JPS58134100A - 多機能クロ−ニングベクタ− - Google Patents
多機能クロ−ニングベクタ−Info
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- JPS58134100A JPS58134100A JP58015395A JP1539583A JPS58134100A JP S58134100 A JPS58134100 A JP S58134100A JP 58015395 A JP58015395 A JP 58015395A JP 1539583 A JP1539583 A JP 1539583A JP S58134100 A JPS58134100 A JP S58134100A
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- Japan
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- replication
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- bacillus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、機能的なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ−（
ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ｐｔ
ｃｒｒ５ｃｅｓ ）の複製起原、機能的なバチルス〔桿
菌）△ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の複製起原、機能的なイーコリ（
大腸菌） （Ｅ、ｃｏｌｉ）の複製起原、および抗生物
質に対する耐性（抵抗性）を付与する１若しくはそれ以
上のＤＮＡセグメン）幸畔井→を含有する新規な多機能
組替えＤＮＡクローニングベクターに関する。本発明は
また、該ベクターの組替え体に関する。
ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ｐｔ
ｃｒｒ５ｃｅｓ ）の複製起原、機能的なバチルス〔桿
菌）△ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の複製起原、機能的なイーコリ（
大腸菌） （Ｅ、ｃｏｌｉ）の複製起原、および抗生物
質に対する耐性（抵抗性）を付与する１若しくはそれ以
上のＤＮＡセグメン）幸畔井→を含有する新規な多機能
組替えＤＮＡクローニングベクターに関する。本発明は
また、該ベクターの組替え体に関する。
従来、選択し得る多機能クローニングベクターが一般的
に存在しないため、ストレプトマイセス、バチルスおよ
びイーコリにおける組替えＤＮＡ技術の開発と利用が妨
げられ、特に部分的には困難であった。本発明に係るベ
クターは、ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコ
リにおいて機能し、選択し得るものであり、従ってこの
技術分野に於いて顕著な進歩を示すものである。
に存在しないため、ストレプトマイセス、バチルスおよ
びイーコリにおける組替えＤＮＡ技術の開発と利用が妨
げられ、特に部分的には困難であった。本発明に係るベ
クターは、ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコ
リにおいて機能し、選択し得るものであり、従ってこの
技術分野に於いて顕著な進歩を示すものである。
本発明に係るベクタ」は、小型で万能であり、それに対
して耐性が付与されている抗生物質に対して感受性を有
するストレプトマイセス、バチルスまたはイーコリ細胞
に導入し、選択することができるので特に有用なもので
ある。臨床的に重要な抗生物質の半数以上はストレプト
マイセス株によって生産されているので、この工業的に
重要なグループに適用し得るクローニング系およびベク
ターを開発することは望ましいことである。更に、この
ベクターはバチルスおよびイーコリに於いても機能する
ので、遺伝物質の異翼間移動および発現が容易になる。
して耐性が付与されている抗生物質に対して感受性を有
するストレプトマイセス、バチルスまたはイーコリ細胞
に導入し、選択することができるので特に有用なもので
ある。臨床的に重要な抗生物質の半数以上はストレプト
マイセス株によって生産されているので、この工業的に
重要なグループに適用し得るクローニング系およびベク
ターを開発することは望ましいことである。更に、この
ベクターはバチルスおよびイーコリに於いても機能する
ので、遺伝物質の異翼間移動および発現が容易になる。
これに関連して、本発明のベクターは、組替えＤＮＡ技
術による物質の生産の為の宿主細胞を選択する上での融
通性を備えている。
術による物質の生産の為の宿主細胞を選択する上での融
通性を備えている。
この事は極めて重要なことである。何故なら、ベクター
の保有している遺伝子の遺伝的発現は、その遺伝子が導
入される細胞の遺伝的背景によって制限を受け、また影
響されるからである。この宿主細胞の違いも、翼間で使
用し得るベクターを提供することによりオリ用される。
の保有している遺伝子の遺伝的発現は、その遺伝子が導
入される細胞の遺伝的背景によって制限を受け、また影
響されるからである。この宿主細胞の違いも、翼間で使
用し得るベクターを提供することによりオリ用される。
例えは、このベク（□
ターは、特にストレプトマイセスおよびバチルスの一方
または双方栃天む種々の宿主細胞において、新しい抗生
物質およびその誘導体を生産するための遺伝子のみなら
ず、既知の抗生物質の収量を増加させる遺伝子をクロー
ンするのに使用することができる。
または双方栃天む種々の宿主細胞において、新しい抗生
物質およびその誘導体を生産するための遺伝子のみなら
ず、既知の抗生物質の収量を増加させる遺伝子をクロー
ンするのに使用することができる。
本発明に係る多機能組替えＤＮＡクローニングベクター
は、ストレプトマイセス、バチルス、およびイーコリ宿
主細胞中でクローンし得るのみならず、形質転換体を好
都合に選択することができる。形質転換は非常に低い頻
度で起るので、何百万という細胞の中で、どの細胞がプ
ラスミドＤＮＡを獲得したかを調べる為の機能試験が実
際上必要である。このことは重要なことである。何故な
ら、非選択性のＤＮＡ配列をこのベクターに挿入するこ
とができ、宿主を形質転換することによって該ベクター
およびその特定のＤＮＡ配列を持った細胞を適当な抗生
物質選択法によって単離することができるからである。
は、ストレプトマイセス、バチルス、およびイーコリ宿
主細胞中でクローンし得るのみならず、形質転換体を好
都合に選択することができる。形質転換は非常に低い頻
度で起るので、何百万という細胞の中で、どの細胞がプ
ラスミドＤＮＡを獲得したかを調べる為の機能試験が実
際上必要である。このことは重要なことである。何故な
ら、非選択性のＤＮＡ配列をこのベクターに挿入するこ
とができ、宿主を形質転換することによって該ベクター
およびその特定のＤＮＡ配列を持った細胞を適当な抗生
物質選択法によって単離することができるからである。
本明細書を理解しやすくするために、以下に用語につい
て説明する、 組替えＤＮＡクローニングベクター：プラスミドを含む
（しかしこれに限定されない）自律性の複製体であって
、１若しくはそれ以上の、それ以外のＤＮＡセグメント
を付加された、あるいは付加することのできるＤＮＡ分
子からなっている。
て説明する、 組替えＤＮＡクローニングベクター：プラスミドを含む
（しかしこれに限定されない）自律性の複製体であって
、１若しくはそれ以上の、それ以外のＤＮＡセグメント
を付加された、あるいは付加することのできるＤＮＡ分
子からなっている。
形質転換： ＤＮＡを受容宿主細胞に導入して遺伝子型
を変え、その受容宿主細胞に安定な遺伝性の変化を生じ
せしめること。
を変え、その受容宿主細胞に安定な遺伝性の変化を生じ
せしめること。
形質転換体：形質転換された受容宿主細胞。
多機能：翼間で機能性を有すること。
感受性宿主細胞：ある抗生物質の存在下において、その
抗生物質に対して耐性を付与するＤＮＡセグメントがな
ければ増殖できない宿主細胞。
抗生物質に対して耐性を付与するＤＮＡセグメントがな
ければ増殖できない宿主細胞。
制限フラグメント：プラスミドに１種またはそれ以上の
制限酵素を作用させることによって生成するプラスミド
の全部またはその直線状の一部分。
制限酵素を作用させることによって生成するプラスミド
の全部またはその直線状の一部分。
挿入アイソマー（異性体）：ＤＮＡフラグメントを、受
容ＤＮＡの１またはそれ以上の適合サイトに挿入する時
に生成し得る２種またはそれ以上の組替えＤＮＡ分子の
１つ。
容ＤＮＡの１またはそれ以上の適合サイトに挿入する時
に生成し得る２種またはそれ以上の組替えＤＮＡ分子の
１つ。
プラスミドＰＩＡ２１．６Ｋｂ ＢａｍＨＩ 制限フ
ラグメント：プラスミドｐＩＪ６に含まれている、同プ
ラスミドの１．６Ｋｂ ＢａｍＨｌ チオストレプト
ン耐性付与フラグメント。
ラグメント：プラスミドｐＩＪ６に含まれている、同プ
ラスミドの１．６Ｋｂ ＢａｍＨｌ チオストレプト
ン耐性付与フラグメント。
プラスミドｐＩＡｌ ３，４Ｋｂ ＢａｍＨＩ 制限
フラグメント：プラスミドｐＩＪ２に含まれている同プ
ラスミドの３，４ Ｋｂ ＢａｍＨＩネオマイシン耐性
付与フラグメント。
フラグメント：プラスミドｐＩＪ２に含まれている同プ
ラスミドの３，４ Ｋｂ ＢａｍＨＩネオマイシン耐性
付与フラグメント。
ＡｍｐＥＬ： アンピシリン耐性表現型。
Ｔｅｔ５： テトラサイタリン感受性表現型。
Ｔｈ１ｏＲ： チオストレプトン耐性表現型。
Ｎｅｏ’： ネオマイシン耐性表現型。
ＣｒｒＩＲ＝ クロラムフェニコール耐性表現型。
ＫｎＲ： カナマイシン耐性表現型。
本発明は、多機能組替えＤＮＡクローニングベクターで
あって、リストレプトマイセスにおいて機能する複製起
原、バチルスにおいて機能する複製起原、およびイーコ
リにおいて機能する複製起原からなる群から独立して選
択される２種またはそれ以上の機能的に異なる輸液超厚
、およびｂ）該− ベクターを構成している複製起原が機能し得る感受性宿
主細胞であって形質転換、細胞分裂および培養が可能な
宿主細胞に導入された時、少なくとも１種の抗生物質に
対する耐性を付与する１種またはそれ以上のＤＮＡセグ
メント、を含有するベクター（ただし、該ベクターが２
種の機能的に異なる複製起原に限定される場合は、その
複製起原はいづれもイーコリにおいて機能しない）を提
供するものである。
あって、リストレプトマイセスにおいて機能する複製起
原、バチルスにおいて機能する複製起原、およびイーコ
リにおいて機能する複製起原からなる群から独立して選
択される２種またはそれ以上の機能的に異なる輸液超厚
、およびｂ）該− ベクターを構成している複製起原が機能し得る感受性宿
主細胞であって形質転換、細胞分裂および培養が可能な
宿主細胞に導入された時、少なくとも１種の抗生物質に
対する耐性を付与する１種またはそれ以上のＤＮＡセグ
メント、を含有するベクター（ただし、該ベクターが２
種の機能的に異なる複製起原に限定される場合は、その
複製起原はいづれもイーコリにおいて機能しない）を提
供するものである。
本発明はまた、上記ベクターの形質転換体を提供するも
のである。
のである。
本発明のベクターは、Ｄストレプトマイセスに於いて機
能する複製起原およびストレプトマイセスに導入された
時少なくとも１種の抗生物質に対する耐性を付与する１
またはそれ以上のＤＮＡセグメントの両方を含有してい
る制限フラグメント、■バチルスに於いて、機能する複
製起原およびバチルスに導入された時少なくとも１種の
抗生物質に対する耐性を付与す：・・る１またはそれ以
上のＤＮＡ：・１１１１゜ セグメントの両方４’＊有している制限フラグメント、
■イーコリプラスミドのレプリコン含有、抗生物質耐性
付与制限フラグメント、の少なくとも２個を結合させる
ことによって組み立てられる。
能する複製起原およびストレプトマイセスに導入された
時少なくとも１種の抗生物質に対する耐性を付与する１
またはそれ以上のＤＮＡセグメントの両方を含有してい
る制限フラグメント、■バチルスに於いて、機能する複
製起原およびバチルスに導入された時少なくとも１種の
抗生物質に対する耐性を付与す：・・る１またはそれ以
上のＤＮＡ：・１１１１゜ セグメントの両方４’＊有している制限フラグメント、
■イーコリプラスミドのレプリコン含有、抗生物質耐性
付与制限フラグメント、の少なくとも２個を結合させる
ことによって組み立てられる。
υとりを結合させるとストレプトマイセスとバチルスの
両方で機能するプラスミドが得られる。１）と■の結合
で得られるプラスミドに３）を結合するとストレプトマ
イセス、バチルス、およびイーコリのいづれでも機能す
るプラスミドが得られる。
両方で機能するプラスミドが得られる。１）と■の結合
で得られるプラスミドに３）を結合するとストレプトマ
イセス、バチルス、およびイーコリのいづれでも機能す
るプラスミドが得られる。
好ましい最初のフラグメント（ここでは例示の目的で、
プラスミドｐＥＬ１０５ （７） 〜４，４ Ｋｂ Ｂ
ａｍＨＩ制限フラグメントで代表させる）は、プラスミ
ドｐ ＩＪＬｆｌのチオストレプトン耐性付与〜１，５
Ｋｂ Ｂ ａｍＨ１制限フラグメントをプラスミドｐ
ＥＬ１０３の〜２．ＢＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメント
に結合させることにより組み立てられる。後者のフラグ
メントはストレプトマイセスにおいて機能する複製起原
を含有しており、従って本発明を実施する上で特に有用
である。好ましい第２のフラグメントはプラスミドｐＨ
１−１５の〜４．６ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントで
ある。このプラスミドｐＨｌ−１５フラグメントはバチ
ルス機能性の複製起原およびバチルスに抗生物質耐性を
付与するＤＮＡセグメントを含んでいる。この最初の制
限フラグメントおよび第２の制限フラグメントを結合す
ると新規の代表的な多機能プラスミドＰＢ５２が得られ
る。Ｂａｍ）ＩＩ制限化プラスミドＰＢＳ ２をＢａｍ
ＨＩ制限化プラスミドｐＢＲ３２２と結合させると、新
規な多機能の代表的プラスミドｐＢｓ４９が得られる。
プラスミドｐＥＬ１０５ （７） 〜４，４ Ｋｂ Ｂ
ａｍＨＩ制限フラグメントで代表させる）は、プラスミ
ドｐ ＩＪＬｆｌのチオストレプトン耐性付与〜１，５
Ｋｂ Ｂ ａｍＨ１制限フラグメントをプラスミドｐ
ＥＬ１０３の〜２．ＢＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメント
に結合させることにより組み立てられる。後者のフラグ
メントはストレプトマイセスにおいて機能する複製起原
を含有しており、従って本発明を実施する上で特に有用
である。好ましい第２のフラグメントはプラスミドｐＨ
１−１５の〜４．６ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントで
ある。このプラスミドｐＨｌ−１５フラグメントはバチ
ルス機能性の複製起原およびバチルスに抗生物質耐性を
付与するＤＮＡセグメントを含んでいる。この最初の制
限フラグメントおよび第２の制限フラグメントを結合す
ると新規の代表的な多機能プラスミドＰＢ５２が得られ
る。Ｂａｍ）ＩＩ制限化プラスミドＰＢＳ ２をＢａｍ
ＨＩ制限化プラスミドｐＢＲ３２２と結合させると、新
規な多機能の代表的プラスミドｐＢｓ４９が得られる。
後者のタイプのプラスミド（群）は極めて万能であり、
ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリのいづれ
に於いても使用することができる。
ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリのいづれ
に於いても使用することができる。
ストレプトマイセスにおいて機能する複製起原を含有し
ているプラスミドＰＥＬ１０３は、約２０．ＯＫｂであ
り、分子クローニングに特に好都合ないくつかの制限サ
イトを含んでいる。プラスミドｐＥＬ１０３の複製起原
は〜２．ｇ ＫｂＢａｍＨＩ制限７７グメント内に局在
化していた為、この〜２Ｊ３ＫｂＢａｍＨ１領域の外側
を切断する制限酵素でこのプラスミドを消化すると、多
種多様の複製超厚含有フラグメントが生成し得る。プラ
スミドｐ ＥＬＩ Ｏ３の詳細な制限サイトおよび機能
地図を第１図に示す（本明細書に添付した全ての図面は
、等尺で描かれてはいない）。
ているプラスミドＰＥＬ１０３は、約２０．ＯＫｂであ
り、分子クローニングに特に好都合ないくつかの制限サ
イトを含んでいる。プラスミドｐＥＬ１０３の複製起原
は〜２．ｇ ＫｂＢａｍＨＩ制限７７グメント内に局在
化していた為、この〜２Ｊ３ＫｂＢａｍＨ１領域の外側
を切断する制限酵素でこのプラスミドを消化すると、多
種多様の複製超厚含有フラグメントが生成し得る。プラ
スミドｐ ＥＬＩ Ｏ３の詳細な制限サイトおよび機能
地図を第１図に示す（本明細書に添付した全ての図面は
、等尺で描かれてはいない）。
プラスミドＰＥＬ１０３は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇ
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（Ｐｅｏｒ、ｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）に寄託され、永
久保存カルチャーコレクションの一部キなっているスト
レプトマイセス・グラニュ０ ／ｌ／−バー （Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ） Ａ
Ａ３９９１２．１３／ＰＥＬ１０３から常法により単離
することができる。これはＮＲＲＬ１２５４９の番号で
誰でも人手することができ、このプラスミドの好ましい
入手源、貯蔵物として使用することができる。
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（Ｐｅｏｒ、ｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）に寄託され、永
久保存カルチャーコレクションの一部キなっているスト
レプトマイセス・グラニュ０ ／ｌ／−バー （Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ） Ａ
Ａ３９９１２．１３／ＰＥＬ１０３から常法により単離
することができる。これはＮＲＲＬ１２５４９の番号で
誰でも人手することができ、このプラスミドの好ましい
入手源、貯蔵物として使用することができる。
多種多様の、複製超厚含有プラスミドＰＥＬ１０３フラ
グメントを組み立てることができるが、本発明を実施す
るには〜２．ＢＫｂＢａｍＨ１制限フラグメントが最も
好ましい。この〜２ｊ３ Ｋｂｌフラグメント１種また
はそれ以上の抗生物質耐性付与ＤＮＡフラグメント（こ
こでは、プラスミドＰＬＲ２のチオストレプトン耐性付
与〜１，５ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントおよびプラ
スミ：ドｐ ＬＪＬｌのネオマイシン耐性付与〜３．４
ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントを例示のために使用す
る）と結合させる。
グメントを組み立てることができるが、本発明を実施す
るには〜２．ＢＫｂＢａｍＨ１制限フラグメントが最も
好ましい。この〜２ｊ３ Ｋｂｌフラグメント１種また
はそれ以上の抗生物質耐性付与ＤＮＡフラグメント（こ
こでは、プラスミドＰＬＲ２のチオストレプトン耐性付
与〜１，５ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントおよびプラ
スミ：ドｐ ＬＪＬｌのネオマイシン耐性付与〜３．４
ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントを例示のために使用す
る）と結合させる。
チオストレプトン耐性付与フラグメントのソーＫｂであ
り、Ｈｉｎｄｌｕ処理プラスミドｐｌＪ６（Ｔｈ ｏｍ
ｐ ｓ ｏ ｎら、Ｎａｔｕｒｅ２８６ ：５２５（１
９８０）参照）をＨｉｎｄＩＩＩ処理プラスミドＰＢＲ
３２２と結合することにより組み立てられる。ネオマイ
シン耐性付与フラグメントのソースであるプラスミドｐ
ＬＲ１は約１４．８Ｋｂであって、プラスミドｐｌＪ６
の代りにプラスミドｐＩＪ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１
９８０） ニより開示されている）を使用するほかは上
記と同様にして組み立てられる。ｐ ＬＲ２およびｐ
ＬＲｌの両プラスミドは、イーコリにおいて機能するの
で、以下の操作のために、常法により増幅し、単離する
ことができる。プラスミドｐ ＬＡｌおよびＰＬＪＬ２
の制限サイトおよび機能地図をそれぞれ第２図および第
３図に示した。
り、Ｈｉｎｄｌｕ処理プラスミドｐｌＪ６（Ｔｈ ｏｍ
ｐ ｓ ｏ ｎら、Ｎａｔｕｒｅ２８６ ：５２５（１
９８０）参照）をＨｉｎｄＩＩＩ処理プラスミドＰＢＲ
３２２と結合することにより組み立てられる。ネオマイ
シン耐性付与フラグメントのソースであるプラスミドｐ
ＬＲ１は約１４．８Ｋｂであって、プラスミドｐｌＪ６
の代りにプラスミドｐＩＪ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１
９８０） ニより開示されている）を使用するほかは上
記と同様にして組み立てられる。ｐ ＬＲ２およびｐ
ＬＲｌの両プラスミドは、イーコリにおいて機能するの
で、以下の操作のために、常法により増幅し、単離する
ことができる。プラスミドｐ ＬＡｌおよびＰＬＪＬ２
の制限サイトおよび機能地図をそれぞれ第２図および第
３図に示した。
チオストレゾトイ。耐性付与〜１，５ＫｂＢａｍＨＩフ
ラグメントとネオマ身・・シン耐性付与〜３，４ＫｂＢ
ａｍＨｌフラグメントとを、プラスミドＰＥＬ１０３の
〜２，８Ｋｂ複製起原含有Ｂ超厚ＨＩ フラグメント
と結合させ、本発明を実施するための出発物質とじて使
用するプラスミドを調製する。この出発物質たるプラス
ミドは、特定の耐性付与ＤＮＡフラグメントの方向に応
じて２方向性である。即ち、ブラフ、 ミＦ ＰＬＲ２
（７） 〜１，５ Ｋｂ Ｂａｍ Ｈｌフラグメントを
プラスミドｐＥＬ１０３の〜’ｌ、８Ｋ ｂ Ｂ ａｍ
Ｈ１７ラグメントに結合させると有用な出発物質プラ
スミドＰＥＬ１０７とｐＥＬ１０５となり、同じ様にプ
ラスミドｐ ＬＲｌの〜３，４ＫｂＢａｍＨＩ ７ラグ
メントを結合させると有用な出発物質プラスミドｐＥＬ
１０９およびｐＥＬｌｌｏが得られ、さらに、同じ様に
これらのフラグメントの両者を結合させると有用な出発
物質プラスミドｐＥＬ１１３、ｐＥＬ１１４、ｐＥＬ１
１５ およびｐＥＬ１１６が得られる。後述する様に、
上記のプラスミド出発物質を部分的にＢ ａ ｍ ＨＩ
消化して、本発明に係るベクターを組み立てるのに有用
な制限フラグメントを生成せしめることができる。
ラグメントとネオマ身・・シン耐性付与〜３，４ＫｂＢ
ａｍＨｌフラグメントとを、プラスミドＰＥＬ１０３の
〜２，８Ｋｂ複製起原含有Ｂ超厚ＨＩ フラグメント
と結合させ、本発明を実施するための出発物質とじて使
用するプラスミドを調製する。この出発物質たるプラス
ミドは、特定の耐性付与ＤＮＡフラグメントの方向に応
じて２方向性である。即ち、ブラフ、 ミＦ ＰＬＲ２
（７） 〜１，５ Ｋｂ Ｂａｍ Ｈｌフラグメントを
プラスミドｐＥＬ１０３の〜’ｌ、８Ｋ ｂ Ｂ ａｍ
Ｈ１７ラグメントに結合させると有用な出発物質プラ
スミドＰＥＬ１０７とｐＥＬ１０５となり、同じ様にプ
ラスミドｐ ＬＲｌの〜３，４ＫｂＢａｍＨＩ ７ラグ
メントを結合させると有用な出発物質プラスミドｐＥＬ
１０９およびｐＥＬｌｌｏが得られ、さらに、同じ様に
これらのフラグメントの両者を結合させると有用な出発
物質プラスミドｐＥＬ１１３、ｐＥＬ１１４、ｐＥＬ１
１５ およびｐＥＬ１１６が得られる。後述する様に、
上記のプラスミド出発物質を部分的にＢ ａ ｍ ＨＩ
消化して、本発明に係るベクターを組み立てるのに有用
な制限フラグメントを生成せしめることができる。
プラスミドｐＨ１−１５は、バチルス機能性の複製超厚
およびそれぞれ抗生物質クロラムフエニ、コールおよび
カナマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡセグメント
（分節）を含んでいる。従って、プラスミドｐＨｌ−１
６は本発明の目的を達成するのに極めて好適な出発物質
である。プラスミドｐＨ１−１６は〜４，５Ｋｂであり
、既知のキメラプラスミドＰＲＤ１２の インビボにお
ける欠失によって生成する（Ｇｒｙｃｚａｎら、Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４１（１１：２４６）。
およびそれぞれ抗生物質クロラムフエニ、コールおよび
カナマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡセグメント
（分節）を含んでいる。従って、プラスミドｐＨｌ−１
６は本発明の目的を達成するのに極めて好適な出発物質
である。プラスミドｐＨ１−１６は〜４，５Ｋｂであり
、既知のキメラプラスミドＰＲＤ１２の インビボにお
ける欠失によって生成する（Ｇｒｙｃｚａｎら、Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４１（１１：２４６）。
これは、Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓのＮＲＲＬ
に寄託され、永久保存カルチャーコレクションの一部と
なっている組立て株（ｃｏｎｓＬｒｕｃＬｅｄ ５ｔｒ
ａｉｎ）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ １
１２／ｐＨ１−１５から、常法に従ッテ単離することが
できる。この株はＮＲＲＬ Ｂ−１２５９７の番号で誰
れでも入手可能であり、このプラスミドの好ましい供給
源、貯蔵源として使用することができる。プラスミドｐ
Ｈｌ−１５の詳細な制限サイトおよび機能地図は第４図
に示しである。簡略化の為、プラスミドｐＨｌ−１５お
よびここに例示したｐＨｌ−１５フラグメントについて
は、３イ固だけのＭｂｏＩＩおよびＴａｇｌ制限サイト
を示す。
に寄託され、永久保存カルチャーコレクションの一部と
なっている組立て株（ｃｏｎｓＬｒｕｃＬｅｄ ５ｔｒ
ａｉｎ）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ １
１２／ｐＨ１−１５から、常法に従ッテ単離することが
できる。この株はＮＲＲＬ Ｂ−１２５９７の番号で誰
れでも入手可能であり、このプラスミドの好ましい供給
源、貯蔵源として使用することができる。プラスミドｐ
Ｈｌ−１５の詳細な制限サイトおよび機能地図は第４図
に示しである。簡略化の為、プラスミドｐＨｌ−１５お
よびここに例示したｐＨｌ−１５フラグメントについて
は、３イ固だけのＭｂｏＩＩおよびＴａｇｌ制限サイト
を示す。
プラスミドｐＨ１−１５の種々の誘導体も出発物質とし
て使用することができる。例えばプラスミドｐＨ１−１
（５の〜Ｑ、７ Ｋｂ Ｈｐａ ＩＩ 制限フラグメン
トノ欠失により新規プラスミドｐＨ１−１８が得られる
。
て使用することができる。例えばプラスミドｐＨ１−１
（５の〜Ｑ、７ Ｋｂ Ｈｐａ ＩＩ 制限フラグメン
トノ欠失により新規プラスミドｐＨ１−１８が得られる
。
プラスミドｐＨｌ−１３は〜３，９Ｋｂであり、バチル
スで機能する複製起原のほかにクロラムフェニコール耐
性付与ＤＮＡセグメントを含んでいる。プラスミドｐＨ
１−１８の制限サイトおよび機能地図を第５図に示した
。簡略化℃為、プラスミドｐＨｌ−１８およびここに例
示のｐＨｌ−１３フラグメントについては３個だけのＭ
ｂｏｌｌおよびＴａｇＩ 制限サイトを示す。
スで機能する複製起原のほかにクロラムフェニコール耐
性付与ＤＮＡセグメントを含んでいる。プラスミドｐＨ
１−１８の制限サイトおよび機能地図を第５図に示した
。簡略化℃為、プラスミドｐＨｌ−１８およびここに例
示のｐＨｌ−１３フラグメントについては３個だけのＭ
ｂｏｌｌおよびＴａｇＩ 制限サイトを示す。
プラスミドｐＨ１−１５およびｐＨｌ−１１３をＢａｍ
ＨＩ消化すると、それぞれ〜４．５ Ｋｂフラグメント
、〜３，９Ｋｂ フラグメントが得られ、これらはそれ
ぞれバチルスについての複製起原および抗生物質耐性を
付与するＤＮＡを含んでいる。従って、このプラスミド
ＰＨＩ−ＩＢの３，９Ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメン
トまタハプ５７． ミｌ’ ｐＨｌ−１６の〜４．６
ＫｂＢａｍＨＩ・１′ 制限フラグメントを前記のプラスミドｐＥＬ１０５の〜
４．４ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントと結合すること
により、本発明の１例としての多機能クローニングベク
ターを容易に組み立てることができる。
ＨＩ消化すると、それぞれ〜４．５ Ｋｂフラグメント
、〜３，９Ｋｂ フラグメントが得られ、これらはそれ
ぞれバチルスについての複製起原および抗生物質耐性を
付与するＤＮＡを含んでいる。従って、このプラスミド
ＰＨＩ−ＩＢの３，９Ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメン
トまタハプ５７． ミｌ’ ｐＨｌ−１６の〜４．６
ＫｂＢａｍＨＩ・１′ 制限フラグメントを前記のプラスミドｐＥＬ１０５の〜
４．４ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントと結合すること
により、本発明の１例としての多機能クローニングベク
ターを容易に組み立てることができる。
ドＰＢＳＩ、 ＰＢＳ２ と呼ぶ。プラスミドｐ’
Ｈｌ−１６の〜４，６Ｋｂ ＢａｍＨ１制限フラグメン
トとプラスミドＰＥＬＩ １０の〜６．２ Ｋ ｂ Ｂ
ａｍ ＨＩ制限フラグメントを結合すると新規多機能
プラスミドｐＢｓ ５が得られる。同様に、プラスミド
ｐＨＩ −１６Ｂａｍ ＨＩフラグメントをプラスミド
ｐＥＬ１１３の〜７，８Ｋｂ Ｂ ａｍ Ｈｌ１ｌｌ
゛限フラグメントと結合させると多機能プラ
スミドｐＢ８７が得られる。プラスミドｐＢｓｌ、ＰＢ
Ｓ ２、ｐＢＳ５およびｐＢＳ ７ の詳細な制限サ
