DD211360A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinierenden dna-klonierungsvektors - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors, indem man einen funktionellen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit ein oder mehr DNA-Sequenzen verbindet, die enthalten (a) ein Restriktionsfragment, das einen Replikationsstartpunkt von Escherichia coli enthaelt, (b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Escherichia coli transformiert sind, die gegenueber dem Antibiotikum sensitiv ist, fuer das eine Resistenz verliehen wird, und (c) ein oder mehr DNA-Segmente, die unabhaengig eine Streptomyces tra-Funktion und/oder Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Streptomyces transformiert sind, die gegenueber dem Antibiotikum sensitiv ist, fuer welches eine Resistenz verliehen wird.

Description

Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors 25

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer rekombinierender DNA-Klonierungsvektoren, die einen funktionellen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* und einen funktionellen Startpunkt eines replikationshaltigen und eine Antibiotikumresistenz verleihenden Restriktions-^OJ fragments eines Plasmids enthalten, das in Escherichia coli funktionell ist.

ι ο ' > K Π 7

Die erfindungsgemäß erhältlichen Vektoren sind vor allem deshalb besonders brauchbar, weil sie klein, versatil und in Streptomyces oder Escherichia coli transformierbar und selektierbar sind. Mehr als die Hälfte der klinisch wichtigen Antibiotika werden durch Stämme von Strepto- : myces gebildet, so daß die Entwicklung von Klonierungssystemen und Klonierungsvektören wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Solche Vektoren erlauben die Klonierung von Genen in Streptomyces, wodurch sich sowohl die Ausbeuten an bekannten Antibiotika erhöhen als auch neue Antibiotika und Antibiotikaderivative produzieren lassen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

und Aufgabe* Ber Erfindung:

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine einfache Selektion von Transformanten. Eine Transformation ist ein Ereignis mit sehr niedriger Häufigkeit, so daß ein solcher funktiöneller Test eine praktische Notwendigkeit zur Bestimmung der Zellen aus Millionen Zellen ist, die das Plasmid DNA aufgenommen haben. Dies ist wichtig, weil __ DNA-Sequenzen, die nicht selektierbar sind, in die Vektoren eingesetzt werden können und sich nach Transformation dann die Zellen, die den Vektor und die jeweils interessierende DNA-Sequenz enthalten, durch geeignete Phenotypselektion isolieren lassen.

Im Zusammenhang mit der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden bestimmte Begriffe verwendet, die wie folgt definiert sind:

3,4kb BamHI-Restriktionsfragment der Plasmide pLR1 oder pI.R4 = das gleiche, eine Neomycinresistenz übertragende 3,4kb BamHI-Fragment, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist.

R Amp = der ampicillinresistente Phenotyp.

Amp = der ampicillinsensitive Phenotyp.

R Tet = der tetracyclinresistente Phenotyp.

g Tet = der tetracyclinsensitive Phenotyp.

cm = der chloraraphenicolresistente Phenotyp.

g Cm = der chloramphenicolsensitive Phenotyp.

R Neo = der neomycinresistente Phenotyp.

S Neo = der neomycinsensitive Phenotyp.

Thio = der thiostreptonresistente Phenotyp. Thio = der thiostreptonsensitive Phenotyp.

RSR S Neo , Neo , Thio und Thio beziehen sich lediglich auf Ergebnisse von Versuchen in Streptomyces, wie sie vor-

R SR S R liegend angewandt wurden. Amp , Amp , Tet , Tet , Cm

20 und Cm beziehen sich nur auf Ergebnisse von Versuchen in Escherichia coli, wie sie vorliegend angewandt wurden.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

^ZJ Die Erfindung bezieht sich speziell auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekaribinierenden DNA-Klonierungsvektors, das da-' durch gekennzeichnet ist, daß man einen funktioneilen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit ein oder mehr

DNA-Sequenzen verbindet, die enthalten

(ä) ein Restriktionsfragment, das einen Replikationsstartpunkt von Escherichia coli enthält,

(b) ein oder mehr-DNA-Segmente, die eine Resistenz

gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, c wenn sie in eine Zelle von Escherichia coli transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist, für das eine Resistenz verliehen wird, und

IQ (c) ein oder mehr DNA-Segmente, die unabhängig eine Streptomyces tra-Funktion und/oder Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Streptomyces transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist, für welches eine Resistenz verliehen wird.

Die erfindungsgemäß erhältlichen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren eignen sich unter anderem zur Detektion transformierter Zellen von Streptomyces, indem man ·

1) Zellen von Streptomyces unter Transformationsbedingungen mit einem solchen rekombinierenden

25 DNA-Klonierungsvektor vermischt und

2) diese Zellen von Streptomyces auf einem Rasen aus einem Indikator für einen Stamm von Streptomyces wachsen läßt und die Kolonien, die den

30 M-Pustelphenotyp zeigen, selektiert.

Die obigen Vektoren werden am besten konstruiert durch Verbinden eines Startpunkts eines replikationshaltigen und eine Streptomyces tra-Funktion verleihenden Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit einem Startpunkt von Escherichia coli eines replikationshaltigen und eine Antibiotikumresistenz verleihenden Restriktionsfragments eines Plasmids von Escherichia coli. Die Plasmide SCP2 und SCP2*, aus denen Startpunkte einer Replikation konstruiert werden/ haben jeweils eine Größe von etwa 31 kb und zeigen ähnliche Restriktionsmuster. Das Plasmid SCP2* entspringt als spontane Mutante des Plasmids SCP2 und kodiert für _ eine selektierbare Kolonie an Pustelmorphologie. Diese Pustel ist zwar von derjenigen des Plasmids SCP2 unterscheidbar, doch sind die Plasmide SCP2 und SCP2* ansonsten praktisch identisch.

nn Da die vorliegende Offenbarung lehrt, daß die Streptomyces tra-Funktion und der Startpunkt der Replikation der Plasraide SCP2 und SCP2* innerhalb ihrer jeweiligen etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Restriktionsfragmente liegen, läßt sich eine Reihe replikationshaltiger und Streptomyces tra-Funktion verleihender Fragmente mit unterschiedlichem Startpunkt bilden. Dies wird erreicht durch Verdauung mit Restriktionsenzymen, die den etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Bereich ausschneiden. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan für das Plasmid SCP2* (und

3Q somit auch für das Plasmid SCP2) geht aus Figur 1 der Zeichnung hervor.

Die Plasmide SCP2 und SCP2* können in herkömmlicher Weise aus den jeweiligen Stämmen von Streptomyces coelicolor A3(2) und Streptomyces coelicolor M110 isoliert werden, die beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.'St.A. hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung sind. Streptomyces coelicolor A3(2) ist ohne jede Beschränkung als eine bevorzugte Quelle und Vorrat für das Plasmid SCP2 unter der Nummer 15042 erhältlich. Streptomyces coelicolor M110 ist ohne jede Beschränkung als eine bevorzugte Quelle und Vorrat für das Plasmid SCP2* unter der Nummer 15041 erhältlich.

Es läßt sich eine Reihe von tra-Funktion.verleihenden und einen Replikationsstartpunkt enthaltenden Restriktionsfragmenten von Plasmiden SCP2 und SCP2* konstruieren. Zu den beispielsmäßig speziell belegten Restriktionsfragmenten gehören die Restriktionsfragmente etwa 5,4 kb EcoRI-Sall, etwa 6,0 kb Sail, etwa 19 kb EcoRI-Hindlll und etwa 31 kb EcoRI des Plasmids SCP2* und das Restriktionsfragment etwa 31 kb BgIII des Plasmids SCP2. Die oben erwähnten Fragmente der Plasmide SCP2* und SCP2 sind jeweils an ein einen Replikationsstartpunkt enthaltendes und eine Antibiotikumresistenz verleihendes Fragment von

^ÄJI Plasmiden pBR325 und pBR322 von Escherichia coli gebunden. Für den Fachmann ist ohne weiteres ersichtlich, daß - auch wenn dies nicht unbedingt erforderlich ist zweckmäßigerweise sowohl das DNA-Segment, das eine Antibiotikumresistenz in Escherichia coli verleiht, als auch

der Replikationsstartpunkt von Escherichia coli ein Restriktionsfragment des gleichen Plasmids von Escherichia coli enthält.

Aus Gründen einer einfachen und leichten Konstruktion verbindet man daher das Fragment etwa 31 kb EcoRI des Plasmids SCP2* und das Fragment etwa 6 kb EcoRI des Plasmids pBR325 miteinander, wodurch beispielsweise die Plasmide

pJL120 und pJL121 gebildet werden. Man erhält rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da die Fragmente in einer von zwei Richtungen verbunden werden können. In ähnlicher Weise erhält man durch Verbinden des SCP2* etwa 6,0 kb Sall-Fragments mit dem etwa 6 kb SaII-Fragment von pBR325 beispielsweise die Plasmide pJL180 und pJLi81. Durch Verbinden des SCP2* etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragments mit dem etwa 4,8 kb EcoRI-Sall-Fragment von pBR325 gelangt man beispielsweise zum Plasmid pJL125. 1Ö Durch Verbinden des SCP2 BamHI-Verdauungsprodukts mit dem etwa 4,4 kb BamHI-Fragment des Plasmids pBR322 ergibt sich beispielsweise das Plasmid pJLi14.

. Alle oben erwähnten Vektoren sind sowohl in Escherichia coli als auch in Streptomyces leicht selektierbar. So verleihen in Escherichia coli beispielsweise die Plasmide pJL120 und pJL121 eine Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetracyclin, die Plasmide pJL180 und pJLi81 eine Resistenz gegenüber Ampicillin und Chloramphenicol und die Plasmide pJL125 und pJLi14 eine Resistenz gegenüber lediglich Ampicillin. Die Vektoren sind daher in herkömmlicher Weise im Wirtssystem aus Escherichia coli selektierbar, indem man dem Kulturmedium das jeweils geeignete Antibiotikum zusetzt.

Die oben erwähnten Vektoren bilden ferner auch den sogenannten Pustelphenotyp, so daß sie in üblicher Weise in Streptomyces selektierbaf sind. Der Pustelphenotyp ist eine erkennbare Eigenart und bekannte Erscheinung

(J. Gen. Microbiol. 126,427 (1981)), die verbunden ist mit einer letalen Zygose und der tra-Funktion (tra = Gene, die für eine Sexualübertragbarkeit kodieren) von Sexualfaktoren von Streptomyces. Nach Auftragen auf einen geeigneten Indikatorstamm ergeben sich mit Transformanten der Plasmide SCP2 und SCP2* sowie der Derivate der Plasmide SCP2 und SCP2* drei unterscheidbare Pustelmbrphologien. Die Koloniemorphologie für den wilden Typus SCP2 und die Mutante SCP2* bezeichnet man hierin jeweils als

P bzw. P*. Eine dritte und bisher unbekannte Pustelmorphologie ergibt sich durch Klonierung in die Restriktionsstelle EcoRI von SCP2 oder SCP2*. Durch eine

solche Inserierung kommt es zu einer Inaktivierung des 5

Gens P und unerwarteten Bildung eines morphologisch unterscheidbaren Minipustelphenotyps, der hierin als M bezeichnet wird, wenn Transformanten in geeigneter Weise aufgezogen werden. Bei einem Minipustel handelt es sich um ein Pustel mit wesentlich kleinerer Größe als die Pusteln, die entweder durch SCP2 oder SCP2* gebildet werden.

Nur transformierte Zellen von Streptomyces zeigen den -C M-Pustelphenotyp, so daß sich Transformanten leicht identifizieren und selektieren lassen. Aus der obigen Beschreibung der vorliegenden pJL-Vektoren kann der Fach-

— ΟΙ mann ohne weiteres erkennen, daß die Plasmide pJL120, pJLi21 und pJL125 für den Phenotyp M kodieren, daß die Plasmide pJL180 und pJLi8i für den Phenotyp P* kodieren und daß das Plasmid pJL114 für den Phenotyp P kodiert. Die zur Expression des Pustelphenotyps geeigneten Indikatorstämme sind bekannt, und hierzu gehören die verschiedenen Stämme von SCP2~ und SCP2*~, wie sie aus den späteren Beispielen hervorgehen. Die vorliegenden Vektoren sind daher in Streptomyces selektierbar und äußerst brauchbar.

