KR100225355B1 - 곤충의 방제방법 및 곤충 방제용 조성물 - Google Patents

곤충의 방제방법 및 곤충 방제용 조성물

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KR100225355B1 KR1019970034751A KR19970034751A KR100225355B1 KR 100225355 B1 KR100225355 B1 KR 100225355B1 KR 1019970034751 A KR1019970034751 A KR 1019970034751A KR 19970034751 A KR19970034751 A KR 19970034751A KR 100225355 B1 KR100225355 B1 KR 100225355B1
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Abstract

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Description

곤충의 방제방법 및 곤충 방제용 조성물
제1도는 pBR322(o)를 이용한 대장균 HB 101 형질전환 및 pBC16(o)을 이용한 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB의 형질전환을 나타내고,
제2도는 형질전환 빈도에 대한 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB배양물의 연령의 영향을 나타내며,
제3도는 형질전환 빈도에 대한 PBS완충 용액의 pH값의 영향을 나타내고,
제4도는 형질전환 빈도에 대한 PBS완충용액의 사카로오스 농도의 영향을 나타내며,
제5도는 형질전환채의 수와 형질전환에 사용된 DNA 양과의 상호 의존성을 나타내고,
제6도는 셔틀백터 pX161의 제한지도이며,
제7도는 pX193의 제한지도이고,
제8도는 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB, 바실투스 세레우스 569K 및 이들의 유도채의 포자형성 배양물의 추출물을 SDS/폴리아크릴아미드 갤 전기영동시킨 것을 나타내며,
제9도는 바실루스 투린지엔시스에 적합한 엘랙트로포레이숀법으로 고초균 LBG B-4468을 pBC16 플라즈미드 DNA로써 형질전환 시킨것을 나타낸다.
본 발명은 바실루스종의 효과적인 형질전환 방법을 기초로 한, 재조합 DNA 기술을 사용하여 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 밀접하게 관련된 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)의 직접적이고 제어 가능한 유전자 조작을 최초로 가능하게 한 방법을 기술한다.
본 발명은 또한 플라즈미드와 셔틀벡터(shuttle vector)의 작성 및 이들로써 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 및/ 또는 바실루스 세레우스균주에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열을 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스내에 삽입하고 또 필요에 따라서 발현시키는 방법에 관한 것이지만, 특히 프로톡신 유전자를 삽입하고 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 신규 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열을 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스내에 직접 클로닝하고 또 필요에 따라서 발현 및 확인하는 방법에 관한 것으로, 그 결과 처음으로 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 유전자 뱅크를 확립하고 또 이들 내에서 유전자 뱅크를 발현할 수 있다.
바실루스 투린지엔시스는 그람 양성 그룹의 호기성, 내생포자 형성 세균에 속한다. 바실루스종과 밀접하게 관련된 종인 바실루스 세레우스 및 바실루스 안트라시와는 달리 바실루스 투린지엔시스 종으로 여태까지 공지된 대부분은 포자형성 단계에서 결정성 구조 때문에 일반적으로 결정체로 불리는 연쇄 포자 봉입체를 생산한다. 이 결정체는 살충 활성의 결정성 프로톡신 단백질, 소위 δ-내독소로 구성되어 있다.
이들 단백질 결정은 바실루스 투린지엔시스 곤충에 대한 독성에 관여한다. δ-내독소는 결정체를 경구 투입한후 결정체가 표적 곤충의 알칼리성 장액에 용해되고 또 곤충의 소화관으로부터 프로테아제의 작용에 의한 제한적 단백질 분해 결과 프로톡신으로부터 실질적인 독성성분이 방출될 때까지는 살충 활성을 나타내지 않는다.
각종 바실루스 투린지엔시스균주의 δ-내독소는 특정 표적 곤충, 특히 각종 나비목, 딱정벌레목 및 디프테라목 유충에 대한 높은 특이성 및 고도의 활성에 의해 구별된다. 바실루스 투린지엔시스의 δ-내독소를 사용하는 장점은 표적 곤충이 결정성 단백질에 대한 내성이 증가하기 힘들고 또 이 독소가 상술한 곤충외에는 인간, 다른 포유류, 조류, 물고기 및 곤충에 대하여 무해하다는 사실에 존재한다.
