DE2827963C2

DE2827963C2 -

Info

Publication number: DE2827963C2
Application number: DE2827963A
Authority: DE
Inventors: Richard Henry Indianapolis Ind. Us Baltz; Otis Webster Greenwood Ind. Us Godfrey
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1977-07-01
Filing date: 1978-06-26
Publication date: 1987-07-23
Also published as: GB1602074A; JPS6141549B2; IE781318L; IT7825255A0; CA1105859A; FR2396082B1; IT1098354B; IE47062B1; HU189441B; AR220714A1; CH639694A5; DE2827963A1; BE868473A; IL55004A0; FR2396082A1; JPS5414580A; NL7807003A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erleichterung des Genaustauschs oder des genetischen Austauschs von Mikroorganismen der Genera Streptomyces und Nocardia durch Bildung und Stabilisierung von Protoplasten eines der Genera oder beider Genera (vgl. Anspruch 1).

Der Genaustausch ist in Kombination mit der spontanen Mutation eine natürliche Methode, mit der Mikroorganismen die Variabilität aufrechterhalten, die dazu erforderlich ist, sich an spezifische Umgebungsbedingungen anzupassen. Der Genaustausch erfolgt offensichtlich in der Natur mindestens zwischen den Vertretern der gleichen Art. Die klassischen im Laboratorium angewandten Methoden zur Bewirkung eines Genaustauschs zwischen Mikroorganismen umfassen die Konjugation, die DNA-Transformation und die Phagen-Transduktion. Der Genaustausch kann durch Genrekombination, durch Plasmidübertragung, durch Heterokaryonbildung und durch Merodiploidbildung zu der Bildung von Hybridstämmen führen. Das Auffinden von Laboratoriumsbedingungen, die einen wirksamen Genaustausch für Mikroorganismen ermöglichen, die keine wirksamen natürlichen Kopulationssysteme besitzen, können jedoch sehr zeitraubend und in einigen Fällen erfolglos sein. Die Schwierigkeiten, die man bei der DNA-Transformation antrifft, schließen physikalische und enzymatische Sperren gegen die DNA-Aufnahme, wie Zellwände und Nukleasen ein. Bei der durch Phagen vermittelten Transduktion ist eine Hauptschwierigkeit, die man bei der Entwicklung des Transduktionssystems antrifft, die Isolation und Identifikation von Viren, die für die spezifischen fraglichen Mikroorganismen ein Transduktionsvermögen besitzen. Die geringe Zahl von allgemeinen Prinzipien und der Mangel einer allgemein anwendbaren Methode, mit der ein Genaustausch bei Mikroorganismen bewirkt werden kann, hat die Entwicklung von wirksamen Methoden für den Genaustausch oder genetischen Austausch bei vielen Mikroorganismen gehindert.

Dennoch stellt der Genaustausch ein sehr wirksames Werkzeug zur Steigerung der Variabilität innerhalb einer Gruppe von Arten dar, die wirtschaftlich und therapeutisch wichtige Stoffwechselprodukte, wie Antibiotika, produzieren. Die industrielle Anwendung dieses Werkzeugs umfaßt den Aufbau von Stämmen, die spezifische Stoffwechselprodukte, wie Antibiotika, Antitumormittel, Enzyme und andere Mikroorganismenprodukte mit nützlichen Eigenschaften, produzieren, sowie die Konstruktion von Hybridarten oder -stämmen, die neue Stoffwechselprodukte mit nützlichen Eigenschaften bilden.

Eine neuere Methode zur Bewirkung des Austauschs von genetischem Material durch erzwungene Zellverschmelzung wurde mit Erfolg bei der genetischen Untersuchung einiger eukaryotischer Organismen angewandt. Der durch Zellverschmelzung verursachte Genaustausch an prokaryotischen Mikroorganismen konnte erst von Schaeffer et al gezeigt werden, wobei Fodor und Alfodi eine Methode entwickelten, die das Verschmelzen von Protoplasten und die Regeneration von Zellen des Genus Bazillus einschließt (P. Schaeffer et al, Proc. Nast. Acad. Sci. 73 [1976], 2151-2155 und K. Fodor und L. Alfodi, Proc. Nat. Acad. Sci. 73 [1976], 2147-2150).

