JPS58134100A - 多機能クロ−ニングベクタ− - Google Patents

多機能クロ−ニングベクタ−

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JPS58134100A
JPS58134100A JP58015395A JP1539583A JPS58134100A JP S58134100 A JPS58134100 A JP S58134100A JP 58015395 A JP58015395 A JP 58015395A JP 1539583 A JP1539583 A JP 1539583A JP S58134100 A JPS58134100 A JP S58134100A
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JP
Japan
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plasmid
replication
vector
bacillus
pbs
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JP58015395A
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English (en)
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ジエ−ムズ・ロバ−ト・ミラ−
ジエフリ−・トビン・フエアマン
ステイ−ブン・コバセビツク
ナンシ−・エレン・マリン・ニ−・ビアマン
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Publication date
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、機能的なストレプトマイセス(Stre−(
origin of  replication)pt
crr5ces )の複製起原、機能的なバチルス〔桿
菌)△ (Bacillus)の複製起原、機能的なイーコリ(
大腸菌) (E、coli)の複製起原、および抗生物
質に対する耐性(抵抗性)を付与する1若しくはそれ以
上のDNAセグメン)幸畔井→を含有する新規な多機能
組替えDNAクローニングベクターに関する。本発明は
また、該ベクターの組替え体に関する。
従来、選択し得る多機能クローニングベクターが一般的
に存在しないため、ストレプトマイセス、バチルスおよ
びイーコリにおける組替えDNA技術の開発と利用が妨
げられ、特に部分的には困難であった。本発明に係るベ
クターは、ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコ
リにおいて機能し、選択し得るものであり、従ってこの
技術分野に於いて顕著な進歩を示すものである。
本発明に係るベクタ」は、小型で万能であり、それに対
して耐性が付与されている抗生物質に対して感受性を有
するストレプトマイセス、バチルスまたはイーコリ細胞
に導入し、選択することができるので特に有用なもので
ある。臨床的に重要な抗生物質の半数以上はストレプト
マイセス株によって生産されているので、この工業的に
重要なグループに適用し得るクローニング系およびベク
ターを開発することは望ましいことである。更に、この
ベクターはバチルスおよびイーコリに於いても機能する
ので、遺伝物質の異翼間移動および発現が容易になる。
これに関連して、本発明のベクターは、組替えDNA技
術による物質の生産の為の宿主細胞を選択する上での融
通性を備えている。
この事は極めて重要なことである。何故なら、ベクター
の保有している遺伝子の遺伝的発現は、その遺伝子が導
入される細胞の遺伝的背景によって制限を受け、また影
響されるからである。この宿主細胞の違いも、翼間で使
用し得るベクターを提供することによりオリ用される。
例えは、このベク(□ ターは、特にストレプトマイセスおよびバチルスの一方
または双方栃天む種々の宿主細胞において、新しい抗生
物質およびその誘導体を生産するための遺伝子のみなら
ず、既知の抗生物質の収量を増加させる遺伝子をクロー
ンするのに使用することができる。
本発明に係る多機能組替えDNAクローニングベクター
は、ストレプトマイセス、バチルス、およびイーコリ宿
主細胞中でクローンし得るのみならず、形質転換体を好
都合に選択することができる。形質転換は非常に低い頻
度で起るので、何百万という細胞の中で、どの細胞がプ
ラスミドDNAを獲得したかを調べる為の機能試験が実
際上必要である。このことは重要なことである。何故な
ら、非選択性のDNA配列をこのベクターに挿入するこ
とができ、宿主を形質転換することによって該ベクター
およびその特定のDNA配列を持った細胞を適当な抗生
物質選択法によって単離することができるからである。
本明細書を理解しやすくするために、以下に用語につい
て説明する、 組替えDNAクローニングベクター:プラスミドを含む
(しかしこれに限定されない)自律性の複製体であって
、1若しくはそれ以上の、それ以外のDNAセグメント
を付加された、あるいは付加することのできるDNA分
子からなっている。
形質転換: DNAを受容宿主細胞に導入して遺伝子型
を変え、その受容宿主細胞に安定な遺伝性の変化を生じ
せしめること。
形質転換体:形質転換された受容宿主細胞。
多機能:翼間で機能性を有すること。
感受性宿主細胞:ある抗生物質の存在下において、その
抗生物質に対して耐性を付与するDNAセグメントがな
ければ増殖できない宿主細胞。
制限フラグメント:プラスミドに1種またはそれ以上の
制限酵素を作用させることによって生成するプラスミド
の全部またはその直線状の一部分。
挿入アイソマー(異性体):DNAフラグメントを、受
容DNAの1またはそれ以上の適合サイトに挿入する時
に生成し得る2種またはそれ以上の組替えDNA分子の
1つ。
プラスミドPIA21.6Kb BamHI  制限フ
ラグメント:プラスミドpIJ6に含まれている、同プ
ラスミドの1.6Kb BamHl  チオストレプト
ン耐性付与フラグメント。
プラスミドpIAl 3,4Kb BamHI  制限
フラグメント:プラスミドpIJ2に含まれている同プ
ラスミドの3,4 Kb BamHIネオマイシン耐性
付与フラグメント。
AmpEL:  アンピシリン耐性表現型。
Tet5:  テトラサイタリン感受性表現型。
Th1oR:  チオストレプトン耐性表現型。
Neo’:  ネオマイシン耐性表現型。
CrrIR=  クロラムフェニコール耐性表現型。
KnR:  カナマイシン耐性表現型。
本発明は、多機能組替えDNAクローニングベクターで
あって、リストレプトマイセスにおいて機能する複製起
原、バチルスにおいて機能する複製起原、およびイーコ
リにおいて機能する複製起原からなる群から独立して選
択される2種またはそれ以上の機能的に異なる輸液超厚
、およびb)該− ベクターを構成している複製起原が機能し得る感受性宿
主細胞であって形質転換、細胞分裂および培養が可能な
宿主細胞に導入された時、少なくとも1種の抗生物質に
対する耐性を付与する1種またはそれ以上のDNAセグ
メント、を含有するベクター(ただし、該ベクターが2
種の機能的に異なる複製起原に限定される場合は、その
複製起原はいづれもイーコリにおいて機能しない)を提
供するものである。
本発明はまた、上記ベクターの形質転換体を提供するも
のである。
本発明のベクターは、Dストレプトマイセスに於いて機
能する複製起原およびストレプトマイセスに導入された
時少なくとも1種の抗生物質に対する耐性を付与する1
またはそれ以上のDNAセグメントの両方を含有してい
る制限フラグメント、■バチルスに於いて、機能する複
製起原およびバチルスに導入された時少なくとも1種の
抗生物質に対する耐性を付与す:・・る1またはそれ以
上のDNA:・1111゜ セグメントの両方4’*有している制限フラグメント、
■イーコリプラスミドのレプリコン含有、抗生物質耐性
付与制限フラグメント、の少なくとも2個を結合させる
ことによって組み立てられる。
υとりを結合させるとストレプトマイセスとバチルスの
両方で機能するプラスミドが得られる。1)と■の結合
で得られるプラスミドに3)を結合するとストレプトマ
イセス、バチルス、およびイーコリのいづれでも機能す
るプラスミドが得られる。
好ましい最初のフラグメント(ここでは例示の目的で、
プラスミドpEL105 (7) 〜4,4 Kb B
amHI制限フラグメントで代表させる)は、プラスミ
ドp IJLflのチオストレプトン耐性付与〜1,5
 Kb B amH1制限フラグメントをプラスミドp
EL103の〜2.BKbBamHI制限フラグメント
に結合させることにより組み立てられる。後者のフラグ
メントはストレプトマイセスにおいて機能する複製起原
を含有しており、従って本発明を実施する上で特に有用
である。好ましい第2のフラグメントはプラスミドpH
1−15の〜4.6KbBamHI制限フラグメントで
ある。このプラスミドpHl−15フラグメントはバチ
ルス機能性の複製起原およびバチルスに抗生物質耐性を
付与するDNAセグメントを含んでいる。この最初の制
限フラグメントおよび第2の制限フラグメントを結合す
ると新規の代表的な多機能プラスミドPB52が得られ
る。Bam)II制限化プラスミドPBS 2をBam
HI制限化プラスミドpBR322と結合させると、新
規な多機能の代表的プラスミドpBs49が得られる。
後者のタイプのプラスミド(群)は極めて万能であり、
ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリのいづれ
に於いても使用することができる。
ストレプトマイセスにおいて機能する複製起原を含有し
ているプラスミドPEL103は、約20.OKbであ
り、分子クローニングに特に好都合ないくつかの制限サ
イトを含んでいる。プラスミドpEL103の複製起原
は〜2.g KbBamHI制限77グメント内に局在
化していた為、この〜2J3KbBamH1領域の外側
を切断する制限酵素でこのプラスミドを消化すると、多
種多様の複製超厚含有フラグメントが生成し得る。プラ
スミドp ELI O3の詳細な制限サイトおよび機能
地図を第1図に示す(本明細書に添付した全ての図面は
、等尺で描かれてはいない)。
プラスミドPEL103は、Northern Reg
ionalResearch Laboratory 
(Peor、ia、l1linois)に寄託され、永
久保存カルチャーコレクションの一部キなっているスト
レプトマイセス・グラニュ0 /l/−バー (Str
eptomyces granuloruber) A
A39912.13/PEL103から常法により単離
することができる。これはNRRL12549の番号で
誰でも人手することができ、このプラスミドの好ましい
入手源、貯蔵物として使用することができる。
多種多様の、複製超厚含有プラスミドPEL103フラ
グメントを組み立てることができるが、本発明を実施す
るには〜2.BKbBamH1制限フラグメントが最も
好ましい。この〜2j3 Kblフラグメント1種また
はそれ以上の抗生物質耐性付与DNAフラグメント(こ
こでは、プラスミドPLR2のチオストレプトン耐性付
与〜1,5KbBamHI制限フラグメントおよびプラ
スミ:ドp LJLlのネオマイシン耐性付与〜3.4
KbBamHI制限フラグメントを例示のために使用す
る)と結合させる。
チオストレプトン耐性付与フラグメントのソーKbであ
り、Hindlu処理プラスミドplJ6(Th om
p s o nら、Nature286 :525(1
980)参照)をHindIII処理プラスミドPBR
322と結合することにより組み立てられる。ネオマイ
シン耐性付与フラグメントのソースであるプラスミドp
LR1は約14.8Kbであって、プラスミドplJ6
の代りにプラスミドpIJ2(Thompsonら(1
980) ニより開示されている)を使用するほかは上
記と同様にして組み立てられる。p LR2およびp 
LRlの両プラスミドは、イーコリにおいて機能するの
で、以下の操作のために、常法により増幅し、単離する
ことができる。プラスミドp LAlおよびPLJL2
の制限サイトおよび機能地図をそれぞれ第2図および第
3図に示した。
チオストレゾトイ。耐性付与〜1,5KbBamHIフ
ラグメントとネオマ身・・シン耐性付与〜3,4KbB
amHlフラグメントとを、プラスミドPEL103の
〜2,8Kb複製起原含有B超厚HI  フラグメント
と結合させ、本発明を実施するための出発物質とじて使
用するプラスミドを調製する。この出発物質たるプラス
ミドは、特定の耐性付与DNAフラグメントの方向に応
じて2方向性である。即ち、ブラフ、 ミF PLR2
(7) 〜1,5 Kb Bam Hlフラグメントを
プラスミドpEL103の〜’l、8K b B am
 H17ラグメントに結合させると有用な出発物質プラ
スミドPEL107とpEL105となり、同じ様にプ
ラスミドp LRlの〜3,4KbBamHI 7ラグ
メントを結合させると有用な出発物質プラスミドpEL
109およびpELlloが得られ、さらに、同じ様に
これらのフラグメントの両者を結合させると有用な出発
物質プラスミドpEL113、pEL114、pEL1
15 およびpEL116が得られる。後述する様に、
上記のプラスミド出発物質を部分的にB a m HI
消化して、本発明に係るベクターを組み立てるのに有用
な制限フラグメントを生成せしめることができる。
プラスミドpH1−15は、バチルス機能性の複製超厚
およびそれぞれ抗生物質クロラムフエニ、コールおよび
