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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen isolierten Bakteriophagen und
ein Verfahren zur Herstellung des Bakteriophagen, der als Werkzeug
für die
Untersuchung der biologischen, biochemischen, physiologischen und
genetischen Eigenschaften von Actinomycetes und anderer Organismen
in Frage kommt. Der erfindungsgemäß erhaltene Bakteriophage ist
besonders geeignet für
die Kennzeichnung antibiotischer Biosynthesewege und ähnlicher
primärer
und sekundärer
Stoffwechselwege. Der Bakteriophage des erfindungsgemäßen Verfahrens
kommt auch für
die Untersuchung mehrerer anderer genetischer und physiologischer
Wege in Frage. Außerdem
kann er zur Erzeugung von Mutationen bei den Stoffwechselwegen von
Bakterien und nach einer gewissen spezifischen Veränderung
wie z.B. nach Klonung in geeignete Mobilisierungsvektoren zur Untersuchung
der Stoffwechselwege anderer Mikroorganismen und Pflanzen verwendet
werden. Mutationen können
praktisch an jedem beliebigen Lokus der Bakterien erzeugt werden.
Die Ergebnisse der oben erwähnten
Veränderungen
bzw. Mutationen können
zur Erzeugung neuer Stoffwechselprodukte oder zur Expression neuer
physiologisch aktiver Verbindungen oder neuer Eigenschaften im selben
Wirt oder in heterologen Wirten führen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Der
Ausdruck "Bakteriophage
bzw. Phage" bedeutet
in der vorliegenden Anmeldung ein Virus oder Viren, welche Bakterin
infizieren. Nach der Infektion kann das Virus neue Nachkommenpartikel
erzeugen oder es kann im Bakteriengenom "schweigend" verbleiben. Unter einem "Lysogen" versteht man hier
ein Bakterium, das einen Bakteriophagen aufweist, ohne von diesem
geschädigt
zu werden. Unter einem "Plaque" versteht man einen
trüben
oder klaren Fleck, der durch Lyse der durch einen Bakteriophagen
infizierten Zellen erzeugt wird. Unter einem "Prophagen" versteht man hier einen Bakteriophagen, der
in einer Bakterienzelle im lysogenen Zustand aufrechterhalten wird.
Unter einem "konfluenten
Rasen" versteht
man ein gleichmäßiges Wachstum
des Organismus auf einer Agarplatte. Unter einem "Phagemid" versteht man hier
einen Plasmidvektor, der einen Teil der Phagen-DNA trägt. Unter
dem Ausdruck "Restriktionsenzym" versteht man hier
eine Endonuclease, welche die durch ihre Erkennungssequenz definierten
DNA-Abschnitte schneidet. Unter "Auxotroph" versteht man einen
im Hinblick auf die Synthese eines oder mehrerer Zucker oder Aminosäuren defektiven Bakterienstamm.
Unter der "Restriktionsbarriere" versteht man ein
Verteidigungssystem des Wirts, welches die Bakterien vor Eindringlingen
schützt,
indem es deren DNA spaltet. Unter "Klonung" versteht man hier das Verfahren zur
Erzeugung rekombinanter DNA. Unter dem Begriff "genetisches Werkzeug" versteht man hier ein System, bei dem
die DNA als Werkzeug verwendet wird. Unter "Mutation" versteht man hier eine Veränderung
in der Basenabfolge der DNA eines Organismus. Diese Veränderung
kann durch Insertion, Deletion oder Modifizierung der DNA-Basen
verursacht werden. Unter "Transposon" versteht man hier
ein genetisches Element, welches die Informationen enthält, die
seinen Einbau in verschiedene Abschnitte im Wirtsgenom ermöglichen.
Unter "Genom" versteht man hier
die Gesamtheit aller Gene eines Virus, einer Zelle, eines Bakteriums oder
eines lebenden Organismus.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die Isolierung eines neuen Bakteriophagen aus dem Stamm
PA 136 von Saccharomonospora aus Bodenproben und dessen Reinigung.
Der erfindungsgemäße Saccharomonospora-Stamm
ist gekennzeichnet durch das Vorliegen einer einzigen lateral angeordneten,
weißen
Spore, durch Meso-Diaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose
als Gesamtzucker, jedoch ohne Mykolsäure, und durch Fettsäuren als
Hauptkomponenten, und zwar C16-Iso und -Antiso-Fettsäuren. Weitere
Eigenschaften dieses Stammes sind: Wachstum auf Hypoxanthin, Hypoxanthin
+ 0,3 % Glucose, Tributyrin, Xylit, Thalliumacetat, Thalliumacetat
+ 0,1 % Glucose, Propanol, Butanol-1,3-diol, D-Fucose, Salicin,
Arabinose, L-Asparagin, Phenylalanin, L-Serin und Na-Benzoat. Der
Stamm gedeiht in einem Temperaturbereich von 20 bis 55°C auf einer
Agarplatte bei einem pH-Bereich von 5,5 bis 9,0. Er ist Katalase-positiv
und produziert extrazelluläre
Enzyme: Lipase (C14), Leucinarylamidase,
Valinarylamidase, Cysteinarylamidase, Trypsin, Chemotrypsin, saure
Phosphatase, Naphthol-As-B1-phosphohydrolase, α-Glucosidase und β-Glucosidase.
Die Gesamtzelle hat folgende chemische Zusammensetzung: Meso-di-aminopimelinsäure, Arabinose,
Galactose, Phosphatidylglycerin, Di-phosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin,
Hydroxyphosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositglycolipide.
Es liegt nicht identifizierte Gruppen von Phospholipiden enthaltender
Zucker vor. Die Gesamtfettsäuren
sind: Als Hauptkomponenten C16-Iso- und
Antiso-Fettsäuren
verzweigter und geradkettiger C-Verbindungen. Saccharose wird nicht
verwertet. Der Stamm produziert in den meisten Fällen ein diffusionsfähiges grünes, orangefarbenes
oder gelbes Pigment. Manchmal produziert der Stamm PA136 von Saccharomonospora überhaupt
kein Pigment. Gelegentlich ist das Pigment nicht-diffusionsfähig. Die von PA136 von Saccharomonospora
produzierten Pigmente sind jedoch wasserlöslich. Unlöslich sind sie in Ether, Ethanol,
Methanol, Butanol, Isopropanol, Benzol, Ethylacetat, Chloroform
und Aceton, teilweise löslich
in Phenol. Das vom Stamm produzierte grüne Pigment ist eine kennzeichnende
Eigenschaft der Gattung Saccharomonospora. Der Stamm PA136 von Saccharomonospora
unterliegt nach 5- bis 6-tägiger
Inkubation auf einer Kulturplatte der Autolyse, was dann bei detaillierter
Analyse zur Isolierung eines Bakteriophagen unter der Bezeichnung
PIS136 führt.
Dieser temperente Bakteriophage weist einen weiten Wirtsbereich
unter grampositiven Bakterien auf und erzeugt bei 2 bis 3 % aller
infizierter Zellen Lysogene. Der Phage PIS136 hat ein DNA-Genom von ca. 90
kb, wobei der Gehalt an GC (Guanidin und Cytosin) 69 bis 71 mol-%
beträgt.
Das Genom dieses Phagen ist teilweise methyliert und entbehrt der
Erkennungsabschnitte für
viele Restriktionsenzyme. Das Phagengenom, das durch Transposition
Random-Mutationen zu erzeugen vermag, zeigt auch das Phänomen der
Geninversion. Des Phänomens
der Geninversion kann man sich bedienen, um den Wirtsbereich des
Phagen im Hinblick auf heterologe und konditionale Genexpression
zu steuern. Der Phage wurde als Lysogen des Stammes PA136 von Saccharomonospora
bei der Microbial Type Culture Collection, Institute of Microbial
Technology, Chandigarh hinterlegt und trägt die Zugangsnummer MTCC A0001,
wobei "A" für Actinomycetes
steht und die Hinterlegungsnummer DSM 12317 bei der DSMZ-DEUTSCHEN
SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, bei der er am
16. Juli 1998 hinterlegt wurde, trägt. Aufgrund seiner einzigartigen
Eigenschaften weist dieser Phage enorme Bedeutung als genetisches
Werkzeug auf und kann in unterschiedlicher Weise als Transposon
für die
Erzeugung von Mutanten, als gattungsübergreifender Klonungsvektor,
für die
Untersuchung von Stoffwechselwegen, als Reporterphage, für die konditionale
Genexpression oder sogar für
die Aktivierung schweigender Gene usw. verwendet werden.
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Bakteriophagen
bzw. Phagen, d.h. Bakterienviren, sind die einfachsten aller Lebewesen.
Sie sind die natürlichen
Objekte für
die Erforschung des Lebens auf dem Molekularniveau. Phagen haben
eine Reihe von regulatorischen Mechanismen entwickelt, um eine wirksame
Produktion von Nachkommenpartikeln im Verlaufe ihrer Entwicklung
zu sichern. Im allgemeinen kommt es jedoch bei ca. 1 % der Zellen,
die von temperenten Phagen infiziert werden, zur Lysogenie, d.h.
dann wenn das Phagengenom in das Wirtsgenom eingebaut wird. Die
Lysogene sind gegen Superinfektion immun.
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Aus
industriell verwendbaren und medizinisch bedeutsamen Bakterien wie
Streptomyces sp., Corynebacterium sp., Lactococcus lactis, Mycobacteria,
Escherichia coli, Salmonella und Staphylococcus sp. usw. werden
zahlreiche Phagen isoliert.
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Ca.
70 % der bekannten und natürlich
vorkommenden Antibiotika werden von Vertretern der Gattung Streptomyces
produziert. Bei den meisten Klonungsverfahren bei verschiedenen
Arten von Streptomyces werden Vektoren auf Plasmidbasis verwendet,
die zur autonomen Replikation befähigt sind (Rao, R.N., Richardson,
M.A. und Kuhtoss, S. 1987, in Methods in Enzymology. 153: 166-198;
Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F. und Kieser, T., 1987, in
Methods in Enzymology. 153: 116-165).
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Gleichzeitig
wurde der einen relativ breiten Wirtsbereich aufweisende temperente
Bakteriophage ⌀C31,
welcher lediglich Streptomyces sp. und die verwandte Gattung Streptoverticillium
sp. infiziert, als vielseitig verwendbarer Klonungsvektor entwickelt
(Chater, K.F., 1986, In The Bacteria, Bd. IX. Queener, S.W. und Day,
L.E. (ed), London: Academic Press, SS. 119-158; Kobler, L., Schwertfirm,
G., Schmieger, H., Bolotin, A. und Sladkova, I., 1991 FEMS Microbiology
Letters, 8: 347-354; Bruton, C.J., Guthrie, E.P. und Charter, K.F., 1991,
Bio/Technology, 9: 652-656). 1991, Kuhtoss, S., Richardson, M. und
Rao, R.N. (Gene, 97: 143-146) entwickelten einen Schaukelvektor,
der sich das abschnittspezifische Rekombinationssystem des Phagen ⌀C31 zunutze
macht. Diese Vektoren ermöglichen
es, dass die geklonte DNA in eine Wirtszelle beständig eingefügt wird.
McHenny, M.A. und Baltz, R.H. (Journal of Bacteriology, 1988, 170:
2276-2282) beanspruchen die Entwicklung eines Transduktionssystems
für mehrere
Arten von Streptomyces und verwandte Gattungen unter Einsatz des
Phagen FP43. Dieses System versagte jedoch bei dem sehr wichtigen
Stamm Streptomyces hygroscopicus 10-22. So verwendeten Zhou, X.,
Deng, Z., Hopwood, D.A. und T. Kieser, (1994 Journal of Bacteriology,
176: 2096-2099) einen neuen Phagen, und zwar ⌀HAU3, der einen relativ breiten
Wirtsbereich innerhalb der Gattung Streptomyces aufweist und entwickelten
einen Phagemiden zur Untersuchung der Molekularbiologie des Stammes
Streptomyces hygroscopicus 10-22).