Es wurde nunmehr gefunden, daß es möglich ist, einen durch Protoplastenverschmelzung induzierten Genaustausch bei prokariotischen Mikroorganismen des Genus Streptomyces zu bewirken. Diese Erkenntnis ermöglicht die Anwendung einer allgemeinen und damit extrem wichtigen Technik zur Erleichterung des Genaustauschs innerhalb der gleichen Art oder verschiedener Arten der wirtschaftlich wichtigen Mikroorganismen des Genus Streptomyces. Es hat sich ferner gezeigt, daß es möglich ist, einen durch Protoplastenverschmelzung induzierten Genaustausch zwischen Mikroorganismen des Genus Streptomyces und Mikroorganismen des nahe verwandten Genus Nocardia zu erzielen. Erfindungsgemäß wird auch der durch Prozoplastenverschmelzung induzierte Genaustausch zwischen anderen Genera innerhalb der Familie der Actinomycetales angestrebt.

Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, den Genaustausch innerhalb der Gruppe der Mikroorganismen des Genus Streptomyces durch Protoplastenverschmelzung oder Protoplastenfusion zu erleichtern.

Gegenstand der Erfindung ist das in Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Bevorzugte Durchführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt also ein mehrstufiges Vorgehen, das darin besteht, daß man auf die im Patentanspruch 1 angegebene Weise

1. Protoplasten bildet und stabilisiert,
2. einen Genaustausch durch Protoplastenverschmelzung bewirkt und
3. aus den verschmolzenen Protoplasten die Zellen regeneriert.

Die regenerierten Hybridstämme einschließlich der rekombinierten Stämme oder Rekombinanten werden dann bezüglich einer bestimmten und erwünschten Eigenschaft untersucht. Beispiele für erwünschte Eigenschaften oder Verhaltensweisen sind die Bildung eines bekannten Stoffwechselprodukts, wie eines Antibiotikums oder eines Antitumormittels, und dies in größerer Ausbeute oder durch einen Stamm, aus dem das Stoffwechselprodukt leichter gewonnen werden kann. Im Fall von Hybridarten oder Hybridstämmen können die erwünschten Eigenschaften das Vermögen zur Bildung neuer, nützlicher Stoffwechselprodukte oder die Fähigkeit zur gesteigerten Bildung bekannter Stoffwechselprodukte einschließen.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandte Bildung und Stabilisierung von Protoplasten kann dadurch erreicht werden, daß man

(a) Zellen unter Bedingungen züchtet, die sie gegenüber Lysozym empfindlich macht oder sensibilisiert und
(b) diese Zellen in einem hypertonischen Puffer mit Lysozym behandelt, um die Zellwände zu entfernen und Protoplasten zu bilden.

Die Entfernung der Zellwände kann dadurch erreicht werden, daß man die Zellen während mehrerer Generationen in einem Medium züchtet, das Glycin in einer unter der Inhibierungsgrenze liegenden Konzentration enthält. Das Wachstum in Gegenwart des Glycins macht die Zellwände der Streptomyces- Mikroorganismen gegen das Enzym Lysozym empfindlich (M. Okanishi et al, J. Gen. Microbiol. 80 [1974] 389-400). Obwohl Zellen, die in Abwesenheit von Glycin gezüchtet worden sind, in vielen Fällen Protoplasten bilden, werden die Protoplasten langsamer und weniger wirksam gebildet.

Das Medium kann irgendein geeignetes flüssiges Medium sein, wie eine Nährbrühe oder eine Trypticase-Soja-Brühe (TSB). Nach der Züchtung oder dem Wachstum in Gegenwart von Glycin werden die Zellen zur Bildung von Protoplasten behandelt. Dies wird üblicherweise dadurch bewirkt, daß man das Mycel wäscht und in einem hypertonischen Medium suspendiert. Geeignete hypertonische Medien enthalten beispielsweise Saccharose, Magnesiumionen, Calziumionen und Phosphationen. Das von Okanishi et al (loc. cit.) beschriebene Medium P ist ein Beispiel eines geeigneten hypertonischen Mediums. Dann gibt man (1 bis 2 mg/ml) Lysozym zu der Zellsuspension und inkubiert die erhaltene Suspension bei etwa 30 bis 37°C, bis die Protoplastenbildung vollständig abgelaufen ist (0,5 bis 2,0 Stunden). Die Beendigung der Protoplastenbildung kann mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops überwacht werden.

