CH639694A5 - Process for facilitating gene exchange of microorganisms of the genera Streptomyces and Nocardia - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Er- der durch Protoplastenverschmelzung induzierte Genaus-

leichterung des Genaustauschs oder des genetischen Aus- 40 tausch zwischen anderen Genera innerhalb der Familie der tauschs von Mikroorganismen der Genera Streptomyces und Actinomycetales angestrebt.

Nocardia Protoplastenverschmelzung: Es hat sich gezeigt, dass es möglich ist, den Genaustausch

Der Genaustausch ist in Kombination mit der spontanen innerhalb der Gruppe der Mikroorganismen des Genus Mutation eine natürliche Methode, mit der Mikroorganismen Streptomyces durch Protoplastenverschmelzung oder Proto-

die Variabilität aufrechterhalten, die dazu erforderlich ist, 45 plastenfusion zu erleichtern.

sich an spezifische Umgebungsbedingungen anzupassen. Der Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Er-

Genaustausch erfolgt offensichtlich in der Natur mindestens leichterung des Genaustauschs im Bereich der Genera Strep-

zwischen den Vertretern der gleichen Art. Die klassischen im tomyces und Nocardia, das dadurch gekennzeichnet ist, dass

Laboratorium angewandten Methoden zur Bewirkung eines man die Technik der Protoplastenverschmelzung oder Pro-

Genaustauschs zwischen Mikroorganismen umfassen die so toplastenfusion anwendet.

Konjugation, die DNA-Transformation und die Phagen- Dieses Verfahren umfasst zweckmässig eine mehrstufige

Transduktion. Der Gen-Austausch kann durch Genrekombi- Verfahrensweise, die darin besteht, dass man nation, durch Plasmidübertragung, durch Heterokaryonbil- 1. Protoplasten bildet und stabilisiert,

dung und durch Merodiploidbildung zu der Bildung von 2. einen Genaustausch durch Protoplastenverschmelzung

Hybridstämmen führen. Das Auffinden von Laboratoriums- 55 bewirkt und bedingungen, die einen wirksamen Genaustausch für Mikro- 3. aus den verschmolzenen Protoplasten die Zellen rege-

organismen ermöglichen, die keine wirksamen natürlichen neriert.

Kopulationssysteme besitzen, können jedoch sehr zeitrau- Die regenerierten Hybridstämme einschliesslich der re-

bend und in einigen Fällen erfolglos sein. Die Schwierig- kombinierten Stämme oder Rekombinanten werden dann be-

keiten, die man bei der DNA-Transformation antrifft, 60 züglich einer bestimmten und erwünschten Eigenschaft unter-

schliessen physikalische und enzymatische Sperren gegen die sucht. Beispiele für erwünschte Eigenschaften oder Verhal-

DNA-Aufnahme, wie Zellwände und Nukleasen ein. Bei der tensweisen sind die Bildung eines bekannten Stoffwechselpro-

durch Phagen vermittelten Transduktion ist eine Haupt- dukts, wie eines Antibiotikums oder eines Antitumormittels,

Schwierigkeit, die man bei der Entwicklung des Transduk- und dies in grösserer Ausbeute oder durch einen Stamm, aus tionssystems antrifft, die Isolation und Identifikation von Vi- 65 dem das Stoffwechselprodukt leichter gewonnen werden ren, die für die spezifischen fraglichen Mikroorganismen ein kann. Im Fall von Hybridarten oder Hybridstämmen können Transduktionsvermögen besitzen. Die geringe Zahl von allge- die erwünschten Eigenschaften das Vermögen zur Bildung meinen Prinzipien und der Mangel einer allgemeinen anwend- neuer, nützlicher Stoffwechselprodukte oder die Fähigkeit

3 639 694

zur gesteigerten Bildung bekannter Stoffwechselprodukte ein- tion optimal ist. Die Wirksamkeit der Protoplastenregenera-

schliessen. tion kann in Abhängigkeit von dem physiologischen Zustand

Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren angewandte der Zellen vor der Protoplastenverschmelzung von < 1Ó-5 bis Bildung und Stabilisierung von Protoplasten kann dadurch 5 x 10" ' variieren. Das am 27. Dezember 1979 erteilte belgierreicht werden, dass man s sehe Patent Nr. 868 472 befasst sich mit einem Verfahren zur

(a) Zellen unter Bedingungen züchtet, die sie gegenüber Bildung von Streptomyces-Protoplasten, die dazu befähigt Lysozym empfindlich macht oder sensibilisiert und sind, durch Regeneration in wirksamer Weise lebensfähige

(b) diese Zellen in einem hypertonischen Puffer mit Lyso- Zellen zu bilden. Dieses Verfahren umfasst die Bestimmung zym behandelt, um die Zellwände zu entfernen und Protopla- des optimalen Zustands der Protoplastenreversion. Der opti-sten zu bilden. i0male Zustand, d.h. der am meisten begünstigte Zustand ist die

Die Entfernung der Zellwände kann dadurch erreicht wer- Übergangsphase zwischen der exponentiellen Wachstums-

den, dass man die Zellen während mehrerer Generationen in phase und der stationären Wachstumsphase.