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Phagen
eines weiteren, für
industrielle Zwecke bedeutenden Organismus, und zwar von Lactococcus lactis,
wurden auch zur Vektorentwicklung benutzt (Kok, J., Van der Vossen,
J.M.B.M. und G. Venema, 1984, Applied environmental Microbiology,
48: 726-731; Van der Vossen, J.M.B.M., Van der Lelie, D. und Venema, G.,
1987, Applied Environmental Micro-biology, 53: 2452-2457). Auch
wurden Versuche unternommen, um den Phagen L5 von Mykobakterien
in einem geeigneten Vektor zu entwickeln, um die Untersuchung der
Molekularbiologie von Mykobakterien zu erleichtern (Lee, M.H., Pascopella,
L., Wu, M.K., Jacobs, W.R. und G.F. Hatfull, 1993 Molecular Microbiology,
7: 407-417). Trotz all dieser Untersuchungen hat die Anwendung der
Molekulartechnik bisher noch nicht zu entscheidenden Ergebnissen
bei Programmen zur Entwicklung industriell verwendbarer Stämme bzw.
bei der Entwicklung von Hybriden oder neuen Antibiotika geführt. Keiner
der bisher in der Literatur beschriebenen Phagen von grampositiven
Bakterien hat die Eigenschaft, ein Transposon abzugeben.
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Ein
Transposon hat die Eigenschaft, sich in willkürlich gewählten Abschnitten in das Wirtsgenom
einzufügen.
Aufgrund ihrer Insertionseigenschaften können Transposone zur Verbesserung
der Erzeugung sekundärer
Metabolite und zur Konstruktion von Stämmen verwendet werden, die
Hybride oder neue sekundäre Metabolite
bilden. Transposone werden auch für den Genbruch und für die Klonung
von generellen Regulatorgenen insgesamt, für die Wege sekundärer Metabolite
und für
starke bzw. Regulatorpromotoren verwendet. Sie könnten auch zur Blockierung
konkurrierender bzw. unnötiger
Wege zur Erzielung einer effektiveren Produktion sekundärer Metabolite
verwendet werden (Hahn, D.R., Solenberg, P.J., McHenny, M.A. und
R.H. Baltz, 1991, Journal of Industrial Microbiology, 7: 229-234).
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Die
vorliegende Erfindung beruht somit auf dem Bedarf nach Entwicklung
eines Systems, mit dessen Hilfe die Molekularbiologie der Klasse
der grampositiven Bakterien, die eine große Zahl von Organismen, wie z.B.
Arten von Amycolatopsis, Corynebacterium, Mycobacteria, Nocardia,
Micromonospora, Rhodococcus, Streptomyces usw. umfasst, die sowohl
industriell als auch medizinisch von Bedeutung sind, untersucht
werden kann. Gegenwärtig
ist kein von einem Mehrfachtransposon bzw. einem Mehrfachphagen
vermittelter Vektor bzw. ein entsprechendes generalisiertes Transduktionssystem
zugänglich,
mit dessen Hilfe die Genetik und die Molekularbiologie dieser Organismen
problemlos untersucht werden könnte.
Außerdem
sind die meisten der genannten Organismen für die Industrie von sehr großer Bedeutung,
da sie Antibiotika, Enzyme, bioaktive kleine Peptide, Glutaminsäure und
viele andere Aminosäuren
als sekundäre
Stoffwechselprodukte erzeugen. Die Steuerung dieser Stoffwechselwege
ist äußerst kompliziert,
da für
die Biosynthese mehrere Zwischenprodukte und Precursor-Verbindungen
erforderlich sind. Im Allgemeinen stehen die sekundären Stoffwechselwege
innerhalb eines Organismus insofern in einer Wechselbeziehung zueinander,
als sie entweder dasselbe Precursormolekül verwenden oder man eine intermediäre Verbindung
des anderen Stoffwechselweges als Precursor verwendet. Dies kann
zu einer Verminderung der Produktion an erwünschtem Endprodukt bei einem der
Stoffwechselwege führen
verglichen mit einem verwandten Stoffwechselweg. Da bei natürlichen
Isolaten die erzeugte Menge sehr gering ist, ist die Gewinnung hohe
Mengen produzierender Stämme
ein Hauptziel der Industrie. Außerdem
produzieren die meisten natürlichen
Isolate mehr als einen sekundären
Metaboliten, wobei die Anwesenheit einer anderen Verbindung oft
unerwünscht
ist. So kann ein Bakteriophage, der die Eigenschaft besitzt, die
Produktion unerwünschter
Verbindungen durch Mutation einzustellen, dazu verwendet werden,
die Umleitung einer Precursorverbindung von einem Stoffwechselweg
zu einem anderen, was häufig einen
begrenzenden Faktor darstellt, zu stoppen, was für die Industrie von sehr großer Bedeutung
ist. Die Eigenschaft der Geninversion beim erfindungsgemäß beschriebenen
Bakteriophagen bzw. Phagen kann dazu verwendet werden, die Probleme
zu überwinden,
die dann entstehen, wenn das intermediäre Produkt eines Stoffwechselweges
das Precursormolekül
eines anderen Stoffwechselweges darstellt. Das Verfahren besteht nun
darin, dass das invertierende Fragment in einem der Biosynthesewege
so geklont wird, dass dann, wenn das Invertierungsfragment in der
einen Ausrichtung vorliegt, der Stoffwechselweg normal funktioniert,
in der anderen Ausrichtung die Biosynthese jedoch an der Stelle,
wo das Inversionsfragement eingefügt wird, gestoppt wird. Der
andere Teil des Stoffwechselweges, der normal funktioniert, kann
jedoch die Akkumulierung intermediärer Produkte ermöglichen,
die von einem anderen Biosyntheseweg verwertet werden. Da der Inversionsprozess
von außen
gesteuert werden kann, ist es möglich,
die Biosynthesewege nach Bedarf zu modifizieren. Der erfindungsgemäß beschriebene
Bakteriophage hat somit umwälzende
Wirkung insbesondere für die
Industriezweige, die an der großtechnischen
Herstellung von durch Mikroorganismen erzeugten wertvollen sekundären Metaboliten
beteiligt sind. Dieser Phage infiziert auch Mykobakterien, wodurch
Mutanten derselben erhalten werden können. Diese können als
Lebendimpfstoffe verwendet werden. Die vorliegende Erfindung bietet
somit die Möglichkeit über einen
Transposon-Phagen zu verfügen,
der als generalisiertes Transduktionssystem für eine Reihe von Gattungen
von grampositiven Bakterien verwendet werden kann.
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Bei
der Herstellung des Bakteriophagen ist die Wahl des Wachstumsmediums
von entscheidender Bedeutung. Es werden dabei verschiedene bekannte
Medien verwendet:
- (1) Luria Bertani (LB), das
pro 1000 ml 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl enthält,
- (2) Hefeextrakt: Malzextrakt pro 1000 ml: 2 g Hefeextrakt, 4
g Malzextrakt und 10 g Glucose,
- (3) Tryptische Sojabouillon pro 1000 ml: 17 g Pankreas-Spaltprodukt von
Casein, 3 g Papain-Spaltprodukt von Soja mehl, 5 g NaCl, 2,5 g zweibasiges
Kaliumphosphat und 2,5 g Dextrose und
- (4) Bennett's
Medium, das pro 1000 ml folgende Komponenten enthält: 1 g
Hefeextrakt, 1 g Fleischextrakt, 2 g Pankreas-Spaltprodukt von Casein und 10 g Dextrose.
Diese bekannten Medien wurden getestet und es wurde festgestellt,
dass keines dieser Medien die Freisetzung großer Mengen an Phagenpartikeln
begünstigt.
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Die
Komponenten der oben aufgeführten
bekannten Medien sind nicht leicht assimilierbar und begünstigen
nicht in erheblichem Maße
den lytischen Zyklus des Phagen. Außerdem entbehren alle oben
genannten Medien der Spurenelemente, die für das Wachstum von Lebewesen
von besonderer Bedeutung sind, was schließlich den lytischen Zyklus
des Bakteriophagen beeinflussen kann. Eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung betrifft somit ein Wachstumsmedium, das unter anderem
für Pilze
und Bakterien und insbesondere für
den Stamm Saccharomonospora PA 136, der ein Lysogen des Phagen PIS
136 darstellt, geeignet ist.
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Hauptaufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher die Herstellung eines Bakteriophagen,
der als genetisches Werkzeug für
die Untersuchung der biologischen, biochemischen, physiologischen
und genetischen Eigenschaften einer großen Zahl von Gattungen der
Actinomycetes und anderer grampositiver Bakterien geeignet ist.
Das Verfahren umfasst die Stufen der Isolierung und Reinigung eines
neuen temperenten Bakteriophagen (bzw. Phagen) aus dem Stamm Saccharomonospora
PA136, wobei der Phage bzw. sein Bakteriophage als genetisches Werkzeug
zur Untersuchung der Molekularbiologie und anderer Eigenschaften
einer großen
Zahl von grampositiven Bakterien verwendet werden kann. Der Stamm
Saccharomonospora PA136 ist ein Lysogen und nach der Lyse ergibt
dieser einen mutagenen Bakteriophagen mit weitem Wirtsbereich, und
zwar PIS136.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des
oben beschriebenen Bakteriophagen bzw. des Phagen als Transposon
für die
Erzeugung von Random-Mutationen in einem weiten Bereich von Bakterien
oder in einem anderen geeigneten Wirt.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des
invertierbaren Fragments des in einen geeigneten Vektor geklonten
Phagen zur Steuerung bzw. Regulierung der sekundären Stoffwechselwege entweder
des Wirtsstammes oder eines heterologen Wirtes. Der Phage PIS 136
kann die Restriktionsbarrieren vieler Actinomycetenstämme überwinden
und sich selbst als Lysogen etablieren, indem er sich an willkürlich gewählten Abschnitten
der Wirtsgenome einfügt.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit einen aus Saccharomonospora isolierten
Bakteriophagen (Zugangsnummer DSM 12317) mit ca. 90 Kilobasenpaaren
eines langen, doppelsträngige
DNA aufweisenden Genoms mit einem Guanidin- und Cytosingehalt von
69-71 mol-% bereit. Der erfindungsgemäße Bakteriophage kommt als
Werkzeug für
die Untersuchung der biologi-schen, biochemischen, physiologischen
und genetischen Eigenschaften von Actinomyceten und anderen Organismen
in Frage.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren zur Isolierung eines Bakteriophagen als Werkzeug für die Untersuchung
biologischer, biochemischer, physiologischer und genetischer Eigenschaften von
Actinomycetes und anderen Organismen, das die Inkubation eines bei
der DSMZ-Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH unter der Zugangsnummer DSM 12317 (Indische Zugangsnummer MTCC
A0001) hinterlegten Stammes von Saccharomonospora in einem Nährmedium
bis zur Erreichung des Autolysestadiums, die Isolierung und Reinigung
eines Bakteriophagen aus diesem Medium umfasst, der in der lysierten
Kultur mit üblichen
Methoden erzeugt wird, bereit. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen
umfasst das Verfahren außerdem
noch das Aufbrechen der Proteinhülle
des isolierten Bakteriophagen mit bekannten Methoden unter nachfolgender
Rückgewinnung
des Bakteriophagen durch übliche
Ausfällungstechniken.