カナマイシンに対する耐性を付与するDNAセグメント
(分節)を含んでいる。従って、プラスミドpHl−1
6は本発明の目的を達成するのに極めて好適な出発物質
である。プラスミドpH1−16は〜4,5Kbであり
、既知のキメラプラスミドPRD12の インビボにお
ける欠失によって生成する(Gryczanら、J、B
acteriology 141(11:246)。
これは、Peoria、 l1linoisのNRRL
に寄託され、永久保存カルチャーコレクションの一部と
なっている組立て株(consLrucLed 5tr
ain)Bacillussubtilis MI 1
12/pH1−15から、常法に従ッテ単離することが
できる。この株はNRRL B−12597の番号で誰
れでも入手可能であり、このプラスミドの好ましい供給
源、貯蔵源として使用することができる。プラスミドp
Hl−15の詳細な制限サイトおよび機能地図は第4図
に示しである。簡略化の為、プラスミドpHl−15お
よびここに例示したpHl−15フラグメントについて
は、3イ固だけのMboIIおよびTagl制限サイト
を示す。
プラスミドpH1−15の種々の誘導体も出発物質とし
て使用することができる。例えばプラスミドpH1−1
(5の〜Q、7 Kb Hpa II 制限フラグメン
トノ欠失により新規プラスミドpH1−18が得られる
プラスミドpHl−13は〜3,9Kbであり、バチル
スで機能する複製起原のほかにクロラムフェニコール耐
性付与DNAセグメントを含んでいる。プラスミドpH
1−18の制限サイトおよび機能地図を第5図に示した
。簡略化℃為、プラスミドpHl−18およびここに例
示のpHl−13フラグメントについては3個だけのM
bollおよびTagI  制限サイトを示す。
プラスミドpH1−15およびpHl−113をBam
HI消化すると、それぞれ〜4.5 Kbフラグメント
、〜3,9Kb フラグメントが得られ、これらはそれ
ぞれバチルスについての複製起原および抗生物質耐性を
付与するDNAを含んでいる。従って、このプラスミド
PHI−IBの3,9Kb BamHI制限フラグメン
トまタハプ57. ミl’ pHl−16の〜4.6 
KbBamHI・1′ 制限フラグメントを前記のプラスミドpEL105の〜
4.4KbBamHI制限フラグメントと結合すること
により、本発明の1例としての多機能クローニングベク
ターを容易に組み立てることができる。
ドPBSI、  PBS2  と呼ぶ。プラスミドp’
Hl−16の〜4,6Kb BamH1制限フラグメン
トとプラスミドPELI 10の〜6.2 K b B
 am HI制限フラグメントを結合すると新規多機能
プラスミドpBs 5が得られる。同様に、プラスミド
pHI −16Bam HIフラグメントをプラスミド
pEL113の〜7,8Kb B am Hl1ll 
     ゛限フラグメントと結合させると多機能プラ
スミドpB87が得られる。プラスミドpBsl、PB
S 2、pBS5およびpBS 7  の詳細な制限サ
イトおよび機能地図をそれぞれ第6図、第7図、第13
図および第14図に示す。
本発明のベクター、例えばプラスミドpBS l、PB
S 2、pBS5綜びpBS 7は、機能的レプリコン
を含有し抗生物質耐性を付与するイーコリプラスミドの
制限フラグメント、例えばプラスミドpBR・□・、。
322 、  PBi’L324  (Bパ61・・、
、i Var  、  F 、、  Gene  4 
 :  121  (1978)参照)、PBR325
(BOI 1var 、F、 、 (1978)参照)
、PBR328(Soberon、X、 + Gene
 9 : 287(1980)参照)などと結合させる
ことができ、か゛<シてイーコリ、ストレプトマイセス
およびバチルスにおいて使用する為の新規多機能プラス
ミドを調製することができる。プラスミドpB59およ
びpBs l Qで例示されるこれらの組み立て物は、
プラスミドの増幅および取扱いがストレプトマイセスま
たはバチルスより・もイーコリにおいてより迅速かつ簡
単に行なえるので、特に好都合である。
即ち、所望の組替えDNA操作をイーコリ宿主系で行な
った後、特定のDNAを除去し、必要ならばプラスミド
型に組み立て直し、ストレプトマイセスまたはバチルス
宿主細胞に導入することができる。
本発明に係る多機能PBSプラスミド群において例示さ
れるストレプトマイセス機能性複製超厚はフ5 スミト
pEL103の〜’1.f3 Kb BamHIフラグ
メントに含まれているが、この複製起原が存在する限り
、類似のpEL103フラグメントも使用することがで
きる。この様な類似のプラスミドpEL103制限フラ
グメントにはPst I、5phi、ngl!ll、C
I!a I、 Xho Iおよびその他のBamH17
ラグメントなどが含まれるが、これらに限定されるもの
ではない。さらに、特定の抗生物質耐性付与DNAセグ
メントは、プラスミドpEL103制限フラグメント上
の1つの位置に限定されるのではなく、複製起原または
他の重要なプラスミド支配の生理機能がこわされない限
り、種々の位置に結合させ、または挿入することができ
る。従って、ここに例示した物の代りに、多くの異なっ
たプラスミドpELl 03制限フラグメントおよびそ
の誘導体を使用することができる。特定のDNAセグメ
ントを結合または挿入するのに適した位置は、当業者に
は明らかであるか、あるいは容易に決定できるものであ
る。
プラスミドpHl−15およびpHl−18のそれぞれ
〜4.6  および3,9KbBamHI制限フラグメ
ントハ、本発明の多機能プラスミドを組み立てるのに好
適であるが、プラスミドpH1−15およびpHl−1
8のその他の多くの、複製超厚含有抗生物質耐性付与フ
ラグメントも使用することができる。プラスミドpH1
−15およびpHl−113の類似の単一切断制限フラ
グメントとしては、例えばプラスミドpH1−15ノB
gl’n、XbaI%EcoR11PvuIIおよびA
vaIフラグメント、プラスミドpH1−18のXba
I、EC0RI。
Pvu nおよびAvalフラグメントを挙げることが
できる。さらに、プラスミドpH1−16およびpH1
−18フラグメント−ζ含まれる抗生物質耐性付与DN
Aセグメントは、1つの位置に制限されるものではない
。むしろ、このセグメントは複製起原または他の重要な
プラスミド支配の生理機能がこわされない限り、種々の
位置に位置することができ、そしてまた挿入されて結合
することができる。
特定のDNAセグメントを結合または挿入するのに適し
た位置は、当業者には明らかであるか、あるいは容易に
決定し得るものである。従って、抗生物質耐性を発現し
、かつバチルスにおいて機能する複製起原を含んでいる
多数の制限フラグメントを組み立てることかで幸委。従
って、ここに例示した物の代りに、その様なフラグメン
トを使用してその他の多機能ベクターを組み立てること
ができ、その組み立てられたベクターも本発明に包含さ
れるものである。
抗生物質耐性付与DNAセグメント’+、その他のバチ
ルス機能性プラスミド、例えばプラスミドpBD15お
よび以下のプラスミド(これらはNIH公報第82〜9
9.1981、Recomb 1nant DNATe
chnical Bulletin ’4 (41: 
143  に記載されている)、即ちpPLIQ、PP
L7065、p1M13、pPL576、pBc16、
pAFvf77、pc 194、pC221、pc22
3、pE194、psA2100、PSA0501、T
P2、pUBllo、pUB112、pBD5、PBD
8、pBD9、pBDlo、 pBDll、pBD12
、PBD20、pBD35、pBD54、pOc; 1
196、pHV 12、pHV l 4、pHV33、
pG2165 オヨびpGrTI すどに結合させても
よい。得られたプラスミドは抗生物質耐性を付与し、か
つバチルスで機能する複製起原を含有しており、従って
、プラスミドpHl−15およびpHl−18の代りに
使用することができ、不発′:′、′ 明の目的を達するととができる。従って本発明は、組み
立てにプラスミドpHl−15またはpH1−18を必
要とする例示した多機能ベクターだけに限定されるもの
ではない。
本明細書において、チオストレプトン、ネオマイシン、
カナマイシンおよびクロラムフェニコール抗生物質耐性
付与DNAセグメントは、それぞれプラスミドPIA2
 (7) 〜1.6 K b B am HI制限フラ
グメント、プラスミドpLR1の〜3,4KbBamH
1制限フラグメント、プラスミドpH1−16の〜4.
6B a m HI制限フラグメントおよびプラスミド
pH1−18の〜3.9BamHI  制限フラグメン
トで例示したが、これは単なる例示に過ぎず、当業者で
あれば上記の抗生物質に対して耐性を付与するその他の
DNAセグメントを、個々にあるいは組み合わせて、組
み立てたり置きかえたりすることができる。プラスミド
p Li2の他のチオストレプトン耐性付与DNAセグ
メントには、例えば〜13icbPstI制限フラグメ
ントおよび〜1.5 K b B amH1制限フラグ
メントのBcJ lサブフラグメントが含まれる。プラ
スミドpLA lの他のネオマイシン耐性付与DNAセ
グメントには、例えば〜3,5KbPstl制限フラグ
メ7 ) オJ: ヒ〜3.4 Kb B amH1制
限フラグメントの5stI−Kpnlサブフラグメント
の大きい方などが含まれる。プラスミドpill−16
の他のカナマイシン耐性付与DNAセグメントには、例
えば〜0.74 Kb Hp a IIフラグメントお
よびBamHI−EcoRI  EcoRl−Pvuu
  AvaI−EcoRIおよびXba I −Pvu
 nフラグメントの大きい方が含まれる。プラスミドp
H1−18の他のクロラムフェニコール耐性付与DNA
セグメントには、例えば〜0.84 Hp a u  
フラグ、メントおよびXba l −Pvu n、Ba
mHI−EcoRlおよびEcoRI−PvuII7ラ
グメントの大きい方が含まれる。
上記の抗生物質およびその他の抗生物質、例えばハイグ
ロマイシン、バタテリオシン、ビアマイシン、ストレプ
トマイシン、タイロシン、エリスロマイシンなどに対す
る耐性を付与するその他のDNAセグメントも本発明の
目的に使用することができる。更に、上記の抗生物質耐
性付与DNAセグメントの種々の機能的誘導体を、遺伝
暗号に従ってヌクレオチドを付加、脱離または置換する
ことによって組み立てることができる。これらの、ある
いはその他の抗生物質耐性付与DNAセグメントをスト
レプトマイセスおよびバチルス複製超厚含有制限フラグ
メントと結合させると本発明の範囲に包含される多機能
ベクターが得られることは容易に理解されよう。
上述の複製超厚含有制限フラグメントおよび抗生物質耐
性付与DNAセグメントは、結合を容易にするために、
常法により修飾(改変)することができる。例えば分子
リンカ−を付加して、結合、または既知のその他の目的
に有用な特異な制限サイトを組み立てる。更に、ヌクレ
オチドを付加、脱離または置換することにより各種の制
限フラグメントを修飾し、特性を変え、そして種々の特
異な、あるいは追加の制限サイトをつくることができる
。当業者にはヌクレオチドの化学および遺伝暗号につい
ての知識があるので、どのヌクレオチドが交換可能であ
るか、そ!て特定の目的を達成する上でどのDNA修飾
が°噛ましいかがわかる。
本発明に係る組替えDNAクローニングベクターは、ス
トレストマイセスまたはバチルスの単一の種または株へ
の使用に限定されるものではない。
多くのバチルスおよびストレプトマイセス分類群の宿主
細胞、特にその無制限株(Restrictionle
ssstrain)  に導入することができる。更に
、ストレプトマイセスについては、その株の多くは経済
的に重要であってアミノグリコシド、マクロライド、β
−ラクタム、ポリエーテル、およびグリコペプチドなど
の抗生物質を産生ずる。無制限株は、当技術分野におい
てよく知られている常法および原理の拡張(exten
sions of principles) (lj]
TIovskay、aら、Microbiologic
al Reviews 44 : 206.1980参
照)により、ストレプトマイセスおよびバチルス分類群
から容易に選択(選別)、単離される。無制限株の宿主
細胞には制限酵素がなく、従って形質転換の際プラスミ
ドD桐Aが切断または分解5こと・石、d      
      △ かない。本発明においては、本発明に係るベクタ111
11 −のいかなる制限等イトも切断しない制限酵素を持って
いる宿主細胞も無制限株とみなす。
アミノグリコシド抗生物質を生産するストレプトマイセ
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することのできる特に有用な
宿主細胞は、例えば5 、kana−myceticu
s (カナマイシン)、S、chrestcmycet
icus (microsporeus(抗生物質5F
−767)、S、ribosidificus△ (抗生物質5F733)、S、flavopersic
us (xペタチノマイシン)、S、5pectabi
l is(アクチノスペクタシン)、S、rirmsu
s fomn parammycinus (パロモマ
イシン、カテヌリン)、S、fradiae変種+1t
al 1cus (7ミノシジン)、S、bluens
is変種、bluensis (プルエンソマイシン)
、S、catenulae (カテヌリン)、S。
ol 1voreLicul i変種、cellulo
philus (デストマイシンA)、S、teneb
rarius(トブラマイシン、アブラマイシン)、S
、1avendulae (ネオマイシン)、S。
