JPS58189198A - キメラクロ−ニングベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトマイセス属（ＳｔｒｅｐＬｏｍγ
ｃｅｓ）および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）で使用するキメ
ラ起源を含有している制限フラグメントおよび大腸菌に
おいて機能するプラスミドの、複製の機能的起源を含有
し抗生物質耐性を付与する制限フラグメントからなる選
択可能な新規組換型ＤＮＡクローニングベクターに関す
る。本発明はまた、上記ベクターの形質転換および該形
質転換体の検出ｔＥに関する。

本発明に係るベクターは小型で万能であり、ストレプト
マイセスまたは大腸菌において形質転換導入（ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍ）および選択が可能である点で特に有用であ
る。臨床的に重要な抗生物質の半数以上はストレプトマ
イセス株群によって生産されているので、この工業的に
重要なグループに適用し得るクローニング系およびベク
ターを開発することは望ましいことである。この様なベ
クターによって、既知の抗生物質の収量を増大させたり
、新規な抗生物質および抗生物質誘導体を生産する１」
的で、ストレプトマイセスに遺伝子をクローンすること
ができる。

本発明方法は、形質転換体の簡便な選択法を提供するも
のである。形質転換は非常に低い頻度で起るので、何百
万という細胞の中で、どの細胞がプラスミドＤＮＡを獲
得したかを調べる為の機能試験が実際上必要である。こ
のことは重要なことである。何故なら、非選択性のＤＮ
Ａ配列をこのベクターに挿入し、宿主を形質転換するこ
とによって該ベクターおよび問題としている特定のＤ　
ＮＡ配列を持った細胞を適当な表現型の選択法によって
単離することができるからである。

本明細書に用いた用語について以下に説明する。

プラスミドｐＬＲ１またはｐＬＲ４３，４ｋｂＢａｍ）
１１制限フラグメント−プラスミドｐｌＪ２に含まれる
同３．４　ｋ　ｂ　Ｂａｍｔｌ　Ｉ　　ネオマイシン耐
性付与フラグメント ＡＩＴＩＰＲ−アンピシリン耐性表現型Ａｍｐ　　−ア
ンピシリン感受性表現型１’ｅｔ　　−アトラサイクリ
ン耐性表現型’ｌ’ｅ　ｔ　　−アトラサイクリン感受
性表現型０杏　−クロラムフェニコール耐性表現型ＣＭ
Ｓ　　−クロラムフェニコール感受性表現型Ｎｅ誹−ネ
オマイシン耐性表現型 Ｎｅｏ　　−ネオマイシン感受性表現型１’ｈ　ｉ　ｏ
”Ｌ−チオストレプトン耐性表現型’Ｉ’ｈｉｏ５−チ
オストレプトン感受性表現型ＮＣ０ｋＮｅＯ５Ｔｈｉｏ
ｋおよび１”ｈｉｏは、本発明で使用したストレプトマ
イセスにおける結果だけを表わしている。また、Ａｍｐ
’、　Ａｍｐ　ｓ、　Ｔｅ　ｔ’、　Ｔｅ　ｔ　ｓ。

Ｃａｎ”およびＱｎ５は、本発明で使用した大腸菌にお
ける結果だけを表わしている。

本発明は、具体的には（ａ）プラスミド５ｃｐ２または
５ＣＰ２″の、複製の機能的起源を含有している制限フ
ラグメント、Φ）大腸菌複製起源を含有してぃる制限フ
ラグメント、（Ｃ）大腸菌の細胞に導入（ｔｒａ＋ｔｓ
　［ｏｍｖ）　　された時、少なくとも１種の抗生物質
に対する耐性を付与する１種もしくはそれ以上のＤＮＡ
セグメント（ただし該細胞は、耐性が付与されるその抗
生物質に対して感受性を有する）、および（ｄ）ストレ
プトマイセスの細胞に導入された時の少なくとも１種の
抗生物質耐性またはストレプトマイセス・トラ（ｔｒａ
）機能のいずれかまたは両者を独立して付与する１種ま
たはそれ以上のＤＮＡセグメント（ただし該細胞は、耐
性か付与されるその抗生物質に対して感受性を有する）
を含有してなる組換えＤＮＡクローニングベクターに関
するものである。

この組換［）　Ｎ　Ａクローニングベクターは、プラス
ミド５ｃｐ２またはｓｃｐ″の、複製の機能的起源含へ 有制限フラグメントと、（ａ）大腸菌複製起源を含有す
る制限フラグメント、（ｂ）大腸菌の細胞に導入した時
少なくとも１種の抗生物質に対する耐性を付与する１種
またはそれ以上のＬ）　Ｎ　ｉ〜上セグメントただし該
細胞は、耐性を付与される抗生物質に対して感受性を有
する〕、および（Ｃ）ストレプトマイセスの細胞に導入
された時、少なくとも１種の抗生物質に対する耐性また
はストレプトマイセス・トラ（ｔｒａ）機能のいずれか
または両者を独立して付与する１種またはそれ以上のＤ
ＮＡセグメント（ただし該細胞は、耐性を付与されるそ
の抗生物質に対し上窓受性を有する）からなる１種また
はそれ以上のＤＮＡ配列を結合（ｌｉｇａｔｉｎｇ）す
ることにより調製される。

本発明は更に、上記ベクターの形質転換体、および該形
質転換体の検出方法であって、（１）形質転換条件下で
ストレプトマイセス細胞と、（ａ）プラスミド５ＣＰ２
または５ＣＰ２”の複製起源およびＰ遺伝子含有制限フ
ラグメントおよび（ｂ）該Ｐ遺伝子のＥｃｏ　ＲＩ　制
限サイトにクローンされた非致死ＤＮＡ配列、を含有す
る組換えＤＮＡクローニングベクターを混合し、そ□し
て（２）指示ストレプトマイセス株のローン（ｉ　ａｗ
ｎ　）上で該ストレプトマイセス細胞を生育させ、Ｍポ
ック（会鰺命ｐｏｃｋ）表現型を示すコロニーを選択す
ることからなる、形質転換体の検出方法を提供するもの
である。

本発明に係るベクターは、プラスミドＳＣ；Ｐ２または
５ＣＰ２＊の、複製起源含有およびストレプトマイセス
・トラ（Ｅｒａ）機能付与制限フラグメントを、大腸菌
プラスミドの、大腸菌複製起源含有および抗生物質耐性
付与制限フラグメントに結合させることにより組み立て
るのが最も良い。複製起源を組み立てるためのプラスミ
ド５ＣＰ２および５ｃｐ２”はそれぞれ〜３１ｋｂであ
り、類似した制御（Ｆ／’　９−７ヲ示ｔ。）５７．　
ｉ　’ｒ’ｓＧ；”ｌｌ−ｊ’５：ｘ、　＝△ ド５ｃｐ２の偶発突然変異体として発生したものであり
、選択可能なコロニー・ポック形態を暗号化している。

このポックはプラスミド５ＣＰ２のものと区別し得るが
、その他の点ではプラスミド５ＣＰ２と５ＣＰ２°は実
質的に同じである。

本明細−書では、プラスミドＳＣ，Ｐ２およびＳ　ＣＰ
　２’ｌ”の複製起源およびストレプトマイセス・トラ
機能はそれらのそれぞれ〜５．４ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ−
５ａｌ　Ｉ　　制限フラグメント内にあると教示してい
るので、多種多様の複製起源含有およびストレプトマイ
セス・トラ機能付与フラグメントを作成し得る。これは
、この〜５，４　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ−５ａｌ　Ｉ領域
の外側を切断スル制限酵素で消化することにより達成さ
れる。プラスミド５ｅｐ２″（従ってまたプラスミド５
ＣＰ２）の詳細な制限部位〔サイト〕地図を第１図に示
した。

プラスミド５ＣＰ２および５ＣＰ２”は、Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａＬｏｒｙ　、　Ｐｅｒｉａ　、　１ｌｌｉｎｏｉｓに
寄託され、パーマネント・ストック・カルチャー・コレ
クションの一部となっているそれぞれＳｔｒｅｐｔｃｍ
ｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）および
５ｔｒｅｐｃａｎｙｃｅｓｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　Ｍ
Ｉ　ＩＱ　株から常法により単離することができる。Ｓ
ｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌ　ｏｒ　
Ａ　３　（２）は、寄託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎ
ａｒｒｂｅｒ）　１５０４２で、プラスミド５ｃｐ２の
好ましいソース（供給源）および貯蔵体として、誰でも
利用することができる。Ｓ　ｔ　ｒｅｐＬ（２）ｙｃｅ
ｓｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　Ｍｌ　ｌ　Ｑは、寄託番号
１５０４１で、プラスミド５ｃｐ２ｘの好ましいソース
および貯蔵体として、誰でも利用することができる。

プラスミド５ＣＰ２および５ｃｐ２’の、多数の、トラ
機能付与および複製起源含有制限フラグメントを組み立
てることができる。具体的な例を例示すると、プラスミ
ドＳＣ，Ｐ２”の〜５，４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−３ａｌ　
Ｉ　、　〜１３．Ｑｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　、　〜１９ｋｂ
　Ｅｃｏ　ＲＩ−１１ｉｎｄ■および〜３１　ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ制限フラグメント、およびプラスミド５ｃｐ２
の〜３１ｋｂＢｇｌＩＩ制限フラグメントなどが挙けら
れる。上記プラスミドＳＣ，Ｐ２Ｍおよび５ＧＰ２フラ
グメントをそれぞれ、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２５お
よびｐＢＲ３２２の、複製起源含有および抗生物質耐性
付与フラグメントに結合させた。必須ではないが、大腸
菌において抗生物質耐性を付与するＤＮＡセグメントと
大腸菌複製起源の両者が、同じ大腸菌プラスミドの制限
フラグメントからなるのが好都合である事は当業者には
容易に理解されよう。

例えば、プラスミド５ｃｐ２’Ｘの〜３　ｌ　ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２５の〜５
ｋｂＥｃ。

Ｒ１フラグメントを結合すると、代表的なプラスミドｐ
ＪＬ１２０およびＰＪＬ１２１が簡単に、そして容易に
得られる。このフラグメントはどちらの方向でも結合す
ることができるので、２方向（配向）の組換プラスミド
か生成する。同様にして５ｃｐ２＊〜５．Ｑ　ｋｂ　Ｓ
ａｌ　Ｉ　７ラグメントとｐＢＲ３２５の〜６ｋｂＳａ
ｌｌフラグメントを結合させると代表的なプラスミドｐ
ＪＬ１ｓｏおよびｐＪＬ１８１が、５ｃｐ２≠〜５，４
ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−５ａＩＩフラグメントとｐＢＲ３２
５の〜４．８　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−５ａｌ　１７ラグメ
ントの結合により代表的プラスミドＰＪＬ１２５か、そ
してｓｃｐ２ＢａｍＨＩ　消化物とプラスミドＰＦ５Ｒ
３２２（７）　〜４．４ｋ　ｂ　Ｂａｍ　ｔＨフラグメ
ントの結合により代表的プラスミドＰＪＬ１１４　がそ
れぞれ得られる。

上記ベクターは全て、大腸菌およびストレプトマイセス
のいずれにおいても容易に選択することができる。例え
ば大腸菌において、プラスミドＰＪＬ１２０　およびｐ
ＪＬ１２１　はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性を付与し、プラスミドＰＪＬ１８０　およびｐＪＬ１
８１　はアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性
を付与し、そしてプラスミドｐＪＬ１２５　およびＰＪ
Ｌ１１４　はアンピアリン耐性だけを付与する。従って
、常法により、培養培地に適当な抗生物質を添加するこ
とによって、大腸菌宿主系でこのベクターを選択するこ
とができる、 上記ベクターはまた、「ポックＪ　（ｐｏｃｋ）表現型
をつくるので、ストレプトマイセスにおいて常法により
選択することができる。この「ポック」表現型は、スト
レプトマイセスの性的因子のトラ機能〔トラ〔【ｒａ）
　＝性的伝達能（ｓｅｘｕａｌ　ｔｒａｎｓｍｉ　−５
ｓａｂｉｌ　１ｃｙ）を暗号化している遺伝子〕および
致死接合（ｌｅｔｈａｌ　ｚｙｇｏｓｉｓ）と関連のあ
るアッセイ（効力検定）可能な形質であり、既知の現象
である（ＢｉｂｂおよびＨｏｐｗｏｏｄ　、　Ｊ　、Ｇ
ｅｎ　１Ｍｉ　ｃｒｏｂ　ｉｏｌ　、　１２６　：４２
７　＋１９８１）。適切な指示味にプレー１−　（ｐｌ
ａｔすした時の３種の異なった「ポック」形態は、プラ
スミド５ＣＰ２．５ａｐ２葉および５ｃｐ２と５ＣＰ２
＊の誘導体の形質転換体と関係している。本明細鉦に於
いて、野生型の５ｃｐ２および突然変異株５ｅｐ２″の
ものと確認されたコロニー形態をそれぞれＰおよびＰ　
と呼ぶ。第３の、そして従来知られていないポック形態
は、５ａｐ２または５ｃｐ２ｘのＥＣ０Ｒ１制限サイト
にクローンした時に生じる。この様な挿入によってＰ遺
伝子か不活性化され、形質転換体を適当にプレートした
時、意外にも、形態学的に区別し得るミニポック表現型
（本明細書においてはＭと呼ぶ）が現れる。この「ミニ
ポック」は、５ｃｐ２または５ＣＰ２′のいずれかにょ
るポックよりも明らかに小さい寸法のポックである。

従ってまた、本発明は、（１）形質転換条件下でストレ
プトマイセス細胞と、（ａ）プラスミド５ｅｐ２または
５ｃｐ２ｘの、複製起源およびＰ遺伝子含有制限フラグ
メントおよび（ｂ）該Ｐ遺伝子のＥｃｏＲＩ制限サイト
にクローンされた非致死ＤＮＡ配列を含有する組換えＤ
ＮＡクローニングベクターとを混合し、そして（２）指
示ストレプトマイセス株のローン（ｌ　ａｗｎ　）上で
該ストレプトマイセス細胞を生育させ、Ｍポック表現型
を示すコロニーを選択することからなる新規な形質転換
体の検出法を提供するものである。

形質転換されたストレプトマイセス細胞だけがＭポック
表現型を示すので、形質転換体を容易に同定、選択する
ことができる。本発明に係るｐＪＩ−ベクタ一群につい
ての上記の記載がら、プラスミドＰＪＬ１２０　、ＰＪ
Ｌ１２１　　およびＰＪＬ１２５　はＭ表現型を暗号化
しており、プラスミドＰＪＬ１８０およびＰＪＬ１８１
　はＰ′表現型を暗号化しており、プラスミドＰＪＬ１
１４　は１表現型を暗号化していることは、当業者には
容易に理解されるであろう。

ポック表現型の発現のための適切な指示株は知られてお
り、これには後記の実施例に例示する各種の５ｃｐ２−
および５ＣＰ２Ｘ−株が含まれる。この様に、本発明に
係るベクターは選択可能であり、ストレプトマイセスに
おいて極めて有用である。