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Der
Bakteriophage kann in einem beliebigen Medium bei einem pH von 7,0
bis 7,5 gezüchtet
werden, das unterschiedliche Mengen an Fleischextrakt, Hefeextrakt,
Trypton, Tryptose, Pepton, Proteosepepton, Malzextrakt, Glucose,
Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Fe(III)-Ammonoiumcitrat und Cobaltchlorid
enthält. Das
bevorzugte Medium umfasst jedoch Rinderextrakt, Tryptose, Peptonproteose,
Hefeextrakt, Glucose, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Fe(III)-Ammoniumcitrat,
Cobaltchlorid bei pH 7,2 in den nachfolgend konkret beschriebenen
Mengen.
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Die
Inkubation während
3-6 Tagen unterstützt
die Freisetzung des Bakteriophagen in das Medium. Die besten Ergebnisse
werden jedoch ab dem fünften
Tag erzielt.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
kann der Bakteriophage durch ein modifiziertes Verfahren nach Yamamoto
et al., 1970 und Smorawinska et al., 1988 (Yamamoto, K.R.; Alberts,
B.M. Benzinger, R. Lawhorne, L. und Trieber, G., 1970, Virology,
40: 734-744; Smorawinska, M., Denis, F., Dery, C.V., Magny, P. und
Brzenski, R., 1988, Journal of General Microbiology, 134: 1773-1778)
gereinigt werden.
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Die
Erfindung erstreckt sich außerdem
auf einen Klonungsvektor, der die DNA des Bakteriophagen enthält, und
kann ein Plasmid umfassen.
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Der
erfindungsgemäße Bakteriophage
kann zur Erzeugung von Mutationen in den Stoffwechselwegen von Bakterien
und nach einer gewissen spezifischen Abänderung, wie z.B. nach Klonung
in geeigneten Mobilisierungsvektoren auch zur Untersu chung der Stoffwechselwege
anderer Mikroorganismen und Pflanzen verwendet werden. Die Ergebnisse
der oben erwähnten
Abänderungen
bzw. Mutationen können
zur Erzeugung neuer Stoffwechselprodukte bzw. zur Expression neuer
physiologisch aktiver Verbindungen führen oder die pathogenen Eigenschaften
eines Organismus verändern,
wobei jedoch die immunogenen Eigenschaften aufrechterhalten werden,
welche den Organismus dazu befähigen,
dass er als Lebendimpfstoffstamm oder zur Expression neuer Eigenschaften
im selben Wirt oder in heterologen Wirten verwendet werden kann.
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Das
Nährmedium
für die
Durchführung
der vorliegenden Erfindung kann durch Mischen geeigneter Mengen
der nachfolgenden chemischen Stoffe und komplexer Medienkomponenten
wie Fleischextrakt oder Lab Lamco, Hefeextrakt, Tryptose, Proteosepepton,
lösliche
Stärke,
Dextrose und Spuren von Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und Fe(III)-Ammoniumcitrat
hergestellt werden. Die fertige Zubereitung, gelöst in doppelt destilliertem
Wasser, hat dann bei Raumtemperatur einen pH von ca. 6,0 bis 6,6.
Dieses Medium wirkt dann nach Einstellung des pH auf einen Bereich
von 7,0 bis 7,2 unter Verwendung von 1N NaOH als Universalmedium für das Wachstum
einer großen
Zahl von Gattungen der Actinomycetes, anderer grampositiver Bakterien,
bestimmter gramnegativer Bakterien und mehrerer Gruppen von Pilzen.
Insbesondere erwies es sich als ausgezeichnetes Medium für das Wachstum
des Stammes Saccharomonospora PA 136.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Nährmedium
ein Gemisch aus Makronährstoffen,
Mikronährstoffen
und Spurenelementen in den nachfolgend genannten Mengen, wobei der
Rest auf doppelt destilliertes Wasser entfällt:
- A.
Makronährstoffe
in Form assimilierbarer C-Quellen wie
1. Lab Lamco oder Fleischextrakt,
8-12 g
2. Stärke,
1-2 g
3. Dextrose, 10-12 g und
auch in Form assimilierbarerr
N-Quellen wie
1. Proteosepepton, 1-3 g
2. Tryptose, 1-3
g
- B. Mikronährstoffe,
ausgewählt
unter Hefeextrakt, 1-3 g, und
- C. Spurenelemte, ausgewählt
unter:
1. Cobaltchlorid oder -nitrat, 5-10 mg
2. Fe(III)-Ammoniumcitrat,
5-10 mg
3. Magnesiumsulfat oder -chlorid, 0-10 mM
4. Calciumchlorid
oder -nitrat, 0-10 mM.
auf 1000 ml doppelt destilliertes Wasser.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung:
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst im Einzelnen folgende Schritte:
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Isolierung
des Saccharomonospora-Stammes
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Aus
einem aktiven Komposthaufen in Northumberland, einer Grafschaft
im Vereinigten Königreich, und
aus Tokio (Japan) wurden 6 bis 18 Zoll unterhalb der Oberfläche Bodenproben
entnommen. Diese wurden zuerst an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet,
um die Organismen abzutöten,
die trocknungsempfindlich sind, und dann bei ca. 100°C erhitzt
und auf Raumtemperatur abgekühlt.
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Ein
Gramm jeder der gesammelten und wie oben vorbehandelten Proben wurde
in sterilem Wasser suspendiert und verwirbelt. 1 ml jeder Suspension
wurde dann in einem üblichen
Medium plattiert, das das Natriumsalz der Huminsäure, CaCO3,
Fe(II)-Sulfat und
KCl, MgSO4, Na2HPO4 in destilliertem Wasser bei einem pH über 7,0
enthielt und mit Cycloheximid, Nystatin, Nalidixinsäure, Penicillin
G und Polymyxin B supplementiert wurde.
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Die
Platten wurden dann während
2 bis 5 Wochen inkubiert. Jede Kolonie der betreffenden Platte wurde
dann auf ein Me dium überimpft,
das abgemessene Mengen an Fleischextrakt, Tryptose, Hefeextrakt,
Proteosepepton, Dextrose, Calciumnitrat oder Calciumchlorid, Magnesiumchlorid
oder Magnesiumsulfat, Spuren von Fe(III)-Ammoniumcitrat, Spuren
von Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und löslicher Stärke in destilliertem Wasser
enthielt, und zwar unter Aufrechterhaltung des pH des Mediums in
einem Bereich zwischen 6,0 und 8,5. Die Kulturplatten wurden dann
inkubiert, wonach die grüne
Pigmente produzierenden Kolonien in einem neuen Medium, das weiter
unten näher
beschrieben wird, gereinigt wurden.
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Identifizierung
des Stammes
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Alle
grünes
Pigment produzierenden Kolonien wurden auf das genannte neue Medium
unter Verwendung von McCartney's-Flaschen
erneut ausgebracht. Eine Probe jedes Isolats wurde dann in Glycerin
konserviert, wobei man das Medium bei einer Temperatur von unter –20°C einsetzte.
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Die
auf diese Weise erhaltenen, grünes
Pigment produzierenden Kolonien wurden nach üblichen Verfahren wie nach
morphologischen Eigenschaften, Verwertung von Substraten wie C- und N-Quelle, Produktion extrazellulärer Enzyme
und chemische Zusammensetzung der Gesamtzelle (chemotaxonomisch)
identifiziert. Die Anwesenheit einer einzigen lateral angeordneten
weißgefärbten Spore,
von Mesodiaminopimelinsäure, Arabinose
und Galactose als Gesamtzucker, jedoch ohne Mykolsäure, und
mit dem Hauptanteil an C16-Iso- und -Anisofettsäuren bewies,
dass es sich bei dem Stamm um einen Vertreter der Gruppe der Actinomycetes handelt.
Der Stamm PA136 wurde als Art der Gattung Saccharomonospora identifiziert.
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Es
wurde festgestellt, dass die Kulturen, welche grünes Pigment produzieren, nach
5- bis 6-tägiger
Inkubation zu lysieren begannen. Die Überimpfung von Zellen aus dem
lysierten Bereich in frisches Medium führte zum Wachstum desselben Organismus,
der ebenfalls lysierte. Dieser Versuch wurde mehrmals wiederholt, wobei
jedes Mal das gleiche Ergebnis erzielt wurde. Die Ergebnisse legten
nahe, dass die Lyse nicht zu 100 % erfolgt und der Grund für die Lyse
erblich ist.
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Das
Phänomen
der Autolyse bzw. der induzierten Lyse, wie sie oben beschrieben
wurde, wurde auch in der Flüssigkultur
beobachtet, wobei sich die Freisetzung des Bakteriophagen als Ursache
für die
Lyse herausstellte.
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Isolierung
und Reinigung des Phagen
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Es
wurde beobachtet, dass der Stamm Saccharomonospora PA136 nach 3-6-tägiger Inkubation
auf einer Kulturplatte lysierte, wobei diese Platte folgende Medien
umfasste:
- 1. Medium mit folgenden Komponenten:
Fleischextrakt, Hefeextrakt, Tryptose, Proteosepepton, Dextrose, Calciumchlorid,
Magnesiumchlorid, Agar und destilliertes Wasser auf 1000 ml bei
einem pH von 6,8 bis 7,5.
- 2. Tryptisches Sojaagar/Bouillon, die Pankreas-Spaltprodukt
von Sojamehl, K2HPO4 Dextrose,
Agar und doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml bei einem pH von
6,8 bis 7,5 enthielt.
- 3. Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium, das Hefeextrakt, Malzextrakt,
Glucose, Agar und doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml bei einem
pH von 6,8 bis 7,5 enthielt.
Die Lyse der Kultur in einer Platte
wurde bis zur Inkubationstemperatur von 55°C beobachtet.
Alle drei
oben aufgeführten
Medien können
sowohl für
die Autolyse als auch für
die Induktion verwendet werden.
- 4. Das neue Medium, das weiter unten näher beschrieben werden wird,
wurde mit 5-6 Ösen
der aktiv wachsenden Kultur von PA136 beimpft und bei ca. 25°C während ca.
36 bis 40 Stunden inkubiert und dann zur Beimpfung eines Mediums
in industriellem Maßstab
verwendet. Die Impfdichte lag zwischen 5 und 10 % und die Kultur
wurde zwischen 25 und 30°C
gezüchtet.
Diese Kultur lysierte nach 4- bis 5-tägiger Inkubation entweder bei
25°C bis
30°C oder
durch Anheben der Temperatur von 39°C auf 42°C während 30 Minuten bis 6 Stunden.
- 5. Gemäß einem
weiteren Versuch wurde eine 2 Tage alte Kultur der Einwirkung von
UV-Licht mit kurzer Wellenlänge
während
ca. 10 bis 40 Sekunden ausgesetzt und dann zur Beimpfung von 300
ml Medium (1000 ml-Kolben) verwendet. Diese Kultur lysierte schneller
als eine, die nicht dem UV-Licht ausgesetzt war. Dauerte die Bestrahlung
länger
als 40 Sekunden, d.h. 60 Sekunden, waren für die Erreichung des lytischen
Stadiums 7 bis 10 Tage erforderlich, da das anfängliche Wachstum nur äußerst schwach
war.
-
Aus
jeder der autolysierten oder induzierten Kulturen konnte der ursprüngliche
Stamm PA 136 wieder zurückgewonnen
werden und der Phage PIS136 konnte gereinigt werden.