albogriseolus(ネオマイシン)、S、a
lbus変種。
metanycinus(メタマイシン)、S、hyg
roscopicus変種、 sagamiensis
(スペクチノマイシン)、S、biki−niensi
s(ストレプトマイシン)、S、griseus (ス
トレプトマイシン)、S 、erythochrano
genes変種。
narutoensis(ストレプトマイシン)、S、
poolensis(ストレプトマイシン) 、S、g
albus (ストレプトマイシン)、S、rameu
s(ストレプトマイシン〕、S、olivaceus(
ストレプトマイシン)、S、rrashuensis(
ストレプトマイシン)、S 、hygroscopic
us変種。
11rrOneus(バリダマイシン)、S、rimo
faciens(デストマイシン)、S、hygros
copicus forma glebosus (グ
レボマイシン) 、 S、fradiae(ヒブリマイ
シン、ネオマイシン)、S、eurocidicus(
抗生物質A16316−C)、S、aquacanus
 (N−メチルヒグロマイシ7B)、S、crysta
l l 1nus(ヒグロマイシ7A)、S、nobo
rit−oensis (ヒグロマイシン)、S、hy
groscopicus (ヒグロマイシン〕、S、a
trofaciens(ヒゲ0フイシン)、S 、ka
sugaspi nus (カスガマイシン)、S、k
asugaensis(カスガマイシン)、S、net
ropsig(抗生物質LL−/W31 )、S、1i
vidus(リビドマイシン)、S、ho[uen−s
is (セルドマイシン複合体)、およびS、canu
s(リボシルバロマミン)の無制限細胞である。
マクロライド抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばS、caelestis(抗生物質M
188)、S、platensis(プラテノマイシン
)、S、rochei変種、 vo鳳ubilis(抗
生物質T2636)、S、venezuelae(メチ
マイシン)、S、griseofuscus(バンドリ
ン)、S 、narbonens i s (ジョサマ
イシン、ナルボマイシン)、S、[ungicidic
us (抗生物質NA−181)、Sogriseof
aciens(抗生物質PA133A%B)、S、ro
seocitreus(アルボサイクリン)、S 、b
runeogr−i 5eus (アルボサイクリン〕
、S 、roseochromogenes(アルボサ
イクリン)、S、cinerochranogenes
(シラマイシルB)、S、albus(アルボマイセチ
ン)、S、felleus(アルボマイシン、ピクロマ
イシン)、S 、roche i (ランカシジン、ボ
レリジン)、S、v、iola−ceoniger(ラ
ンカシジン)、Slgriseus(ボレリジン)、S
 、mai zeus (インゲラマイシン)、S、a
lbus変種。
coilmyceticus(+:lレイマイシン)、
Somycarofaciens、′□ □ (アセチル−ロイコマイシン、・ニスピノマイシン)、
S、hygroscopicus(ツリマイシン、レロ
マイシン、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシ
ン)、Sogriseospiral is(レロ?イ
シン)、S、1avendulae(アルトガマイシン
)、S、ri+nosus (= ニートラマイシン)
、S 、del tae(デルタマイシン)、S、fu
ng−icidicus変種、espinomycet
icus (x スビ/?イシン)、S、furdic
idicus(ミデカマイシン)、S、arrbofa
c−iens(ホロマシジ7D)、S、eurocid
icus (メチマイシン)、S、griseolus
(グリソリキシン)、S。
flavochrom<genes(7v ロフイシン
、ジノマイシン)、S、firrthriaLus(ア
7 ロフイシン)、S、fascic−ulus(77
口フィシン)、S、erythreus (xリスロマ
イシン)、S、antibioticw(オレアンドマ
イシン)、S 、ol ivochramgenes(
オレアンドマイシン)、S、spinichranog
enes変種、suragaoens i s (クジ
マイシン)、S、kitasatoensis(oイコ
マイシン)、S、narb−onensis&種、 j
osamyceticus(oインマイシンA3、ジョ
サマイシン)、S’、albogriseolus(ミ
コノマイシン)、S、bikiniensis(’4 
ヤ/l/ :] フィシン)、S。
cirratus(シラマイシル″1つ、S、djak
artensis (=ダS、fradiae(タイロ
シン、ラクテノシン、マクロシン)、S、goshik
ieniis(ハ7ダマイシン)、Sogr−iseo
flavus(7キユマイシン)、S、halsted
ii  (カルボマイシン)、S、tendae(カル
ボマイシン)、S 、smcrosporeus (カ
ルボマイシン)、S、Lhermotol−erans
(カルボマイシン)、およびS、albiret 1c
ul i(カルボマイシン)の無制限細胞である。
β−ラクタム抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばS、lipm−ni i (A168
84、 MM4550.  MM13902)、 S、
clavul ig−erus (A16886B、ク
ラプラン酸)、S、laCLa−mdurans (セ
フ 7 フィシンC)、S、griseus(セファマ
イシフA、B)、S、hygroscopicus (
デアセトキシセファロスポリンC)、Sowadaya
mensis(v8−3442−D)、S、chart
reusis (S F 1523 )、S、he−t
eranorphusおよびS、panayensis
(02081X) :S、cinnamonensis
、 S、fimbriatus、 S、1ulsLed
ii、 S。
rocheiおよびS、viridochranoge
nes  (セフ 7 ? イシ7A、 B ) ; 
S、cattleya(チェナマイシン);およびS、
olivaceus、 S、flavovirensS
S、flavus、 S、ful−vovirldis
、 S、argenteolus、およびS 、s 1
oyaens i(MM4550 およびMM1390
2)の無制限細胞である。
ポリエーテル抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞で・あって、それ
に本発明のベクターを導又することのできる特に有用な
宿主細胞は、例えばS、albus(A204、A 2
8695AおよびB1  サリノマイシン)、S、hy
groscopicus (A218、エメリジッド、
DE3936.、A120A、A28695AおよびB
1エテロマイシン、ジノマイシン)、S、griseu
s (グリソリキシン)、S、conglobatus
(イオ/フィシン)、S 、eurocidicus変
種、 asterocidicus(ライドロマイシン
)、S、1a−saliensis(ラサロシツド)、
S、ribosidificus(ロノマイシン)、S
、cacaoi変種、 asoensis (リソセリ
ン)、S、cinnamnensis(−1−ネンシン
)、S+aureo−fac 1ens (ナラジン)
、Sogallinarius (RP30504)、
S、longwoodensis(リソセリン)、S、
flaveolus (CP38936)、S、mxt
abil is (S−11743a ) 、kヨヒS
−violaceoniger にグリジン)の無制限
細胞である。
グリコペプチド抗生物質群を生産するストレプトマイセ
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することができる特に有用な
宿主細胞は、例えばS、cri−entalis およ
びS、haranomchiensis (パンコマイ
シ7 ) ; S、c2[ndidus (A−365
12、アボパルシン)、およびS、eburospor
eus(LL−AM 374 )の無制限細胞である。
本発明のベクターを使用することができ、導入すること
のできる他のストレプトマイセス無制限株の好ましい宿
主細胞には、S、coel 1color; S、gr
a−nuloruber、 S、roseosporu
s、 S、1ividans、、S、espinosu
s。
およびS 、azureus  の無制限細胞が含まれ
る。
本発明のベクターを導入することのできる特に有用なバ
チルスの無制限株の好ましい宿主細胞は、例えばB、5
ubtil is、 B、5ubtilis M 11
12、B、thurin−gien、sis 、 B、
thuringiensis変種、1sraelien
sis、B。
cereus、 B、anthracis、IB、pi
liformis、 B、tropicuslB、al
vei、 B、megateriun、 B、puni
lus、 B、licheniEoimis。
B、polynyxa、 B、rmcerans、 B
、circulans、B、stearothe−rm
ophilus、 B、coagulans、 B、f
inmslB、brevis、 B。
5phaericus 、 B、pasteurii 
1B+fastidiosus 、 −B、1arva
e 。
B、lentimorbus、 B、apiarus、
 B、amyloliquifaciens。
B、1aterosporus 、およびB、popi
llaeの無制限細胞である。
上記の代表的なストレプトマイセスおよびバチルス宿主
細胞のほかに、本発明のベクターはその他の分類群、例
えば5taphylococcus、 5taphyl
ococ−cus aureus 、 5trepto
coccus 1  関連放線菌類、例えばStrep
tosporangiun、 Actinoplane
s、 Nocardia。
Mi crcmanosporaおよびLactoba
cil Iusなどの無制限株の細胞に導入することが
でき、使用することができる。更に、イーコリレプリコ
ンを含有している多機能ベクターは、イーコリに導入す
ることもできる。この様畝本発明のベクターは広い適用
性を有し、各種の生物の宿主細胞に導入すること力、1 ができる。
本発明の実施態様は全て有用なものであるが、本発明の
組替えDNAクローニングベクターおよび形質転換体の
ある物は特に有用である。即ち、好ましいベクターはプ
ラスミドPBSI、PBS2. PBS民pBs 7お
よびpBS9であり、好ましい形質転換体はStrep
tcmyces ambofaciens/pBsl、
S、ambofaciens/pBsJS、arIth
o[aciens/pBs5、S、ambofacie
ns/pBs7.5Jnbofac−iens/pBS
g、Bacillus 5ubLil is Ml 1
1:¥’PBS 1、B、5ub−ti1is/M11
1ppBS2、B、5ubti1is、A(111pp
BS5、B。
5ubtil is//M111ypBS7、B、5u
bLi1is/MIl13/pBS9およびE、col
 i K12 HBIOI/pBs9である。
本発明に係る組替えDNAクローニングベクターおよび
形質転換体は、広い利用性を有し、ストレプトマイセス
、バチルス、イーコリおよび関連生物に使用するのに好
適な多機能クローニングビーヒクル(媒介物)としての
必要性を満たすのに役立っている。更に、形質転換され
ていない宿主細胞に対して有毒である抗生物質に対して
耐性を付与する本発明に係るベクターの能力は、形質転
換体を選択(選別)するための便利な手段ともなる。ベ
クターDNAを獲得した特定の細胞を決定し、選択する
ことが実際的に必要であるので、このことは極めて重要
である。その存在を知る為の機能試験がないその他のD
NAセグメントも本発明のベクターに挿入することがで
き、この選択能のないDNAを含有している形質転換体
を、適当な抗生物質選択によって単離することができる
この様な非選択性のDNAセグメントは、プラスミドの
機能および複製に必要な領域内を除いて、あらゆる位置
(サイト)に挿入することができ、これには抗生物質修
飾酵素を特定している遺伝子およびあらゆるタイプの調
節遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではな
い。
より具体的には、遺伝子を含有している非選択性DNA
セグメントは、例えば代表的プラスミドpBs9に、〜
1,6KbBamHI耐性付与フラグメントの中央のS
a1!I制限サイトで挿入することができる。この様な
挿入によってチオストレプトン耐性遺伝子が不活性化さ
れ、従って、この組替えプラスミドを含有しているスト
レプトマイセス形質転換体を容易に確認することができ
る。これは次の如くして行なう;先ずネオマイシン耐性
を選択し、次いでチオストレプトンに耐性を持たないネ
オマイシン耐性ストレプトマイセス形質転換体ヲ確認す
る。同様に、ある特定のDNAセグメントを、例えば〜
3,4KbBamH1耐性付与フラグメントの内部Ba
mHI制限サイトに挿入すると、ネオマイシン耐性遺伝
子が不活性化される。従って、この組替えプラスミドを
保有しているストレプトマイセス形質転換体は、先づチ
オストレプトン耐性を選択し、次いでネオマイシンに対
して耐性を持っていないチオストレプトン耐性形質転換