上記のプラスミドにはまた、ストレプトマイセスに於い
て抗生物質耐性を付与するＤＮＡセグメントを付与する
ことができる。例示のため、具体的にｐＪＬ１９０　お
よびｐＪＬ１９５で代表されるこの様な誘導体は更にも
う１つの選択可能な表現型を発現する。プラスミドｐＪ
Ｌ１９０　は、プラスミドｐＬＲ４のネオマイシン耐性
を付与する〜７，７ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　Ｉ［フ
ラグメントを、プラスミドＰＪＬ１２１　の〜ｌ　９ｋ
ｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ｍ７５　クメ７トに結合す
ることによって組み立てられる。プラスミドｐＪＬ１９
５　は、ｐＬＲ４の〜７，５ｓｃｂ　ＥｃｏＲＩ　一部
分的Ｓａｌ　ＩフラグメントをプラスミドｐＪＬ１２５
（７）〜５．４ｋｂＥｃｏＲＩ−５ａｌ　Ｉ　　７ラグ
メントに結合させることによって組み立てられる。この
ＰＪＬ１２５プラスミドは、プラスミドｐｓｃＰ２’の
最も大きイ（５，４ｋｂ）ＥｃｏＲｌ−５ａｔ　Ｉフラ
グメントを含んでおり、プラスミドｐＪＬ１２１のＳａ
ｌ　ｌ除去によって組み立てられる。代表的なプラスミ
ドｐ　Ｊ　Ｌ　１９０およびＰＪＬ１９５　は、ネオマ
イシン耐性の他に、上記のＭ表現型をも発現する。

ネオマイシン耐性付与フラグメントの供給源であるプラ
込ミドｐＬＲ４は、〜７．７ｋｂであり、ＢａｍＨＩ処
理したプラスミド、ｐＢλ３２２とｐＬＲｌ　　の結合
によって組み立てられる。プラスミドｐＬＲ１は〜１４
．８ｋｂ　であり、ＨｉｎｄＩＩ処理シタフラスミドｐ
　Ｉ　Ｊ　２（１’ｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　
、　２８６：５２５＋１９８０）をＨｉｎｄＩ［Ｉで処
理したプラスミドルＢ即２２に結合させて組み立てられ
る。当業者には容易に理解されるであろうが、プラスミ
ドｐＬＲ４およびｐＬＲｌはいずれも同じネオマイシン
耐性遺伝子を含んでおり、従っていずれも上記のｐＪＬ
　　ネオマイシン耐性ベクターの組み立てに使用するこ
とができる。

ｐＪＬ１９２　と命名されたもう１つのネオマイシン耐
性付与プラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒ
ｉ　−５ｅｏｆｕｓｕｓに含まれているプラスミドｐＪ
Ｌ１ｃ＋ｃＸＤ△ 突然変異株として単離された。プラスミドＰ　Ｊ　Ｌ１
９２は高濃度のネオマイシンに対して耐性を示し、従っ
てプラスミドＰＪＬ１９０　、ｐＪＬ１９５　、ｐｌＪ
２、ｐＬＲ４およびｐＬＲｌに含まれる耐性遺伝子と区
別し得る新規なネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる。

同様に、ＰＪＬ１９９　　と命名されたもう１つのネオ
マイシン耐性付与プラスミドは、プラスミドｐ　Ｊ　ｌ
−１９５の突然変異株として単離された。当業者には明
らかであろうが、プラスミドｐＪＬ１９２またはｐＪＬ
１９９のこの新規なネオマイシン耐性遺伝子は、簡単に
切り取り、他のベクターと結合させることができる。こ
の遺伝子によって、改善された、より効率的な形質転換
体の選択を行なうことができる。プラスミドｐＪＬ１９
０　およびｐＪＬ１９５　の場合と同味、プラスミドＰ
ＪＬ１９２　およびＰＪＬ１９９の形質転換体は、適当
な指示株にプレートされた時、Ｍ表現型を発現する。

プラスミドｐＪＬ１９２　は、＋４ｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　、　Ｐｅｏｌ　ｉａ　、　ＩＩＩ　１ｎｏｉｓ　　に
寄託さし、ハーマネント・ストック・カルチャー・コレ
クションの１部となっているＥ　、　ｃｏｌ　ｉ　ｋ１
２　ｃ６ｏ。

Ｒｋ　　Ｍｋ　／ｐＪＬ１９２　から常法に従って単離
することができる。これは、寄託番号Ｂ−１５０４０で
、プラスミドＰＪＬ１９２　の好ましいソースお−よび
貯蔵体として、誰でも利用することができる。

フラスミｔ’　ＰＬＲ２（７）〜１．３５ｋｂ　Ｂａｍ
ＨＩ制限フラグメントで例示される抗生物質チオストレ
プトンに対する耐性を付与するＤＮＡセグメントも、ネ
オマイシン耐性付与セグメントの代りに、あるいはそれ
と共に、使用することができる。このチオストレプトン
耐性付与フラグメントの供給源であるプラスミドＰＬＲ
２は〜１８．７ｋｂ　てあり、Ｈｉｎｄｕで処理したプ
ラスミドｐ　ｌ　Ｊ　５　（ＩｈｃｎｐｓｏｎらＮａ　
ｔｕｒｅ、２８６：５２５．１９８０ＪをＨｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ処理プラスミドＰＢＲ３２２に結合することによっ
て組み立てられる。プラスミドＰＬＲ２は大腸菌におい
て機能し、従って増幅させて容易に単離し、そ、の後の
操作に使用することができる。

簡梗のため、そして容易な組み立てのため、プラスミド
ＰＬＲ２のチオストレプトン耐性付与〜１．３５ｋｂ　
ＢａｍＨＩ　７ラグメントをプラスミドＰＢＲ３２８の
Ｂａｍ１−１１制限サイトに結合させ、プラスミドｐＪ
Ｌ１９旺つくった。ＰＪＬ１９３（７）　〜１ｋｂＢｃ
ｌ　Ｉ制限フラグメントはチオストレプトン耐性付与り
　Ｎ　Ａセグメントを含んでいる。従って、実施例５２
〜５６に記載した様に、結合（リゲーション）によって
本発明の範囲に包含されるベクターが得られる。

各種のプラスミド５ＣＰ２および５ｅｐ２ｘ制限フラグ
メントが、それぞれその〜５，４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−
５ａｌ　Ｉ制限フラグメントに含まれた複製起源を有す
る限り、本発明を実施する目的に使用することができる
。この様なその他のプラスミド５ｅｐ２および５ｅｐ２
　　制限フラグメントには、〜６ｋｂＳａｌ■、〜１５
ｋｂＰｓｔＩ、〜２３ｋｂＢｇｌ　ＩＩ、〜１５ｋｂＢ
ＪＴＩＩＩＩ　、　〜ｌ　４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ
　ｔ　Ｉ　、　〜１３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌ、
および〜ｌ　５　ｋｂ　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ　
７ラグメントが含まれる。これらの７ラグメントはスト
レプトマイセス・トラ（ｔｒａ）機能を含んでおり、大
腸菌プラスミドの、機能的な大腸菌複製起源含有および
抗生物質耐性付与制限フラグメントに結合させることが
できる。この様な大腸菌プラスミドには、例えばプラス
ミドＰＢＲ３２２、ＰＢＲ３２４、ｐＢＲ３２５、ｐＢ
Ｒ３２７、ｐ　ＢＲ３２８などか含まれる。

従って本発明は、いくつかのｐＪＬ組み立てに於いて例
示したプラスミドｐＢＲ３２２またはｐＢＲ３２５を使
用することに限定されるものではない。

本明細書で例示したネオマイシンおよびチオストレプト
ン抗生物質耐性付与１）　Ｎ　Ａセグメントは、それぞ
れプラスミドｐＬＲ４の〜７．７　ｋ　ｂ　Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉ　−Ｈｌｎｄｎ［フラグメント並びに〜７，５ｋｂ　
ＥｃｏＲＩ一部分的５ａｌ１７ラグメント、およびＰＬ
Ｒ２〜１．３５８ａｍＩ（Ｉ　７ラグメント並びにＰＪ
’１９３〜１ｋｂ　ＢｃｌＩフラグメントであるが、当
業者であればネオマイシンまたはチオストレプトンに対
する耐性を付与するその池のＤＮＡセグメントを組み立
て、使用することができる。プラスミドｐＬＲ１のその
他のネオマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントには、例え
ば〜３．４　ｋ　ｂ　Ｂ　ａｍ　ＨＩ制限フラグメント
１．．３，５ｋｂＰｓｔｌ制限フラグメント、および〜
３．４　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントの５ｓｔＩ
−Ｋｐｎｌサブフラグメントの大きい方などが含まれる
。他のチオストレプトン耐性付与セグメントとしては、
例えばプラスミドＰＬＲ２の〜１３ｋｂＰｓｔｌ　　フ
ラグメントが挙げられる。上記と同じ、あるいは別の抗
生物質、例エバハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃ　
ｉｎ）　、ビアマイシン（ｖｉａｍｙｃｉｎ）、タイロ
シア　（ｔｙｌｏｓｉｎ）、エリスロマイシンなどに対
する耐性を付与するその他のＤＮＡセグメントも、組み
立て、使用することができる。更に、上記の抗生物質耐
性付与ＤＮＡフラグメントから、遺伝暗号に従ってヌク
レオチドの添加、削除または置換を行なうことによって
、その種々の誘導体を組み立てることもてきる。

上記の誘導体またはその他の抗生物質耐性付与１）　Ｎ
　Ａセグメントを、大腸菌抗生物質耐性付与ＤＮＡセグ
メント、大腸菌複製起源含有制限フラグメントおよびプ
ラスミド５ＣＰ２または５ｅｐ２°の複製起源含有制限
フラグメントを含有するベクターと結合させることによ
り、本発明の範囲に包含されるプラスミドが得られる。

従って、ストレプトマイセス・トラ（ｔｒａ）機能およ
びそれに関係するポック表現型の代りに抗生物質耐性付
与１）　Ｎ　Ａセグメントを選択マーカーとして使用す
ることかできる。即ち、本発明に係るベクターは、トラ
（ｔｒａ）の単独使用またはそれと抗生物質耐性付与Ｄ
ＮＡセグメントとの併用に限定されるものではない。更
に、特定の抗生物質耐性付与１）ＮＡ上セグメント、本
発明のキメラプラスミド（ｃｌｌｉｍｅｒｉｃｐｌａｓ
ｍｉｄｓ）の唯一の位置に限定されるものではなく、複
製起源またはその他の重要なプラスミド支配の生理学的
機能が破壊されない限り、種々の位置（サイト）に挿入
、結合させることができる。特定のＤＮＡセグメントを
どこに挿入し、結合させるのが都合が良いかは、当業者
であれば容易に決定することができるはすである。

本発明に係るベクターを構成するプラスミド５ｃｐ２．
５ｃｐ２凶、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２２などの鍾々の
制限フラグメント、および種々の抗生物質耐性付与ＤＮ
Ａセグメントは、結合を促進させるために改変すること
ができる。例えば上記ＤＮＡフラグメントのあるものに
、あるいは全てに、分子リンカ−を備えさせることがで
きる。即ち、その後の結合のための特異部位（サイト〕
を組み立てることができる。さらに、複製起源含有制限
フラグメントは、ある種のヌクレオチドを付加、削除あ
るいは置換することにより改変してその特性を変えるこ
とができ、ＤＮＡ結合のための種々の制限サイトを備え
させることができる。当業者はヌクレオチド化学および
遺伝暗号に精通しており、従ってどのヌクレオチドが交
換可能であり、特定の目的にはどの様なりＮＡの改変が
望ましいかを理解している。

５ＣＰ２または５ＣＰ２Ｘストレプトマイセス・トラ（
Ｅｒａ）機能を含有する組換１）　Ｎ　Ａクローニング
ベクターは、自己伝達能（ｓｅｌｆ　ｔｒａｎｓｍｉｓ
ｓａｂｌｅ）を有し、従って、形質転換されたストレプ
トマイセス群と形質転換されなかったストレプトマイセ
ス群との交配中に、容易に転移する。このことは好都合
である。というのは、それ故に本発明に係る／ベクター
は、プロトプラスト形質転換だけでなく、通常の遺伝交
雑（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｒｏｓｓｅｓ）によっても導入
することができるからである。従って、本ベクターはプ
ロトプラスト化するのか困難なストレプトマイセス株に
おいて有用であり、この様にして、遺伝子操作およびＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行い得る宿主の数が非常に増加
するのである。

もつと重要なことは、本発明のベクターに組みたてられ
たＤＮＡライブラリーは、通常のレプリカ・プレート交
配法によって、必要な遺伝子を素早く、簡単にスクリー
ニングできるということである。トラ（ｔｒａＪ機能か
なければ、ライブラリーの数千のコロニーのそれぞれか
らＤＮＡを単離し適当な株に導入し、所望の遺伝子を含
有しているクローンを同定しなければならない。ストレ
プトマイセスに於いて使用するための、広範囲に利用で
きるファージベクターがないので、本発明のトラ（ｔｒ
ａ）ベクターは、大腸菌における遺伝子ライブラリーを
スクリーニングするためのレプリカ・プレート形質導入
法におけるバクテリオファージλと同様、一般的なりロ
ーニングおよびスクリーニングの役割を果たすことにな
る。従って、所望の遺伝子はレプリカ・プレート交配法
によって容易に同定することができ、実施例２０Ｇに記
載した様に大腸菌に入れる（シャｌ−Ｊぺ　ｓｈｕｔｔ
ｌｉｎｇ）ことによって簡単に増幅させることかできる
。

本発明に係るベクターは広範囲に利用でき、多くのスト
レプトマイセス群の宿主細胞、特にアミノグリコシド、
マクロライド、β−ラクタム、ポリエーテルおよびグリ
コペプチド抗生物質などの抗生物質類を生産する経済的
に重要な分類群の無制限味（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌ
ｅｓｓ　５ｔｒａｉｎｓ）に導入する。ことができる。

この様な無制限味は、よく知られている常法（−ｖｓｋ
ａｙａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ五
ｅｗｓ　。

４４：２０６．１９８０）によって、ストレプトマイで
ス群から容易に選択、単離される。無制限味の宿主細胞
は制限酵素を欠失しており、従って形質転換に際してプ
ラスミドＤＮＡを切断したり分解したりすることがない
。本発明においては、本発明に係るベクターの制限サイ
トのいずれをも切断吏ることのない制限酵素を含む宿主
細胞も、無制限味とみなす。

アミノグリコンド抗生物質を産生じ、本発明のベクター
を使用、導入するのに特に有用なストレプトマイセス群
の無制限味の好ましい宿主細胞は、例えばＳ、ｋａｎａ
ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　（カナマイシン）、Ｓ、（ｈｒｅ
−ｓｔｃｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（アミノシジン）、Ｓ、ｇ
ｒｉｓｅｏｆＪａｖｕｓ　　（抗生物質ＭＡ１２６７）
、Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　（抗生物質５Ｆ−７
６７）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉ［１ｃｕｓ　　（抗生物
質５Ｆ７３３）、５Ｊ１ａｖｏｐｅｒｓｉｃｕｓ　（７
，ヘク＋／　？　イ’／　７　）、Ｓ、５ｐｅｃｔａｂ
ｉｌｉｓ　（アクチノスペクタシン）、Ｓ、ｒｉｍｏｓ
ｕｓ　ｆｏｒｍａ　ｐａｒｃｒｍｍｙｃｉｎｕｓ　（）
暑ｏ　モフイシン、カテヌリン）、Ｓ、Ｅｒａｄｉａｅ
変種、１ｔａｌｉｃｕｓ　（アミノシジン）、Ｓ、ｂｌ
ｕｅｎｓｉｓ変種、ｂｌｕｅｎｓｉｓ　　（プルエンン
マイシン）、Ｓ、ｃａｔｅｎｕｌａｅ　（カテヌリン）
、Ｓ。