イトおよび機能地図をそれぞれ第６図、第７図、第１３
図および第１４図に示す。
Ｈｌ−１６の〜４，６Ｋｂ ＢａｍＨ１制限フラグメン
トとプラスミドＰＥＬＩ １０の〜６．２ Ｋ ｂ Ｂ
ａｍ ＨＩ制限フラグメントを結合すると新規多機能
プラスミドｐＢｓ ５が得られる。同様に、プラスミド
ｐＨＩ −１６Ｂａｍ ＨＩフラグメントをプラスミド
ｐＥＬ１１３の〜７，８Ｋｂ Ｂ ａｍ Ｈｌ１ｌｌ
゛限フラグメントと結合させると多機能プラ
スミドｐＢ８７が得られる。プラスミドｐＢｓｌ、ＰＢ
Ｓ ２、ｐＢＳ５およびｐＢＳ ７ の詳細な制限サ
イトおよび機能地図をそれぞれ第６図、第７図、第１３
図および第１４図に示す。
本発明のベクター、例えばプラスミドｐＢＳ ｌ、ＰＢ
Ｓ ２、ｐＢＳ５綜びｐＢＳ ７は、機能的レプリコン
を含有し抗生物質耐性を付与するイーコリプラスミドの
制限フラグメント、例えばプラスミドｐＢＲ・□・、。
Ｓ ２、ｐＢＳ５綜びｐＢＳ ７は、機能的レプリコン
を含有し抗生物質耐性を付与するイーコリプラスミドの
制限フラグメント、例えばプラスミドｐＢＲ・□・、。
３２２ 、 ＰＢｉ’Ｌ３２４ （Ｂパ６１・・、
、ｉ Ｖａｒ 、 Ｆ 、、 Ｇｅｎｅ ４
： １２１ （１９７８）参照）、ＰＢＲ３２５
（ＢＯＩ １ｖａｒ 、Ｆ、 、 （１９７８）参照）
、ＰＢＲ３２８（Ｓｏｂｅｒｏｎ、Ｘ、 ＋ Ｇｅｎｅ
９ ： ２８７（１９８０）参照）などと結合させる
ことができ、か゛＜シてイーコリ、ストレプトマイセス
およびバチルスにおいて使用する為の新規多機能プラス
ミドを調製することができる。プラスミドｐＢ５９およ
びｐＢｓ ｌ Ｑで例示されるこれらの組み立て物は、
プラスミドの増幅および取扱いがストレプトマイセスま
たはバチルスより・もイーコリにおいてより迅速かつ簡
単に行なえるので、特に好都合である。
、ｉ Ｖａｒ 、 Ｆ 、、 Ｇｅｎｅ ４
： １２１ （１９７８）参照）、ＰＢＲ３２５
（ＢＯＩ １ｖａｒ 、Ｆ、 、 （１９７８）参照）
、ＰＢＲ３２８（Ｓｏｂｅｒｏｎ、Ｘ、 ＋ Ｇｅｎｅ
９ ： ２８７（１９８０）参照）などと結合させる
ことができ、か゛＜シてイーコリ、ストレプトマイセス
およびバチルスにおいて使用する為の新規多機能プラス
ミドを調製することができる。プラスミドｐＢ５９およ
びｐＢｓ ｌ Ｑで例示されるこれらの組み立て物は、
プラスミドの増幅および取扱いがストレプトマイセスま
たはバチルスより・もイーコリにおいてより迅速かつ簡
単に行なえるので、特に好都合である。
即ち、所望の組替えＤＮＡ操作をイーコリ宿主系で行な
った後、特定のＤＮＡを除去し、必要ならばプラスミド
型に組み立て直し、ストレプトマイセスまたはバチルス
宿主細胞に導入することができる。
った後、特定のＤＮＡを除去し、必要ならばプラスミド
型に組み立て直し、ストレプトマイセスまたはバチルス
宿主細胞に導入することができる。
本発明に係る多機能ＰＢＳプラスミド群において例示さ
れるストレプトマイセス機能性複製超厚はフ５ スミト
ｐＥＬ１０３の〜’１．ｆ３ Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグ
メントに含まれているが、この複製起原が存在する限り
、類似のｐＥＬ１０３フラグメントも使用することがで
きる。この様な類似のプラスミドｐＥＬ１０３制限フラ
グメントにはＰｓｔ Ｉ、５ｐｈｉ、ｎｇｌ！ｌｌ、Ｃ
Ｉ！ａ Ｉ、 Ｘｈｏ Ｉおよびその他のＢａｍＨ１７
ラグメントなどが含まれるが、これらに限定されるもの
ではない。さらに、特定の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグ
メントは、プラスミドｐＥＬ１０３制限フラグメント上
の１つの位置に限定されるのではなく、複製起原または
他の重要なプラスミド支配の生理機能がこわされない限
り、種々の位置に結合させ、または挿入することができ
る。従って、ここに例示した物の代りに、多くの異なっ
たプラスミドｐＥＬｌ ０３制限フラグメントおよびそ
の誘導体を使用することができる。特定のＤＮＡセグメ
ントを結合または挿入するのに適した位置は、当業者に
は明らかであるか、あるいは容易に決定できるものであ
る。
れるストレプトマイセス機能性複製超厚はフ５ スミト
ｐＥＬ１０３の〜’１．ｆ３ Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグ
メントに含まれているが、この複製起原が存在する限り
、類似のｐＥＬ１０３フラグメントも使用することがで
きる。この様な類似のプラスミドｐＥＬ１０３制限フラ
グメントにはＰｓｔ Ｉ、５ｐｈｉ、ｎｇｌ！ｌｌ、Ｃ
Ｉ！ａ Ｉ、 Ｘｈｏ Ｉおよびその他のＢａｍＨ１７
ラグメントなどが含まれるが、これらに限定されるもの
ではない。さらに、特定の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグ
メントは、プラスミドｐＥＬ１０３制限フラグメント上
の１つの位置に限定されるのではなく、複製起原または
他の重要なプラスミド支配の生理機能がこわされない限
り、種々の位置に結合させ、または挿入することができ
る。従って、ここに例示した物の代りに、多くの異なっ
たプラスミドｐＥＬｌ ０３制限フラグメントおよびそ
の誘導体を使用することができる。特定のＤＮＡセグメ
ントを結合または挿入するのに適した位置は、当業者に
は明らかであるか、あるいは容易に決定できるものであ
る。
プラスミドｐＨｌ−１５およびｐＨｌ−１８のそれぞれ
〜４．６ および３，９ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメ
ントハ、本発明の多機能プラスミドを組み立てるのに好
適であるが、プラスミドｐＨ１−１５およびｐＨｌ−１
８のその他の多くの、複製超厚含有抗生物質耐性付与フ
ラグメントも使用することができる。プラスミドｐＨ１
−１５およびｐＨｌ−１１３の類似の単一切断制限フラ
グメントとしては、例えばプラスミドｐＨ１−１５ノＢ
ｇｌ’ｎ、ＸｂａＩ％ＥｃｏＲ１１ＰｖｕＩＩおよびＡ
ｖａＩフラグメント、プラスミドｐＨ１−１８のＸｂａ
Ｉ、ＥＣ０ＲＩ。
〜４．６ および３，９ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメ
ントハ、本発明の多機能プラスミドを組み立てるのに好
適であるが、プラスミドｐＨ１−１５およびｐＨｌ−１
８のその他の多くの、複製超厚含有抗生物質耐性付与フ
ラグメントも使用することができる。プラスミドｐＨ１
−１５およびｐＨｌ−１１３の類似の単一切断制限フラ
グメントとしては、例えばプラスミドｐＨ１−１５ノＢ
ｇｌ’ｎ、ＸｂａＩ％ＥｃｏＲ１１ＰｖｕＩＩおよびＡ
ｖａＩフラグメント、プラスミドｐＨ１−１８のＸｂａ
Ｉ、ＥＣ０ＲＩ。
Ｐｖｕ ｎおよびＡｖａｌフラグメントを挙げることが
できる。さらに、プラスミドｐＨ１−１６およびｐＨ１
−１８フラグメント−ζ含まれる抗生物質耐性付与ＤＮ
Ａセグメントは、１つの位置に制限されるものではない
。むしろ、このセグメントは複製起原または他の重要な
プラスミド支配の生理機能がこわされない限り、種々の
位置に位置することができ、そしてまた挿入されて結合
することができる。
できる。さらに、プラスミドｐＨ１−１６およびｐＨ１
−１８フラグメント−ζ含まれる抗生物質耐性付与ＤＮ
Ａセグメントは、１つの位置に制限されるものではない
。むしろ、このセグメントは複製起原または他の重要な
プラスミド支配の生理機能がこわされない限り、種々の
位置に位置することができ、そしてまた挿入されて結合
することができる。
特定のＤＮＡセグメントを結合または挿入するのに適し
た位置は、当業者には明らかであるか、あるいは容易に
決定し得るものである。従って、抗生物質耐性を発現し
、かつバチルスにおいて機能する複製起原を含んでいる
多数の制限フラグメントを組み立てることかで幸委。従
って、ここに例示した物の代りに、その様なフラグメン
トを使用してその他の多機能ベクターを組み立てること
ができ、その組み立てられたベクターも本発明に包含さ
れるものである。
た位置は、当業者には明らかであるか、あるいは容易に
決定し得るものである。従って、抗生物質耐性を発現し
、かつバチルスにおいて機能する複製起原を含んでいる
多数の制限フラグメントを組み立てることかで幸委。従
って、ここに例示した物の代りに、その様なフラグメン
トを使用してその他の多機能ベクターを組み立てること
ができ、その組み立てられたベクターも本発明に包含さ
れるものである。
抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメント’＋、その他のバチ
ルス機能性プラスミド、例えばプラスミドｐＢＤ１５お
よび以下のプラスミド（これらはＮＩＨ公報第８２〜９
９．１９８１、Ｒｅｃｏｍｂ １ｎａｎｔ ＤＮＡＴｅ
ｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ’４ （４１：
１４３ に記載されている）、即ちｐＰＬＩＱ、ＰＰ
Ｌ７０６５、ｐ１Ｍ１３、ｐＰＬ５７６、ｐＢｃ１６、
ｐＡＦｖｆ７７、ｐｃ １９４、ｐＣ２２１、ｐｃ２２
３、ｐＥ１９４、ｐｓＡ２１００、ＰＳＡ０５０１、Ｔ
Ｐ２、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＵＢ１１２、ｐＢＤ５、ＰＢＤ
８、ｐＢＤ９、ｐＢＤｌｏ、 ｐＢＤｌｌ、ｐＢＤ１２
、ＰＢＤ２０、ｐＢＤ３５、ｐＢＤ５４、ｐＯｃ； １
１９６、ｐＨＶ １２、ｐＨＶ ｌ ４、ｐＨＶ３３、
ｐＧ２１６５ オヨびｐＧｒＴＩ すどに結合させても
よい。得られたプラスミドは抗生物質耐性を付与し、か
つバチルスで機能する複製起原を含有しており、従って
、プラスミドｐＨｌ−１５およびｐＨｌ−１８の代りに
使用することができ、不発′：′、′ 明の目的を達するととができる。従って本発明は、組み
立てにプラスミドｐＨｌ−１５またはｐＨ１−１８を必
要とする例示した多機能ベクターだけに限定されるもの
ではない。
ルス機能性プラスミド、例えばプラスミドｐＢＤ１５お
よび以下のプラスミド（これらはＮＩＨ公報第８２〜９
９．１９８１、Ｒｅｃｏｍｂ １ｎａｎｔ ＤＮＡＴｅ
ｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ’４ （４１：
１４３ に記載されている）、即ちｐＰＬＩＱ、ＰＰ
Ｌ７０６５、ｐ１Ｍ１３、ｐＰＬ５７６、ｐＢｃ１６、
ｐＡＦｖｆ７７、ｐｃ １９４、ｐＣ２２１、ｐｃ２２
３、ｐＥ１９４、ｐｓＡ２１００、ＰＳＡ０５０１、Ｔ
Ｐ２、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＵＢ１１２、ｐＢＤ５、ＰＢＤ
８、ｐＢＤ９、ｐＢＤｌｏ、 ｐＢＤｌｌ、ｐＢＤ１２
、ＰＢＤ２０、ｐＢＤ３５、ｐＢＤ５４、ｐＯｃ； １
１９６、ｐＨＶ １２、ｐＨＶ ｌ ４、ｐＨＶ３３、
ｐＧ２１６５ オヨびｐＧｒＴＩ すどに結合させても
よい。得られたプラスミドは抗生物質耐性を付与し、か
つバチルスで機能する複製起原を含有しており、従って
、プラスミドｐＨｌ−１５およびｐＨｌ−１８の代りに
使用することができ、不発′：′、′ 明の目的を達するととができる。従って本発明は、組み
立てにプラスミドｐＨｌ−１５またはｐＨ１−１８を必
要とする例示した多機能ベクターだけに限定されるもの
ではない。
本明細書において、チオストレプトン、ネオマイシン、
カナマイシンおよびクロラムフェニコール抗生物質耐性
付与ＤＮＡセグメントは、それぞれプラスミドＰＩＡ２
（７） 〜１．６ Ｋ ｂ Ｂ ａｍ ＨＩ制限フラ
グメント、プラスミドｐＬＲ１の〜３，４ＫｂＢａｍＨ
１制限フラグメント、プラスミドｐＨ１−１６の〜４．
６Ｂ ａ ｍ ＨＩ制限フラグメントおよびプラスミド
ｐＨ１−１８の〜３．９ＢａｍＨＩ 制限フラグメン
トで例示したが、これは単なる例示に過ぎず、当業者で
あれば上記の抗生物質に対して耐性を付与するその他の
ＤＮＡセグメントを、個々にあるいは組み合わせて、組
み立てたり置きかえたりすることができる。プラスミド
ｐ Ｌｉ２の他のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグ
メントには、例えば〜１３ｉｃｂＰｓｔＩ制限フラグメ
ントおよび〜１．５ Ｋ ｂ Ｂ ａｍＨ１制限フラグ
メントのＢｃＪ ｌサブフラグメントが含まれる。プラ
スミドｐＬＡ ｌの他のネオマイシン耐性付与ＤＮＡセ
グメントには、例えば〜３，５ＫｂＰｓｔｌ制限フラグ
メ７ ） オＪ： ヒ〜３．４ Ｋｂ Ｂ ａｍＨ１制
限フラグメントの５ｓｔＩ−Ｋｐｎｌサブフラグメント
の大きい方などが含まれる。プラスミドｐｉｌｌ−１６
の他のカナマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントには、例
えば〜０．７４ Ｋｂ Ｈｐ ａ ＩＩフラグメントお
よびＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲｌ−Ｐｖｕｕ
ＡｖａＩ−ＥｃｏＲＩおよびＸｂａ Ｉ −Ｐｖｕ
ｎフラグメントの大きい方が含まれる。プラスミドｐ
Ｈ１−１８の他のクロラムフェニコール耐性付与ＤＮＡ
セグメントには、例えば〜０．８４ Ｈｐ ａ ｕ
フラグ、メントおよびＸｂａ ｌ −Ｐｖｕ ｎ、Ｂａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲｌおよびＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ７ラ
グメントの大きい方が含まれる。
カナマイシンおよびクロラムフェニコール抗生物質耐性
付与ＤＮＡセグメントは、それぞれプラスミドＰＩＡ２
（７） 〜１．６ Ｋ ｂ Ｂ ａｍ ＨＩ制限フラ
グメント、プラスミドｐＬＲ１の〜３，４ＫｂＢａｍＨ
１制限フラグメント、プラスミドｐＨ１−１６の〜４．
６Ｂ ａ ｍ ＨＩ制限フラグメントおよびプラスミド
ｐＨ１−１８の〜３．９ＢａｍＨＩ 制限フラグメン
トで例示したが、これは単なる例示に過ぎず、当業者で
あれば上記の抗生物質に対して耐性を付与するその他の
ＤＮＡセグメントを、個々にあるいは組み合わせて、組
み立てたり置きかえたりすることができる。プラスミド
ｐ Ｌｉ２の他のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグ
メントには、例えば〜１３ｉｃｂＰｓｔＩ制限フラグメ
ントおよび〜１．５ Ｋ ｂ Ｂ ａｍＨ１制限フラグ
メントのＢｃＪ ｌサブフラグメントが含まれる。プラ
スミドｐＬＡ ｌの他のネオマイシン耐性付与ＤＮＡセ
グメントには、例えば〜３，５ＫｂＰｓｔｌ制限フラグ
メ７ ） オＪ： ヒ〜３．４ Ｋｂ Ｂ ａｍＨ１制
限フラグメントの５ｓｔＩ−Ｋｐｎｌサブフラグメント
の大きい方などが含まれる。プラスミドｐｉｌｌ−１６
の他のカナマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントには、例
えば〜０．７４ Ｋｂ Ｈｐ ａ ＩＩフラグメントお
よびＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲｌ−Ｐｖｕｕ
ＡｖａＩ−ＥｃｏＲＩおよびＸｂａ Ｉ −Ｐｖｕ
ｎフラグメントの大きい方が含まれる。プラスミドｐ
Ｈ１−１８の他のクロラムフェニコール耐性付与ＤＮＡ
セグメントには、例えば〜０．８４ Ｈｐ ａ ｕ
フラグ、メントおよびＸｂａ ｌ −Ｐｖｕ ｎ、Ｂａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲｌおよびＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ７ラ
グメントの大きい方が含まれる。
上記の抗生物質およびその他の抗生物質、例えばハイグ
ロマイシン、バタテリオシン、ビアマイシン、ストレプ
トマイシン、タイロシン、エリスロマイシンなどに対す
る耐性を付与するその他のＤＮＡセグメントも本発明の
目的に使用することができる。更に、上記の抗生物質耐
性付与ＤＮＡセグメントの種々の機能的誘導体を、遺伝
暗号に従ってヌクレオチドを付加、脱離または置換する
ことによって組み立てることができる。これらの、ある
いはその他の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメントをスト
レプトマイセスおよびバチルス複製超厚含有制限フラグ
メントと結合させると本発明の範囲に包含される多機能
ベクターが得られることは容易に理解されよう。
ロマイシン、バタテリオシン、ビアマイシン、ストレプ
トマイシン、タイロシン、エリスロマイシンなどに対す
る耐性を付与するその他のＤＮＡセグメントも本発明の
目的に使用することができる。更に、上記の抗生物質耐
性付与ＤＮＡセグメントの種々の機能的誘導体を、遺伝
暗号に従ってヌクレオチドを付加、脱離または置換する
ことによって組み立てることができる。これらの、ある
いはその他の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメントをスト
レプトマイセスおよびバチルス複製超厚含有制限フラグ
メントと結合させると本発明の範囲に包含される多機能
ベクターが得られることは容易に理解されよう。
上述の複製超厚含有制限フラグメントおよび抗生物質耐
性付与ＤＮＡセグメントは、結合を容易にするために、
常法により修飾（改変）することができる。例えば分子
リンカ−を付加して、結合、または既知のその他の目的
に有用な特異な制限サイトを組み立てる。更に、ヌクレ
オチドを付加、脱離または置換することにより各種の制
限フラグメントを修飾し、特性を変え、そして種々の特
異な、あるいは追加の制限サイトをつくることができる
。当業者にはヌクレオチドの化学および遺伝暗号につい
ての知識があるので、どのヌクレオチドが交換可能であ
るか、そ！て特定の目的を達成する上でどのＤＮＡ修飾
が°噛ましいかがわかる。
性付与ＤＮＡセグメントは、結合を容易にするために、
常法により修飾（改変）することができる。例えば分子
リンカ−を付加して、結合、または既知のその他の目的
に有用な特異な制限サイトを組み立てる。更に、ヌクレ
オチドを付加、脱離または置換することにより各種の制
限フラグメントを修飾し、特性を変え、そして種々の特
異な、あるいは追加の制限サイトをつくることができる
。当業者にはヌクレオチドの化学および遺伝暗号につい
ての知識があるので、どのヌクレオチドが交換可能であ
るか、そ！て特定の目的を達成する上でどのＤＮＡ修飾
が°噛ましいかがわかる。
本発明に係る組替えＤＮＡクローニングベクターは、ス
トレストマイセスまたはバチルスの単一の種または株へ
の使用に限定されるものではない。
トレストマイセスまたはバチルスの単一の種または株へ
の使用に限定されるものではない。
多くのバチルスおよびストレプトマイセス分類群の宿主
細胞、特にその無制限株（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｅ
ｓｓｓｔｒａｉｎ） に導入することができる。更に
、ストレプトマイセスについては、その株の多くは経済
的に重要であってアミノグリコシド、マクロライド、β
−ラクタム、ポリエーテル、およびグリコペプチドなど
の抗生物質を産生ずる。無制限株は、当技術分野におい
てよく知られている常法および原理の拡張（ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ） （ｌｊ］
ＴＩｏｖｓｋａｙ、ａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４ ： ２０６．１９８０参
照）により、ストレプトマイセスおよびバチルス分類群
から容易に選択（選別）、単離される。無制限株の宿主
細胞には制限酵素がなく、従って形質転換の際プラスミ
ドＤ桐Ａが切断または分解５こと・石、ｄ
△ かない。本発明においては、本発明に係るベクタ１１１
１１ −のいかなる制限等イトも切断しない制限酵素を持って
いる宿主細胞も無制限株とみなす。
細胞、特にその無制限株（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｅ
ｓｓｓｔｒａｉｎ） に導入することができる。更に
、ストレプトマイセスについては、その株の多くは経済
的に重要であってアミノグリコシド、マクロライド、β
−ラクタム、ポリエーテル、およびグリコペプチドなど
の抗生物質を産生ずる。無制限株は、当技術分野におい
てよく知られている常法および原理の拡張（ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ） （ｌｊ］
ＴＩｏｖｓｋａｙ、ａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４ ： ２０６．１９８０参
照）により、ストレプトマイセスおよびバチルス分類群
から容易に選択（選別）、単離される。無制限株の宿主
細胞には制限酵素がなく、従って形質転換の際プラスミ
ドＤ桐Ａが切断または分解５こと・石、ｄ
△ かない。本発明においては、本発明に係るベクタ１１１
１１ −のいかなる制限等イトも切断しない制限酵素を持って
いる宿主細胞も無制限株とみなす。
アミノグリコシド抗生物質を生産するストレプトマイセ
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することのできる特に有用な
宿主細胞は、例えば５ 、ｋａｎａ−ｍｙｃｅｔｉｃｕ
ｓ （カナマイシン）、Ｓ、ｃｈｒｅｓｔｃｍｙｃｅｔ
ｉｃｕｓ （ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（抗生物質５Ｆ
−７６７）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ△ （抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ、ｆｌａｖｏｐｅｒｓｉｃ
ｕｓ （ｘペタチノマイシン）、Ｓ、５ｐｅｃｔａｂｉ
ｌ ｉｓ（アクチノスペクタシン）、Ｓ、ｒｉｒｍｓｕ
ｓ ｆｏｍｎ ｐａｒａｍｍｙｃｉｎｕｓ （パロモマ
イシン、カテヌリン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ変種＋１ｔ
ａｌ １ｃｕｓ （７ミノシジン）、Ｓ、ｂｌｕｅｎｓ
ｉｓ変種、ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエンソマイシン）
、Ｓ、ｃａｔｅｎｕｌａｅ （カテヌリン）、Ｓ。
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することのできる特に有用な
宿主細胞は、例えば５ 、ｋａｎａ−ｍｙｃｅｔｉｃｕ
ｓ （カナマイシン）、Ｓ、ｃｈｒｅｓｔｃｍｙｃｅｔ
ｉｃｕｓ （ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（抗生物質５Ｆ
−７６７）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ△ （抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ、ｆｌａｖｏｐｅｒｓｉｃ
ｕｓ （ｘペタチノマイシン）、Ｓ、５ｐｅｃｔａｂｉ
ｌ ｉｓ（アクチノスペクタシン）、Ｓ、ｒｉｒｍｓｕ
ｓ ｆｏｍｎ ｐａｒａｍｍｙｃｉｎｕｓ （パロモマ
イシン、カテヌリン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ変種＋１ｔ
ａｌ １ｃｕｓ （７ミノシジン）、Ｓ、ｂｌｕｅｎｓ
ｉｓ変種、ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエンソマイシン）
、Ｓ、ｃａｔｅｎｕｌａｅ （カテヌリン）、Ｓ。
ｏｌ １ｖｏｒｅＬｉｃｕｌ ｉ変種、ｃｅｌｌｕｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ （デストマイシンＡ）、Ｓ、ｔｅｎｅｂ
ｒａｒｉｕｓ（トブラマイシン、アブラマイシン）、Ｓ
、１ａｖｅｎｄｕｌａｅ （ネオマイシン）、Ｓ。
ｐｈｉｌｕｓ （デストマイシンＡ）、Ｓ、ｔｅｎｅｂ
ｒａｒｉｕｓ（トブラマイシン、アブラマイシン）、Ｓ
、１ａｖｅｎｄｕｌａｅ （ネオマイシン）、Ｓ。
ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ（ネオマイシン）、Ｓ、ａ
ｌｂｕｓ変種。
ｌｂｕｓ変種。
ｍｅｔａｎｙｃｉｎｕｓ（メタマイシン）、Ｓ、ｈｙｇ
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ変種、 ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ
（スペクチノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋｉ−ｎｉｅｎｓｉ
ｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （ス
トレプトマイシン）、Ｓ 、ｅｒｙｔｈｏｃｈｒａｎｏ
ｇｅｎｅｓ変種。
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ変種、 ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ
（スペクチノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋｉ−ｎｉｅｎｓｉ
ｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （ス
トレプトマイシン）、Ｓ 、ｅｒｙｔｈｏｃｈｒａｎｏ
ｇｅｎｅｓ変種。
ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、
ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン） 、Ｓ、ｇ
ａｌｂｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒａｍｅｕ
ｓ（ストレプトマイシン〕、Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（
ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒｒａｓｈｕｅｎｓｉｓ（
ストレプトマイシン）、Ｓ 、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓ変種。
ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン） 、Ｓ、ｇ
ａｌｂｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒａｍｅｕ
ｓ（ストレプトマイシン〕、Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（
ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒｒａｓｈｕｅｎｓｉｓ（
ストレプトマイシン）、Ｓ 、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓ変種。
１１ｒｒＯｎｅｕｓ（バリダマイシン）、Ｓ、ｒｉｍｏ
ｆａｃｉｅｎｓ（デストマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂｏｓｕｓ （グ
レボマイシン） 、 Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ（ヒブリマイ
シン、ネオマイシン）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ（
抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、ａｑｕａｃａｎｕｓ
（Ｎ−メチルヒグロマイシ７Ｂ）、Ｓ、ｃｒｙｓｔａ
ｌ ｌ １ｎｕｓ（ヒグロマイシ７Ａ）、Ｓ、ｎｏｂｏ
ｒｉｔ−ｏｅｎｓｉｓ （ヒグロマイシン）、Ｓ、ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ヒグロマイシン〕、Ｓ、ａ
ｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ（ヒゲ０フイシン）、Ｓ 、ｋａ
ｓｕｇａｓｐｉ ｎｕｓ （カスガマイシン）、Ｓ、ｋ
ａｓｕｇａｅｎｓｉｓ（カスガマイシン）、Ｓ、ｎｅｔ
ｒｏｐｓｉｇ（抗生物質ＬＬ−／Ｗ３１ ）、Ｓ、１ｉ
ｖｉｄｕｓ（リビドマイシン）、Ｓ、ｈｏ［ｕｅｎ−ｓ
ｉｓ （セルドマイシン複合体）、およびＳ、ｃａｎｕ
ｓ（リボシルバロマミン）の無制限細胞である。
ｆａｃｉｅｎｓ（デストマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂｏｓｕｓ （グ
レボマイシン） 、 Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ（ヒブリマイ
シン、ネオマイシン）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ（
抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、ａｑｕａｃａｎｕｓ
（Ｎ−メチルヒグロマイシ７Ｂ）、Ｓ、ｃｒｙｓｔａ
ｌ ｌ １ｎｕｓ（ヒグロマイシ７Ａ）、Ｓ、ｎｏｂｏ
ｒｉｔ−ｏｅｎｓｉｓ （ヒグロマイシン）、Ｓ、ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ヒグロマイシン〕、Ｓ、ａ
ｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ（ヒゲ０フイシン）、Ｓ 、ｋａ
ｓｕｇａｓｐｉ ｎｕｓ （カスガマイシン）、Ｓ、ｋ
ａｓｕｇａｅｎｓｉｓ（カスガマイシン）、Ｓ、ｎｅｔ
ｒｏｐｓｉｇ（抗生物質ＬＬ−／Ｗ３１ ）、Ｓ、１ｉ
ｖｉｄｕｓ（リビドマイシン）、Ｓ、ｈｏ［ｕｅｎ−ｓ
ｉｓ （セルドマイシン複合体）、およびＳ、ｃａｎｕ
ｓ（リボシルバロマミン）の無制限細胞である。
マクロライド抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばＳ、ｃａｅｌｅｓｔｉｓ（抗生物質Ｍ
１８８）、Ｓ、ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（プラテノマイシン