体を調べることによって容易に確認することができる。
従って、ストレプトマイセスにおいて抗生物質耐性を選
択するこの能力によって、問題としている特定の非選択
性DNAを含有している極めて少数の細胞を有効に分離
することができる。
更に、遺伝子を含有している非選択性DNAセグメント
は、例えば代表的な、プラスミドpBs9のカナマイシ
ン耐性付与フラグメントのBgJn制限サイ・トに挿入
することができる。この様な挿入でカナマイシン耐性遺
伝子は不活性化され、従ってこの組替えプラスミドを含
有しているバチルス形質転換体を容易に確認することが
できる。これは次の如<シて行なう:先づクロラムフェ
ニコール耐性を選択し、次いでカナマイシンに対して耐
性ヲ持たないクロラムフェニコール耐性バチルス形質転
換体を確認する。同様にして、所望のDNA文グメント
を、例えばクロラムフェニコール耐性付与フラグメント
の内部MboII制限サイトに挿入するとクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子が不活性化される。従って、この組
替えプラスミドを保持しているバチルス形質転換体は、
先づカナマイシン耐性を選択し、次いでクロラムフェニ
コールに対する耐性を持たないカナマイシン耐性形質転
換体を確認することにより容易に同定される。従って、
バチルスにおいて抗生物質耐性を選択するこの能力によ
って、間暉としている特定の非選択性11 DNAを含有していで、極めて少数の細胞を効率よく分
離することができる。この様な選択は、イーコリに於い
ても行なうことができる。
上述の抗生物質耐性についての機能試験は、コピー数を
増大させるDNAセグメントまたは調節要素として働き
個々の抗生物質耐性遺伝子の発現を促すDNAセグメン
トを位置づけるのにも使用される。この様なセグメント
(例えばプロモーター、アテニュエーター、リプレッサ
ー、インジューサー、リボゾーム結合サイトなどである
が、これらに限定され吐い)は、ストレプトマイセス、
バチルス、イーコリおよび関連生物の細胞中で、他の遺
伝子の発現を調節するのに使用される。
本発明にかかるチオストレプトン、ネオマイシン、カナ
マイシンおよびクロラムフェニコール耐性付与ベクター
は、結合したDNAセグメントが幾世代にも渡って、安
定悦−宿主細胞中に保持されていることを確めるのにも
有用である。チオストレプトン、ネオマイシン、カナマ
イシンまたはクロラムフェニコール耐性付与フラグメン
トと共有結合しており、ストレプトマイセス、バチルス
、イーコリ、または関連生物の細胞中で増殖されるこれ
らの遺伝子またはDNAフラグメントは、その形質転換
体を、形質転換されなかった細胞にとっては有毒な濃度
のチオストレプトン、ネオマイシン、カナマイシンまた
はクロラムフェニコールに晒らすことによって維持され
る。従って、ベクターを失ない、それ故この共有結合D
NAを失なった形質転換体は増殖することができず、培
養から除去される。この様に、本発明のベクターは、特
、にストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリにお
いて、所望のDNA配列を安定化し、保持することがで
きる。
本発明に係るクローニングベクターおよび形質転換体は
、一般にストレプトマイセスおよび関連細胞中で生産さ
れる種々の物質の収量を改善するための、遺伝子のクロ
ーニングを提供するものである。この様な物質の例とし
ては、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロスポ
リン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラ
マイシン、トブラマイシン、エリスロマイシンなどが挙
げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、工
業的に重要な蛋白質、例えばヒトインシュリン、ヒトプ
ロインシュリン、グルカゴン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、牛成長ホルモンなど、工業的に重要な方
法および化合物と関連して来る代謝径路における酵素機
能、または遺伝子発現を改善する調節要素、を暗号化し
ているDNA配列をクローニング、特徴づけ、および再
構成するのに有用な選択性ベクターを提供するものであ
る。これらの望ましいDNA配列には、誘導抗生物質、
例えばストレプトマイシン、セファロスポリン、タイロ
シン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラ
マイシン、トフラマイシンおよびエリスロマイシン誘導
体などの合成を触媒している酵素、または抗生物質また
はその他の生産物の生合成を調整し、増大させる酵素を
暗号化しているDNAが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。この様なりNA上セグメント挿入し
、安定化させ得ることによって、抗生物質の収量および
利用性を、増大させることができる。
本発明の多機能クローニングベクターを使用すれば、現
在イーコリおよびバチルスで生合成されている生産物を
ストレプトマイセスにおいテ遺伝模なストレプトマイセ
ス発酵は、バチルスまたはイーコリの発酵よりもよく知
られ、よく理解されているので、特に好都合である。事
実、イーコリの工業的規模の発酵は依然として高度の経
験を要するものであり、場合によっては非常に困難なも
のである。本発明は、例えばヒトインシュリン、ヒトプ
ロインシュリン、クルヵゴン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、牛成長ホルモンなど、現在イーコリで生
合成されている物質をストレプトマイセスで生産する別
法を提供することにより、この問題を回避するものであ
る。本発明のベクターは非常に万能であり、上記の生産
物を発現するDNA配列または生産物を産生ずるイーコ
リプラスミド全体からなる配列のいづれかまたは両方を
収容することがで1きるので、このことが可能である。
即ち、本発明′#2より、宿主の選択に融通がきき、ス
トレプトマイセス、バチルスおよびイーコリにおいてポ
リペプチドおよびその他の生産物を生合成することがで
きる。特定の物質を生産するためには、そして一定の発
酵法ではどの様な宿主が最も適しているかは当業者の知
るところであるか、あるいは容易に決定できるものであ
る。
それぞれプラスミドPEL103およびpH1−15の
供給源であるストレプトマイセス・グラニュロルーバ(
Streptanyces granuloruber
)AA 39912.13/pEL103  およびバ
チルス・サチリス(BacillussubL市り/M
1112/pHl−16は、イクつかの異なった培地を
使って、数多(の方法で培養することができる。培養培
地中の好ましい炭水化物源は、例えば糖蜜、グルコース
、デキストリン、グリセリンなどであり、窒素源は、例
えば大豆粉、アミノ酸混合物、ペプトンなどである。栄
養無機塩も混入されるが、これにはナトリウム、カリウ
ム1、 アンモニア、カルシウム、燐酸、塩素および硫
酸イオンなどのイオン類を生成し得る通常の塩類が挙げ
られる。他の微生物の増殖や発育に必要であるのと同じ
様に、必須微量元素も添加する。この様な微量元素は、
通常培地の他の成分を添加する際、その成分の不純物と
して供給される。
ストレプトマイセスΦグラニュロルーバAA39912
.13/pEL103  は、好気性培養条件下、約p
ti5〜9 という比較的広いμml範囲で、約15〜
40°Gの温度で増殖される。しかし、最もコピー数を
高くしてプラスミドPEL103を生産するにjよ、声
約7.2の培地を使って培養を開始し、培養温度を約3
0°Gに保つのが望ましい。この条件下でストレプトマ
イセス・グラニュロルーバAA39912.13/pE
L103  を培養すると、当業者によく知られた技術
で、常法によりプラスミドpEL103が単離される細
胞保有体が得られる。
バチルス・サチリスMl 112/pHJ直−16は、
好気性培養条件下、約5.0〜8.5という比較的広い
pH範囲で、約25〜45°Cの温度で増殖する。
しかし、最もコピー数を多くしてプラスミド…1−16
を生産するには、μ約7の培地で培養を開始し、培養温
度を37°Cに保つのが好ましい。この条件下でバチル
ス・サチリスM1112/pH1−16を培養すると、
当業者によく知られた技術で、常法によりプラスミドp
H1−15が単離される細胞保有体が得られる。
本発明を更に詳細に説明するために、以下に実施例を挙
げる。本発明を実施するための説明および実際の手法を
適当と思われる場所に挿入した。
実施例1 プラスミドPEL103の単離ペストレプト
マイセス・グラニュロルーバAA39912.13/P
EL103 の培養ストレプトマイセス・グラニュロル
ーバ&A39912.13/pEL103(NRRL1
2549)の栄養接種物を、常法により、その株を滅菌
トリブチカーゼ大豆ブロス”)(35グ/l脱イオン水
)5〇−中、液中好気条件下で増殖させることにより調
製した。
このトリブチカーゼ大豆ブロス接種物を30°Cで48
時間インキュベートした。インキュベートした後、この
接種物約10rn1.を滅菌ブロス50〇−に移し、3
0°Cで約20時面インキュベートし:1□:?: た。田の調節は行わなかった6′ブンキユベートしたも
のから、ストレプトマイセス・グラニュロルーバ煮A3
9912.13/PEL103細胞を収穫し、次いてプ
ラスミドDNAを単離することができる。
匂 トリブチカーゼ大豆ブロスはBBL Divisi
on。
Becton−Dickinson & Canpan
y、 Cockeysv…e、 Maryland21
030から入手できる。
B、プラスミドの単離 ストレプトマイセス−グラニュロルーバmA39912
.13/pEL103細胞約121(湿めった重量)を
遠心分離しく10分、4°”−IQOOOrpm)、1
0チグリセリンで洗い、上の条件下で遠心分離して回収
した。TES緩衝液(0,01MトIJス(ヒドロキシ
メチル)アミノエタン〔トリス〕、0.001MEDT
A、34チシユクロース、Fi(8)約504を添加し
、次いで0.25 M EDTA 10m1中のりゾチ
ーム約0.25Pを加えた。この混合物を37°Cで約
15分間インキュベートした後、TE緩衝液(0,OI
M)リス、0.001MEDTA%pH°°10”°”
!J )、、’i”7”、7 X−”°°2約2約°パ
加。得られた混合物を、、約15分間65°Cでインキ
ュベートした。溶解質を遠心分離(45分間、4°c、
18.00Orpm)した後、上澄液をイソアミルアル
コールで4回、クロロホルム−インアミルアルコール溶
液(24:1)で1回抽出した。次いで水相に3M酢酸
ナトリウム0.1容量を加えた後、冷(−20°G)9
5チエタノール3容量を添加した。ドライアイス−エタ
ノール浴中でエタノール沈殿を素早く行ない、DNA沈
殿を遠心分離(15分、4°C,10,000rpm)
で集めた。この沈殿を減圧乾燥し、STE緩衝液(0,
01M ) IJス、0.601MEDTA、    
      。
5iB50.01M  塩化ナトリウム)1.1−に再
懸35.00Orpm)によりてプラスミドDNAを精
製した。遠心分離した後所望のプラスミドpEL103
DNA帯を除き、常法によりエチジウムプロミドを抽出
した。3容量のエタノール中でDNAを沈殿させ、この
様にして分離したプラスミドpEL103DNMr:1
0倍に希釈したTE緩衝液1−に溶解し、−20°Cで
貯蔵した。
実施例2 プラスミドpLR2の組み立てA、プラスミ
ドplJ6のHindnl消化プラスミドp I J 
5 DNA (rhanpsonら、Na t ure
286:525.1980年参照)約20μ1(20μ
y)、BSA(牛血清アルブミン、111Vnl ) 
5 Ill、水19 ply、 HindIII (3
New EnglandBioLabs単位含有)制限
酵素8υ1μl、および反応ミックス約5Kを37°G
で2時間インキュベートした。4M酢酸アンモニウム約
50μlおよび95チエタノール200 tII!を加
えて反応を停止させた。得られた1)NA沈殿物を70
チエタノールで2回洗浄し、減圧乾燥し、TE緩衝液2
0μlに懸濁して一20°Cで貯蔵した。
匂制限酵素は以下の供給者から入手できる:New E
ngl and Bio Labs 、、 Inc 、
 (32Tozer RoadBeverly、 Ma
ssachusetts 01915)、Boehri
nger −Mannheim Biochemica
ls (794l Castleway DriveI
ndianapol i s 、 Indiana 4
6250 )。
細Hind m制限酵素のための反応ミックスは、以下
の成分で調製した: 600mMNaCJ1100mM
トリス−HCJ (PH7,9)、7 Q rnM M
 g C12,16mMジチオトレイット。
B、プラスミドpBR322のHindll消化プラス
ミドPBR322DNA″D約8μl(4μ7)、反応
ミックス5g、BSAC11F9/rnl) 5μ11
水31μrおよび川ndI[制限酵素1μlを37°G
で2時間インキュベートした。60°Gで10分インキ
ユヘートして反応を終結した後、酢酸アンモニウム約5
0μでと95%エタ/−ル200μeを添加した。
得られたDNA沈殿を70チエタノールで2回洗浄し、
減圧乾燥し、水45μlに懸濁した。
匂プラスミドpBR322は前記Boehringer
 −Mannheim Biochemical s 
 から入手できる。
Q  Hind]I消化プラスミドplJ6とpBR3