ｏｆ　１ｖｏｒｅｔｉｃｕｌ　ｉ変種、ｃｅｌｌｕｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ　（デストマイソ７Ａ）、Ｓ、ｔｅｎｅｂ
ｒａｒｉｕｓ　（ト１ブラマイシン、アブラマイシン）
、Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ　（ネオマイシン〕、Ｓ、
ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　（ネオマイシン）、Ｓ、
ａｌｂｕｓ　　変種。

ｍｅｔａ＋ｎｙｃｉｎｕｓ　（メタマイシン）、Ｓ、ｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ変種、　ｓａｇａｍｉｅｎｓ
ｉｓ　（スペクチ／フィシン）、Ｓ、ｂｉｋｉ−ｎｉｅ
ｎｓｉｓ　（ストレプトマイシン）、Ｓｏｇｒｉｓｅｕ
ｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｏｃｈｒｃ
ｍ）ｇｅｎｅｓ変種。

ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ　（ストレプトマイシン）、Ｓ
、ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン）　、Ｓ、
ｇａｌｂｕｓ　（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒａｍｅ
ｕｓ　（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｏｆ　１ｖａｃｅ
ｕｓ　（ストレプトマイシン）、Ｓｏｍａｓｈｕｅｎｓ
ｉｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ　、ｈｙｇｒｏｓｃｏ
ｐｉｃｕｓ変種。

１ｉ＋ｍｎｅｕｓ　（バリダマイシン）、Ｓ、ｒｉｍｏ
［ａｃｉｅｎｓ　（デルタマイシン〕、Ｓ、ｈｙｇｒｏ
ｓｃｏｐｉｃｕｓ　Ｅｏｒｒｒｒａ　ｇｌｅｂｏｓｕｓ
（ダレボマイシン）　、Ｓ、［ｒａｄｉａｅ（ヒブリマ
イシン、ネオマイシン）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ
　（抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）　、Ｓ、ａｑｕａｃａ
ｎｕｓ（Ｎ　−ｌ　−ｆ−ルヒグロマイシンＢ）、Ｓ、
ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ（ヒゲ０フイシンＡ）、Ｓ　
、ｎｏｂｏｒ　ｉ　ｔ−ｏｅｎｓｉｓ（ヒグロマイシン
）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　　（ヒゲ０フイ
シン〕、Ｓ、ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ　（ヒゲ０フイシ
ン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ（カスガマイシ７
　）　、Ｓ、ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ（カルボマイシン
）　、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ（抗生物質ＬＩ−−ＡＭ
３１）、Ｓ、１ｉｖｉｄｕｓ（リビドマイシ７　）　、
Ｓ、ｈｏｆｕｅｎ−ｓｉｓ（セルドマイシン複合体）、
およびＳ、ｃａｎｕｓ　（リボシルパロマミン〕の無制
限細胞である。

マクロライド抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばＳ、ｃａｅｌｅｓｔｉｓ（抗生物質Ｍ
１８８）、Ｓ、ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（プラテノマイシン
〕、Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ変種、ｖｏｌｕｂｉｌ　ｉｓ（抗
生物質Ｔ２６３６　）、Ｓ、ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（メ
チマイシン）　、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　（バ
ンドリン）、Ｓ、ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　（ジョサマ
イシン、カルボマイシン）、Ｓ、ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃ
ｕｓ　　（抗生物質ＮＡ　−１８１）、Ｓｌｇｒｉｓｅ
ｏｆａｃｉｅｎｓ（抗生物質ＰＡ１３３Ａ％Ｂ）、Ｓ、
ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ（アルボサイクリン〕、Ｓ　
、ｂｒｕｎｅｏｇｒ−ｉｓｅｕｓ（アルボサイクリン）
、Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｈｒａｎｏｇｅｎｅｓ（アルボサイ
クリン）、ｓ　、ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｃｒｒｎｇｅｎｅ
ｓ（シラマイシンＢ〕、Ｓ、ａｌｂｕｓ（アルボマイセ
チン）、Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ（アルボマイシン、ピクロ
マイシン）、Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ（ランカシジン、ボレリ
ジン〕、Ｓ、ｖｉｏｌａ−ｃｅｏｎｉｇｅｒ（ランカシ
ジン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ（ボレ１ノジン〕、Ｓ、＋
ｍ１ｚｅｕｓ（インゲラマイシン）、Ｓ、ａｌｂｕｓ変
種。

ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（：ｌレイマイシン）、Ｓ
、ｍｙｃａｒｏ［ａｃｉｅｎｓ（アセチル−ロイコマイ
シン、ニスピノマイシン〕、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉ
ｃｕｓ（ツリマイシン、レロマイシン、マロマイシン、
タイロシン、カルボマイシン）、Ｓ＋ｇｒｉｓｅｏｓｐ
ｉｒａｌ　ｉｓ（レロマイシン）、Ｓ、１ａｖｅｎｄｕ
ｌａｅ（アルトガマイシン）、Ｓ、ｒｉｍｏｓｕｓにュ
ートラ？イシン〕、Ｓ、ｄｅｌｔａｅ（デルタマイシン
）、Ｓ、Ｅｕｎｇ−ｉｃｉｄｉｃｕｓ変種、　ｅｓｐｉ
ｎａｎｙｃｅｔｉｃｕｓ（ｘ　スピラマイシン〕、Ｓ。

［ｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ（ミデカマイシン）、Ｓ、ｅ
ｕｒｏｃ−ｉｄｉｃｕｓ（メチマイシン）、Ｓｌｇｒｉ
ｓｅｏｌｕｓ（グ１ノセオマイシン）、Ｓ　、　Ｅｌ　
ａｖｏｃｈｒｃｍｏｇｅｎｅｓ　（アマロマイシン、ジ
ノマイシン）、Ｓ、ｆｉ而面ｉａｔｕｓげマロマイシン
）、Ｓ、　［ａｓｃｉｃｕｌｕｓ（アマロマイシン）、
Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ（ｘリスロマイシン）、Ｓ　、
ａｎｔ　１ｂｉｏｔ　１ｃｕｓ（オレアンドマイシン）
、Ｓ　、ｏｌ　ｉｖｏｃｈｒｃｍｏｇｅｎｅｓ　（オレ
アンドマイシン〕、Ｓ、ｓｐｉｎｉｃｈｒｃｍｏｇｅｎ
ｅｓ変種、　ｓｕｒａｇａｏｅｎｓｉｓ（クジマイシン
）、Ｓ、ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ（ロイコマイシン
）、Ｓ、ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ変種、ｊｏｓａｍｙｃ
ｅｔｉｃｕｓ　　（ｏインマイシンＡ３、ジョサマイシ
ン〕、Ｓ、ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　（ミコノマイ
シン）、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ（チャルコマイシ
ン）、Ｓ、ｃｉｒｒａｔｕｓ（シラマイシン〕、Ｓ、ｄ
ｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ　（ニダマイシン）、Ｓ、ｅｕ
ｒｙｔｈｅｒｍｕｓ（アンゴラマイシン）、Ｓ、　Ｅｒ
ａｄｉａｅ（タイロシン、ラクテノシン、マクロシン〕
、Ｓ、ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ（ハ７ダマイシン）、
Ｓｏｇｒ−ｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ（７キユマイシン〕、
Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　　（カルボマイシン）、Ｓ、
ｔｅｎｄａｅ（カルボマイシン）、Ｓｏｍａｃｒｏｓｐ
ｏｒｅｕｓ（カルボマイシン）、Ｓ、ｔｈｅｒｍｏｔｏ
ｌ　−ｅｒａｎｓ（カルボマイシン）、Ｓ、ａｌｂｉｒ
ｅｔｉｃｕｌｉ　　（カルボマイシン）およびＳ、ａｍ
ｂｏ［ａｃｉｅｎｓ　（スピラマイシン〕の無制限細胞
である。

β−ラクタム抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベクターを導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えはＳ　、ｌ　ｉ　ＰＴｍ−ｎ１ｉ（Ａ１
６８８４、ＭＭ’４５５０、ＭＭｌ　３９０２　）、Ｓ
、ｃｌａ　−ｖｕｌ　ｉｇｅｒｕｓ　（Ａ　Ｉ５　（３
８５Ｂ、クラプラン酸）、Ｓ、Ｉａｃｔａ−ｍｄｕｒａ
ｎｓ（−１ｚ）７フイシンＣ）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ　
（セフ　７７　イシ７Ａ％Ｂ　）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ　（プアーｔ＝トキノセファロスポリ７Ｃ
）、Ｓ、ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ（ＷＳ　−３４４２
−１））、Ｓ、ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ（Ｓ　Ｆ　１５
２３　）、Ｓ、ｈｅＬｅ−ｒａｍｒｐｈｕｓおよびＳ、
ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ（Ｃ２０８１Ｘ）　：Ｓ、ｃｉｎ
ｎａｎｏｎｅｎｓｉｓ　Ｓ、［ｉｍｂｒｉａｃｕｓｌＩ
Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ、　Ｓ。

ｒｏｃｈｅｉおよびＳ、ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｃｍｏｇｅ
ｎｅｓ　（セファマイシフＡ％Ｂ　）　；　Ｓ、ｃａＬ
ｔｌｅｙａ（チェナフイ’／７）：およびＳ、ｏｌ　１
ｖａｃｅｕｓ　％Ｓ、ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ、Ｓ、ｆ
ｌａｖｕｓ　、　Ｓ、ｆｕｌ−ｖｏｖｉｒｌｄｉｓｌＳ
、ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ、およびＳ、ｓｉｏｙａｅｎ
ｓｉｓ（ＭＭ４５５０およびＭＭ　１３９０２　）の無
制限細胞である。

ポリエーテル抗生物質群を生産するストレプトマイセス
分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それに
本発明のベク々−を導入することのできる特に有用な宿
主細胞は、例えばＳ、ａｌｂｕｓ（Ａ２０４、Ａ２８６
９５ＡおよびＢ１サリノマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ　（Ａ２１８　、エメリジッド、Ｄ　Ｅ
３９３６、Ａｌ２０Ａ、Ａ２８６９５ＡおよびＢ、エテ
ロマイシン、ジアネマイシン）、Ｓ　＋ｇｒ　１ｓｅｕ
ｓ　（グリソリキシン）、Ｓ、ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ
（イオノマイシン）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ変種
、　ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉｃｕｓ（ライドロマイシン）
、Ｓ、１ａ−ｓａｌ　１ｅｎｓ　ｉｓ（ラサロシッド）
、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉＦｉｃｕｓ（ａノマイシン）、
Ｓ、ｃａｃａｏｉ変種、ａｓｏｅｎｓｉｓ　　（リソセ
リン）、Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ（モネンシン
）、Ｓ、ａｕｒｅｏ−ｆａｃｉｅｎｓ（−）−プラン）
、Ｓ、ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ　（ＲＰ　３０５０４）
、Ｓ　、ｌ　ｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓ　ｉ　ｓ　（リソセ
リン）、Ｓ、ｆｌａｖｅｏｌｕｓ　（ＣＰ３８９３６）
、Ｓ、ｒｍｔａｂｉｌ　ｉｓ（Ｓ　−１１７４３ａ　）
、およびＳ。

ｖｉｏｌ　ａｃｅｏｎｉｇｅｒにゲリシン〕の無制限細
胞である。

グリコペプチド抗生物質群を生産するストレプトマイセ
ス分類群の無制限株の好ましい宿主細胞であって、それ
に本発明のベクターを導入することができる特に有用な
宿主細胞は、例えばＳ、ｃｒｉ−ｅｎｔａｌ　ｉｓおよ
びＳ、ｈａｒａｎｏｎｎｃｈｉｅｎｓｉｓ　（バンコマ
イシン）　；　Ｓ、ｃａｎＴｉｉｄｕｓ（Ａ−３５５１
２、アボパルシン〕、およびＳ　、ｅｂｕｒｏｓｐｏｒ
ｅｕｓ　（ＬＬ−ＡＭ　３７４　）の無制限細胞である
。

本発明のベクターを使用することができ、導入すること
のできる他のストレプトマイセス無制限株の好ましい宿
主細胞には、Ｓ、ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ、　Ｓ。

ｒＯ５ｅＯ８ｐｏｒｕｓ　、　Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ　
％Ｓ、ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ　、およびＳ。

ａｚｕｒｅｕｓ　の無制限細胞が含まれる。

上記の代表的なストレプトマイセス宿主細胞のほかに、
本発明に係るベクターは大腸菌にも有用であり、これに
導入することができる。この様に、本発明のベクターの
適用範囲は広く、各種生物の宿主細胞に有用で、これに
導入することができる。

本発明の全ての実施形式は有用であるが、本発明に係る
組換ＤＮＡクローニングベクターおよび形質転換体のあ
るものが特に好ましい。即ち、好ましいベクターはＰＪ
Ｌ１１４、ＰＪＬ１２１、ＰＪＬ１２５゜ＰＪＬ１８０
．ＰＪＬ１９０、ＰＪＬ１９２、ＰＪＬ１９５、ｐＪＬ
１９７、ｐＪＬ１９９およびＰＨＪＬ２１２であり、好
ましい形質転換体は５ｔｒｅｐＬａｒｒｙｃｅｓ　ｇｒ
ｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ｐＪＬ１１４、Ｓ、ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ／ｐＪＬ１２１、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕ
ｓｃｕｓ　／ＰＪＬ１２５、ＳｏｇｒｉｓｅｏＥｕｓｃ
ｕｓ　／ＰＪＩ−１８０、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕ
ｓ／ＰＪＬ１９０、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ｐ
ＪＬ１ｇ２、Ｓ６ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ＰＪＬ１
９５、Ｓ　ｇｒｉｓｅ６ｆｕｓｃｕｓ／ｐＪＬ１９９、
Ｓ１ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ＰＪＬ１９７、　Ｓｏ
ｇｒ　１ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ｐＨＪ　ｒ−２１２、Ｅ
、ｃｏｌ　ｉ　　Ｋ１２Ｃ６ｏｏＲｋ−Ｍｋ−／ｐＪ　
Ｌ１１４、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２　Ｃ６Ｃ６００Ｒｋ
−ゾＰＪＬ１２１、Ｅ、ｃｏｌ　Ｉ　Ｋ　１２　Ｃ５Ｑ
　□Ｒ％に−／ｐ　Ｊ　Ｌ　１２５、Ｅ、（ｏｆ　Ｉ　
Ｋ１２　Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ／ｐ　Ｊ　Ｌｉ２Ｑ、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ−／ＰＪＬ１９０
、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ５ＱＱＲｋ−ＭｋプＰＪＬ１
９２、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６Ｃ６００Ｒｋ−／Ｐ
ＪＬ１９５、Ｅ、Ｃ０１ｉＫ１２Ｃ６００Ｒｋ−Ｎｆｋ
−／ＰＪＬ１９９、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００Ｒｋ
−Ｍｋ−／ＰＪＬ１９７、およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２
Ｃ６００Ｒｋ−Ｍｋ−／′ＰＨＪＬ２１２である。更に
これらの好ましいものの内、プラスミドｐＪＬ１９０、
ＰＪＬ１９２、ｐＪＬ１９５、ｐＪＬ１９７、ＰＪＬ１
９９およびｐＪＬ、および形質転換体Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ
ｌ：ｕｓｃｕｓ／ｐＪＬ１９Ｑ、Ｓ０ｇｒｉｓｅｏｆｕ
ｓｃｕｓ／ｐＪＬ１９２、Ｓ＋ｇｒｉ５ｅｏｆｕｓｃｕ
ｓ／ｐＪＬ１９５、Ｓ１ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ｐ
ＪＬ１９７、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ｐＪＬ１
９９、Ｓ１ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ｐＨＪＬ２１２
、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ，６００Ｒｋ−Ｍｉｃ−／
ｐＪＬ１９ｏ、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ，６００Ｒｋ
−Ｍｋ−／ＰＪＬ１９２、Ｅ、ｃｏｌ＋　Ｋ１２　Ｃ６
Ｃ６００Ｒｋ−／ｐＪＬ１９５およびＥ、ｃｏｌｉＫ１
２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−／ＰＪＬ１９７、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−／ＰＪＬ１９９およ
びＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒｋ’％　／ｐＨＪ
Ｌ２１２が最も好ましい。Ｓｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ　
ｇｒｉｓｅｏ−ｆｕｓｃｓ　は内因性プラスミドを含ん
でおらず、また△ 抗生物質を合成しないので好ましい宿主である。