einem Medium züchtet, das Glycin in einer unter der Inhibie- Der am meisten begünstigte Zustand kann dadurch ermit-rungsgrenze liegenden Konzentration enthält. Das Wachstum telt werden, dass man den Wachstumszyklus der Streptomy-

in Gegenwart des Glycins macht die Zellwände der Strepto- 15 ces Mikroorganismen überwacht. Dies erfolgt üblicherweise myces Mikroorganismen gegen das Enzym Lysozym emp- unter Anwendung einer Trübungsmesstechnik und einer findlich (M. Okanishi et al, J. Gen. Microbiol.80 (1974) Überwachung der Änderung der optischen Dichte über das

389-400). Obwohl Zellen, die in Abwesenheit von Glycin ge- Absorptionsvermögen bei 600 nm (A600). Im allgemeinen züchtet worden sind, in vielen Fällen Protoplasten bilden, unterliegen die Streptomyces-Mikroorganismen einer gerin-

werden die Protoplasten langsamer und weniger wirksam ge- 20 gen Zelldichte (A600 von weniger als 1,5) in löslichen kom-

bildet. plexen Medien einem relativ schnellen exponentiellen Wachs-

Das Medium kann irgendein geeignetes flüssiges Medium tum mit Zellverdopplungszeiten von etwa 1,5 Stunden bis zu sein, wie eine Nährbrühe oder eine Trypticase-Soja-Brühe mehreren Stunden. Wenn das Zellwachstum A600-Werte von (TSB). Nach der Züchtung oder dem Wachstum in Gegen- 1,5 bis 4,0 erreicht, treten die Zellen in eine Übergangsphase wart von Glycin werden die Zellen zur Bildung von Protopla- 25 ein, die der stationären Wachstumsphase vorausgeht. Die sten behandelt. Dies wird üblicherweise dadurch bewirkt, Übergangsphase kann sich von 2 bis 24 Stunden erstrecken dass man das Mycel wäscht und in einem hypertonischen Me- und die Zellmasse kann in Abhängigkeit von der betreffenden dium suspendiert. Geeignete hypertonische Medien enthalten Art des Mikroorganismus sich während dieser Wachstumsbeispielsweise Saccharose, Magnesiumionen, Calziumionen phase um 50% bis zu dem Sechsfachen vermehren, und Phosphationen. Das von Okanishi et al (loc.cit.) be- 30 Dann werden die mutmasslichen Hybridstämme ein-schriebene Medium P ist ein Beispiel eines geeigneten hyper- schliesslich rekombinierter Stämme kloniert und genetisch tonischen Mediums. Dann gibt man ( 1 bis 2 mg/ml) Lysozym unter Anwendung von Standardmethoden untersucht, um zu der Zellsuspension und inkubiert die erhaltene Suspension festzustellen, ob sie Gene enthalten, die von beiden Elternor-bei etwa 30 bis 37 °C, bis die Protoplastenbildung vollständig ganismen abgeleitet sind. Echte Hybridstämme einschliesslich abgelaufen ist (0,5 bis 2,0 Stunden). Die Beendigung der Pro- 35 rekombinierte Stämme werden dann bezüglich der angestreb-toplastenbildung kann mit Hilfe eines Phasenkontrastmikro- ten günstigen Eigenschaften untersucht.

skops überwacht werden. Das erfindungsgemässe Verfahren ist für Arten der Ge-

Die Protoplastenverschmelzung wird dadurch erreicht, nera Streptomyces und Nocardia geeignet, die aus Gründen dass man die Protoplasten der beiden elterlichen Organismen der physikalischen Unverträglichkeit normalerwiese für einen vermischt, um das Verschmelzen der elterlichen Protoplasten 40 Genaustausch weniger oder ungeeignet sind. Die erfindungs-

zu indizieren. Die elterlichen Organismen können Stämme gemässe Methode ermöglicht den Austausch und die Rekom-

der gleichen Art (Intraspezies) oder verschiedener Art (Inter- bination von Desoxyribonukleinsäure (DNA) bei sehr hohen spezies) sein. Die Protoplastenmischung wird zentrifugiert, Frequenzen. Diese Methode ist besonders geeignet für einen wonach der gebildete Protoplasten-Zentrifugenrückstand in Genaustausch zwischen mutierten Organismen der gleichen einem geringen Volumen eines hypertonischen Puffers sus- 45 Art, wenngleich auch eine Genübertragung zwischen Mikro-

pendiert wird. Die Verschmelzung und die Fusion wird da- Organismen verschiedener Art erleichtert werden kann. Das durch gefördert, dass man die elterlichen Protoplasten mit erfindungsgemässe Verfahren ist besonders geeignet für die

Polyäthylenglykol (PEG) behandelt. Beispielsweise kann Entwicklung von neuen Stämmen des Antibiotika liefernden man zu den erneut suspendierten Protoplasten eine Lösung Mikroorganismus Streptomyces.

von Polyäthylenglykol in einem hypertonischen Puffer (vor- so Beispielsweise ergibt die Anwendung des erfindungsge-zugsweise eine Lösung mit einer Konzentration von 40%) zu- mässen Verfahrens auf Stämme des Mikroorganismus Strep-setzen. Die erhaltenen verschmolzenen Protoplasten werden tomyces fradiae Rekombinationsausbeuten von IO4 bis 105 auf ein hypertonisches Agarmedium aufgebracht (z.B. auf das pro ml oder Frequenzen bzw. Häufigkeiten von IO-4 bis 10-3 von Okanishi et al (loc. cit.) beschriebene Medium R2 oder pro lebensfähigem Protoplasten. In den Laboratorien der Anähnliche Medien). 55 melderin waren bislang durchgeführte Versuche für eine Gen-