-
Der
Phage wurde nach dem üblichen
Verfahren von Yamamoto et al., 1970, und Smorawinska et al., 1988
(Yamamoto, K.R.; Alberts, B.M., Benzinger, R., Lawhorne, L. und
Treiber, G., 1970, Rapid bacteriophage sedimentation in the presence
of polyethylen-glycol and its application to large scale virus purification,
Virology, 40: 734-744; Smorawinska, M., Denis, F., Dery, C.V., Magny,
P. und Brzenski, R., 1988. Characterization of SE-3, a virulent
bacteriophage of Saccharopolyspora erythraea, Journal of General
Microbiology, 134: 1773-1778), unter geringer Modifizierung gereinigt,
wobei letztere darin bestand, dass bei 35.000 Upm während ca.
vier Stunden pelletiert wurde.
-
In
den Ansprüchen
10-14 wird ein Verfahren beansprucht, bei dem die Ausfällung des
Polynucleotids in Anwesenheit von 0,25 M NaCl und einer Lösung von
0,15 M NaCl und 0,015 M Tri-Na-Citrat bei 4°C in Anwesenheit von Ethanol
durchgeführt
wird.
-
Die
weitere elektronenmikroskopische Kennzeichnung des Bakteriophagen
erfolgte nach dem üblichen
Verfahren, z.B. durch Negativfärbung
unter Verwendung von Phosphorwolframsäure bei neutralem pH.
-
Der
Bakteriophage weist keine Stellen für die mit * markierten Restriktionsenzyme
auf, ist jedoch gegenüber
den nachfolgend angeführten
Restriktionsenzymen empfindlich:
*Ava I, *Ase I, BamHI, *Bgl
II, *Dpn I, *Dra I, EcoRI, *Hind III, *EcoR V, Kpn I, *Pst I, *Xba
I, *Xho I, BstE II, Bst X I, Alu I, Sau3A I, Sph I (hitzebeständig), Sfi
I, Cla I, Nco I, MlU I, Sac I, Sac II, Sca I, Sal I, Sma I, Stu
I, Pvu II, Xma I, Nhe I, Spe I, SnaB I, Not I, Xmn I, Msp I, Hpa
II, Mbo I, Hae III, Hha I, *Nsi I, Nar I, Age I, BstN I (das sind
die Standardbezeichnungen, die weltweit verwendet werden. Diese
Produkte werden von unterschiedlichen Firmen unter den üblichen
Bezeichnungen, wie hier beschrieben, vertrieben).
-
Der
Phage bzw. Bakteriophage infiziert die folgenden Stämme von
Actinomycetes: Streptomyces albusG (D.A. Hopwood), Streptomyces
albus (Sal I-defektive Mitante) (D.A. Hopwood), S. albunaceus, S.
achromogenes subsp., achromogenes (DSM 40028), S. coelicolor A3
(2) (D.A. Hopwood), S. coelicolor ΦC31 empfindliche Mutante, (D.A.
Hopwood), S, clavuligerus (NRRL-B 3585), S. canescens (ISP 5001),
S. galileus (K. Dharmalingam), S. hygroscopicus (ISP 5578), S. lividans
(D.A. Hopwood), S. varsoviensis (DSM 40346), S. vastus (DSM 40309),
S. vinaceus (DSM 40257), Saccharopolyspora erythreus (NRRL-B 5616),
Saccharothrix aerocolonigenes (DSM 40034), Streptoverticillium albireticuli
(DSM 40051), Microtetraspora inositola (DSM 43189), Micromonospora
pusilla (IFO 14684), Actinomadura madurae (IFO 14623), Amycolatopsis
mediterranei (ATCC 27643), A. mediterranei (ATCC 21789), A. mediterranei
(ATCC 21271), A. mediterranei(13685), Nocardia amarae (Gordona amarae),
Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegnatis und Bacillus subtilis.
-
Gewinnung
der Phagen-DNA
-
Das
Standardverfahren zur Herstellung von Phagen-DNA wurde entsprechend
dem Phagen PIS136 modifiziert: Die Behandlung mit ProteinaseK und
SDS (Na-dodesyl-sulfat) wurde mit β-Mercaptoethanol und Triton
X-100 supplementiert. Über
längere
Zeit wurde in einem Temperaturbereich von 37-53°C inkubiert. Die Empfindlichkeit
der Phagen-DNA gegenüber
Restriktionsenzymen und gegenüber
Methylierung erfolgte nach dem üblichen
Verfahren.
-
Der
Wirtsbereich des Bakteriophagen PIS136 wurde nach Standardverfahren
entweder durch Serienverdünnung
des Phagenpräparats
unter Auftüpfeln
auf den Rasen der Teststämme
oder durch Infektion einer Einzelzellkultur, von Sporen oder Myzelen
der Teststämme
geprüft.
Die Anwesenheit einer lytischen Zone bzw. Plaque-Bildung zeigten,
dass ein konkreter Stamm gegenüber
dem Phagen empfindlich ist.
-
Zur
Erzeugung des Lysogens aus den Stämmen, welche Sporen produzierten,
bediente man sich des von Hopwood et al., 1985 (Hopwood, D.A., Bibb,
M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate,
D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. und Schrempf, H., 1985, Genetic manipulation
of Streptomyces: A. laboratory manual. The John Innes Foundation,
Vereinigtes Königreich)
beschriebenen Verfahrens. Zur Isolierung der Lysogene aus nicht
sporenbildenden Stämmen
wurden die Zellen aus dem lysierten Bereich gesammelt, in einem
sterilen Phagenpuffer suspendiert und auf ein neues Nährme dium
(wie oben beschrieben) ausgebracht. Die heranwachsenden Kolonien
wurden auf die Anwesenheit des Bakteriophagen nach Standardmethoden
wie Southern-Hybridisierung unter Verwendung der DNA des Phagen
PIS136 als Sonde oder durch Auftüpfeln
der vermuteten Lysogene auf den Rasen eines phagenempfindlichen
Stammes und nachfolgende Beobachtung der Lysezone um die aufgetüpfelten
Zellen getestet.
-
Die
auf diese Weise erhaltenen Lysogene wurden auf veränderte Eigenschaften
hin, auf Mutationen im Substratverwertungsweg, auf den Verlust der
Pigmentproduktion oder im Hinblick auf die Sporenbildung nach der
Standardmethode getestet, beschrieben von Hopwood et al., 1985 (Hopwood,
D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser,
H.M., Lydiate, D.H., Smith, C.P., Ward, J.M. und Schrempf, H., 1985, Genetic
manipulation of Streptomyces: A Laboratory manual. The John Innes
foundation, Vereinigtes Königreich).
Die Lysogene, die sich im Hinblick auf die Verwertung eines oder
mehrerer getesteter Substrate als defektiv erwiesen, wurden ferner
durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Gesamtphagen-DNA
als Sonde auf die Anwesenheit des Bakteriophagen geprüft.
-
Das
Originallysogen Saccharomonospora PA136 produziert ein grünes Pigment.
Aus dem Stamm Saccharomonospora PA136, welcher das ursprüngliche
grüne Pigment
produziert, wurden jedoch auch gelbes Pigment oder überhaupt
kein Pigment produzierende Varianten erzielt. Diese Variantenstämme unterliegen auch
der Autolyse und produzieren den Phagen PIS136. Die Lysate des gelbes
Pigment oder überhaupt
kein Pigment produzierenden Varianten und der aus diesen Lysaten
gereinigte Phage PIS136 zeigten einen relativ schmalen Wirtsbereich
verglichen mit dem des Phagenpräparats
aus dem grünes
Pigment produzierenden Lysat. Durch Spaltung der Phagen-DNA durch
mehrere Restriktionsenzyme konnte ferner festgestellt werden, dass
eine Region des Phagen-DNA ihre Orientierung verändert und diese Veränderung
auf der Inversion eines der DNA-Fragmente beruht. Die Inversion
der Phagen-DNA bzw. des Polynucleotidfragments scheint die Ursache
für den
verminderten Wirtsbereich zu sein, den Phagenpräparate zeigen, die aus gelbes
Pigment oder überhaupt
kein Pigment produzierenden Varianten erhalten wurden.
-
Eigenschaften der Stämme Saccharomonospora
PA136
-
Verwertung
folgender Verbindungen: (a) NaCl; (b) Hypoxanthin; (c) Hypoxanthin
+ 0,3 % Glucose; (d) Tributyrin; (e) Xylit; (f) Thalliumacetat;
(g) Thalliumacetat + 0,1 % Glucose; (h) Propanol; (i) Butanol-1,3-diol;
(j) D-Fucose; (k) Salicin; (1) Arabinose; (m) L-Asparagin; (n) Phenylalanin
und (p) Na-Benzoat.
-
Wachstum
bei 20-55°C
auf einer Agarplatte. Wachstum in einem pH-Bereich von 5,5 bis 9,0.
Katalase-positiv. Produktion folgender extrazellulärer Enzyme:
(a) Lipase (C14); (b) Leucinarylamidase; (c) Valinarylamidase; (d)
Cysteinarylamidase; (e) Trypsin; (f) Chemotrypsin; (g) Saure Phosphatase;
(h) Naphthol-As-B1-Phosphorhydrolase; (i) α-Glucosidase; (j) β-Glucosidase.
-
Die
chemische Zusammensetzung der Gesamtzelle umfasst Mesodi-aminopimelinsäure, Arabinose, Galactose,
Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin,
Hydroxyphosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositglycolipide und
Zucker mit einer nichtidentifizierte Gruppe von Phospholipiden.
-
Es
liegt ein Hauptanteil an C16-Iso und -Antiso-Fettsäuren verzweigt-
und geradkettiger C-Verbindungen vor. Saccharose wird nicht verwertet.
Es wird jeweils eine einzige lateral angeordnete weiße Spore
gebildet. Meist wird diffundierbares Pigment gebildet, das grün, orange
oder gelb ist. Manchmal produziert der Stamm Saccharomonospora PA136 überhaupt
kein Pigment. Gegebenenfalls ist das Pigment auch nicht diffun dierbar.
Die vom Stamm Saccharomonospora PA136 produzierten Pigmente sind
jedoch wasserlöslich.
Die Pigmente sind unlöslich
in Ether, Ethanol, Methanol, Butanol, Isopropanol, Benzol, Ethylacetat,
Chloroform und Aceton, jedoch teilweise löslich in Phenol.
-
Aufgrund
der Eigenschaften wie Meso-diaminopimelinsäure, vorwiegender Anteil an
C16-Iso- und -Antiso-Fettsäuren sowie
Arabinose und Galactose als wichtigster Zucker wurde der grünes Pigment
produzierende Stamm als Art der Gattung Saccharomonospora identifiziert.
-
Das
für die
Inkubation und die Reinigung der Kolonien verwendete Wachstumsmedium
wurde durch Mischen geeigneter Mengen der nachfolgenden chemischen
Stoffe und komplexer Medienkomponenten, ausgewählt unter Rinderextrakt oder
Lab Lamco, Hefeextrakt, Tryptose, Peptonproteose, lösliche Stärke, Dextrose
und Spuren von Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und Fe(III)-Ammoniumcitrat,
hergestellt. Die Zubereitung hat nach ihrer Herstellung und Lösung in
doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur einen pH von ca. 6,0
bis 6,6. Dieses Medium wirkt, wenn es als solches verwendet wird,
bzw. nach Einstellung des pH auf 7,0-7,2 unter Verwendung von 1
N NaOH als Universalmedium für
das Wachstum einer großen
Zahl von Gattungen der Actinomycetes, weiterer grampositiver Bakterien,
beliebiger gramnegativer Bakterien und bei mehreren Gruppen von
Pilzen. Das Wachstumsmedium ist ein Universalwachstumsmedium, das
besonders geeignet ist für
anspruchsvolle Organismen der Gattungen Actinomadura, Amycolatopsis,
Anthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Streptomyces,
Streptoverticillium, Saccharomonospora, Microtetraspora, Micromonospora,
Nocardia, Nocardiodes, für
langsam und schnell wachsende Mycobacteria, die Gattungen Bacillus,
Escherichia und Pseudomonas sowie für mehrere andere langsam wachsende,
jedoch noch nicht identifizierte Actinomyceten und mehrere Gruppen
von Pilzen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird das Medium
jedoch insbesondere im Hinblick auf seine Eignung als Wachstumsmedium
für Saccharomonospora-Stämme beschrieben.