Die Protoplastenverschmelzung wird dadurch erreicht, daß man die Protoplasten der beiden elterlichen Organismen vermischt, um das Verschmelzen der elterlichen Protoplasten zu induzieren. Die elterlichen Organismen können Stämme der gleichen Art (Intraspezies) oder verschiedener Art (Interspezies) sein. Die Protoplastenmischung wird zentrifugiert, wonach der gebildete Protoplasten-Zentrifugenrückstand in einem geringen Volumen eines hypertonischen Puffers suspendiert wird. Die Verschmelzung und die Fusion wird dadurch gefördert, daß man die elterlichen Protoplasten mit Polyäthylenglykol (PEG) behandelt. Beispielsweise kann man zu den erneut suspendierten Protoplasten eine Lösung von Polyäthylenglykol in einem hypertonischen Puffer (vorzugsweise eine Lösung mit einer Konzentration von 40%) zusetzen. Die erhaltenen verschmolzenen Protoplasten werden auf ein hypertonisches Agrarmedium aufgebracht (z. B. auf das von Okanishi et al [loc. cit.] beschriebene Medium R2 oder ähnliche Medien).

Die Regeneration der Zellen aus den verschmolzenen Protoplasten wird dadurch erreicht, daß man die verschmolzenen Protoplasten bei einer geeigneten Temperatur auf einem hypertonischen Agrarmedium inkubiert. Die geeignete Temperatur kann von den optimalen Wachstumstemperaturen der Elternstämme abgelesen werden. Zur Bestätigung des Genaustauschs verwendet man vorzugsweise Mikroorganismen, die geeignete Genmarkierungen aufweisen, wie eine Auxotrophie oder eine Beständigkeit gegen Antibiotika.

Zu diesem Zeitpunkt ist es bevorzugt, insbesondere bei der genetischen Kreuzung von Mikroorganismen verschiedener Art, zunächst den physiologischen Wachstumszustand der Zellen zu bestimmen, der für die Protoplastenregeneration optimal ist. Die Wirksamkeit der Protoplastenregeneration kann in Abhängigkeit von dem physiologischen Zustand der Zellen vor der Protoplastenverschmelzung von <10^-⁵ bis 5 × 10^-¹ variieren. Eine am gleichen Tag eingereichte Patentanmeldung der gleichen Anmelderin P 28 27 930.3 befaßt sich mit einem Verfahren zur Bildung von Streptomyces- Protoplasten, die dazu befähigt sind, durch Regeneration in wirksamer Weise lebensfähige Zellen zu bilden. Dieses Verfahren umfaßt die Bestimmung des optimalen Zustands der Protoplastenreversion. Der optimale Zustand, d. h. der am meisten begünstigte Zustand ist die Übergangsphase zwischen der exponentiellen Wachstumsphase und der stationären Wachstumsphase.

Der am meisten begünstigte Zustand kann dadurch ermittelt werden, daß man den Wachstumszyklus der Streptomyces- Mikroorganismen überwacht. Dies erfolgt üblicherweise unter Anwendung einer Trübungsmeßtechnik und einer Überwachung der Änderung der optischen Dichte über das Absorptionsvermögen bei 600 nm (A600). Im allgemeinen unterliegen die Streptomyces-Mikroorganismen einer geringen Zelldichte (A600 von weniger als 1,5) in löslichen komplexen Medien einem relativ schnellen exponentiellen Wachstum mit Zellverdopplungszeiten von etwa 1,5 Stunden bis zu mehreren Stunden. Wenn das Zellwachstum A600-Werte von 1,5 bis 4,0 erreicht, treten die Zellen in eine Übergangsphase ein, die der stationären Wachstumsphase vorausgeht. Die Übergangsphase kann sich von 2 bis 24 Stunden erstrecken und die Zellmasse kann in Abhängigkeit von der betreffenden Art des Mikroorganismus sich während dieser Wachstumsphase um 50% bis zu dem Sechsfachen vermehren.