従ッテ、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　の形質転換体
は、抗生物質合成のための遺伝子を発現するクローンに
ついてスクリーニングすることができる。

本発明に係るベクターは、大腸菌およびストレフトマイ
セスで機能する複製起源群を含んでおり、従って宿主の
選択には柔軟性がある。従って、クローン化ＤＮＡ配列
を、新規プラスミドの組み立て、物理的分析、および制
限部位のマツピング（地図作成）のために大腸菌に導入
（ｓｈｕｔＬＩｅル、次いで機能分析および菌株の改善
の為にストレプトマイセスに導入し返す（シャトル・バ
ック）ことができる。プラスミドの増幅および操作は、
ストレプトマイセスより大腸菌の方がより迅速に、より
簡便に行なうことができるので、このことは特に好都合
である。例えは、本発明のベクターは、１ Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２に入れ、スペクチノマイシン
またはクロラムフェニコールの存在Ｆで生育させること
により、常法通り増幅させることができる。これはスト
レプトマイセス宿主系では不？ｊＪ能である。更に、全
てのこのプラスミドベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２で
発現する耐性マーカーを含んでいるので、組換え体を簡
単に選択することができる。従ってストレプトマイセス
で同様の操作を行なう場合よりも短時間に、そして容易
に、多量のプラスミド１）　Ｎ　Ａを単離することがで
きる。即ち、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主系で所望の組換えＤＮＡ
操作が終了した後、特定のストレプトマイセスＤＮＡを
除去し、必要ならば再ひプラスミドの形に組み立てるこ
とかでき、次いでストレプトマイセス宿主細胞に導入す
るこトカできる。本発明のベクターは、ストレプトマイ
セスに於いて完全に選択可能であるので、組換え体クロ
ーンの同定を効率よく行なうことができる。

本発明の組換えＤＮＡクローニングベクターおよび形質
転換体は、広い利用性を持っており、ストレプトマイセ
スおよび大腸菌に使用するのに適したクローニング媒体
として役立つものである。

更に、本発明のベクターがポック表現型または抗生物質
耐性を付与し得ることは、形質転換体の便利な選択手段
を提供することになるうベクターＤＮＡを獲得した細胞
を決定、選択することの実際上の必要性から、このこと
は重要である。存在を確認するための機能的試験法のな
いＤＮＡセグメントをも本発明のベクターに挿入するこ
とができ、この非選択性ＤＮＡを含有する形質転換体を
、適当な抗生物質選択法または他の表現型選択法によっ
て単離することができる。この様な非選択性ＤＮＡセグ
メントは、プラスミド機能および複製に必要な領域内を
除いてあらゆる部位に挿入することができ、これには抗
生物質改変酵素を指定している遺伝子およびあらゆるタ
イプの調節遺伝子が含まれる。

更に詳しくは、遺伝子を含有する非選択性ＤＮＡセグメ
ントをプラスミド、例えは代表的なプラスミドＰＪＬ１
９２の、〜７，７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ｍ耐
性付与フラグメントの内部ＢａｍＨＩ制限部位（サイト
）に挿入することができる。この挿入によってネオマイ
シン耐性遺伝子が不活性化され、この組換えプラスミド
を含有するストレプトマイセス形質転換体の同定が容易
となる。これは次の様にして達成される。即ち、先づＭ
ポック形態を選択し、次いでネオマイシンに耐性を持た
７ｊいＭ形質転換体を同定するのである。同様に、Ｉ）
　Ｎ　Ａセグメントを代表的なプラスミドＰＪＬ１８０
の、例えば唯一のＰｓｔ　Ｉ制限部位（サイト）に挿入
するとアンピシリン耐性遺伝子が不活性化される。従っ
て、この組換えプラスミドを持った大腸菌形質転換体は
、先づクロラムフェニコール耐性体を選択し、次いでそ
れらの内アンピシリンに耐性を持たないクロラムフェニ
コール耐性形質転換体を同定する。従って、ストレプト
マイセスおよび大腸菌において抗生物質耐性またはその
他の表現型マーカーを選択することができることにより
、興味ある特定の非選択性ＤＮＡを含有している極めて
少数の細胞を、効率よく単離することができる。

上記した如き抗生物質耐性についての機能試験は、調節
因子として働き個々の抗生物質耐性遺伝子の発現を促し
ているＤＮＡセグメントを確認するのにも使用すること
ができる。プロモーター、アテニュエーター、リプレッ
サー、インデューサ、リポソーム結合部位などを包含す
るこの様なセグメント（これらのものに限定される訳で
はない〕は、ストレプトマイセスおよび大腸菌の細胞中
で、他の遺伝子の発現をコントロール（調節）するのに
使用することができる。

本発明に係る抗生物質耐性付与ベクターは、幾計代にも
渡って、連結されたＤＮＡセグメントが宿主細胞中に安
定に維持されることを保証するのにも有用である。抗生
物質耐性付与フラグメントと共有結合しており、ストレ
プトマイセスまたは大腸菌のいずれかで増殖されるこれ
らの遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、その形質転換
体を、形質転換されなかった細胞にとっては有毒な濃度
の抗生物質に晒らすことによって保持される。従って、
ベクターを失ない、それ故この共有結合ＤＮＡを失なっ
た形質転換体は増殖することができず、培養から除去さ
れろうこの様に、本発明のベクターは、あらゆる興味あ
るＤＮＡ配列を保持す本発明に係るクローニングベクタ
ーおよび形質転換体により、現在ストレプトマイセスお
よび関連細胞中で生産されている種々の物質の収量を改
善するための遺伝子をクローニングすることができる。

こノ様な物質の例としては、ストレプトマイシン、タイ
ロシン、セファロスポリン類、アクタプラニン、ナラジ
ン、モネンシン、アブラマイシン、トブラマイシン、エ
リスロマイシンなどが挙ケられるが、これらに限定され
ない。本発明はまた、工業的に重要な蛋白質、例えばヒ
トインシュリン、ヒトプロインシュリン、ヒト成長ホル
モン、牛成長ホルモン、グルカゴン、インターフェロン
、蛋白質、工業的に重要なプロセスおよび化合物と関連
している代謝径路における酵素機能、または遺伝子発現
を改善する調節因子を暗号化している１）　Ｎ　Ａ配列
をクローニング、特徴つけ、および再構成するのに有用
な選択性ベクターを提供するものである。これらの望ま
しいＤＮＡ配列には、誘導（ｄｅｒ　１ｖａｔ　１ｚｅ
ｄ）抗生物質、例えばストレプトマイシン、セファロス
ポリン、タイロシン、アクタプラニン、ナラジン、モネ
ンシン、アブラマイシン、トブラマイシンおよびエリス
ロマイシンの誘導体などの合成を触媒している酵素、ま
たは抗生物質またはその他の生産物の生合成を調整し、
増大させる酵素を暗号化しているＤＮＡが挙げられるが
、これらに限定されるものではない。

上記のＤＮＡセグメントをストレプトマイセスおよび大
腸菌に挿入し、安定化し、シャトル化（行ったり来たり
すること）し得ることにより、ストレプトマイセスによ
って生産される抗生物質の収量および利用性を増大させ
るための組換え遺伝子操作が容易になる。更に、プラス
ミド５ＣＰ２または５ｅｐ２′複製起源は低いコピー数
を暗号化しているので、高いコピー数のプラスミドから
発現された場合には致死的となる様なりＮＡ配列も含め
て、はとんどあらゆるＤＮＡ配列を本発明のベクターに
容易にクローンすることができ、ストレプトマイセスと
大腸菌の間を行き来（シャトル）させることができる。

プラスミド５ｃｐ２および５ｃｐ２ｘのそれぞれの供給
源としてのＳｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃ
ｏｌｏｒ　Ａ３　（２）およびＳ、ｃｏｅｌ　１ｃｏｌ
ｏｒ　Ｍ　１１０は、種々の培地を使ッテ、色々の方法
で培養することができる。培養培地に好ましい炭水化物
源は、例えば糖蜜、グルコース、デキストリン、グリセ
リンなどであり、窒素源は例えば大豆粉、アミノ酸混合
物およびペプトンなどである。栄養無機塩も混入される
が、これにはナトリウム、カリウム、アンモニア、カル
シウム、燐酸、塩素および硫酸イオンなどのイオン類を
生成し得る通常の塩類が挙げられる。他の微生物の増殖
や発育に必要であるのと同じ様に、必須微量元素も添加
する。この様な微量元素は、通常培地の他の成分を添加
する際、その成分の不純物として供給される。

Ｓｔｒｅｐｔｃｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　
Ｍｌ　ｌ　Ｑ　およびＳ、ｃｏｅｌｉ−ｃｏｌｏｒ　Ａ
　３　（２）は、好気性培養条件下、約ｐ１５〜９とい
う比較的広いＩｉＩ範囲で、約１５〜４０°Ｃの温度で
増殖される。しかし、最もコピー数を高くしてプラスミ
ド５ｃｐ２および５ＣＰ２　　を生産するには、田約７
．２の培地を使って培養を開始し、培養温度を約３０°
Ｇに保つのが望ましい。この条件下でＳｔｒｅｐｔｃｍ
ｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　Ｍ　１１０および
Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏ−１ｏｒ　Ａ　３　（２）を培養す
ると、当業者によく知られた技術で、常法によりそれぞ
れプラスミド５ｃｐ２および５ＣＰ２”が単離される細
胞の保有体が得られる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。適
当と思われる箇所に、本発明の組み立ての説明および実
際の操作を記載した。

実施例１　プラスミド５ＣＰ２ｘの単離Ａ、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＭＩＩＱの培
養Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　
Ｍｌ　１０　（ＮＲＲＬ　１５０４１）の増殖接種物を
、常法により、その株を滅菌トリブチカーゼ大豆ブロス
”１）（３５ｙ／ｉ脱イオン水）５０゜ｅ中、液中好気
条件下で増殖させることにより調製した。

このトリブチカーゼ大豆ブロス接種物を３０℃で４８時
間インキュベートした。この培養物約５０×２） ＩＩｌｅをホモジナイズし、滅菌ＹＥＭＥＳＧ　　　培
地４５０ｆｆｌｅに移し、３０°Ｃで少なくとも４０時
間、６５時間を超えない様にインキュベートした。ｐＨ
の調節は行わなかった。インキュベートしたものから、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ｍ
ｌ　ｌ　Ｑ細胞を収穫し、次いでプラスミドＤＮＡを単
離することかできる。

×１）トリブチカーゼ大豆ブロスはＤｉｆｃｏ　Ｌａｂ
ｏｒａ　−ｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃ
ｈｉｇａｎから入手できる。

×２）ＹＥＭＥＳＧは０．３％酵母エキス、０．５％ペ
プトン、０．３％麦芽エキス、１％デキストロース、３
４％シュクロース、０．１％Ｍｇ　Ｃ１２および０．１
％グリシンを含有している。

Ｂ、プラスミドの単離 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　
Ｍ　１１０細胞約１０ｙ（湿めった重量−以下、ｗｅｔ
ｗｇｔと記す。）を遠心分離（１０分、４℃、１０，０
００ｒＰｍ）して集め、Ｔ　Ｅ　Ｓ緩衝液（０，ＯＩＭ
ｌ−リス（ヒドロキシメチル）アミノエタン〔【ｒｉＳ
〕、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ、２５％シュクロース、Ｐ
Ｈ８）を約１０　ｍｅ７’　ｙ　（ｗｅｔｗｇｔ）細胞
の割合で加えた。細胞を攪拌して懸濁し、Ｉ　Ｑ　ｍｅ
／ｙ　（ｗｅｔ　ｗｇｔ　）細胞の０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８、次いで５　ｍｅ／？　（ｗｅｔ　ｗｇｔ　
）細胞のリゾチーム（１０■／ｍｅ　、　Ｔ　Ｅ　Ｓ中
）を加えた。この混合物を３７℃で約１５分間インキュ
ベートした後、約１．５　ｍｅ／ｙ　（ｗｅｔ　ｗｇｔ
　）細胞の２０％ＳＤＳ　（ラウリル硫酸ナトリウム（
ＢＤＨＣｈｅｔｎｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ。

Ｐｏｏｌｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ　’）を加えた。得られ
た混合物を室温で３０分間放置し、次いで最終濃度かＩ
ＭＮａ−Ｃ１となる様に５ＭＮａＣ１を加えた。再ひ室
温で１５分間放置した後、混合物を氷上に２時装置しま
た。溶解質を遠心分離しく２０分、４℃、１７．５０Ｏ
ｒｐｍ）、上澄液を集めて０．６４容のインプロピルア
ルコールと混合した。ＤＮＡ沈殿物を遠心分離して集め
た（１５分、４℃、１０，０００ｒＰｍ）。沈殿物を風
乾し、再ひｌ　ｍｅ／ｙ　（ｗｅｔ　ｗｇ、ｔ　）細胞
のＴ　Ｅ緩衝液（０，０１Ｍトリス、Ｑ、　Ｑ　Ｑ　Ｉ
Ｍ　ＥＤＴＡ）に懸濁した。プロピジウム・ヨーシト（
ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ　）を用い、セシウム
クロライド勾配遠心分離法（２０時間、２０℃、ｓＯ，
Ｏｏｏｒｐｍ）でプラスミドＤＮＡを精製した。遠心分
離の後、所望のプラスミド５ＣＰ２ｘＤＮＡ帯を除去し
、常法に従ってプロピジウム・ヨーシトを抽出した。こ
のＣｓＣ１−ＤＮＡ溶液を一２０°Ｃて貯蔵した。使用
前に、Ｔ　Ｅを用いたＰＤＩＱ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）
カラム交換あるいはＴＥに対する透析によってＤＮＡを
脱塩した。常法によりエタノールでＤＮＡを沈殿させ、
Ｔ　Ｅに溶解した。

実施例２　プラスミドｐＬＲ１の組み立てＡ、プラスミ
ドｐｌＪ　２のＨｉｎｄｌ［消化プラスミドＰＩＪ２Ｄ
ＮＡ（ＴｈＯｍＰＳＯｎら、Ｎａｔｕｒｅ２８６　：５
２５．１９８０年参照）約２０μｚ（，２０ｐｙ）、Ｂ
ＳＡ（牛血清アルブミン、１＋ｎｇ／＋＋ｚ　’）　５
　ｐｉ、水１９　Ｉｌｌ、　Ｈｉｎｄ　Ｊｌ［（３Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ単位含有）制限
酵素ｘ１）１μｌ、および反応ミックス′趨５μｌを３
７℃で２時間インキュベートシタ。４Ｍ酢酸アンモニウ
ム約５０μｌおよび９５％エタノール２００μｌを加え
て反応を停止させた。得られたＤＮＡ沈殿物を７０％エ
タノールで２回洗浄し、減圧乾燥、し、Ｔ　Ｅ緩衝液２
０μｌに懸濁し、−２０°Ｃに冷凍して貯蔵した。

×１）制限酵素およびその他の酵素は以下の供給者から
入手できる：　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａ
ｂｓ、、　Ｉｎｃ。

（３２１−ｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｑ　１９１５）、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ（７９４１Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　Ｄｒｉｖｅ　Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。