-
Das
Verfahren zur Herstellung des Wachstumsmediums umfasst das Mischen
von A, B und C, d.h. der Makronährstoffe,
Mikronährstoffe
und Spurenelemente in den nachfolgend genannten Mengen:
- A. Makronährstoffe
in Form assimilierbarer C-Quellen wie
1. Lab Lamco oder Fleischextrakt,
8-12 g
2. Stärke,
1-2 g
3. Dextrose, 10-12 g und
auch in Form assimilierbarer
N-Quellen wie
1. Proteosepepton, 1-3 g
2. Tryptose, 1-3
g
- B. Mikronährstoffe,
ausgewählt
unter
Hefeextrakt, 1-3 g, und
- C. Spurenelemente, ausgewählt
unter:
1. Cobaltchlorid oder -nitrat, 5-10 mg
2. Fe(III)-Ammoniumcitrat,
5-10 mg
3. Magnesiumsulfat oder -chlorid, 0-10 mM
4. Calciumchlorid
oder -nitrat, 0-10 mM,
auf 1000 ml doppelt destilliertes Wasser.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung enthält
das Medium Makronährstoffe
wie Kohlenstoff in Form von Lab Lamco oder Fleischextrakt, Stärke und
Dextrose, Stickstoff in Form von Proteosepepton und Tryptose, Mikronährstoffe
wie Vitamine in Form von Hefeextrakt, Spurenelemente wie Cobaltchlorid
oder Cobaltnitrat und Fe(III)-Ammoniumcitrat und doppelt destilliertes
Wasser. Gegebenenfalls können
gereinigtes Agar, Calcium und Magnesium zugesetzt werden.
-
Einer
der wichtigsten Aspekte bei der Herstellung des Wachstumsmediums
ist die Zugabe einer Extra-C-Quelle zum Medium. Es ist allgemein
bekannt, dass Glucose in den Stoffwechselweg eintritt, ohne modifiziert
zu werden, so dass es für
die meisten Organismen ein bevorzugtes C-Substrat darstellt, weil
es auch sehr rasch verwertet wird. Hohe Glucosekonzentrationen im
Medium üben
jedoch eine negative Wirkung aus, da Glucose die Osmolarität des Mediums
verändert.
Die Glucose/Dextrose-Konzentration im Medium wird auch durch Autoklavieren
sowie durch lange Inkubation beeinflusst. Viele Actinomycetes-Gattungen
wachsen sehr langsam, so dass eine zusätzliche C-Quelle erforderlich
ist, welche die Glucose/Dextrose nur langsam und konstant über längere Zeit
freisetzt. Als zusätzliche
C-Quelle wurde im Hinblick auf die Eigenschaften von Actinomycetes
und einiger Pilze Stärke
gewählt,
da die meisten oben angeführten
Organismen Stärke
verwerten, wenn auch nur langsam. Ein weiterer wichtiger Aspekt
besteht im Zusatz von Spurenelementen wie Cobalt und Eisen. Die
entscheidende Rolle, welche Spurenelemente beim Wachstum von Organismen
spielen, ist eine allgemein anerkannte Tatsache. Keines der oben
aufgeführten
Medien weist jedoch Spurenelemente als Teil ihrer Komponente auf.
-
Die
einzelnen Makro- und Mikronährstoffe
des erfindungsgemäßen Mediums
liegen in folgender Konzentration vor: Makronährstoffe: Lab Lamco, 8-10 g
oder Fleischextrakt, 10-12 g, Proteosepepton, 1-3 g, Tryptose, 1-3
g, Dextrose, 10-12 g, lösliche
Stärke,
1-2 g, die Mikronährstoffe
sind Hefeextrakt, 1-3 g und die Spurenelemente sind Cobaltchlorid
oder -nitrat, 5-10 mg, Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5-10 mg, Magnesiumsulfat
oder Magnesiumchlorid, 5-10 mM, Calciumchlorid oder Calciumnitrat,
5-10 mM, doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml und pH 6,8-7,2.
Die Zugabe von Calcium- und Magnesiumionen ist fakultativ, d.h.
ihre An- oder Abwesenheit hat auf das Wachstum des jeweiligen Organismus
keine besondere Auswirkung.
-
In
Tabelle 1 wird das tryptische Soja-Bouillonmedium mit anderen Zusatzstoffen
verglichen, im Wesentlichen im Hinblick auf das Wachstum von PA136
unter nachfolgender Lyse. Der Phage wird aus der lysierten Kultur
von Saccharomonospo ra Stamm PA 136 gereinigt. Das neue Medium ermöglicht die
Durchführung der
Lyse innerhalb von 96 Stunden. Das TSB-Medium nimmt 144 Stunden
in Anspruch und selbst dann noch ist die Lyse unvollständig. Die
unvollständige
Lyse führt
zu einer geringen Phagenausbeute.
-
-
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird in den nachfolgenden Beispielen illustriert, schränkt den
Umfang der vorliegenden Anmeldung jedoch nicht ein.
-
Beispiel 1:
-
Zehn
Gramm Bodenproben wurden aus einer Tiefe von 15 Zoll unterhalb der
Oberfläche
eines aktiven Komposthaufens aus Northumberland, einer Grafschaft
im Vereinigten Königreich,
sowie aus Tokio (Japan) entnommen. Die Proben wurden zuerst 8 Tage
lang bei Raumtemperatur luftgetrocknet, um trocknungsempfindliche
Organismen abzutöten,
dann 1 Stunde lang bei 110°C
erwärmt
und wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Ein Gramm der gesammelten
und wie oben beschrieben vorbehandelten Probe wurde in sterilem Wasser
suspendiert und verwirbelt. 1 ml dieser Suspension wurde dann auf
Platten mit einem Medium ausgebracht, das das Na-Salz der Huminsäure, 10
g, CaCO3, 0,02 g, Fe(II)-Sulfat, 0,01 g,
KCl, 1,7 g, MgSO4, 0,05 g, (Na)2HPO4, 0,5 g, in destilliertem Wasser bei pH
7,2 enthielt, und mit Cycloheximid, 50 μg/ml und Nystatin, 50 μg/ml, Nalidixinsäure, 20 μg/ml, Penicillin
G 0,8 μg/ml
und Polymyxin B 4 μg/ml
supplementiert. Die 21 verwendeten Platten wurden dann bei einer
Temperatur zwischen 25°C
und 55°C
(drei Platten jeweils bei einer Temperaturdifferenz von 5°C), während einer
Zeitdauer im Bereich von 2-5 Wochen inkubiert. Jede Kolonie der
jeweiligen Platte wurde dann auf ein Medium überimpft, das Fleischextrakt,
12 g, Tryptose, 2 g, Hefeextrakt, 2 g, Proteosepepton, 2 g, Dextrose,
10 g, Calciumnitrat oder Calciumchlorid, 10 mM, Magnesiumchlorid oder
Magnesiumsulfat, 10 mN, Fe(II)-Ammoniumcitrat, 5 mg, Cobaltchlorid
oder Cobaltnitrat, 5 mg und lösliche Stärke, 10
mg in 1000 ml destilliertem Wasser enthielt, wobei der pH des Mediums
bei 7,2 gehalten wurde. Die Kulturplatten wurden dann bei 30°C inkubiert,
wonach die grüne
Pigmente produzierenden Kolonien auf dem obigen Medium gereinigt
wurden. Alle grüne
Pigmente produzierenden Kolonien wurden dann auf das obige Medium,
das Gegenstand einer parallelen Anmeldung ist, in einer Petrischale
oder auf Schrägagar
unter Verwendung von McCartney's-Flaschen überimpft.
Eine Probe jedes Isolats wurde dann in Glycerin konserviert, wobei
man das Medium bei einer Temperatur von unter –20°C einsetzte. C. Die auf diese
Weise erhaltenen, grünes
Pigment produzierenden Kolonien wurden nach üblichen Verfahren wie nach
morphologischen Eigenschaften, Verwertung von Substraten wie C-
und N-Quelle, Produktion extrazellulärer Enzyme und chemische Zusammensetzung
der Gesamtzelle (chemotaxonomisch) identifiziert. Die Anwesenheit
einer einzigen, lateral angeordneten weißgefärbten Spore, von Mesodiaminopimelinsäure, Arabinose
und Galactose als Gesamtzucker, jedoch ohne Mykolsäure, und
mit dem Hauptanteil an C16-Iso- und -Anisofettsäuren bewies,
dass es sich bei dem Stamm um einen Vertreter der Gruppe der Actinomycetes
handelt, wobei der Stamm als einer Art der Gattung Saccharomonospora
zugehörig
bezeichnet wurde.
-
Beispiel 2
-
Der
Phage PIS 136 wurde wie folgt isoliert:
Der Stamm Saccharomonospora
PA136, wie er oben erhalten wurde, wurde in dem obigen Medium an
5 aufeinander folgenden Tagen gezüchtet, bei 30°C inkubiert
und danach bei 200 Upm geschüttelt.
Nach den 5 Tagen wurde die Kultur bei 39°C 4 Stunden lang inkubiert.
Diese Inkubation ermöglichte
die Lyse der Kultur. Das auf diese Weise erhaltene Lysat wurde mit
Chloroform (Endkonzentration 3 %) behandelt. Das Chloroform tötet die
restlichen nichtlysierten lebenden Bakterien ab und unterstützt die
Lyse halblysierter Zellen. Dem auf diese Weise erhaltenen Lysat
wurde Natriumchlorid bis zur Endkonzentration von 0,05 mol zugesetzt,
wonach durch langsames Schütteln
gelöst
und in Eis während
1 Stunde inkubiert wurde. Das Gemisch wurde dann bei 8000 g 30 Minuten
lang bei 4°C
zentrifugiert, wonach der Überstand
gesammelt wurde. Dem auf diese Weise erhaltenen Überstand wurde Polyethylenglycol
8000 bis zu einer Endkonzentration von 10 % zugesetzt, wonach bis zur
Vervollständigung
bei sehr geringer Geschwindigkeit, um jede Schädigung der Phagenpartikel zu
vermeiden, gelöst
wurde. Diese Suspension wurde dann 17 bis 18 Stunden lang bei 4°C inkubiert.
Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat
wurde bei 10.000 g während
25 Minuten bei 4°C
pelletiert, in einen Phagenpuffer suspendiert und 24 Stunden bei
4°C stehen
gelassen. Nach erneutem Rühren
der Suspension wurde eine gleiche Menge Chloroform zugesetzt, sorgfältig, jedoch
langsam gerührt,
um das Polyethylenglycol und die Pigmente auszufällen, wonach bei 4°C 8 Stunden
lang inkubiert wurde. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde dann
erneut bei 14.000 Upm bei 4°C
15 Minuten lang zentrifugiert, wonach die obere wässrige Phase
in einem frischen Zentrifugenröhrchen
gesammelt wurde und das Verfahren anschließend wiederholt wurde. Die
auf diese Weise erhaltene wässrige
Phase wurde in einem Glyceringradienten, der 3 ml 40%-iges Glycerin
und 4 ml 5 %-iges Glycerin (die Verdünnungen erfolgten im Phagenpuffer)
enthielt und mit 3 ml Phagensuspension gereinigt. Die Pelletierung
erfolgte bei 35.000 Upm 4,5 Stunden lang bei 4°C in einem Standard-SW41-Rotor. Die
auf diese Weise erhaltenen Pellets enthielten den Phagen, der dann
erneut im Phagenpuffer suspendiert wurde. Die wie oben beschrieben
erhaltenen Glycerinpellets wurden unter Verwendung eines Gradienten
aus Cäsiumchloridlösungen,
die im Phagenpuffer erhalten wurden, gereinigt. Der Stufengradient
wurde in einem Zentrifugenröhrchen
aus drei 2 ml-Lösungen
mit einer Dichte von jeweils 1,360, 1,490 und 1,600 g cm–3 hergestellt.