Dann werden die mutmaßlichen Hybridstämme einschließlich rekombinierter Stämme kloniert und genetisch unter Anwendung von Standardmethoden untersucht, um festzustellen, ob sie Gene enthalten, die von beiden Elternorganismen abgeleitet sind. Echte Hybridstämme einschließlich rekombinierte Stämme werden dann bezüglich der angestrebten günstigen Eigenschaften untersucht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für Arten der Genera Streptomyces und Nocardia geeignet, die aus Gründen der physikalischen Unverträglichkeit normalerweise für einen Genaustausch wenig oder ungeeignet sind. Die erfindungsgemäße Methode ermöglicht den Austausch und die Rekombination von Desoxyribonukleinsäure (DNA) bei sehr hohen Frequenzen. Diese Methode ist besonderes geeignet für einen Genaustausch zwischen mutierten Organismen der gleichen Art, wenngleich auch eine Genübertragung zwischen Mikroorganismen verschiedener Art erleichtert werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Entwicklung von neuen Stämmen des Antibiotika liefernden Mikroorganismus Streptomyces.

Beispielsweise ergibt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Stämme des Mikroorganismus Streptomyces fradiae Rekombinationsausbeuten von 10⁴ bis 10⁵ pro ml oder Frequenzen bzw. Häufigkeiten von 10^-⁴ bis 10^-3 pro lebensfähigem Protoplasten. In den Laboratorien der Anmelderin waren bislang durchgeführte Versuche für eine Genrekombination des Mikroorganismus Streptomyces fradiae unter Anwendung von Standardmethoden (siehe D. A. Hopwood, Bact. Rev. 31 [1967] 373-403) ohne Erfolg, indem keine Rekombinationsklone festgestellt werden konnten (d. h. weniger als 1 in 10⁷).

Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Steigerung der Wahrscheinlichkeit des spezifischen Rekombinationsereignisses bei den Mikroorganismen Streptomyces fradiae um einen Faktor von mindestens 10⁴.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch dazu geeignet, die normalerweise nicht selbst übertragbare extrachromosomale DNA (Plasmide) von einer Streptomycesart auf eine andere zu übertragen. Somit kann man unter geeigneten Bedingungen plasmid-codierte Gene für die Antibiotikasynthese oder die Antibiotikasteuerung aus einem Stamm mit einem schlechten Stoffwechselpotential für die Synthese des Antibiotikums auf einen hierfür günstigeren Stamm übertragen.

Weiterhin erstreckt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf die engverwandten Mikroorganismen des Genus Nocardia. Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, eine durch Protoplastenverschmelzung induzierte Genübertragung innerhalb der Gruppe des Genus Nocardia und zwischen der Gruppe des Genus Streptomyces und der Gruppe des Genus Nocardia zu erreichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für Streptomyces- und Nocardia-Arten von wirtschaftlicher Bedeutung. Die bevorzugten Streptomyces- und Nocardia-Arten sind jene, die Antibiotika produzieren. Beispielsweise umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung den Genaustausch bei elterlichen Organismen, die Makrolid-Antibiotika, Aminoglykosid-Antibiotika, β-Lactam-Antibiotika, Polyäther-Antibiotika oder Glykopetid-Antibiotika produzierende Stämme der Art Streptomyces oder Nocardia sind.