１ｎｄｉａｎａ　４６２５０　’ｌ。Ｂｅｔｈｅｓｄａ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　（
ＢＲＬ）　（Ｂｏｘ　５ＱＩＱ％ＲｏｃＫｖｉｌｌｅ　
。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｅｌｋｈａ
ｒｔ、　１ｎｄｉａｎａ　４６５１５）。

×２）　４１ｉｎｄ　ｆＪＪ制限酵素のための反応ミッ
クスは、以下の成分で調製した：　６　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　
Ｎａ（４ｙ、１００ｍＭトリス−ＨＣ／　（、ｐＨ７，
９）、７ｏｍＭＭｇｃ１２．１０ｍＭジチオトレイット
。

Ｂ、プラスミ）’　ｐＢＲ３２２（７）Ｈｉｎｄ　ｍ消
化プラスミドＰＢＲ３２２ＤＮＡ約８　ｔｉｌ（４μｙ
）、反応ミックス５μｇ、ＢＳＡ（１■／Ｗｄり　５μ
ｌ、水３１　ｐｉおよびＩ（ｉｎｄ　［１制限酵素１ｔ
ｔｅを３７°Ｃて２時間インキュベートした。６０℃で
１０分インキュベートして反応を終結した後、酢酸アン
モニウム約５０μｌと９５％エタノール２００μｌを添
加した。得られたＤＮＡ沈殿を７０％エタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌに懸濁した。

Ｃ，Ｈｉｎｄ　ｆＪＪ消化したプラスミドｐｌＪ２とｐ
ＢＲ３２２の結合（リゲーション） Ｈｉｎｄ　ｍ処理プラスミドＰＩＪ２（実施例２Ａのも
の）約２０　ｉｔｚ、Ｈｉｎｄ　Ｉｌｒ処理プラスミド
ｐＢＲ３２２（実施例２Ｂのもの）２０＃！−ＢＳＡ（
１−ｙ／）ｍｅ ５　μｐ　、　−ｒ４　ＤＮＡ　’Ｊ　ｉｆ−セｘ１）
１　ｔｕ、　オヨＵ”Ｊ　’ｆ−ションミックスｘ２）
５μｌを１６℃で４時間インキュベートシタ。４Ｍ酢酸
アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００
μｌを加えて反応を終了させた。得られたＤＮＡ沈殿物
を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、Ｔ　Ｅ
緩衝液に懸濁した。この懸濁ＤＮＡは所望のプラスミド
ｐＬＲ１を構成していた。

刈）Ｔ４ＤＮＡリガーゼは前記Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ、、　Ｉｎｃ、から入手できる。

×２）リゲーションミックスは以下の成分で調製した：
　５ＱＱｍ’Ｍ　トＩＪ　ス−ＨＣｚ　（ｐＨ７，８”
）、　２００ｍＭ　　ジチオトレイット、１００ｍＭ　
ＭｇＣｌ２．１０ＭＡＴＰ 実施例３　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＨＢ１０１／ＰＬＲ
Ｉ（７）調製凍結したコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ
１２１−ＩＢＩＯＩ細胞（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ
　２　：　７５−９３．１９７７年参照）約ＩＱｍｆを
遠心分離によってペレット化し、０．０１Ｍ塩化ナトリ
ウム約１ｏｍｅに懸濁した。

次いで細胞を再びペレット化し、０．０３’Ｍ塩化カル
シウム約１’Ｑ’ｍｅに再懸濁し、氷上で約２０分イン
キュベートし、３回目のペレット化を行ない、最後に０
．０３Ｍ塩化カルシウム１．２５　ｍｅに再懸濁した。

得られた細胞懸濁液は以降の形質転換を行ない得るもの
（コンピテント）であった。

′ｒＥ緩衝液中のプラスミドｐＬＲ１（実施例２Ｃのも
の）をエタノール沈殿させ、３ＱｍＭ塩化カルシウム溶
液１５０μｌに懸濁し、試験管中でコンピテントＥ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ細胞約２００μｌとゆっく
り混合した。得られた混合物を氷上で約４５分、次いで
４２°Ｃで約１分インキュベートした。次いで、アンピ
シリンを５０μｙ／ｍｅ含有するＩ−−ブｏ　ス（Ｂｅ
ｒｔａｎｉ　、　Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
６２　：２９３．１９５１年参照）約３　ｍｅを添加し
た。この混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュ
ベートし、アンピシリンを含有しているし一寒天（Ｍｉ
ｌｌｅｒ　；　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　）ｌａｒｂｏｒｌＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７２参
照）上にプレートした。生存コロニーを選択し、期待し
た表現型（Ａｍｐ　　、Ｔｅｔ５）　　を試験した結果
、これは所望のＥ、　ｃｏｌ　１Ｋ１２　　ＨＢＩＯＩ
／ｐＬＲ１形質転換体を構成していた。

実施例４　プラスミドｐＬＲ４の組み立てＡ、プ７スミ
ドｐＬＲ１の部分的ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＬＲ１
約１０μ１（１０μｙ）、ＢＳＡ（１ｍｙ／　ｍｅ　）
　５　ｉｌｌ、水２９　Ｍｇ　−ＢａｍＨＩ制限酵素（
水で１：４に希釈）１μｌ、および反応ミックス′１）
５μｌを３７°Ｃで１５分間イインキュベートした。４
Ｍ酢酸アンモニウム約５０μｌと９５％エタノール２０
０　ｐｌを加えて反応を停止させた。得られたＤＮＡ沈
殿を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、水２
０μｌに懸濁した。

Ｊ’）ＢａｍＨＩ制御酵素の為の反応ミックスは以下の
成分で調製した：　１．５　Ｍ　ＮａＣｚ、６０ｍＭト
ＩＪ　スー塩酸（ＰＨ７，９’ｌ、５　Ｑ　ｍ　Ｍ　Ｍ
ｇ　Ｃｌ　２Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨｉ
消化）ｆｉｎｄ　ｆｆｆ制限酵素と反応ミックスの代り
にＢａｍ■１制限酵素と反応ミックスを用いる他は実施
例２Ｂと同様にして所望の消化を行なった。消化したＰ
ＢＲ３２２は水２９μｌに懸濁した。

Ｃ３部分的ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＬＲ１とＢａｍ
Ｈ１消化プラスミドｐＢＲ３２２の結合実施例２Ｃと実
質的に同様にして表記の結合を行なった。得られた連結
ＤＮＡをＴ　Ｅ緩衝液に懸濁した。これは所望のプラス
ミドｐＬＲ４，を構成していた。

実施例５　　Ｅｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ
４の組み立て 形質転換にプラスミドｐＬＲ１の代りにプラスミドｐＬ
Ｒ４を用いる他は実施例３と実質的に同じ方法で表記の
組み立てを行なった。生存コロニーを選択して期待され
る表現型（Ａｒ１１ＰＲ１−ｒｅｔ５）について試験し
たところ、これは所望のＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２■Ｂ１
０１／ｐＬＲ４形質転換体を構成していた。

実施例６　プラスミドＰＪＬ１２０およびｐＪＬ１２１
の組み立て　　□ Ａ、プラスミドｓｃｐ　２　　のＥｃｏＲＩ消化プラス
ミド５ＣＰ２”ＤＮＡ約１５０μｌ（５，７ｐｙ’）、
水１　ｍｅ、　ＥｃｏＲ１制限酵素２μ１（２０ＢＲＬ
単位含有）、およびＥｃｏＲＩ反応ミックス＊１’）１
７μｌ　を３７°Ｃで２．５時間インキュベートした。

６５℃で１５分間インキュベートして反応を停止させた
。

制限化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　）が終了したことを
確認するために、常法に従って反応物をアガロースゲル
゛嘔気泳動法（ＡＧＥ）により分析した。制限化ＤＮＡ
は使用するまで４°Ｃで貯蔵した。

×ｌ）　ＥｃｏＲ１制限酵素のための反応ミックスは以
下ノ成分でＨ製Ｌ　タ：　５００　ｍＭ　ＮａＣｚ、１
０００ｍＭ　トリス−ＨＣｚ　（ｐＨ７，５）、１００
　ｍＭ　ＭｇＣ１２Ｂ、プラスミドＰＢｋ３２５（ＤＥ
ｃｏＲＩ消化プラスミド５ＣＰ２Ｘの代りにプラスミド
ＰＢＲ３２５を使用する他は実施例６Ａと実質的に同様
にして表記の消化を行なった。得られたＤＮＡは使用す
るまで４℃で貯蔵した。

Ｃ９ＥＣ０ＲＩ消化したプラスミド５ＣＰ２ｘとＰＢｋ
３２５の結合 ＥＣ０Ｒ１消化プラスミド５ＣＰ２ｘ（実施例６Ａ）約
４０１１１．　ＥｃｏＲ１消化プラスミドＰＢＲ３２５
（実施例６Ｂ　’）　１０ｔｉｅ、ＭｇＣｚ２（０，１
Ｍ）１０ｐｅ、（ＮＨ，、）２ＳＯ４（０，ＬＭ）　１
０ｐｔ：、Ａ−ｒＰ（２ｍＭ）１０μｌ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．１μｌ、およびリゲーション（結合）ミック
スＸ１）２０μｌを４°Ｃで１８時間インキュベートし
た。適切な連結が起ったかどうかを調べる為に反応物を
ＡＧＥで分析した。

懸濁されたＤＮＡは、所望の〜３５．８ｋｂプラスミド
ＰＪＬ１２０およびＰＪＬ１２１を構成していた。

プラスミドＰＢＲ３２５ＥｃｏＲ１フラグメントはいず
れの方向にも配向し得るので、２つの配向の組換えプラ
スミドか生成する。プラスミドＰＪＬ１２０およびｐＪ
Ｌ１２１のそれぞれの制限部位地図を決め（実施例７に
記載した様に単離してから）、第２図に示した。

×１）リゲーションミックスは以下の成分で調製した：
５０ｍＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７，５）、ｌＱｍＭβ−
メルカプトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡ、５０■／ｍｅ
ＢｓＡ 実施例７　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６Ｃ６００Ｒ
ｋ−／ｐＪＬ１２０およびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ
６００Ｒｋ　　Ｍｋ−／ＰＪ”１２１の組み立て Ａ、凍結：ｌ　ンヒ−ｒ　７１−　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ
１２　ｃ６００Ｒ１−、Ｍｋ−の調製 Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ５ＱＯＲｋ−Ｍｋ−（７）
新鮮なオーバーナイトカルチャー（ＣｈａｎｇおよびＣ
ｏｈｅｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７１　：１０３０−
１０３４．１９７４年参照）を新鮮なＬ−ブｏ　ス（Ｍ
ｉｌｌｅｒ　、　Ｅｘｐｅｒｉ　−ｍｅｎｔｓ　ｉｎ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ　、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９７２）中で継代培養しく１：１０）、３７℃で１時
間増殖させた。総計６６０　Ｋｌｅｔ（単位の細胞を収
穫し、１００ｍＭＮａＣｌ２２．５Ｉ＋Ｉｔ＋テ洗浄し
、１０％のグリセリンを含んだ１５０ｍＭのＣａ　Ｃ１
２に懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。遠心
分離して細胞を集め、Ｃａ　Ｃ１２−グリセリンＱ、　
５　ｍｅに再懸濁し、氷上で３−５分間冷却して凍結し
た。

この細胞懸濁液は使用するまで液体窒素に入れて保存し
た。保存しても、共有結合により閉環した環状ＤＮＡに
よる形質転換の頻度または生育力に悪影響はみられなか
った。

Ｂ、形質転換 ０．０５−（実施例６Ｃの試料１０ｔｔｔと４０ｔｔｉ
（ＤＩ　Ｘ５ＳＣ（０，０１５Ｍ　ＮａＣ１、０，００
１５Ｍクエン酸す）　ＩＪウム、ＰＨ７）に対して細胞
Ｑ、１ｍｌ！の割合で混合した。この形質転換混合物を
氷上で２０分間冷却し、１分間４２℃でヒートショック
を与え、１０分間氷上で冷却した。この試料をＬ−グロ
ス０．８５　ｍｌで希釈し、３７℃で１．５時間インキ
ュベートし、アンピシリン（５０μｙ／　ｍｅ　）およ
びテトラサイタリン（１２，５μｙ／ｍｅ）を含有して
いるＬ−寒天に広け、３７℃で１８時間インキュベート
した。生成したコロニーを選択し、期待される表現型（
Ａｍｐ　　＝　−ｒｅＬ　　、　ＣＭ５）を試験したと
ころ、所望（Ｄ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｃ６０Ｃ６
００Ｒｋ−／ＰＪＬ１２０およびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１
２　Ｃ６００Ｒｋ　Ｍｋ−／ＰＪＬ１２１形質転換体を
構成していた。アンピシリンおよびテトラサにクリン耐
性コロニーを既知の方法で単離して培養し、構成プラス
ミドの制限酵素およびＡＧＥ分析により、常法通り同定
した。

この同定された形質転換体を、既知の方法にょるプラス
ミドｐＪＬ１２０およびｐＪＬ１２１の単離およびその
後の生産に使用した。

実施例８　プラスミドｐＪＬ１ｓｏおよびＰＪＬ１８１
の組み立て Ａ、プラスミド５ｃｐ２×の５ａｌｌｔ肖化および〜５
．Ｑ　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉフラグメントの単離Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉ制限酵素および反応ミックスの代りに５ａｌＩ制限酵
素および反応ミックス刈）を使用する他は実施例６と実
質的に同様にして所望の消化を行なった。反応物をＡＧ
Ｅで分析して完了を確認し、６５℃で１５分間加熱して
終了せしめた。生成したＳａｌ　Ｉ制限フラグメントを
ＡＧＥで分離し、この分離したフラグメントのゲル中の
位置を、エチジウムプロミドで染色し、紫外線により螢
光帯を視覚的に確認した。問題としている〜５．Ｑｋｂ
フラグメントを含むゲルフラグメントをゲルから切断し
、ＴＢＥ緩衝液（１，６％Ｓｉｇｍａ７−９緩衝液ｘ２
）、０、０９３％Ｎ　ａ　２　Ｅ　ＤＴ　Ａ、０．５５
　％硼ｅ　）　中ニ’Ｍ気溶出した。ＴＢＥ緩衝液中の
ゲルフラグメントを透析袋に入れ、１ｏｏｖで１時間電
気泳動した。

水溶液を透析袋から集め、平衡化緩衝液（０１ＭＫＣｌ
、ｌ　ＱｍＭ　ｌ−リスー夏ＩＣｚ　、　’ｐ）１７．
８　）で平衡化Ｌ　ｆ：　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　セルロー　
７．カラム””　（０，５ｄ、Ｗｈａ（ｍａｎ　Ｄ　Ｅ
　５２　）に通した。カラムを平衡化緩衝Ｗ　２．５　
ｍｅで洗浄し、ＤＮＡ（約５μｙ）を溶出緩衝液（ｌ　
Ｍ　ＮａＣｚ、ｌ　Ｑ　ｍＭ　トＩＪ　ス−ＦＩＣ４、
ｐｌ−１７，８）で溶出した。溶出液のＮａ＋イオン濃
度を約０．３５Ｍに調節し、２容量（約９　ｍｅ　）の
１００％エタノールを加え、次いで一２０℃に１６時間
冷却することによってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿
物を遠心分離によってペレット化し、７５％エタノール
で洗浄して乾燥し、ＴＥ緩衝液に溶解した。