Die vorgängig
als wässrige
Phase erhaltene Phagensuspension wurde oben auf die Gradientenlösung aufgegeben.
Der Gradient wurde bei 30.000 U/min 4,5 Stunden lang bei 16°C zentrifugiert.
Der Phase wurde dann zwischen 1600 und 1490 einer Bandenanalyse
unterworfen, dann durch Durchstechen der Seite des Röhrchens
entfernt und im Phagenpuffer verdünnt. Die Phagensuspension wurde
dann gegen den Phagenpuffer, der 25 mM Tris.HCl, 10 mM Magnesiumsulfat
und 10 mM Calciumnitrat oder -chlorid enthielt, bei einem pH von
7,5 und einer Temperatur von 4°C
während
24 Stunden dialysiert und dann für
weitere Untersuchungen verwendet. Die Transmissionselektronenmikroskopie
bestätigte
die Anwesenheit eines Bakteriophagen mit einem hexagonalen Kopf
und einem langen kontraktilen Schwanz im Lysat sowie in den Pellets,
die durch Glycerin-Gradientenreinigung oder durch Cäsiumchlorid-Gradientenreinigung
erhalten wurde.
-
Beispiel 3
-
Zur
Untersuchung des Wirtsbereichs wurden die Sporen produzierenden
Bakterienteststämme
(s. Tabelle 1) in einem Medium gezüchtet, das folgende Komponenten
enthielt:
Hefeextrakt, 2 g, Malzextrakt, 10 g, Glucose, 4 g,
Calciumcarbonat, 2,0 g, Agar, 1,2 % und 1000 ml doppelt destilliertes
Wasser, bei pH 7,2. Die Platten wurden dann bei 25-30°C bis zur
Sporenbildung inkubiert. Die Sporen wurden im Phagenpuffer gesammelt,
und zwar durch Kratzen auf der sporenbildenden Oberfläche, und dann
durch Verwirbeln gemischt, wonach die Suspension durch sterile nichtabsorbierende
Baumwolle filtriert wurde. Es wurde festgestellt, dass 0,2 ml einer
leicht trüben
Lösung
einen konfluenten Rasen erzeugten. In einem anderen sterilen Röhrchen wurden
0,2 ml der Sporensuspension durch Zugabe von 750 μl Phagenpuffer
und 50 μl
1 × 109 pbE/ml Phagensuspension (pbE = plaquebildende
Einheit) weiter verdünnt.
Nach leichtem, jedoch sorgfältigem
Rühren,
wurde die gesamte Suspension 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Nach einstündiger
Inkubation wurden 2 ml des in der parallelen Anmeldung beschriebenen,
0,3 % Agar enthaltenden Mediums sowie 10 mM Calciumnitrat und Magnesiumchlorid
zugesetzt, leicht gerührt
und dann auf vorgetrocknetes Medium aufgegeben. Die Mediumtemperatur
lag unter 95°C
und die Suspension wurde gleichmäßig auf
der Platte verteilt. Die Platte wurde dann eine Stunde lang stehen
gelassen und dann bei 25-30°C
inkubiert. Die Anwesenheit klarer oder trüber Flecken bzw. Plaques war
ein Indiz für
die Anwesenheit des Phagen, was bestätigte, dass der Bakterienteststamm
gegen die Phageninfektion enpfindlich ist. Man kann auch die Sporen
vor ihrer Infektion mit dem Phagen keimen lassen.
-
Beispiel 4
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Zur
Erzeugung von Lysogenen wurden 10-20 μl der in Beispiel 2 erhaltenen
Phagensuspension bzw. des Phagenlysates auf den Rasen des zu testenden
Stammes durch Betupfen auf getüpfelt.
Nach vollständiger
Trocknung der Suspension wurde der aufgetüpfelte Bereich markiert, wonach
man die Sporenbildung abwartete (sofern der Teststamm Sporen bildete)
bzw. während
5-6 Tagen inkubiert. Die Sporen- bzw. Myzelsuspension wurde dann
im Phagenpuffer verdünnt,
um zu einzelnen Kolonien zu gelangen. Diese wurden dann entweder
auf dem Rasen des empfindlichen Stammes bzw. Teststammes replika-plattiert
oder einzeln auf eine vorbeimpfte Platte aufgetüpfelt. Danach ließ man die
Platten wachsen und jede eine Lysezone bildende Kolonie war dann
Gegenstand für
weitere Tests als Lysogen. Einige Lysogene erwiesen sich auch als
auxotroph und entbehrten des Vermögens zur Synthese von Zuckern
oder Aminosäuren,
wie z.B. von Lactose, Galactose, Glucose, Arginin, Methionin, Tyrosin,
Leucin usw. Die beobachtete Auxotrophie beruhte auf einer Mutation der
Stoffwechselwege für
Zucker und Aminosäuren,
die durch den Phagen PIS136 verursacht war. Mutationen in mehr als
einem Weg bestätigen,
dass der Phage PIS136 in das Wirtsgenom an willkürlichen Abschnitten aufgenommen
wurde. Das Vermögen
zur Mutation und Random-Transposition zeigten deutlich Streptomyces coelicolor,
Streptomyces albis und Mycobacterium fortuitum.
-
Beispiel 5:
-
Die
DNA des Phagen PIS136 wurde nach einer Standardmethode zur Phagen-DNA-Reinigung
gereinigt, jedoch unter Abänderung
zur Anpassung an den Phagen PIS136. Die ca. 1 × 109 Phagenpartikel
pro ml enthaltende Phagensuspension wurde mit einer EDTA (Ethylendiamino-tetra-essigsäure)-Lösung gemischt, um
eine Endkonzentration von 50 mM zu erzielen. Diese Suspension wurde
dann mit einer Endkonzentration von ProteinaseK von 100 μg/ml, β-Mercaptoethanol,
14 mM, und 0,5 % SDS gemischt und bei 37°C während 2 Stunden inkubiert.
Nach der Zugabe von Triton X100 bis zu einer Endkonzentration von
1 % wurde die Lösung
30 Minuten bei 53°C
inkubiert. Diesem Gemisch wurde SSC (NaCl, 3 M, und TriNatriumCitrat,
0,3 M) bis zu einer Endkonzentration von 1X zugesetzt, wonach das
Gemisch 30 Minuten bei 65°C
inkubiert wurde. Nach langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur wurde
NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugesetzt. Nach sorgfältigem Rühren wurde
ein gleiches Volumen TE-gesättigtes
Phenol (Tris HCl pH 8,0, 10 mM, und EDTA pH 8,0, 1 mM) zugesetzt.
Nach sorgfältigem
Rühren
der Lösung
wurde bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, wonach die obere
wässrige
Schicht gesammelt wurde. Die Grenzschicht wurde noch einmal mit
TE extrahiert, wonach der Prozess der Phenolbehandlung wiederholt
wurde. Die wässrige
Schicht wurde mit zwei Chloroformbehandlungen weiter gereinigt,
wonach dann die Phagen-DNA mit dem zweifachen Volumen an kaltem
abs. Ethanol ausgefällt
wurde. Nach zwei Wäschen
in 70 %-igem Ethanol bei Raumtemperatur wurde das erhaltene Pellet
getrocknet und im TE-Puffer gelöst.
Die auf diese Weise erhaltene Phagen-DNA wurde für weitere Untersuchungen verwendet,
bei denen die DNA mit insgesamt 45 unterschiedlichen Restriktionsenzymen,
Methylase-empfindliche eingeschlossen, gespalten wurden. Die einzelnen
von den Restriktionsenzymen MspI, HPaII, Sau3Al, Mbol, erzeugten
DNA-Bandenmuster zeigen, dass die PIS136-DNA methyliert ist.
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Beispiel 6:
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Zum
Nachweis der Aufnahme des Phagen PIS136 in die Chromosomen der vermuteten,
in Beispiel 4 erzeugten Lysogene und der Gesamt-DNA aus dem Stamm
Saccharomonospora und anderer Lysogene wurde nach der Standardmethode
von Hopwood et al. (Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser,
T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward,
J.M. und H. Schrempf, 1985, Genetic manipulation of Streptomyces:
A Laboratory Manual. Publ. The John Innes Foundation, Norwich, Vereinigtes
Königreich)
gearbeitet. In allen Fällen
wurde die DNA von jenen Restriktionsenzymen gespalten, die innerhalb
des Phagengenoms schneiden. Die DNA-Banden wurden auf einem Agarosegel
getrennt und auf eine Nylonmembran mit bekannten Methoden transferiert.
Danach wurde die Southern-Hybridisierung
nach einer veröffentlichten
Standardmethode durchgeführt.
Als Probe wurde die Gesamt-DNA des Phagen PIS 136 oder eines der
Fragmente von PIS 136 verwendet. Das Vorliegen der Hybridisierungsbande
der PIS136-DNA zeigt, dass der Phage PIS136 in die Genome der vermuteten
Lysogene anderer Wirtsstämme
sowie in Saccharomonospora PA136 aufgenommen wurde.
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Beispiel 7
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Das
Inversionsvermögen
der DNA des Phagen PIS136 wurde durch Isolieren der Phagen-DNA getrennt
von den Lysaten der gelben und grünen Varianten von Saccharomonospora
PA136 geprüft.
Diese beiden DNA-Präparate
wurden dann der Restriktionsspaltung durch ClaI, NcoI und PvuII
unterworfen, wonach die erhaltenen DNA-Fragmente auf einem Agarosegel
getrennt wurden. Danach wurden sie auf eine Nylonmembran nach der
Standardmethode transferiert. Anschließend erfolgte die Southern-Hybridisierung
unter Verwendung der Gesamtphagen-DNA als Probe. Ein ClaI-Fragment
des weiß gefärbten Phagen
von ca. 3,8 kb war durch zwei Fragmente von von ca. 2 kb und 1,8
kb in den von der weiß gefärbten Variante
erzeugten Phagen repräsentiert.
Dieses Ergebnis zeigt, dass nach Inversion in eine andere Richtung
das 3,8 kb-ClaI-Fragment einen zusätzlichen Locus für das Enzym
ClAI erworben hat. Da die ClaI-Fragmente der beiden Typen des Phagenpräparats zu
100 % homolog sind, sind die von den Varianten des Stammes Saccharomonospora
PA136 produzierten Phagen, welche gelbes und grünes Pigment erzeugen, identisch.
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Beispiel 8
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Unter
Verwendung des Bakteriophagen bzw. Phagen wurden Mutanten bei antibiotischen
Stoffwechselwegen, wie z.B. bei Rifamycin und Actinorhodin erzeugt.