바실루스 투린지엔시스 프로톡신(protoxin)의 살충력은 초기부터 인식되어 있었다. 20세기 말경부터 바실루스 투린지엔시스 재제는 경작식물에 있는 곤충에 의해 유발된 각종 질병을 방재하기 위한 생물적 살충제로서 사용되어 왔다.
1) 골덴버그와 마갈리트가 바실루스 투린지엔시스 변종 이스라엘렌시스를 발견(1977)하고 또 2) 크리크 일행이 바실루스 투린지엔시스 변종 태내브리오니스를 발견(1983)함으로써 바실루스 투린지엔시스의 사용 범위를 모기와 풍뎅이 유충에 까지 넓힐 수 있었다.
유전 공학과 이로부터 유래하는 새로운 가능성을 도입하는 것에 의하여 부실루스 투린지엔시스 독소의 영역은 새로운 자극을 받게 되었다.
예를 들어 δ-내독소를 예를 들어 대장균과 같은 외래 숙주 생물에 클로닝하는 것은 이미 통상적인 것이다. 그 결과 δ-내독소의 전체계의 DNA 서열이 밝혀졌다. (예를 들어 3)슈넵프 에이취. 이. 및 휘트리 에이취. 알, 1981; (4)클리에르 에이. 일행, 1982; 5) 가이저 엠 일행, 1986; 6) 하이디 엠. 젯 일행, 1987).
바실루스 투린지엔시스종의 대부분은 살충 활성 단백질을 코드하는 몇개의 유전자를 함유한다. 포자 형성단계에서만 발현되는 이들 유전자들은 대부분의 경우 대형 전이가능 플라즈미드 (30-150Md)상에 존재하며 따라서 이들의 상호 적합할 때 각종 바실루스, 투린지엔시스 균주사이 및 바실루스 투린지엔시스와 바실루스 세레우스간에 용이하게 상호 교환될 수 있다. (7) 고나잘레즈 제이. 엠 일행, 1982).
바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키의 프로톡신 유전자는 관련 유전자 집단에 속하며, 이들의 많은 것은 이미 클론되고 임기서열 결정화되었다. 이 작업은 특히 대장균 클로닝 계에서 실행되었다.
바실루스 투린지엔시스 유전자의 클로닝은 여태까지 몇개의 배타적인 이형 숙주계에만 한정되었고, 그중에서도 대장균계가 가장 잘 연구되어 알려져있다.
그러나 최근 프로톡신 유전자를 고초균 (4) 클리에르 일행, 1982), 형광균(8) 오부코위즈 엠. 지이. 이행, 1986) 및 맥주 효모균(BP 0 238 441호)과 같은 기타 숙주계에 성공적으로 클로닝하고 발현시켰다는 것이 보고되었다. δ-내독소 유전자를 식물 숙주계에 삽입하고 발현시키는 것도 성공적이었다(BP 0292 435호).
대장균에서의 클로닝에서 장점은 몇개 프로톡신 유전자가 그람 양성 프로모터 이외에 대장균 유사 프로모터를 함유할 수 있다는 사실이다. 이들 프로모터 유사 DNA 서열은 이들이 조절 서열을 인식할 수 있을 때 바실루스 투린지엔시스 프로톡신 유전자가 이형 숙주계에서도 발현 가능하게 한다.
숙주 세포를 파쇄한 후, 발현된 프로톡신 단백질을 분리한 다음 공지 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
그러나 대장균 유사 프로모터가 모든 프로톡신 유전자에 존재하지는 않기 때문에 9) (도노반 일행, 1988) 상술한 필수 조건을 충족시키는 특정 프로톡신 유전자만이 이형 숙주계에서 발현되고 그에 따라 확인될 수 있다.
유전자를 천연적인 숙주 생물외에 클로닝하고 또 이들 균주를 생물적 살충제로서 실재로 사용하는 것은 많은 결점과 관련되며, 이들중 어떤 것은 매우 위험하다;
a) 원래의 발현 서열로부터 바실루스 투린지엔시스 프로톡신 유전자를 발현하는 것이 특정 경우에만 가능하다.
b) 일반적으로 발현된 외래 단백질의 분비가 거의 없거나 또는 극미하다.
c)δ-내목소의 정확한 겹침이 이형 숙주 세포의 환원 배지에서 언제나 가능한 것은 아니고 또 이로 말미암아 특정 활성 또는 독소의 숙주 범위가 바람작하지 않게 변화할 수 있다.
d) 발현이 일어나기는 하지만 원래 발현의 서열중 클론된 외래유전자의 발현율이 대부분 매우 낮다.