以降、この常套の分離法をＡＧＥ／ＤＥ５２／電気溶出
と呼ぶ。

×１）　Ｓａｌ　Ｉ制限酵素のための反応ミックスは以
下の成分で調製した＋　１５０　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣｚ、
８０ｍＭトリス−ＨＣｚ　（ｐ８７．５　’ｌ、６０　
ｍＭ　Ｍｇ（４＋２．２ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ ×２）Ｓｉｇｍａ　７−９緩衝液はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ　（Ｐ、０．　Ｂｏｘ　１４
５０８、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　５３１７８　）がら入手出来る。

×３）ＤＥＡＥセルｏ−ス（ＤＥ５２　）はＸＡ／ｈａ
ｔｍａｎＩｎｃ、、　（９Ｂｒｉｄｅｗｅｌｌ　Ｐｌａ
ｃｅ、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ　Ｏ７
０１４）かう入手出来ル。

Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２５（７）　Ｓａｌ　Ｉ　消化
プラスミドＰＢＲ３２５を使用し、フラグメントをプレ
パラテイブＡＧＥ／ＤＥ５２．’電気溶出にょて分離し
ないこと以外は実施例８Ａと実質的に同様にして表記の
消化を行なった。得られたＤＮＡを゛ｒＥ緩衝液に溶解
し、使用するまで４℃で貯蔵した。

Ｃ，５ａｌＩ消化プラスミドｐＢＲ３２５およびプ７　
スミ）’　５ＣＰ２”　ノ〜６．Ｑ　ｋｂ　Ｓａｌ　ｌ
　７７クメ７トの結合 実施例８Ａで得た５ＣＰ２”　（７）　６．　Ｏｋｂ　
Ｓａｌ　Ｉ　７　ラグメント約１．５μノを実施例８Ｂ
で製造したＳａｌ　Ｉ消化ｐＢＲ３２５０，５μ７と混
合した。標準的なエタノール沈殿法でＤＮＡ混合物を沈
殿させ、蒸留水３μｌ、０．６６Ｍ　ＡＴＰ　４μ！、
リガーゼ−キナーゼ混合物（０，２５Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７，８）、５゜％グリセリン）２μｌおよびＴ４
−ＤＮＡ　リガーゼ１μ／（１単位）に再溶解した。１
５℃で１時間インキュベートした後、反応混合物を水１
２μｌ、０．６６Ｍ　ＡＴＰ　２０μｌ、リガーゼ−キ
ナーゼ混合物８μｌで希釈し、１５℃で１８時間インキ
ュベートした。得られた結合ＤＮＡを、ｌＸ５ＳＣ中に
１−５に希釈した。所望の〜１２．Ｏｋｂプラスミドｐ
ＪＩ−１８０およびＰＪＬ１８１を構成していた。

プラスミドＰＢＲ３２５Ｓａｌ　ｌフラグメントはいづ
れの方向にも配向し得るので２配向の組換えプラスミド
が生成する。プラスミドｐＪＬ１８０およびＰＪＬ１８
１のそれぞれの制限部位地図を第３図に示した。

実施例９　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒ
ｋ−／ＰＪＬ１８０およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ５
ＱＯＲｋ−Ｍｋ−／ｐＪＬ１８１の組み立て プラスミドＰＪＬ１２０およびｐＪＬ１２１の代りにプ
ラスミドｐＪＬ１８０およびＰＪＬ１８１　ＤＮＡ（実
施例８Ｃから得たもの）の混合物を使用する他は実施例
７と実質的に同様にして表記の組み立てを行なった。得
られた形質転換体コロニーを１期待した表現型（Ａｍｐ
Ｒ−ＴｅｔＳ、　ＣＭＲ）　Ｋライて検査、選択した所
、所望のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−
／ｐＪＬｔｓｏおよびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ
６００Ｒｋ−／ＰＪＬ１８１形質転換体を形成していた
。既知の方法でアンピシリンおよびクロラムフエニコド
の制限酵素およびＡＧＥ分析により、常法に従って確認
した。この同定した形質転換体は、既知の方法により、
プラスミドＰＪＬ１ｓｏおよびｐＪＬ１８１の単離およ
びその後の生産に使用することかできる。

実施例１０　プラスミドＰＪＬ１２５の組み立てＡ、プ
ラスミドｐＪＬ１２１のＳａｌ　Ｉ消化および〜１０．
２　ｋｂ　Ｓａｌ　ｌフラグメントの単離プラスミド５
ｃｐ２　　の代りにプラスミドｐＪＬ１２１　を使用し
、消化完了前に反応を停止する以外は実施例８と同様に
して表記の消化を行なった。

得られたＳａｌ　ｌ制限フラグメントはプレパラティブ
ＡＧＨによって分離することなく、標準的なエタノール
沈殿法によって沈殿させた。この制限フラグメントをＴ
　Ｅ緩衝液に溶解し、直ちに結合させた。

ＩＳ、　　プラスミドＰＪＬ１２１の〜１０．２　ｋｂ
　ＳａＬ　ｌフラグメントの結合 ｐＢＲ３２５およびプラスミド５ＣＰ２ｘのＳａｌ　ｌ
　７ラグメントの代りにプラスミドｐＪＬ１２１σ）　
Ｓａｔ　１フラグメントを使用する他は実施例８Ｃと実
質的に同様にして表記の結合を行なった。得られた結合
ＤＮＡは所望のプラスミドｐＪＬ１２５と１２のその他
のプラスミドを構成しており、これらを単離しり所、ｐ
ＪＬ１２１のＳａｌ　ｌ制限フラグメントを含んでいる
ことがわかった。常法により単離した、プラスミドｐＢ
Ｒ３２５からの複製起源およびプラスミドＳＣＰ　２”
の〜５．４　ｋｂ複製起源含有ＥｃｏＲ１−５ａｌ　ｌ
　フラグメントを含有しているプラスミドｐＪＬ１２５
は、−ｒＥ緩衝液に溶解し、使用するまで４℃で貯蔵し
た。プラスミドＰＪＬ１２５の制限部位地図を第４図に
示した。この制限部位地図は、形質転換したＥ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｋ１２　Ｃ５ＱＱＲｋ−Ｍｋ−からのプラスミド
で決定した。

実施例１１　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒ１（
−Ｍｋ−／ｐ　、Ｉ　Ｌ　１２５の組み立て プラスミドｐＪＬ１２０およびｐＪＬ１２１の代りにプ
ラスミドｐＪＬ１２５を使用する他は実施例７と実質的
に同様にして表記の組み立てを行なった。

得られたコロニーを期待した表現型（Ａｍｐ　−Ｔｅｔ
”’、ＣＭＳ　）について検査、選択した所、所望のＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒｋ　Ｍｋ−／ＰＪＬ１
２５形質転換体を構成していた。この転質転換体の同定
は、ＥｃＫａ　ｒｄ　ｔの方法（１９７８、プラスミド
１：５８４）およびＫｌｅｉｎらの方法（１９８０、プ
ラスミド３：８８）により、ＡＧＦ、および制限分析に
よって更に確認した。この形質転換体は、既知の方法に
よるプラスミドＰＪＬ１２５の単離およびその後の生産
のために、常法に従って培養した。

実施例１２　プラスミドｐＪＬ１９０の組み立てＡ、プ
ラスミドＰＪＬ１２１のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｌｌ
消化および〜１９．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−１−ｋｉｎ
ｄ　■７ラグメプラスミドｐＪＬ１２１ＤＮＡ約２００
μ１（８０μハ、ＢＳＡ（１ｍｙ／ｍｅ）３０ｔｔｚ−
Ｈｉｎｄｆｆｌ制限酵素（２００ＢＬＬ単位含有）４０
μｚおよび１（ｉｎｄ　Ｉｌ１反応ミックスｘ１）３０
μｅを３７℃で約３時間、次いて６５°Ｃで１０分間イ
ンキュベートした。反応混合物３００Ｉｌｌを４℃に冷
却し、ｌ　Ｑ　Ｘ　Ｈｉｎｄ　１ｌｌ−Ｅｃｏ　ＲＩ希
釈反応ミックスＸ２）１１０μｌおよびＥｃｏ　ＲＩ制
限酵素３０μ１（３００ＢＲＬ単位含有）を追加し、３
７°Ｃで３時間、次いで６５℃で１０分間インキュベー
トし一４℃に冷却した。得られた〜１９．□　ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ｌ［制限フラグメントを、常法に
よりＡＧＥ／ＤＥ５２／＊気溶出によって単離した。所
望のＤＮＡを゛［Ｅ緩衝液に溶解し、使用するまで４℃
で貯蔵した。

×ｌ’））ｌｉｎｄ■反応ミックスは以下の成分で調製
した；６０ｍＭトリス、−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）−５０
０ｍＭＮａＣ４＋、６０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜×２）　
Ｈｉｎｄ　Ｎ　−Ｅｃｏ　ＲＩ希釈剤は以下の成分で調
製した：３８２ｍＭｌ−リスーＨＣ／　ｊ　ｐ）ｉ　７
．５　）、５０ｍＭ　ＮａＣ１，２２ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ
！２Ｂ、プラスミ）’　ｐＬＲ４（Ｄ　ＥｃｏＲｌ　−
Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ消化およヒ〜７．７　ｋｂ　Ｅｃｏ　
Ｒ１−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩフラクメントの単離 プラスミドｐＪＬ１２１の代りにプラスミドｐＬＲ４を
使用する他は実施例１２Ａと実質的に同様にして表記の
消化および単離を行なった。所望の〜７、７　ｋｂフラ
クメントをＴ　Ｅ緩衝液に溶解し、使用するまで４℃で
保存した。

Ｃ、プラスミドｐＪＬ１２１の〜１９．Ｑ　ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲｌｌｌｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントおよびプラスミ
ドｐＬＲ４の〜７．７　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｈｌｎ
ｄ　■７ラグメントの結合プラスミド５ＣＰ２”）６．
０ｋｂＳａｌ　Ｉ　フラグメントおよび５ａｌｌ’消化
ｐＢＲ３２５の代りにプラスミドｐ　、Ｊ　Ｌ　１２１
の〜１９．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　■７　ラ
クメントおよびプラスミドｐＬＲ４の〜７．７　Ｅｃｏ
Ｒｌ　−ｆ（ｉｎｄ　ＩＩＩフラクメントを使用する他
は実施例８Ｃと実質的に同様にして表記の結合を行なっ
た。得られた結合ＤＮＡは所望のプラスミドｐＪＬ１９
０を構成しており、これは使用するまで４°Ｃで保存し
た。プラスミドＰＪＬ１９０の制限部位および機能地図
を第４図に示す。この制限部位地図は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−に形質導入し
たプラスミドから決定した。

実施例１３　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００
Ｒｋ−／ｐＪＬ１９０の組み立て プラスミドｐＪＬ１２０およびＰＪＬ１２１の代りにプ
ラスミドｐＪＬ１９０を使用する他は実施例７と実質的
に同様にして表記の組み立てを行なった。

得られたコロニーを期待した表現型（Ａ１１１ＰＲ１Ｔ
ｅａＳ）について検査、選択し、常法（実施例１１に記
載）によりサイズ（寸法）を決めた所、所望のＥ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６Ｃ６００Ｒｋ　／ＰＪＬ１９０
形質転換体を構成していた。既知の方法でプラスミドｐ
ＪＬ１９０　を単離し、その後の生産を行なうために、
この形質転換体を常法に従って培養した。

実施例１４　プラスミドＰＪＬ１９２の単離抗生物質ネ
オマイシン（Ｉ　Ｑ　ｔｔｙ／ｍｅ　）に対する強い耐
性を付与するプラスミドｐ　Ｊ　Ｉ−１９２は、Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｐｅｏｒｉａ。

１１１ｉｎｏｉｓ　）に寄託番号１５０４０て寄託され
、その永久保存培養コレクションの一部となっているＥ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６Ｃ６００Ｒｋ−／ＰＪＬ１９
２から常法に従って分離することができる。プラスミド
ｐＪＬ１９２の制限部位地図は、第４図に示したプラス
ミドＰＪＬ１９０の地図と区別がつかない様である。

実施例１５　プラスミドＰＪＬ１９５の組み立てＡ、プ
ラスミドｐＪＬ１２５のＥｃｏＲｌ　−５ａｌ　ｌ消化
およ（ｊ〜５．４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　
７ラグメントの単離 プラスミドＰＪＬ１２１およびＨｉｎｄｕ制限酵素およ
び反応ミックスの代りにプラスミドｐＪＬ１２５および
Ｓａｌ　ｌ制限酵素および反応ミックスを使用する他は
、実施例１２Ａと実質的に同様にして表記の消化および
単離を行なう。更に、Ｓａｌ　Ｉ　−Ｅｃ。

ＲＩ希釈剤ｘ１）を使用した。得られた〜５．４　ｋｂ
　Ｅｃ。

ＲＩ−５ａｌ　ｌフラグメントをＴＥ緩衝液に溶解し、
使用するまで４℃で保存した。

×ｌ　）　Ｓａｌ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ希釈剤は以下の成分
で調製した：９４０ｍＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７，５）
、５５ｍＭＢ、プラスミドｐＬＲ４のＥｃｏＲＩ一部分
的Ｓａｌ　ｌ消化および〜７．５　ｋｂ　Ｅｃｏ旧一部
分的Ｓａｌ　ｌフラグメントの単離 ＰＪＬ４２１の代りにプラスミドｐ　Ｌ　Ｒ４を使用す
る他は実施例１２Ａと実質的に同様にしてＳａｌ　ｌ消
化を行なった。部分的Ｓａｌ　ｌ消化が目的であるので
、得られた混合物を先ず３７°Ｃて１５分間、次いて６
５℃で１０分間インキュベートした。４°Ｃに冷却した
後、得られた部分的Ｓａ１１〜７．７ｋｂ直鎖フラグメ
ントを常法に従ってＡＧＥ／ＤＥ５２／電気溶出によっ
て単離した。所望のＤＮＡを゛ｒＥ緩衝液に溶解し、Ｓ
ＣＰ　２　　のＳａｌ　ｌフラグメントの代りに上記フ
ラグメントを使用する他は実施例６Ａと実質的に同様に
して、　ＥｃｏＲ１制限酵素で消化した。所望の〜７．
５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−５ａｌ　Ｉ　７　ラグメント
（最も大きいＥｃｏ　ＲＩ　７Ｓａｌ　ｌフラグメント
）をＡＧＥ／ＤＥ５２／電気溶出によって単離し、−ｒ
　Ｅ緩衝液に溶解し、使用するまて４°Ｃ１で保存した
。

Ｃ，プラスミドＰＪＬ１２５の〜５．４　ｋｂ　Ｅｃｏ
Ｒｌ　−５ａＪ　ｌフラグメントとプラスミドｐＬＲ４
の〜７．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ一部分的Ｓａｌ　ｌフラグ
メントの結合プラスミド５ＣＰ２ｘの〜６．（ｌ　ｋｂ
　Ｓａｌ　ｌ　７ラグメントおよびＳａｌ　Ｉ消化ｐＢ
Ｒ３２５の代りにプラスミドＰＪＬ１２５の〜５．４　
ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−８ａｌ　ｒ　　７　ラグメントお
よびプラスミドｐＬＲ４の〜７．５　ｋｂ　Ｅｃ。

Ｒ１一部分的Ｓａｌ　ｌフラグメントを使用するほかは
実施例８Ｃと実質的に同様にして表記の結合を行なった
。得られた結合ＤＮＡは所望のプラスミドｐＪＬ１９５
を構成しており、これは使用するまで４℃で保存した。

プラスミドｐＪＬ１９５の制限部位地図を第５図に示し
た。この制限部位地図は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒｋ−から単離した
プラスミドで決定した。