）、Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ変種、 ｖｏ鳳ｕｂｉｌｉｓ（抗
生物質Ｔ２６３６）、Ｓ、ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（メチ
マイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ（バンドリ
ン）、Ｓ 、ｎａｒｂｏｎｅｎｓ ｉ ｓ （ジョサマ
イシン、ナルボマイシン）、Ｓ、［ｕｎｇｉｃｉｄｉｃ
ｕｓ （抗生物質ＮＡ−１８１）、Ｓｏｇｒｉｓｅｏｆ
ａｃｉｅｎｓ（抗生物質ＰＡ１３３Ａ％Ｂ）、Ｓ、ｒｏ
ｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ（アルボサイクリン）、Ｓ 、ｂ
ｒｕｎｅｏｇｒ−ｉ ５ｅｕｓ （アルボサイクリン〕
、Ｓ 、ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（アルボサ
イクリン）、Ｓ、ｃｉｎｅｒｏｃｈｒａｎｏｇｅｎｅｓ
（シラマイシルＢ）、Ｓ、ａｌｂｕｓ（アルボマイセチ
ン）、Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ（アルボマイシン、ピクロマ
イシン）、Ｓ 、ｒｏｃｈｅ ｉ （ランカシジン、ボ
レリジン）、Ｓ、ｖ、ｉｏｌａ−ｃｅｏｎｉｇｅｒ（ラ
ンカシジン）、Ｓｌｇｒｉｓｅｕｓ（ボレリジン）、Ｓ
、ｍａｉ ｚｅｕｓ （インゲラマイシン）、Ｓ、ａ
ｌｂｕｓ変種。
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばＳ、ｃａｅｌｅｓｔｉｓ（抗生物質Ｍ
１８８）、Ｓ、ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（プラテノマイシン
）、Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ変種、 ｖｏ鳳ｕｂｉｌｉｓ（抗
生物質Ｔ２６３６）、Ｓ、ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（メチ
マイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ（バンドリ
ン）、Ｓ 、ｎａｒｂｏｎｅｎｓ ｉ ｓ （ジョサマ
イシン、ナルボマイシン）、Ｓ、［ｕｎｇｉｃｉｄｉｃ
ｕｓ （抗生物質ＮＡ−１８１）、Ｓｏｇｒｉｓｅｏｆ
ａｃｉｅｎｓ（抗生物質ＰＡ１３３Ａ％Ｂ）、Ｓ、ｒｏ
ｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ（アルボサイクリン）、Ｓ 、ｂ
ｒｕｎｅｏｇｒ−ｉ ５ｅｕｓ （アルボサイクリン〕
、Ｓ 、ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（アルボサ
イクリン）、Ｓ、ｃｉｎｅｒｏｃｈｒａｎｏｇｅｎｅｓ
（シラマイシルＢ）、Ｓ、ａｌｂｕｓ（アルボマイセチ
ン）、Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ（アルボマイシン、ピクロマ
イシン）、Ｓ 、ｒｏｃｈｅ ｉ （ランカシジン、ボ
レリジン）、Ｓ、ｖ、ｉｏｌａ−ｃｅｏｎｉｇｅｒ（ラ
ンカシジン）、Ｓｌｇｒｉｓｅｕｓ（ボレリジン）、Ｓ
、ｍａｉ ｚｅｕｓ （インゲラマイシン）、Ｓ、ａ
ｌｂｕｓ変種。
ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（＋：ｌレイマイシン）、
Ｓｏｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ、′□ □ （アセチル−ロイコマイシン、・ニスピノマイシン）、
Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（ツリマイシン、レロ
マイシン、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシ
ン）、Ｓｏｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ ｉｓ（レロ？イ
シン）、Ｓ、１ａｖｅｎｄｕｌａｅ（アルトガマイシン
）、Ｓ、ｒｉ＋ｎｏｓｕｓ （＝ ニートラマイシン）
、Ｓ 、ｄｅｌ ｔａｅ（デルタマイシン）、Ｓ、ｆｕ
ｎｇ−ｉｃｉｄｉｃｕｓ変種、ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｉｃｕｓ （ｘ スビ／？イシン）、Ｓ、ｆｕｒｄｉｃ
ｉｄｉｃｕｓ（ミデカマイシン）、Ｓ、ａｒｒｂｏｆａ
ｃ−ｉｅｎｓ（ホロマシジ７Ｄ）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄ
ｉｃｕｓ （メチマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ
（グリソリキシン）、Ｓ。
Ｓｏｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ、′□ □ （アセチル−ロイコマイシン、・ニスピノマイシン）、
Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（ツリマイシン、レロ
マイシン、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシ
ン）、Ｓｏｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ ｉｓ（レロ？イ
シン）、Ｓ、１ａｖｅｎｄｕｌａｅ（アルトガマイシン
）、Ｓ、ｒｉ＋ｎｏｓｕｓ （＝ ニートラマイシン）
、Ｓ 、ｄｅｌ ｔａｅ（デルタマイシン）、Ｓ、ｆｕ
ｎｇ−ｉｃｉｄｉｃｕｓ変種、ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｉｃｕｓ （ｘ スビ／？イシン）、Ｓ、ｆｕｒｄｉｃ
ｉｄｉｃｕｓ（ミデカマイシン）、Ｓ、ａｒｒｂｏｆａ
ｃ−ｉｅｎｓ（ホロマシジ７Ｄ）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄ
ｉｃｕｓ （メチマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ
（グリソリキシン）、Ｓ。
ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍ＜ｇｅｎｅｓ（７ｖ ロフイシン
、ジノマイシン）、Ｓ、ｆｉｒｒｔｈｒｉａＬｕｓ（ア
７ ロフイシン）、Ｓ、ｆａｓｃｉｃ−ｕｌｕｓ（７７
口フィシン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ （ｘリスロマ
イシン）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｗ（オレアンドマ
イシン）、Ｓ 、ｏｌ ｉｖｏｃｈｒａｍｇｅｎｅｓ（
オレアンドマイシン）、Ｓ、ｓｐｉｎｉｃｈｒａｎｏｇ
ｅｎｅｓ変種、ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ ｉ ｓ （クジ
マイシン）、Ｓ、ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ（ｏイコ
マイシン）、Ｓ、ｎａｒｂ−ｏｎｅｎｓｉｓ＆種、 ｊ
ｏｓａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（ｏインマイシンＡ３、ジョ
サマイシン）、Ｓ’、ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ（ミ
コノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ（’４
ヤ／ｌ／ ：］ フィシン）、Ｓ。
、ジノマイシン）、Ｓ、ｆｉｒｒｔｈｒｉａＬｕｓ（ア
７ ロフイシン）、Ｓ、ｆａｓｃｉｃ−ｕｌｕｓ（７７
口フィシン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ （ｘリスロマ
イシン）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｗ（オレアンドマ
イシン）、Ｓ 、ｏｌ ｉｖｏｃｈｒａｍｇｅｎｅｓ（
オレアンドマイシン）、Ｓ、ｓｐｉｎｉｃｈｒａｎｏｇ
ｅｎｅｓ変種、ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ ｉ ｓ （クジ
マイシン）、Ｓ、ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ（ｏイコ
マイシン）、Ｓ、ｎａｒｂ−ｏｎｅｎｓｉｓ＆種、 ｊ
ｏｓａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（ｏインマイシンＡ３、ジョ
サマイシン）、Ｓ’、ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ（ミ
コノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ（’４
ヤ／ｌ／ ：］ フィシン）、Ｓ。
ｃｉｒｒａｔｕｓ（シラマイシル″１つ、Ｓ、ｄｊａｋ
ａｒｔｅｎｓｉｓ （＝ダＳ、ｆｒａｄｉａｅ（タイロ
シン、ラクテノシン、マクロシン）、Ｓ、ｇｏｓｈｉｋ
ｉｅｎｉｉｓ（ハ７ダマイシン）、Ｓｏｇｒ−ｉｓｅｏ
ｆｌａｖｕｓ（７キユマイシン）、Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄ
ｉｉ （カルボマイシン）、Ｓ、ｔｅｎｄａｅ（カル
ボマイシン）、Ｓ 、ｓｍｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ （カ
ルボマイシン）、Ｓ、Ｌｈｅｒｍｏｔｏｌ−ｅｒａｎｓ
（カルボマイシン）、およびＳ、ａｌｂｉｒｅｔ １ｃ
ｕｌ ｉ（カルボマイシン）の無制限細胞である。
ａｒｔｅｎｓｉｓ （＝ダＳ、ｆｒａｄｉａｅ（タイロ
シン、ラクテノシン、マクロシン）、Ｓ、ｇｏｓｈｉｋ
ｉｅｎｉｉｓ（ハ７ダマイシン）、Ｓｏｇｒ−ｉｓｅｏ
ｆｌａｖｕｓ（７キユマイシン）、Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄ
ｉｉ （カルボマイシン）、Ｓ、ｔｅｎｄａｅ（カル
ボマイシン）、Ｓ 、ｓｍｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ （カ
ルボマイシン）、Ｓ、Ｌｈｅｒｍｏｔｏｌ−ｅｒａｎｓ
（カルボマイシン）、およびＳ、ａｌｂｉｒｅｔ １ｃ
ｕｌ ｉ（カルボマイシン）の無制限細胞である。
β−ラクタム抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばＳ、ｌｉｐｍ−ｎｉ ｉ （Ａ１６８
８４、 ＭＭ４５５０． ＭＭ１３９０２）、 Ｓ、
ｃｌａｖｕｌ ｉｇ−ｅｒｕｓ （Ａ１６８８６Ｂ、ク
ラプラン酸）、Ｓ、ｌａＣＬａ−ｍｄｕｒａｎｓ （セ
フ ７ フィシンＣ）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ（セファマ
イシフＡ、Ｂ）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （
デアセトキシセファロスポリンＣ）、Ｓｏｗａｄａｙａ
ｍｅｎｓｉｓ（ｖ８−３４４２−Ｄ）、Ｓ、ｃｈａｒｔ
ｒｅｕｓｉｓ （Ｓ Ｆ １５２３ ）、Ｓ、ｈｅ−ｔ
ｅｒａｎｏｒｐｈｕｓおよびＳ、ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ
（０２０８１Ｘ） ：Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ
、 Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ、 Ｓ、１ｕｌｓＬｅｄ
ｉｉ、 Ｓ。
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばＳ、ｌｉｐｍ−ｎｉ ｉ （Ａ１６８
８４、 ＭＭ４５５０． ＭＭ１３９０２）、 Ｓ、
ｃｌａｖｕｌ ｉｇ−ｅｒｕｓ （Ａ１６８８６Ｂ、ク
ラプラン酸）、Ｓ、ｌａＣＬａ−ｍｄｕｒａｎｓ （セ
フ ７ フィシンＣ）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ（セファマ
イシフＡ、Ｂ）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （
デアセトキシセファロスポリンＣ）、Ｓｏｗａｄａｙａ
ｍｅｎｓｉｓ（ｖ８−３４４２−Ｄ）、Ｓ、ｃｈａｒｔ
ｒｅｕｓｉｓ （Ｓ Ｆ １５２３ ）、Ｓ、ｈｅ−ｔ
ｅｒａｎｏｒｐｈｕｓおよびＳ、ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ
（０２０８１Ｘ） ：Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ
、 Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ、 Ｓ、１ｕｌｓＬｅｄ
ｉｉ、 Ｓ。
ｒｏｃｈｅｉおよびＳ、ｖｉｒｉｄｏｃｈｒａｎｏｇｅ
ｎｅｓ （セフ ７ ？ イシ７Ａ、 Ｂ ） ；
Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ（チェナマイシン）；およびＳ、
ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、 Ｓ、ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓＳ
Ｓ、ｆｌａｖｕｓ、 Ｓ、ｆｕｌ−ｖｏｖｉｒｌｄｉｓ
、 Ｓ、ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ、およびＳ 、ｓ １
ｏｙａｅｎｓ ｉ（ＭＭ４５５０ およびＭＭ１３９０
２）の無制限細胞である。
ｎｅｓ （セフ ７ ？ イシ７Ａ、 Ｂ ） ；
Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ（チェナマイシン）；およびＳ、
ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、 Ｓ、ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓＳ
Ｓ、ｆｌａｖｕｓ、 Ｓ、ｆｕｌ−ｖｏｖｉｒｌｄｉｓ
、 Ｓ、ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ、およびＳ 、ｓ １
ｏｙａｅｎｓ ｉ（ＭＭ４５５０ およびＭＭ１３９０
２）の無制限細胞である。
ポリエーテル抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞で・あって、それ
に本発明のベクターを導又することのできる特に有用な
宿主細胞は、例えばＳ、ａｌｂｕｓ（Ａ２０４、Ａ ２
８６９５ＡおよびＢ１ サリノマイシン）、Ｓ、ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （Ａ２１８、エメリジッド、
ＤＥ３９３６．、Ａ１２０Ａ、Ａ２８６９５ＡおよびＢ
１エテロマイシン、ジノマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕ
ｓ （グリソリキシン）、Ｓ、ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ
（イオ／フィシン）、Ｓ 、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ変
種、 ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉｃｕｓ（ライドロマイシン
）、Ｓ、１ａ−ｓａｌｉｅｎｓｉｓ（ラサロシツド）、
Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ（ロノマイシン）、Ｓ
、ｃａｃａｏｉ変種、 ａｓｏｅｎｓｉｓ （リソセリ
ン）、Ｓ、ｃｉｎｎａｍｎｅｎｓｉｓ（−１−ネンシン
）、Ｓ＋ａｕｒｅｏ−ｆａｃ １ｅｎｓ （ナラジン）
、Ｓｏｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ （ＲＰ３０５０４）、
Ｓ、ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ（リソセリン）、Ｓ、
ｆｌａｖｅｏｌｕｓ （ＣＰ３８９３６）、Ｓ、ｍｘｔ
ａｂｉｌ ｉｓ （Ｓ−１１７４３ａ ） 、ｋヨヒＳ
−ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ にグリジン）の無制限
細胞である。
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞で・あって、それ
に本発明のベクターを導又することのできる特に有用な
宿主細胞は、例えばＳ、ａｌｂｕｓ（Ａ２０４、Ａ ２
８６９５ＡおよびＢ１ サリノマイシン）、Ｓ、ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （Ａ２１８、エメリジッド、
ＤＥ３９３６．、Ａ１２０Ａ、Ａ２８６９５ＡおよびＢ
１エテロマイシン、ジノマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕ
ｓ （グリソリキシン）、Ｓ、ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ
（イオ／フィシン）、Ｓ 、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ変
種、 ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉｃｕｓ（ライドロマイシン
）、Ｓ、１ａ−ｓａｌｉｅｎｓｉｓ（ラサロシツド）、
Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ（ロノマイシン）、Ｓ
、ｃａｃａｏｉ変種、 ａｓｏｅｎｓｉｓ （リソセリ
ン）、Ｓ、ｃｉｎｎａｍｎｅｎｓｉｓ（−１−ネンシン
）、Ｓ＋ａｕｒｅｏ−ｆａｃ １ｅｎｓ （ナラジン）
、Ｓｏｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ （ＲＰ３０５０４）、
Ｓ、ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ（リソセリン）、Ｓ、
ｆｌａｖｅｏｌｕｓ （ＣＰ３８９３６）、Ｓ、ｍｘｔ
ａｂｉｌ ｉｓ （Ｓ−１１７４３ａ ） 、ｋヨヒＳ
−ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ にグリジン）の無制限
細胞である。
グリコペプチド抗生物質群を生産するストレプトマイセ
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することができる特に有用な
宿主細胞は、例えばＳ、ｃｒｉ−ｅｎｔａｌｉｓ およ
びＳ、ｈａｒａｎｏｍｃｈｉｅｎｓｉｓ （パンコマイ
シ７ ） ； Ｓ、ｃ２［ｎｄｉｄｕｓ （Ａ−３６５
１２、アボパルシン）、およびＳ、ｅｂｕｒｏｓｐｏｒ
ｅｕｓ（ＬＬ−ＡＭ ３７４ ）の無制限細胞である。
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することができる特に有用な
宿主細胞は、例えばＳ、ｃｒｉ−ｅｎｔａｌｉｓ およ
びＳ、ｈａｒａｎｏｍｃｈｉｅｎｓｉｓ （パンコマイ
シ７ ） ； Ｓ、ｃ２［ｎｄｉｄｕｓ （Ａ−３６５
１２、アボパルシン）、およびＳ、ｅｂｕｒｏｓｐｏｒ
ｅｕｓ（ＬＬ−ＡＭ ３７４ ）の無制限細胞である。
本発明のベクターを使用することができ、導入すること
のできる他のストレプトマイセス無制限株の好ましい宿
主細胞には、Ｓ、ｃｏｅｌ １ｃｏｌｏｒ； Ｓ、ｇｒ
ａ−ｎｕｌｏｒｕｂｅｒ、 Ｓ、ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕ
ｓ、 Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ、、Ｓ、ｅｓｐｉｎｏｓｕ
ｓ。
のできる他のストレプトマイセス無制限株の好ましい宿
主細胞には、Ｓ、ｃｏｅｌ １ｃｏｌｏｒ； Ｓ、ｇｒ
ａ−ｎｕｌｏｒｕｂｅｒ、 Ｓ、ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕ
ｓ、 Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ、、Ｓ、ｅｓｐｉｎｏｓｕ
ｓ。
およびＳ 、ａｚｕｒｅｕｓ の無制限細胞が含まれ
る。
る。
本発明のベクターを導入することのできる特に有用なバ
チルスの無制限株の好ましい宿主細胞は、例えばＢ、５
ｕｂｔｉｌ ｉｓ、 Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ １１
１２、Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎ、ｓｉｓ 、 Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ変種、１ｓｒａｅｌｉｅｎ
ｓｉｓ、Ｂ。
チルスの無制限株の好ましい宿主細胞は、例えばＢ、５
ｕｂｔｉｌ ｉｓ、 Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ １１
１２、Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎ、ｓｉｓ 、 Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ変種、１ｓｒａｅｌｉｅｎ
ｓｉｓ、Ｂ。
ｃｅｒｅｕｓ、 Ｂ、ａｎｔｈｒａｃｉｓ、ＩＢ、ｐｉ
ｌｉｆｏｒｍｉｓ、 Ｂ、ｔｒｏｐｉｃｕｓｌＢ、ａｌ
ｖｅｉ、 Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ、 Ｂ、ｐｕｎｉ
ｌｕｓ、 Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉＥｏｉｍｉｓ。
ｌｉｆｏｒｍｉｓ、 Ｂ、ｔｒｏｐｉｃｕｓｌＢ、ａｌ
ｖｅｉ、 Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ、 Ｂ、ｐｕｎｉ
ｌｕｓ、 Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉＥｏｉｍｉｓ。
Ｂ、ｐｏｌｙｎｙｘａ、 Ｂ、ｒｍｃｅｒａｎｓ、 Ｂ
、ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅ−ｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ、 Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ、 Ｂ、ｆ
ｉｎｍｓｌＢ、ｂｒｅｖｉｓ、 Ｂ。
、ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅ−ｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ、 Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ、 Ｂ、ｆ
ｉｎｍｓｌＢ、ｂｒｅｖｉｓ、 Ｂ。
５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ 、 Ｂ、ｐａｓｔｅｕｒｉｉ
１Ｂ＋ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ 、 −Ｂ、１ａｒｖａ
ｅ 。
１Ｂ＋ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ 、 −Ｂ、１ａｒｖａ
ｅ 。
Ｂ、ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、 Ｂ、ａｐｉａｒｕｓ、
Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ。
Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ。
Ｂ、１ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ 、およびＢ、ｐｏｐｉ
ｌｌａｅの無制限細胞である。
ｌｌａｅの無制限細胞である。
上記の代表的なストレプトマイセスおよびバチルス宿主
細胞のほかに、本発明のベクターはその他の分類群、例
えば５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、 ５ｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃ−ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 、 ５ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ １ 関連放線菌類、例えばＳｔｒｅｐ
ｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｎ、 Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ
ｓ、 Ｎｏｃａｒｄｉａ。
細胞のほかに、本発明のベクターはその他の分類群、例
えば５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、 ５ｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃ−ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 、 ５ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ １ 関連放線菌類、例えばＳｔｒｅｐ
ｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｎ、 Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ
ｓ、 Ｎｏｃａｒｄｉａ。
Ｍｉ ｃｒｃｍａｎｏｓｐｏｒａおよびＬａｃｔｏｂａ
ｃｉｌ Ｉｕｓなどの無制限株の細胞に導入することが
でき、使用することができる。更に、イーコリレプリコ
ンを含有している多機能ベクターは、イーコリに導入す
ることもできる。この様畝本発明のベクターは広い適用
性を有し、各種の生物の宿主細胞に導入すること力、１ ができる。
ｃｉｌ Ｉｕｓなどの無制限株の細胞に導入することが
でき、使用することができる。更に、イーコリレプリコ
ンを含有している多機能ベクターは、イーコリに導入す
ることもできる。この様畝本発明のベクターは広い適用
性を有し、各種の生物の宿主細胞に導入すること力、１ ができる。
本発明の実施態様は全て有用なものであるが、本発明の
組替えＤＮＡクローニングベクターおよび形質転換体の
ある物は特に有用である。即ち、好ましいベクターはプ
ラスミドＰＢＳＩ、ＰＢＳ２． ＰＢＳ民ｐＢｓ ７お
よびｐＢＳ９であり、好ましい形質転換体はＳｔｒｅｐ
ｔｃｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢｓｌ、
Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢｓＪＳ、ａｒＩｔｈ
ｏ［ａｃｉｅｎｓ／ｐＢｓ５、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＢｓ７．５Ｊｎｂｏｆａｃ−ｉｅｎｓ／ｐＢＳ
ｇ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌ ｉｓ Ｍｌ １
１：￥’ＰＢＳ １、Ｂ、５ｕｂ−ｔｉ１ｉｓ／Ｍ１１
１ｐｐＢＳ２、Ｂ、５ｕｂｔｉ１ｉｓ、Ａ（１１１ｐｐ
ＢＳ５、Ｂ。
組替えＤＮＡクローニングベクターおよび形質転換体の
ある物は特に有用である。即ち、好ましいベクターはプ
ラスミドＰＢＳＩ、ＰＢＳ２． ＰＢＳ民ｐＢｓ ７お
よびｐＢＳ９であり、好ましい形質転換体はＳｔｒｅｐ
ｔｃｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢｓｌ、
Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢｓＪＳ、ａｒＩｔｈ
ｏ［ａｃｉｅｎｓ／ｐＢｓ５、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＢｓ７．５Ｊｎｂｏｆａｃ−ｉｅｎｓ／ｐＢＳ
ｇ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌ ｉｓ Ｍｌ １
１：￥’ＰＢＳ １、Ｂ、５ｕｂ−ｔｉ１ｉｓ／Ｍ１１
１ｐｐＢＳ２、Ｂ、５ｕｂｔｉ１ｉｓ、Ａ（１１１ｐｐ
ＢＳ５、Ｂ。
５ｕｂｔｉｌ ｉｓ／／Ｍ１１１ｙｐＢＳ７、Ｂ、５ｕ
ｂＬｉ１ｉｓ／ＭＩｌ１３／ｐＢＳ９およびＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＢｓ９である。
ｂＬｉ１ｉｓ／ＭＩｌ１３／ｐＢＳ９およびＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＢｓ９である。
本発明に係る組替えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体は、広い利用性を有し、ストレプトマイセス
、バチルス、イーコリおよび関連生物に使用するのに好
適な多機能クローニングビーヒクル（媒介物）としての
必要性を満たすのに役立っている。更に、形質転換され
ていない宿主細胞に対して有毒である抗生物質に対して
耐性を付与する本発明に係るベクターの能力は、形質転
換体を選択（選別）するための便利な手段ともなる。ベ
クターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し、選択する