Die Regeneration der Zellen aus den verschmolzenen Pro- rekombination des Mikroorganismus Streptomyces fradiae toplasten wird dadurch erreicht, dass man die verschmölze- unter Anwendung von Standardmethoden (siehe D.A. Hop-

nen Protoplasten bei einer geeigneten Temperatur auf einem wood, Bact. Rev. 31 (1967) 373-403) ohne Erfolg, indem hypertonischen Agarmedium inkubiert. Die geeignete Tem- keine Rekombinationsklone festgestellt werden konnten (d.h.

peratur kann von den optimalen Wachstumstemperaturen 60 weniger als 1 in 107). Somit ermöglicht das erfindungsgemässe der Elternstämme abgelesen werden. Zur Bestätigung des Verfahren die Steigerung der Wahrscheinlichkeit des spezifi-

Genaustausches verwendet man vorzugsweise Mikroorganis- sehen Rekombinationsereignisses bei den Mikroorganismen men, die geeignete Genmarkierungen aufweisen, wie eine Au- Streptomyces fradiae um einen Faktor von mindestens 104.

xotrophie oder eine Beständigkeit gegen Antibiotika. Das erfindungsgemässe Verfahren ist auch dazu geeignet,

Zu diesem Zeitpunkt ist es bevorzugt, insbesondere bei 6s die normalerweise nicht selbst übertragbare extrachromoso-

der genetischen Kreuzung von Mikroorganismen verschiede- male DNA (Plasmiden) von einer Streptomycesart auf eine ner Art, zunächst den physiologischen Wachstumszustand andere zu übertragen. Somit kann man unter geeigneten Be-

der Zellen zu bestimmen, der für die Protoplastenregenera- dingungen plasmid-codierte Gene für die Antibiotiksynthese

639 694 4

oder die Antibiotiksteuerung aus einem Stamm mit einem S. maizeus (Ingramycin), S. albus var. coilmyceticus (Colei-schlechten Stoffwechselpotential für die Synthese des Anti- mycin), S. mycarofaciens (Acetyl-leukomycin, Espinomycin), biotikums auf einen hierfür günstigeren Stamm übertragen. S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Ty-Weiterhin erstreckt sich das erfindungsgemässe Verfahren losin, Carbomycin), S. griseospiralis (Relomycin), S. lavendu-auch auf die engverwandten Mikroorganismen des Genus 5 lae (Aldgamycin), S. rimosus (Neutramycin), S. deltae (Delta-Nocardia. Es hat sich gezeigt, dass es möglich ist, eine durch mycine), S. fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomy-Protoplastenverschmelzung induzierte Genübertragung in- eine), S. furdicidicus (Mydecamycin), S. ambofaciens (Foro-nerhalb der Gruppe des Genus Nocardia und zwischen der macidin D), S. eurocidicus (Methymycin), S. griseolus (Gri-Gruppe des Genus Streptomyces und der Gruppe des Genus seomyein), S. flavochromogenes (Amaromycin, Shincomy-Nocardia zu erreichen. io cine), S. fimbriatus (Amaromycin), S. fasciculus (Amaromy-

Das erfindungsgemässe Verfahren ist besonders geeignet ein), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleando-für Streptomyces- und Nocardia-Arten von wirtschaftlicher mycin), S. olivochromogenes (Oleandomycin), S. spinichro-Bedeutsamkeit. Die bevorzugten Streptomyces- und Nocar- mogenes var. suragaoensis (Kujimycine), S. kitasatoensis dia-Arten sind jene, die Antibiotika, wie Aminoglykosid, Ma- (Leucomycin), S. narbonensis var. josamyceticus (Leucomy-krolid, ß-Lactam, Polyäther und Glykopeptid-Antibiotika is ein A3, Josamycin), S. albogriseolus (Mikonomycin), S. biki-produzieren. Die Anwendung des erfindungsgemässen Ver- niensis (Chalcomycin), S. cirratus (Cirramycin), S. djakarten-fahrens zur Bewirkung eines Genaustauschs, wenn mindes- sis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae tens einer der Elternorganismen ein antibiotikproduzierender (Tylosin, Lactenocin, Makrocin), S. goshikiensis (Bandamy-Mikroorganismus der Genera Streptomyces und Nocardia ein), S. griseoflavus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin), ist, ist daher ein Beispiel einer besonders bevorzugten Ausfüh- 20 S. tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (Carbomycin), S. rungsform des erfindungsgemässen Verfahrens. Beispiels- thermotolerans (Carbomycin) und S. albireticuli (Car-weise umfasst eine bevorzugte Ausführungsform der vorlie- bomyein).

genden Erfindung den Genaustausch bei elterlichen Organis- Streptomyces- und Nocardia-Arten, von denen bekannt men, die Makrolid-Antibiotika, Aminoglykosid-Antibiotika, ist, dass sie ß-Lactam-Antibiotika produzieren, sind beispiels-ß-Lactam-Antibiotika, Polyäther-Antibiotika oder Glyko- 25 weise die folgenden: S. lipmanii (A16884, MM 4550, MM peptid-Antibiotika produzierende Stämme der Art Strepto- 13902), N. uniformis (Nocardicin), S. clavuligerus (A16886B, myces oder Nocardia sind. Clavulansäure, S. lactamdurans (Cephamycin C), S. griseus