Die oben erwähnten Plasmide können ferner auch mit einem DNA-Segment versehen werden, das in Streptomyces eine Antibiotikumresistenz verleiht. Solche Derivate, von denen spezielle Beispiele die Plasmide pJLi90 und pJL195 sind, exprimieren einen weiteren selektierbaren Phenotyp. Das Plasmid pJL190 wird konstruiert durch Verbinden des eine Neomycinresistenz verleihenden etwa 7,7 kb EcoRI-HindlII-Fragments des Plasmids pLR4 mit dem etwa 19 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pJL121. Das Plasmid pJL195 wird konstruiert durch Verbinden des pLR4 etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragments mit dem etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment des Plasmids pJL125. Das letztgenannte Plasmid pJL125 enthält das größte (5,4 kb) EcoRI-SaII-Fragment des. Plasmids pSCP2* und wird konstruiert durch Sall-Auslöschung des Plasmids pJL121. Zusätzlich zur Neomycinresistenz exprimieren die Plasmide pJL190 und pJL195 obigen Ausführungen zufolge auch den Phenotyp.M.

Das Plasmid pLR4, nämlich die Quelle für die eine Neomycinresistenz verleihenden Fragmente, hat eine Größe von etwa 7,7 kb und wird konstruiert durch Verbinden der mit BamHI behandelten Plasmide pBR322 und pLR1. Das Plasmid pLR1 hat eine Größe von etwa 14,8 kb und wird konstruiert durch Verbinden des mit Hindlll behandelten Plasmids pIJ2 (Nature 286, 525 (1980)) mit dem mit Hindlll behandelten Plasmid pBR322. Wie vom Fachmann ohne weiteres erkennbar, enthalten beide Plasmide pLR4 und pLR1 das gleiche Gen

-ΙΟΙ für die Neomycinresistenz, so daß sich zur Konstruktion der oben erwähnten neomycinresistenten pJL-Vektoren eines dieser Plasmide verwenden läßt.

Ein weiteres, eine Neomycinresistenz verleihendes Piasmid, das als Plasmid pJL192 bezeichnet wird, wird als spontane Mutante des Plasmids pJL190 isoliert, die in Streptomyces griseofuscus vorkommt. Das Plasmid pJL192 sorgt für eine Resistenz gegenüber erhöhten Mengen an Neomycin, und es enthält daher ein neues Gen für eine Neomycinresistenz, das vom Resistenzgen, welches die Plasmide pJL190, pJLi95, pIJ2, pLR4 und pLR1 enthält, unterscheidbar ist. In ähnlicher Weise wird auch ein weiteres, eine Neomycinresistenz verleihendes Plasmid, das als Plasmid pJLi99 bezeichnet wird, als spontane Mutante des Plasmids pJLi95 isoliert. Der Fachmann erkennt ohne weiteres, daß sich das neue Gen für eine Neomycinresistenz der Plasmide pJLi92 oder pJLi99 ohne weiteres ausschneiden und mit anderen Vektoren verbinden läßt.

Das Gen erlaubt eine bessere und wirkungsvollere Selektion von Transformanten. Wie im Falle der Plasmide pJL190 und pJL195 exprimieren auch die Transformanten der Plasmide ρJL192 und pJL199 den Phenotyp M, wenn man sie auf

einen geeigneten Indikatorstamm aufträgt. 25

Das Plasmid pJL192 läßt sich in üblicher Weise aus Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~/pJL192 isolieren, nämlich aus einem Stamm, der beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung ist. Dieser Stamm ist von dort als Vorrat und bevorzugte Quelle für das Plasmid pJLi92 unter der Nummer B-15040 frei beziehbar.

Ein DNA-Segment, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Thiostrepton verleiht, wie beispielsweise das etwa 1,35 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2, kann auch zusammen mit dem eine Neomycinresistenz verleihenden Seg-

ment oder anstelle dieses Segments verwendet werden. Das Plasmid pLR2, nämlich die Quelle für das die Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, hat eine Größe von etwa 18,7 kb und wird konstruiert durch Verbinden des mit Hindlll behandelten Plasmids pIJ6 (Nature 286, 525 (1980)) mit dem mit Hindlll behandelten Plasmid pBR322. Das Plasmid pLR2 ist in Escherichia coli funktionell und läßt sich daher für eine einfache anschließende Manipulation verstärken und isolieren.

Aus Gründen einer einfachen und leichten Konstruktion verbindet man das die Thiostreptonresistenz verleihende etwa 1,35 kb BaraHI-Fragment des Plasmids pLR2 mit der BamHI-Restriktionsstelle des Plasmids pBR328 unter BiI-dung des Plasmids pJL193. Das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 enthält das die Thiostreptonresistenz verleihende DNA-Segment. Durch entsprechendes Verbinden, wie dies in den Beispielen 52 bis 56 beschrieben ist, erhält man daher Vektoren, die innerhalb des Ümfangs der vorliegenden Erfindung liegen.

Verschiedene Restriktionsfragmente der Plasmide SCP2 und SCP2* können für Zwecke einer Konstruktion der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern der in ihren jeweiligen etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Restriktionsfragmenten enthaltene Replikationsstartpunkt vorhanden ist. Zu solchen weiteren Restriktionsfragmenten der Plasmide SCP2 und SCP2* gehören unter anderem die Fragmente etwa 6 kb Sail, etwa 15 kb Pstl, etwa 23 kb BgIII, etwa 15 kb BamHI,

etwa 14 kb EcoRI-PstI, etwa 13 kb EcoRI-BamHI und etwa 15 kb Pstl-BamHI. Diese Fragmente enthalten die Streptomyces tra-Funktion und können mit einem Restriktionsfragment eines Plasmids von Escherichia coli verbunden werden, das einen in Escherichia coli funktioneilen Repli-

·" kationsstartpunkt enthält und eine Antibiotikumresistenz verleiht. Zu solchen Plasmiden von Escherichia coli gehören beispielsweise die Plasmide pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328 und dergleichen. Die vorliegende Erfindung

ist daher nicht auf die Verwendung eines der Plasmide pBR322 oder pBR325 beschränkt, wie sie als Beispiele in mehreren Konstruktionen von pJL verwendet werden.

Als DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Neomycin und Thiostreptqn verleihen, sind hierin zwar beispielsmäßig die etwa 7,7 kb EcoRI-HindiII«und die etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragmente des Plasmids pLR4 sowie die pLR2 etwa 1,35 BamHI- und die pJL193 etwa 1 kb Bcll-Fragmente erwähnt, doch kann der Fachmann auch andere DNA-Segmente konstruieren und verwenden, die ebenfalls eine Resistenz gegenüber Neomycin oder Thiostrepton verleihen. Zu anderen DNA-Segmenten des Plasraids pLR1, die eine Neomycinresistenz verleihen, gehören beispielsweise das etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment, das etwa 3,5 kb Pstl-Restriktionsfragment und das größere der Sstl-Kpnl-Subfragmente des etwa 3,4 kb BamHI-Re-.striktionsfragments. Zu anderen eine Thiostreptonresistenz verleihenden Segmente gehört beispielsweise das etwa 13 kb Pstl-Fragment des Plasmids pLR2. Es lassen sich auch weitere DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den gleichen oder anderen Antibiotika verleihen, wie beispielsweise gegenüber Hygromycin, Viamycin, Tylosin, Erythromycin und dergleichen, in dem Fachmann geläufiger Weise konstruieren und verwenden. Darüber hinaus können auch verschiedene funktionelle Derivate der oben beschriebenen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente konstruiert werden, indem man Nucleotide in Übereinstimmung mit dem genetischen Kode addiert, eliminiert oder sub-

^ou stituiert. Durch Verbinden der oben erwähnten Derivate oder irgendeines der anderen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente mit einem Vektor, der ein eine Antibiotikumresistenz verleihendes DNA-Segment von Escherichia coli, ein Restriktionsfragment mit einem

Replikationsstartpunkt von Escherichia coli und ferner ein einen Replikatxonsstartpunkt enthaltendes Restriktionsfragment der Plasmide SCP2 oder SCP2* enthält, ge-

langt man zu Plasmiden, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Das eine Antibiotikumresistenz verleihende DNA-Segment läßt sich daher als selektierbarer Präger anstelle der Streptomyces tra-Funktion verwenden und mit einem Pustelphenotyp in Verbindung stehen. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher nicht auf die Verwendung von tra allein oder in Kombination mit einem eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segment beschränkt. Darüber hinaus ist ein besonderes, eine Antibiotikumresistenz verleihendes DNA-Segment nicht auf eine einzige Stelle an den vorliegenden chimeren Plasmiden beschränkt sondern läßt sich auch an verschiedenen Stellen verbinden oder einsetzen, sofern der Replikationsstartpunkt oder sonstige kritische plasmidgesteuerte physiologische Funktionen nicht zerstört werden. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres ermitteln, welche Stellen für eine Verbindung oder einen Einsatz eines bestimmten DNA-Segments zweckmäßig sind.

Die verschiedenen Restriktionsfragmente der Plasmide SCP2, SCP2*, pBR325, pBR322 und dergleichen und ferner auch die verschiedenen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente, welche die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten, können zu einer Erleichterung der Verbindung modifiziert sein. So lassen sich beispielsweise bei einigen oder allen der oben erwähnten DNA-Fragmente Molekülverknüpfer vorsehen. Auf diese Weise können ganz einfach spezielle Stellen für eine nachfolgende Verbindung konstruiert werden. Die einen Replikationsstartpunkt enthaltenden Restriktionsfragmente können weiter auch durch Addition, Eliminierung oder Substitution bestimmter Nucleotide so abgewandelt werden, daß es hierdurch zu einer Veränderung ihrer Eigenschaften unter Bildung einer Vielfalt an Restriktionsstellen für eine Verbindung von DNA kommt. Der mit der Nucleotidchemie und dem genetischen Kode vertraute Fachmann weiß, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar sind und durch welche Abwandlungen

-14-von DNA sich jeweils ein bestimmter Zweck erreichen läßt.

Die rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren, die die SCP2 oder SCP2* Streptomyces tra-Funktion enthalten, sind selbstübertragbar und lassen sich daher ohne weiteres während einer Paarung zwischen transformierten und nichttransformierten Vertretern aus der Gattung der Streptomyces übertragen. Dies ist von Vorteil, weil sich die vorliegenden Vektoren daher nicht nur durch Protoplasttransformation sondern auch durch herkömmliche genetische Kreuzungen übertragen lassen. Die Vektoren sind daher in Stämmen von Streptomyces brauchbar, die schwierig protoplastizierbar sind, wodurch sich die Anzahl an Wirten stark erhöht, in denen eine Genmanipulation und DNA-KIo-

15 nierung vorgenommen werden kann.

Noch wichtiger ist, daß in den vorliegenden Vektoren konstruierte DNA-Bibliotheken einfach und rasch durch herkömmliche Doppelplättenpaarungsverfahren bezüglich interessierender Gene durchgesehen werden können. Ohne die tra-Funktion muß die DNA von jedem der Tausende an Klonen in der Bibliothek abgetrennt und in geeignete Stämme transformiert werden, damit sich die Klone identifizieren lassen, die die gewünschten Gene enthalten.