Streptomyces-Arten, von denen bekannt ist, daß sie Aminoglykosid-Antibiotika liefern, sind beispielsweise die folgenden: S. kanamyceticus (Kanamycine), S. chrestomyceticus (Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. microsporeus (Antibiotikum SF-767), S. ribosidificus (Antibiotikum SF-733), S. flavopersicus (Spectinomycin), S. spectabilis (Actinospectacin), S. rimosus forma paromomycinus (Paromomycin, Catenulin), S. fradiae var. italicus (Aminosidin), S. bluensis var. bluensis (Bluensomycin), S. catenulae (Catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin A), S. tenebrarius (Tobramycin, Apramycin, S. lavendulae (Neomycin), S. albogriseolus (Neomycin), S. albus var. metamycinus (Metamycin), S. hygroscopicus var. sagamiensis (Spectinomycin), S. bikiniensis (Streptomycin), S. griseus (Streptomycin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (Streptomycin), S. poolensis (Streptomycin), S. galbus (Streptomycin), S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomycin), S. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var. limoneus (Validamycine), S. rimofaciens (Destomycine), S. hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin), S. fradiae (Hybrimycine, Neomycine), S. eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), S. aquacanus (N-Methylhygromycin B), S. crystallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S. hygroscopicus (Hygromycine), S. atrofaciens (Hygromycin), S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis (Kasugamycine), S. netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Lividomycine), S. hofuensis (Seldomycin-Komplex) und S. canus (Ribosylparomamin).

Streptomyces- und Nocardia-Arten, von denen bekannt ist, daß sie Makrolid-Antibiotika produzieren, sind beispielsweise die folgenden: N. gardneri (Proactinomycin), N. mesenterica (Mesenterin), S. caelestis (Antibiotikum M188), S. platensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S. fungicidicus (Antibiotikum NA-181), S. griseofaciens (Antibiotikum PA133A, B), S. roseocitreus (Albocyclin), S. bruneogriseus (Albocyclin), S. roseochromogenes (Albocyclin), S. cinerochromogenes (Cineromycin B), S. albus (Albomycetin), S. felleus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Lankacidin, Borrelidin), S. violaceoniger (Lankacidin), S. griseus (Borrelidin), S. maizeus (Ingramycin), S. albus var. coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (Acetyl-leukomycin, Espinomycin), S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), S. griseospiralis (Relomycin), S. lavendulae (Aldgamycin), S. rimosus (Neutramycin), S. deltae (Deltamycine), S. fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomycine), S. furdicidicus (Mydecamycin), S. ambofaciens (Foromacidin D), S. eurocidicus (Methymycin), S. griseolus (Griseomycin), S. flavochromogenes (Amaromycin, Shincomycine), S. fimbriatus (Amaromycin), S. fasciculus (Amaromycin), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleandomycin), S. olivochromogenes (Oleandomycin), S. spinichromogenes var. suragaoensis (Kujimycine), S. kitasatoensis (Leucomycin), S. narbonensis var. josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), S. albogriseolus (Mikonomycin), S. bikiniensis (Chalcomycin), S. cirratus (Cirramycin), S. djakartensis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae (Tylosin, Lactenocin, Makrocin), S. goshikiensis (Bandamycin), S. griseoflavus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin), S. tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (Carbomycin), S. thermotolerans (Carbomycin) und S. albireticuli (Carbomycin).

Streptomyces- und Nocardia-Arten, von denen bekannt ist, daß sie β-Lactam-Antibiotika produzieren, sind beispielsweise die folgenden: S. lipmanii (A16884, MM 4550, MM 13902), N. uniformis (Nocardicin), S. clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), S. lactamdurans (Cephamycin C), S. griseus (Cephamycin A, B), S. hygroscopicus (Deacetoxycephalosporin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartreusis (SF 1623), S. heteromorphus und S. panayensis (C2081X); S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viridochromogenes (Cephamycine A, B); S. cattleya (Thienamycin); und S. olivaceus, S. flavovirens, S. flavus, S. fulvoviridis, S. argenteolus und S. sioyaensis (MM 4550 und MM 13902).

Streptomyces-Arten, von denen bekannt ist, daß sie Polyäther-Antibiotika produzieren, schließen beispielsweise die folgenden ein:

S. albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), S. hygroscopicus (A218, Emericid, DE3936), A120A, A28695A und B, Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. conglabatus (Ionomycin), S. eurocidicus var. asterocidicus (Laidlomycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosidificus (Lonomycin), S. cacaoi var. asoensis (Lysocellin), S. cinnamonensis (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gallinarius (RP 30504), S. longwoodensis (Lysocellin), S. flaveolus (CP38936), S. mutabilis (S-11743a) und S. violaceoniger (Nigericin).