Streptomyces-Arten, von denen bekannt ist, dass sie Ami- (Cephamycin A, B), S. hygroscopicus (Deacetoxycephalospo-noglykosid-Antibiotika liefern, sind beispielsweise die folgen- rin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartreusis (SF den: S. kanamyceticus (Kanamycine), S. chrestomyceticus 30 1623), S. heteromorphus und S. panayensis (C208IX),. S. cin-(Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. namonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viri-microsporeus (Antibiotikum SF-767), S. ribosidificus (Anti- dochromogenes (Cephamycine A, B),. S. cattleya (Thienamy-biotikum SF733), S. flavopersicus (Spectinomycin), S. specta- ein),, und S. olivaceus, S. flavovirens, S. flavus, S. fulvoviri-bilis (Actinospectacin), S. rimosus forma paromomycinus dis, S. argenteolus und S. sioyaensis (MM 4550 und MM (Paromomycin), Catenulin), S. fradiae var. italicus (Aminosi- 35 13902).

din), S. bluensis var. bluensis (Bluensomycin), S. catenulae Streptomyces-Arten, von denen bekannt ist, dass sie Poly-

(Catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin äther-Antibiotika produzieren, schliessen beispielsweise die A), S. tenebrarius (Tobramycin, Apramycin), S. lavendulae folgenden ein:

(Neomycin), S. albogriseolus (Neomycin), S. albus var. meta- S. albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), S. hygros-myeinus (Metamycin), S. hygroscopicus var. sagamiensis 40 copicus (A218, Emericid, DE3936), A120A, A28695A und B, (Spectinomycin), S. bikiniensis (Streptomycin), S. griseus Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. conglo-(Streptomycin), S. erythrochromogenes var. narutoensis batus (Ionomycin), S. eurocidicus var. asterocidicus (Laidlo-

(Streptomycin), S. poolensis (Streptomycin), S. galbus (Strep- mycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosidificus (Lonomy-tomycin),S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomy- ein), S. cacaoi var. asoensis (Lysocellin), S. cinnamonensis ein), S. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var. Ii- 45 (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gallinarius (RP moneus (Validamycine), S. rimofaciens (Destomycine), S. 30504), S. longwoodensis (Lysocellin), S. flaveolus hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin), S. fradiae (CP38936), S. mutabilis (S-l 1743a) und S. violaceoniger (Ni-

(Hybrimycine, Neomycine), S. eurocidicus (Antibiotikum gericin).

A16316-C), S. aquacanus (N-Methylhygromycin B), S. cry- Streptomyces- und Nocardia-Arten, von denen bekannt stallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S. 50 ist, dass sie Glykopeptid-Antibiotika produzieren, sind bei-hygroscopicus (Hygromycine), S. atrofaciens (Hygromycin), spielsweise die folgenden: N. fruetiferi (Ristomycin), N. lu-S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis (Kasugamy- rida (Ristocetin) N. actinoides (Actinoidin), S. orientalis und cine), S. netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Livi- S. haranomachiensis (Vancomycin); S. Candidus (A-35512, domyeine), S. hofuensis (Seldomycin-Komplex) und S. canus Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374). (Ribosylparomamin). 55 Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung

Streptomyces- und Nocardia-Arten, von denen bekannt der Erfindung.

ist, dass sie Makrolid-Antibiotika produzieren, sind beispielsweise die folgenden: N. gardneri (Proactinomycin), N. mesen- Beispiel 1 terica (Mesenterin), S. caelestis (Antibiotikum M188), S. pia- Man verwendet die auxotrophen Mutanten Al(leu) und tensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum 60 D6(met) des Mikroorganismus Streptomyces fradiae. Man T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bund- impft jeweils 50 ml Tryptikase-Soja-Brühe (TSB), die 0,4% lin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S. fungicidicus Glycin und 0,4% Maltose enthält, mit 0,5 ml einer Suspen-(Antibiotikum NA-181), S. griseofaciens (Antibiotikum sion der vegetativen Zellen in flüssigem Stickstoff getrennt an. PA133A, B), S. roseocitreus (Albocyclin), S. bruneogriseus Dann inkubiert man die Kulturen während 18 Stunden bei (Albocyclin), S. roseochromogenes (Albocyclin), S. cinero- «5 37 °C unter Belüftung (250 min- ', 2,5-cm Auslenkung). Man chromogenes (Cineromycin B), S. albus (Albomycetin), S. fei- wäscht die Mycele durch Zentrifugieren und suspendiert sie leus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Lankacidin, Borre- dann erneut in 20 ml des Mediums P (M. Okanishi et al, loc. lidin), S. violaceoniger (Lankacidin), S. griseus (Borrelidin), cet.), das 1 mg/ml) Lysozym enthält. Man inkubiert die sus-

5 639 694

pendierten Mycelzellen während 2 Stunden bei 30 °C. Die er- bewirken. Die verschmolzenen Protoplasten werden sofort haltenen Protoplasten werden vermischt, zentrifugiert und mit dem Medium P verdünnt und auf ein modifiziertes Me-dann erneut in 1 ml des Mediums P gelöst. Dann gibt man je- dium R2 aufgetragen (Okanishi et al, loc. cit.,. das mit 20% weils 0,1 ml der Protoplastensuspension Lösungen von Poly- Saccharose ergänzt ist und keine Casaminosäuren enthält),