実施例１６　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６０
０Ｒｋ−／ｐＪＬ１９５の組み立て プラスミドＰＪＬ１２０およびｐＪＬ１２１の代りにプ
ラスミドｐＪＬ１９５を使用する他は実施例７と実質的
に同様にして所望の組み立てを行なう。得られたコロニ
ーを期待された表現型（ＡｍｐＲ＝　Ｔｅ　ｔ　”およ
びサイズ（実施例１１に記載）番こつＧ１て試験した所
、所望のＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒ％（”ｋ
　　／ＰＪＬ１９５形質転換体を構成しても）た。既知
の方１去でプラスミドｐＪＬ１９５を単離し、その後の
生産を行なうため、この形質転換体を常法番こより培養
した。

実施例１７　プラスミドｐＪＬ１１４の組み立てＡ、プ
ラスミド５ＣＰ２の部分的ＢａｍＨ１消イヒプラスミド
５ＣＰ２　　およびＥｃｏＲＩ　制ｉ艮酵素および反応
ミックスの代りにプラスミド５ｅｐ２＋Ｎｏｒｔｈｅｒ
ｎ　　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａ丁ｃｈ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　（Ｐｅｏｒｉａ　、　ｌ１ｌｉｎ
ｏｉｓ　）に寄託、番号１５０４２で寄託され、その永
久保存培養コレクションの一部となっているＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）力
）ら、実施例１の方法に従って単離したもの）、Ｂａｍ
Ｈ１制限酵累および反応ミックス７１）を使用する他Ｃ
ま実施例６Ａと実質的に同じ方法で表記の消化を行なっ
た。所望のＤＮＡは使用するまて４°Ｃで保存した。

・）×１　’）　Ｒａｍ　）−ＩＩｌ制限酵素ための反
応ミ゛ンクスＣよ以下の成分から調製した：１０００ｍ
ＭトリスーＨＣ１（ＰＨ７，４）、１００　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｚ２Ｂ、ＢａｍＨＩ消化プラスミド５ＣＰ２およびＢ
ａｍ用消化プラスミドｐＢＲ３２２の結合 プラスミド５ＣＰ２ｘおよびＰＢＲ３２５の代りにプラ
スミド５ＣＰ２のＢａｍＨＩ　　消化物（実施例１７Ａ
で調製）およびＢａｍＨＩ−消化プラスミドｐＢＲ３２
２（実施例４Ｂで調製）を使用する他は実施例６Ｃと同
様に操作して表記の結合を行なう。得られたＤＮＡは４
°Ｃで保存した。これは所望の〜３４．６ｋｂプラスミ
ドＰＪＬ１１４を構成していた。

実施例１８　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒｋ
−１ｖｌｋ−／ＰＪＬ１１４の組み立て プラスミドＰＪＬ１２０およびＰＪＬ１２１の代りにプ
ラスミドＰＪＬ１１４を使用する他は実施例７と実質的
に同様にして表記の組み立てを行なった。得られたコロ
ニーを、期待される表現型（ＡｍＰＲ１Ｔｅｔ５）につ
いて検査、選択した所、所望のＥ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒｋ’ｋ　／ＰＪＬ１１４
形！転換体を形成転換体た。既知の方法で、アンピシリ
ン耐性でテトラサイクリン感受性のコロニーを単離して
培養し、常法により、構成プラスミドの制限酵素および
アガロースゲル電気泳動分析により、同定した。

分析の結果、実施例１７Ａに記載した消化の結果、５Ｃ
Ｐ２のＢｇｌ　ｆｌ制限部位の１つだけがＢａｍＨＩ制
限酵素によって切断されたことがわかった。

これはめったにないことで、繰り返されることがなかっ
たから、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６００Ｒｋ’ｋ　　
／ｐＪＬ１１４は前記Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託番
号Ｂ−１５０３９で寄託された。

これは永久保存培養コレクションの一部となっている。

この株は、プラスミドｐＪＬ１１４の好ましいソースお
よび貯蔵源として利用することができる。プラスミドＰ
ＪＬ１１４の制限部位地図を第５図に示す。

実施例１　ｇ　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓ
ｅｏｆｕｓｃｕｓ　／ＰＪＬ１２０の組み立て Ａ、プロトプラスト調製の為のカルチャーの育成 この株を０．４％グリシンを補足したＴ　Ｓ　Ｂ中、３
０℃で２０時間、液中条件下で生育させることにより増
殖接種物を常法通り調製した。培養をホモジナイズし、
同じ培地に１／２０希釈で接種し、３０℃で１８時間生
育させた。

Ｂ、形質転換 プラスミドＰＪＬ１２０ＤＮＡ約２０μノおよびＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　−ｒｙｐｅＣｕｌ　【ｕｒｅ　　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ、　　ＲｏｃＫｖｉｌｌｅ　、Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ　　　に寄託され、その永久保存培養コレク
ションの一部となっている。寄託番号ＡＴＣＣ２３９１
６で一般に利用可能である。）のＩ　Ｘ　１０’プロト
プラストを使って、国際特許公開番号ＷＯ７９１０１１
６９（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＢＧ　７９１０００９
５　）の実施例２の方法で所望の形質転換を行なった。

Ｃ０選択 低い頻度の形質転換であっても、これを分析すルタメに
、２つの方法を採用した。

（１）　　ポック−分析 再生プロトプラストの融合性ローン（ｌａｗｎｓ）を含
有する再生プレートから、胞子を次の様に採取した。プ
レートに約１０　ｍｅの滅菌蒸留水を加え、培養の表面
をループでゆっくりとかき取り、胞子をはかした。得ら
れた胞子懸濁液を２０，００　Ｑ　ｒｐｍで１０分間遠
心分離した。上澄液を捨て、残った胞子ペレットを２０
％（ｖ／ｖ　）グリセリンＱ、　３　ｍｅに再懸濁した
。順次、この胞子懸濁液０．　ｌ　ｍｅを２０％（Ｖ／
Ｖ　）グリセリン０．９＋ｎｅに移すことによって、１
０−５までの連続希釈液を調製した。生育力が多少損な
われるがこの胞子は一２０℃で貯蔵することができる。

採取した各プレートの連続希釈液の一定のもの（例えば
１０−１．１０−２．１０−’）から約Ｑ、　ｌ　ｍｅ
をに２培地（ＨｏｐｗｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ。

１９７８　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１６２：３０）プレート（
これは、融合性ローンを産生ずるに十分なだけの、もと
の形質転換操作に使用したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓの胞子を持っている）に移し
た。この操作は、ＹＭＸ寒天（０，５％酵母エキス、０
．５％麦芽エキス、０．１％デキストロースおよび２％
寒天）で置き換えても行なうことができる。形質転換体
は、典型的には、３０℃で３日間発育させた後、ローン
内に発現し得る形でプラスミドを含有している胞子によ
って発現される性質、「ポック」の外観から検出するこ
とができる。この形質転換体は、常法により、ポックの
中央から胞子を、ＹＭＸ培地（Ｈｏｐｗｏｏｄ　１　ｇ
　６７、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅ
ｗ、　３１　：３７３　）の寒天平板につまみ取ること
により回収した。

（２）　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｃ６０Ｃ６００Ｒ
ｋへのもどし形質転換 （１）と同様にして胞子を集め、０．４％グリシンを補
足した一ｆｓＢ５０ｍｅに接種する。３０°Ｃで２０時
間培養し、細胞を採取し、ＤＮＡを単離する。

Ｃ５ｃ、およびプロピジウムヨージドを用いた遠心分離
を省略する他は実施例ＩＢと同様にして単離を行なう。

次いでこのＤＮＡ５０μｌを使って、実施例７Ｂに記載
した様にＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ｃ６００ｉｋ−Ｍｋ
−を形質転換する。形質転換中のプラスミドは、実施例
１１と同様に、常套手段で同定、確認した。

ＰＪＬ１１４、Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　／
ｐ　Ｊ　Ｌ　１２１、Ｓ。

ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　／ｐＪＬ１２５、Ｓ、　ｇ
ｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　／ＰＪＬ１８０およびＳ　、
　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　／ｐ　Ｊ　Ｌ　１８１の
組み立て プラスミドＰＪＬ１２０の代りにプラスミドｐＪＬ１１
４、ＰＪＬ１２１、ＰＪＬ１２５、ＰＪＬ１８０おヨヒ
ＰＪＬ１８１　を個々の組み立てに使用する以外は実施
例２０と実質的に同様にして、それぞれ個々、別々に表
記の組み立てを行ない、選択し、回収した。

実施例２１　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ　／ＰＪＬ１９０の組み立て Ａ、形質転換 プラスミドｐＪＬ１２０の代りにプラスミドｐＪＬ１９
０　を使用する他は実施例１９Ｂと実質的に同様にして
、表記の形質転換を行なった。

Ｂ１選択 再生プロトプラストに、最終プレート濃度を１μｙ／ｎ
ｔにするに十分な量のネオマイシンを含有しているＲ２
培地トップ寒天を積層することにより、所望の形質転換
体をネオマイシン耐性について選択した。次いで、得ら
れたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏ−ｆｕｓ
ｃｕｓ／ｐＪＬ１９０形質転換体を、実施例２０Ｂの方
法と実質的に同様にして、期待されるポック形態につい
て試験した。

実施例２２Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆ
ｕｓｃｕｓ　／ＰＪＬ１９５の組み立て プラスミドｐＪＬ１９０の代りにプラスミドｐＪＬ１９
５　を使用する他は実施例２１と実質的に同様にして所
望の組み立てを行ない、選択し、回収した。

実施例２３　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅ
ｏ［ｕｓｃｕｓ　／ｐＪＬ１９２の組み立て プラスミドｐＪＬ１９５および最終プレート濃度を１μ
ｙ　／ｍｅとするに十分な量のネオマイシンを含有する
トップ寒天の代りにプラスミドＰＪＬ１９２および選択
過程において最終プレート濃度を１０μ２／ｍｅにする
に十分な量のネオマイシンを含有するトップ寒天を使用
する他は実施例２２と実質的に同様にして表記の組み立
て、選択、回収を行なつた。

実施例２４　　Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆ　ｒａ
ｄｌａｅ　／　ｐ　ＪＬＩ　２Ｑ、Ｓ、　ｆｒａｄｉａ
ｅ／ｐＪＬ１１４、Ｓ−ｆｒａｄｉａｅ／ｐＪＬ１２１
゜Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ／ｐＪＬ１２５、Ｓ、　ｆｒａ
ｄｉａｅ／ｐＪＬ１８０、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ／ｐＪＬ
１８１、Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ　／ＰＪＬ１９０、Ｓ、
　ｆｒａｄｉａｅ／ｐＪＬ１９５、Ｓ、　ｆｒａｄｉａ
ｅ／ｐＪＬ１９２の組み立て Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓの代りにＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅを使用する他は、それぞ
れ実施例１９．２０．２１．２２および２３と実質的に
同様にして１表記の組み立て、選択および回収を個々別
々に行なった。更に、Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅのプロトプ
ラスト−化および生育のための゛ｒＳＢ培地を改変し、
わずか０．２％のグリシンを含有する様にした。

実施例２５　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄ
ａｎｓ／ｐＪＬ１２０、Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ／ｐＪ
Ｌ１１４、Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ／ｐＪＬ１２１、Ｓ、
　ｌ１ｖｉｄａｎｓ／ｐＪＬ１２５、Ｓ、　１ｉｖｉｄ
ａｎｓ／ｐＪＬ１８０、Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ／ｐＪ
Ｌ１８１、Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ／ｐＪＬ１９０、Ｓ
、１ｉｖｉｄａｎｓ／ｐＪＬ１９５およびＳ、　ｌ　１
ｖｉｄａｎｓ　／ｐＪＬ９２ Ｓｏｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓの代りにＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ｌ１ｖｉ−２０、 ｄａｎｓを使用する他はそれぞれ実施例１９、△２１．
２２および２３と実質的に同様にして、表記の組み立て
、選択、および回収を個々別々に行なった。

更に、Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓをプロトプラスト化し、生
育させるための培地として国際特許公開ｌｌ＆１ｌＷｏ
　７９１０１１６９（国際特許出願１＆ＰＣＴ／ＢＧ７
９１０００９５号）の実施例２に記載のものを使用した
。

実施例２６　抗生物質ネオマイシンに対する強い耐性を
付与するプラスミドＰＪＬ１９２突然変異体の単離 実施例２１に従ってＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉ
ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ／ＰＪＬ１９０を単離した。各種濃
度のネオマイシンを補足した栄養寒天上のコロニーの増
殖を分析することにより、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕ
ｓ／ｐＪＬ１ｇ□は１，０μｙ　／ｍｅのネオマイシン
に対して耐性を示すことがわかった。Ｓ、　ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓを、常法通り、１０μｆ　／ｍｅのネオ
マイシンを補足した栄養寒天プレートに広げた。この高
濃度のネオマイシンの存在下で生育するコロニーが見つ
かった。分析を繰り返すことにより、このコロニーは上
記耐性を示すこトカ証明すレ、Ｓ　、　ｇｒｉ　５ｅｏ
ｆｕｓｃｕｓ　／ｐ　Ｊ　Ｌ　１９２と命名された。こ
のプラスミドＰＪＬ１９２を、実施例１９Ｃに記載した
様に、もどし形質転換によってＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２
　Ｃ６００Ｒｋ　’に−に移した（ｓｈｕｔｔｌｅ’）
。

ＰＪＬ１９２の制限部位地図は、ＰＪＬ１９０と区別で
きない様である。

実施例２７　抗生物質ネオマイシンに対する強い耐性を
付与するプラスミドｐＪＬ１９９突然変異体の単離 Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　／ｐＪＬ１９０の代
りにＳ　ｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｆｕｓ
ｃｕｓ　／ｐ　Ｊ　Ｌ　１９５　（実施例２２で製造）
を使用する他は実施例２６と実質的に同様にして表記の
単離を行なった。ネオマイシンに対して強い耐性を示し
たコロ＝−はＳ、ｇｒｉｓｅ□ｆｕｓｃｕｓ　／ｐ　Ｊ
　Ｌｉ２Ｏと命名された。このプラスミドｐＪＬ１９９
を、実施例１９Ｃに記載した様に、もどし形質転換によ
ってＥ、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋ　ｌ　２　ｃ５００　Ｒｋ−
Ｍｋ−に移した（ｓｂｕｔｔｌｅ　）。ｐＪＬ１９９の
制限部位地図はｐＪＬ１９５と区別できない様である。

プラスミドｐＪＬ１９５のｐＬＲ４−誘導ネオマイシン
耐性付与フラグメントの代りにプラスミドＰＪＬ１９２
のネオマイシン耐性付与フラグメント（実施例１５およ
び２７て調製）を使用すること番こよって、プラスミド
ｐＪＬ１９９を常法に従って組み立て得ることは当業者
には明らかであろう。この様な置き換えによっても所望
のプラスミドｐＪＬ１９９　が得られる。

実施例２８　プラスミドＰＬＲ２の組み立てＡ、　　ブ
ラフ、ミＦｐＩＪ６の）ｌｉｎｄＩ［ｒ消化プラスミｌ
’　ｐｌ　Ｊ　６　ＤＮＡ　（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎ
ａ（ｕｒｅ２８６：５２５．１９８０に記載されている
）約２０μｌ（ｚｏｐｙ　）、ＢＳＡ（牛血清アルブミ
ン、１　ｍｙ／ｍｅ　’）５１１１、水１　ｇ　ｐｌ　
、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ制限酵素　（３ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ単位）１μｌ、反応ミックスｘ
ｘ５μｌを３７℃で２時間インキュベートした。４Ｍ酢
酸アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２０
０μｅを加えて反応を停止させた。得られたＤＮＡ沈殿
物を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧下で乾燥し、
ＴＥＩ衝液２０μｌに懸濁し、−２０℃で冷凍して保存
した。