^z;j Es gibt keine breit anwendbaren Phagvektoren für einen Einsatz in Streptomyces, so daß die vorliegenden tra Vektoren die allgemeine Klonierungs- und Auswahlrolle analog zu der des Bacteriophagen λ bei einer Doppelplattenpaarung für eine Durchsuchung von Genbibliothe-

ken in Escherichia coli erfüllen. Auf diese Weise lassen sich durch das Doppelplättenpaarungsverfahren ohne weiteres die erwünschten Gene identifizieren und dann durch Einschleusung in Escherichia coli in der im späteren Beispiel 2OC beschriebenen Weise leicht verstärken. , Die erfindungsgemäßen Vektoren sind breit anwendbar und werden in Wirtszellen mancher Vertreter aus der Gattung der Streptomyces transformiert, insbesondere in restriktions-

losen Stämmen wirtschaftlich wichtiger Taxa, die Antibiotika bilden, wie Aminoglycosid-, Makrolid-, ß-Lactam-, Polyether- und Glycopeptidantibiotika. Solche restriktionslose Stämme lassen sich aus der Gattung der Streptomyces unter Anwendung herkömmlicher Verfahren leicht selektieren und isolieren (Microbiological Reviews 44, 206 (1980)). Wirtszellen restriktionsloser Stämme enthalten keine Restriktionsenzyme, so daß sie Plasmid-DNA nach Transformation nicht schneiden oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren schneiden, werden erfindungsgemäß ebenfalls als restriktionslos angesehen.

1.5 Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Aminoglycosidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen:

s. kana myceticus (Kanamycine), S. chrestomyceticus (Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. microsporeus (Antibiotikum SF-767),S. ribosidificus (Antibiotikum SF733), S. flavopersicus (Spectinomycin), S. spectabilis (Actinospectacin), S. rimosus forma

paromomycinus (Paromomycine, Catenulin), S. fradiae var. italicus (Aminosidin), S. bluensis var.. bluensis (Bluensomycin), S. catenulae (Catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin A), S. tenebrarius (Tobramycin,

Apramycin), S. lavendulae (Neomycin), S. albogriseolus on ^Λν (Neomycine), S. albus var. metamycinus (Metamycin), S. hygroscopicus var. sagamiensis (Spectinomycin), S. bikiniensis (Streptomycin), S. griseus (Streptomycin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (Streptomycin),

S. poolensis (Streptomycin), S. galbus (Streptomycin),

S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomycin),

S. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var.· limoneus (Validamycine), S. rimofaciens (Destomycine),

S. hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin), S. fradiae (Hybrimycine, Neomycine), S. eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), S. aquacanus (N-Methylhygromycin B), S. crystallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S. hygroscopicus (Hygromycine), S. atrofaciens (Hygromycin), S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis (Kasugamycine), S. netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Lividomycine), S. hofuensis (SeI-domycinkomplex) und S. canus (Ribosylparoiiiamin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Makrolidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktions-

15 lose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen:

S. caelestis (Antibiotikum M188), S. platensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S. fungicidicus

20 (Antibiotikum NA-181), S. griseofaciens (Antibiotikum

PA133A, B), S. roseocitreus (Albocyclin), S. bruneogriseus (Albocyclin), S. roseochromogenes (Albocyclin), S. cinerochromogenes (Cineromycin B), S. albus (Albomycetin), S. felleus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Lankacidin,

Borrelidin), S. violaceoniger (Lankacidin), S. griseus (Borrelidin), S. maizeus (Ingramycin), S. albus var. coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (Acetylleukomycin, Espinomycin), S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), S. griseo-

° spiralis (Relomycin), S. lavendulae (Aldgamycin), S.

rimosus (Neutramycin), S. deltae (Deltamycine), S. fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomycine), S. furdicidicus (Mydecamycin), S. eurocidicus (Methymycin),S.

griseolus (Griseomycin), S. flavochromogenes (Amaromycin,

Shincomycine), S-.* fimbriatus . (Amaromycin) , S. fasciculus (Amaromycin), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleandomycin), S. olivochromogenes (Oleandomycin),

S. spinichromogenes var. suragaoensis (Kujimycine), S. kitasatoensis (Ijeucomycin) , S. narbonensis var. josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), S. albogriseolus (Mikonomycin), S. bikiniensis (Chalcomycin), S. cirratus (Cirramycin), S. djakartensis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae (Tylosin, Lactenocin, Macrocin), S. goshikiensis (Bandamycin), S. griseoflavus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin), S. tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (Carbomycin), S. thermotolerans (Garbomycin), S. albireticuli (Carbomycin) und S. ambofaciens (Spiramycin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die ß-Lactamantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), S. clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), S. lactamdurans (Cephamycin C),

s. griseus (Cephamycin A, B), S. hygroscopicus (Desacetoxycephalosporin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartreusis (SF 1623), S. heteromorphus und S. panayensis (C2081X), S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viridochromogenes (Cephamycine A, B),

" S. cattleya (Thienamycin) und S. olivaceus, S. flavovirens, S. flavus, S. fulvoviridis, S. argenteolus sowie S. sioyaensis (MM 4550 und MM 13902).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die. Polyetherantibiotika bürden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), S. hygro-³ß scopicus (A218, Emericid, DE3936), A120A, A28695A und B, Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. conglobatus (Ionomycin), S. eurocidicus var. asterocidicus (Laidlomycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosi-

dificus (Lonomycin), S. cacaoi var. asoensis (Lysocellin), S. cinnamonensis (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gallinarius (RP 30504) , S-. longwoodensis (Lysocellin) , S. flaveolus (CP38936), S. mutabilis (S-11743a) und si

5 violaceoniger (Nigericin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Gattung Streptomyces, die Glycopeptidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgenden Organismen: S. orientalis und S. haranomachiensis (Vancomycin), S. candidus (A-35512, Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme anderer Streptomyces, in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise folgen-

20 den Organismen: S. granuloruber, S. roseosporus, S. lividans, S. espinosus und S. azureus.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Wirtszellen typischer Streptomyces sind die vorliegenden Vektoren auch in Escherichia coli brauchbar und transformierbar. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher breit anwendbar und geeignet, und sie können in Wirtszellen aus einer Vielfalt von Organismen transformiert werden.

Im allgemeinen sind alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung brauchbar. Einige der vorliegenden rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten sind jedoch bevorzugt. Bevorzugte Vektoren sind daher pJL114, pJLi21, pJLi25, pJL180, pJL190, pJL192, pJL195, pJL197, pJLi99 und pHJL212, und zu bevorzugten Transformanten gehören demnach Streptomyces griseofuscus/pJL114, S. griseofuscus/pJLi21, S. griseofuscus/pJL125, S. gri-

seofuscus/pJLieO, S- griseofuscus/pJLI90, S. griseofuscus/ pJLi92, S. griseofuscus/pJL195, S. griseofuscus/pJL199, S. griseofuscus/pJLI97, S. griseofuscus/pHJL212, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL114, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL121, E. coli K12 C600R_k -M_k-/pJL125, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL-

180, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL190, E. coli K12 C600R_k~M_k-/pJL192, E. coli K12 C600R_k"M_k-/pJL195, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJLi99, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL197 und E. , coli K12 C600R_k-M_k-/pHJL212. Am meisten bevorzugt sind aus dieser bevorzugten Gruppe die Plasmide pJL190, pJL192, PJL195, pJLi97, pJL199 und pHJL212 und die Transformanten S. griseofuscus/pJLI90, S. griseofuscus/pJLi92, S. griseofuscus/pJLi95, S. griseofuscus/pJLI97, S. griseofuscus/pJL199, S. griseofuscus/pHJL212, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL190, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL192, E, coli K12 C600R_k-M_k-/pJL195 und E. coli K12 C600R_k-M_k~/pJL197, E. coli K12 C600R_k-M_k-/pJL199 und E. coli K12 C600R_k~M_k-/pHJL212. Streptomyces griseofuscus ist ein bevorzugter Wirt, weil dieser Organismus kein endogenes Plasmid enthält und kein Antibiotikum synthetisiert. Transformanten von Streptomyces griseofuscus können daher auf Klone durchsucht werden, die Gene für eine Antibiotikumsynthese ausdrücken.

Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten Replikationsstartpunkte, die in Escherichia coli und Streptomyces funktionell sind und gestalten die Auswahl an Wirten daher flexibel. Klonierte DNA-Sequenzen können deshalb in Escher ichia coli eingeschleust werden, um hierdurch neue Plasmide zu konstruieren, physikalisch zu analysieren und Restriktionsstellen vorzusehen, und sie lassen sich dann wieder in Streptomyces rückschleusen, um die Stämme funktionell zu analysieren und zu verbessern. Dies ist besonders vorteilhaft, weil sich eine Verstärkung und Manipulierung von Plasmiden in Escherichia coli rascher und einfacher durchführen läßt als in Streptomyces. So können die vorliegenden Vektoren beispielsweise in übli-

eher Weise in Escherichia coli K12 verstärkt werden, indem man sie mit Spectinomycin oder Chloramphenicol wachsen läßt- Dies ist in dem Wirtssystem aus Streptomyces nicht möglich. Da alle Plasmidvektoren Resistenzpräger enthalten, die in Escherichia coli K12 ausgedrückt werden, lassen sich ferner auch Rekombinanten leicht selektieren. Man kann daher große Mengen an Plasmid-DNA einfach und in kürzerer Zeit isolieren als bei Anwendung ähnlicher Verfahren in Streptomyces. Nach Abschluß der

TO gewünschten rekombinierenden DNA-Verfahren im Wirtssystem in Escherichia coli kann man die jeweilige Streptomyces-DNA daher entfernen, wieder zur Plasmidform (falls erforderlich) umkonstruieren und dann in eine Wirtszelle von Streptomyces transformieren. Die vorliegenden Vektoren sind in Streptomyces vollständig selektierbar, so daß sich die rekombinierenden Klone sauber und rasch identifizieren lassen.

Die erfindungsgemäßen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten verfügen über eine breite Brauchbarkeit und tragen zur Auffüllung des Bedarfs an geeigneten Klonierungsträgern bei, die in Streptomyces und Escherichia coli verwendet werden können. Die Fähigkeit der vorliegenden Vektoren, einen Pustelphenotyp oder eine Resistenz gegenüber Antibiotika zu verleihen, sorgt ferner für ein funktionelles Werkzeug zur Selektierung von Transformanten. Dies ist wichtig, weil in der Praxis die Notwendigkeit zur Bestimmung und Selektierung der besonderen Zellen besteht, die Vektor-

DNA aufgenommen haben. Zusätzliche DNA-Segmente, für deren Gegenwart es keine funktionellen Tests gibt,· können in die vorliegenden Vektoren ebenfalls inseriert werden, wobei sich dann durch Selektion mit einem geeigneten Antibiotikum oder einem anderen Phenotyp Transformanten

isolieren lassen, die die nichtselektierbare DNA enthalten. Solche nichtselektierbare DNA-Segmente können an jeder Stelle mit Ausnahme der Bereiche inseriert werden,

die für die Funktion und Replikation des Plasmids erforderlich sind, und hierzu gehören Gene, bei denen es sich um Antibiotikamodifikationsenzyme und Regulationsgene jeglicher Art handelt.

Ein nichtselektxerbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, kann vor allem in ein Plasmid, wie beispielsweise das Plasmid pJLi92, an der inneren BamHI-Restriktionsstelle des eine Resistenz verleihenden etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragments inseriert werden. Eine solche Insertion führt zu einer Inaktivierung des Gens für die Neomycinresistenz und ermöglicht so eine leichte Identifizierung von Streptomyces-Transformanten, die das rekombinierende Plasmid enthalten. Hierzu führt man zuerst eine Selektion bezüglich der M-Pustelmorphologie durch und identifiziert dann diejenigen M-Transformanten, die gegenüber Neomycin nicht resistent sind. In ähnlicher Weise führt eine Insertion eines DNA-Segments in das Plasmid pJL180 an beispielsweise der einmaligen Pstl-Restriktionsstelle zu einer Inaktivierung des Gens für die Ampicillinresistenz. Transformanten von Escherichia coli, die dieses rekombinierende Plasmid enthalten, lassen sich daher ebenfalls leicht identifizieren, indem man zuerst eine Selektion bezüglich einer Chloramphenicolresistenz durchführt und dann diejenigen chloramphenicolresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Ampicillin nicht resistent sind. Die Selektierbarkeit bezüglich einer Antibiotikumresistenz oder sonstiger phenotypischer Präger in Streptomyces und Escherichia

™ coli erlaubt daher eine saubere und wirkungsvolle Isolierung der äußerst seltenen Zellen, die die jeweils interessierende nichtselektierbare DNA enthalten.