22の結合(リゲーション) 11indll処理プラスミドpIJ6 (実施例2A
(7)もの)約20117:、 HindllI 処理
プラスミドpBR322(実施例2 B、のもの)り0
μl、BSA(11Ni/rn!、)5g、T4 DN
A  リガニゼ′1)1μl、およびリゲーションミッ
クス″り5μlを16°Gで4時間インキュベートした
。4M酢酸アンモニウム約50xJおよび95係エタノ
ール200紹を加えて反応を終了させた。得られたDN
A沈殿物を70%エタノールで2回洗浄し、減圧乾燥し
、TE緩衝液に懸濁した。この懸濁DNAは所望のプラ
スミド1λ2を構成していた。
Hl)T4DNAリガーゼは前記New Engl a
nd Bi。
I、abs 、 、 Inc 、から入手できる。
m  IJゲーションミックスは以下の成分で調製した
: 500mM l−リフ、 −HCl:(p H7,
8)、200mMジチオトレイット、100mM Mg
Cj’2、l QmM ATIO実施例3  E、 c
ol i K12 HBIOI/PLR2の調製凍結し
たコンピテントイーコリ(E、col i) K12H
BIOI細胞(Bolivarら、Gene 2 : 
75−93 。
1977年参照)を遠心分離によってペレット化し、0
、OIM塩化ナトリウム約10rn!、に懸濁した。次
いで細胞を再び□ペレット化し、0.03M塩化カルシ
ウム約10−に再懸濁し、氷上で約20分インキ−ベー
トし、3o’1目のペレット化を行ない、最後に0.0
3M塩化カルシウム1.25−に再懸濁した。
得られた細胞懸濁液は以降の形質転換を行ない得るもの
(コンピテント)であった。
TE緩衝液中のプラスミドPLR2(実施例2Cのもの
)をエタノール沈殿させ 39mM塩化カルシウム溶液
150μlに懸濁し、試験管中でコンピテントE、co
li K12 HBIOI  細胞約200μlとゆっ
くり混合した。得られた混合物を氷上で約45分、次い
で42°Gで約1分インキュベートした。
次いで、アンピシリンを50μliE/、/含有するL
−ブロス(BertanilJ、Bacteriolo
gy 62 :293.1951年参照)約3rnIを
添加した。この混合物を振盪しながう378Cで1時間
インキユベートシ、アンピシリンを含有しティるし一寒
天(Mi l l er Experimentsin
 MDl ecular Geneti cs 、 (
aid Spring )hrbor Labs 。
Co1d Spring Harbor 、 New 
York参照)上ニノばした。
生存コロニーを選択し、期待した表現型・^−1−5)
を試験した結果、これは所望のE、COI i K12
HB I Q 1/PIA2形質転換体を構成していた
実施例4 プラスミドp LRlの組み立てプラスミド
pIJ2(ThanPSOnら、Nature 2−8
6−:525.1980年参照)をプラスミドplJ6
の代りに使用するほかは実施例2ANCと同様にしてプ
ラスミドpLR1を調製した。この所望のプラスミドp
LR1をTE緩衝液に懸濁した。
実施例5  E、col i K12 HBIO1/p
LR21の調製プラスミドp Li2の代りにプラスミ
ドpLRlを形質転換に使用する以外は実施例3と同様
にして調製を行なった。生存コロニーを選択して期待さ
れる表現型(AmpR,Tet’)を試験した結果、所
望のE、col i K12 HBIOI/PLRI形
質転換体を構成していた。
実施例6 プラスミドpEL107およびpEL105
の組み立て 八 プラスミドp LR2のBamH1消化および〜1
.6Kbチオストレプトン耐性付与フラグメントの単離 プラスミドp Li2 DNA約50μm、反応ミツク
オ010 xi 、 BSA(IWIi/WJ) 10
 pi: 、水29 pl、オヨびBamHI  制限
酵素1 pl (4単Vμl)を3700で2時間イン
キュベートした。同容量の4M酢酸アンモニウムおよび
2.5容量の95係エタノールを加え、その混合物を一
20°Gで約18時間冷却してDNAを沈殿させた。こ
のDNA沈殿物を遠心分離して集め、TE緩衝液約50
μl に懸濁した。このDNA懸濁液から、常法により
、ゲル電気泳動によって所望の〜1,5KbBamHI
制限フラグメントを単離した。単離後、このフラグメン
トを、次の工程の結合のために、TE緩衝液約20μl
に再懸濁した。
−4BamH1制限酵素のための反応ミックスは以下の
成分で調製した: 1.5 M Nap/、60mM)
リス−HCI(pH7,9)、5 Q rnM M g
 C/ 2゜B、プラスミドPEL103の部分的Ba
mHI 消化プラスミドpELIQ3 DNA約20μ
グ、反応ミックス10μ/、 BSA(1!/mA) 
10μl、水39μl。
およびBamHI  制限酵素(酵素2μlを水8μe
に希釈して調製する)1μlを周囲温度で約15分間イ
ンキュベートした。同容量の4M酢酸アンモニウムおよ
び2容量の95%!タノールを加え、この混合物を約1
8時間−20°Gに冷却してDNAを沈殿させた。DN
A沈殿物を遠心分離して集め、70チエタノールで洗い
、減圧乾燥した後TE緩衝液約50μlに懸濁した。
q 結合(リゲーション) 部分的に消化したプラスミドpELIQ3DNA約20
μm、プラスミドpIJL 2 (7)〜l、5 K 
b B a mHl制限フラグメント10μグ、リゲー
ションミックス5μ11BSA(IF/If/i)5μ
l、水10μl およびT4DNAIJガーゼ1μlの
混合物を166Cで約4時間インキュベートした。4M
酢酸アンモニウム40μl および冷エタノール200
μlを添加した後、この混合物を約18時間−20°C
に冷却してDNAを沈殿させた。このDNA沈殿物を遠
心分離して集め、70%エタノール中で洗浄し、再び集
め、次の形質転換工程のために培地P (Hopwoo
dおよびWright、J 0Molecular a
nd General Gen−etics 162:
307、” 1978年参照)501?に懸濁した。 
     : ■、。
可能性のあるPELI($3制限フラグメントの内、ど
のフラグメントが〜1,5KbBamHIチオストレプ
トン耐性付与フラグメントと結合するかによって、種々
のタイプの組替えプラスミドが生成する。
プラスミドpEL103の〜2,8KbBamHI制限
フラグメントに結合すると所望の〜4,4Kbプラスミ
ドpEL107およびpEL105が得られる。〜1,
6xbBamHI耐性付与フラグメントはどちらの方向
にも向くことができるので、2方向の組替えプラスミド
が生成する。プラスミドpEL107およびpEL10
5の各々の制限サイトおよび機能地図を第8図に示す。
プラスミドPEL103の部分的BamHI 消化によ
り、互いに、そしてまた1またはそれ以上の耐性付与D
NAフラグメントと結合し得る種々の制限フラグメント
の混合物が生成し、従っていくつかのその他の組替えプ
ラスミドが得られることは当業者には容易に理解される
であろう。このその他のプラスミドも、〜2.8KbB
amHI複製起原含有フラグメントを含んでいる限り、
本発明の組み立てを例示するのに使用することができる
。上記のその他のプラスミドは、適当な宿主細胞に常法
に従って導入することができ、制限酵素およびゲル電気
泳動分析によって同定することができる。
実施例7 5treptanycesaniofaci
en仲ELIQ7およびS、ambofaciens/
pEL105の調製実施例6CからのDNA約20μグ
およびストレプトマイセス・アンボファシエンスゞυ(
S、anbo[aci−ens)のプロトプラスト(B
alLz、 J、ofGeneral Micro−b
iology 107 : 93.1978年参照)1
x109 を使って、国際特許出願APCT/GB79
100095(国際公開/KW079101169 )
の実施例2の方法に従って表記の調製を行なった。
凪)この株は前記NRRLに寄託されており、NRRL
2420の番号で誰でも利用可能である。
再生プロトプラストに改良R2培地(Baltz。
J、of General Microbiology
 107 : 93.1978年参照)トップ寒天(最
終的なプレート濃度を50μり/vnl にするに十分
なチオストレプトンを含有している)を積層することに
より、所望の形質転換体をチオストレプトン耐性によっ
て選択する。
得られた5treptanyces ambofaci
ens /pEL 107およびS 、anthofa
ciens /pELIQ5チオストレプトン耐性コロ
ニーを既知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの
制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定した。
従って、最終濃度を50μP/TrJにするに十分なチ
オストレプトンを含有しているトリブチカーゼ大豆ブロ
スに接種することにより、異なった単離されたコロニー
の栄養接種物(10mj)を常法により調製する。接種
物をいくつか調製し、全ての所望の形質転換体タイプの
ものおよび構成プラスミドが単離されるまで以下の操作
を行なう。即ち、細胞が十分増殖するまで30°Gでイ
ンキュベートした後、細胞含有ブロス6−を遠心分離す
る。得られたペレットをTE緩衝液で洗浄し、再びペレ
ット化し、50mMトリX (pH8,0)400μJ
  に懸濁する。次いで0.25 M EDTA約80
μ11RNase 20111およびりYチーム100
#J(101Rg/、/ T E )を加える。この混
合物を37°Gで約15分間インキュベートし?、=1
..10%トリトンX−100約10pl;および5M
NaCJ15045を加え、60°Cで15分インキュ
ベートする。得られた溶解質を遠心分離しく15分、4
°G115,000rpm)ムーイソアミルアルコール
溶液(24:1)で1回抽出した後エタノール沈殿させ
る。構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定は、
常法により、制限酵素およびゲル電気泳動分析により行
なう。
実施例8 プラスミドPEL109およびpELl 1
0の組み立て 八 プラスミドpLAlの部分的BamHI消化および
〜3,4Kbネオマイシン耐性付与フラグメントの単離 実施例6Bと実質的に同様にして、所望の部分的消化お
よび単離を行なう。〜3,4 Kb BamHI 制限
フラグメントをTE緩衝液約20μlに懸濁し、以下の
結合を行なう。
B、結合(リゲーション) 実施例6Cとi質的に同様にして、〜3,4KbBam
1・、・。
HIネオマイシン耐性付与制限フラグメントを、部分的
にBamHI消化したプラスミドpEL103(実施例
6Bで製造)と結合させる。
可能性のあるpEL103制限フラグメントの内、どれ
が〜3,4 Kb BamHIネオマイシン耐性付与フ
ラグメントと結合するかによって種々のタイプの組替え
プラスミドが生成する。プラスミドpEL103の〜2
.8KbBamHI制限フラグメントに結合すると、所
望の〜6.2KbプラスミドpEL109およびpEL
lloが生成する。〜3,4 K b B am HI
耐性付与フラグメントはどちらの方向にも向くことがで
きるので、2方向の組替えプラスミドが生成する。
プラスミドp ELI O9およびpELlloのそれ
ぞれの制限サイトおよび機能地図を第9図番こホす。
実施例6Cに記載した様に、上記の方法で〜2.8Kb
BamHI複製起原含有フラグメントを含んでいるその
他の組替えプラスミドが生成し得ることは、当業者に容
易に理解される所であろう。これらのプラスミドは、本
発明の組み立てを更に例示するのに使用することができ
る。上記のその他のプラスミドは、常法に従って導入す
ることができ、制限酵素およびゲル電気泳動分析によっ
て同定することができる。
実施例9 5treptanyces anfx+fa
ciens/pEL109およびS、ambofaci
ens/pEL110の調製国際公開AW079101
169(国際特許出願点PCT/GB 7910009
5 )の実施例2に開示の方法に従って、実施例8から
のDNA約20μmおよび5treptanyces 
ambofaciens (NRRL FL24 ’I
 Q )のプロトプラストI×108を使って、所望の
組み立てを行なう。再生プロトプラストに改良i2培地
トップ寒天(最終プレート濃度を1μか−とするに十分
なネオマイシン”υを含有している)を積層することに
より、所望の形質転換体をネオマイシン耐性によって選
択する。
得られたStreptomyces ambofaci
ens/pELI Q9およびS、aI′rbofac
iens/pEL110ネオマイシン耐性コロニーを既
知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの制限酵素
およびゲル電気泳動分析によって同定する。チオストレ
プトンの代りにネオマイシン(1μり/−)をトリブチ
カーゼ大豆ブロスに添加するほかは実施例7に記載の方
法に従って、構成プラスミド、従って形質転換体の同定
を行なう。
磁)抗生物質ネオマイシンは、Sigma(SL。
Louis、 Missouri)から入手できる。
実施例10  プラスミドPEL113およびpELl
 14の組み立て 実施例1に記載の方法に従って、Streptanyc
esambofaciens/PEL107 (実施例
7で調製)からプラスミドpEL107を単離し、実施
例6Bの方法に従ってBamHI制限酵素で部分消化す
る。実施mCと実質的に同じ方法で、この部分的Bam
HI 消化物をプラスミドpLR1の〜3,4Kbネオ
マイシン耐性付与BamH1フラグメント(実施例8A