äthyllenglycol in dem Medium P (0,9 ml) mit verschiedenen 5 Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Konzentrationen zu, um die Zellmembranverschmelzung zu Tabelle I angegeben:

Wirkung der Polyäthylenglycol-Konzentration auf die Rekombinationshäufigkeit

Versuch zugegebene Pro zugegebene Poly-

Rekombinanten

Rekombinations

toplasten

äthylenglycol-

pro ml häufigkeit

lösung

(%)A

1

0,1 ml Zellen

+ 0,9ml60%iges

4,3 x io3

2,2

Polyäthylenglycol

2

0,1 ml Zellen

+ 0,9 ml 40%iges

5,9 x 103

3,0

Polyäthylenglycol

3

0,1 ml Zellen

+ 0,9 ml FS*

1,1 x 104

5,6

40%iges Poly

äthylenglycol

4

0,1 ml Zellen

+ 0,9 ml FS

4,9 x 103

2,5

30%iges Poly

äthylenglycol

5

0,1 ml Zellen

0,9 ml FS

2,9 x 103

1,5

20%iges Poly

äthylenglycol

6

0,1 ml Zellen

+ 0,9 ml FS 0

1,9 x 102

0,1

Polyäthylenglycol

^ Anzahl der Prototrophen/ml x überlebende Zellen

*FS = durch Hydration sterilisiert (Millipor-Filter 0,45 um) Zentrifugieren, durch erneutes Suspendieren in dem Medium

P gewaschen. Dann wurde zu der letztendlich gebildeten Suspension eine 40%ige Lösung von Polyäthylenglycol 6000 in Die obige Verschmelzung wurde unter Verwendung einer 40 dem Medium P (0,9 ml) zugegeben, um die Zellmembranver-40%igen Lösung von filtrationssterilisiertem Polyäthylengly- Schmelzung zu induzieren. Die Protoplastenverschmelzung col wiederholt. Es ergab sich eine Rekombinationshäufigkeit konnte mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops festgestellt von 3,5 x 104 Rekombinanten pro ml. Die Rekombinanten- werden.

kolonien wurden auf ein nichthypertonisches selektives Medium kloniert und bezüglich ihrer Stabilität untersucht. Von 45 Die verschmolzenen Protoplasten wurden sofort mit ei-den zehn untersuchten Rekombinanten waren sämtliche pro- nem der nachstehenden Medien verdünnt: Medium P, das totroph und stabil (d.h. verloren die ausgewählte Markierung 40% Polyäthylenglycol enthält, Medium P oder destilliertes bei einer extensiven Subkultur unter nichtselektiven Bedin- Wasser. Die verdünnten Materialien wurden auf das Medium gungen nicht). R2 (Okanishi et al, loc. cit.) auftetragen, um den Nachweis

50 der Rekombination und der Regeneration von prototrophen Rekombinanten zu ermöglichen. Das verwendete Medium Beispiel 2 R2 enthielt Asparagin anstelle von Prolin als Stickstoffquelle.

Man verwendet auxotrophe Mutanten des Genus Strepto- Die Rekombinanten wurden nach einer Inkubination wäh-myces fradiae. Mindestens ein Elternstamm enthielt zwei au- rend 10 bis 24 Tagen bei 34 °C ausgezählt. Bei vielen Kreu-xotrophe Markierungen und eine Markierung in Form einer 55 zungen wurden die prototrophen Rekombinanten weiter un-Spectinomycinresistenz (spc). Jeder der genetisch markierten tersucht bezüglich der Anwesenheit einer nicht ausgewählten S.-fradiae-Stämme wurde in einer 0,4% Glycin enthaltenden Markierung (Spectomycinresistenz), um einzelne Mutanten-Trypticase-Soja-Brühe (TSB) gezüchtet. Nachdem das reversionsartifakte zu eliminieren. Weitere Untersuchungen

Wachstum einer optischen Dichte von 1,5 bis 5 entsprach (ge- wurden durchgeführt, um die Rekombination zu bestätigen, messen bei 600 nm in einem Kolorimeter (Baush and Lomb), 60 Die gesamten Rekombinanten sind auf die ursprünglichen wurden die Mycele zweimal durch Zentrifugieren gewaschen Volumen der gemischten Protoplasten bezogen, die im allge-und dann in dem Medium P suspendiert (M. Okanishi et al, meinen IO8 bis 109 Protoplasten/ml enthielten, die durch di-loc. cit.). Dann wurden die Suspensionen mit Lysozym ( 1 bis rektes Auszählen in einer Blutkörperchenzählkammer ermit-2 mg/ml) versetzt. Die suspendierten Mycelzellen wurden telt wurden.

während 0,5 bis 2 Stunden bei 30 bis 34 °C inkubiert. Die er- Eine Zusammenfassung der verschiedenen genetischen haltenen Protoplasten wurden vermischt (jeweils 0,5 ml der Kreuzungen durch Protoplastenverschmelzung ist in der elterlichen Suspension). Die Mischung wurde mehrfach durch nachstehenden Tabelle II angegeben.