Der oben beschriebene funktionelle Test bezüglich einer Antibiotikumresistenz kann auch zur Identifizierung von DNA-Segmenten verwendet werden, die als Steuerungselemente wirken und eine Expression eines individuellen Gens

für eine Antibiotikumresistenz lenken. Solche Segmente, zu denen unter anderem Promotoren, Abschwächer, Repressoren, Induktoren, ribosomale Bindestellen und dergleichen gehören, können zur Steuerung der Expression anderer Gene in Zellen von Streptomyces und Escherichia coli verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen, eine Antibiotikumresistenz verleihenden Vektoren eignen sich auch zur Sicherstellung, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszellen über eine Reihe von Generationen stabil gehalten werden. Diese Gene oder DNA-Fragmente, die kovalent an ein eine Antibiotikumresistenz übertragendes Fragment gebunden sind und in Streptomyces oder Escherichia coli propagiert werden, werden aufrechterhalten, indem man die Transformanten solchen Konzentrationen an Antibiotikum aussetzt, die für die nichttransformierten Zellen toxisch sind. Transformanten, die den Vektor und infolgedessen jegliche kovalent gebundene DNA verlieren, können daher nicht wachsen und werden aus der Kultur eliminiert. Die erfindungsgemäßen Vektoren lassen sich daher zur Aufrechterhaltung irgendeiner interessierenden DNA-Sequenz verwenden.

Die erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren und Transforraanten sorgen für die Klonierung von Genen unter Verbesserung der Ausbeuten an verschiedenen Produkten, die derzeit in Streptomyces und damit verwandten Zellen gebildet werden. Zu Beispielen für solche Produkte gehören unter anderem Streptomycin, Tylosin, Cephalosporine, Actaplanin, Narasin, Monensin,. Apramycin, Tobramycin, Erythromycin und dergleichen.- Die Erfindung sorgt weiter für selektierbare Vektoren, die geeignet sind für eine Klonierung, Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen, welche für kommerziell wichtige Proteine ko-^OJ dieren, wie beispielsweise für Humaninsulin, Humanproinsulin, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, GIucagon, Interferon und dergleichen, für enzymatische

Funktionen in metabolischen Reaktionen, die zu technisch wichtigen Verfahren und Verbindungen führen, oder für Steuerelemente zur Verbesserung einer Genexpression. Zu diesen gewünschten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme, welche eine Synthese von Antibiotikaderivaten katalysiert, wie beispielsweise Streptomycin-, Cephalosporin-, Tylosin-, Actaplanin-, Narasin-, Monensin-, Apramycin-j Tobramycin- und Erythromycinderivaten, oder für Enzyme kodiert, die eine Bioproduktion von Antibiotika oder sonstigen Produkten vermittelt oder verbessert.

Die Fähigkeit zur Insertion, Stabilisierung und Einschleusung der oben erwähnten DNA-Segmente in Streptomyces und Escherichia coli ermöglicht eine leichte rekombinierende genetische Manipulation unter Erhöhung der Ausbeute und Verfügbarkeit von Antibiotika, die durch Streptomyces erzeugt werden. Der Replikationsstartpunkt der Plasmide SCP2 oder SCP2* kodiert auch für eine niedrige Kopienzahl, so daß zusätzlich nahezu jede DNA-Seguenz unter Einschluß der Sequenzen, die letal sind, wenn sie aus einem eine hohe Kopienzahl ergebenden Plasmid ausgedrückt werden, ohne weiteres in die vorliegenden Vektoren kloniert und zwischen Streptomyces und Escherichia

coil hin- und hergeschleust werden kann. 25

Streptomyces coelicolor A3(2) und Streptomyces coelicolor M110 lassen sich jeweils als Quellen für die Plasmide SCP2 und SCP2* in einer Reihe von Wegen unter Verwendung irgendeines von mehreren verschiedenen Medien züchten.

zu Kohlenhydratquellen, die in einem Kulturmedium bevorzugt sind, gehören beispielsweise Melasse, Glucose, Dextrin und Glycerin, während zu Stickstoffquellen beispielsweise Sojamehl, Aminosäuregemische und Peptone gehören. Anorganische Nährsalze werden ebenfalls zugeführt, und hierzu gehören die üblichen Salze, die für Ionen von Natrium, Kalium, Ammoniak, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat und ähnlichem sorgen. Genau wie dies für das

Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, werden auch im vorliegenden Fall essentielle Spurenelemente zugesetzt. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich in Form von Verunreinigungen zugeführt, die in den zugesetzten anderen Bestandteilen des Mediums zufällig vorhanden sind.

Streptomyces coelicolor M110 oder Streptomyces coelicolor • A3(2) wächst unter aeroben Züchtungsbedingungen über einem verhältnismäßig breiten pH-^Bereich von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen, die von etwa 15 bis 40⁰C reichen. Zur Bildung der Plasmide SCP2 und SCP2* in höchster Kopienzahl geht man jedoch zweckmäßigerweise von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 7,2 aus und hält die Züchtungstemperatur bei etwa 30⁰C. Durch Züchtung von Streptomyces coelicolor M110 und Streptomyces coelicolor A3(2) unter den oben erwähnten Bedingungen gelangt man zu einem Zellvorrat, aus welchem sich die Plasmide SCP2 und SCP2* ohne weiteres unter Anwendung herkömmlicher Techniken isolieren lassen.

Ausführungsbeispiele;

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. Erforderlichenfalls werden darin sowohl Erläuterungen als auch tatsächliche Verfahren zum Aufbau der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1 30

Isolierung des Plasmids SCP2*

ι. A. Züchtung von Streptomyces coelicolor M110

Man stellt in herkömmlicher Weise ein vegetatives Inokulum von Streptomyces coelicolor M110 (NRRL 15041) her, indem man den Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilisierten Trypticase-Sojabrühe* bei einer

Konzentration von 35 g/l in deionisiertem Wasser wachsen läßt.

Das Inokulum aus der Trypticase-Sojabrühe wird 48 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C inkubiert. Die 50 ml Kultur wird dann homogenisiert, in 450 ml sterilisiertes YEMESG**- Medium übertragen und dann wenigstens 40 Stunden/ jedoch nicht mehr als 65 Stunden, bei 30⁰C inkubiert. Der pH-Wert wird nicht eingestellt. Nach Inkubation sind die Zellen von Streptomyces coelicolor M110 fertig zur Ernte und nachfolgenden Isolierung der Plasmid-DNA.

* Die Trypticase-Sojabrühe ist erhältlich von Difco

Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A. 15

** Das YEMESG enthält 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,3 % Malzextrakt, 1 % Dextrose, 34 % Saccharose, 0,1 % MgCl, und 0,1 % Glycin.

20 B. Isolierung des Plasmids

Etwa 10 g (Naßgewicht) an Zellen von Streptomyces coelicolor M110 werden durch Zentrifugieren (10 Minuten, 4⁰C, 10 000 UpM) geerntet und dann mit etwa 10 ml/g feuchter Zellen an TES-Puffer (0,01 Mol Tris(hydroxymethyl)aminoethan /Tris/, 0,001 Mol EDTA, 25 % Saccharose, pH 8) versetzt. Die Zellen werden zu einer Suspension verwirbelt, worauf man 10 ml/g Naßgewicht der Zellen an 0,25m EDTA vom pH 8 und dann 5 ml/g Naßgewicht der Zellen an Lyso-

™ zym (10 mg/ml in TES) zugibt. Nach Inkubieren des Gemisches bei 37⁰C über etwa 15 Minuten gibt man etwa 1,5 ml/g Naßgewicht der Zellen an 20 %-igem SDS zu (Natriumlaurylsulfat von BDH Chemicals Ltd. Poole, England). Man läßt das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur ste-

hen und versetzt es dann mit 5m NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 Mol NaCl. Nach erneutem Stehenlassen bei Raumtemperatur (15 Minuten) gibt man das Gemisch 2 Stunden auf Eis. Das Lysat wird abzentrifugiert (20 Minu-

. ten, 4⁰C, 17 500 UpM) und die überstehende Flüssigkeit zusammengefaßt und mit 0,64 Volumina Isopropylalkohol vermischt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugieren (15 Minuten, 4°C, 10 000 UpM) gesammelt. Der Niederschlag wird an der Luft getrocknet und dann in 1 ml TE-Puffer (0,01 Mol Tris, 0,001 Mol EDTA) pro g Naßzellen resuspendiert. Zur Reinigung wird die Plasmid-DNA hierauf unter Anwendung von Cäsiumchloridgradienten mit Propidiumiodid zentrifugiert (20 Stunden, 20⁰C, 50 000 UpM). Nach der Zentrifugation wird die Bande der gewünschten Plasmid-SCP2*-DNA entfernt und das Propidiumiodid in herkömmlicher Weise extrahiert. Die CsCl-DNA-Lösung wird bei -20⁰C aufbewahrt. Vor Verwendung wird die DNA entweder durch PD10-Säulenaustausch (Bio Rad) mit TE oder durch Dialyse gegen TE entsalzt. Die DNA wird durch herkömmliche Verfahren mit Ethanol ausgefällt und wieder in TE gelöst.

Beispiel 2 Konstruktion des Plasmids pLR1

A. Hindlll-Verdauung des Plasmids pIJ2

Man inkubiert etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid-pIJ2-DNA (Nature 286,525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym* (das 3 New England Bio Labs-Einheiten enthält) und 5 μΐ Reaktionsmischung** 2 Stunden bei 37⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igera Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung auf -20⁰C eingefroren.

* Die Restriktionsenzyme und anderen Enzyme sind von folgenden Firmen erhältlich:

1 New England Bio Labs., Inc. 32 Tozer Road Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

Boehringer-Mannheim Biochemicals

7941 Castleway Drive

Indianapolis, Indiana 46250, V.St.A.

Bethesda Research Laboratories (BRL)

Box 6010

Rockville, Maryland 20850, V.St.A.

Research Products

Miles Laboratories, Inc.

Elkhart, Indiana 465.15, V.St.A.

** Die Reaktionsmischung für das Hindlll-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:

15 600 mMol NaCl

100 mMol Tris-HCl, pH 7,9

70 mMol MgCl₂

10 mMol Dithiothreit

20 B. Hindlll-Verdauung des Plasmids pBR322

Man inkubiert etwa 8 μΐ (4 μg) Plasmid-pBR322-DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37°C. Nach Abbrechen der Reaktion durch 10 Minuten langes Inkubieren bei 60⁰C gibt man etwa 50 μΐ Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-iges Ethanol zu. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.

30 '..·'

C. . Verbindung der mit Hindlll verdauten Plasmide pIJ2 und pBR322

Man inkubiert etwa 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pIJ2 (von Beispiel 2A), 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pBR322 (von Beispiel 2B) , 5 μΐ BSA (.1 mg/ml) , 1 μΐ T4-DNA-Ligase* und 5 μΐ Verknüpfungsmischung**

4 Stunden bei 16⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol abgebrochen. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die suspendierte DNA stellt das gewünschte Plasmid pLR1 dar.

* Die T4-DNA-Ligase ist von folgender Firma erhältlich:

New England Bio Labs., Inc.

32 Tozer Rd.

Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

** Die Verknüpfungsmischung wird unter Verwendung fol- ** gender Zusammensetzung hergestellt:

500 mMol Tris-HCl, pH 7,8 200 mMoi Dithiothreit 100 mMol MgCl₂ 20 10 mMol ATP

Beispiel 3 Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR1

Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von Escherichia coli K12 HB101 (Gene 2, 75 bis 93 (1977)) werden durch Zentrifugation pelletisiert und dann^ in etwa 10 ml 0,01m Natriumchlorid suspendiert. Hierauf werden die Zellen

erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03m Calciumchlorid resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich abermals in 1,25 ml 0,03m Calciumchlorid suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende Transformation

35 leistungsfähig.