で調製)と結合させて所望のプラスミドを得る。プラス
ミドPEL107は、ネオマイシン耐性フラグメントの
挿入の為の、1以上のBamH1制限サイトを持ってい
るので、プラスミドPEL113およびPE上114の
挿入異性体も生成する。〜3,4KbBamHlネオマ
イシン耐性付与フラグメントは両方向に向くことができ
るので、2方向の郷替えプラスミドが生成する。プラス
ミドpEL113およびpEL114のそれぞれの制限
サイトおよび機能地図を第10図に示す。
実施例11  Streptanycesambofa
ciens/pEL113およびSo、vnbo[ac
iens/pEL114 (7)調製国際出願AW07
9101169(国際特許出願人PCT/GB 791
00095 )の実施例2に記載の方法と実質的に同じ
方法で、実施例10のDNA20μmおよび5trep
tanyces arcbofaciens(NRRL
 A 2420 )のプロトプラストl×108を使っ
て所望の調製を行なう。実施例7および9に記載した方
法で、先づチオストレプトン耐性、次いでネオマイシン
耐性で所望の形質転換体を選択する。得られた5tre
ptanyces arflbofaciens/pE
L l l 3およびS、amboE−aciens/
pEL114チオストレプトン並びにネオマイシン耐性
コロニーを既知の方法で単離し、培養し、構成プラスミ
ドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定する。
構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定は、ネオ
マイシン(1μm/−)お、:( よびチオストレプトン(50μP/ln/)の両方をト
リプヂカーゼ犬豆ブロスに添加するほかは実施例7と実
質的に同じ方法で行なう。
実施例12 プラスミドpEL115およびpEL11
6の組み立て プラスミドpEL107の代りにプラスミドPEL10
5を部分的BamHI消化に使用するほかは実施例10
と実質的に同様番こして、所望のプラスミドを組み立て
る。プラスミドp ELI 05は、ネオマイシン耐性
フラグメント挿入のための1以上のBamHI 制限サ
イトを持っているので、プラスミドpEL115および
pEL116の挿入異性体も生成する。〜3.4KbB
amHlネオマイシン耐性付与フラグメントはどちらの
方向にも向き得るので、2方向の組替えプラスミドが生
成する。プラスミドpEL115およびPEL116の
それぞれの制限サイトおよび機能地図を第11図に示す
実施例13 Streptomyces ambofa
ciens /pEL115およびS、anbofac
iens /pEL116の調製実施例11と同様にし
て、実施例12のDNA20μグを使って所望の調製を
行なう。得られた5treptanyces ambo
faciens /pEL115およびS、anbo−
[aciens /pEL 116チオストレプトン並
びにネオマイシン耐性コロニーを、既知の方法で単離し
、培養し、実施例11と実質的に同じ方法で、構成プラ
スミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定す
る。
実施例14 プラスミドpEL121およびpEL12
2の組み立て 所望のプラスミドは、実施例6Gの結合法に従って、プ
ラスミドpEL107の部分的B am HI消化物を
、BamHI 消化プラスミドpBR322に結合させ
ることによって得られる。実施例1の方法に従って、5
treptanyces Mrbofaciens /
pEL107 (実施例7で調製)からプラスミドpE
L107を単離し、実施例6Bに従って部分的BamH
1消化する。Hind II制限酵素の代りにBamH
I制限酵素を使用する以外は実施例2Bと同様の方法で
、BamHI消化プラスミドpBllL322を調製す
る。所望のプラスミドDNAを遠心分離して集め、70
チェタ/−ルで洗浄し、減圧乾燥し、TE緩衝液50μ
ziこ懸濁する。プラスミドpEL107は、制限プラ
スミドpBfL322挿入のための1以上のBamHI
  制限サイトを持っているので、プラスミドp EL
121およびpEL122の挿入アイソマーも生成する
。制限プラスミドpBR322はいづれの方向も向き得
るので、2方向の組替えプラスミドが生成する。プラス
ミドpEL121およびpEL122の制限サイトおよ
び機能地図を第12図に示す。
実施例15  E、coli K12 HBIOI/P
EL121 およびE、col i K12 HBIO
I/PEL122の調製プラスミド−p Li2の代り
にプラスミドPEL121およびpEL122を形質転
換に使用するほかは実施例3と同じ方法で、所望の表記
の調製を行なう。
生存コロニーを先づ選択し、期待される表現型(Amp
’、 Te t S)を試験し、構成プラスミドの制限
酵素およびゲル電気泳動分析により、所望のE、col
iK12 HBIOI/pEL121およびE、col
 i K12 HBIOI/pEL122形質転換体で
あることを常法により確認する。
実施例16 プラス・ミ□す・ドpa1−15の単離へ
 Bacillus subtillisM1112/
pHI 16の培養PAB寒天Cll天15 F!/l
、クロラムフェニコール10,1/m!含有PAB”l
) CPenassay broth) )に植えつけ
ることにより、常法通りBacillus sub−t
illisM1112/PHI−16(NRRL B−
12597)の栄養接種物を得た。接種プレートを37
°Gで約18時間インキュベートした後、1個のコロニ
ーを選択し、10μg/rnlのクロラムフェニコール
を含有する滅菌PAB培地500.nlに接種した。得
られた接種ブロスを37°Gで約18時間インキュベー
トした物から、Bacillus 5ubtillis
 Ml 112/pHl−16細胞を収穫し、プラスミ
ドDNAを単離することができる。
m PABはDi fco Laboratories
(Detroit 、Mich−igan)から入手で
きる。
B、プラスミドの分離 遠心分離(10分、4°C:、10,000rPm)に
よってBacil lus sugt if is M
l 112/PHI−15細胞約10□ 1(湿めった重量)を集め、TES約50−で洗浄し、
再び遠心′益−シて集めた。このペレットに、25q6
のシュクロースを含むTE緩衝液約20rnlを加え、
次いで水250μl中のりゾチーム約10■を加えた。
この混合物を37°Cで約30分間インキュベートし、
次いでRNa s e  約100単位を添加した。こ
の混合物を37°Cで30分間インキュベートし、5D
S(ドデシル硫酸ナトリウム)および塩化ナトリウムに
ついてそれぞれ1チ、IMとした後、水浴に入れて約3
時間冷却した。溶解質を遠心分離(30分、4°C11
9,000rP) した後、上澄液に1゛Eを加えて3
168−とし、セシウムクロライド28.7S’および
エチジウムブロマイド0.4m/(10WVnl)を添
加した。これをセシ勾 16時間)にかけた。プラスミド帯を集め、55.00
0rpnで16時間遠心分離して集め、同容量のイソア
ミルアルコールで3回抽出し、希釈TEで透析し、エタ
ノール沈殿させ、TE400μlに再懸濁−した。得ら
れたプラスミドpHl−15DNAは、使用するまで4
°Gで保存した。
プラスミドpHl−16の〜0.74 Kb Hpa 
1175グメント内にカナマイシン耐性遺伝子が含まれ
ている。従って、HpalI制限酵素で処理した後結合
させると、カナマイシン耐性遺伝子のない、pHl−1
8と命名した〜3.gicb3チスミドが得られる。
プラスミドpHI −18組み立てについて以下に詳述
する。
実施例17 プラスミドpH1−18の組み立て八 プ
ラスミドpH1−15の部分的Hpa II消化プラス
ミドpHl−15DNA約5μ1(25μ7)、B 5
 A 1 ttl (2m97m1 )、水37 tt
l 、 HpalI(2Fi4ew England 
Bio Labs単位)制限酵素2 plおよび反応ミ
ックス雉)5μlを37°Cで1時間インキュベートし
た。65°Gで10分加熱して反応を終結した後、95
係エタノール2容量を添加してDNAを沈殿させた。得
られたDNA沈殿物を70係エタノールで洗浄し、減圧
乾燥し、TE緩衝液5μlに懸濁し、使用するまで4°
Gで貯蔵した。
(社)Hpau制限酵素のための反応ミックスは以下の
成分で調製した: 5 QmM KC:(3,100m
Mトリス−HCl (pH7,4)、100mM Mg
CJ2、lQmMジチオトレイット。
B、7” 5スミ)’pHl−168paII消化物の
結合プラスミドpf(I−15Hp a IF消化物(
実施例17Aで調製)約5μJ、”I”4DNAリガー
ゼ2μlおよびリゲーションミックス0υ43μl を
約16°Cで約18時間インキュベートした。3M酢酸
ナトリウム約5μlと95チエタノール150μlを加
えて反応を停止させ、所望のDNA沈殿物を70%エタ
ノールで洗浄し、減圧乾燥し、TE緩衝液10μlに懸
濁し、使用するまで4°Cで貯蔵した。
Xυ リゲーションミックスは以下の成分で調製した:
 55 mM トリス−HC:J(PH7,8)、lQ
mM ジチオトレーイツト、5.5 rnM M g 
CZ 2.4mMATP実施例18  Bacillu
s 5ubtilis M1112/PH1−18の調
製 Bacillus 5ubtilis M1112は、
常法書こより、B。
5ubt市s MII 12/pH1−15(NRRL
 B−12597)をクロラムフェニコールの非存在下
で培養することにより得ることができる。B、5ubt
ilis MI 112/PH11 一16細胞は、この培養条件下では自動的にpHl−1
6プラスミドを失ない、所望のクロラムフェニコール感
受性のB、5ubtilis M1112株が生成する
バチルス形質転換操作斎こ於いて、このプラスミドを欠
(B、5ubt山S M1112だけが選択され、使用
されることを試験し、確実にするために、タロラムフェ
ニコールに対する感受性を利用し得ることは、当業者に
は明らかであろう。
滅菌PAB約50.nlにBacillus 5ubt
iIis M1112を接種し、細胞密度が2×108
細胞/rn1.になるまで37°Cでインキュベートし
た。この細胞をペレット化し、次いでSMMP(同容量
の各々4 X PABおよヒ1.0 Mシュクロース、
0.04Mマレイン酸、および0.04 M MgCJ
2からナル溶液(NaOHでpH6,5に調節))約5
−に再懸濁することにより、滅菌的に細胞をプロトプラ
スト化した。次いでリゾチーム(SMM((15Mシュ
クロース、0.02Mマレイン酸および0.02MMg
C12、N a OHテP )lB、5に調節)中、2
0〜/、Z)約250μバp過滅菌して加えた。細胞を
37°C約2時間、ゆっくり振盪し′1・1 てインキュベートじだ占得られたプロトプラストをペレ
ット化し、SMMP5−で洗い、SMMP5./に再懸
濁した。遠心分離(25°G、12分、2600rpm
) シた後、プラスミドpHI −18DNA (実施
例17で調製〕オヨび2X SMM (7)1 : 1
混合物約2゜μlを加えて仁のプロトプラスト約0.1
−を形質転換した。PEG溶液(PEG6000(ポリ
エチレングリ:I−ル:1405’、2X SMM 5
0.z、水ヲ加工て100rn!、)約1.5−を直ち
に加え、約2分後にSMMP5.nlを加えた。次いで
このプロトプラストをペレット化し、SMMP 1rn
lに懸濁し、ゆっくり振盪させながら約2時間30’C
でインキュベートした。この様にして調製した懸濁液の
一部を、1で当たり以下の成分を含有しているクロラム
フェニコール含有0M3再生培地に植えた:寒天127
を含有している脱イオン水′555−中のD−マンニッ
ト911.10%カザミノ酸5O−11oチ酵母エキス
5O−12oチグルコース25−15チ燐酸ジ力リウム
100m/、IMMfc/220m/、10%ゼラチン
200m/、10〜クロラムフエニコール。D−マンニ
ット、カザミノ酸および酵母エキスは一緒に圧熱滅菌し
た。圧熱滅菌した後ゼラチンを直ちに加え、残りの成分
はこの混合物を冷却した後に加えた。この培地の最終的
なりロラムフエニコール濃度は10μy/rnlテあっ
た。
クロラムフェニコール耐性コロニーを、カナマイシン感
受性について試験した。クロラムフェニコール耐性でカ
ナマイシン感受性コロニーハ、所望のBacillus
 5ubt市s Ml 112/pHl−18株としテ
選択された。この株を培養し、常法通り構成プラスミド
の制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定確認した
実施例19 プラスミドpBs lおよびpH53の組
み立て プラスミドPEL105 (実施例と同様にして、△ Streptomyces ambofaciens/
pEL105 (実施例7で調製)から常法により単離
)約lOμJ(5μi)、BS A (1mW/mt 
) 2μ11水29 μl、 BamHI (水で1:
4に希釈)制限酵素、および反応ミックス′)5μlを
25°Cで15分間インキュベートした。4M酢酸アン
モニウム約50μl と95係エタノール300μlを
加えて反応を停止させた。
−20°Cに2時間冷却した後、得られたDNA沈殿物
を遠心分離によって集め、70チエタノール中で2回洗
浄し、減圧乾燥し、TE緩衝液約10μlに懸濁した。
プラスミドPEL105は2つのBam H1制限サイ
トを持っているので、種々のフラグメントの混合物が生
成する。
Xi) BamHI制限酵素のための反応ミックスは、