3); 10) 슈넵프 및 휘트리(1982; 1985)는 대장균에 클론된 바실루스 투린지엔시스 독소는 대장균 전테 세포 단백질의 0.5% 내지 1% 만을 구성하는 반면 바실루스 투린지엔시스내의 결정성 단백질은 포자 형성 배양액의 건조 증량의 30% 내지 40%에 달한다고 추정한다. 이러한 발현율의 불일치는 이형 숙주계에서 포자 형성 특이 조절 시그널이 부족하고 또 바실루스 투린지엔시스 프로모터의 인식상의 난점 및/또는 왜래 숙주에 의한 독소 분자의 번역후 수식에서의 문제에 의할 수 있다.
e) 발현용으로 일반적으로 사용되는 숙주 균주의 대부분은 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 만큼 무해한 독소는 아니다.
f) 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스는 미생물 토양 식물군의 천연적 주요 성분을 구성하며, 이것은 발현용으로 일반적으로 사용되는 숙주 균주의 대부분에 대해서는 그렇지 않다.
상술한 문제와 난점은 상기 바실루스 투린지엔시스 유전자가 발현을 위한 프로톡신 유전자의 천연적인 그람 양성 프로모터를 사용할 수 있는 상동 숙주계에 직접적으로 클론될 수 있으면 극복될 수 있다.
그러나 상업적 측면에서 매우 중요한 세균인 바실루스 투린지엔시스를 직접적 유전자 수식이 가능하게 만들고 또 그에 따라 클론된 프로톡신 유전자를 바실루스 투린지엔시스균주에 효과적으로 재삽입할 수 있는 방법은 아직 없었다.
이러한 이유로는 형질전환율을 적합하게 높게하며 그에 따라 확립된 rDNA 수법의 바실루스 투린지엔시스에도 또한 적용할 수 있게 하는 바실루스 투린지엔시스 및 그와 관련된 바실루스 세레우스에 대한 효과적인 형질전환계를 개발하는 것이 아직 성공적이지 않았기 때문이라 생각된다.
신규 살충 특성을 갖는 새로운 바실루스 투린지엔시스균주를 제조하기 위해 여태까지 사용된 방법은 주로 플라즈미드가 코드하는 프로톡신 유전자의 집합에 의한 이동을 기초로 하고 있다.
클론된 바실루스 투린지엔시스 결정성 단백질 유전자의 바실루스 투린지엔시스로의 성공적인 재삽입은 오직 한 경우(11)클리에르 에이, 일행, 1983)에서만 기재되어 있으나, 이 경우에서도 역시 바실루스 투린지엔시스에 대한 적합한 형질전환계가 부족하기 때문에 고초균과 바실루스 투린지엔시스간의 집합에 의하여 이진할 필요가 있었다. 또한 클리에르 일행에 의하여 기술된 방법에서도 대장균은 중간 숙주로 사용된다.
그러나 접합에 의한 전달 방법은 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 유전자 수식을 위해 통상적으로 사용하기에는 부적합하게 만드는 심각한 결점들을 갖고 있다. 클리에르 일행에 의하면 기술된 방법에서도 대장균은 중간 숙주로 사용된다.
천연 숙주 생물밖에서 유전자를 클로닝하고 이들 균주를 실제로 생물적 살충제로서 사용하는 것은 수많은 결점과 관련되어 있고 이들중 몇몇은 심각하다;
a) 플라즈미드가 코딩한 프로톡신 유전자를 접합에 의하여 전달하는것은 바실루스 투린지엔시스균주 사이 및 서로 융화되는 바실루스 세레우스와 바실루스 투린지엔시스균주 사이에서만 가능하다.
b) 개통이 먼 균주사이의 접합에 의한 플라스미드의 전달에 의해서는 전달 비율이 매우 낮다.
c) 프로톡신 유전자의 발현 조절 또는 수식의 방법이 없다.
d) 유전자 자체를 수식할 방법이 없다.
e) 몇개의 프로톡신 유전자가 1개균주에 존재할 때 각 유전자의 발현은 소위 유전자 투어 효과의 결과로서 크게 감소될 수 있다.
f) 관련 프로톡신 유전자의 가능한 상동 재조합의 결과로서 불안정성이 생길 수 있다.