Das Plasmid pLR1 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird in Ethanol gefällt, in 150 μΐ 30-milli-

molarer CaIc iuinchlor idlösung suspendiert und in einem Teströhrchen mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia coli K12 HB101 leicht vermischt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42⁰C inkubiert. Hierauf gibt man etwa 3 ml L-Brühe (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) zu, die 50 ^g/ml Ampicillin enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann auf L-Agar (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) aufgezogen, der Ampicillin enthält. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp ,

ο Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia

coli K12 HB101/pLRi-Transformanten dar. 15

Beispiel 4

Konstruktion des Plasmids pLR4 20 A. Teil-BamHI-Verdauung des Plasmids pLR1

Man inkubiert etwa 10 μΐ (10 ng) des Plasmids pLR1, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI-Restriktionsenzym (mit Wasser auf 1:4 verdünnt) und 5 μΐ Reaktionsmischung*15 Minuten bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 20 μΐ Wasser suspendiert.

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:

35 1,5 Mol NaCl

60 mMol Tris-HCl, pH 7,9 60 mMol MgCl₂

-30-1 B. BamHI-Verdauung des Plasmids pBR322

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man BamHI-Restriktionsenzym und Reaktionsmischung anstelle von Hindlll-Restriktionsenzym und Reaktionsmischung verwendet. Das verdaute Plasmid pBR322 wird in 29 μΐ Wasser suspendiert.

10 C. Verknüpfung von mit BamHI teilverdautem Plasmid pLR1 und mit BamHI verdautem Plasmid pBR322

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt. Die erhaltene verknüpfte DNA wird in TE-Puffer suspendiert und stellt das gewünschte Plasmid pLR4 dar.

'.,-/;;:, Beispiel 5 >. ^v* 20 Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR4

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle des Plasmids pLRi für die Transformation das Plasmid pLR4 verwendet. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 HB101/pLR4-Transformanten dar.

30 Beispiel 6

Konstruktion der Plasmide pJL120 und ρJLI21

A. EcoRI-Verdauung des Plasmids SCP2* 35

Man inkubiert etwa 150 μΐ (5,7 μg) Plasmid-SCP2*-DNA, 1 ml Wasser, 2 μΐ EcoRI-Restriktionsenzym (mit einem Ge-

halt von 20 BRL-Einheiten) und 17 μΐ EcoRI-Reaktionsmischung* 2,5 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wird durch 15 Minuten lange Inkubation bei 65⁰C beendet. Das Reaktionsgemisch wird in üblicher Weise durch Agarosegelelektrophorese (AGE) analysiert/ um so den Endpunkt der Restriktion zu ermitteln. Die erhaltene restriktierte DNA wird bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

* Die Reaktionsmischung für das EcoRI-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:

500 mMol NaCl 1000 mMol Tris-HCl, pH 7,5 15 100 mMol MgCl₂

B. EcoRI-Verdauung des Plasmids pBR325

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids SCP2* hier jedoch das Plasmid pBR325 verwendet. Die erhaltene DNA wird bis zur späteren Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.

C. Verknüpfung der mit EcoRI verdauten Plasmide SCP2* und pBR325

Man inkubiert etwa 40 μΐ mit EcoRI verdautes Plasmid SCP2* (von Beispiel 6A), 10 ul mit EcoRI verdautes Plas_mid pBR325 (von Beispiel 6B), 10 μΐ MgCl₂ (0,1 Mol), 10 μΐ (NH₄J₂SO₄ (0,1 Mol), 10 μΐ ATP (2 mMol), 0,1 μΐ T4-DNA-Ligase und 20 μΐ Verknüpfungsmischung* 18 Stunden bei 4°C. Die Reaktion wird durch AGE analysiert, wodurch die gewünschte Verknüpfung bestätigt wird. Die suspendierte DNA stellt die gewünschten etwa 35,8 kb Plasmide pJLi20 und pJL121 dar.

Es entstehen rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das Plasmid pBR325 EcoRI-Fragment nach jeweils

. einer von zwei Richtungen orientiert sein kann. Man bestimmt die Restriktionsstellenpläne der beiden Plasmide pJLi20 und pJLi21 (nach Isolierung gemäß Beispiel 7), und diese gehen aus Figur 2 der Zeichnung hervor.

* Die Verknüpfungsmischung wird unter Verwendung

folgender Zusammensetzung hergestellt: 10

50 mMol Tris-HCl, pH 7,5 10 mMol ß-Mercaptoethanol

1 mMol EDTA 50 mg/ml BSA 15

Beispiel 7

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R,-M_k-/pJL120 und Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL121 *~

.20; : —— — - :;.

A. Herstellung von gefrorenem leistungsfähigem Escheiichia coli K12 C600R_k-M_k~

Man unterteilt frische Übernachtkulturen von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k- (Proc. Nat. Acad. Sei. 71, 1030 bis 1034 (1974)) mit frischer L-Brühe (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) in einem Verhältnis von 1:10 in Unterkulturen und läßt diese 1 Stunde bei 37°C wachsen. Es werden insgesamt 660 Klett-Einheiten an Zellen geerntet, mit 2,5 ml 100-millimolarem NaCl gewaschen, in 150-millimolarem CaCl₂ mit 10 % Glycerin suspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in 0,5 ml CaCl-- ^OD Glycerin resuspendiert, 3 bis 5 Minuten auf Eis gekühlt und eingefroren. Die Zellsuspensionen werden bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Konservierung und Aufbewahrung führen zu keiner Beeinträchtigung

der Lebensfähigkeit oder Häufigkeit einer Transformation durch kovalent geschlossene zirkuläre DNA.

B. Transformation 5

Die leistungsfähigen Zellen werden in einem Eisbad aufgetaut und in einem Verhältnis von 0,1 ml Zellen auf 0,05 ml DNA (10 ill der in Beispiel 6C beschriebenen Probe und 40 μΐ 0,1 XSSC (0,015 Mol NaCl, 0,0015 Mol Natriumzitrat vom pH 7) vermischt. Das Transformationsgemisch wird 20 Minuten auf Eis gekühlt, 1 Minute einem Wärmeschock von 42⁰C unterzogen und 10 Minuten auf Eis gekühlt. Die Proben werden dann mit 0,85 ml L-Brühe verdünnt, 1,5 Stunden bei 37⁰C inkubiert, auf L-Agar, der Ampicillin (50 ug/ml) und Tetracyclin (12,5 ug/ml) enthält, aufgetragen und 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert.

Die erhaltenen Kolonien werden selektiert und bezüglich

RRS des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet , Cm ) untersucht.

Sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL120 und Escherichia coli K12 C600-Rj-Mj-/pJLi21 dar. Die gegenüber Ampicillin und Tetracyclin resistenten Kolonien werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und AGE-Analyse hinsichtlich der *5 Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

Die identifizierten Transformanten verwendet man dann zur anschließenden Produktion und Isolierung der Plasmide

pJL120 und pJLi2i unter Anwendung bekannter Verfahren. 30

Beispiel 8 Konstruktion der Plasmide pJLi80 und pJL181

A. Sall-Verdauung des Plasmids SCP2* und Isolierung des etwa 6,0 kb Säll-Fragments

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6

beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung von Sall-Restriktionsenzymynd Reaktionsmischung* anstelle von EcoRI-Restriktionsenzym und Reaktionsmischung. Die Reaktion wird durch AGE untersucht, um ihren vollständigen Ablauf zu verifizieren, und durch 15 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet. Die erhaltenen SaIl-Restriktionsfragmente werden durch AGE abgetrennt und die abgetrennten Fragmente dann im Gel durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Sichtbarmachen der fluoreszierenden Banden mit einem Ultraviolettlicht lokalisiert. Das Gelfragment, welches das interessierende etwa 6,0 kb-Fragment enthält, wird aus dem Gel ausgeschnitten und in TBE-Puffer (1,6 % Sigma 7 bis 9 Puffer**, 0,093 % Na-EDTA, 0,55 % Borsäure) elektroeluiert. Das Gelfragment im TBE-Puffer wird in einen Dialyseschlauch gegeben und 1 Stunde bei 100 Volt einer Elektrophorese unterzogen. Die wässrige Lösung wird vom Dialyseschlauch gesammelt und durch eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule*** (0,5 ml Whatman DE52) geführt, die mit einem Äquilibrie-

20 rungspuffer (0,1 Mol KCl, 10 mMol Tris-HCl, pH 7,8)

äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 2,5 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen und die DNA (etwa 5 μg) mit 1,5 ml Elutionspuffer (1 Mol NaCl, 10 mMol Tris-HCl, pH 7,8) eluiert. Das Elüat wird.auf eine etwa 0,35m Konzentration an Na⁺-Ionen eingestellt, worauf man die DNA durch Zugabe von 2 Volumina (etwa 9 ml) an 100 %-igem Ethanol und anschließendes 16-stündiges Kühlen auf -20⁰C ausfällt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation pelletisiert, mit 75 %-igem Ethanol gewaschen, getrocknet

und in TE-Puffer gelöst. Diese herkömmliche Isolierungstechnik wird im folgenden als AGE/DE52/Elektroelution bezeichnet.

* Die Reaktionsmischung für das Sall-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt: -

1 1500 mMol NaCl

80 mMol Tris-HCl, pH 7,5 60 mMol MgCl₂ 2 mMol EDTA

** Der Sigma.7 bis 9 Puffer ist erhältlich von Sigma Chemical Company, P.O.Box 14508, St. Louis, Missouri 63178, V.St.A.

*** Die DEAE-Cellulose (DE52) ist erhältlich von Whatman Inc., 9 Bridewell Place, Clifton, New Jersey 07014, V.St.A.

B. Sall-Verdauung des Plasmids pBR325 15

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 8A beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch das Plasmid pBR325 verwendet und die Fragmente nicht durch präparative AGE/DE52/Elektroelution abtrennt. Die erhaltene DNA wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

C. Verknüpfung von mit Sail verdautem Plasmid pBR325 und etwa 6,0 kb Sall-Fragment des Plasmids SCP2*

Man vermischt etwa 1,5 ug des gemäß Beispiel 8A hergestellten 6,0 kb Sall-Fragments von SCP2* mit 0,5 μg des gemäß Beispiel 8B hergestellten, mit Sail verdauten pBR325. Das DNA-Gemisch wird durch übliche Fällung mit Ethanol ausgefällt und wieder in 3 μΐ destilliertem Wasser, 4 μΐ 0,66m ATP, 2 μΐ Ligase-Kinase-Mischung (0,25 Mol Tris'HCl, pH 7,8, 50 mMol .MgCl₂, 25 mMol Dithiothreit und 25 % Glycerin) sowie 1 μΐ T4-DNA-Ligase (1 Einheit) gelöst. Nach 1-stündiger Inkubation bei 15⁰C wird das Reaktionsgemisch mit 12 μΐ Wasser, 20 μΐ 0,66m ATP und 8 μΐ Ligase-Kinase-Mischung verdünnt und dann 18 Stunden bei 15⁰C inkubiert. Die erhaltene verknüpfte DNA wird

unter einem Verhältnis von 1:5 mit 0,1 XSSC verdünnt und stellt die gewünschten etwa 12,0 kb Plasmide pJLi80 und pJLi81 dar.