以下の成分で調製した: 1,5MNaC1!、59m
M )リス−HC1!(pH7,9)、5 Q rnM
 M g C/ 2゜B、 プラスミドpH1−18の
B油■消化フ5 x ミt’ pH1−18約5μ/ 
(5,uy)、BSA(1”9/mj) 2 til、
水9μl、BamHI(4単’tV111)制限酵素1
μlおよび反応ミックス1.5μlを370Cで約2時
間インキュベートした。同容量の4M酢酸アンモニウム
および2.5容量の95チエタノールを添加した後、と
の混合物を一206Cに約18時間冷却してDNAを沈
殿させた。遠心分離によってDNA沈殿物”l’+集め
、70%エタノールで洗い、TE緩衝液約10μlに懸
濁した。
q 結合(リゲーション) BamHI消化プラスミドpHl−1s (実施例18
Bにより調製)約5μ11プラスミドPEL1o5B罰
■部分的消化物(実施例18Aで調製)8μl、水27
μJ、ATP5μl: (4mM )、リゲーションミ
ックス5μlおよび”I’4ONAリガーゼ2μlを1
6°Q約18時間インキュベートした。4M酢酸アンモ
ニウム5ON!および95%エタノール200μlを加
えて反応を停止させた。−20’Cで約2時間インキュ
ベートした後、所望のプラスミドpBslおよびpH5
3DNA沈殿物を遠心分離して集め、70%エタノール
で洗い、減圧乾燥し、TE緩衝液10g に懸濁し、使
用するまで4°Cで貯蔵した。
プラスミドPEL105には2つのBamHI制限サイ
トがあるので、部分的BamHI消化により2個の〜4
.4Kb BamHIフラグメントが生成する。従って
、上記の操作によってプラスミドpBs lおよびPB
S3の挿いアイッ2=4!成t6゜8つ、1郵1ワ。、
いはいづれの方(3”’計も結合することができるので
、2方向の組替えプラスミドが生成する。プラスミドp
Bs lおよびpH53のそれぞれの制限サイトおよび
機能地図を第6図に示した。
実施例20 プラスミドPB52およびpBS4の組み
立て B amHI  消化プラスミドpHl−15をプラス
ミドpHI −18の代りに用いるほかは実施例19A
−Cと同様にして、所望の表記の組立てを行なう。
プラスミドpEL105は2つのBamHI制限サイト
を持っているので、部分的BamHI消化によって2個
の〜44 Kb BamHlフラグメントが生成する。
従って、上記の操作によりプラスミドPBS2とpH5
4の挿入アイソマーも得られる。BamH珊J限DNA
はいづれの方向にも結合することができるので、2方向
の組替えプラスミドが生成する。プラスミドpBS 2
およびpBS 4のそれぞれの制限サイトおよび機能地
図を第7図に示した。
実施例21 プラスミドpBS5およびpBs5の組み
立て プラスミドPEL105とpH1−18の代りにプラス
ミドpEL110とp)(I−15を使用するほかは実
施例19A−Cと実質的に同様にして表記の組み立てを
行なう。プラスミドpEL110は、実施例1と同様に
して、5trepta′rryces ambofac
iens/pELl 10 (実施例9で調製)から常
法により単離する。
プラスミドpEL110には2つのBamH1制限サイ
トがあるので、部分的B am HI  消化によって
2つの〜6.2 Kb BamHIフラグメントが生成
する。従って、上記の操作によってpH55とpH56
の挿入アイソマーも得られる。B am HI制限DN
Aはいづれの方向にも結合し得るので、2方向の組替え
プラスミドが生成する。プラスミドpBs5およびpB
S6のそれぞれの制限サイトおよび機能地図を第13図
に示した。
実施例22 プラスミドpBS7およびpBs8の組み
立て プラスミドpEL105およびpHl−18の代りにプ
ラスミドpEL113およびpH115を用いるほかは
、実施例19A、−C,と同様の方法で表記の組み立て
を行なう。プラスミドpEL113は、実施例1と同様
にしてStreptcmyces arnbofaci
ens/pEL113 (実施例11で調製)から常法
により単離する。
プラスミドpEL113は、3つのBamHIigI限
サイトを持っているので、部分的BamH1消化によっ
て3つの〜7.8Kb BamHIフラグメントが生成
する。
pH58の挿入アイソマーも得られる。BamH1制限
DNAはいづれの方向にも結合することができるので、
2方向の組替えプラスミドが生成する。プラスミドpB
57およびpBs8のそれぞれの制限サイトおよび機能
地図を第14図に示す。
実施例23 プラスミドpBS9およびPBSIOの組
み立て プラスミドPEL105およびpH1−18の代りにプ
ラスミドPEL122およびpHl−15を用いるほか
は実施例19A−Gと実質的に同様にして、表記の組み
立てを行なう。プラスミドpEL122は、E、col
iに12HB101/pEL122 (実施例15で調
製)から常法により単離する。   ′。
プラスミドPEL122は3つ、1のBamHI制限サ
イト:11 を持っているので、部分的BamHI消化により3つの
〜8.7 K b BamHIフラグメントが生成する
。従って、上記の操作によってpBs9およびpBsl
Qの挿入アイソマーも生成する。BamHI制限DNA
はいづれの方向にも結合し得るので、2方向の組替えプ
ラスミドが得られる。プラスミドpBS9およびプラス
ミドpBslQのそれぞれの制限サイトおよび機能地図
を第15図に示す。
実施例24  Bacillus 5ubtilis 
M1112/pBs1およびBacillus 5ub
tilis M1112/pBS3 ノ調製プラスミド
pHl−18の代りに、プラスミドpB51およびpH
83(実施例19で調製)からなるDNAを用いるほか
は、実施例18と実質的に同じ方法で、所望の表記の調
製を行なう。得られたBacillus subtiM
s Ml 112/PBS 1およびBacillus
subtilis M1112/PBS3クロラムフェ
ニコール耐性並びにカナマイシン感受性形質転換体コロ
ニーを既知の方法で分離し一培養し、常法に従い、構成
プラスミドの制限溝□“素およびゲル電気泳動分析に1
1: よって同定する。′□°” 実施例25  Bacillus 5ubtilis 
M1112/PBS2およびBacillus 5ub
tilis Mll 12/PBS4の調製プラスミド
pHl−18の代りに、プラスミドpBS2およびpB
S4 (実施例20で調製)からなるDNAを用いるほ
かは、実施例18と実質的に同じ方法で、表記の調製を
行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーを
選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験する
。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性のBa
cillussubLi1isMIl12/pBs2お
よびB、5ubtil is Ml 112/pBs 
4形質転換体を常法により単離し、培養し、構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、常法に
従って同定する。
実施例25  Bacillus 5ubtilis 
M1112/pBS5およびBacillus 5ub
til is M1112/pBs6 (y)調製プラ
スミドpH1−18の代りにプラスミドpBS5および
pBS6 (実施例21で調製)からなるDNAを使用
するほかは、実施例18と実質的に同じ方法で表記の調
製を行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーを選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験
した。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性の
Bacillus 5ub−1ilis M1112/
PBS5および3.5ubtilis M1112/p
BS5形質転換体を常法に従って分離し、培養し、構成
プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、
常法に従って同定する。
実施例27  BacillussubtilisMI
l12/pBS7およびBacillus 5ubti
lis M1112/pBSB (7)調製プラスミド
pHl−1gの代りにプラスミドpBs 7およびpB
s8  (実施例22で調製)からなるDNAを使用す
るほかは、実施例18と実質的に同じ方法で表記の調製
を行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニー
を選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験し
た。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性のB
acillus 5ub−tilis M1112/争
BS7およびB、5ubLilis M1112/PB
S8形質転換体を常法に従って選択し、培養し、構成プ
ラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、常
法に従って同定する。
実施例2 g  Bacillus 5ubtilis
 Mil12/pBS9およびBacillus 5u
btilis M1112/PBSIOノ調製プラスミ
ドpHI=18の代りにプラスミドpBS9およびpB
slo(実施例23で調製)からなるDNAを使用する
ほかは、実施例18と実質的に同じ方法で表記の調製を
行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーを
選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験した
。この推定上のクロラムフェニコールおよびカナマイシ
ン耐性のBacillus 5ubtilis M11
12./PBS5およびB、5ubtil 15M11
12/PBS6形質転換体を常法に従って選択し、培養
し、構成プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析
により、常法に従って同定する。
実施例29  Streptcmyces amboE
aciens /pBS lおよびS、grrbofa
ciens/pBS3 (y)調製実施例19のDNA
約20 μPおよびStreptp−myces ar
rt+ofaciens (NRRL A2420 )
のプロトプラスト1×108を使い、国際公開AW07
9101169(国際特許出願点PCT/GB 791
00095 )、実施例2の方法に従って表記の調製を
行なう。再生プロトプラストに改良R2培地トップ寒天
(最終プレート濃度を50μm/rnlにするに十分な
チオストレプトン含有)を積層することにより、所望の
形質転換体をチオストレプトン耐性iこついて選択する
。得られた5treptanyces anthOfa
ciens/pBS 1およびS、antx*faci
ens/pBS3チオストレプトン耐性コロニーを既知
の方法で分離し、培養し、実施例7と同様に構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析によって同定す
る。
実施例30 5treptanyces ambofa
ciens /pBs2およびS 、aTIbofac
iens/pBS 4の調製実施例20からのDNA約
20μグおよび5tre−ptanyces ambo
faciens (NRRL A2420 )のプロト
プラスト1×108を使って、国際公開点WO7910
1169(国際特許出願/F)、PCT/GB7910
0095λ実施例2、の方法に従って表記の調製を行な
う。
再生プロトプラストに改良R2培地トップ寒天(最終プ
レート濃度を50μグ/−にするに十分なチオストレプ
トン含有)を積層することにより、所望の形質転換、体
をチオストレプトン耐性について選択す、。得I’ll
:らtLf: 5treptanyces ambof
aciens/PBS2耐性コロニーを既知の方法で分
離し、培養し、実施例7と同様に構成プラスミドの制限
酵素およびゲル電気泳動分析によって同定する。
実施例31 5treptauyces arItho
faciens/pBS5およびS、ambofaci
ens/pBS5 cr)調製実施例21のDNA約2
0μグおよびStreptom−yCei ambof
aciens (NRRL A2420 ) (7)プ
ロトプラストI×108を使い、国際公開AWO791
01169(国際特許出願&PC:T/C,B7910
0095)、実施例2、の方法に従って表記の調製を行
なう。再生プロトプラストに改良R2培地トップ寒天(
最終プレート濃度を1μY、Mにするに十分なネオマイ
シン含有)を積層することにより、所望の形質転換体を
ネオマイシン耐性について選択する。得られた5tre
ptanyces ambofaciens/pBS5
およびS、am−bofaciens/pBS5ネオマ
イシン耐性コロニーを既知の方法で分離し、培養し、実
施例9と同様に構成プラスミドの制限酵素およびゲル電
気泳動分析によって同定する。
実施例32 5treptanyces ambo[a
ciens/pBS7およびS、anthofacie
ns/pBS8 (7)調製実施例22のDNA約20
μ7およびStrepto−myces arrtho
[aciens (NRRL 42420 )のプロト
プラスト−×10 を使い、国際公開点WO79101