639 694 6

Tabellen

Versuch Elternmarkierung

Behandlung

Verdünnungs

Prototrophe

Spectomycinre-

Elternteil 1

Elternteil 2 mitPoly-

medium

Rekombinanten,

sistente proto

äthylenglycol

Revertanten/ml A

trophe Mutanten

1 metA

arg spe metB

+

P+PEG*

2,4 x IO4

6/7

2 metA

arg spe metB

-

P

6,6 x IO3

8/8

3 metA

arg spe metB

—

h2o

7,0 x IO1

11/11

4 metA

arg spe

-

+

P + PEG

<10'

0/0

5 metA

arg spe

-

—

P

<10'

0/0

6 metA

arg spe

-

—

h2o

<10'

0/0

7

metB

+

P+PEG

2x10'

0/3

8

metB

-

P

2x10'

0/6

9

metB

-

h20

2x 10'

0/8

10 metA

arg spe cysD

+

P

1,1 x IO5

ND**

11

cysD

+

P

<10'

ND

12 metA

arg spe

-

+

P

<10'

ND

*Polyäthylenglycol **Nicht ermittelt À In dem Medium R2 bestimmt

Die Markierungsbezeichnungen sind jene von Hopwood et al (Bact. Rev. 37,1973) 371-405). Die metA-, arg- und metB-Mar-kierer sind auxotroph. Die spc-Markierer bezeichnen eine Beständigkeit gegenüber 50 ng/ml Spectinomycin.

Wie im Fall des Beispiels 1 erzielt man ein geringeres, jedoch signifikantes Mass der Rekombination, wenn man die Protoplasten zentrifugiert und ohne Polyäthylenglycol in dem Medium P suspendiert. Dieses Mass der Protoplastenverschmelzung ist voraussichtlich eine Folge der Anwesenheit von Calciumionen in dem Puffer. Durch Verdünnen der Protoplasten mit destilliertem Wasser wird die Anzahl der Rekombinanten um den Faktor 100 vermindert. Praktisch sämtliche untersuchten genetischen Rekombinanten enthielten die spc-Markierung des Stammes, der metA arg-Markierangen aufwies, so dass die Möglichkeit ausgeschlossen ist, dass die Reversion des metB-Stammes für die Zahlenwerte verantwortlich sein könnte. Der doppelt markierte auxotrophe Stamm hat nie eine Rückkehr zu einem prototrophen Verhalten gezeigt, so dass eine Reversion dieses Stammes als Erklärung der Ergebnisse nicht herangezogen werden kann. Die anderen Kontrollergebnisse der Tabelle II geben weiteren Hinweis dafür, dass die Rekombination in der Tat nach der Protoplastenverschmelzung erfolgt. Nach dem Klonieren erweisen sich sämtliche offenbar als Rekombinanten anzusprechenden Stämme als stabil. Der verwendete Stamm S. fradiae ist ein Mikroorganismenstamm, der das Antibiotikum Tylosin produziert. Es hat sich gezeigt, dass viele genetische Rekombinanten dieses Stammes S. fradiae ebenfalls Thylosin bilden.

Beispiel 3

Bei dieser genetischen Kreuzung wurde der Mikroorganismus Streptomyces griseofuscus verwendet. Die angewandte Verfahrensweise war die in Beispiel 2 beschriebene, mit dem Unterschied, dass man die Tryptikase-Soja-Brühe (TSB) mit 0,8% Glycin versah und die rekombinanten Kolonien nach einer Inkubation während 7 Tagen bei 34 °C auszählte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden

Tabelle III zusammengefasst. Bei sämtlichen sechs Versuchen wurden die Protoplasten mit in dem Medium P verdünntem Polyäthylenglycol behandelt und auf dem Medium R2 untersucht. In sämtlichen Fällen ergab sich eine Häufigkeit der ge-30 netischen Rekombination, die um den Faktor IO3 bis 104 grösser ist als die prototrophen Reversionen.

Tabelle III

35

Elternmarkierung

Versuch

Elternteil 1

Elternteil 2

Prototrophe Rekombi

nation

oder Revertanten/ml

1

met arg

3,1 x 104

2

met trp

4,8 x 103

3

arg trp

4,2 xlO4

4

met

—

<10'

5

arg

-

1,0 x IQ1

6

trp

-

<10'

Beispiel 4

Man verwendet Streptomyces fradiae (met) und Strepto-50 myces bikiniensis (nie ade). Man inkubiert jede Kultur nach der Verfahrensweise von Beispiel 1. Die in der nachstehenden Tabelle IV angegebenen Kreuzungen der Stämme wurden unter Anwendung herkömmlicher Kopulationstechniken durchgeführt und mit der erfindungsgemässen Protoplystenver-55 schmelzungstechnik verglichen. Die Tabelle IV verdeutlicht, dass die Protoplastenverschmelzung eine Steigerung der Rekombinationshäufigkeit um mindestens den Faktor 200 im Vergleich zu der herkömmlichen Kopulationstechnik ermöglicht.

7

639 694

Tabelle IV

Vergleich der Rekombinationshäufigkeit bei Kreuzung verschiedener Arten unter Verwendung vegetativer Zellen bzw. unter Anwendung der Protoplastenverschmelzung

1. Vegetative Zellen1 A. Rekombinationshäufigkeit

Suspension

S. bikiniensisx S. bikiniensis S. fradiae

B. Rekombinantenanalyse

S. fradiae

Ausgewählte Markierungen nie ade

1,1 x 10 8 5,9 x 10 9

< 1 x 10 9 <5,9xl09

met

<2,4x io-1

Rekombinante Nr.