10 μl des
Phagenpräparats
(4,5 × 108 plaquebildende Einheiten pro ml) wurden
auf den Rasen von Streptomyces coelicolor (für Actinorhodin) und Amycolatopsis
mediterranei (für
Rifamycin) auf getüpfelt
und bei 30°C
während
fünf Tagen
inkubiert. Isolierte Kolonien, die auf dem aufgetüpfelten
Bereich gediehen, wurden in einer Platte aus frischem Medium gereinigt
und 3-5 Tage wachsen gelassen. Aus den isolierten Kolonien wurde
im Phagenpuffer eine Sporen- oder Myzelsuspension hergestellt und
danach auf frische Platten ausgebracht, welche das erfindungsgemäße Nährmedium
enthielten, um einzelne Kolonien zu erzielen. Willkürlich ausgewählte Kolonien
wurden dann auf Lysogenie, Mutation in den Stoffwechselwegen durch
Southern-Hybridisierung und auf die Erzeugung von Stoffwechselprodukten
geprüft.
Es wurden mehrere Lysogene erhalten, die Mutationen in antibiotischen
Stoffwechselwegen zeigten. Mehrere andere erhaltene Mutanten erwiesen
sich hinsichtlich der Aminosäurebiosynthese
als defektiv.
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Beispiel 9
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Zur
Bestätigung,
dass das genetische Material des Phagen-PIS mit einem Protein überzogen
ist, wurde ein mit Glycerin gereinigtes Phagenpräparat mit einem ein Protein
aufbringenden Puffer bei folgender Endkonzentration der einzelnen
Komponenten gemischt: Tris-Puffer, pH 6,8-15,6 mM, Glycerin, 2,5
%, Na-Dodesylsulfat, 0,5 %, und Bromphenolblau, 0,0125 %. Die Proben
wurden dann 15 Minuten lang in einem Bad aus kochendem Wasser erhitzt,
dann schockartig in Eiswasser 10 Minuten lang abgeschreckt und bei
13.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Die Proben wurden dann
auf 14 %-iges Polyacrylamidgel aufgebracht, wonach die Proteine
in einem Laufpuffer aufgetrennt wurden, der folgende Komponenten
enthielt: Tris-Base, 3 g/l, Glycin, 14,4 g/l und Na-Dodesylsulfat,
0,1 %. Der pH des Gellaufpuffers lag bei 8,3. Das Gel wurde in einer wässrigen
Lösung
angefärbt,
die auf 100 ml folgende Komponenten enthielt: Methanol, 50 ml, Essigsäure, 10 ml,
Coomassie Brilliant Blau R250, 0,25 g, und Wasser, 40 ml. Die Anfärbung erfolgte
während
2 Stunden bei 42°C.
Das Gel wurde dann unter mehrmaliger Abänderung der Lösung entfärbt, die
auf 100 ml folgende Komponenten enthielt: Methanol, 10 ml, Essigsäure, 5 ml
und Wasser 85 ml. Die Ge samtproteinbeschichtung des Phagen wird
durch 9 Banden mit annäherndem
Molekulargewicht von 60, 57, 42, 36, 30, 29, 22, 20 und 14 Kilodalton
dargestellt, wobei das Protein mit 60 bzw. 57 Kilodalton das Hauptprotein
der Phagenbeschichtung darstellt und in sehr hoher Konzentration
vorliegt.
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Beispiel 10:
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Die
Molekulargröße des genetischen
Material des Phagen, das eine doppelsträngige DNA darstellt, wurde
unter Verwendung von vier Restriktionsenzymen berechnet: NotI, NheI,
SnaBI und ScaI. Die DNA-Fragmente, die durch Spaltung des genetischen
Materials des Phagen PIS 136 mit den vier Restriktionsenzymen bei
unterschiedlicher Permitation und Kombination erhalten wurden, wurden
entweder auf einem normalen Agarosegel oder durch Pulse Field-Gelelectrophorese
unter Einstellung der Laufbedingungen auf 1,5 V/cm2 des
Gels während
15 Stunden bei 14°C
und dann bei 2 V/cn2 während 3 Stunden unter einem
Winkel von 120° und
bei einer Umschaltzeit von 5 bis 60 Sekunden bei linear ansteigender
Variablen aufgetrennt. Das Gel wurde dann in Ethidiumbromid angefärbt, wonach
das Molekulargewicht mit Standardmolekulargewichtsmarkern berechnet
wurde. Die Molekulargröße der PIS
136-DNA betrug ca. 90 kb. Das Guanidin:Cytosin-Verhältnis des PIS
136-Genoms wurde mit Standardmethoden gemessen, die aus dem Stand
der Technik bekannt und belegt sind. Es betrug 69-71 Mol-%. Der
Bakteriophage PIS 136 ist resistent gegenüber mehreren Restriktionsenzymen,
bei denen man meinen möchte,
dass das hohe Guanidin:Cytosin-Verhältnis einen sensiblen Locus
gewährleisten
würde.
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Beispiel 11
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Der
Phage PIS 136 wurde aus den Lysogenen von Amycolatopsis mediterranei
nach Induktion mit UV-Licht isoliert und gereinigt, um festzustellen,
dass bestimmte andere Actinomycetes-Stämme
auch als Wirt für
das Studium der Phagenbiologie in Frage kommen. Die Reinigung des
Phagen erfolgte wie in Beispiel 2. Lysogene von Amycolatopsis mediterranei
wurden wie in Beispiel 4 erzeugt. Die Ergebnisse zeigen, dass Amycolatopsis
mediterranei als alternativer Wirt für die Vermehrung und genetische
Studien am Phagen in Frage kommt. Diese Studien umfassen das Wachstum
des Bakteriophagen im Wirt, den Rezeptor für den Phagen, der den Eintritt
des Phagen in den Wirt ermöglicht,
die Faktoren, welche es dem Phagen ermöglichen, sich im Wirt festzusetzen
usw. Die Abänderung
dieser Faktoren kann die Erweiterung des Wirtsbereichs des Phagen unterstützen, wodurch
seine Verwendbarkeit als Vektorsystem oder genetisches Werkzeug
erhöht
wird. Da der Stamm Amycolatopsis mediterranei das wichtige Antibiotikum
Rifamycin und seine Analoga produziert, kann man ausgehend vom Stand
der Technik den Stoffwechselweg der Antibiotika und auch die Wirkung
der Blockierung der Funktion eines bestimmten Gens für den Stoffwechselweg
bei der Produktion eines Antibiotikums studieren. Ferner kann man
den Phagen PIS 136 verwenden, um viele andere antibiotische Stoffwechselwege zu
blockieren, die gewöhnlich
parallel zu einem in der Literatur beschriebenen Stoffwechselweg
ablaufen, und ein Durchschnittsfachmann auf dem vorliegenden Gebiet
kann diese Versuche durchführen.
Der Stand der Technik kann auf beliebige andere Organismen übertragen
werden, für
die man den Phagen PIS 136 oder seine Derivate, die man nach einem
gut dokumentierten Standardverfahren erzeugen kann, als Wirt verwenden kann.
Alle oben beschriebenen Methoden kommen für die Antibiotikaproduktion
in Frage. In vielen Fällen
können
auf diese Weise mehrere neue Metabolite erhalten werden.
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Beispiel 12
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In
diesem Beispiel werden die Eigenschaften von Amycolatopsis mediterranei-Lysogenen
für die
Antibiotikaproduktion untersucht und mit einem Antibiotikum verglichen,
das vom Nicht-Lysogen erzeugt wurde. Das Beispiel zeigt, dass der
Phage PIS 136 tatsächlich
die Antibiotikaproduktion modifiziert. Nach dem in Beispiel 4 beschriebenen
Methode wurden mehrere Lysogene des Stammes Amycolatopsis mediterranei
erzeugt. Die Lysogene wuchsen in einem bekannten Medium fol gender
Zusammensetzung (in g/l): Sojabohnenmehl (entfettet), 5,0; Calciumcarbonat,
9,0, pH 7,2; (nach Autoklavierung) filtersterilisiertes Na-Barbiturat,
1,5: Dextrose, 50,0: Kaliumdihydrogenphosphat, 3,0; Ammoniumsulfat,
7,0; Magnesiumsulfat, 1,0; Kupfersulfat, 3,3 mg; Fe(II)-Sulfat,
10,0 mg; Mangansulfat, 4,0 mg; Zinksulfat, 50,0 mg. 500 ml-Kolben
mit 50 ml Medium wurden mit einer 2 Tage alten Kultur beimpft und
bei 30°C
und 200 Upm inkubiert. Für
jedes Lysogen wurden 5 Kolben beimpft. Die Kolben wurden innerhalb
eines 2 Tage-Invervalls
entfernt bzw. dann, wenn sich das Medium von fast farblos in einzelne
Gelb- bzw. Rot-Schattierungen verfärbte. Die Zellen und weitere
Komponenten des Mediums wurden durch Zentrifugieren bei 4°C entfernt.
Der pH des Überstandes
wurde auf 2,2 bzw. ca. 2,0 mit Hilfe von 6 M Schwefelsäure eingestellt.
Die Bouillon wurde dann mit 0,2 Volumina Ethylacetat extrahiert.
Die Extraktion wurde viermal wiederholt. Sämtlich Ethylacetatextrakte
wurden miteinander gemischt und auf das Endvolumen von 1,5 ml bei
30°C eingeengt.
Die Fermentationsprodukte wurden auf fluoriszierenden, mit Kieselerde
beschichteten Dünnschichtchromatographie-Platten
aufgetrennt. Die Emerck-Zahl betrug 1,05554, wobei folgende Lösungsmittelsysteme
verwendet wurden: Chloroform 6: Methanol 6: Wasser 1 und Chloroform
6: Methanol 6: Wasser 1: Ammoniak 1. Die Platten wurden dann unter
kurz- und langwelligem UV-Licht sichtbar
gemacht. Einige der von den Lysogenen produzierten Metabolite unterschieden
sich von den von der nicht-lysogenen
Kontrolle produzierten. Diese Metabolite zeigten entweder andere
Fluoreszenzeigenschaften oder, falls die Fluoreszenz dieselbe war
wie bei der Kontrolle, zeigten sich sehr deutliche Unterschiede
in ihrer relativen Mobilität,
wenn man sie dünnschichtchromatographisch
untersuchte, wie dies 1 zeigt.
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Beispiel 13:
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Die
Fermentation einiger Lysogene wurde wiederholt, um zu zeigen, dass
der Phage PIS 136 die Antibiotikumproduktion durch Abänderung
des Locus für
die Aufnahme in den Wirt be einflussen kann. Das Verfahren zur Extraktion
der Fermentationsprodukte und ihre Analyse entsprechen Beispiel
12. Zwei von den von den Lysogenen produzierten Metaboliten unterschieden
sich von der früheren
Charge. Die Analyse der DNA der Lysogene zeigt deutlich, dass der
Phage PIS 136 seine Position im Verlaufe der Fermentation verändert hat
und diese Positionsänderung
des Phagen innerhalb des Wirtsgenoms eine tiefgreifende Wirkung
auf den antibiotischen Biosyntheseweg zu haben scheint. Die Wirkung
auf die Biosynthese ist deutlich sichtbar, da die produzierten Metabolite
sich von der früheren
Charge unterscheiden. Die Positionsänderung des Phagen lässt sich
durch die transposogene Natur des Phagengenoms erklären. Möglicherweise
ist der Phage während
der Replikation zur Positionsänderung
und Verschiebung zu einem neuen Locus befähigt, wodurch unterschiedliche
Gruppen von Genen beeinflusst werden. Dieser Eigenschaft des Phagen
kann sich jeder Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bedienen,
um Mutationen zu erzeugen, die von Nutzen sind bei der Verbesserung
der Antibiotikabiosynthese, bei der Produktion von hybriden Antibiotika
und von neuen Metaboliten. Die Mutationen, die für die Untersuchung der allgemeinen
Biologie und Physiologie jedes Organismus, für den der Phage PIS 136 oder
seine Derivate in Frage kommt, geeignet sind, werden konstruiert
unter Anwendung dere zugänglichen
Techniken wie Polymerasekettenreaktion oder Klonung des ganzen Phagen
in einen neuen Vektor oder in bereits zugängliche Vektoren oder eines
Fragments des Phagengenoms in einen Vektor oder die nackte DNA an
sich und können
als Wirt verwendet werden.
