezeichnung des Pläsmids*

Aufbau durch Verknüpfung mit BamHI-Fragmenten

42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57

58

59

pBS25 und pBS26 pBS27 und pBS28 pBS2 9 und pBS3 0 pBS31 und pBS32 pBS33 und pBS34 pBS35 und pBS36 pBS37 und pBS38 pBS39 und pBS40 pBS41 und pBS42 PBS4 3 und pBS4 4 pBS45 und pBS46 pBS47 und pBS48 pBS4 9 und pBS5 0 pBS51 und pBS5 2 pBS5 3 und pBS54 PBS5.5 und pBS5 6

pBS57 und pBS58 PBS5 9 und pBS60

pHI-18 und pELlO9 pHI-18 und pELHO pHI-18 und pEL113 pHI-18 und pELH4 pHI-18 und pELllS pHI-18 und pELllö pHI-18 und-pELl21 pHI-18 und pELl22 PBR322 und pBS13 pBR3 2 2 und pBS18 pBR3 2 2 und pBS7 pBR3 2 2 und pBS2 7 PBR3 2 2 und pBS2 P.BR3 22 und pBSl pBR3 2 8 und pBS2 p3R3 2 8 und pBSl

Verknüpfung mit EcoRI Fragmenten

pBR3 2 8 und pBS2 pBR3 2 8 und p3Sl

Das in den obigen Beispielen 35 bis 49 erstgenannte Plasmid'kennzeichnet die Orientierung, bei der das pEL-Gen für die Thiostreptonrasistenz oder Neomycinresistenz gegenüberliegend (anstelle benachbart) zum pHI-Gen für die Kanamycinresistenz oder Chloramphenicolresistenz angeordnet ist. Das zweitgenannte Plasmid kennzeichnet die umgekehrte Orientierung.

35 Das in den obigen Beispielen 50 bis 57 erstgenannte Plasmid kennzeichnet die Orientierung, bei der die pHI PvuII-Stelle benachbart zur oBR HindiII-Ste1Ie angeordnet ist. Das zweite Plasmid kennzeichnet die umgekehrte Orientierung.

2^7 J J U Q -57-

Das in den obigen Beispielen 58 und 59 erstgenannte Plasmid kennzeichnet die Orientierung, bei der die pHI Xbal-Stelle benachbart zur pBR PvuII-Stelle angeordnet ist. Das zweite Plasmid kennzeichnet die umgekehrte Orientierung.

TABELLE II Beispiele für Transformanten

1. Bacillus R/pR , worin R für subtilis, subtilis MI112, RUB331, thuringiensis, megaterium, cereus,· popillae, laterosporus oder amyloliquifaciens steht und R unabhängig irgendein pBS-Plasmid der in den Beispielen 35 bis 5 9 von Tabelle I angegebenen Art bedeutet.

2 1 2 2. Streptomyces R /pR , worin R für ambofaciens, fradiae, coelicolor, aureofaciens, granuloruber oder lividans steht und R~ unabhängig die oben angegebene Bedeutung hat.

3. Escherichia coli R³/pR⁴, worin R³ für K12, K12 HBlOl, K12 RV308, C600R, -M, oder K12 C600 steht und R⁴ unabhängig irgendein pBS-Plasmid der in den Beispielen 48 bis 5 9 von Tabelle I angegebenen Art becLeutet.

Claims (15)

U ö - 58 - Erfindungsansprüche:

1) .ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikations-

startpunkt, der in Streptomyces funktionell ist, als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthält, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Streptomyces transformiert sind,

1. Verfahren zur Herstellung eines multifunktionellen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens zwei der folgenden Fragmente miteinander verknüpft:

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e -

k e η η ζ ei c h η e t , daß die in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coil funktioneilen Replikationsstart- ^O punkte ein Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3, ein Restriktionsfragment des Plasmids pHI-16 und ein Restriktionsfragment eines Escherichia coli-Plasmids sind.

2) ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Bacillus funktionell ist/ als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthält, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Bacillus transformiert sind/

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, d a d u r c h-

^OJ gekennzeichnet, daß die im Vektor enthalte-' nen Replikationsstartpunkte ein Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 und ein Restriktionsfragment des Plasmids oHI-16 sind,

247550

3) ein Restriktionsfragment, das sowohl einen Replikationsstartpunkt, der in Escherichia coli funktionell ist, als auch ein oder mehr DNA-Segmente enthält, die eine Resistenz 'gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in Escherichia coli transformiert sind, mit der Maßgabe, daß keiner der Replikationsstartpunkte in Escherichia coli funktionell ist, wenn der Vektor auf zwei funktionell unterschiedliche Replikationsstartpunkte

beschränkt ist. ·

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch

gekennzeichnet, daß der ein Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 enthaltende Replikationsstartpunkt das ~^I2,8 kb BamHI-Fragment ist.

5. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Escherichia coli-Plasmid das Plasmid pBR322 oder pBR328 ist.

6. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, · dadurch gekennzeichnet , daß das ·~ 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 eine Thiostreptonresistenz verleiht.

7. ' Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß das ~3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRl eine Neomycinresistenz verleiht.

8. Verfahren nach Punkt I₇ 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß das .~ 4,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pH.I-16 eine Chloramphenicolresistenz verleiht.

9. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß das ^ 3,9 kb ,BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pHI-18 eine Kanamycinresistenz verleiht.

10. Verfahren nach Punkt 3 zur Herstellung der Plasmide pBSl und p3S3 und ihrer Insertionsisomeren, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit BamHI teilverdaute Plasmid pELlOS mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pHI-18 verknüpft.

11. Verfahren nach Punkt 3 zur Herstellung der Plasmide pBS2 und p3S4 und ihrer Insertionsisomeren, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit

lh I i) 5 U Ö - 60 -

] . BamHI. teilverdaute Plasmid pELlO5 mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pHI-16 verknüpft.

12. Verfahren nach Punkt 3 zur Herstellung der Plasmide pBS5 und pBS.6 und ihrer Insertionsisomeren, dadurch g. ekennzeichnet , daß man das mit BamHI teilverdaute Plasmid pELllO mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pHI-16 verknüpft.

13. Verfahren nach Punkt 3 zur Herstellung der Plasmide pBS7 und pBS8 und ihrer Insertionsisomeren, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit BamHI teilverdaute Plasmid pELll3 mit dem mit- BamHI verdauten Plasmid pHI-16 verknüpft.

14. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 5 zur Herstellung

eines in Streptomyces, Bacillus und Escherichia coli funktioneilen Klonierungsvektors, dadurch gekennzeichnet, daß die Replikationsstartpunkte i-tfi Vektor ein Restriktionsfragment des Plasmids pEL10 3₇ ein Restriktionsfragment des Plasmids pHI-16 und ein Restriktionsfragment des PlasmidspBR322 sind.

15. Verfahren nach Punkt 14 zur Herstellung der Pias— mide pBS9 und p3S10 und ihrer Insertionsisomeren, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man das mit

BamHI teilverdaute Plasmid. pELl22 mit dem mit BamHI verdauten Plasmid oHI-16 verknüpft.