Es ergeben sich rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das Plasmid pBR325 Sall-Fragment nach jeweils einer von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne für die beiden Plasmide pJL180 und pJL181 gehen aus Figur 3 der Zeichnung hervor. 10

Beispiel 9

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL180 und Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJL181

15 : ^:

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der Plasmide pJL120 und pJL121 hier jedoch das Gemisch der Plasmid-pJLi80 und pJLi81-DNA (von Beispiel 8C) ver-

20 wendet. Die erhaltenen Transformantenkolonien werden

R selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp ,

SR Tet , Cm ) untersucht. Sie stellen die gewünschten

Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k~M_k-/pJL180 und Escherichia coli K12 C600R,-M_l,-/pJL181 dar. Die ge^z;> genüber Ampicillin und Chloramphenicol resistenten Kolonien werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und AGE-Analyse bezüglich der Plasmide identifiziert/ aus denen sie aufgebaut sind. Die identifizieren

ten Transformanten lassen sich dann für eine anschließende Produktion und Isolierung der Plasmide pJLi80 und pJLi81 nach bekannten Verfahren verwenden.

Beispiel 10 35

Konstruktion des Plasmids pJL125.

A. Sall-Verdauung des Plasmids pJLi21 und Isolierung des etwa 10,2 kb Sail-Fragments

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Reaktion vor Beendigung der Verdauung gestoppt wird und daß man anstelle des Plasmids SCP2* hier das Plasmid pJLi21 verwendet. Die erhaltenen Sall-Restriktionsfragmen te werden nicht durch präparative AGE abgetrennt sondem durch übliche Fällung mit Ethanol ausgefällt. Die Restrxktionsfragmente werden in TE-Puffer gelöst und sofort verknüpft.

B. Verknüpfung des etwa 10,2 kb Sail-Fragments des Plasmids pJL121

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung der Sall-Fragmente des Plasmids pJLi21 anstelle des SaII-Fragments der Plasmide SCP2* und pBR325. Die erhaltene verknüpfte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pJL125 und 12 anderen Plasmiden, deren anschließende Isolierung ergibt, daß sie weitere Sall-Restriktionsfragmente des Plasmids pJL121 enthalten. Das Plasmid pJL.125, das in herkömmlicher Weise isoliert wird und einen Replikationsstartpunkt vom Plasmid pBR325 und ferner den etwa 5,4 kb« Startpunkt des replikationshaltigen EcoRI-Sall-Fragments des Plasmids SCP2* enthält, wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt. Der Restriktionsstellenplan für das Plasmid pJL125 geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Der Restriktiorisstellenplan ist mit einem Plasmid aus transformiertem Escherichia coli K12 C600R_k-M, - bestimmt worden.

35 Beispiel 11

Konstruktion von*Escherichia coli K12 C600R.-M*-/pJL125

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt/ wobei anstelle der Plasmide pJL120 und pJL121 hier jedoch das Plasmid pJL125 verwendet wird. Die erhaltenen Kolonien werden selektiert R SS und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet , Cm ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJLi25 dar. Die Identität der Transformanten wird durch AGE-Analyse und Restriktionsanalyse unter Anwendung des in Plasmid 1,

(1978) und Plasmid 3, 88 (1980) beschriebenen Verfahrens weiter bestätigt. Die Transformanten werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, um sie schließlich zur Produktion und Isolierung des Plasmids pJL125 nach bekannten Verfahren zu verwenden.

15 ___

Beispiel 12 Konstruktion des Plasmids pJL190

A. EcoRI-Hindlll-Verdauung des Plasmids pJL121 und Isolierung des etwa 19,0 kb EcoRI-HindiII-Fragments

Man inkubiert etwa 200 μΐ (80 μg) Plasmid-pJL121-DNA, 30 μΐ BSA (1 mg/ml), 40 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym (das 200 BRL-Einheiten enthält) und 30 μΐ Hindlll-Reaktionsmischung* etwa 3 Stunden bei 37⁰C und dann 10 Minuten bei 65°C. Die 300 μΐ Reaktionsgemisch werden auf 4°C gekühlt und mit 110 μΐ 10Χ HindIII-*EcoRI-Verdünnungsreaktionsmischung** und 30 μΐ EcoRI-Restriktionsenzym (das 300 BRL-Einheiten enthält) ergänzt, worauf man sie zuerst 3 Stunden bei 37⁰C inkubiert, dann 10 Minuten bei 65⁰C inkubiert und schließlich auf 4⁰C kühlt. Das erhaltene etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Restriktionsfragment wird in herkömmlicher Weise durch AGE/DE52/Elektroelution isoliert.

Die gewünschte DNA wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

* Die Hindlll-Reaktionsmischung wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:

60 mMol Tris-HCl, pH 7,5 5 500 mMol NaCl 60 mMol MgCl₂

** Das Hindlll-VEcoRI-Verdünnungsmittel wird unter

Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt: 10

382 mMol Tris-HCl, pH 7,5 _t 50 mMol NaCl 22 mMol MgCl₂

B. EcoRI-Hindlll-Verdauung des Plasmids pLR4 und Isolierung des etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragments

Die gewünschte Verdauung und Isolierung führt man praktisch wie in Beispiel 12A beschrieben durch, wobei man abweichend davon anstelle des Plasmids pJL121 hier jedoch das Plasmid pLR4 verwendet. Das gewünschte etwa 7,7 kb-Fragment wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

C. Verknüpfung des etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Fragments des Plasmids pJLi21 mit dem etwa 7,7 kb EcoRI-Hind-III-Fragment des Plasmids pLR4

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des 6,0 kb Sail-Fragments des Plasmids SCP2* und des mit Sail verdauten Plasmids pBR325 hier jedoch das etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasraids pJL121 und das etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pLR4 verwendet. Die erhaltene verknüpfte DNA stellt das gewünschte Plasmid pJLi90 dar, das bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt wird. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funk-

tionsplan für das Plasmid pJL190 geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor. Der Restriktionsstellenplan ist an einem in Escherichia coli K12 C600R,-M, -transformierten Plasmid bestimmt worden.

Beispiel 13

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R_k-Mj-/pJL190

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der Plasmide pJL120 und pJLi21 hier jedoch das Plasmid pJL190 ver~ wendet. Die erhaltenen Kolonien werden selektiert und

R S

bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) und ihrer Größe in üblicher Weise (wie in Beispiel 11 beschrieben) untersucht. Sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~/pJLi90 dar. Die Transformanten werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, um daraus dann nach bekannten Verfahren das Plasmid pJL19Q zu bilden und zu isolieren.

Beispiel 14 ;

Isolierung_des Plasmids pJL192

Das Plasmid pJI.192, welches für eine hohe Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin (10 ug/ml) sorgt, kann in herkömmlicher Weise aus Escherichia coli K12 C600R,-M.-/pJL192 isoliert werden, nämlich aus einem in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegten Stammt der von dieser Hinterlegungsstelle unter der Nummer 15040 frei bezogen werden kann. Der Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL192 scheint nicht unterscheidbar zu sein vom in Figur 4 gezeigten Restriktionsstellenplan für das Plasmid pJL190.

-41-1 Beispiel 15

Konstruktion des Plasmids pJL195

A. EcoRI-Sall-Verdauung des Plasmids pJL125 und Isolierung des etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragments

Die gewünschte Verdauung und Isolierung führt man praktisch wie in Beispiel 12A beschrieben durch, wobei man abweichend davon hier jedoch das Plasmid pJL125 und das Sall-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung verwendet, und nicht das Plasmid pJL121 und das HindIII-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung. Zusätzlich verwendet man auch das SalI-»EcoRI-Verdünnungsmittel*.

Das erhaltene etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment wird in TE-Puffer gelöst und bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

* Das SalI-*EcoRI-Verdünnungsmittel wird unter Ver-Wendung folgender Zusammensetzung hergestellt:

940 mMol Tris-HCl, pH 7,5 55 mMol MgCl₂

25 B. EcoRI-Teil-Sall-Verdauung des Plasmids

pLR4 und Isolierung des etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragments

Die Sall-Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 12A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pJL121 hier jedoch das Plasmid-pLR4 verwendet. Da lediglich eine teilweise Sall-Verdauung gewünscht ist, inkubiert man das erhaltene Gemisch zuerst 15 Minuten bei 37°C und dann 10 Minuten bei 65°C. Nach Abkühlen auf 4^ec isoliert man das erhaltene Teil-Sall etwa 7,7 kb-Linearfragment in herkömmlicher Weise durch AGE/DE52/Elektroelution. Die gewünschte DNA wird in TE-Puffer gelöst und praktisch unter Anwendung des in Beispiel 6A beschrie-

T benen Verfahrens mit EcoRI-Restriktionsenzym verdaut, wobei man abweichend davon jedoch das obige Fragment verwendet, und nicht das Sall-Fragment von SCP2*. Das gewünschte etwa 7,5 kb EcoRI-Sall-Fragment (das größtmögliche EcoRI-Sall-Fragment) wird durch AGE/DE52/Elektroelution isoliert, in TE-Puffer gelöst und dann bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

C. Verknüpfung des etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragments des Plasmids pJL125 mit dem etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragment des Plasmids pLR4

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man hier das etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment des Plasmids pJL125 und das etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragment des Plasmids pLR4 verwendet, und nicht das etwa 6,0 kb Sall-Fragment des Plasmids SCP2* und das mit Sail verdaute Plasmid pBR325. Die erhaltene verknüpfte DNA stellt das gewünschte Plasmid pJLi95 dar und wird bis zum späteren Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt. Ein Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL195 geht aus Figur 5 der Zeichnung hervor. Der Restriktionsstellenplan ist mit einer Plas-

midisolierung aus Escherichia coli K.12 C600R, -M, - beoc KK

25 stimmt worden.

Beispiel 16

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R,-M_k-/pJL195

Die gewünschte. Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch das Plasmid pJL195 verwendet und nicht die Plasmide pJL120 und pJL121. Die erhaltenen Kolonien werden bezüglich des erwarteten Phenotype (Amp , Tet ) und ihrer Größe (wie in Beispiel 11 beschrieben) untersucht und stellen die gewünschten Escherichia coli K12 C600Rj-M,-/pJL195-Tränsförmanten dar. Die Transförmanten

werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, um hierauf unter Anwendung bekannter Verfahren das Plasmid pJLi95 zu produzieren und isolieren.

5 Beispiel 17

Konstruktion des Plasmids pJL114

A. BamHI-Teilverdauung des Plasmids SCP2

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6A beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch das Plasmid SCP2 (welches gemäß Beispiel 1 aus Streptomyces coelicolor A3(2) isoliert worden ist, nämlieh einem in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory hinterlegten Stamm, der von dort unter der Nummer 15042 frei bezogen werden kann) und das BamHI-Restriktionsenzym sowie die Reaktionsmischung* verwendet und nicht das Plasmid SCP2* und das EcoRI-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung. Die gewünschte DNA wird bis zum späteren Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:

1000 mMol Tris-HCl, pH 7,4

100 mMol MgCl₂ 30

B. Verknüpfung von mit BamHI verdautem Plasmid SCP2 mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pBR322

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Be ispiel 6C beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch das mit BamHI verdaute Plasmid SCP2 (hergestellt gemäß Beispiel 17A) und das mit BamHI ver-*

daute Plasmid pBR322 (hergestellt gemäß Beispiel 4B) verwendet, und nicht die Plasmide SCP2* und pBR325. Die erhaltene DNA wird bei 4⁰C aufbewahrt und stellt das gewünschte etwa 34,6 kb-Plasmid pJL114 dar.

·.' 5; ' '

Beispiel 18

Konstruktion von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-/pJLi

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch das Plasmid pJL114 und nicht die Plasmide pJL120 und pJL-121 verwendet. Die erhaltenen Kolonien werden selektiert

R S und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 C600Rj-M_k-/pJL114-Transformanten dar. Die ampicillin™ resistenten und tetracyclinsensitiven Kolonien werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert, gezüchtet _N und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzym- \ j 20 analyse und elektrophoretische Analyse mit Agarosegel / hinsichtlich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

Bei dieser Analyse ergibt sich, daß das BamHI-Restrlktionsenzym während der in Beispiel 17A beschriebenen Verdauung nur eine der Bglll-Restriktionsstellen von SCP2 geschnitten hat. Da es sich hierbei um ein seltenes Ereignis handelt, welches nicht mehr wiederholt worden ist, wurde Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pJL114 in der stän-3" digen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt, von der es unter der Nummer B-15039 frei beziehbar ist. Der Stamm ist als eine bevorzugte Quelle und als Grundvorrat für das Plasmid pJL114 verfügbar. Ein Restriktionsstellen-

plan für das Plasmid pJL114 geht aus Figur 5 der Zeichnung hervor.