169(国際特許出願應PCT/GB79100095
)、実施例2、の方法に従って表記の調製を行なう。実
施例7および9の方法に従い、所望の形質転換体を先づ
チオストレプトン耐性について、次いでネオマイシン耐
性について選択する。
得られた5treptanyces 21′fIbof
aciens/pBS7およびS、7)oEacien
s/pBS8チオストレプトン並びにネオマイシン耐性
コロニーを既知の方法で分離し、培養し、実施例11と
同様に構成プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分
析によって同定する。
実施例33 5treptcnvyces arrbo
faciens/pBS9およびS、anttofac
iens/pBS I Qの調製実施例23のDNA約
20μ7およびStrepto−myces arit
*ofaciens (NRRL A2420 )のプ
ロトプラスト1×108 を使い、国際公開点WO79
101169(国際特許出願應PCT/GB79100
095)、実施例2、の方法に従って表記の調製を行な
う。再生プロトプラストに改良R2培地トップ寒天(最
終プレート濃度を50μm/−にするに十分なチオスト
レプトン含有)を積層することにより、所望の形質転換
体をチオストレプトン耐性について選択する。
得られた5treptanyces ambofaci
ens/pBS9およびS、aIrbofaciens
/pBs 10 チオストレプトン耐性コロニーを既知
の方法で分離し、培養し、実施例7と同様に構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析によって同定す
る。
実施例34  E、coli K12 HBIOI/P
BS9  およびE、coli K12 HBIOI/
PBSIOの調製プラスミドpLR2の代りに実施例2
3で調製したDNAを形質転換に使用する以外は、実施
例3と実質的に同様にして表記の調製を行なう。生存コ
ロニーを先づ選択し、期待される表現型(Am4l’e
tS)について試験し、常法に従い、構成プラスミドの
制限酵素およびゲル電ネ泳動分析により、所望のE、c
oli K12 HBIQl/卆BSg  およびE、
coliK12 HBIOI/pBs10形質転換体で
あることを確認する。
以上述べた方法で調製し得るその他の代表的なプラスミ
ドおよび形質転換体をそれぞれ表■および表■に示す。
本発明の目的からして、表Iに挙げたPBSプラスミド
は、個々の調製の際に得られる挿入アイソマーを包含し
ている。
□ 11:。
表■ 代表的なプラスミド (社)実施例35〜49において、最初に挙げたプラス
ミドは pELチオストレプトンまたはネオマイシン耐
性遺伝子がpHIカナマイシンまたはクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子と反対(隣接していない)の配向をとっ
ており、2番目のプラスミドはその逆の配向をとってい
る。
実施例50〜57においては、最初に挙げたプラスミド
はpHI PvullサイトがpBRHind III
サイトに隣接している配向をとっており、2番目のプラ
スミドはその反対の配向をとっている。
実施例58および59においては、最初に挙げたプラス
ミドはpHI Xb a IサイトがpBRPvuII
サイトに隣接している配向をとっており、2番目のプラ
スミドが逆の配向をとっている。
表■ 代表的な形質転換体 1、  Bacillus R/pR1(コこでkは5
ubtilis。
5ubtilis M1112、RUB 331、th
ur ingiens i s 。
megateriun、cereus、 popill
ae、 1aterosporus。
またはamylol 1qui faciensであり
、1は独立して表Iの実施例35〜59に挙げたpBS
プラスミドのいづれかである)。
2.Streptcmyces R2/pR”    
(ココテR”ハanbofaciens、 fradi
ae、 coelicolor、 aureofaci
ens。
granuloruber 、または1ividans
 テ;y)す、R1は独立して前記と同意義である)。
3、  E、coliR3/pR’    (ココテR
3ハに12、K12 HBIOI、Kl、9 RV30
g、c6001tk−Mk−; t fニーはに12 
C600であり、dは独立して表■の実施例48〜59
に挙げたPBSプラスミドのいづれかである。
【図面の簡単な説明】
第1図はプラスミドpEL103の制限サイトおよび機
能地図を示す模式図であり、以下同様に第2図〜第15
図はそれぞれプラスミドpIAl 、PLJL2、pH
1−15、pHl−18、pBslとpBS3、PBS
2とpB54%pEL107とpEL105、PF、L
i2OとpELllo、PEL113とpEL114、
PEL115とpE私116、pEL121とpEL1
22、pBS5とpBS5、pBS7とpBsg、およ
びpBs gとpBS I Qの制限サイトおよび機−
能地図を示す模式図である。 FIG、 I ph1 FIG、 2 FIG、 3 FIG、4 FIG、 5 FIG、 6 pH$1 u3 FjG、7 FIG、 8 EL107 FIG、9 −110・ IIILllo FIG、 10 1113 a114 FIG、1l pfflL118 1L118 FIG 12 p!L121 plL12! FIG、 +3 − m56 FIG、 14 −S$− FIG、 +5 第1頁の続き C12R1/19 )        6760−48
(C12N 15100 CI2 R1/465)        6760−4
8(C12N 15100 CI2 R1107)        6760−48
(CI2 N 15100 C12R1/19 )        6760−4B
(C12P 、 19/34 C12R1/125)        6760−48
@l!  明者シエフリー・トビン・フェアマン アメリカ合衆国インディアナ46 22フインデイアナポリス・イー スト・カロリー・コート3617番 0発 明 者 :・受テイーブン・コバ上ビック1フメ
リカ合衆国インディアナ46 ′265インディアナポリス・グリ ムローズ4フ22番 0発 明 者 ナンシー・エレン・マリン・ニー・ビア
マン アメリカ合衆国カリフォルニア 95014キユーパーテイーノ・リ バティー・オーク・レーン1010 4番

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 l、多機能組替えDNAクローニングベクターであって
    、 a)ストレプトマイセスにおいて機能する複製起原、バ
    チルスにおいて機能する複製起原、およびイーコリにお
    いて機能する複製起原からなる群から独立して選択され
    る2種またはそれ以上の機能的に異なる複製起原、およ
    び b)該ベクターを構成している複製起原が機能し得る感
    受性宿主細胞であって形質転換、細胞分裂および培養が
    可能な宿主細胞に導入された時、少なくとも1種の抗生
    物質に対する耐性を付与する1種またはそれ以上のDN
    Aセグメント、を含有する多機能組替えDNAクローニ
    ングベクター(ただし、該ベクターが2種の機能的に異
    なる複製起原に限定される場合は、その複製起原はいづ
    れもイーコリにおいて機能しない)。 2、ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリに於
    いて機能する複製起原がそれぞれプラスミドpEL10
    3 の制限フラグメント、プラスミドpH1−15の制
    限フラグメントおよびイーコリプラスミドの制限フラグ
    メントである第1項に記載のベクター。 3、ベクター中の複製起原がプラスミドpEL103の
    制限フラグメントおよびプラスミドpH1−16の制限
    フラグメントである第1項または第2項に記載のベクタ
    ー。 4、該プラスミドpEL103の複製起源含有制限フラ
    グメントが〜2.8KbBamH1フラグメントである
    第2項または第3項に記載のベクター。 5、イーコリプラスミドがプラスミドpBR322また
    はpBR328である第2項に記載のベクター。 6、プラスミF pLR2ノ〜1.6 Kb BamH
    I制限フラグメントがチオストレプトン耐性を担ってい
    る第1項〜第4項のいづれかに記載あベクター。 7、プラスミドpLR1(7)〜3.4 Kb Bam
    HI制限フラグメントがネオマイシン耐性を担っている
    第1項〜第4項のいづれかに記載のベクター。 8プラスミl−’ pH1−15の〜4.6 K b 
    B a mHI制限フラグメントがクロラムフェニコー
    ル耐性を担っている第1項〜第4項のいづれかに記載の
    ベクタ0 9、プラスミドpH1−18の〜3.9 Kb Bam
    HI制限フラグメントがカナマイシン耐性を担っている
    第1項〜第4項のいづれかに記載のベクター。 10、プラスミドpBSl、 pBs2.pBs3、p
    BS4. pBS5、pBS6. pBS7、pBS8
    、pBS9、pBs l Q、pH511、pBS 1
    2゜pBs13、pBs14、pBslQ、pBslQ
    、pBs 17、pBs l 8、pBslQ、PBS
    20、PBS 21、PBS22. PBS23、PB
    S24、PBS25、pB虚26、PBS27、PBS
    28、PBS29、p13s30、PBS31、pBs
    32. pBs33、pBs34. pBS35、pB
    S35、pBS37、pBS 38、pBs 39、p
    B京40、pBS 4 l、PBS42゜pBS43、
    P13s44. pBs45. pBs45. pBS
    47、pBs48、′:1″:、。 pBS4(1,pBS5Q、pBs51、pBs、52
    . pBS53、pBs54、pBS55. pB55
    5%pBS57、pBS58SpBs59、またはpB
    S5Qである第1項〜第9項のいづれかに記載のベクタ
    ー。 PBS6. PBS7またはpH88である第10項に
    記載のベクター。 12、 pBSg、pBslQ、pB84gまタハPB
    S6oテアル第10項に記載のベクター。 13、第1項〜第11項に記載の組替えDNAクローニ
    ングベクターのいづれかを含有する形質転換された無制
    限宿主細胞(ただし、該宿主細胞は形質転換前、DNA
    セグメント含有該ベクターによって耐性が付与される所
    の抗生物質に対して感受性を有しており、そして該ベク
    ターを構成している少なくとも1個の複製起原は該宿主
    細胞において機能性を有する)。 14、ストレプトマイセス、好ましくはarnbofa
    cienslcoelicolorまたはfradia
    e種である第13項に、1ニー 記載の宿主細胞。:、’、Ill、、 15、バチルス、好ま’L<は5ubtilis種であ
    る第13項に記載の宿主細胞。 16、プラスミドPBS9、PBS49 t fニー 
    ハPBS60 金含有しているイーコリである第13項
    に記載の宿主細胞。 17、 E、col i K12 HBIOI/PBS
    9 である第16項に記載の宿主細胞。 18、1)ストレプトマイセスに於いて機能する複製起
    原およびストレプトマイセスに導入された時少なくとも
    1種の抗生物質に対する耐性を付与する1またはそれ以
    上のDNAセグメントを含有している制限フラグメント
    、 2)バチルスに於いて機能する複製起原およびバチルス
    に導入された時少なくとも1種の抗生物質に対する耐性
    を付与する1またはそれ以上のDNAセグメントを含有
    している制限フラグメント、 3)イーコリに於いて機能する複製起原およびイーコリ
    に導入された時少なくとも1種の抗生物質に対する耐性
    を付与する1またはそれ以上のDNAセグメントを含有
    している制限フラグメント、の少な(とも2個を結合す
    ることからなる多機能組替えクローニングベクターの製
    法(ただし、該ベクターが2種の機能的に異なる複製起
    原に限定される場合は、その複製起原はいづれもイーコ
    リにおいて機能しない)。 19、ベクター中の複製起原がプラスミドpEL103
    の制限フラグメント、プラスミドpJ−II−16の制
    限フラグメントおよびプラスミドpBR322の制限フ
    ラグメントである、ストレプトマイセス、バチルスおよ
    びイーコリにおいて機能するクローニングベクターを製
    造する第18項に記載の製法。 20、プラスミドpHl−15またはPH1−18であ
    る組替、jDNAクローニングベクター。 21、Bacillus 5ubt目i s MI 1
    12/pH116の培養細胞を溶解し、溶解質からプラ
    スミドを分離することからなるプラスミドpHl15の
    分離法。 22、該細胞をリゾチームで処理し、プラスミドを遠心
    分離で分離する第21項に記載の分離法。 23、プラスミドpHl15の部分的Hpa■消化物を
    自己結合させることからなるプラスミドPI−1118
    の調製法。
JP58015395A 1982-02-01 1983-01-31 多機能クロ−ニングベクタ− Pending JPS58134100A (ja)

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