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Beispiel 14
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Lysogene
von Streptomyces coelicolor wurden auf unterschiedlich mutierte
Phänotypen
geprüft.
Der Stamm Streptomyces coelicolor produziert das blau pigmentierte
Antibiotikum Actinorhodin und ein weiteres rot pigmentiertes Antibiotikum.
Die Farbproduktion ist somit ein direktes Indiz für die Antibiotikaproduktion.
Außerdem
produziert der Stamm Sporen von grauer Farbe. Jede Mutation, entweder
auf dem antibiotischen Stoffwechselweg oder auf dem Stoffwechselweg
der Sporenbildung bedeutet eine Änderung
in der Färbung des
Pigments oder des nichtsporenbildenden Myzels oder in den weißen Sporen.
Außerdem
kann der Stamm Streptomyces coelicolor auf einem 34 %-ige Saccharose
enthaltenden Medium wachsen. Die Lysogene von Streptomyces coelicolor
wurden wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten. Nach Bestätigung der
Aufnahme des Phagen PIS 136 in das Wirtschromosom nach einem beliebigen
bekannten Verfahren bzw. gemäß Beispiel
2 wurden die Mutanteneigenschaften der Lysogene entsprechend dem
Stand der Technik geprüft.
Eine Gruppe von Mutanten produzierte überhaupt kein Pigment und die
Sporen waren weiß.
Eine andere Mutantengruppe, die weit schneller als das als Kontrolle
dienende Nicht-Lysogen wuchs, entbehrte ebenfalls eines Pigments. Eine
weitere bildete überhaupt
kein Pigment, aber eine überaus
große
Zahl von grauen Sporen. Eine Mutantengruppe produzierte weder Pigment
noch Sporen. Eine weitere Mutantengruppe produzierte kein Pigment, jedoch
Sporen, die nur in geringer Zahl vorhanden und von weißer Farbe
waren. Eine weitere Gruppe von Lysogenen gedieh nicht in 34 %-iger
Saccharose enthaltendem Medium, was für eine Mutation in der Zellwand oder
im Saccharosestoffwechselweg sprach. Das Sporenbildungsvermögen änderte sich
auch in aus dem Stand der Technik bekannten spezifischen Sporenbildungsmedium
nicht. Das Einsetzen der Sporenbildung ist für die Antibiotikaproduktion
von äußerst großer Bedeutung.
Bei Verwendung des Phagen PIS 136 kann man daher in jedem Wirt,
den der Phage PIS 136 infiziert, Mutanten erzeugen. Dies ermöglicht die
Untersuchung der Regulation des antibiotischen Biosyntheseweges
oder eines beliebigen anderen Stoffwechselweges, der sonst schwer
zu untersuchen wäre.
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Beispiel 15
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Der
Einfluss des Phagen PIS 136 auf die Untersuchung pathogener Organismen
kann auf verschiedene Weise erfolgen. Im vorliegenden Beispiel wurden
nach der in Beispiel 4 be schriebenen Methode Lysogene von Mycobacterium
fortuitium erzeugt. Die Lysogenie wurde nach üblichen Verfahren und nach
der in Beispiel 6 beschriebenen Methode bestätigt. Die Mutanteneigenschaften
wurden entsprechend den Methoden, die aus dem Stand der Technik
bekannt sind, geprüft.
Einige der Lysogene hatten die Eigenschaft zur Segmentierung verloren
und waren myzelial geworden. Da die Sptierung mehrere biochemische
Veränderungen
in der Zelle umfasst, sind myzeliale Mykobakterien vermutlich nicht
pathogen. Ferner sind diese Mutanten auch für die Aufdeckung der biochemischen
Stoffwechselwege geeignet, die die Hauptrolle bei der Septierung spielen,
sowie für
die Feststellung des Signals, das die Zelle zur Septierung veranlasst.
Man kann somit den Mechanismus der Pathogenität dieser pathogenen Organismen
studieren, welche der Phage PIS 136 infiziert. Auch ist es möglich, Mutanten
zu finden, welche die Pathogenität
verloren haben, jedoch lange genug überleben, um eine Immunreaktion
auszulösen.
Derartige Stämme
können
als Impfstoffe verwendet werden, was aus dem Stand der Technik gut
bekannt ist. Der Phage PIS 136 kann in die Zelle aufgenommen werden,
welche er infiziert, und kann daher als Werkzeug zur Identifizierung
der Mutante verwendet werden sowie zur Identifizierung des Gens,
in dem es zur Mutation gekommen ist. Die Verwendung des Transposons
als Signaturmarkierung zur Identifizierung von Mutanten ist aus
dem Stand der Technik gut bekannt. Bisher wurde jedoch noch nie
ein Bakteriophage als Signaturzielsystem verwendet, um das pathogene
Wachstum in einem Wirt zu untersuchen.
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Herstellung des Mediums
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Beispiel 16:
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Die
nachfolgend genannten Medienkomponenten und Chemikalien von Analysequalität wurden
bei Raumtemperatur miteinander gemischt: Fleischextrakt, 10 g, Hefeextrakt,
2 g, Proteosepepton, 2 g, Tryptose, 2 g, Dextrose, 10 g, lösliche Stärke, 1 g,
Cobaltchlorid, 5 mg, Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5 mg, dop pelt destilliertes Wasser,
1000 ml, Agar, 11 g, pH 7,0. Das Medium wurde unter einem Dampfdruck
von 20 psi 20 Minuten lang sterilisiert. Dieses Medium unterstützte das
Wachstum von Actinomadura sp., Amycolatopsis sp., Arthrobacter sp.,
Brevibacterium sp., Corynebacterium sp., Rhodococcus sp., einer
großen
Zahl von Streptomyces sp., Saccharomonospora sp., Saccharopolyspora
sp., Miocrobispora sp., Microtetraspora sp., Micromonospora sp.,
Nocardia sp., Nocardiodes sp. und Streptosporangium sp., Streptococcus
sp., Staphylococcus sp., Bacillus sp., Escherichia sp., Pseudomonas
sp. und von mehreren Gruppen von Pilzen. Mykobakterien gediehen nicht
sehr gut in diesem Medium. Nach Wachstum während zwei Wochen zeigten einige
Arten von Streptomyces, Microbispora und Microtetraspora nur geringe
Sporenbildung, die meisten der oben aufgeführten Stämme bildeten jedoch überhaupt
keine Sporen und zeigten nach 3-tägiger Inkubation ein gutes
myzeliales Wachstum, was zeigt, dass das Medium für alle Actinomycetes
und andere Gruppen von Bakterien und Pilzen sehr geeignet ist. Die
Art von Saccharomonospora gedieh in diesem Medium bei Temperaturen
von bis zu 55°C
gut.
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Beispiel 17
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Die
Zusammensetzung des Mediums war Folgende: Fleischextrakt, 12 g,
Hefeextrakt, 2 g, Proteosepepton, 2 g, Tryptose, 2 g, Dextrose,
10 g, Cobaltchlorid, 5 mg, Fe(III)-ammoniumcitrat, 5 mg, doppelt
destilliertes Wasser auf 1000 ml, Agar, 11 g, pH 7,0. Das Medium
wurde unter einem Dampfdruck von 20 psi 20 Minuten lang sterilisiert.
Die langsam wachsenden Arten von Actinomadura, Streptosporangium,
Microbispora und Microtetraspora gediehen nur schwach verglichen
mit einer Mediumzusammensetzung, die mit 10 g/1000 ml Fleischextrakt
und Stärke,
wie oben beschrieben, ergänzt
wurde.
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Beispiel 18
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Die
Zusammensetzung des Mediums war Folgende Fleischextrakt, 12 g, Hefeextrakt,
2 g, Proteosepepton, 2 g, Trypto se, 2 g, Dextrose, 10 g, Cobaltchlorid,
5 mg, Fe(III)-ammoniumcitrat, 5 mg, doppelt destilliertes Wasser
auf 1000 ml, Agar, 11 g, pH 7,0. Das Medium wurde unter einem Dampfdruck
von 20 psi 20 Minuten lang sterilisiert. Unter Beibehaltung der
restlichen Medienkomponenten, wie oben beschrieben, wurde Dextrose
durch 1 % V/V Glycerin als Endkonzentration ersetzt und es wurden
1,0 g Citronensäure
zugesetzt. Der Ersatz und die Zugabe erleichterten das Wachstum
eines großen
Bereichs rasch wachsender Mykobakterien und zumindest eines langsam
wachsenden Mycobacteriums, und zwar von M. bovis BCG Bacillus Calmette
Guerin).
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Vorteile der
vorliegenden Erfindung und des Mediums:
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Der
entsprechend den Beispielen erhaltene Bakteriophage hat folgende
Vorteile:
- 1. Der Bakteriophage bzw. seine DNA
kann im Gegensatz zu fast allen von anderen Autoren beschriebenen Bakteriophagen
eine ganze Reihe von Mikroorganismen infizieren.
- 2. Der erfindungsgemäße Bakteriophage
bzw. seine DNA können
spezifisch für
Infektion von Gattungen der Actinomycetes verwendet werden.
- 3. Der Bakteriophage kann zur Erzeugung von Randommutationen
bei einem weiten Bereich von Mikroorganismen verwendet werden, und
zwar selbst bei Mikroorganismen, bei denen die klassischen Methoden nicht
greifen.
- 4. Der erfindungsgemäß beschriebene
Bakteriophage kann zur Erzeugung von Mutationen in spezifischen Stoffwechselwegen
zur Gewinnung neuer Verbindungen verwendet werden.
- 5. Der Bakteriophage kann auch zur Mobilisierung von aus einem
Organismus in einen anderen und auch zur spezifischen Platzierung
in einer großen
Zahl von Organismen, einschließ lich
Pflanzen, verwendet werden.
- 6. Der Bakteriophage kann auch zur vorübergehenden Blockierung eines
Stoffwechselweges verwendet werden. Dies ermöglicht die Akkumulierung des
intermediären
Stoffwechselproduktes im System, das dann von einem anderen funktionellen
Stoffwechselweg verwertet wird. Dieser Prozess führt zur Akkumulierung neuer
Stoffwechselprodukte.
- 7. Der Phage oder seine DNA kann auch zur Erzeugung von Mutationen
in pathogenen Organismen wie Mykobakaterien zur Produktion von Impfstämmen verwendet
werden.
- 8. Das Medium unterstützt
das Wachstum mehrerer Gruppen von Pilzen einschließlich der
anspruchsvollen Basidiomyceten. Das Medium verkürzt die Wachstumsdauer und
da es die Sporenbildung nicht unterstützt, ist es geeignet, wann
immer eine große
Myzelkultur erforderlich ist.
- 9. Die erfindungsgemäße Mediumzusammensetzung
ist eine synergistische Zusammensetzung, was ein schnelleres Wachstum
einer großen
Zahl von Organismen begünstigt,
Sporenbildung verhindert und einer relativ hohen Wachstumstemperatur
standhält,
ohne dass das Wachstumsmuster beeinträchtigt würde. Nach gewissen Modifizierungen,
wie sie in den Beispielen 18 und 19 erläutert werden, können auch
anspruchsvolle Organismen wie Mykobakterien auf diese Weise leicht
gezüchtet
werden.