Streptomyces- und Nocardia-Arten, von denen bekannt ist, daß sie Glykopeptid-Antibiotika produzieren, sind beispielsweise die folgenden: N. fructiferi (Ristomycin), N. lurida (Ristocetin), N. actinoides (Actinoidin), S. orientalis und S. haranomachiensis (Vancomycin); S. candidus (A-35512, Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374).

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Man verwendet die auxotrophen Mutanten Al(leu) und D6(met) des Mikroorganismus Streptomyces fradiae. Man impft jeweils 50 ml Tryptikase-Soja-Brühe (TSB), die 0,4% Glycin und 0,4% Maltose enthält, mit 0,5 ml einer Suspension der vegetativen Zellen in flüssigem Stickstoff getrennt an. Dann inkubiert man die Kulturen während 18 Stunden bei 37°C unter Belüftung (250 min^-¹, 2,5 cm Auslenkung). Man wäascht die Mycele durch Zentrifugieren und suspendiert sie dann erneut in 20 ml des Mediums P (M. Okanishi et al, loc. cet.), das (1 mg/ml) Lysozym enthält. Man inkubiert die suspendierten Mycelzellen während 2 Stunden bei 30°C. Die erhaltenen Protoplasten werden vermischt, zentrifugiert und dann erneut in 1 ml des Mediums P gelöst. Dann gibt man jeweils 0,1 ml der Protoplastensuspension Lösungen von Polyäthylenglycol in dem Medium P (0,9 ml) mit verschiedenen Konzentrationen zu, um die Zellmembranverschmelzung zu bewirken. Die verschmolzenen Protoplasten werden sofort mit dem Medium P verdünnt und auf ein modifiziertes Medium R2 aufgetragen (Okanishi et al, loc. cit.; das mit 20% Saccharose ergänzt ist und keine Casaminosäuren enthält). Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben:

Tabelle I

Wirkung der Polyäthylenglycol-Konzentration auf die Rekombinationshäufigkeit

Die obige Verschmelzung wurde unter Verwendung einer 40%igen Lösung von filtrationssterilisiertem Polyäthylenglycol wiederholt. Es ergab sich eine Rekombinationshäufigkeit von 3,5 × 10⁴ Rekombinationen pro ml. Die Rekombinantenkolonien wurden auf ein nichthypertonisches selektives Medium kloniert und bezüglich ihrer Stabilität untersucht. Von den zehn untersuchten Rekombinanten waren sämtliche prototroph und stabil (d. h. verloren die ausgewählte Markierung bei einer extensiven Subkultur unter nichtselektiven Bedingungen nicht).

Beispiel 2

Man verwendet auxotrophe Mutanten des Genus Streptomyces fradiae. Mindestens ein Elternstamm enthielt zwei auxotrophe Markierungen und eine Markierung in Form einer Spectinomycinresistenz (spc.) Jeder der genetisch markierten S.-fradiae-Stämme wurde in einer 0,4% Glycin enthaltenden Trypticase-Soja-Brühe (TSB) gezüchtet. Nachdem das Wachstum einer optischen Dichte von 1,5 bis 5 entsprach (gemessen bei 600 nm in einem Kolorimeter (Baush and Lomb), wurden die Mycele zweimal durch Zentrifugieren gewaschen und dann in dem Medium P suspendiert (M. Okanishi et al, loc. cit.). Dann wurden die Suspensionen mit Lysozym (1 bis 2 mg/ml) versetzt. Die suspendierten Mycelzellen wurden während 0,5 bis 2 Stunden bei 30 bis 34°C inkubiert. Die erhaltenen Protoplasten wurden vermischt (jeweils 0,5 ml der elterlichen Suspension). Die Mischung wurde mehrfach durch Zentrifugieren, durch erneutes Suspendieren in dem Medium P und schließlich durch Suspendieren in 0,1 ml des Mediums P gewaschen. Dann wurde zu der letztendlich gebildeten Suspension eine 40%ige Lösung von Polyäthylenglycol 6000 in dem Medium P (0,9 ml) zugegeben, um die Zellmembranverschmelzung zu induzieren. Die Protoplastenverschmelzung konnte mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops festgestellt werden.