1

2

3

2. Protoplastenverschmelzung4 A. Rekombinationshäufigkeit

Suspension

S. bikiniensis x S. S. bikiniensis x S. S. bikiniensis S. fradiae

B. Rekombinantenanalyse fradiae fradiae

Rekombinante Nr.

1

2

3

4

5

6

7

9

10

Ausgewählte Markierung ade ade ade ade ade ade ade ade nie nie

Stabilität der ausgewählten

Markierung nie

+ 2

+

+

Nicht ausgewählte Markierungen ade

Polyäthylenglycol

Ausgewählte Markierungen nie ade

Morphologie der Kolonie3

Sb Sb Sb met

+

2,5 x 10 6 < 4,4 x 10 7 <3,3x10 8

1,7x10 5 <4,4x 10 7 <3,3 x 10"8

<4,4xl0"7

Stabilität der ausgewählten

Markierung

+ 2

+

+

+

+

+

+

+

+

Nicht ausgewählte Markierungen nie ade Morphologie der Kolonie3,5

Sb Sb Sb Sb Sb Sb Sb Sb

+ Sb

+ Sb

'Medium und Kopulationsbedingungen nach Hopwood und Sermonti (Adv. Genet 11 (1962) 273-342).

2Nach dem Klonieren auf die selektiven Medien wurden die Rekombinanten während 48 Stunden in Tryptikase-Soja-Brühe (TSB) gezüchtet, mit Ultraschall behandelt und dann auf einen Tryptikase-Soja-Brühe-Agar (TSB-Agar) aufgebracht. Nach einer Inkubation von 4 Tagen wurden jeweils 10 Kolonien jeder Rekombinante bezüglich der ausgewählten Markierung untersucht. Das Zeichen + bedeutet, dass die Untersuchung positiv war, während das Zeichen - bedeutet, dass einige der Kolonien die ausgewählte Markierung verloren haben.

3Sb = Morphologie von S. bikiniensis

4Die Protoplastenverschmelzung wurde in 40%igem Polyäthylenglycol in dem Medium P (sterilisiert durch Filtration) in Gang gebracht.

'Sämtliche Sb-Kolonien bildeten Zorbamycin.

639 694

Beispiel 5

Es wurden verschiedene Kreuzungen zwischen verschiedenen Arten unter Anwendung der erfindungsgemässen Proto-plastenverschmelzungstechnik untersucht. Die Stämme wurden über Nacht unter optimalen Kulturbedingungen mit wachstumsbegrenzenden Glycinkonzentrationen inkubiert. Die Protoplasten wurden durch Behandlung mit Lysozym (1 mg/ml) während 1 bis 4 Stunden bei 30°C von den Stämmen abgelöst. Die erhaltenen Protoplasten wurden vermischt und in dem Medium P suspendiert (nach der Verfahrensweise von Beispiel 1). Dann wurde zu der letztendlich gebildeten Suspension eine 40%ige Lösung von Polyäthylenglycol 6000 in dem Medium P (0,9 ml) zugegeben, um die Fusion der Zellmembranen zu bewirken. Zum Vergleich wurde 0,1 ml der Protoplastensuspension in 0,9 ml des Mediums P suspendiert. Die behandelten und die nichtbehandelten Protoplasten wurden unmittelbar danach mit dem Medium P verdünnt und auf ein selektives Medium aufgebracht (Medium R2 ohne Casa-minosäure-Ergänzung). Es wurden die in der nachstehenden Tabelle V angegebenen Stämme verwendet.

Tabelle V

Organismus

5 Streptomyces coelicolor 1190 Nocardia erythropolis NE17 Streptomyces fradiae D6 Streptomyces cinnamonensis 3823-A5 Streptomyces lipmann A16884 io Streptomyces tenebrarius St26-A4 Streptomyces lipmanii LA423 Streptomyces clavuligerus J1 Streptomyces cinnamonensis M2 Streptomyces aureofaciens S5 ls Streptomyces aureofaciens S15 Streptomyces Candidus A35512-A1 Streptomyces bikiniensis 241-44 Streptomyces fradiae SFA2

Phänotyp3

his ura cap met leu his lys

UD

UD

UD

UD

Anthranilsäure nie ade cys

'Die Protoplasten von S. lipmanii zeigten keine Regeneration auf dem Medium R2.

2cap steht für eine Beständigkeit gegen Chloramphenieol in einer Dosis von 20 |xg/ml,. die verbleibenden Markierungen sind auxotroph.