' -45- 1 Beispiel 19

/ Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJL120

A. Wachsenlassen von Kulturen zur Herstellung von Protoplasten

Man stellt in herkömmlicher Weise ein vegetatives Inokulum her/ indem man den Stamm unter submersen Bedingungen 20 Stunden bei 30⁰C in TSB wachsen läßt, das mit 0,4 % Glycin ergänzt worden ist. Die Kultur wird homogenisiert und unter einer 1:20-Verdünnung in das gleiche Medium inokuliert und dann 18 Stunden bei 30⁰C wachsen gelassen.

15 B. Transformation

Unter Verwendung von etwa 20 ng Plasmid-pJL120-DNA und

9 1X10 Protoplasten von Streptomyces griseofuscus, nämlich einem in der ständigen Kulturen Sammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A. hinterlegten Stamm, von der er unter der Nummer ATCC 23916 frei beziehbar ist, wird die gewünschte Transformation praktisch wie im Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung PCT/BG79/00095) beschrieben durchgeführt.

jß. Selektion

Zur Untersuchung einer Transformation sogar bei niedrigen Häufigkeiten werden zwei Verfahren angewandt.

(1) Pustelversuch

Von den Regenerationsplatten, die ineinanderfließende Rasen an,regenerierten Protoplasten enthalten, werden Sporen wie folgt geerntet. Man versetzt die Platte mit etwa 10 ml sterilem destilliertem Wasser und kratzt die Oberfläche der Kultur zur Entfernung der Sporen mit einer

Schlaufe leicht ab. Die erhaltene Sporensuspension wird 10 Minuten bei 20 000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, und das zurückbleibende Sporenpellet resuspendiert man in 0,3 ml 20 %-igem (Volumen/ Volumen) Glycerin. Man macht ReihenVerdünnungen der Präparation bis hinab zu 10 durch aufeinanderfolgende Übertragung von 0,1 ml der Sporensuspension auf 0,9 ml 20 %-igem (Volumen/Volumen) Glycerin. Die Sporen werden dann bei -20⁰C aufbewahrt» wodurch sie nur wenig an Lebensfähigkeit verlieren. Mengen von etwa 0,1 ml von eini-

-1 -2 gen der Verdünnungsreihen (beispielsweise 10 , 10 ,

-4 10 ) aus jeder der abgeernteten Platten überträgt man dann auf mit R.-Medium (Molecular and General Genetics 162, 30 (1978)) versehene Platten, die eine solche Menge an Sporen des Stammes von Streptomyces griseofuscus enthalten, wie er ursprünglich beim Transformationsverfahren verwendet worden ist, daß ein ineinanderfließender Rasen gebildet wird. Dieses Verfahren kann auch unter Verwendung von YMX-Agar durchgeführt werden (0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Malzextrakt, 0,1 % Dextrose und 2 % Agar). Transformanten lassen sich im allgemeinen nach dreitägigem Wachsenlassen bei 30⁰C durch das Auftreten der sogenannten Pusteln feststellen, nämlich einem Gut, das von Sporen ausgedrückt wird, die das Plasmid in einer ausdrückbaren Form im Rasen enthalten. Die Transformanten werden gewonnen, indem man in herkömmlicher Weise vom Zentrum der Pustel Sporen entnimmt und auf eine mit YMX-Medium versehene Agarplatte gibt (Bacteriological Review, 31,

373 (1967)). 30

(2) Rücktransformation zu Escherichia coli K12 C600R.-M,-:

Die Sporen werden wie oben unter (1) beschrieben gesammelt, dann jedoch zur Beimpfung von 50 ml TSB verwendet, das mit 0,4 % Glycin ergänzt ist. Man läßt die Kultur 20 Stunden bei 30⁰C wachsen, worauf man die Zellen erntet und die DNA isoliert. Die Isolierung wird wie in Beispiel

1B beschrieben vorgenommen, wobei man abweichend davon die Zentrifugierung mit CsCl und Propidiumiodid jedoch wegläßt. Sodann verwendet man 50 μΐ dieser DNA zur Transformierung von Escherichia coli K12 C60OR^-M - nach dem in Beispiel 7B beschriebenen Verfahren. Die in den Transformanten befindlichen Plasmide werden in herkömmlicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben verifiziert und identifiziert.

10 Beispiel 20

Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJL114, Streptomyces griseof uscus/pJLI 21, Streptomyces griseofuscus/pJL·- 125» Streptomyces griseofuscus/pJLI80 und Streptomyces griseofuscus/pJLI81

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch unter Anwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrens einzeln durchgeführt, selektiert und gewonnen, wobei man abweichend davon für die jeweilige Konstruktion jedoch die Plasmide pJLi14, pJL121, pJL125, pJL180 und pJL181 verwendet, und nicht das Plasmid pJL120.

Beispiel 21 25

Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJL190

A. Transformation

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 19B beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pJL120 hier jedoch das Plasmid pJL190 verwendet.

35 B. Selektion

Die gewünschten Transformanten werden bezüglich ihrer Neomycinresistenz selektiert/ indem man die regenerieren-

den Protoplasten mit R₂-Mediumoberagar überschichtet, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 1 μg/ml ergibt. Die erhaltenen Streptomyces griseofuscus/pJL190-Transformanten werden dann bezüglich der erwarteten Pustelmorphologie praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2OB beschriebenen Verfahrens untersucht.

Beispiel 22 10

Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJLI95

Man führt die gewünschte Konstruktion, Selektierung und

Gewinnung praktisch wie in Beispiel 21 beschrieben durch,

wobei man anstelle des Plasitiids pJLi90 hier jedoch das Plasmid pJL195 verwendet.

Beispiel 23 20 Konstruktion von Streptomyces griseofuscus/pJLI92

Man führt die gewünschte Konstruktion, Selektierung und Gewinnung praktisch wie in Beispiel 22 beschrieben durch, wobei man hier jedoch das Plasmid pJLi92 und beim Selektionsverfahren einen Oberagar verwendet, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 10 ug/ml ergibt, und nicht das Plasmid pJL195 und einen Oberagar einsetzt, der so viel Neomycin enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzen-

30 tration von 1 μg/ml ergibt.

Beispiel 24

Konstruktion von Streptomyces fradiae/pJLi20, Streptomyces fradiae/pJL114, Streptomyces fradiae/pJL121, Strepto myces fradiae/pJL125, Streptomyces fradiae/pJL180, Streptomyces fradiae/pJL18i, Streptomyces fradiae/pJLi90, Streptomyces fradiae/pJLi95 und Streptomyces fradiae/pJL192

t Die gewünschten einzelnen Konstruktionen, Selektionen und Gewinnungen werden praktisch wiö in den⁷ Beispielen -^₁, 19, 20, 21, 22 und 23 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch Streptomyces fradiae anstelle von Streptomyces griseofuscus verwendet. Ferner wird auch das TSB-Medium zur Protoplastifizierung und zum Wachsenlassen von Streptomyces fradiae so abgewandelt, daß es lediglich 0,2 % Glycin enthält.

10 Beispiel 25

Konstruktion von Streptomyces lividans/pJL120, Streptomyces lividans/pJL114, Streptomyces lividans/pJL121, Streptomyces lividans/pJL125, Streptomyces lividans/pJL-180, Streptomyces lividans/pJLI81, Streptomyces lividans/ pJL190, Streptomyces lividans/pJLi95 und Streptomyces lividans/pJL192

Die gewünschten einzelnen Konstruktionen, Selektionen und Gewinnungen werden praktisch wie in den Beispielen 19, 20, 21, 22 und 23 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch Streptomyces lividans anstelle von Streptomyces griseofuscus verwendet. Ferner wird zur Protoplastifizierung und zum Wachsenlassen von Streptomyces lividans ein Medium verwendet, wie es in Beispiel 2 der internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (internationale Patentanmeldung PCT/BG79/00095) beschrieben ist.

30 Beispiel 26

Isolierung der Plasmidmutante pJL192, die eine hohe Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin verleiht

Man isoliert Streptomyces griseofuscus/pJLi90 wie in Beispiel 21 beschrieben. Eine Analyse der auf Nähragar, welcher mit verschiedenen Konzentrationen an Neomycin ergänzt worden ist, gewachsenen Kolonien zeigt, daß Strep-

tomyces griseofuscus/pJLi90 eine Resistenz aufweist gegenüber 1/0 μ9/ΐη1 Neomycin. Streptomyces griseofuscus wird in herkömmlicher Weise auf Nähragarplatten aufgetragen/ die mit 10 ug/ml Neomycin ergänzt sind. Hierbei läßt sich eine Kolonie entdecken, die das Wachstum bei dieser hohen Konzentration an Neomycin hemmt. Nach wiederholter Analyse ergibt sich, daß diese Kolonie die oben erwähnte Resistenz aufweist, und diese Kolonie wird als Streptomyces griseofuscus/pJL192 bezeichnet. Das Plasmit pJLi92 wird in Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~ durch Rücktransformation wie in Beispiel 19C beschrieben eingeschleust. Der Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL192 ist anscheinend nicht unterscheidbar vom Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL190.

Beispiel 27

Isolierung der Plasmidmutante pJL199, die eine hohe Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin verleiht 20

Die gewünschte Isolierung wird praktisch wie in Beispiel 26 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch Streptomyces griseofuscus/pJLi95 (hergestellt gemäß Beispiel 22) verwendet und nicht Streptomyces griseofuscus/pJL^O. Eine Kolonie, die eine hohe Resistenz gegenüber Neomycin aufweist, wird als Streptomyces griseofuscus/pJL199 bezeichnet. Das Plasmid pJL199 wird durch Rücktransformation wie in Beispiel 19C beschrieben in Escherichia coli K12 CöOOR^-M^- eingeschleust. Der

Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL199 scheint vom Restriktionsstellenplan des Plasmids pJL195 nicht unterscheidbar zu sein.

Es ist für den Fachmann ohne weiteres erkennbar, daß sich das Plasmid pJLi99 auch in herkömmlicher Weise konstruieren läßt, indem man das die Neomycinresistenz verleihende Fragment des Plasmids pJL192 (hergestellt nach den

Beispielen 15 und 27) anstelle des vom pLR4 abgeleiteten, Neomycinresistenz übertragenden Fragments des Plasmids pJL195 verwendet. Ein solcher Ersatz führt daher ebenfalls zum gewünschten Plasmid pJL199.

Beispiel 28

Konstruktion des Plasmids pLR2 10 A. HindiII-Verdauung des Plasmids pIJ6

Man inkubiert etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid-pIJ6-DNA (Nature 286, 525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym* (das 3 New England Bio Labs-Einheiten enthält) und 5 μΐ Reaktionsmischung** 2 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung bei -20⁰C eingefroren.

B. HindiII-Verdauung des Plasmids pBR322

Man inkubiert etwa 8 μΐ (4 μg) Plasmid-pBR322-DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ Hindlll-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37⁰C. Nach Beendigung der Reaktion durch 10 Minuten langes Inkubieren bei 60⁰C gibt man etwa 50 μΐ Ammoniumacetat und 200 μΐ

^ow 95 %-iges Ethanol zu. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.

C. Verknüpfung der mit Hindlll verdauten Plasmide pIJ6 und pBR322

Man inkubiert etwa 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pIJ6 (von Beispiel 2A), 20 μΐ mit Hindlll behandeltes

Plasmid pBR322 (von Beispiel 2B), 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 1 μΐ T4-DNA-Ligase* und 5 μΐ Verknüpfungsmischung** 4 Stunden bei 16°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4m Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die suspendierte DNA stellt das gewünschte Plasmid pLR2 dar.