ことが実際的に必要であるので、このことは極めて重要
である。その存在を知る為の機能試験がないその他のＤ
ＮＡセグメントも本発明のベクターに挿入することがで
き、この選択能のないＤＮＡを含有している形質転換体
を、適当な抗生物質選択によって単離することができる
。
形質転換体は、広い利用性を有し、ストレプトマイセス
、バチルス、イーコリおよび関連生物に使用するのに好
適な多機能クローニングビーヒクル（媒介物）としての
必要性を満たすのに役立っている。更に、形質転換され
ていない宿主細胞に対して有毒である抗生物質に対して
耐性を付与する本発明に係るベクターの能力は、形質転
換体を選択（選別）するための便利な手段ともなる。ベ
クターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し、選択する
ことが実際的に必要であるので、このことは極めて重要
である。その存在を知る為の機能試験がないその他のＤ
ＮＡセグメントも本発明のベクターに挿入することがで
き、この選択能のないＤＮＡを含有している形質転換体
を、適当な抗生物質選択によって単離することができる
。
この様な非選択性のＤＮＡセグメントは、プラスミドの
機能および複製に必要な領域内を除いて、あらゆる位置
（サイト）に挿入することができ、これには抗生物質修
飾酵素を特定している遺伝子およびあらゆるタイプの調
節遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではな
い。
機能および複製に必要な領域内を除いて、あらゆる位置
（サイト）に挿入することができ、これには抗生物質修
飾酵素を特定している遺伝子およびあらゆるタイプの調
節遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではな
い。
より具体的には、遺伝子を含有している非選択性ＤＮＡ
セグメントは、例えば代表的プラスミドｐＢｓ９に、〜
１，６ＫｂＢａｍＨＩ耐性付与フラグメントの中央のＳ
ａ１！Ｉ制限サイトで挿入することができる。この様な
挿入によってチオストレプトン耐性遺伝子が不活性化さ
れ、従って、この組替えプラスミドを含有しているスト
レプトマイセス形質転換体を容易に確認することができ
る。これは次の如くして行なう；先ずネオマイシン耐性
を選択し、次いでチオストレプトンに耐性を持たないネ
オマイシン耐性ストレプトマイセス形質転換体ヲ確認す
る。同様に、ある特定のＤＮＡセグメントを、例えば〜
３，４ＫｂＢａｍＨ１耐性付与フラグメントの内部Ｂａ
ｍＨＩ制限サイトに挿入すると、ネオマイシン耐性遺伝
子が不活性化される。従って、この組替えプラスミドを
保有しているストレプトマイセス形質転換体は、先づチ
オストレプトン耐性を選択し、次いでネオマイシンに対
して耐性を持っていないチオストレプトン耐性形質転換
体を調べることによって容易に確認することができる。
セグメントは、例えば代表的プラスミドｐＢｓ９に、〜
１，６ＫｂＢａｍＨＩ耐性付与フラグメントの中央のＳ
ａ１！Ｉ制限サイトで挿入することができる。この様な
挿入によってチオストレプトン耐性遺伝子が不活性化さ
れ、従って、この組替えプラスミドを含有しているスト
レプトマイセス形質転換体を容易に確認することができ
る。これは次の如くして行なう；先ずネオマイシン耐性
を選択し、次いでチオストレプトンに耐性を持たないネ
オマイシン耐性ストレプトマイセス形質転換体ヲ確認す
る。同様に、ある特定のＤＮＡセグメントを、例えば〜
３，４ＫｂＢａｍＨ１耐性付与フラグメントの内部Ｂａ
ｍＨＩ制限サイトに挿入すると、ネオマイシン耐性遺伝
子が不活性化される。従って、この組替えプラスミドを
保有しているストレプトマイセス形質転換体は、先づチ
オストレプトン耐性を選択し、次いでネオマイシンに対
して耐性を持っていないチオストレプトン耐性形質転換
体を調べることによって容易に確認することができる。
従って、ストレプトマイセスにおいて抗生物質耐性を選
択するこの能力によって、問題としている特定の非選択
性ＤＮＡを含有している極めて少数の細胞を有効に分離
することができる。
択するこの能力によって、問題としている特定の非選択
性ＤＮＡを含有している極めて少数の細胞を有効に分離
することができる。
更に、遺伝子を含有している非選択性ＤＮＡセグメント
は、例えば代表的な、プラスミドｐＢｓ９のカナマイシ
ン耐性付与フラグメントのＢｇＪｎ制限サイ・トに挿入
することができる。この様な挿入でカナマイシン耐性遺
伝子は不活性化され、従ってこの組替えプラスミドを含
有しているバチルス形質転換体を容易に確認することが
できる。これは次の如＜シて行なう：先づクロラムフェ
ニコール耐性を選択し、次いでカナマイシンに対して耐
性ヲ持たないクロラムフェニコール耐性バチルス形質転
換体を確認する。同様にして、所望のＤＮＡ文グメント
を、例えばクロラムフェニコール耐性付与フラグメント
の内部ＭｂｏＩＩ制限サイトに挿入するとクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子が不活性化される。従って、この組
替えプラスミドを保持しているバチルス形質転換体は、
先づカナマイシン耐性を選択し、次いでクロラムフェニ
コールに対する耐性を持たないカナマイシン耐性形質転
換体を確認することにより容易に同定される。従って、
バチルスにおいて抗生物質耐性を選択するこの能力によ
って、間暉としている特定の非選択性１１ ＤＮＡを含有していで、極めて少数の細胞を効率よく分
離することができる。この様な選択は、イーコリに於い
ても行なうことができる。
は、例えば代表的な、プラスミドｐＢｓ９のカナマイシ
ン耐性付与フラグメントのＢｇＪｎ制限サイ・トに挿入
することができる。この様な挿入でカナマイシン耐性遺
伝子は不活性化され、従ってこの組替えプラスミドを含
有しているバチルス形質転換体を容易に確認することが
できる。これは次の如＜シて行なう：先づクロラムフェ
ニコール耐性を選択し、次いでカナマイシンに対して耐
性ヲ持たないクロラムフェニコール耐性バチルス形質転
換体を確認する。同様にして、所望のＤＮＡ文グメント
を、例えばクロラムフェニコール耐性付与フラグメント
の内部ＭｂｏＩＩ制限サイトに挿入するとクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子が不活性化される。従って、この組
替えプラスミドを保持しているバチルス形質転換体は、
先づカナマイシン耐性を選択し、次いでクロラムフェニ
コールに対する耐性を持たないカナマイシン耐性形質転
換体を確認することにより容易に同定される。従って、
バチルスにおいて抗生物質耐性を選択するこの能力によ
って、間暉としている特定の非選択性１１ ＤＮＡを含有していで、極めて少数の細胞を効率よく分
離することができる。この様な選択は、イーコリに於い
ても行なうことができる。
上述の抗生物質耐性についての機能試験は、コピー数を
増大させるＤＮＡセグメントまたは調節要素として働き
個々の抗生物質耐性遺伝子の発現を促すＤＮＡセグメン
トを位置づけるのにも使用される。この様なセグメント
（例えばプロモーター、アテニュエーター、リプレッサ
ー、インジューサー、リボゾーム結合サイトなどである
が、これらに限定され吐い）は、ストレプトマイセス、
バチルス、イーコリおよび関連生物の細胞中で、他の遺
伝子の発現を調節するのに使用される。
増大させるＤＮＡセグメントまたは調節要素として働き
個々の抗生物質耐性遺伝子の発現を促すＤＮＡセグメン
トを位置づけるのにも使用される。この様なセグメント
（例えばプロモーター、アテニュエーター、リプレッサ
ー、インジューサー、リボゾーム結合サイトなどである
が、これらに限定され吐い）は、ストレプトマイセス、
バチルス、イーコリおよび関連生物の細胞中で、他の遺
伝子の発現を調節するのに使用される。
本発明にかかるチオストレプトン、ネオマイシン、カナ
マイシンおよびクロラムフェニコール耐性付与ベクター
は、結合したＤＮＡセグメントが幾世代にも渡って、安
定悦−宿主細胞中に保持されていることを確めるのにも
有用である。チオストレプトン、ネオマイシン、カナマ
イシンまたはクロラムフェニコール耐性付与フラグメン
トと共有結合しており、ストレプトマイセス、バチルス
、イーコリ、または関連生物の細胞中で増殖されるこれ
らの遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、その形質転換
体を、形質転換されなかった細胞にとっては有毒な濃度
のチオストレプトン、ネオマイシン、カナマイシンまた
はクロラムフェニコールに晒らすことによって維持され
る。従って、ベクターを失ない、それ故この共有結合Ｄ
ＮＡを失なった形質転換体は増殖することができず、培
養から除去される。この様に、本発明のベクターは、特
、にストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリにお
いて、所望のＤＮＡ配列を安定化し、保持することがで
きる。
マイシンおよびクロラムフェニコール耐性付与ベクター
は、結合したＤＮＡセグメントが幾世代にも渡って、安
定悦−宿主細胞中に保持されていることを確めるのにも
有用である。チオストレプトン、ネオマイシン、カナマ
イシンまたはクロラムフェニコール耐性付与フラグメン
トと共有結合しており、ストレプトマイセス、バチルス
、イーコリ、または関連生物の細胞中で増殖されるこれ
らの遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、その形質転換
体を、形質転換されなかった細胞にとっては有毒な濃度
のチオストレプトン、ネオマイシン、カナマイシンまた
はクロラムフェニコールに晒らすことによって維持され
る。従って、ベクターを失ない、それ故この共有結合Ｄ
ＮＡを失なった形質転換体は増殖することができず、培
養から除去される。この様に、本発明のベクターは、特
、にストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリにお
いて、所望のＤＮＡ配列を安定化し、保持することがで
きる。
本発明に係るクローニングベクターおよび形質転換体は
、一般にストレプトマイセスおよび関連細胞中で生産さ
れる種々の物質の収量を改善するための、遺伝子のクロ
ーニングを提供するものである。この様な物質の例とし
ては、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロスポ
リン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラ
マイシン、トブラマイシン、エリスロマイシンなどが挙
げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、工
業的に重要な蛋白質、例えばヒトインシュリン、ヒトプ
ロインシュリン、グルカゴン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、牛成長ホルモンなど、工業的に重要な方
法および化合物と関連して来る代謝径路における酵素機
能、または遺伝子発現を改善する調節要素、を暗号化し
ているＤＮＡ配列をクローニング、特徴づけ、および再
構成するのに有用な選択性ベクターを提供するものであ
る。これらの望ましいＤＮＡ配列には、誘導抗生物質、
例えばストレプトマイシン、セファロスポリン、タイロ
シン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラ
マイシン、トフラマイシンおよびエリスロマイシン誘導
体などの合成を触媒している酵素、または抗生物質また
はその他の生産物の生合成を調整し、増大させる酵素を
暗号化しているＤＮＡが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。この様なりＮＡ上セグメント挿入し
、安定化させ得ることによって、抗生物質の収量および
利用性を、増大させることができる。
、一般にストレプトマイセスおよび関連細胞中で生産さ
れる種々の物質の収量を改善するための、遺伝子のクロ
ーニングを提供するものである。この様な物質の例とし
ては、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロスポ
リン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラ
マイシン、トブラマイシン、エリスロマイシンなどが挙
げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、工
業的に重要な蛋白質、例えばヒトインシュリン、ヒトプ
ロインシュリン、グルカゴン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、牛成長ホルモンなど、工業的に重要な方
法および化合物と関連して来る代謝径路における酵素機
能、または遺伝子発現を改善する調節要素、を暗号化し
ているＤＮＡ配列をクローニング、特徴づけ、および再
構成するのに有用な選択性ベクターを提供するものであ
る。これらの望ましいＤＮＡ配列には、誘導抗生物質、
例えばストレプトマイシン、セファロスポリン、タイロ
シン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラ
マイシン、トフラマイシンおよびエリスロマイシン誘導
体などの合成を触媒している酵素、または抗生物質また
はその他の生産物の生合成を調整し、増大させる酵素を
暗号化しているＤＮＡが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。この様なりＮＡ上セグメント挿入し
、安定化させ得ることによって、抗生物質の収量および
利用性を、増大させることができる。
本発明の多機能クローニングベクターを使用すれば、現
在イーコリおよびバチルスで生合成されている生産物を
ストレプトマイセスにおいテ遺伝模なストレプトマイセ
ス発酵は、バチルスまたはイーコリの発酵よりもよく知
られ、よく理解されているので、特に好都合である。事
実、イーコリの工業的規模の発酵は依然として高度の経
験を要するものであり、場合によっては非常に困難なも
のである。本発明は、例えばヒトインシュリン、ヒトプ
ロインシュリン、クルヵゴン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、牛成長ホルモンなど、現在イーコリで生
合成されている物質をストレプトマイセスで生産する別
法を提供することにより、この問題を回避するものであ
る。本発明のベクターは非常に万能であり、上記の生産
物を発現するＤＮＡ配列または生産物を産生ずるイーコ
リプラスミド全体からなる配列のいづれかまたは両方を
収容することがで１きるので、このことが可能である。
在イーコリおよびバチルスで生合成されている生産物を
ストレプトマイセスにおいテ遺伝模なストレプトマイセ
ス発酵は、バチルスまたはイーコリの発酵よりもよく知
られ、よく理解されているので、特に好都合である。事
実、イーコリの工業的規模の発酵は依然として高度の経
験を要するものであり、場合によっては非常に困難なも
のである。本発明は、例えばヒトインシュリン、ヒトプ
ロインシュリン、クルヵゴン、インターフェロン、ヒト
成長ホルモン、牛成長ホルモンなど、現在イーコリで生
合成されている物質をストレプトマイセスで生産する別
法を提供することにより、この問題を回避するものであ
る。本発明のベクターは非常に万能であり、上記の生産
物を発現するＤＮＡ配列または生産物を産生ずるイーコ
リプラスミド全体からなる配列のいづれかまたは両方を
収容することがで１きるので、このことが可能である。
即ち、本発明′＃２より、宿主の選択に融通がきき、ス
トレプトマイセス、バチルスおよびイーコリにおいてポ
リペプチドおよびその他の生産物を生合成することがで
きる。特定の物質を生産するためには、そして一定の発
酵法ではどの様な宿主が最も適しているかは当業者の知
るところであるか、あるいは容易に決定できるものであ
る。
トレプトマイセス、バチルスおよびイーコリにおいてポ
リペプチドおよびその他の生産物を生合成することがで
きる。特定の物質を生産するためには、そして一定の発
酵法ではどの様な宿主が最も適しているかは当業者の知
るところであるか、あるいは容易に決定できるものであ
る。
それぞれプラスミドＰＥＬ１０３およびｐＨ１−１５の
供給源であるストレプトマイセス・グラニュロルーバ（
Ｓｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ
）ＡＡ ３９９１２．１３／ｐＥＬ１０３ およびバ
チルス・サチリス（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂＬ市り／Ｍ
１１１２／ｐＨｌ−１６は、イクつかの異なった培地を
使って、数多（の方法で培養することができる。培養培
地中の好ましい炭水化物源は、例えば糖蜜、グルコース
、デキストリン、グリセリンなどであり、窒素源は、例
えば大豆粉、アミノ酸混合物、ペプトンなどである。栄
養無機塩も混入されるが、これにはナトリウム、カリウ
ム１、 アンモニア、カルシウム、燐酸、塩素および硫
酸イオンなどのイオン類を生成し得る通常の塩類が挙げ
られる。他の微生物の増殖や発育に必要であるのと同じ
様に、必須微量元素も添加する。この様な微量元素は、
通常培地の他の成分を添加する際、その成分の不純物と
して供給される。
供給源であるストレプトマイセス・グラニュロルーバ（
Ｓｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ
）ＡＡ ３９９１２．１３／ｐＥＬ１０３ およびバ
チルス・サチリス（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂＬ市り／Ｍ
１１１２／ｐＨｌ−１６は、イクつかの異なった培地を
使って、数多（の方法で培養することができる。培養培
地中の好ましい炭水化物源は、例えば糖蜜、グルコース
、デキストリン、グリセリンなどであり、窒素源は、例
えば大豆粉、アミノ酸混合物、ペプトンなどである。栄
養無機塩も混入されるが、これにはナトリウム、カリウ
ム１、 アンモニア、カルシウム、燐酸、塩素および硫
酸イオンなどのイオン類を生成し得る通常の塩類が挙げ
られる。他の微生物の増殖や発育に必要であるのと同じ
様に、必須微量元素も添加する。この様な微量元素は、
通常培地の他の成分を添加する際、その成分の不純物と
して供給される。
ストレプトマイセスΦグラニュロルーバＡＡ３９９１２
．１３／ｐＥＬ１０３ は、好気性培養条件下、約ｐ
ｔｉ５〜９ という比較的広いμｍｌ範囲で、約１５〜
４０°Ｇの温度で増殖される。しかし、最もコピー数を
高くしてプラスミドＰＥＬ１０３を生産するにｊよ、声
約７．２の培地を使って培養を開始し、培養温度を約３
０°Ｇに保つのが望ましい。この条件下でストレプトマ
イセス・グラニュロルーバＡＡ３９９１２．１３／ｐＥ
Ｌ１０３ を培養すると、当業者によく知られた技術
で、常法によりプラスミドｐＥＬ１０３が単離される細
胞保有体が得られる。
．１３／ｐＥＬ１０３ は、好気性培養条件下、約ｐ
ｔｉ５〜９ という比較的広いμｍｌ範囲で、約１５〜
４０°Ｇの温度で増殖される。しかし、最もコピー数を
高くしてプラスミドＰＥＬ１０３を生産するにｊよ、声
約７．２の培地を使って培養を開始し、培養温度を約３
０°Ｇに保つのが望ましい。この条件下でストレプトマ
イセス・グラニュロルーバＡＡ３９９１２．１３／ｐＥ
Ｌ１０３ を培養すると、当業者によく知られた技術
で、常法によりプラスミドｐＥＬ１０３が単離される細
胞保有体が得られる。
バチルス・サチリスＭｌ １１２／ｐＨＪ直−１６は、
好気性培養条件下、約５．０〜８．５という比較的広い
ｐＨ範囲で、約２５〜４５°Ｃの温度で増殖する。
好気性培養条件下、約５．０〜８．５という比較的広い
ｐＨ範囲で、約２５〜４５°Ｃの温度で増殖する。
しかし、最もコピー数を多くしてプラスミド…１−１６
を生産するには、μ約７の培地で培養を開始し、培養温
度を３７°Ｃに保つのが好ましい。この条件下でバチル
ス・サチリスＭ１１１２／ｐＨ１−１６を培養すると、
当業者によく知られた技術で、常法によりプラスミドｐ
Ｈ１−１５が単離される細胞保有体が得られる。
を生産するには、μ約７の培地で培養を開始し、培養温
度を３７°Ｃに保つのが好ましい。この条件下でバチル
ス・サチリスＭ１１１２／ｐＨ１−１６を培養すると、
当業者によく知られた技術で、常法によりプラスミドｐ
Ｈ１−１５が単離される細胞保有体が得られる。
本発明を更に詳細に説明するために、以下に実施例を挙
げる。本発明を実施するための説明および実際の手法を
適当と思われる場所に挿入した。
げる。本発明を実施するための説明および実際の手法を
適当と思われる場所に挿入した。
実施例１ プラスミドＰＥＬ１０３の単離ペストレプト
マイセス・グラニュロルーバＡＡ３９９１２．１３／Ｐ
ＥＬ１０３ の培養ストレプトマイセス・グラニュロル
ーバ＆Ａ３９９１２．１３／ｐＥＬ１０３（ＮＲＲＬ１
２５４９）の栄養接種物を、常法により、その株を滅菌
トリブチカーゼ大豆ブロス”）（３５グ／ｌ脱イオン水
）５〇−中、液中好気条件下で増殖させることにより調
製した。
マイセス・グラニュロルーバＡＡ３９９１２．１３／Ｐ
ＥＬ１０３ の培養ストレプトマイセス・グラニュロル
ーバ＆Ａ３９９１２．１３／ｐＥＬ１０３（ＮＲＲＬ１
２５４９）の栄養接種物を、常法により、その株を滅菌
トリブチカーゼ大豆ブロス”）（３５グ／ｌ脱イオン水
）５〇−中、液中好気条件下で増殖させることにより調
製した。
このトリブチカーゼ大豆ブロス接種物を３０°Ｃで４８
時間インキュベートした。インキュベートした後、この
接種物約１０ｒｎ１．を滅菌ブロス５０〇−に移し、３
０°Ｃで約２０時面インキュベートし：１□：？： た。田の調節は行わなかった６′ブンキユベートしたも
のから、ストレプトマイセス・グラニュロルーバ煮Ａ３
９９１２．１３／ＰＥＬ１０３細胞を収穫し、次いてプ
ラスミドＤＮＡを単離することができる。
時間インキュベートした。インキュベートした後、この
接種物約１０ｒｎ１．を滅菌ブロス５０〇−に移し、３
０°Ｃで約２０時面インキュベートし：１□：？： た。田の調節は行わなかった６′ブンキユベートしたも
のから、ストレプトマイセス・グラニュロルーバ煮Ａ３
９９１２．１３／ＰＥＬ１０３細胞を収穫し、次いてプ
ラスミドＤＮＡを単離することができる。
匂 トリブチカーゼ大豆ブロスはＢＢＬ Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ。
ｏｎ。
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃａｎｐａｎ
ｙ、 Ｃｏｃｋｅｙｓｖ…ｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ２１
０３０から入手できる。
ｙ、 Ｃｏｃｋｅｙｓｖ…ｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ２１
０３０から入手できる。
Ｂ、プラスミドの単離
ストレプトマイセス−グラニュロルーバｍＡ３９９１２
．１３／ｐＥＬ１０３細胞約１２１（湿めった重量）を
遠心分離しく１０分、４°”−ＩＱＯＯＯｒｐｍ）、１
０チグリセリンで洗い、上の条件下で遠心分離して回収
した。ＴＥＳ緩衝液（０，０１ＭトＩＪス（ヒドロキシ
メチル）アミノエタン〔トリス〕、０．００１ＭＥＤＴ
Ａ、３４チシユクロース、Ｆｉ（８）約５０４を添加し
、次いで０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ １０ｍ１中のりゾチ
ーム約０．２５Ｐを加えた。この混合物を３７°Ｃで約
１５分間インキュベートした後、ＴＥ緩衝液（０，ＯＩ
Ｍ）リス、０．００１ＭＥＤＴＡ％ｐＨ°°１０”°”
！Ｊ ）、、’ｉ”７”、７ Ｘ−”°°２約２約°パ
加。得られた混合物を、、約１５分間６５°Ｃでインキ
ュベートした。溶解質を遠心分離（４５分間、４°ｃ、
１８．００Ｏｒｐｍ）した後、上澄液をイソアミルアル
コールで４回、クロロホルム−インアミルアルコール溶
液（２４：１）で１回抽出した。次いで水相に３Ｍ酢酸
ナトリウム０．１容量を加えた後、冷（−２０°Ｇ）９
５チエタノール３容量を添加した。ドライアイス−エタ
ノール浴中でエタノール沈殿を素早く行ない、ＤＮＡ沈
殿を遠心分離（１５分、４°Ｃ，１０，０００ｒｐｍ）
で集めた。この沈殿を減圧乾燥し、ＳＴＥ緩衝液（０，
０１Ｍ ） ＩＪス、０．６０１ＭＥＤＴＡ、
。
．１３／ｐＥＬ１０３細胞約１２１（湿めった重量）を
遠心分離しく１０分、４°”−ＩＱＯＯＯｒｐｍ）、１
０チグリセリンで洗い、上の条件下で遠心分離して回収
した。ＴＥＳ緩衝液（０，０１ＭトＩＪス（ヒドロキシ
メチル）アミノエタン〔トリス〕、０．００１ＭＥＤＴ
Ａ、３４チシユクロース、Ｆｉ（８）約５０４を添加し
、次いで０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ １０ｍ１中のりゾチ
ーム約０．２５Ｐを加えた。この混合物を３７°Ｃで約
１５分間インキュベートした後、ＴＥ緩衝液（０，ＯＩ
Ｍ）リス、０．００１ＭＥＤＴＡ％ｐＨ°°１０”°”
！Ｊ ）、、’ｉ”７”、７ Ｘ−”°°２約２約°パ
加。得られた混合物を、、約１５分間６５°Ｃでインキ
ュベートした。溶解質を遠心分離（４５分間、４°ｃ、
１８．００Ｏｒｐｍ）した後、上澄液をイソアミルアル
コールで４回、クロロホルム−インアミルアルコール溶
液（２４：１）で１回抽出した。次いで水相に３Ｍ酢酸
ナトリウム０．１容量を加えた後、冷（−２０°Ｇ）９
５チエタノール３容量を添加した。ドライアイス−エタ
ノール浴中でエタノール沈殿を素早く行ない、ＤＮＡ沈
殿を遠心分離（１５分、４°Ｃ，１０，０００ｒｐｍ）
で集めた。この沈殿を減圧乾燥し、ＳＴＥ緩衝液（０，
０１Ｍ ） ＩＪス、０．６０１ＭＥＤＴＡ、
。
５ｉＢ５０．０１Ｍ 塩化ナトリウム）１．１−に再
懸３５．００Ｏｒｐｍ）によりてプラスミドＤＮＡを精
製した。遠心分離した後所望のプラスミドｐＥＬ１０３
ＤＮＡ帯を除き、常法によりエチジウムプロミドを抽出
した。３容量のエタノール中でＤＮＡを沈殿させ、この
様にして分離したプラスミドｐＥＬ１０３ＤＮＭｒ：１
０倍に希釈したＴＥ緩衝液１−に溶解し、−２０°Ｃで
貯蔵した。
懸３５．００Ｏｒｐｍ）によりてプラスミドＤＮＡを精
製した。遠心分離した後所望のプラスミドｐＥＬ１０３
ＤＮＡ帯を除き、常法によりエチジウムプロミドを抽出
した。３容量のエタノール中でＤＮＡを沈殿させ、この
様にして分離したプラスミドｐＥＬ１０３ＤＮＭｒ：１
０倍に希釈したＴＥ緩衝液１−に溶解し、−２０°Ｃで
貯蔵した。
実施例２ プラスミドｐＬＲ２の組み立てＡ、プラスミ
ドｐｌＪ６のＨｉｎｄｎｌ消化プラスミドｐ Ｉ Ｊ
５ ＤＮＡ （ｒｈａｎｐｓｏｎら、Ｎａ ｔ ｕｒｅ
２８６：５２５．１９８０年参照）約２０μ１（２０μ
ｙ）、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、１１１Ｖｎｌ ）
５ Ｉｌｌ、水１９ ｐｌｙ、 ＨｉｎｄＩＩＩ （３
Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ単位含有）制限
酵素８υ１μｌ、および反応ミックス約５Ｋを３７°Ｇ
で２時間インキュベートした。４Ｍ酢酸アンモニウム約
５０μｌおよび９５チエタノール２００ ｔＩＩ！を加
えて反応を停止させた。得られた１）ＮＡ沈殿物を７０
チエタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液２
０μｌに懸濁して一２０°Ｃで貯蔵した。
ドｐｌＪ６のＨｉｎｄｎｌ消化プラスミドｐ Ｉ Ｊ
５ ＤＮＡ （ｒｈａｎｐｓｏｎら、Ｎａ ｔ ｕｒｅ
２８６：５２５．１９８０年参照）約２０μ１（２０μ
ｙ）、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、１１１Ｖｎｌ ）
５ Ｉｌｌ、水１９ ｐｌｙ、 ＨｉｎｄＩＩＩ （３
Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ単位含有）制限
酵素８υ１μｌ、および反応ミックス約５Ｋを３７°Ｇ
で２時間インキュベートした。４Ｍ酢酸アンモニウム約
５０μｌおよび９５チエタノール２００ ｔＩＩ！を加
えて反応を停止させた。得られた１）ＮＡ沈殿物を７０
チエタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液２
０μｌに懸濁して一２０°Ｃで貯蔵した。
匂制限酵素は以下の供給者から入手できる：Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ 、、 Ｉｎｃ 、
（３２Ｔｏｚｅｒ ＲｏａｄＢｅｖｅｒｌｙ、 Ｍａ
ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９１５）、Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ （７９４ｌ Ｃａｓｔｌｅｗａｙ ＤｒｉｖｅＩ
ｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉ ｓ 、 Ｉｎｄｉａｎａ ４
６２５０ ）。
ｎｇｌ ａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ 、、 Ｉｎｃ 、
（３２Ｔｏｚｅｒ ＲｏａｄＢｅｖｅｒｌｙ、 Ｍａ
ｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９１５）、Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ （７９４ｌ Ｃａｓｔｌｅｗａｙ ＤｒｉｖｅＩ
ｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉ ｓ 、 Ｉｎｄｉａｎａ ４
６２５０ ）。
細Ｈｉｎｄ ｍ制限酵素のための反応ミックスは、以下
の成分で調製した： ６００ｍＭＮａＣＪ１１００ｍＭ
トリス−ＨＣＪ （ＰＨ７，９）、７ Ｑ ｒｎＭ Ｍ
ｇ Ｃ１２，１６ｍＭジチオトレイット。
の成分で調製した： ６００ｍＭＮａＣＪ１１００ｍＭ
トリス−ＨＣＪ （ＰＨ７，９）、７ Ｑ ｒｎＭ Ｍ
ｇ Ｃ１２，１６ｍＭジチオトレイット。
Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌｌ消化プラス
ミドＰＢＲ３２２ＤＮＡ″Ｄ約８μｌ（４μ７）、反応