Die verschmolzenen Protoplasten wurden sofort mit einem der nachstehenden Medien verdünnt: Medium P, das 40% Polyäthylenglycol enthält, Medium P oder destilliertes Wasser. Die verdünnten Materialien wurden auf das Medium R2 (Okanishi et al, loc. cit.) aufgetragen, um den Nachweis der Rekombination und der Regeneration von prototrophen Rekombinanten zu ermöglichen. Das verwendete Medium R2 enthielt Asparagin anstelle von Prolin als Stickstoffquelle. Die Rekombinanten wurden nach einer Inkubination während 10 bis 24 Tagen bei 34°C ausgezählt. Bei vielen Kreuzungen wurden die prototrophen Rekombinanten weiter untersucht bezüglich der Anwesenheit einer nicht ausgewählten Markierung (Spectinomycinresistenz), um einzelne Mutantenreversionsartifikate zu eliminieren. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Rekombination zu bestätigen. Die gesamten Rekombinanten sind auf die ursprünglichen Volumen der gemischten Protoplasten bezogen, die im allgemeinen 10⁸ bis 10⁹ Protoplasten/ml enthielten, die durch direktes Auszählen in einer Blutkörperchenzählkammer ermittelt wurden.

Eine Zusammenfassung der verschiedenen genetischen Kreuzungen durch Protoplastenverschmelzung ist in der nachstehenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Wie im Fall des Beispiels 1 erzielt man ein geringeres, jedoch signifikantes Maß der Rekombination, wenn man die Protoplasten zentrifugiert und ohne Polyäthylenglycol in dem Medium P suspendiert. Dieses Maß der Protoplastenverschmelzung ist voraussichtlich eine Folge der Anwesenheit von Calciumionen in dem Puffer. Durch Verdünnen der Protoplasten mit destilliertem Wasser wird die Anzahl der Rekombinanten um den Faktor 100 vermindert. Praktisch sämtliche untersuchten genetischen Rekombinanten enthielten die spc-Markierung des Stammes, der metA arg-Markierungen aufwies, so daß die Möglichkeit ausgeschlossen ist, daß die Reversion des metB-Stammes für die Zahlenwerte verantwortlich sein könnte. Der doppelt markierte auxotrophe Stamm hat nie eine Rückkehr zu einem prototrophen Verhalten gezeigt, so daß eine Reversion dieses Stammes als Erklärung der Ergebnisse nicht herangezogen werden kann. Die anderen Kontrollergebnisse der Tabelle II geben weiteren Hinweis dafür, daß die Rekombination in der Tat nach der Protoplastenverschmelzung erfolgt. Nach dem Klonieren erweisen sich sämtliche offenbar als Rekombinanten anzusprechenden Stämme als stabil. Der verwendete Stamm S. fradiae ist ein Mikroorganismenstamm, der das Antibiotikum Tylosin produziert. Es hat sich gezeigt, daß viele genetische Rekombinanten dieses Stammes S. fradiae ebenfalls Tylosin bilden.

Beispiel 3

Bei dieser genetischen Kreuzung wurde der Mikroorganismus Streptomyces griseofuscus verwendet. Die angewandte Verfahrensweise war die in Beispiel 2 beschriebene, mit dem Unterschied, daß man die Tryptikase-Soja-Brühe (TSB) mit 0,8% Glycin versah und die rekombinanten Kolonien nach einer Inkubation während 7 Tagen bei 34°C auszählte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt. Bei sämtlichen sechs Versuchen wurden die Protoplasten mit in dem Medium P verdünntem Polyäthylenglycol behandelt und auf dem Medium R2 untersucht. In sämtlichen Fällen ergab sich eine Häufigkeit der genetischen Rekombination, die um den Faktor 10³ bis 10⁴ größer ist als die prototrophen Reversionen.