많은 그람 양성 생물에 대해 통상적으로 사용되어온 다른 형질전환 방법은 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 모두에 대하여 부적합하다고 밝혀졌다.
상술한 방법중의 하나는 폴리에틸렌 글라콜 처리에 의한 세균 원형질체의 직접적 형질전환법인데, 이것은 많은 방선균주 (12) 빕 제이.제이 일행, 1978) 및 고초균 (13)창 에스. 및 코헨 얘스. 엔, 1979), 거대균 (14)브라운, 비이. 제이 및 칼론 비이. 찌, 1980), 유산 연쇄상 구균 (15)콘도 제이. 캐이. 및 맥 케이 엘.엘, 1985), 대변 연쇄상 구균 (16) 위드 알 일행), 코리네 박테륨 글루타미쿰 (17) 요시하마엠, 일행, 1985) 및 수많은 그람 양성 세균에서 성공적으로 사용되어 왔다.
이 방법은 사용하기 위하여 세균 세포는 먼저 원형질체로 전환되어야 하는데, 즉 세포벽이 용균효소에 의하여 분해된다.
이 직접적 형질전환법의 성공을 위한 다른 전제 조건은 새로이 도입된 유전 정보의 발현 및 성공적인 형질전환전 형질 전환된 원형질체의 복합 고체 배지상에서의 재생이 선별성 마커에 의해 확인될 수 있어야 하는 것이다.
이 형질전환 법은 바실루스 투린지엔시스 및 그와 관련된 바실루스 세레우스에 대해 부적합 한 것으로 밝혀졌다. 바실루스 투린지엔시스의 리소자입에 대한 높은 내성 및 원형걸체의 완전한 세포벽 함유 세포로의 재생력이 매우 불량한 결과 형질전환율이 낮아 재생하기 곤란하였다 (18) 알리크하이안 에스. 제이 일행, 1981; 19) 마틴 피이. 에이 일행, 1981; 20)피셔 에이취-엠 일행, 1984).
그러므로 이 방법으로는 기껏해야 재조합 DNA와 작업하기 부적합한 매우 간단한 플라즈미드가 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 세포에 낮은 빈도로 삽입된다.
진술한 방법을 사용하여 성취할 수 있는 충분한 형질전환율에 대한 각 보고는 매우 복잡하고 적합한 프로그램의 작성에 따라 다르지만, 이들 프로그램은 1개의 특정 바실루스균주에만 적용 가능하고 또 시간과 경비면에서 지출이 높다 (21)샬 디이, 1986). 그러므로 이러한 방법은 산업적 규모에서 통상적으로 사용하기에는 부적합하다.
바실루스 투린지엔시스 유전학 분야에서 집중 연구는 직접적으로 유전자 수식될 수 있고 그에 따라 천연적인 숙주계에서 프로톡신 유전자를 클로닝할 수 있는 바실루스 투린지엔시스 또는 밀접하게 관련된 바실루스 세레우스를 제조할 수 있는 신규 방법을 개발하는데 실질적인 관심을 갖고 있다. 이러한 연구에도 불구하고 현존하는 난점과 문제를 해결할 수 있는 충분한 해결점이 아직 없었다.
적합하게 높은 형질전환 빈도를 가지면서 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 급격하고 효과적이며 재현 가능한 형질전환을 가능하게 하는 적당한 형질전환법은 현재로는 없고 또 다른 세균성 숙주계에 대하여 이미 확립된 재조합 DNA수법의 바실루스 투린지엔시스에 또한 적용가능한 적합한 클로닝 벡터도 없다. 바실루스 세레우스에 대해서도 마찬가지이다.
이러한 목적은 놀랍게도 몇개의 공지된 간단한 방법 단계를 사용하는 것에 의하여 본 발명의 범위내에서 달성되었다.