ミックス５ｇ、ＢＳＡＣ１１Ｆ９／ｒｎｌ） ５μ１１
水３１μｒおよび川ｎｄＩ［制限酵素１μｌを３７°Ｇ
で２時間インキュベートした。６０°Ｇで１０分インキ
ユヘートして反応を終結した後、酢酸アンモニウム約５
０μでと９５％エタ／−ル２００μｅを添加した。
ミドＰＢＲ３２２ＤＮＡ″Ｄ約８μｌ（４μ７）、反応
ミックス５ｇ、ＢＳＡＣ１１Ｆ９／ｒｎｌ） ５μ１１
水３１μｒおよび川ｎｄＩ［制限酵素１μｌを３７°Ｇ
で２時間インキュベートした。６０°Ｇで１０分インキ
ユヘートして反応を終結した後、酢酸アンモニウム約５
０μでと９５％エタ／−ル２００μｅを添加した。
得られたＤＮＡ沈殿を７０チエタノールで２回洗浄し、
減圧乾燥し、水４５μｌに懸濁した。
減圧乾燥し、水４５μｌに懸濁した。
匂プラスミドｐＢＲ３２２は前記Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ
から入手できる。
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ
から入手できる。
Ｑ Ｈｉｎｄ］Ｉ消化プラスミドｐｌＪ６とｐＢＲ３
２２の結合（リゲーション） １１ｉｎｄｌｌ処理プラスミドｐＩＪ６ （実施例２Ａ
（７）もの）約２０１１７：、 ＨｉｎｄｌｌＩ 処理
プラスミドｐＢＲ３２２（実施例２ Ｂ、のもの）り０
μｌ、ＢＳＡ（１１Ｎｉ／ｒｎ！、）５ｇ、Ｔ４ ＤＮ
Ａ リガニゼ′１）１μｌ、およびリゲーションミッ
クス″り５μｌを１６°Ｇで４時間インキュベートした
。４Ｍ酢酸アンモニウム約５０ｘＪおよび９５係エタノ
ール２００紹を加えて反応を終了させた。得られたＤＮ
Ａ沈殿物を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し
、ＴＥ緩衝液に懸濁した。この懸濁ＤＮＡは所望のプラ
スミド１λ２を構成していた。
２２の結合（リゲーション） １１ｉｎｄｌｌ処理プラスミドｐＩＪ６ （実施例２Ａ
（７）もの）約２０１１７：、 ＨｉｎｄｌｌＩ 処理
プラスミドｐＢＲ３２２（実施例２ Ｂ、のもの）り０
μｌ、ＢＳＡ（１１Ｎｉ／ｒｎ！、）５ｇ、Ｔ４ ＤＮ
Ａ リガニゼ′１）１μｌ、およびリゲーションミッ
クス″り５μｌを１６°Ｇで４時間インキュベートした
。４Ｍ酢酸アンモニウム約５０ｘＪおよび９５係エタノ
ール２００紹を加えて反応を終了させた。得られたＤＮ
Ａ沈殿物を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し
、ＴＥ緩衝液に懸濁した。この懸濁ＤＮＡは所望のプラ
スミド１λ２を構成していた。
Ｈｌ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼは前記Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ ａ
ｎｄ Ｂｉ。
ｎｄ Ｂｉ。
Ｉ、ａｂｓ 、 、 Ｉｎｃ 、から入手できる。
ｍ ＩＪゲーションミックスは以下の成分で調製した
： ５００ｍＭ ｌ−リフ、 −ＨＣｌ：（ｐ Ｈ７，
８）、２００ｍＭジチオトレイット、１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｊ’２、ｌ ＱｍＭ ＡＴＩＯ実施例３ Ｅ、 ｃ
ｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ２の調製凍結し
たコンピテントイーコリ（Ｅ、ｃｏｌ ｉ） Ｋ１２Ｈ
ＢＩＯＩ細胞（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２ ：
７５−９３ 。
： ５００ｍＭ ｌ−リフ、 −ＨＣｌ：（ｐ Ｈ７，
８）、２００ｍＭジチオトレイット、１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｊ’２、ｌ ＱｍＭ ＡＴＩＯ実施例３ Ｅ、 ｃ
ｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ２の調製凍結し
たコンピテントイーコリ（Ｅ、ｃｏｌ ｉ） Ｋ１２Ｈ
ＢＩＯＩ細胞（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２ ：
７５−９３ 。
１９７７年参照）を遠心分離によってペレット化し、０
、ＯＩＭ塩化ナトリウム約１０ｒｎ！、に懸濁した。次
いで細胞を再び□ペレット化し、０．０３Ｍ塩化カルシ
ウム約１０−に再懸濁し、氷上で約２０分インキ−ベー
トし、３ｏ’１目のペレット化を行ない、最後に０．０
３Ｍ塩化カルシウム１．２５−に再懸濁した。
、ＯＩＭ塩化ナトリウム約１０ｒｎ！、に懸濁した。次
いで細胞を再び□ペレット化し、０．０３Ｍ塩化カルシ
ウム約１０−に再懸濁し、氷上で約２０分インキ−ベー
トし、３ｏ’１目のペレット化を行ない、最後に０．０
３Ｍ塩化カルシウム１．２５−に再懸濁した。
得られた細胞懸濁液は以降の形質転換を行ない得るもの
（コンピテント）であった。
（コンピテント）であった。
ＴＥ緩衝液中のプラスミドＰＬＲ２（実施例２Ｃのもの
）をエタノール沈殿させ ３９ｍＭ塩化カルシウム溶液
１５０μｌに懸濁し、試験管中でコンピテントＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ 細胞約２００μｌとゆっ
くり混合した。得られた混合物を氷上で約４５分、次い
で４２°Ｇで約１分インキュベートした。
）をエタノール沈殿させ ３９ｍＭ塩化カルシウム溶液
１５０μｌに懸濁し、試験管中でコンピテントＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ 細胞約２００μｌとゆっ
くり混合した。得られた混合物を氷上で約４５分、次い
で４２°Ｇで約１分インキュベートした。
次いで、アンピシリンを５０μｌｉＥ／、／含有するＬ
−ブロス（ＢｅｒｔａｎｉｌＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ ６２ ：２９３．１９５１年参照）約３ｒｎＩを
添加した。この混合物を振盪しながう３７８Ｃで１時間
インキユベートシ、アンピシリンを含有しティるし一寒
天（Ｍｉ ｌ ｌ ｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ
ＭＤｌ ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ 、 （
ａｉｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）ｈｒｂｏｒ Ｌａｂｓ 。
−ブロス（ＢｅｒｔａｎｉｌＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ ６２ ：２９３．１９５１年参照）約３ｒｎＩを
添加した。この混合物を振盪しながう３７８Ｃで１時間
インキユベートシ、アンピシリンを含有しティるし一寒
天（Ｍｉ ｌ ｌ ｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ
ＭＤｌ ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ 、 （
ａｉｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）ｈｒｂｏｒ Ｌａｂｓ 。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ参照）上ニノばした。
Ｙｏｒｋ参照）上ニノばした。
生存コロニーを選択し、期待した表現型・＾−１−５）
を試験した結果、これは所望のＥ、ＣＯＩ ｉ Ｋ１２
ＨＢ Ｉ Ｑ １／ＰＩＡ２形質転換体を構成していた
。
を試験した結果、これは所望のＥ、ＣＯＩ ｉ Ｋ１２
ＨＢ Ｉ Ｑ １／ＰＩＡ２形質転換体を構成していた
。
実施例４ プラスミドｐ ＬＲｌの組み立てプラスミド
ｐＩＪ２（ＴｈａｎＰＳＯｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２−８
６−：５２５．１９８０年参照）をプラスミドｐｌＪ６
の代りに使用するほかは実施例２ＡＮＣと同様にしてプ
ラスミドｐＬＲ１を調製した。この所望のプラスミドｐ
ＬＲ１をＴＥ緩衝液に懸濁した。
ｐＩＪ２（ＴｈａｎＰＳＯｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２−８
６−：５２５．１９８０年参照）をプラスミドｐｌＪ６
の代りに使用するほかは実施例２ＡＮＣと同様にしてプ
ラスミドｐＬＲ１を調製した。この所望のプラスミドｐ
ＬＲ１をＴＥ緩衝液に懸濁した。
実施例５ Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯ１／ｐ
ＬＲ２１の調製プラスミドｐ Ｌｉ２の代りにプラスミ
ドｐＬＲｌを形質転換に使用する以外は実施例３と同様
にして調製を行なった。生存コロニーを選択して期待さ
れる表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ’）を試験した結果、所
望のＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲＩ形
質転換体を構成していた。
ＬＲ２１の調製プラスミドｐ Ｌｉ２の代りにプラスミ
ドｐＬＲｌを形質転換に使用する以外は実施例３と同様
にして調製を行なった。生存コロニーを選択して期待さ
れる表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ’）を試験した結果、所
望のＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲＩ形
質転換体を構成していた。
実施例６ プラスミドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０５
の組み立て 八 プラスミドｐ ＬＲ２のＢａｍＨ１消化および〜１
．６Ｋｂチオストレプトン耐性付与フラグメントの単離 プラスミドｐ Ｌｉ２ ＤＮＡ約５０μｍ、反応ミツク
オ０１０ ｘｉ 、 ＢＳＡ（ＩＷＩｉ／ＷＪ） １０
ｐｉ： 、水２９ ｐｌ、オヨびＢａｍＨＩ 制限
酵素１ ｐｌ （４単Ｖμｌ）を３７００で２時間イン
キュベートした。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび
２．５容量の９５係エタノールを加え、その混合物を一
２０°Ｇで約１８時間冷却してＤＮＡを沈殿させた。こ
のＤＮＡ沈殿物を遠心分離して集め、ＴＥ緩衝液約５０
μｌ に懸濁した。このＤＮＡ懸濁液から、常法により
、ゲル電気泳動によって所望の〜１，５ＫｂＢａｍＨＩ
制限フラグメントを単離した。単離後、このフラグメン
トを、次の工程の結合のために、ＴＥ緩衝液約２０μｌ
に再懸濁した。
の組み立て 八 プラスミドｐ ＬＲ２のＢａｍＨ１消化および〜１
．６Ｋｂチオストレプトン耐性付与フラグメントの単離 プラスミドｐ Ｌｉ２ ＤＮＡ約５０μｍ、反応ミツク
オ０１０ ｘｉ 、 ＢＳＡ（ＩＷＩｉ／ＷＪ） １０
ｐｉ： 、水２９ ｐｌ、オヨびＢａｍＨＩ 制限
酵素１ ｐｌ （４単Ｖμｌ）を３７００で２時間イン
キュベートした。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび
２．５容量の９５係エタノールを加え、その混合物を一
２０°Ｇで約１８時間冷却してＤＮＡを沈殿させた。こ
のＤＮＡ沈殿物を遠心分離して集め、ＴＥ緩衝液約５０
μｌ に懸濁した。このＤＮＡ懸濁液から、常法により
、ゲル電気泳動によって所望の〜１，５ＫｂＢａｍＨＩ
制限フラグメントを単離した。単離後、このフラグメン
トを、次の工程の結合のために、ＴＥ緩衝液約２０μｌ
に再懸濁した。
−４ＢａｍＨ１制限酵素のための反応ミックスは以下の
成分で調製した： １．５ Ｍ Ｎａｐ／、６０ｍＭ）
リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）、５ Ｑ ｒｎＭ Ｍ ｇ
Ｃ／ ２゜Ｂ、プラスミドＰＥＬ１０３の部分的Ｂａ
ｍＨＩ 消化プラスミドｐＥＬＩＱ３ ＤＮＡ約２０μ
グ、反応ミックス１０μ／、 ＢＳＡ（１！／ｍＡ）
１０μｌ、水３９μｌ。
成分で調製した： １．５ Ｍ Ｎａｐ／、６０ｍＭ）
リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）、５ Ｑ ｒｎＭ Ｍ ｇ
Ｃ／ ２゜Ｂ、プラスミドＰＥＬ１０３の部分的Ｂａ
ｍＨＩ 消化プラスミドｐＥＬＩＱ３ ＤＮＡ約２０μ
グ、反応ミックス１０μ／、 ＢＳＡ（１！／ｍＡ）
１０μｌ、水３９μｌ。
およびＢａｍＨＩ 制限酵素（酵素２μｌを水８μｅ
に希釈して調製する）１μｌを周囲温度で約１５分間イ
ンキュベートした。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよ
び２容量の９５％！タノールを加え、この混合物を約１
８時間−２０°Ｇに冷却してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮ
Ａ沈殿物を遠心分離して集め、７０チエタノールで洗い
、減圧乾燥した後ＴＥ緩衝液約５０μｌに懸濁した。
に希釈して調製する）１μｌを周囲温度で約１５分間イ
ンキュベートした。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよ
び２容量の９５％！タノールを加え、この混合物を約１
８時間−２０°Ｇに冷却してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮ
Ａ沈殿物を遠心分離して集め、７０チエタノールで洗い
、減圧乾燥した後ＴＥ緩衝液約５０μｌに懸濁した。
ｑ 結合（リゲーション）
部分的に消化したプラスミドｐＥＬＩＱ３ＤＮＡ約２０
μｍ、プラスミドｐＩＪＬ ２ （７）〜ｌ、５ Ｋ
ｂ Ｂ ａ ｍＨｌ制限フラグメント１０μグ、リゲー
ションミックス５μ１１ＢＳＡ（ＩＦ／Ｉｆ／ｉ）５μ
ｌ、水１０μｌ およびＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ１μｌの
混合物を１６６Ｃで約４時間インキュベートした。４Ｍ
酢酸アンモニウム４０μｌ および冷エタノール２００
μｌを添加した後、この混合物を約１８時間−２０°Ｃ
に冷却してＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡ沈殿物を遠
心分離して集め、７０％エタノール中で洗浄し、再び集
め、次の形質転換工程のために培地Ｐ （Ｈｏｐｗｏｏ
ｄおよびＷｒｉｇｈｔ、Ｊ ０Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎ−ｅｔｉｃｓ １６２：
３０７、” １９７８年参照）５０１？に懸濁した。
： ■、。
μｍ、プラスミドｐＩＪＬ ２ （７）〜ｌ、５ Ｋ
ｂ Ｂ ａ ｍＨｌ制限フラグメント１０μグ、リゲー
ションミックス５μ１１ＢＳＡ（ＩＦ／Ｉｆ／ｉ）５μ
ｌ、水１０μｌ およびＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ１μｌの
混合物を１６６Ｃで約４時間インキュベートした。４Ｍ
酢酸アンモニウム４０μｌ および冷エタノール２００
μｌを添加した後、この混合物を約１８時間−２０°Ｃ
に冷却してＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡ沈殿物を遠
心分離して集め、７０％エタノール中で洗浄し、再び集
め、次の形質転換工程のために培地Ｐ （Ｈｏｐｗｏｏ
ｄおよびＷｒｉｇｈｔ、Ｊ ０Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎ−ｅｔｉｃｓ １６２：
３０７、” １９７８年参照）５０１？に懸濁した。
： ■、。
可能性のあるＰＥＬＩ（＄３制限フラグメントの内、ど
のフラグメントが〜１，５ＫｂＢａｍＨＩチオストレプ
トン耐性付与フラグメントと結合するかによって、種々
のタイプの組替えプラスミドが生成する。
のフラグメントが〜１，５ＫｂＢａｍＨＩチオストレプ
トン耐性付与フラグメントと結合するかによって、種々
のタイプの組替えプラスミドが生成する。
プラスミドｐＥＬ１０３の〜２，８ＫｂＢａｍＨＩ制限
フラグメントに結合すると所望の〜４，４Ｋｂプラスミ
ドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０５が得られる。〜１，
６ｘｂＢａｍＨＩ耐性付与フラグメントはどちらの方向
にも向くことができるので、２方向の組替えプラスミド
が生成する。プラスミドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０
５の各々の制限サイトおよび機能地図を第８図に示す。
フラグメントに結合すると所望の〜４，４Ｋｂプラスミ
ドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０５が得られる。〜１，
６ｘｂＢａｍＨＩ耐性付与フラグメントはどちらの方向
にも向くことができるので、２方向の組替えプラスミド
が生成する。プラスミドｐＥＬ１０７およびｐＥＬ１０
５の各々の制限サイトおよび機能地図を第８図に示す。
プラスミドＰＥＬ１０３の部分的ＢａｍＨＩ 消化によ
り、互いに、そしてまた１またはそれ以上の耐性付与Ｄ
ＮＡフラグメントと結合し得る種々の制限フラグメント
の混合物が生成し、従っていくつかのその他の組替えプ
ラスミドが得られることは当業者には容易に理解される
であろう。このその他のプラスミドも、〜２．８ＫｂＢ
ａｍＨＩ複製起原含有フラグメントを含んでいる限り、
本発明の組み立てを例示するのに使用することができる
。上記のその他のプラスミドは、適当な宿主細胞に常法
に従って導入することができ、制限酵素およびゲル電気
泳動分析によって同定することができる。
り、互いに、そしてまた１またはそれ以上の耐性付与Ｄ
ＮＡフラグメントと結合し得る種々の制限フラグメント
の混合物が生成し、従っていくつかのその他の組替えプ
ラスミドが得られることは当業者には容易に理解される
であろう。このその他のプラスミドも、〜２．８ＫｂＢ
ａｍＨＩ複製起原含有フラグメントを含んでいる限り、
本発明の組み立てを例示するのに使用することができる
。上記のその他のプラスミドは、適当な宿主細胞に常法
に従って導入することができ、制限酵素およびゲル電気
泳動分析によって同定することができる。
実施例７ ５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓａｎｉｏｆａｃｉ
ｅｎ仲ＥＬＩＱ７およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／
ｐＥＬ１０５の調製実施例６ＣからのＤＮＡ約２０μグ
およびストレプトマイセス・アンボファシエンスゞυ（
Ｓ、ａｎｂｏ［ａｃｉ−ｅｎｓ）のプロトプラスト（Ｂ
ａｌＬｚ、 Ｊ、ｏｆＧｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏ−ｂ
ｉｏｌｏｇｙ １０７ ： ９３．１９７８年参照）１
ｘ１０９ を使って、国際特許出願ＡＰＣＴ／ＧＢ７９
１０００９５（国際公開／ＫＷ０７９１０１１６９ ）
の実施例２の方法に従って表記の調製を行なった。
ｅｎ仲ＥＬＩＱ７およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／
ｐＥＬ１０５の調製実施例６ＣからのＤＮＡ約２０μグ
およびストレプトマイセス・アンボファシエンスゞυ（
Ｓ、ａｎｂｏ［ａｃｉ−ｅｎｓ）のプロトプラスト（Ｂ
ａｌＬｚ、 Ｊ、ｏｆＧｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏ−ｂ
ｉｏｌｏｇｙ １０７ ： ９３．１９７８年参照）１
ｘ１０９ を使って、国際特許出願ＡＰＣＴ／ＧＢ７９
１０００９５（国際公開／ＫＷ０７９１０１１６９ ）
の実施例２の方法に従って表記の調製を行なった。
凪）この株は前記ＮＲＲＬに寄託されており、ＮＲＲＬ
２４２０の番号で誰でも利用可能である。
２４２０の番号で誰でも利用可能である。
再生プロトプラストに改良Ｒ２培地（Ｂａｌｔｚ。
Ｊ、ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
１０７ ： ９３．１９７８年参照）トップ寒天（最
終的なプレート濃度を５０μり／ｖｎｌ にするに十分
なチオストレプトンを含有している）を積層することに
より、所望の形質転換体をチオストレプトン耐性によっ
て選択する。
１０７ ： ９３．１９７８年参照）トップ寒天（最
終的なプレート濃度を５０μり／ｖｎｌ にするに十分
なチオストレプトンを含有している）を積層することに
より、所望の形質転換体をチオストレプトン耐性によっ
て選択する。
得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ ／ｐＥＬ １０７およびＳ 、ａｎｔｈｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬＩＱ５チオストレプトン耐性コロ
ニーを既知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの
制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定した。
ｅｎｓ ／ｐＥＬ １０７およびＳ 、ａｎｔｈｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬＩＱ５チオストレプトン耐性コロ
ニーを既知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの
制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定した。
従って、最終濃度を５０μＰ／ＴｒＪにするに十分なチ
オストレプトンを含有しているトリブチカーゼ大豆ブロ
スに接種することにより、異なった単離されたコロニー
の栄養接種物（１０ｍｊ）を常法により調製する。接種
物をいくつか調製し、全ての所望の形質転換体タイプの
ものおよび構成プラスミドが単離されるまで以下の操作
を行なう。即ち、細胞が十分増殖するまで３０°Ｇでイ
ンキュベートした後、細胞含有ブロス６−を遠心分離す
る。得られたペレットをＴＥ緩衝液で洗浄し、再びペレ
ット化し、５０ｍＭトリＸ （ｐＨ８，０）４００μＪ
に懸濁する。次いで０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ約８０
μ１１ＲＮａｓｅ ２０１１１およびりＹチーム１００
＃Ｊ（１０１Ｒｇ／、／ Ｔ Ｅ ）を加える。この混
合物を３７°Ｇで約１５分間インキュベートし？、＝１
．．１０％トリトンＸ−１００約１０ｐｌ；および５Ｍ
ＮａＣＪ１５０４５を加え、６０°Ｃで１５分インキュ
ベートする。得られた溶解質を遠心分離しく１５分、４
°Ｇ１１５，０００ｒｐｍ）ムーイソアミルアルコール
溶液（２４：１）で１回抽出した後エタノール沈殿させ
る。構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定は、
常法により、制限酵素およびゲル電気泳動分析により行
なう。
オストレプトンを含有しているトリブチカーゼ大豆ブロ
スに接種することにより、異なった単離されたコロニー
の栄養接種物（１０ｍｊ）を常法により調製する。接種
物をいくつか調製し、全ての所望の形質転換体タイプの
ものおよび構成プラスミドが単離されるまで以下の操作
を行なう。即ち、細胞が十分増殖するまで３０°Ｇでイ
ンキュベートした後、細胞含有ブロス６−を遠心分離す
る。得られたペレットをＴＥ緩衝液で洗浄し、再びペレ
ット化し、５０ｍＭトリＸ （ｐＨ８，０）４００μＪ
に懸濁する。次いで０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ約８０
μ１１ＲＮａｓｅ ２０１１１およびりＹチーム１００
＃Ｊ（１０１Ｒｇ／、／ Ｔ Ｅ ）を加える。この混
合物を３７°Ｇで約１５分間インキュベートし？、＝１
．．１０％トリトンＸ−１００約１０ｐｌ；および５Ｍ
ＮａＣＪ１５０４５を加え、６０°Ｃで１５分インキュ
ベートする。得られた溶解質を遠心分離しく１５分、４
°Ｇ１１５，０００ｒｐｍ）ムーイソアミルアルコール
溶液（２４：１）で１回抽出した後エタノール沈殿させ
る。構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定は、
常法により、制限酵素およびゲル電気泳動分析により行
なう。
実施例８ プラスミドＰＥＬ１０９およびｐＥＬｌ １
０の組み立て 八 プラスミドｐＬＡｌの部分的ＢａｍＨＩ消化および
〜３，４Ｋｂネオマイシン耐性付与フラグメントの単離 実施例６Ｂと実質的に同様にして、所望の部分的消化お
よび単離を行なう。〜３，４ Ｋｂ ＢａｍＨＩ 制限
フラグメントをＴＥ緩衝液約２０μｌに懸濁し、以下の
結合を行なう。
０の組み立て 八 プラスミドｐＬＡｌの部分的ＢａｍＨＩ消化および
〜３，４Ｋｂネオマイシン耐性付与フラグメントの単離 実施例６Ｂと実質的に同様にして、所望の部分的消化お
よび単離を行なう。〜３，４ Ｋｂ ＢａｍＨＩ 制限
フラグメントをＴＥ緩衝液約２０μｌに懸濁し、以下の
結合を行なう。
Ｂ、結合（リゲーション）
実施例６Ｃとｉ質的に同様にして、〜３，４ＫｂＢａｍ
１・、・。
１・、・。
ＨＩネオマイシン耐性付与制限フラグメントを、部分的
にＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＥＬ１０３（実施例
６Ｂで製造）と結合させる。
にＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＥＬ１０３（実施例
６Ｂで製造）と結合させる。
可能性のあるｐＥＬ１０３制限フラグメントの内、どれ
が〜３，４ Ｋｂ ＢａｍＨＩネオマイシン耐性付与フ
ラグメントと結合するかによって種々のタイプの組替え
プラスミドが生成する。プラスミドｐＥＬ１０３の〜２
．８ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントに結合すると、所
望の〜６．２ＫｂプラスミドｐＥＬ１０９およびｐＥＬ
ｌｌｏが生成する。〜３，４ Ｋ ｂ Ｂ ａｍ ＨＩ
耐性付与フラグメントはどちらの方向にも向くことがで
きるので、２方向の組替えプラスミドが生成する。
が〜３，４ Ｋｂ ＢａｍＨＩネオマイシン耐性付与フ
ラグメントと結合するかによって種々のタイプの組替え
プラスミドが生成する。プラスミドｐＥＬ１０３の〜２
．８ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントに結合すると、所
望の〜６．２ＫｂプラスミドｐＥＬ１０９およびｐＥＬ
ｌｌｏが生成する。〜３，４ Ｋ ｂ Ｂ ａｍ ＨＩ
耐性付与フラグメントはどちらの方向にも向くことがで
きるので、２方向の組替えプラスミドが生成する。
プラスミドｐ ＥＬＩ Ｏ９およびｐＥＬｌｌｏのそれ
ぞれの制限サイトおよび機能地図を第９図番こホす。
ぞれの制限サイトおよび機能地図を第９図番こホす。
実施例６Ｃに記載した様に、上記の方法で〜２．８Ｋｂ
ＢａｍＨＩ複製起原含有フラグメントを含んでいるその
他の組替えプラスミドが生成し得ることは、当業者に容
易に理解される所であろう。これらのプラスミドは、本
発明の組み立てを更に例示するのに使用することができ
る。上記のその他のプラスミドは、常法に従って導入す
ることができ、制限酵素およびゲル電気泳動分析によっ
て同定することができる。
ＢａｍＨＩ複製起原含有フラグメントを含んでいるその
他の組替えプラスミドが生成し得ることは、当業者に容
易に理解される所であろう。これらのプラスミドは、本
発明の組み立てを更に例示するのに使用することができ
る。上記のその他のプラスミドは、常法に従って導入す
ることができ、制限酵素およびゲル電気泳動分析によっ
て同定することができる。
実施例９ ５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｎｆｘ＋ｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＥＬ１０９およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＥＬ１１０の調製国際公開ＡＷ０７９１０１
１６９（国際特許出願点ＰＣＴ／ＧＢ ７９１０００９
５ ）の実施例２に開示の方法に従って、実施例８から
のＤＮＡ約２０μｍおよび５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ ＦＬ２４ ’Ｉ
Ｑ ）のプロトプラストＩ×１０８を使って、所望の
組み立てを行なう。再生プロトプラストに改良ｉ２培地
トップ寒天（最終プレート濃度を１μか−とするに十分
なネオマイシン”υを含有している）を積層することに
より、所望の形質転換体をネオマイシン耐性によって選
択する。
ｃｉｅｎｓ／ｐＥＬ１０９およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＥＬ１１０の調製国際公開ＡＷ０７９１０１
１６９（国際特許出願点ＰＣＴ／ＧＢ ７９１０００９
５ ）の実施例２に開示の方法に従って、実施例８から
のＤＮＡ約２０μｍおよび５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ ＦＬ２４ ’Ｉ
Ｑ ）のプロトプラストＩ×１０８を使って、所望の
組み立てを行なう。再生プロトプラストに改良ｉ２培地
トップ寒天（最終プレート濃度を１μか−とするに十分
なネオマイシン”υを含有している）を積層することに
より、所望の形質転換体をネオマイシン耐性によって選
択する。
得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＥＬＩ Ｑ９およびＳ、ａＩ′ｒｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＥＬ１１０ネオマイシン耐性コロニーを既
知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの制限酵素
およびゲル電気泳動分析によって同定する。チオストレ
プトンの代りにネオマイシン（１μり／−）をトリブチ
カーゼ大豆ブロスに添加するほかは実施例７に記載の方
法に従って、構成プラスミド、従って形質転換体の同定
を行なう。