Ｂ、プラスミドＰＢＲ３２２ｃ７’）Ｈｉｎｄ　■消イ
しプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ約８μｌｃ４μノ）、
反応ミックス５ｐｐ−ＢＳＡ（１ｍｅ／ｍｅ）！５ｐｐ
、、水３１ｐｅ、およびＨｉｎｄｌｌ制限酵素１ｐｅを
３７°Ｃで２時間インキュベートした。６０°Ｃで１０
分間インキュベートして反応を停止させ、酢酸アンモニ
ウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００μｌを添
加した。得られたＤＮＡ沈殿物を７０％エタノ−Ｊしで
２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μＥに懸濁した。

Ｃ，１４ｉｎｄｌ’ｌで消化したプラスミドｐＩＪ　６
およびｐＢＲ３２２の結合 ■ｎｃｌＩＩ［処理プラスミドｐＩＪ　６　（実施例２
Ａカ１ら）約２０　ｐｚ、Ｈｉｎｄ■処理プラスミドｐ
ＢＲ３２２（実施例２Ｂから）　２０１１１．ＢＳＡ（
１ｍｙ／ｍｅ）５１１１、−ｒ４ＤＮＡリガーゼｘ１μ
ｌ、および結合ミックス７７５μｌを１６℃で４時間イ
ンキュベートした。４Ｍ酢酸アンモニウム約５０μｌお
よび９５％エタノール２００μＥを加えて反応を停止さ
せた。得られたＤＮＡ沈殿物を７０％エタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥し、Ｔ　Ｅ緩衝液に懸濁した。懸濁し
たＤＮＡは所望のプラスミドＰＬＲ２を構成していた。

実施例２ｇ　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ／Ｐ
ＬＲ２の組み立て 冷凍したコンピテント濁Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢＩ
ＯＩ細胞（ＢｏｌｉｖＢｒら、Ｇｅｎｅ　２　：　７５
−９３．１９７７’）約１０−を遠心分離してペレット
化し、０．ＯＩＭ塩化ナトリウム約ＩＱｍｅに懸濁した
。次いで細胞を再びペレット化し、０．０３Ｍ塩化カル
シウム約ｌＱｍ＋！に再懸濁し、氷上で２０分間インキ
ュベートし、３回目のペレット化を行ない、最後に０．
０３Ｍ塩化カルシウム１．２５□ｅに再懸濁した。得ら
れた細胞懸濁液は次の形質転換についてコンピテントで
あった。

Ｔ　Ｅ緩衝液中のプラスミドＰＬＲ２（実施例２Ｃで調
製）をエタノール沈殿させ、３ＱｍＭ塩化カルシウム溶
液１５０μｌに懸濁し、試験管内でコンピテントＥ、　
ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ｆ（Ｂ　１０１細胞約２００μｌと
ゆっくり混合した。得られた混合物を氷上で約４５分間
、次いで４２℃で約１分間インキュベートした。次いで
アンピシリン５０μＱ　／ｍｅを含有するし一ブロス約
３　ｍｅ　（Ｂｅｒｔａｎｉ　、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ６２：２９３）を添加した。この混合物を３
７°Ｃで１時間振盪してインキュベートし、アンピシリ
ンを含有するＬ−寒天（Ｍｉｌｌｅｒ＝　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｓＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　）にプレートした。生存コロニーを期待
した表現型（ＡｎＩＰＲ５’ｆ’ｅ　ｔ　５）について
検査、選択した所、所望のＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２１（
ＢＩＯＩ／ＰＬＲ２形質転換体を構成していた。

以上の方法で組み立てられる代表的なプラスミドおよび
形質転換体には、以下の表１および２に示すものか含ま
れる。

表２１代表的形質転換体 １．　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｒ／ｐＲ’　（こ
こで、ｋはｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　、　ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ　−ｆｒａｄｉａｅまたは１ｉｖｉｄａｎ
ｓ−Ｒ’はそれぞれＰＪＬ１２２、ＰＪＬ１２３、ＰＪ
Ｌ１２４、ＰＪＬ１２６、ＰＪＬ１７６、ｐＪＬ１２０
０、ｐＪＬ１２旧、ｐＪＬ１２０２、ＰＪＬ１２０３、
ＰＪＬ１２０４、ＰＪＬ１２０５、ＰＪＬ１２０６、Ｐ
ＪＬ１７０６、ＰＪＬ１８００、ｐＪＬ１８０１、ＰＪ
Ｌ１９００、ＰＪＬ１９０２、ＰＪＬ１９０５、ｐＪＬ
１９６、ＰＪＬ１９７、ＰＪＬ１９０７、ｐＪＬ１９８
、ｐ１１ＪＬ２１２またはｐＨＪ２１３である）。

２、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｒ／ｐＲ（ココでＲ
は０６００ｋｋ−Ｍｋ−１２９４、Ｃ６００またはＲＶ
３０８、ｋｌは上記と同意義である）。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図はそれぞれプラスミド５ｃｐ２並びに５
ｃｐ２　　の、プラスミドｐ　Ｊ　Ｌ　１２０　　並び
にＰＪＬ１２１の、プラスミドＰＪＬ１８ｏ並びにｐＪ
Ｌ１８１の、プラスミドＰＪＬ１２５並びにｐＪＬ１９
０の、およびプラスミドＰＪＬ１９５並ひにｐＪＬ１１
４の、制限部位地図である。 ＦＩＧ、　１ ＳＯＦ２および！ＩＣＰｉ会 ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ−３ ＪＬ１８０ ＪＬ１８１ ＦＩＧ、４ ＪＬｔ２５ ＪＬ１９０ 第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／４６５）　　　　　　　　　６７６０−４
８（Ｃ１２Ｑ　　１１０４　　　　　　　　　　−アメ
リカ合衆国４６２６０インデイ アナ・インディアナポリス・マ イクセル・ドライブ７０２３番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）プラスミド５ＣＰ２または５ｃｐ２°の、複
   製の機能的起源を含有している制限フラグメント、 （ｂ）大腸菌複製起源を含有している制限フラグメント
   、 （Ｃ）大腸菌の細胞に導入された時、少なくとも１種の
   抗生物質に対する耐性を付与する１種もしくはそれ以上
   のｌ）　Ｎ　Ａセグメント（ただし該細胞は、耐性が付
   与されるその抗生物質に対して感受性を有する）、およ
   び （ｄ）ストレプトマイセスの細胞に導入された時、少な
   くとも１種の抗生物質に対する耐性またはストレプトマ
   イセス・トラ（ｔｒａ）機能のいずれかまたは両者を独
   立して付与する１種またはそれ以上のＤＮＡセグメント
   （ただし該細胞は、耐性が付与されるその抗生物質に対
   して感受性を有する）、を含有してなる組換ＤＮＡクロ
   ーニングベＩクター。 ２プラスミドである第１項に記載のベクター。 ３、プラスミド５ｃｐ２または５ＣＰ２”の制限フラグ
   メントが〜５，４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−５ａｌ　１７ラグ
   メント、〜５．Ｑｋｂ　Ｓ　ａ　ｌ　Ｉ　７ラグメント
   、〜１９ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ　ｍ　７ラグメ
   ントまたは〜３１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ７ラグメントである
   第１項または第２項に記載のベクター〇 ４、大腸菌複製起源がｐＢ艮３２２複製起源、ＰＢＲ３
   ２４複製起源、ｐＢＲ３２５複製起源、ｐＢＲ３２７複
   製起源またはｐ　ＢＲ３２８複製起源である第１項〜第
   ３項のいずれかに記載のベクター。 ５、大腸菌において耐性を付与する１種またはそれ以上
   のＤＮＡセグメントが、アンピシリン、クロラムフェニ
   コールまたはテトラサイクリンに対して耐性を付与する
   ＤＮＡセグメントである第１項〜第４項のいずれかに記
   載のベクター。 ６、ストレプトマイセスにおいて耐性を付与する１種ま
   たはそれ以上のＤＮＡセグメントがネオマイシン−また
   はチオストレプトンに対して耐性を付与するＤＮＡセグ
   メントである第１項〜第５項のいずれかに記載のベクタ
   ー。 ７、プラスミドＰＪＬ１８０、ＰＪＬ１８１、ＰＪＬ１
   ２５、ＰＪＬ１９０、ＰＪＵ１９ｇ、ＰＪＬ１９５、Ｐ
   ＪＬ１９９、ＰＪＬ１２２、ＰＪＬ１２３、ＰＪＬ１２
   ４、ＰＪＬ１２６、ＰＪＬ１７６、ＰＪＬ１２′ＧＯ１
   ＰＪＬ１２０１、ＰＪＬ１００２１、ＰＪＬ１２０，３
   、ＰＪＬ１２０４、ＰＪＬ１２０５、ＰＪＬ１２０６、
   ＰＪＬ１７０６、ＰＪＬ１８００、ＰＪＬ１８０１、Ｐ
   ＪＬＩ　９００゜ＰＪＬ１９０２、ＰＪＬ１９０５、Ｐ
   ＪＬ１９３、ＰＪＬ１９６、ＰＪＬ１９７、ＰＪＬ１９
   ８、−ＰＨＪＬ２１２、ＰＨＪＬ２１３またはＰＪＬ１
   ９０７である第６項に記載のベクター。 ８抗生物質耐性を付与するＤＮＡ−ｐグメントがプラス
   ミドＰＪＬ１９２の〜７．７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
   ｎｄ　ＩＩ制限フラグメント、プラスミドｐＬＲ４の〜
   ７．７　ｋｂ　＆：。 ＲＩ−Ｊ（ｉ　ｎｄ　Ｎ　制限フラグメント、プラスミ
   ドｐＬＲ４（７）〜７．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ一部分的Ｓ
   ａｌ　Ｉ　制限フラグメント、プラスミドＰＬＲ２の〜
   １．３５　ｋｂ　Ｂａｍ１（Ｉ制限フラグメントまたは
   プラスミドｐＪＬ１９３の〜１ｋｂＢｃｌ　Ｉ制限フラ
   グメントである第１項〜第７項のいずれかに記載のベク
   ター。 ９ストレプトマイセスにおいて、）少なくとも１０μＦ
   ／、／の濃度のネオマイシンに対して耐性を付与するプ
   ラスミドＰＪＬ１９０またはＰＪＬ１９５強耐性突然変
   異体である第８項に記載のベクター。 １０、プラスミドＰＪＬ１１４゜ １１、プラスミドＰＪＬ１２０゜ １２、プラスミドＰＪＬ１２１゜ １３、プラスミドＰＪＬ１９２゜ １４、プラスミドＰＪＬ１９３゜ １５、プラ入・ミドＰＪＬ１９７゜ １６、プラスミドＰＪＬ１９８゜ １７、プラスミドＰＪＬ２１２゜ １８プラスミドＰＪＬ２１３゜ １９第１項〜第１８項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ
   クローニングベクターを含有する形質転換された宿主細
   胞。 ２０、ストレプトマイセス、好ましくは１ｉｖｉｄａｎ
   ｓ。 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓｌｆｒａｄｉａｅまたはａｍ
   ｂｏ　Ｅａｃ　ｉｅｎ、ｓ種のストレプトマイセスであ
   る第１９項に記載の宿主細胞。 ２１、　Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　ｋ１２である第１９項に記載
   の宿主細胞。 ２２、第３項に記載のプラスミド５ＣＰ２または５ＣＰ
   ２％　〜５．４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−５ａｌ　１または
   −５，Ｑｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ制限フラグメントを含有して
   いる制限フラグメント。 田、第８項に記載のプラスミドＰＪＬ１９２〜７，７ｋ
   ｂＥｃｏＲＩ−Ｉ（ｉｎｄ　ｍ制限フラグメントを含有
   している制限フラグメント。 ２４、（ａ）大腸菌複製起源を含有する制限フラグメン
   ト、 （ｂ）大腸菌の細胞に導入した時少なくとも１種の抗生
   物質に対する耐性を付与する１種またはそれ以上のＤＮ
   Ａセグメント（ただし該細胞は、耐性が付与される抗生
   物質に対して感受性を有する）、および ＜Ｃ＞ストレプトマイセスの細胞に導入された時、少な
   くとも１種の抗生物質に対する耐性またはストレプトマ
   イセス・トラ（ｔｒａ）機能のいずれかまたは両者を独
   立して付与する１種またはそれ以上のＤＮＡセグメント
   （ただし該細胞は、耐性が付与されるその抗生物質に対
   して感受性を有する）、を含有する１種またはそれ以上
   のＤＮＡ配列とプラスミド５ＣＰ２または５ｅｐ２鋏の
   複製の機能的起源含有フラグメントを結合させることか
   らなる組換えＤＮＡクローニングベクターの製造法。 ２５、プラスミド５ｃｐ２または５ｅｐ２Ｘ”の制限フ
   ラグメントが〜５．４　ｋ　ｂ　Ｅｃ　ｏ　ＲＩ−８ａ
   　ｌ　Ｉ　７ラグメント、〜６．Ｏｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　
   ７ラグメント、〜１９　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ
   　ＩＩ７ラグメントまたは、、３１　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ
   Ｉ　７ラグメントであり、大腸菌複製起源がｐＢＲ３２
   ２複製起源、ｐＢＲ３２４複製起源、ｐＢＲ−３２５複
   製起源、ＰＢＲ３２戒製起源土製起源ＢＲ３２８複製起
   源であり、大腸菌において耐性を付与する１種またはそ
   れ以上のＤＮＡセグメントがアンピシリン、クロラムフ
   ェニコールまたはテトラサイクリンに対して耐性を付与
   するＤＮＡセグメントであり、ストレプトマイセスに於
   いて耐性を付与する１種またはそれ以上のＤＮＡセグメ
   ントがネオマイシンまたはチオストレプトンに対して耐
   性を付与する１）　Ｎ　Ａセグメントである第２４項に
   記載の製造法。 ２６．（１）形質転換条件下で、（ａ）プラスミド５Ｇ
   Ｐ２または５ＣＰ２　　の複製起源およびＰ遺伝子含有
   制限フラグメントおよび（ｂ）該Ｐ遺伝子のＥｃｏ　Ｒ
   Ｉ　制限サイトにクローンされた非致死ＤＮＡ配列を含
   有する組換１）　Ｎ　Ａクローニングベクターをストレ
   プトマイセス細胞と混合し、次いで （２）ストレプトマイセス指示株のローン上で該ストレ
   プトマイセス細胞を生育させ、Ｍデフ２表現型を示すコ
   ロニーを選択する、 ことからなる形質転換体の検出法。 ２７、複製起源およびＰ遺伝子含有制限フラグメントが
   プラスミド５ＣＰ２　　のものである第２６項に記載の
   検出法。 あストレプトマイセス細胞および指示株が好ましくはｌ
   　ｉｖｉｄａｎｓ１ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ％ｆｒａ
   ｄｉａｅまたはａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ種である第２６
   項または第２７項に記載の検出法。 四１組換えＤＮＡクローニングベクターがプラスミ　ド
   ＰＪＬ１２０、　ｐＪＬ１２１、　ｐＪＬ１２５、　ｐ
   ＪＬ１９０、ｐＪＩ、１９２、ＰＪＬ１９５、ＰＪＬ１
   ９７、ＰＪＬ１９８、ｐＨＪＬ２１２またはＰＨＪＬ２
   １３である第２６項〜第２８項のいずれかに記載の検出
   法。