Tabelle III

Beispiel 4

Man verwendet Streptomyces fradiae (met) und Streptomyces bikiniensis (nic ade). Man inkubiert jede Kultur nach der Verfahrensweise von Beispiel 1. Die in der nachstehenden Tabelle IV angegebenen Kreuzungen der Stämme wurden unter Anwendung herkömmlicher Kopulationstechniken durchgeführt und mit der erfindungsgemäßen Protoplastenverschmelzungstechnik verglichen. Die Tabelle IV verdeutlicht, daß die Protoplastenverschmelzung eine Steigerung der Rekombinationshäufigkeit um mindestens den Faktor 200 im Vergleich zu der herkömmlichen Kopulationstechnik ermöglicht.

Tabelle IV

Vergleich der Rekombinationshäufigkeit bei Kreuzung verschiedener Arten unter Verwendung vegetativer Zellen bzw. unter Anwendung der Protoplastenverschmelzung

1. Vegetative Zellen¹)
A. Rekombinationshäufigkeit B. Rekombinantenanalyse 2. Protoplastenverschmelzung⁴)
A. Rekombinationshäufigkeit B. Rekombinantenanalyse

Beispiel 5

Es wurden verschiedene Kreuzungen zwischen verschiedenen Arten unter Anwendung der erfindungsgemäßen Protoplastenverschmelzungstechnik untersucht. Die Stämme wurden über Nacht unter optimalen Kulturbedingungen mit wachstumsbegrenzenden Glycinkonzentrationen inkubiert. Die Protoplasten wurden durch Behandlung mit Lysozym (1 mg/ml) während 1 bis 4 Stunden bei 30°C von den Stämmen abgelöst. Die erhaltenen Protoplasten wurden vermischt und in dem Medium P suspendiert (nach der Verfahrensweise von Beispiel 1). Dann wurde zu der letztendlich gebildeten Suspension eine 40%ige Lösung von Polyäthylenglycol 6000 in dem Medium P (0,9 ml) zugegeben, um die Fusion der Zellmembranen zu bewirken. Zum Vergleich wurde 0,1 ml der Protoplastensuspension in 0,9 ml des Mediums P suspendiert. Die behandelten und die nichtbehandelten Protoplasten wurden unmittelbar danach mit dem Medium P verdünnt und auf ein selektives Medium aufgebracht (Medium R2 ohne Casaminosäure- Ergänzung). Es wurden die in der nachstehenden Tabelle V angegebenen Stämme verwendet.

Tabelle V

Tabelle VI

Claims

1. Verfahren zur Erleichterung des Genaustauschs bei Organismen der Genera Streptomyces und Nocardia durch Bildung und Stabilisierung von Protoplasten eines der Genera oder beider Genera, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) die Protoplasten in der Übergangsphase des Zellwachstums bildet,
2) die auf diese Art gebildeten Protoplasten zur Verschmelzung in einem hypertonischen Puffer vermischt und
3) die verschmolzenen Protoplasten zur Erzielung ihrer Regenerierung auf einem hypertonischen Agrarmedium züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protoplastenverschmelzung dadurch fördert, daß man die Protoplasten mit Polyäthylenglycol behandelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch bei Organismen des Genus Streptomyces durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen Organismen der gleichen Art bewirkt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen Organismen verschiedener Arten durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch bei Organismen des Genus Nocardia durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen Organismen der Genera Streptomyces und Nocardia durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. fradiae-Stämmen bewirkt.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. griseofuscus-Stämmen bewirkt.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. fradiae und S. bikiniensis bewirkt.

11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. fradiae und S. cinnamonensis bewirkt.

12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. lipmanii und S. tenebrarius bewirkt.

13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. cinnamonensis und S. aureofaciens bewirkt.

14. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. aureofaciens und S. candidus bewirkt.

15. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen S. lipmanii und S. clavuligerus bewirkt.

16. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Genaustausch zwischen N. erythropolis und S. coelicolor bewirkt.