ｅｎｓ／ｐＥＬＩ Ｑ９およびＳ、ａＩ′ｒｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＥＬ１１０ネオマイシン耐性コロニーを既
知の方法で単離し、培養し、構成プラスミドの制限酵素
およびゲル電気泳動分析によって同定する。チオストレ
プトンの代りにネオマイシン（１μり／−）をトリブチ
カーゼ大豆ブロスに添加するほかは実施例７に記載の方
法に従って、構成プラスミド、従って形質転換体の同定
を行なう。
磁）抗生物質ネオマイシンは、Ｓｉｇｍａ（ＳＬ。
Ｌｏｕｉｓ、 Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手できる。
実施例１０ プラスミドＰＥＬ１１３およびｐＥＬｌ
１４の組み立て 実施例１に記載の方法に従って、Ｓｔｒｅｐｔａｎｙｃ
ｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ＰＥＬ１０７ （実施例
７で調製）からプラスミドｐＥＬ１０７を単離し、実施
例６Ｂの方法に従ってＢａｍＨＩ制限酵素で部分消化す
る。実施ｍＣと実質的に同じ方法で、この部分的Ｂａｍ
ＨＩ 消化物をプラスミドｐＬＲ１の〜３，４Ｋｂネオ
マイシン耐性付与ＢａｍＨ１フラグメント（実施例８Ａ
で調製）と結合させて所望のプラスミドを得る。プラス
ミドＰＥＬ１０７は、ネオマイシン耐性フラグメントの
挿入の為の、１以上のＢａｍＨ１制限サイトを持ってい
るので、プラスミドＰＥＬ１１３およびＰＥ上１１４の
挿入異性体も生成する。〜３，４ＫｂＢａｍＨｌネオマ
イシン耐性付与フラグメントは両方向に向くことができ
るので、２方向の郷替えプラスミドが生成する。プラス
ミドｐＥＬ１１３およびｐＥＬ１１４のそれぞれの制限
サイトおよび機能地図を第１０図に示す。
１４の組み立て 実施例１に記載の方法に従って、Ｓｔｒｅｐｔａｎｙｃ
ｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ＰＥＬ１０７ （実施例
７で調製）からプラスミドｐＥＬ１０７を単離し、実施
例６Ｂの方法に従ってＢａｍＨＩ制限酵素で部分消化す
る。実施ｍＣと実質的に同じ方法で、この部分的Ｂａｍ
ＨＩ 消化物をプラスミドｐＬＲ１の〜３，４Ｋｂネオ
マイシン耐性付与ＢａｍＨ１フラグメント（実施例８Ａ
で調製）と結合させて所望のプラスミドを得る。プラス
ミドＰＥＬ１０７は、ネオマイシン耐性フラグメントの
挿入の為の、１以上のＢａｍＨ１制限サイトを持ってい
るので、プラスミドＰＥＬ１１３およびＰＥ上１１４の
挿入異性体も生成する。〜３，４ＫｂＢａｍＨｌネオマ
イシン耐性付与フラグメントは両方向に向くことができ
るので、２方向の郷替えプラスミドが生成する。プラス
ミドｐＥＬ１１３およびｐＥＬ１１４のそれぞれの制限
サイトおよび機能地図を第１０図に示す。
実施例１１ Ｓｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＥＬ１１３およびＳｏ、ｖｎｂｏ［ａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＥＬ１１４ （７）調製国際出願ＡＷ０７
９１０１１６９（国際特許出願人ＰＣＴ／ＧＢ ７９１
０００９５ ）の実施例２に記載の方法と実質的に同じ
方法で、実施例１０のＤＮＡ２０μｍおよび５ｔｒｅｐ
ｔａｎｙｃｅｓ ａｒｃｂｏｆａｃｉｅｎｓ（ＮＲＲＬ
Ａ ２４２０ ）のプロトプラストｌ×１０８を使っ
て所望の調製を行なう。実施例７および９に記載した方
法で、先づチオストレプトン耐性、次いでネオマイシン
耐性で所望の形質転換体を選択する。得られた５ｔｒｅ
ｐｔａｎｙｃｅｓ ａｒｆｌｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＥ
Ｌ ｌ ｌ ３およびＳ、ａｍｂｏＥ−ａｃｉｅｎｓ／
ｐＥＬ１１４チオストレプトン並びにネオマイシン耐性
コロニーを既知の方法で単離し、培養し、構成プラスミ
ドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定する。
ｃｉｅｎｓ／ｐＥＬ１１３およびＳｏ、ｖｎｂｏ［ａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＥＬ１１４ （７）調製国際出願ＡＷ０７
９１０１１６９（国際特許出願人ＰＣＴ／ＧＢ ７９１
０００９５ ）の実施例２に記載の方法と実質的に同じ
方法で、実施例１０のＤＮＡ２０μｍおよび５ｔｒｅｐ
ｔａｎｙｃｅｓ ａｒｃｂｏｆａｃｉｅｎｓ（ＮＲＲＬ
Ａ ２４２０ ）のプロトプラストｌ×１０８を使っ
て所望の調製を行なう。実施例７および９に記載した方
法で、先づチオストレプトン耐性、次いでネオマイシン
耐性で所望の形質転換体を選択する。得られた５ｔｒｅ
ｐｔａｎｙｃｅｓ ａｒｆｌｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＥ
Ｌ ｌ ｌ ３およびＳ、ａｍｂｏＥ−ａｃｉｅｎｓ／
ｐＥＬ１１４チオストレプトン並びにネオマイシン耐性
コロニーを既知の方法で単離し、培養し、構成プラスミ
ドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定する。
構成プラスミド、従ってその形質転換体の同定は、ネオ
マイシン（１μｍ／−）お、：（ よびチオストレプトン（５０μＰ／ｌｎ／）の両方をト
リプヂカーゼ犬豆ブロスに添加するほかは実施例７と実
質的に同じ方法で行なう。
マイシン（１μｍ／−）お、：（ よびチオストレプトン（５０μＰ／ｌｎ／）の両方をト
リプヂカーゼ犬豆ブロスに添加するほかは実施例７と実
質的に同じ方法で行なう。
実施例１２ プラスミドｐＥＬ１１５およびｐＥＬ１１
６の組み立て プラスミドｐＥＬ１０７の代りにプラスミドＰＥＬ１０
５を部分的ＢａｍＨＩ消化に使用するほかは実施例１０
と実質的に同様番こして、所望のプラスミドを組み立て
る。プラスミドｐ ＥＬＩ ０５は、ネオマイシン耐性
フラグメント挿入のための１以上のＢａｍＨＩ 制限サ
イトを持っているので、プラスミドｐＥＬ１１５および
ｐＥＬ１１６の挿入異性体も生成する。〜３．４ＫｂＢ
ａｍＨｌネオマイシン耐性付与フラグメントはどちらの
方向にも向き得るので、２方向の組替えプラスミドが生
成する。プラスミドｐＥＬ１１５およびＰＥＬ１１６の
それぞれの制限サイトおよび機能地図を第１１図に示す
。
６の組み立て プラスミドｐＥＬ１０７の代りにプラスミドＰＥＬ１０
５を部分的ＢａｍＨＩ消化に使用するほかは実施例１０
と実質的に同様番こして、所望のプラスミドを組み立て
る。プラスミドｐ ＥＬＩ ０５は、ネオマイシン耐性
フラグメント挿入のための１以上のＢａｍＨＩ 制限サ
イトを持っているので、プラスミドｐＥＬ１１５および
ｐＥＬ１１６の挿入異性体も生成する。〜３．４ＫｂＢ
ａｍＨｌネオマイシン耐性付与フラグメントはどちらの
方向にも向き得るので、２方向の組替えプラスミドが生
成する。プラスミドｐＥＬ１１５およびＰＥＬ１１６の
それぞれの制限サイトおよび機能地図を第１１図に示す
。
実施例１３ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬ１１５およびＳ、ａｎｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ／ｐＥＬ１１６の調製実施例１１と同様にし
て、実施例１２のＤＮＡ２０μグを使って所望の調製を
行なう。得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬ１１５およびＳ、ａｎｂｏ−
［ａｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬ １１６チオストレプトン並
びにネオマイシン耐性コロニーを、既知の方法で単離し
、培養し、実施例１１と実質的に同じ方法で、構成プラ
スミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定す
る。
ｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬ１１５およびＳ、ａｎｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ／ｐＥＬ１１６の調製実施例１１と同様にし
て、実施例１２のＤＮＡ２０μグを使って所望の調製を
行なう。得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬ１１５およびＳ、ａｎｂｏ−
［ａｃｉｅｎｓ ／ｐＥＬ １１６チオストレプトン並
びにネオマイシン耐性コロニーを、既知の方法で単離し
、培養し、実施例１１と実質的に同じ方法で、構成プラ
スミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定す
る。
実施例１４ プラスミドｐＥＬ１２１およびｐＥＬ１２
２の組み立て 所望のプラスミドは、実施例６Ｇの結合法に従って、プ
ラスミドｐＥＬ１０７の部分的Ｂ ａｍ ＨＩ消化物を
、ＢａｍＨＩ 消化プラスミドｐＢＲ３２２に結合させ
ることによって得られる。実施例１の方法に従って、５
ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ Ｍｒｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／
ｐＥＬ１０７ （実施例７で調製）からプラスミドｐＥ
Ｌ１０７を単離し、実施例６Ｂに従って部分的ＢａｍＨ
１消化する。Ｈｉｎｄ ＩＩ制限酵素の代りにＢａｍＨ
Ｉ制限酵素を使用する以外は実施例２Ｂと同様の方法で
、ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢｌｌＬ３２２を調製す
る。所望のプラスミドＤＮＡを遠心分離して集め、７０
チェタ／−ルで洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液５０μ
ｚｉこ懸濁する。プラスミドｐＥＬ１０７は、制限プラ
スミドｐＢｆＬ３２２挿入のための１以上のＢａｍＨＩ
制限サイトを持っているので、プラスミドｐ ＥＬ
１２１およびｐＥＬ１２２の挿入アイソマーも生成する
。制限プラスミドｐＢＲ３２２はいづれの方向も向き得
るので、２方向の組替えプラスミドが生成する。プラス
ミドｐＥＬ１２１およびｐＥＬ１２２の制限サイトおよ
び機能地図を第１２図に示す。
２の組み立て 所望のプラスミドは、実施例６Ｇの結合法に従って、プ
ラスミドｐＥＬ１０７の部分的Ｂ ａｍ ＨＩ消化物を
、ＢａｍＨＩ 消化プラスミドｐＢＲ３２２に結合させ
ることによって得られる。実施例１の方法に従って、５
ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ Ｍｒｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／
ｐＥＬ１０７ （実施例７で調製）からプラスミドｐＥ
Ｌ１０７を単離し、実施例６Ｂに従って部分的ＢａｍＨ
１消化する。Ｈｉｎｄ ＩＩ制限酵素の代りにＢａｍＨ
Ｉ制限酵素を使用する以外は実施例２Ｂと同様の方法で
、ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢｌｌＬ３２２を調製す
る。所望のプラスミドＤＮＡを遠心分離して集め、７０
チェタ／−ルで洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液５０μ
ｚｉこ懸濁する。プラスミドｐＥＬ１０７は、制限プラ
スミドｐＢｆＬ３２２挿入のための１以上のＢａｍＨＩ
制限サイトを持っているので、プラスミドｐ ＥＬ
１２１およびｐＥＬ１２２の挿入アイソマーも生成する
。制限プラスミドｐＢＲ３２２はいづれの方向も向き得
るので、２方向の組替えプラスミドが生成する。プラス
ミドｐＥＬ１２１およびｐＥＬ１２２の制限サイトおよ
び機能地図を第１２図に示す。
実施例１５ Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／Ｐ
ＥＬ１２１ およびＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯ
Ｉ／ＰＥＬ１２２の調製プラスミド−ｐ Ｌｉ２の代り
にプラスミドＰＥＬ１２１およびｐＥＬ１２２を形質転
換に使用するほかは実施例３と同じ方法で、所望の表記
の調製を行なう。
ＥＬ１２１ およびＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯ
Ｉ／ＰＥＬ１２２の調製プラスミド−ｐ Ｌｉ２の代り
にプラスミドＰＥＬ１２１およびｐＥＬ１２２を形質転
換に使用するほかは実施例３と同じ方法で、所望の表記
の調製を行なう。
生存コロニーを先づ選択し、期待される表現型（Ａｍｐ
’、 Ｔｅ ｔ Ｓ）を試験し、構成プラスミドの制限
酵素およびゲル電気泳動分析により、所望のＥ、ｃｏｌ
ｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＥＬ１２１およびＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＥＬ１２２形質転換体で
あることを常法により確認する。
’、 Ｔｅ ｔ Ｓ）を試験し、構成プラスミドの制限
酵素およびゲル電気泳動分析により、所望のＥ、ｃｏｌ
ｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＥＬ１２１およびＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＥＬ１２２形質転換体で
あることを常法により確認する。
実施例１６ プラス・ミ□す・ドｐａ１−１５の単離へ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓＭ１１１２／
ｐＨＩ １６の培養ＰＡＢ寒天Ｃｌｌ天１５ Ｆ！／ｌ
、クロラムフェニコール１０，１／ｍ！含有ＰＡＢ”ｌ
） ＣＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ） ）に植えつけ
ることにより、常法通りＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ−ｔ
ｉｌｌｉｓＭ１１１２／ＰＨＩ−１６（ＮＲＲＬ Ｂ−
１２５９７）の栄養接種物を得た。接種プレートを３７
°Ｇで約１８時間インキュベートした後、１個のコロニ
ーを選択し、１０μｇ／ｒｎｌのクロラムフェニコール
を含有する滅菌ＰＡＢ培地５００．ｎｌに接種した。得
られた接種ブロスを３７°Ｇで約１８時間インキュベー
トした物から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｌｉｓ
Ｍｌ １１２／ｐＨｌ−１６細胞を収穫し、プラスミ
ドＤＮＡを単離することができる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓＭ１１１２／
ｐＨＩ １６の培養ＰＡＢ寒天Ｃｌｌ天１５ Ｆ！／ｌ
、クロラムフェニコール１０，１／ｍ！含有ＰＡＢ”ｌ
） ＣＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ） ）に植えつけ
ることにより、常法通りＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ−ｔ
ｉｌｌｉｓＭ１１１２／ＰＨＩ−１６（ＮＲＲＬ Ｂ−
１２５９７）の栄養接種物を得た。接種プレートを３７
°Ｇで約１８時間インキュベートした後、１個のコロニ
ーを選択し、１０μｇ／ｒｎｌのクロラムフェニコール
を含有する滅菌ＰＡＢ培地５００．ｎｌに接種した。得
られた接種ブロスを３７°Ｇで約１８時間インキュベー
トした物から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｌｉｓ
Ｍｌ １１２／ｐＨｌ−１６細胞を収穫し、プラスミ
ドＤＮＡを単離することができる。
ｍ ＰＡＢはＤｉ ｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（Ｄｅｔｒｏｉｔ 、Ｍｉｃｈ−ｉｇａｎ）から入手で
きる。
（Ｄｅｔｒｏｉｔ 、Ｍｉｃｈ−ｉｇａｎ）から入手で
きる。
Ｂ、プラスミドの分離
遠心分離（１０分、４°Ｃ：、１０，０００ｒＰｍ）に
よってＢａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｇｔ ｉｆ ｉｓ Ｍ
ｌ １１２／ＰＨＩ−１５細胞約１０□ １（湿めった重量）を集め、ＴＥＳ約５０−で洗浄し、
再び遠心′益−シて集めた。このペレットに、２５ｑ６
のシュクロースを含むＴＥ緩衝液約２０ｒｎｌを加え、
次いで水２５０μｌ中のりゾチーム約１０■を加えた。
よってＢａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｇｔ ｉｆ ｉｓ Ｍ
ｌ １１２／ＰＨＩ−１５細胞約１０□ １（湿めった重量）を集め、ＴＥＳ約５０−で洗浄し、
再び遠心′益−シて集めた。このペレットに、２５ｑ６
のシュクロースを含むＴＥ緩衝液約２０ｒｎｌを加え、
次いで水２５０μｌ中のりゾチーム約１０■を加えた。
この混合物を３７°Ｃで約３０分間インキュベートし、
次いでＲＮａ ｓ ｅ 約１００単位を添加した。こ
の混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、５Ｄ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）および塩化ナトリウムに
ついてそれぞれ１チ、ＩＭとした後、水浴に入れて約３
時間冷却した。溶解質を遠心分離（３０分、４°Ｃ１１
９，０００ｒＰ） した後、上澄液に１゛Ｅを加えて３
１６８−とし、セシウムクロライド２８．７Ｓ’および
エチジウムブロマイド０．４ｍ／（１０ＷＶｎｌ）を添
加した。これをセシ勾 １６時間）にかけた。プラスミド帯を集め、５５．００
０ｒｐｎで１６時間遠心分離して集め、同容量のイソア
ミルアルコールで３回抽出し、希釈ＴＥで透析し、エタ
ノール沈殿させ、ＴＥ４００μｌに再懸濁−した。得ら
れたプラスミドｐＨｌ−１５ＤＮＡは、使用するまで４
°Ｇで保存した。
次いでＲＮａ ｓ ｅ 約１００単位を添加した。こ
の混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、５Ｄ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）および塩化ナトリウムに
ついてそれぞれ１チ、ＩＭとした後、水浴に入れて約３
時間冷却した。溶解質を遠心分離（３０分、４°Ｃ１１
９，０００ｒＰ） した後、上澄液に１゛Ｅを加えて３
１６８−とし、セシウムクロライド２８．７Ｓ’および
エチジウムブロマイド０．４ｍ／（１０ＷＶｎｌ）を添
加した。これをセシ勾 １６時間）にかけた。プラスミド帯を集め、５５．００
０ｒｐｎで１６時間遠心分離して集め、同容量のイソア
ミルアルコールで３回抽出し、希釈ＴＥで透析し、エタ
ノール沈殿させ、ＴＥ４００μｌに再懸濁−した。得ら
れたプラスミドｐＨｌ−１５ＤＮＡは、使用するまで４
°Ｇで保存した。
プラスミドｐＨｌ−１６の〜０．７４ Ｋｂ Ｈｐａ
１１７５グメント内にカナマイシン耐性遺伝子が含まれ
ている。従って、ＨｐａｌＩ制限酵素で処理した後結合
させると、カナマイシン耐性遺伝子のない、ｐＨｌ−１
８と命名した〜３．ｇｉｃｂ３チスミドが得られる。
１１７５グメント内にカナマイシン耐性遺伝子が含まれ
ている。従って、ＨｐａｌＩ制限酵素で処理した後結合
させると、カナマイシン耐性遺伝子のない、ｐＨｌ−１
８と命名した〜３．ｇｉｃｂ３チスミドが得られる。
プラスミドｐＨＩ −１８組み立てについて以下に詳述
する。
する。
実施例１７ プラスミドｐＨ１−１８の組み立て八 プ
ラスミドｐＨ１−１５の部分的Ｈｐａ ＩＩ消化プラス
ミドｐＨｌ−１５ＤＮＡ約５μ１（２５μ７）、Ｂ ５
Ａ １ ｔｔｌ （２ｍ９７ｍ１ ）、水３７ ｔｔ
ｌ 、 ＨｐａｌＩ（２Ｆｉ４ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂｓ単位）制限酵素２ ｐｌおよび反応ミ
ックス雉）５μｌを３７°Ｃで１時間インキュベートし
た。６５°Ｇで１０分加熱して反応を終結した後、９５
係エタノール２容量を添加してＤＮＡを沈殿させた。得
られたＤＮＡ沈殿物を７０係エタノールで洗浄し、減圧
乾燥し、ＴＥ緩衝液５μｌに懸濁し、使用するまで４°
Ｇで貯蔵した。
ラスミドｐＨ１−１５の部分的Ｈｐａ ＩＩ消化プラス
ミドｐＨｌ−１５ＤＮＡ約５μ１（２５μ７）、Ｂ ５
Ａ １ ｔｔｌ （２ｍ９７ｍ１ ）、水３７ ｔｔ
ｌ 、 ＨｐａｌＩ（２Ｆｉ４ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂｓ単位）制限酵素２ ｐｌおよび反応ミ
ックス雉）５μｌを３７°Ｃで１時間インキュベートし
た。６５°Ｇで１０分加熱して反応を終結した後、９５
係エタノール２容量を添加してＤＮＡを沈殿させた。得
られたＤＮＡ沈殿物を７０係エタノールで洗浄し、減圧
乾燥し、ＴＥ緩衝液５μｌに懸濁し、使用するまで４°
Ｇで貯蔵した。
（社）Ｈｐａｕ制限酵素のための反応ミックスは以下の
成分で調製した： ５ ＱｍＭ ＫＣ：（３，１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）、１００ｍＭ Ｍｇ
ＣＪ２、ｌＱｍＭジチオトレイット。
成分で調製した： ５ ＱｍＭ ＫＣ：（３，１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）、１００ｍＭ Ｍｇ
ＣＪ２、ｌＱｍＭジチオトレイット。
Ｂ、７” ５スミ）’ｐＨｌ−１６８ｐａＩＩ消化物の
結合プラスミドｐｆ（Ｉ−１５Ｈｐ ａ ＩＦ消化物（
実施例１７Ａで調製）約５μＪ、”Ｉ”４ＤＮＡリガー
ゼ２μｌおよびリゲーションミックス０υ４３μｌ を
約１６°Ｃで約１８時間インキュベートした。３Ｍ酢酸
ナトリウム約５μｌと９５チエタノール１５０μｌを加
えて反応を停止させ、所望のＤＮＡ沈殿物を７０％エタ
ノールで洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液１０μｌに懸
濁し、使用するまで４°Ｃで貯蔵した。
結合プラスミドｐｆ（Ｉ−１５Ｈｐ ａ ＩＦ消化物（
実施例１７Ａで調製）約５μＪ、”Ｉ”４ＤＮＡリガー
ゼ２μｌおよびリゲーションミックス０υ４３μｌ を
約１６°Ｃで約１８時間インキュベートした。３Ｍ酢酸
ナトリウム約５μｌと９５チエタノール１５０μｌを加
えて反応を停止させ、所望のＤＮＡ沈殿物を７０％エタ
ノールで洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液１０μｌに懸
濁し、使用するまで４°Ｃで貯蔵した。
Ｘυ リゲーションミックスは以下の成分で調製した：
５５ ｍＭ トリス−ＨＣ：Ｊ（ＰＨ７，８）、ｌＱ
ｍＭ ジチオトレーイツト、５．５ ｒｎＭ Ｍ ｇ
ＣＺ ２．４ｍＭＡＴＰ実施例１８ Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＨ１−１８の調
製 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２は、
常法書こより、Ｂ。
５５ ｍＭ トリス−ＨＣ：Ｊ（ＰＨ７，８）、ｌＱ
ｍＭ ジチオトレーイツト、５．５ ｒｎＭ Ｍ ｇ
ＣＺ ２．４ｍＭＡＴＰ実施例１８ Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＨ１−１８の調
製 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２は、
常法書こより、Ｂ。
５ｕｂｔ市ｓ ＭＩＩ １２／ｐＨ１−１５（ＮＲＲＬ
Ｂ−１２５９７）をクロラムフェニコールの非存在下
で培養することにより得ることができる。Ｂ、５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ ＭＩ １１２／ＰＨ１１ 一１６細胞は、この培養条件下では自動的にｐＨｌ−１
６プラスミドを失ない、所望のクロラムフェニコール感
受性のＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２株が生成する
。
Ｂ−１２５９７）をクロラムフェニコールの非存在下
で培養することにより得ることができる。Ｂ、５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ ＭＩ １１２／ＰＨ１１ 一１６細胞は、この培養条件下では自動的にｐＨｌ−１
６プラスミドを失ない、所望のクロラムフェニコール感
受性のＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２株が生成する
。
バチルス形質転換操作斎こ於いて、このプラスミドを欠
（Ｂ、５ｕｂｔ山Ｓ Ｍ１１１２だけが選択され、使用
されることを試験し、確実にするために、タロラムフェ
ニコールに対する感受性を利用し得ることは、当業者に
は明らかであろう。
（Ｂ、５ｕｂｔ山Ｓ Ｍ１１１２だけが選択され、使用
されることを試験し、確実にするために、タロラムフェ
ニコールに対する感受性を利用し得ることは、当業者に
は明らかであろう。
滅菌ＰＡＢ約５０．ｎｌにＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ
ｉＩｉｓ Ｍ１１１２を接種し、細胞密度が２×１０８
細胞／ｒｎ１．になるまで３７°Ｃでインキュベートし
た。この細胞をペレット化し、次いでＳＭＭＰ（同容量
の各々４ Ｘ ＰＡＢおよヒ１．０ Ｍシュクロース、
０．０４Ｍマレイン酸、および０．０４ Ｍ ＭｇＣＪ
２からナル溶液（ＮａＯＨでｐＨ６，５に調節））約５
−に再懸濁することにより、滅菌的に細胞をプロトプラ
スト化した。次いでリゾチーム（ＳＭＭ（（１５Ｍシュ
クロース、０．０２Ｍマレイン酸および０．０２ＭＭｇ
Ｃ１２、Ｎ ａ ＯＨテＰ ）ｌＢ、５に調節）中、２
０〜／、Ｚ）約２５０μバｐ過滅菌して加えた。細胞を
３７°Ｃ約２時間、ゆっくり振盪し′１・１ てインキュベートじだ占得られたプロトプラストをペレ
ット化し、ＳＭＭＰ５−で洗い、ＳＭＭＰ５．／に再懸
濁した。遠心分離（２５°Ｇ、１２分、２６００ｒｐｍ
） シた後、プラスミドｐＨＩ −１８ＤＮＡ （実施
例１７で調製〕オヨび２Ｘ ＳＭＭ （７）１ ： １
混合物約２゜μｌを加えて仁のプロトプラスト約０．１
−を形質転換した。ＰＥＧ溶液（ＰＥＧ６０００（ポリ
エチレングリ：Ｉ−ル：１４０５’、２Ｘ ＳＭＭ ５
０．ｚ、水ヲ加工て１００ｒｎ！、）約１．５−を直ち
に加え、約２分後にＳＭＭＰ５．ｎｌを加えた。次いで
このプロトプラストをペレット化し、ＳＭＭＰ １ｒｎ
ｌに懸濁し、ゆっくり振盪させながら約２時間３０’Ｃ
でインキュベートした。この様にして調製した懸濁液の
一部を、１で当たり以下の成分を含有しているクロラム
フェニコール含有０Ｍ３再生培地に植えた：寒天１２７
を含有している脱イオン水′５５５−中のＤ−マンニッ
ト９１１．１０％カザミノ酸５Ｏ−１１ｏチ酵母エキス
５Ｏ−１２ｏチグルコース２５−１５チ燐酸ジ力リウム
１００ｍ／、ＩＭＭｆｃ／２２０ｍ／、１０％ゼラチン
２００ｍ／、１０〜クロラムフエニコール。Ｄ−マンニ
ット、カザミノ酸および酵母エキスは一緒に圧熱滅菌し
た。圧熱滅菌した後ゼラチンを直ちに加え、残りの成分
はこの混合物を冷却した後に加えた。この培地の最終的
なりロラムフエニコール濃度は１０μｙ／ｒｎｌテあっ
た。
ｉＩｉｓ Ｍ１１１２を接種し、細胞密度が２×１０８
細胞／ｒｎ１．になるまで３７°Ｃでインキュベートし
た。この細胞をペレット化し、次いでＳＭＭＰ（同容量
の各々４ Ｘ ＰＡＢおよヒ１．０ Ｍシュクロース、
０．０４Ｍマレイン酸、および０．０４ Ｍ ＭｇＣＪ
２からナル溶液（ＮａＯＨでｐＨ６，５に調節））約５
−に再懸濁することにより、滅菌的に細胞をプロトプラ
スト化した。次いでリゾチーム（ＳＭＭ（（１５Ｍシュ
クロース、０．０２Ｍマレイン酸および０．０２ＭＭｇ
Ｃ１２、Ｎ ａ ＯＨテＰ ）ｌＢ、５に調節）中、２
０〜／、Ｚ）約２５０μバｐ過滅菌して加えた。細胞を
３７°Ｃ約２時間、ゆっくり振盪し′１・１ てインキュベートじだ占得られたプロトプラストをペレ
ット化し、ＳＭＭＰ５−で洗い、ＳＭＭＰ５．／に再懸
濁した。遠心分離（２５°Ｇ、１２分、２６００ｒｐｍ
） シた後、プラスミドｐＨＩ −１８ＤＮＡ （実施
例１７で調製〕オヨび２Ｘ ＳＭＭ （７）１ ： １
混合物約２゜μｌを加えて仁のプロトプラスト約０．１
−を形質転換した。ＰＥＧ溶液（ＰＥＧ６０００（ポリ
エチレングリ：Ｉ−ル：１４０５’、２Ｘ ＳＭＭ ５
０．ｚ、水ヲ加工て１００ｒｎ！、）約１．５−を直ち
に加え、約２分後にＳＭＭＰ５．ｎｌを加えた。次いで
このプロトプラストをペレット化し、ＳＭＭＰ １ｒｎ
ｌに懸濁し、ゆっくり振盪させながら約２時間３０’Ｃ
でインキュベートした。この様にして調製した懸濁液の
一部を、１で当たり以下の成分を含有しているクロラム
フェニコール含有０Ｍ３再生培地に植えた：寒天１２７
を含有している脱イオン水′５５５−中のＤ−マンニッ
ト９１１．１０％カザミノ酸５Ｏ−１１ｏチ酵母エキス
５Ｏ−１２ｏチグルコース２５−１５チ燐酸ジ力リウム
１００ｍ／、ＩＭＭｆｃ／２２０ｍ／、１０％ゼラチン
２００ｍ／、１０〜クロラムフエニコール。Ｄ−マンニ
ット、カザミノ酸および酵母エキスは一緒に圧熱滅菌し
た。圧熱滅菌した後ゼラチンを直ちに加え、残りの成分
はこの混合物を冷却した後に加えた。この培地の最終的
なりロラムフエニコール濃度は１０μｙ／ｒｎｌテあっ
た。
クロラムフェニコール耐性コロニーを、カナマイシン感
受性について試験した。クロラムフェニコール耐性でカ
ナマイシン感受性コロニーハ、所望のＢａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔ市ｓ Ｍｌ １１２／ｐＨｌ−１８株としテ
選択された。この株を培養し、常法通り構成プラスミド
の制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定確認した
。
受性について試験した。クロラムフェニコール耐性でカ
ナマイシン感受性コロニーハ、所望のＢａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔ市ｓ Ｍｌ １１２／ｐＨｌ−１８株としテ