10 Beispiel 29

Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR2

Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von Escherichia coli K12 HB101 (Gene 2, 75 bis 93 (1977)) werden durch Zentrifugation pelletisiert und dann in etwa 10 ml 0,01m Natriumchlorid suspendiert. Hierauf werden die Zellen erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03m Calciumchlorid resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich abermals in 1,25 m\ 0,03m Calciumchlorid suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende Transformation leistungsfähig.

Das Plasmid pLR2 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird in Ethanol gefällt, in 150 μΐ 30-millimolarer Calciumchloridlösung suspendiert und in einem Teströhrchen mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia coli K12 HB101 leicht vermischt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42°C inkubiert. Hierauf gibt man etwa 3 ml L-Brühe (J. Bacteriology 62, 293 (1951)) zu, die 50 μg/ml Ampicillin enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann auf L-Agar (Miller,

^J0 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York) aufgezogen, der Ampicillin enthält. Die überlebenden Kolonien werden

-53-

selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht. Sie stellen die gewünschten Escherichia coli K12 HB101/pLR2-Transformanten dar.

Beispiele für weitere Plasmide und Transformanten, die unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konstruiert werden können, gehen aus den folgenden Tabellen I und II hervor.

Ui

co

NJ

Cn

Tabelle I Repräsentative Plasmide

Beispiel	Name des	Ifogef ähre.Größe	Escherichia	Streptomyces-
Nr.	Plasmids	in kb	coli-Präger	Präger
30	pJL122	24,4	Anp , Tet	M
31	pJL123	27,8	ÄmpR, TetR	M
32 .	pJL124	21,1-24,2	Amp , Tet	H · .
33	pJL126	9,1-10,6	AmpR, TetR	M
34	pJL176	32,5	CmR,· TetR	P*

PJL1200

35,8

36	PJL1201	35,8
37'	PJL1202	24,4
38	PJL1203	27,8
39	pJL1204	21,1-24,2
40	PJL1205	10,2
41	PJL1206	9,1-10,6
42	PJL1706	32,5
43	PJL1716	22,5
44	PJL3176	22,5

Amp^R, Tet^R

p, Tet^R Amp^R, Tet^R Amp^R, Tet^R Atrp^R, Tet^R

Ainp^R, Tet^R Qn^R, Tet^R

Cm^R, Tet^R

, Tet

M M M M M M P

P P*

Konstruktion

Sstl-Auslöschung von pJL120 Bglll-Auslöschung von pJLi21 Pstl-Teilauslöschung von pJL120 Xorll-Teilauslöschung von pJL120

etwa 16,6 kb Pstl und fremdartiges etwa 10,0 kb Pstl von SCP2* in die Pstl-Stelle von pBR325

SCP2 EcoRI-Stelle in die pBR325 EcoRI-Stelle

Umgekehrte Orientierung von pJLi200 Sstl-Auslöschung von pJLi200 BgIII-Auslöschung von pJL1201 Pstl-Teilauslöschung pJLi200 Sall-Auslöschung von pJLi201 Xorll-Teilauslöschung von pJL1200

etwa 10,6 kb Pstl und fremdartiges etwa 10,0 kb Pstl von SCF2 in die Pstl-Stelle vohpBR325

etwa 16,6 kb Pstl von SCP2 in die Pstl-Stelle von pBR325

etwa 16,6 kb Pstl von SCP2* in die Pstl-Stelle von pBR325

co cn

ro cn

cn

Beispiel Nr.

45

Name des Plasmids

PJL1800

Ungefähre. Größe in Kb

12,6

46 .	pJL1801	12,6
47	PJL1900	25,9
48	OJL1902	25,9
49	PJL1905	12,1
50	pJL193	6/9
51	pJL196	12,1
52	pJL197	13,1

Tabelle I (Fortsetzung) Repräsentative Pläämide

Escherichia coli-Präger

, Cm^R

Streptonyces-•Präger

M, Neo^J

M, Neo^J

M, Neo^f

Thio*

M, Neo

Konstruktion

Neo^R,

Olid

etwa 6,0 kb Sail von SCP2 in die Sall-Stelle von pBR325

Utagekehrte Orientierung von pJL1800

etwa 19,0 kb EcoRI-HindlH von pJL1201 und etwa 7,7 kb EcoRI-HindlH von pLR4

etwa 19,0 kb EcoRI-HindlH von pJL1201 und etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll von pLR4

etwa 5,4 kb EcoRI-Sall von pJLi205 und etwa 7,5 kb EeoRI-Teil-Sall von pLR4

etwa 1,35 kb BamHE von pLR2 in BamHI von pBR328

etwa 5,4 kb EcoRI-Sall von pJL125 in etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall von pJL192

etwa 1 kb Bell von pJL193 in Teil-BaniHI von PJL196, derartige Orientierung, daß die CIaI-Stelle des etwa 1 kb Bcll-Eragments proximal zur Sall-Stelle des pBR322-Fragnents und daß die Sall-Stelle der etwa 1 kb Bcll-Stelle proximal zum Gen für die Neoirycinresistenz Uegt

Ui

ω ο

cn

»ο ο

Beispiel Name des Nr. Plasmids

PJL1907

PJL198

PHJL212

PHJL213

Ungefähre.Größe

inkb

13> 13,1 .13,9

13,9

Tabelle I (Fortsetzung) Repräsentative Plasmide

Escberichia coli-Präger

Amp^R Amp^R Amp^R

Strepfcomyces-Präger

M, Neo^R,

M, Neo^R,

M, Neo^R,

M, Neo^R,

Thio'

Thio*

Thio

Thio^J

Konstruktion

etwa 1 kb Bell von pJL193 in Teil-BamHI von pJI#1905

gleich wie pJL197 mit der Ausnahme, daß das Bcll-Fragment umgekehrt orientiert ist

etwa 1 kb Bcll-Fragment von pJL193 in das Teil-BamHI von pJL195, Orientierung und Insertion sind gleich wie bei pJL198

gleich wie pBJL212 mit der Ausnahme, daß S Orientierung und Insertion gleich sind · wie bei pJL197

Tabelle II Beispiele für Transformanten

1. Streptomyces R/pR , worin R für griseofuscus, ambofaciens, fradiae oder lividans steht und R unabhängig folgende Bedeutungen hat: pJLi22, pJL123, pJL124, pJL126, pJL176, pJLi200_f pJL1201, pJLi202, pJLi203, pJL1204, pJL1205, pJL1206, pJL1706, pJL1800, PJL1801, PJL1900, PJL1902, pJL1905, PJL196, pJL197_# PJL1907, PJL198, PHJL212 undpHJL213.

2. Escherichia coli K12 R²/pR¹, worin R² für C600R.-M,-, 294, C600 oder RV308 steht und R unabhängig obige

Bedeutungen hat.

Claims (18)

1. ErfindungsanSprüche;

   1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors, dadurch gekennzeichnet, daß man einen funktioneilen Startpunkt eines replikationshaltigen Restriktionsfragments der Plasmide SCP2 oder SCP2* mit ein oder mehr DNA-Sequenzen verbindet, die enthalten

   (a) ein Restriktionsfragment, das einen Replikationsstartpunkt von Escherichia coli enthält,

   (b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Escherichia coli transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist, für das eine Resistenz verliehen wird, und

   20 (c) ein oder mehr DNA-Segmente, die unabhängig eine

   Streptomyces tra-Funktion und/oder Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine Zelle von Streptomyces transformiert sind, die gegenüber dem Antibiotikum sensitiv ist,

   25 für welches eine Resistenz verliehen wird .
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Restriktion|fragment der Plasmide SCP2 oder SCP2* das etwa 5,4 kb EcpRI-Sail-Fragment, etwa 6,0 kb Sail-Fragment, etwa 19 kb EcoRI-Hindlll-Fragment oder etwa 31 kb EcoRI-Fragment verwendet.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Replikationsstartpunkt von Escherichia coli den pBR322-Replikationsstartpunkt, pBR324-Replikätionsstartpunkt, pBR325-Replikationsstartpunkt, pBR327-Replikationsstartpunkt oder pBR328-Replikationsstartpunkt verwendet.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein oder mehr DNA-Segmente, die für eine Resistenz in Escherichia coli sorgen, DNA-Segmente verwendet, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin,

   5 Chloramphenicol oder Tetracyclin verleihen.
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein oder mehr DNA-Segmente, die für eine Resistenz in Streptomyces sorgen, DNA-Segmente verwendet, die eine Resistenz gegenüber Neomycin oder Thiostrepton verleihen.
6. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als DNA-Segment, das eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, das etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL192, das etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Restriktionsfragment des Plasmids pLR4, das etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Restriktionsfragment des Plasmids pLR4, das etwa 1,35 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 oder das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 verwendet.
7. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Plasmide pJL180, pJLi81, pJL125, pJL190, pJL192, pJLi95, pJL199, pJL122, pJL123, PJL124, pJL126, pJL176, pJLi200, pJL1201, pJLi020, pJL1203, PJL1204, pJLi205, pJL1206, pJLi706, pJL1800, PJL1801, PJL1900, pJL1902, pJL1905, pJL193, pJL196, pJL-197, pJL198, pHJL212, pHJL213 oder pJLi907 herstellt.
8. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pJL120 und pJL121, dadurch gekennzeichnet, daß man die EcoRI-Verdauungsprodukte der Plas-

   ³⁵ mide SCP* und pBR325 verbindet.

   -6 ΟΙ 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pJL180 und pJL181, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 6,0 kb Sall-Verdauungsprodukt des Plasmids SCP* mit dem Sall-Verdauungsprodukt des Plasmids pBR325 verbindet.
9. 10. Verfahren nach Punkt 8 zur Herstellung des Plasmids pJL125, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Teil-Sall-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL121 einer Selbst-

   10 Verknüpfung unterzieht.
10. 11. Verfahren nach Punkt 8 zur Herstellung des Plasmids pJL190, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 19,0 kb EcoRI-Hindlll-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL121 mit dem etwa 7,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragment des Plasmids pLR4 verbindet.
11. 12. Verfahren nach Punkt 11 zur Isolierung des Plasmids pJL192, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Streptomyces, vorzugsweise Zellen der Species griseofuscus, die mit dem Plasmid pJL190 transformiert worden sind, bezüglich einer hohen Neomycinresistenz selektiert und untersucht und das Plasmid pJL192 aus den resistenten

    Zellen isoliert. 25
12. 13. Verfahren nach Punkt 10 zur Herstellung des Plasmids pJL195, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Fragment des Plasmids pJL125 mit dem etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Fragment des Plasmids pLR4

    30 verbindet.
13. 14. Verfahren nach Punkt 13 zur Isolierung des Plasmids pJLi99, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Streptomyces, vorzugsweise Zellen der Species griseofuscus, die mit dem Plasmid pJLi95 transformiert worden sind, bezüglich einer hohen Neomycinresistenz selektiert und untersucht und das Plasmid pJLi99 aus den resistenten Zellen isoliert.
14. 15. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung des Plasmids pJL114, dadurch gekennzeichnet, daß man das Teil-BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids SCP2 mit dem etwa 4,4 kb BamHI-Fragment des Plasmids pBR322

    5 verbindet.
15. 16. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung des Plasmids pJLi93, dadurch gekennzeichnet, daß man das BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pBR328 mit dem etwa 1,35 kb-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 verbindet.
16. 17. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung des Plasmids pJL196, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 7,5 kb EcoRI-Teil-Sall-Verdauungsprodukt
    des Plasmids pJL192 mit dem etwa 5,4 kb EcoRI-Sall-Restriktionsfragment des Plasmids pJL125 verbindet.
17. 18. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pJLi97 und pJL198, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 mit dem Teil-BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL196 verbindet.
18. 19. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 zur Herstellung der Plasmide pHJL212 und pHJL213, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 1 kb Bcll-Restriktionsfragment des Plasmids pJL193 mit dem Teil-BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pJL195 verbindet.