3UD = nichtidentifizierte Auxotrophie Tabelle VI

Kreuzung

S. coelicolor 1190 x N, erythropolis NE17 S. coelicolor 1190 x N, erythropolis NE17 S. fradiae D6 x S. cinnamonensis 3823-A5 S. fradiae D6 x S. cinnamonensis 3823-A5 S. lipmanii A-16884 x S. tenebrarius St26-A4 S. lipmanii A-16884 x S. tenebrarius St26-A4 S. lipmanii LA423 x S. clavuligerus J1 S. lipmanii LA423 x S. clavuligerus Ji S. cinnamonensis M2 x S. aureofaciens S5 S. cinnamonensis M2 x S. aureofaciens S5 S. aureofaciens S15 x S. Candidus A-35512-A1 S. aureofaciens S15 x S. Candidus A-35512-A1 S. bikiniensis 241-4 x S. fradiae SFA2 S. bikiniensis 241-4 x S. fradiae SFA2

Polyäthylen- Selektive Anzahl der glyeol1 Medien2-3-4 Prototro-

phen/ml

+ R2+cap + CA 3,0x10'

R2+cap+CA <3,0x10°

+ R2 1,5x10'

R2 <3,0x10°

+ R2 2,0 xlO3

R2 8,0x10'

+ R2 1,9 xlO2

R2 1,2 xlO2

+ R2 3,0x10'

R2 <3,0x10°

+ R2 5,0 x 10'

R2 <3,0x10°

+ R2 Adenin 1,0x10'

R2 Adenin 3,0x10°

'40%, durch Filtration sterilisiert

2cap = 20 p.g/ml Chloramphenieol nach 24stündiger Inkubation zugesetzt

3CA = Casaminosäuren

4Das Medium R2 enthält keine Casaminosäuren

C

Claims (10)

639 694 2 PATENTANSPRÜCHE baren Methode, mit der ein Genaustausch bei Mikroorganis-

1. Verfahren zur Erleichterung des Genaustausches bei men bewirkt werden kann, hat die Entwicklung von wirksa-Organismen der Genera Streptomyces und Nocardia, da- men Methoden für den Gen-Austausch oder genetischen Aus-durch gekennzeichnet, dass man die Technik der Protopla- tausch bei vielen Mikroorganismen gehindert, stenverschmelzung anwendet. s Dennoch stellt der Genaustausch ein sehr wirksames

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Werkzeug zur Steigerung der Variabilität innerhalb einer dass man die Protoplasten durch Züchtung der Organismen Gruppe von Arten dar, die wirtschaftlich und therapeutisch in der Übergangsphase des Wachstums bildet. wichtige Stoffwechselprodukte, wie Antibiotika, produzieren.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch ge- Die industrielle Anwendung dieses Werkzeugs umfasst den kennzeichnet, dass man die Protoplasten durch Züchten der io Aufbau von Stämmen, die spezifische Stoffwechselprodukte, Mikroorganismen in einem hypertonischen Nährmedium in wie Antibiotika, Antitumormittel, Enzyme und andere Mi-Gegenwart einer nichtinhibierenden Konzentration von Gly- kroorganismenprodukte mit nützlichen Eigenschaften, pro-cin und durch Behandeln mit Lysozym bildet. duzieren, sowie die Konstruktion von Hybridarten oder

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch ge- -Stämmen, die neue Stoffwechselprodukte mit nützlichen Ei-kennzeichnet, dass man die Protoplastenverschmelzung da- is genschaften bilden.

durch fördert, dass man die Protoplasten mit Polyäthylengly- Eine neuere Methode zur Bewirkung des Austauschs von col behandelt. genetischem Material durch erzwungene Zellverschmelzung

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge- wurde mit Erfolg bei der genetischen Untersuchung einiger kennzeichnet, dass man einen Genaustausch zwischen Orga- eukaryotischer Organismen angewandt. Der durch Zellver-nismen der gleichen Art bewirkt. 20 Schmelzung verursachte Genaustausch an prokaryotischen

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge- Mikroorganismen konnte erst von Schaeffer et al gezeigt wer-kennzeichnet, dass man einen Genaustausch zwischen Orga- den, wobei Fodor und Alfodi eine Methode entwickelten, die nismen verschiedener Arten durchführt. das Verschmelzen von Protoplasten und die Regeneration

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge- von Zellen des Genus Bazillus einschliesst (P. Schaeffer et al, kennzeichnet, dass man einen Genaustausch zwischen S. fra- 25 Proc. Nat. Acad. Sei. 73 (1976), 2151-2155 und K. Fodor und diae-Stämmen bewirkt. L. Alfoldi, Proc. Nat. Acad. Sei. 73 (1976), 2147-2150).

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge- Es wurde nunmehr gefunden, dass es möglich ist, einen kennzeichnet, dass man einen Genaustausch zwischen S. gri- durch Protoplastenverschmelzung induzierten Genaustausch seofuscus-Stämmen bewirkt. bei prokariotischen Mikroorganismen des Genus Streptomy-

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge- 30 ces zu bewirken. Diese Erkenntnis ermöglicht die Anwendung kennzeichnet, dass man einen Genaustausch zwischen S. te- einer allgemeinen und damit extrem wichtigen Technik zur nebrarius-Stämmen bewirkt. Erleichterung des Genaustauschs innerhalb der gleichen Art

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge- oder verschiedener Arten der wirtschaftlichen wichtigen Mi-kennzeichnet, dass man einen Genaustausch zwischen S. ery- kroorganismen des Genus Streptomyces. Es hat sich ferner threus-Stämmen bewirkt. 35 gezeigt, dass es möglich ist, einen durch Protoplastenverschmelzung induzierten Genaustausch zwischen Mikroorga-

nismen des Genus Streptomyces und Mikroorganismen des nahe verwandten Genus Nocardia zu erzielen. Es wird auch