選択された。この株を培養し、常法通り構成プラスミド
の制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定確認した
。
実施例１９ プラスミドｐＢｓ ｌおよびｐＨ５３の組
み立て プラスミドＰＥＬ１０５ （実施例と同様にして、△ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／
ｐＥＬ１０５ （実施例７で調製）から常法により単離
）約ｌＯμＪ（５μｉ）、ＢＳ Ａ （１ｍＷ／ｍｔ
） ２μ１１水２９ μｌ、 ＢａｍＨＩ （水で１：
４に希釈）制限酵素、および反応ミックス′）５μｌを
２５°Ｃで１５分間インキュベートした。４Ｍ酢酸アン
モニウム約５０μｌ と９５係エタノール３００μｌを
加えて反応を停止させた。
み立て プラスミドＰＥＬ１０５ （実施例と同様にして、△ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／
ｐＥＬ１０５ （実施例７で調製）から常法により単離
）約ｌＯμＪ（５μｉ）、ＢＳ Ａ （１ｍＷ／ｍｔ
） ２μ１１水２９ μｌ、 ＢａｍＨＩ （水で１：
４に希釈）制限酵素、および反応ミックス′）５μｌを
２５°Ｃで１５分間インキュベートした。４Ｍ酢酸アン
モニウム約５０μｌ と９５係エタノール３００μｌを
加えて反応を停止させた。
−２０°Ｃに２時間冷却した後、得られたＤＮＡ沈殿物
を遠心分離によって集め、７０チエタノール中で２回洗
浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液約１０μｌに懸濁した。
を遠心分離によって集め、７０チエタノール中で２回洗
浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液約１０μｌに懸濁した。
プラスミドＰＥＬ１０５は２つのＢａｍ Ｈ１制限サイ
トを持っているので、種々のフラグメントの混合物が生
成する。
トを持っているので、種々のフラグメントの混合物が生
成する。
Ｘｉ） ＢａｍＨＩ制限酵素のための反応ミックスは、
以下の成分で調製した： １，５ＭＮａＣ１！、５９ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣ１！（ｐＨ７，９）、５ Ｑ ｒｎＭ
Ｍ ｇ Ｃ／ ２゜Ｂ、 プラスミドｐＨ１−１８の
Ｂ油■消化フ５ ｘ ミｔ’ ｐＨ１−１８約５μ／
（５，ｕｙ）、ＢＳＡ（１”９／ｍｊ） ２ ｔｉｌ、
水９μｌ、ＢａｍＨＩ（４単’ｔＶ１１１）制限酵素１
μｌおよび反応ミックス１．５μｌを３７０Ｃで約２時
間インキュベートした。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウム
および２．５容量の９５チエタノールを添加した後、と
の混合物を一２０６Ｃに約１８時間冷却してＤＮＡを沈
殿させた。遠心分離によってＤＮＡ沈殿物”ｌ’＋集め
、７０％エタノールで洗い、ＴＥ緩衝液約１０μｌに懸
濁した。
以下の成分で調製した： １，５ＭＮａＣ１！、５９ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣ１！（ｐＨ７，９）、５ Ｑ ｒｎＭ
Ｍ ｇ Ｃ／ ２゜Ｂ、 プラスミドｐＨ１−１８の
Ｂ油■消化フ５ ｘ ミｔ’ ｐＨ１−１８約５μ／
（５，ｕｙ）、ＢＳＡ（１”９／ｍｊ） ２ ｔｉｌ、
水９μｌ、ＢａｍＨＩ（４単’ｔＶ１１１）制限酵素１
μｌおよび反応ミックス１．５μｌを３７０Ｃで約２時
間インキュベートした。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウム
および２．５容量の９５チエタノールを添加した後、と
の混合物を一２０６Ｃに約１８時間冷却してＤＮＡを沈
殿させた。遠心分離によってＤＮＡ沈殿物”ｌ’＋集め
、７０％エタノールで洗い、ＴＥ緩衝液約１０μｌに懸
濁した。
ｑ 結合（リゲーション）
ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＨｌ−１ｓ （実施例１８
Ｂにより調製）約５μ１１プラスミドＰＥＬ１ｏ５Ｂ罰
■部分的消化物（実施例１８Ａで調製）８μｌ、水２７
μＪ、ＡＴＰ５μｌ： （４ｍＭ ）、リゲーションミ
ックス５μｌおよび”Ｉ’４ＯＮＡリガーゼ２μｌを１
６°Ｑ約１８時間インキュベートした。４Ｍ酢酸アンモ
ニウム５ＯＮ！および９５％エタノール２００μｌを加
えて反応を停止させた。−２０’Ｃで約２時間インキュ
ベートした後、所望のプラスミドｐＢｓｌおよびｐＨ５
３ＤＮＡ沈殿物を遠心分離して集め、７０％エタノール
で洗い、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液１０ｇ に懸濁し、使
用するまで４°Ｃで貯蔵した。
Ｂにより調製）約５μ１１プラスミドＰＥＬ１ｏ５Ｂ罰
■部分的消化物（実施例１８Ａで調製）８μｌ、水２７
μＪ、ＡＴＰ５μｌ： （４ｍＭ ）、リゲーションミ
ックス５μｌおよび”Ｉ’４ＯＮＡリガーゼ２μｌを１
６°Ｑ約１８時間インキュベートした。４Ｍ酢酸アンモ
ニウム５ＯＮ！および９５％エタノール２００μｌを加
えて反応を停止させた。−２０’Ｃで約２時間インキュ
ベートした後、所望のプラスミドｐＢｓｌおよびｐＨ５
３ＤＮＡ沈殿物を遠心分離して集め、７０％エタノール
で洗い、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液１０ｇ に懸濁し、使
用するまで４°Ｃで貯蔵した。
プラスミドＰＥＬ１０５には２つのＢａｍＨＩ制限サイ
トがあるので、部分的ＢａｍＨＩ消化により２個の〜４
．４Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成する。従って
、上記の操作によってプラスミドｐＢｓ ｌおよびＰＢ
Ｓ３の挿いアイッ２＝４！成ｔ６゜８つ、１郵１ワ。、
いはいづれの方（３”’計も結合することができるので
、２方向の組替えプラスミドが生成する。プラスミドｐ
Ｂｓ ｌおよびｐＨ５３のそれぞれの制限サイトおよび
機能地図を第６図に示した。
トがあるので、部分的ＢａｍＨＩ消化により２個の〜４
．４Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成する。従って
、上記の操作によってプラスミドｐＢｓ ｌおよびＰＢ
Ｓ３の挿いアイッ２＝４！成ｔ６゜８つ、１郵１ワ。、
いはいづれの方（３”’計も結合することができるので
、２方向の組替えプラスミドが生成する。プラスミドｐ
Ｂｓ ｌおよびｐＨ５３のそれぞれの制限サイトおよび
機能地図を第６図に示した。
実施例２０ プラスミドＰＢ５２およびｐＢＳ４の組み
立て Ｂ ａｍＨＩ 消化プラスミドｐＨｌ−１５をプラス
ミドｐＨＩ −１８の代りに用いるほかは実施例１９Ａ
−Ｃと同様にして、所望の表記の組立てを行なう。
立て Ｂ ａｍＨＩ 消化プラスミドｐＨｌ−１５をプラス
ミドｐＨＩ −１８の代りに用いるほかは実施例１９Ａ
−Ｃと同様にして、所望の表記の組立てを行なう。
プラスミドｐＥＬ１０５は２つのＢａｍＨＩ制限サイト
を持っているので、部分的ＢａｍＨＩ消化によって２個
の〜４４ Ｋｂ ＢａｍＨｌフラグメントが生成する。
を持っているので、部分的ＢａｍＨＩ消化によって２個
の〜４４ Ｋｂ ＢａｍＨｌフラグメントが生成する。
従って、上記の操作によりプラスミドＰＢＳ２とｐＨ５
４の挿入アイソマーも得られる。ＢａｍＨ珊Ｊ限ＤＮＡ
はいづれの方向にも結合することができるので、２方向
の組替えプラスミドが生成する。プラスミドｐＢＳ ２
およびｐＢＳ ４のそれぞれの制限サイトおよび機能地
図を第７図に示した。
４の挿入アイソマーも得られる。ＢａｍＨ珊Ｊ限ＤＮＡ
はいづれの方向にも結合することができるので、２方向
の組替えプラスミドが生成する。プラスミドｐＢＳ ２
およびｐＢＳ ４のそれぞれの制限サイトおよび機能地
図を第７図に示した。
実施例２１ プラスミドｐＢＳ５およびｐＢｓ５の組み
立て プラスミドＰＥＬ１０５とｐＨ１−１８の代りにプラス
ミドｐＥＬ１１０とｐ）（Ｉ−１５を使用するほかは実
施例１９Ａ−Ｃと実質的に同様にして表記の組み立てを
行なう。プラスミドｐＥＬ１１０は、実施例１と同様に
して、５ｔｒｅｐｔａ′ｒｒｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＥＬｌ １０ （実施例９で調製）から常
法により単離する。
立て プラスミドＰＥＬ１０５とｐＨ１−１８の代りにプラス
ミドｐＥＬ１１０とｐ）（Ｉ−１５を使用するほかは実
施例１９Ａ−Ｃと実質的に同様にして表記の組み立てを
行なう。プラスミドｐＥＬ１１０は、実施例１と同様に
して、５ｔｒｅｐｔａ′ｒｒｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＥＬｌ １０ （実施例９で調製）から常
法により単離する。
プラスミドｐＥＬ１１０には２つのＢａｍＨ１制限サイ
トがあるので、部分的Ｂ ａｍ ＨＩ 消化によって
２つの〜６．２ Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成
する。従って、上記の操作によってｐＨ５５とｐＨ５６
の挿入アイソマーも得られる。Ｂ ａｍ ＨＩ制限ＤＮ
Ａはいづれの方向にも結合し得るので、２方向の組替え
プラスミドが生成する。プラスミドｐＢｓ５およびｐＢ
Ｓ６のそれぞれの制限サイトおよび機能地図を第１３図
に示した。
トがあるので、部分的Ｂ ａｍ ＨＩ 消化によって
２つの〜６．２ Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成
する。従って、上記の操作によってｐＨ５５とｐＨ５６
の挿入アイソマーも得られる。Ｂ ａｍ ＨＩ制限ＤＮ
Ａはいづれの方向にも結合し得るので、２方向の組替え
プラスミドが生成する。プラスミドｐＢｓ５およびｐＢ
Ｓ６のそれぞれの制限サイトおよび機能地図を第１３図
に示した。
実施例２２ プラスミドｐＢＳ７およびｐＢｓ８の組み
立て プラスミドｐＥＬ１０５およびｐＨｌ−１８の代りにプ
ラスミドｐＥＬ１１３およびｐＨ１１５を用いるほかは
、実施例１９Ａ、−Ｃ，と同様の方法で表記の組み立て
を行なう。プラスミドｐＥＬ１１３は、実施例１と同様
にしてＳｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ ａｒｎｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＥＬ１１３ （実施例１１で調製）から常法
により単離する。
立て プラスミドｐＥＬ１０５およびｐＨｌ−１８の代りにプ
ラスミドｐＥＬ１１３およびｐＨ１１５を用いるほかは
、実施例１９Ａ、−Ｃ，と同様の方法で表記の組み立て
を行なう。プラスミドｐＥＬ１１３は、実施例１と同様
にしてＳｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ ａｒｎｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＥＬ１１３ （実施例１１で調製）から常法
により単離する。
プラスミドｐＥＬ１１３は、３つのＢａｍＨＩｉｇＩ限
サイトを持っているので、部分的ＢａｍＨ１消化によっ
て３つの〜７．８Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成
する。
サイトを持っているので、部分的ＢａｍＨ１消化によっ
て３つの〜７．８Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成
する。
ｐＨ５８の挿入アイソマーも得られる。ＢａｍＨ１制限
ＤＮＡはいづれの方向にも結合することができるので、
２方向の組替えプラスミドが生成する。プラスミドｐＢ
５７およびｐＢｓ８のそれぞれの制限サイトおよび機能
地図を第１４図に示す。
ＤＮＡはいづれの方向にも結合することができるので、
２方向の組替えプラスミドが生成する。プラスミドｐＢ
５７およびｐＢｓ８のそれぞれの制限サイトおよび機能
地図を第１４図に示す。
実施例２３ プラスミドｐＢＳ９およびＰＢＳＩＯの組
み立て プラスミドＰＥＬ１０５およびｐＨ１−１８の代りにプ
ラスミドＰＥＬ１２２およびｐＨｌ−１５を用いるほか
は実施例１９Ａ−Ｇと実質的に同様にして、表記の組み
立てを行なう。プラスミドｐＥＬ１２２は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉに１２ＨＢ１０１／ｐＥＬ１２２ （実施例１５で調
製）から常法により単離する。 ′。
み立て プラスミドＰＥＬ１０５およびｐＨ１−１８の代りにプ
ラスミドＰＥＬ１２２およびｐＨｌ−１５を用いるほか
は実施例１９Ａ−Ｇと実質的に同様にして、表記の組み
立てを行なう。プラスミドｐＥＬ１２２は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉに１２ＨＢ１０１／ｐＥＬ１２２ （実施例１５で調
製）から常法により単離する。 ′。
プラスミドＰＥＬ１２２は３つ、１のＢａｍＨＩ制限サ
イト：１１ を持っているので、部分的ＢａｍＨＩ消化により３つの
〜８．７ Ｋ ｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成する
。従って、上記の操作によってｐＢｓ９およびｐＢｓｌ
Ｑの挿入アイソマーも生成する。ＢａｍＨＩ制限ＤＮＡ
はいづれの方向にも結合し得るので、２方向の組替えプ
ラスミドが得られる。プラスミドｐＢＳ９およびプラス
ミドｐＢｓｌＱのそれぞれの制限サイトおよび機能地図
を第１５図に示す。
イト：１１ を持っているので、部分的ＢａｍＨＩ消化により３つの
〜８．７ Ｋ ｂ ＢａｍＨＩフラグメントが生成する
。従って、上記の操作によってｐＢｓ９およびｐＢｓｌ
Ｑの挿入アイソマーも生成する。ＢａｍＨＩ制限ＤＮＡ
はいづれの方向にも結合し得るので、２方向の組替えプ
ラスミドが得られる。プラスミドｐＢＳ９およびプラス
ミドｐＢｓｌＱのそれぞれの制限サイトおよび機能地図
を第１５図に示す。
実施例２４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１２／ｐＢｓ１およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐＢＳ３ ノ調製プラスミド
ｐＨｌ−１８の代りに、プラスミドｐＢ５１およびｐＨ
８３（実施例１９で調製）からなるＤＮＡを用いるほか
は、実施例１８と実質的に同じ方法で、所望の表記の調
製を行なう。得られたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉＭ
ｓ Ｍｌ １１２／ＰＢＳ １およびＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＢＳ３クロラムフェ
ニコール耐性並びにカナマイシン感受性形質転換体コロ
ニーを既知の方法で分離し一培養し、常法に従い、構成
プラスミドの制限溝□“素およびゲル電気泳動分析に１
１： よって同定する。′□°” 実施例２５ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１２／ＰＢＳ２およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍｌｌ １２／ＰＢＳ４の調製プラスミド
ｐＨｌ−１８の代りに、プラスミドｐＢＳ２およびｐＢ
Ｓ４ （実施例２０で調製）からなるＤＮＡを用いるほ
かは、実施例１８と実質的に同じ方法で、表記の調製を
行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーを
選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験する
。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性のＢａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂＬｉ１ｉｓＭＩｌ１２／ｐＢｓ２お
よびＢ、５ｕｂｔｉｌ ｉｓ Ｍｌ １１２／ｐＢｓ
４形質転換体を常法により単離し、培養し、構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、常法に
従って同定する。
Ｍ１１１２／ｐＢｓ１およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐＢＳ３ ノ調製プラスミド
ｐＨｌ−１８の代りに、プラスミドｐＢ５１およびｐＨ
８３（実施例１９で調製）からなるＤＮＡを用いるほか
は、実施例１８と実質的に同じ方法で、所望の表記の調
製を行なう。得られたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉＭ
ｓ Ｍｌ １１２／ＰＢＳ １およびＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＢＳ３クロラムフェ
ニコール耐性並びにカナマイシン感受性形質転換体コロ
ニーを既知の方法で分離し一培養し、常法に従い、構成
プラスミドの制限溝□“素およびゲル電気泳動分析に１
１： よって同定する。′□°” 実施例２５ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１２／ＰＢＳ２およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ Ｍｌｌ １２／ＰＢＳ４の調製プラスミド
ｐＨｌ−１８の代りに、プラスミドｐＢＳ２およびｐＢ
Ｓ４ （実施例２０で調製）からなるＤＮＡを用いるほ
かは、実施例１８と実質的に同じ方法で、表記の調製を
行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーを
選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験する
。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性のＢａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂＬｉ１ｉｓＭＩｌ１２／ｐＢｓ２お
よびＢ、５ｕｂｔｉｌ ｉｓ Ｍｌ １１２／ｐＢｓ
４形質転換体を常法により単離し、培養し、構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、常法に
従って同定する。
実施例２５ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ１１１２／ｐＢＳ５およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌ ｉｓ Ｍ１１１２／ｐＢｓ６ （ｙ）調製プラ
スミドｐＨ１−１８の代りにプラスミドｐＢＳ５および
ｐＢＳ６ （実施例２１で調製）からなるＤＮＡを使用
するほかは、実施例１８と実質的に同じ方法で表記の調
製を行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーを選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験
した。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ−１ｉｌｉｓ Ｍ１１１２／
ＰＢＳ５および３．５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐ
ＢＳ５形質転換体を常法に従って分離し、培養し、構成
プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、
常法に従って同定する。
Ｍ１１１２／ｐＢＳ５およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌ ｉｓ Ｍ１１１２／ｐＢｓ６ （ｙ）調製プラ
スミドｐＨ１−１８の代りにプラスミドｐＢＳ５および
ｐＢＳ６ （実施例２１で調製）からなるＤＮＡを使用
するほかは、実施例１８と実質的に同じ方法で表記の調
製を行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーを選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験
した。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ−１ｉｌｉｓ Ｍ１１１２／
ＰＢＳ５および３．５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐ
ＢＳ５形質転換体を常法に従って分離し、培養し、構成
プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、
常法に従って同定する。
実施例２７ ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＩ
ｌ１２／ｐＢＳ７およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐＢＳＢ （７）調製プラスミド
ｐＨｌ−１ｇの代りにプラスミドｐＢｓ ７およびｐＢ
ｓ８ （実施例２２で調製）からなるＤＮＡを使用す
るほかは、実施例１８と実質的に同じ方法で表記の調製
を行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニー
を選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験し
た。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性のＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／争
ＢＳ７およびＢ、５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＢ
Ｓ８形質転換体を常法に従って選択し、培養し、構成プ
ラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、常
法に従って同定する。
ｌ１２／ｐＢＳ７およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ Ｍ１１１２／ｐＢＳＢ （７）調製プラスミド
ｐＨｌ−１ｇの代りにプラスミドｐＢｓ ７およびｐＢ
ｓ８ （実施例２２で調製）からなるＤＮＡを使用す
るほかは、実施例１８と実質的に同じ方法で表記の調製
を行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニー
を選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験し
た。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性のＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／争
ＢＳ７およびＢ、５ｕｂＬｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＢ
Ｓ８形質転換体を常法に従って選択し、培養し、構成プ
ラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析により、常
法に従って同定する。
実施例２ ｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍｉｌ１２／ｐＢＳ９およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＢＳＩＯノ調製プラスミ
ドｐＨＩ＝１８の代りにプラスミドｐＢＳ９およびｐＢ
ｓｌｏ（実施例２３で調製）からなるＤＮＡを使用する
ほかは、実施例１８と実質的に同じ方法で表記の調製を
行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーを
選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験した
。この推定上のクロラムフェニコールおよびカナマイシ
ン耐性のＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１
１２．／ＰＢＳ５およびＢ、５ｕｂｔｉｌ １５Ｍ１１
１２／ＰＢＳ６形質転換体を常法に従って選択し、培養
し、構成プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析
により、常法に従って同定する。
Ｍｉｌ１２／ｐＢＳ９およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２／ＰＢＳＩＯノ調製プラスミ
ドｐＨＩ＝１８の代りにプラスミドｐＢＳ９およびｐＢ
ｓｌｏ（実施例２３で調製）からなるＤＮＡを使用する
ほかは、実施例１８と実質的に同じ方法で表記の調製を
行なう。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーを
選択し、常法によりカナマイシン耐性について試験した
。この推定上のクロラムフェニコールおよびカナマイシ
ン耐性のＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１
１２．／ＰＢＳ５およびＢ、５ｕｂｔｉｌ １５Ｍ１１
１２／ＰＢＳ６形質転換体を常法に従って選択し、培養
し、構成プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析
により、常法に従って同定する。
実施例２９ Ｓｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ ａｍｂｏＥ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＢＳ ｌおよびＳ、ｇｒｒｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ３ （ｙ）調製実施例１９のＤＮＡ
約２０ μＰおよびＳｔｒｅｐｔｐ−ｍｙｃｅｓ ａｒ
ｒｔ＋ｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ）
のプロトプラスト１×１０８を使い、国際公開ＡＷ０７
９１０１１６９（国際特許出願点ＰＣＴ／ＧＢ ７９１
０００９５ ）、実施例２の方法に従って表記の調製を
行なう。再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天
（最終プレート濃度を５０μｍ／ｒｎｌにするに十分な
チオストレプトン含有）を積層することにより、所望の
形質転換体をチオストレプトン耐性ｉこついて選択する
。得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｎｔｈＯｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ １およびＳ、ａｎｔｘ＊ｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＢＳ３チオストレプトン耐性コロニーを既知
の方法で分離し、培養し、実施例７と同様に構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析によって同定す
る。
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＢＳ ｌおよびＳ、ｇｒｒｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ３ （ｙ）調製実施例１９のＤＮＡ
約２０ μＰおよびＳｔｒｅｐｔｐ−ｍｙｃｅｓ ａｒ
ｒｔ＋ｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ）
のプロトプラスト１×１０８を使い、国際公開ＡＷ０７
９１０１１６９（国際特許出願点ＰＣＴ／ＧＢ ７９１
０００９５ ）、実施例２の方法に従って表記の調製を
行なう。再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天
（最終プレート濃度を５０μｍ／ｒｎｌにするに十分な
チオストレプトン含有）を積層することにより、所望の
形質転換体をチオストレプトン耐性ｉこついて選択する
。得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｎｔｈＯｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ １およびＳ、ａｎｔｘ＊ｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＢＳ３チオストレプトン耐性コロニーを既知
の方法で分離し、培養し、実施例７と同様に構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析によって同定す
る。
実施例３０ ５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＢｓ２およびＳ 、ａＴＩｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＢＳ ４の調製実施例２０からのＤＮＡ約
２０μグおよび５ｔｒｅ−ｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ）のプロト
プラスト１×１０８を使って、国際公開点ＷＯ７９１０
１１６９（国際特許出願／Ｆ）、ＰＣＴ／ＧＢ７９１０
００９５λ実施例２、の方法に従って表記の調製を行な
う。
ｃｉｅｎｓ ／ｐＢｓ２およびＳ 、ａＴＩｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＢＳ ４の調製実施例２０からのＤＮＡ約
２０μグおよび５ｔｒｅ−ｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ）のプロト
プラスト１×１０８を使って、国際公開点ＷＯ７９１０
１１６９（国際特許出願／Ｆ）、ＰＣＴ／ＧＢ７９１０
００９５λ実施例２、の方法に従って表記の調製を行な
う。
再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天（最終プ
レート濃度を５０μグ／−にするに十分なチオストレプ
トン含有）を積層することにより、所望の形質転換、体
をチオストレプトン耐性について選択す、。得Ｉ’ｌｌ
：らｔＬｆ： ５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ／ＰＢＳ２耐性コロニーを既知の方法で分
離し、培養し、実施例７と同様に構成プラスミドの制限
酵素およびゲル電気泳動分析によって同定する。
レート濃度を５０μグ／−にするに十分なチオストレプ
トン含有）を積層することにより、所望の形質転換、体
をチオストレプトン耐性について選択す、。得Ｉ’ｌｌ
：らｔＬｆ： ５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ／ＰＢＳ２耐性コロニーを既知の方法で分
離し、培養し、実施例７と同様に構成プラスミドの制限
酵素およびゲル電気泳動分析によって同定する。
実施例３１ ５ｔｒｅｐｔａｕｙｃｅｓ ａｒＩｔｈｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ５およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＢＳ５ ｃｒ）調製実施例２１のＤＮＡ約２
０μグおよびＳｔｒｅｐｔｏｍ−ｙＣｅｉ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ） （７）プ
ロトプラストＩ×１０８を使い、国際公開ＡＷＯ７９１
０１１６９（国際特許出願＆ＰＣ：Ｔ／Ｃ，Ｂ７９１０
００９５）、実施例２、の方法に従って表記の調製を行
なう。再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天（
最終プレート濃度を１μＹ、Ｍにするに十分なネオマイ
シン含有）を積層することにより、所望の形質転換体を
ネオマイシン耐性について選択する。得られた５ｔｒｅ
ｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ５
およびＳ、ａｍ−ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ５ネオマ
イシン耐性コロニーを既知の方法で分離し、培養し、実
施例９と同様に構成プラスミドの制限酵素およびゲル電
気泳動分析によって同定する。
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ５およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＢＳ５ ｃｒ）調製実施例２１のＤＮＡ約２
０μグおよびＳｔｒｅｐｔｏｍ−ｙＣｅｉ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ） （７）プ
ロトプラストＩ×１０８を使い、国際公開ＡＷＯ７９１
０１１６９（国際特許出願＆ＰＣ：Ｔ／Ｃ，Ｂ７９１０
００９５）、実施例２、の方法に従って表記の調製を行
なう。再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天（
最終プレート濃度を１μＹ、Ｍにするに十分なネオマイ
シン含有）を積層することにより、所望の形質転換体を
ネオマイシン耐性について選択する。得られた５ｔｒｅ
ｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ５
およびＳ、ａｍ−ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ５ネオマ
イシン耐性コロニーを既知の方法で分離し、培養し、実
施例９と同様に構成プラスミドの制限酵素およびゲル電
気泳動分析によって同定する。
実施例３２ ５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ［ａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ７およびＳ、ａｎｔｈｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＢＳ８ （７）調製実施例２２のＤＮＡ約２０
μ７およびＳｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｒｒｔｈｏ
［ａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ ４２４２０ ）のプロト
プラスト−×１０ を使い、国際公開点ＷＯ７９１０１
１６９（国際特許出願應ＰＣＴ／ＧＢ７９１０００９５
）、実施例２、の方法に従って表記の調製を行なう。実
施例７および９の方法に従い、所望の形質転換体を先づ
チオストレプトン耐性について、次いでネオマイシン耐
性について選択する。
ｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ７およびＳ、ａｎｔｈｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＢＳ８ （７）調製実施例２２のＤＮＡ約２０
μ７およびＳｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｒｒｔｈｏ
［ａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ ４２４２０ ）のプロト
プラスト−×１０ を使い、国際公開点ＷＯ７９１０１
１６９（国際特許出願應ＰＣＴ／ＧＢ７９１０００９５
）、実施例２、の方法に従って表記の調製を行なう。実
施例７および９の方法に従い、所望の形質転換体を先づ
チオストレプトン耐性について、次いでネオマイシン耐
性について選択する。
得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ２１′ｆＩｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ７およびＳ、７）ｏＥａｃｉｅｎ
ｓ／ｐＢＳ８チオストレプトン並びにネオマイシン耐性
コロニーを既知の方法で分離し、培養し、実施例１１と
同様に構成プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分
析によって同定する。
ａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ７およびＳ、７）ｏＥａｃｉｅｎ
ｓ／ｐＢＳ８チオストレプトン並びにネオマイシン耐性
コロニーを既知の方法で分離し、培養し、実施例１１と
同様に構成プラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分
析によって同定する。
実施例３３ ５ｔｒｅｐｔｃｎｖｙｃｅｓ ａｒｒｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ９およびＳ、ａｎｔｔｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＢＳ Ｉ Ｑの調製実施例２３のＤＮＡ約
２０μ７およびＳｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｒｉｔ
＊ｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ）のプ
ロトプラスト１×１０８ を使い、国際公開点ＷＯ７９
１０１１６９（国際特許出願應ＰＣＴ／ＧＢ７９１００
０９５）、実施例２、の方法に従って表記の調製を行な
う。再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天（最
終プレート濃度を５０μｍ／−にするに十分なチオスト
レプトン含有）を積層することにより、所望の形質転換
体をチオストレプトン耐性について選択する。
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＢＳ９およびＳ、ａｎｔｔｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＢＳ Ｉ Ｑの調製実施例２３のＤＮＡ約
２０μ７およびＳｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｒｉｔ
＊ｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲＲＬ Ａ２４２０ ）のプ
ロトプラスト１×１０８ を使い、国際公開点ＷＯ７９
１０１１６９（国際特許出願應ＰＣＴ／ＧＢ７９１００
０９５）、実施例２、の方法に従って表記の調製を行な
う。再生プロトプラストに改良Ｒ２培地トップ寒天（最
終プレート濃度を５０μｍ／−にするに十分なチオスト
レプトン含有）を積層することにより、所望の形質転換
体をチオストレプトン耐性について選択する。
得られた５ｔｒｅｐｔａｎｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＢＳ９およびＳ、ａＩｒｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＢｓ １０ チオストレプトン耐性コロニーを既知
の方法で分離し、培養し、実施例７と同様に構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析によって同定す
る。
ｅｎｓ／ｐＢＳ９およびＳ、ａＩｒｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＢｓ １０ チオストレプトン耐性コロニーを既知
の方法で分離し、培養し、実施例７と同様に構成プラス
ミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析によって同定す
る。
実施例３４ Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／Ｐ
ＢＳ９ およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／
ＰＢＳＩＯの調製プラスミドｐＬＲ２の代りに実施例２
３で調製したＤＮＡを形質転換に使用する以外は、実施
例３と実質的に同様にして表記の調製を行なう。生存コ
ロニーを先づ選択し、期待される表現型（Ａｍ４ｌ’ｅ
ｔＳ）について試験し、常法に従い、構成プラスミドの
制限酵素およびゲル電ネ泳動分析により、所望のＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＱｌ／卆ＢＳｇ およびＥ、
ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＢｓ１０形質転換体で
あることを確認する。
ＢＳ９ およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／
ＰＢＳＩＯの調製プラスミドｐＬＲ２の代りに実施例２
３で調製したＤＮＡを形質転換に使用する以外は、実施
例３と実質的に同様にして表記の調製を行なう。生存コ
ロニーを先づ選択し、期待される表現型（Ａｍ４ｌ’ｅ
ｔＳ）について試験し、常法に従い、構成プラスミドの
制限酵素およびゲル電ネ泳動分析により、所望のＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＱｌ／卆ＢＳｇ およびＥ、
ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＢｓ１０形質転換体で
あることを確認する。
以上述べた方法で調製し得るその他の代表的なプラスミ
ドおよび形質転換体をそれぞれ表■および表■に示す。
ドおよび形質転換体をそれぞれ表■および表■に示す。
本発明の目的からして、表Ｉに挙げたＰＢＳプラスミド
は、個々の調製の際に得られる挿入アイソマーを包含し
ている。
は、個々の調製の際に得られる挿入アイソマーを包含し
ている。
□
１１：。
表■ 代表的なプラスミド
（社）実施例３５〜４９において、最初に挙げたプラス
ミドは ｐＥＬチオストレプトンまたはネオマイシン耐
性遺伝子がｐＨＩカナマイシンまたはクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子と反対（隣接していない）の配向をとっ
ており、２番目のプラスミドはその逆の配向をとってい
る。
ミドは ｐＥＬチオストレプトンまたはネオマイシン耐
性遺伝子がｐＨＩカナマイシンまたはクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子と反対（隣接していない）の配向をとっ
ており、２番目のプラスミドはその逆の配向をとってい
る。
実施例５０〜５７においては、最初に挙げたプラスミド
はｐＨＩ ＰｖｕｌｌサイトがｐＢＲＨｉｎｄ ＩＩＩ
サイトに隣接している配向をとっており、２番目のプラ
スミドはその反対の配向をとっている。
はｐＨＩ ＰｖｕｌｌサイトがｐＢＲＨｉｎｄ ＩＩＩ
サイトに隣接している配向をとっており、２番目のプラ
スミドはその反対の配向をとっている。
実施例５８および５９においては、最初に挙げたプラス
ミドはｐＨＩ Ｘｂ ａ ＩサイトがｐＢＲＰｖｕＩＩ
サイトに隣接している配向をとっており、２番目のプラ
スミドが逆の配向をとっている。
ミドはｐＨＩ Ｘｂ ａ ＩサイトがｐＢＲＰｖｕＩＩ
サイトに隣接している配向をとっており、２番目のプラ
スミドが逆の配向をとっている。
表■ 代表的な形質転換体
１、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｒ／ｐＲ１（コこでｋは５
ｕｂｔｉｌｉｓ。
ｕｂｔｉｌｉｓ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１１１２、ＲＵＢ ３３１、ｔｈ
ｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓ ｉ ｓ 。
ｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓ ｉ ｓ 。
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ、ｃｅｒｅｕｓ、 ｐｏｐｉｌｌ
ａｅ、 １ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ。
ａｅ、 １ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ。
またはａｍｙｌｏｌ １ｑｕｉ ｆａｃｉｅｎｓであり
、１は独立して表Ｉの実施例３５〜５９に挙げたｐＢＳ
プラスミドのいづれかである）。
、１は独立して表Ｉの実施例３５〜５９に挙げたｐＢＳ
プラスミドのいづれかである）。
２．Ｓｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ Ｒ２／ｐＲ”
（ココテＲ”ハａｎｂｏｆａｃｉｅｎｓ、 ｆｒａｄｉ
ａｅ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、 ａｕｒｅｏｆａｃｉ
ｅｎｓ。
（ココテＲ”ハａｎｂｏｆａｃｉｅｎｓ、 ｆｒａｄｉ
ａｅ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、 ａｕｒｅｏｆａｃｉ
ｅｎｓ。
ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ 、または１ｉｖｉｄａｎｓ
テ；ｙ）す、Ｒ１は独立して前記と同意義である）。
テ；ｙ）す、Ｒ１は独立して前記と同意義である）。
３、 Ｅ、ｃｏｌｉＲ３／ｐＲ’ （ココテＲ
３ハに１２、Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ、Ｋｌ、９ ＲＶ３０
ｇ、ｃ６００１ｔｋ−Ｍｋ−； ｔ ｆニーはに１２
Ｃ６００であり、ｄは独立して表■の実施例４８〜５９
に挙げたＰＢＳプラスミドのいづれかである。
３ハに１２、Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ、Ｋｌ、９ ＲＶ３０
ｇ、ｃ６００１ｔｋ−Ｍｋ−； ｔ ｆニーはに１２
Ｃ６００であり、ｄは独立して表■の実施例４８〜５９
に挙げたＰＢＳプラスミドのいづれかである。
第１図はプラスミドｐＥＬ１０３の制限サイトおよび機
能地図を示す模式図であり、以下同様に第２図〜第１５
図はそれぞれプラスミドｐＩＡｌ 、ＰＬＪＬ２、ｐＨ
１−１５、ｐＨｌ−１８、ｐＢｓｌとｐＢＳ３、ＰＢＳ
２とｐＢ５４％ｐＥＬ１０７とｐＥＬ１０５、ＰＦ、Ｌ
ｉ２ＯとｐＥＬｌｌｏ、ＰＥＬ１１３とｐＥＬ１１４、
ＰＥＬ１１５とｐＥ私１１６、ｐＥＬ１２１とｐＥＬ１
２２、ｐＢＳ５とｐＢＳ５、ｐＢＳ７とｐＢｓｇ、およ
びｐＢｓ ｇとｐＢＳ Ｉ Ｑの制限サイトおよび機−
能地図を示す模式図である。 ＦＩＧ、 Ｉ ｐｈ１ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、 ５ ＦＩＧ、 ６ ｐＨ＄１ ｕ３ ＦｊＧ、７ ＦＩＧ、 ８ ＥＬ１０７ ＦＩＧ、９ −１１０・ ＩＩＩＬｌｌｏ ＦＩＧ、 １０ １１１３ ａ１１４ ＦＩＧ、１ｌ ｐｆｆｌＬ１１８ １Ｌ１１８ ＦＩＧ １２ ｐ！Ｌ１２１ ｐｌＬ１２！ ＦＩＧ、 ＋３ − ｍ５６ ＦＩＧ、 １４ −Ｓ＄− ＦＩＧ、 ＋５ 第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／１９ ） ６７６０−４８
（Ｃ１２Ｎ １５１００ ＣＩ２ Ｒ１／４６５） ６７６０−４
８（Ｃ１２Ｎ １５１００ ＣＩ２ Ｒ１１０７） ６７６０−４８
（ＣＩ２ Ｎ １５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） ６７６０−４Ｂ
（Ｃ１２Ｐ 、 １９／３４ Ｃ１２Ｒ１／１２５） ６７６０−４８
＠ｌ！ 明者シエフリー・トビン・フェアマン アメリカ合衆国インディアナ４６ ２２フインデイアナポリス・イー スト・カロリー・コート３６１７番 ０発 明 者 ：・受テイーブン・コバ上ビック１フメ
リカ合衆国インディアナ４６ ′２６５インディアナポリス・グリ ムローズ４フ２２番 ０発 明 者 ナンシー・エレン・マリン・ニー・ビア
マン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５０１４キユーパーテイーノ・リ バティー・オーク・レーン１０１０ ４番
能地図を示す模式図であり、以下同様に第２図〜第１５
図はそれぞれプラスミドｐＩＡｌ 、ＰＬＪＬ２、ｐＨ
１−１５、ｐＨｌ−１８、ｐＢｓｌとｐＢＳ３、ＰＢＳ
２とｐＢ５４％ｐＥＬ１０７とｐＥＬ１０５、ＰＦ、Ｌ
ｉ２ＯとｐＥＬｌｌｏ、ＰＥＬ１１３とｐＥＬ１１４、
ＰＥＬ１１５とｐＥ私１１６、ｐＥＬ１２１とｐＥＬ１
２２、ｐＢＳ５とｐＢＳ５、ｐＢＳ７とｐＢｓｇ、およ
びｐＢｓ ｇとｐＢＳ Ｉ Ｑの制限サイトおよび機−
能地図を示す模式図である。 ＦＩＧ、 Ｉ ｐｈ１ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、 ５ ＦＩＧ、 ６ ｐＨ＄１ ｕ３ ＦｊＧ、７ ＦＩＧ、 ８ ＥＬ１０７ ＦＩＧ、９ −１１０・ ＩＩＩＬｌｌｏ ＦＩＧ、 １０ １１１３ ａ１１４ ＦＩＧ、１ｌ ｐｆｆｌＬ１１８ １Ｌ１１８ ＦＩＧ １２ ｐ！Ｌ１２１ ｐｌＬ１２！ ＦＩＧ、 ＋３ − ｍ５６ ＦＩＧ、 １４ −Ｓ＄− ＦＩＧ、 ＋５ 第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／１９ ） ６７６０−４８
（Ｃ１２Ｎ １５１００ ＣＩ２ Ｒ１／４６５） ６７６０−４
８（Ｃ１２Ｎ １５１００ ＣＩ２ Ｒ１１０７） ６７６０−４８
（ＣＩ２ Ｎ １５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） ６７６０−４Ｂ
（Ｃ１２Ｐ 、 １９／３４ Ｃ１２Ｒ１／１２５） ６７６０−４８
＠ｌ！ 明者シエフリー・トビン・フェアマン アメリカ合衆国インディアナ４６ ２２フインデイアナポリス・イー スト・カロリー・コート３６１７番 ０発 明 者 ：・受テイーブン・コバ上ビック１フメ
リカ合衆国インディアナ４６ ′２６５インディアナポリス・グリ ムローズ４フ２２番 ０発 明 者 ナンシー・エレン・マリン・ニー・ビア
マン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５０１４キユーパーテイーノ・リ バティー・オーク・レーン１０１０ ４番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｌ、多機能組替えＤＮＡクローニングベクターであって
、 ａ）ストレプトマイセスにおいて機能する複製起原、バ
チルスにおいて機能する複製起原、およびイーコリにお
いて機能する複製起原からなる群から独立して選択され
る２種またはそれ以上の機能的に異なる複製起原、およ
び ｂ）該ベクターを構成している複製起原が機能し得る感
受性宿主細胞であって形質転換、細胞分裂および培養が
可能な宿主細胞に導入された時、少なくとも１種の抗生
物質に対する耐性を付与する１種またはそれ以上のＤＮ
Ａセグメント、を含有する多機能組替えＤＮＡクローニ
ングベクター（ただし、該ベクターが２種の機能的に異
なる複製起原に限定される場合は、その複製起原はいづ
れもイーコリにおいて機能しない）。 ２、ストレプトマイセス、バチルスおよびイーコリに於
いて機能する複製起原がそれぞれプラスミドｐＥＬ１０
３ の制限フラグメント、プラスミドｐＨ１−１５の制
限フラグメントおよびイーコリプラスミドの制限フラグ
メントである第１項に記載のベクター。 ３、ベクター中の複製起原がプラスミドｐＥＬ１０３の
制限フラグメントおよびプラスミドｐＨ１−１６の制限
フラグメントである第１項または第２項に記載のベクタ
ー。 ４、該プラスミドｐＥＬ１０３の複製起源含有制限フラ
グメントが〜２．８ＫｂＢａｍＨ１フラグメントである
第２項または第３項に記載のベクター。 ５、イーコリプラスミドがプラスミドｐＢＲ３２２また
はｐＢＲ３２８である第２項に記載のベクター。 ６、プラスミＦ ｐＬＲ２ノ〜１．６ Ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ制限フラグメントがチオストレプトン耐性を担ってい
る第１項〜第４項のいづれかに記載あベクター。 ７、プラスミドｐＬＲ１（７）〜３．４ Ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ制限フラグメントがネオマイシン耐性を担っている
第１項〜第４項のいづれかに記載のベクター。 ８プラスミｌ−’ ｐＨ１−１５の〜４．６ Ｋ ｂ
Ｂ ａ ｍＨＩ制限フラグメントがクロラムフェニコー
ル耐性を担っている第１項〜第４項のいづれかに記載の
ベクタ０ ９、プラスミドｐＨ１−１８の〜３．９ Ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ制限フラグメントがカナマイシン耐性を担っている
第１項〜第４項のいづれかに記載のベクター。 １０、プラスミドｐＢＳｌ、 ｐＢｓ２．ｐＢｓ３、ｐ
ＢＳ４． ｐＢＳ５、ｐＢＳ６． ｐＢＳ７、ｐＢＳ８
、ｐＢＳ９、ｐＢｓ ｌ Ｑ、ｐＨ５１１、ｐＢＳ １
２゜ｐＢｓ１３、ｐＢｓ１４、ｐＢｓｌＱ、ｐＢｓｌＱ
、ｐＢｓ １７、ｐＢｓ ｌ ８、ｐＢｓｌＱ、ＰＢＳ
２０、ＰＢＳ ２１、ＰＢＳ２２． ＰＢＳ２３、ＰＢ
Ｓ２４、ＰＢＳ２５、ｐＢ虚２６、ＰＢＳ２７、ＰＢＳ
２８、ＰＢＳ２９、ｐ１３ｓ３０、ＰＢＳ３１、ｐＢｓ
３２． ｐＢｓ３３、ｐＢｓ３４． ｐＢＳ３５、ｐＢ
Ｓ３５、ｐＢＳ３７、ｐＢＳ ３８、ｐＢｓ ３９、ｐ
Ｂ京４０、ｐＢＳ ４ ｌ、ＰＢＳ４２゜ｐＢＳ４３、
Ｐ１３ｓ４４． ｐＢｓ４５． ｐＢｓ４５． ｐＢＳ
４７、ｐＢｓ４８、′：１″：、。 ｐＢＳ４（１，ｐＢＳ５Ｑ、ｐＢｓ５１、ｐＢｓ、５２
． ｐＢＳ５３、ｐＢｓ５４、ｐＢＳ５５． ｐＢ５５
５％ｐＢＳ５７、ｐＢＳ５８ＳｐＢｓ５９、またはｐＢ
Ｓ５Ｑである第１項〜第９項のいづれかに記載のベクタ
ー。 ＰＢＳ６． ＰＢＳ７またはｐＨ８８である第１０項に
記載のベクター。 １２、 ｐＢＳｇ、ｐＢｓｌＱ、ｐＢ８４ｇまタハＰＢ
Ｓ６ｏテアル第１０項に記載のベクター。 １３、第１項〜第１１項に記載の組替えＤＮＡクローニ
ングベクターのいづれかを含有する形質転換された無制
限宿主細胞（ただし、該宿主細胞は形質転換前、ＤＮＡ
セグメント含有該ベクターによって耐性が付与される所
の抗生物質に対して感受性を有しており、そして該ベク
ターを構成している少なくとも１個の複製起原は該宿主
細胞において機能性を有する）。 １４、ストレプトマイセス、好ましくはａｒｎｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓｌｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはｆｒａｄｉａ
ｅ種である第１３項に、１ニー 記載の宿主細胞。：、’、Ｉｌｌ、、 １５、バチルス、好ま’Ｌ＜は５ｕｂｔｉｌｉｓ種であ
る第１３項に記載の宿主細胞。 １６、プラスミドＰＢＳ９、ＰＢＳ４９ ｔ ｆニー
ハＰＢＳ６０ 金含有しているイーコリである第１３項
に記載の宿主細胞。 １７、 Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＢＳ
９ である第１６項に記載の宿主細胞。 １８、１）ストレプトマイセスに於いて機能する複製起
原およびストレプトマイセスに導入された時少なくとも
１種の抗生物質に対する耐性を付与する１またはそれ以
上のＤＮＡセグメントを含有している制限フラグメント
、 ２）バチルスに於いて機能する複製起原およびバチルス
に導入された時少なくとも１種の抗生物質に対する耐性
を付与する１またはそれ以上のＤＮＡセグメントを含有
している制限フラグメント、 ３）イーコリに於いて機能する複製起原およびイーコリ
に導入された時少なくとも１種の抗生物質に対する耐性
を付与する１またはそれ以上のＤＮＡセグメントを含有
している制限フラグメント、の少な（とも２個を結合す
ることからなる多機能組替えクローニングベクターの製
法（ただし、該ベクターが２種の機能的に異なる複製起
原に限定される場合は、その複製起原はいづれもイーコ
リにおいて機能しない）。 １９、ベクター中の複製起原がプラスミドｐＥＬ１０３
の制限フラグメント、プラスミドｐＪ−ＩＩ−１６の制
限フラグメントおよびプラスミドｐＢＲ３２２の制限フ
ラグメントである、ストレプトマイセス、バチルスおよ
びイーコリにおいて機能するクローニングベクターを製
造する第１８項に記載の製法。 ２０、プラスミドｐＨｌ−１５またはＰＨ１−１８であ
る組替、ｊＤＮＡクローニングベクター。 ２１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ目ｉ ｓ ＭＩ １
１２／ｐＨ１１６の培養細胞を溶解し、溶解質からプラ
スミドを分離することからなるプラスミドｐＨｌ１５の
分離法。 ２２、該細胞をリゾチームで処理し、プラスミドを遠心
分離で分離する第２１項に記載の分離法。 ２３、プラスミドｐＨｌ１５の部分的Ｈｐａ■消化物を
自己結合させることからなるプラスミドＰＩ−１１１８
の調製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US344710 | 1982-02-01 | ||
| US06/344,710 US4503155A (en) | 1982-02-01 | 1982-02-01 | Multifunctional, cloning vectors for use in Streptomyces, Bacillus, and E. coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58134100A true JPS58134100A (ja) | 1983-08-10 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58015395A Pending JPS58134100A (ja) | 1982-02-01 | 1983-01-31 | 多機能クロ−ニングベクタ− |
Country Status (11)
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|---|---|
| US (1) | US4503155A (ja) |
| EP (1) | EP0085548A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58134100A (ja) |
| AU (1) | AU555628B2 (ja) |
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| DD (1) | DD208372A5 (ja) |
| DK (1) | DK36283A (ja) |
| GB (1) | GB2114137B (ja) |
| GR (1) | GR79115B (ja) |
| IE (1) | IE830161L (ja) |
| IL (1) | IL67760A (ja) |
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1983
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- 1983-01-28 EP EP83300442A patent/EP0085548A3/en not_active Withdrawn
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- 1983-01-31 DK DK36283A patent/DK36283A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-01-31 JP JP58015395A patent/JPS58134100A/ja active Pending
- 1983-01-31 GR GR70368A patent/GR79115B/el unknown
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| GR79115B (ja) | 1984-10-02 |
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