따라서 본 발명은 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 유전자 조작에 적합한 재조합 DNA를 사용하는 간단한 형질전환법을 사용하여 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스를 고효율로 형질전환하는 것에 의하여 최초로 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스의 직접적이고 특이적으로 조절되며 재현가능한 유전자 조작을 가능하게 한, 재조합 DNA 기술을 기본한 신규 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열, 특히 프로톡신 유전자를 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에 삽입, 클로닝 및 발현시키는 방법에도 관한 것이며, 다음을 포함한다;
a) 유전자 또는 DNA를 단리하고; b) 필요에 따라 단리 유전자 또는 DNA를 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 작용할 수 있는 발현 서열에 기능적으로 연결시키며; c) b)로 부터의 유전자 조립체를 적합한 벡터를 사용한 형질전환법에 의하여 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포로 도입하고; 또 d) 필요에 따라 상응하는 유전자 산물을 발현하고, 또 필요에 따라 그것을 단리한다.
본 발명은 또한 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열, 특히 프로톡신 유전자를 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에 클로닝, 발현 및 확인하는 직접적인 방법을 포함하며, 하기로 구성된다;
a) 적합한 제한 효소를 사용하여 바실루스 투린지엔시스의 전체 DNA를 분해하고; b) 적합한 크기의 단편을 생성한 제한 단편으로부터 단리하며; c) 상기 단편을 적합한 벡터로 삽입하고; d) 상기 벡터로 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포를 형질전환시키며; 또 e) 적합한 스크리닝 방법을 사용하여 신규 DNA 서열을 위치확인하고 또 필요에 따라서 이들을 형질전환체로부터 단리한다.
구조 유전자외에 본 발명에 따라 본 방법에 사용될 수 있는 기타 유용한 DNA 서열로서 예를 들어 조절 작용을 갖는 비 코딩 DNA 서열, 즉 안티센스(antisense) DNA도 가능하다.
따라서 본 발명의 방법은 과학적 측면 및 상업적 측면 모두에서 특히 관심 있는 많은 새로운 가능성과 통한다.
예를 들어 δ-내독소 합성의 조절에 관하여, 특히 포자형성에 대한 유전자 수준에서의 정보를 처음으로 입수 가능하다.
또한 곤충에 대한 독성을 갖는 영역이 존재하는 독소 분자의 위치 및 이(들) 영역이 숙주 특이성과 관련되는 정도를 분명히 할 수 있어야 한다.
각종 독소 분자 및 바실루스 투린지엔시스의 여러 종으로 부터의 이들 분자를 코딩하는 독소 유전자의 분자 구조의 지식은 본 발명의 방법을 사용하여 최초로 가능한 이들 유전자의 조절되는 유전자 조작에 특히 유용하다.
δ-내독소 유전자 자체의 조절 수식외에 본 발명의 신규 방법은 이들 유전자의 발현을 조절하는 조절 DNA 서열의 조작을 가능하게 하는데, 그 결과 숙주 특이성, 특히 흡수 행위와 같은 δ-내독소의 특수한 특성이 특이적으로 조절되는 방식으로 수식되며 또 예를 들어 더 강하고 보다 효과적인 프로모터 서열을 삽입하는 것에 의하여 δ-내독소의 재조비율이 향상될 수 있다.
선별된 유전자 또는 서브 유전자(subgene)를 시험관에서 특이적으로 조절되는 돌연 변이시켜 새로운 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 변종을 수득할 수 있다.
새로운 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 변종을 작성하는 다른 방법은 상이한 바실루스 투린지엔시스공급원에서 유래하는 유전자 또는 유전자의 부분을 서로 접합시켜 사용범위가 더 넓은 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스균주를 생성하는 것을 포함한다. 또한 합성적으로 또는 반합성적으로 생성된 독소 유전자는 새로운 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 변종을 작성하기 위한 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 형질전환 빈도에서의 현저한 증가 및 이 방법의 단순화의 결과로서 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 유전자 뱅크의 확립 및 수식된 신규 유전자의 급격한 스크리닝을 가능하게 한다.
특히 본 발명은 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 유전자 뱅크의 직접적 발현 및 공지의 바람직하게는 면역학적 또는 생물학적 방법을 사용하여 바실루스 투린지엔시스에서 신규 프로톡신 유전자의 확인을 최초로 가능하게 한다.
따라서 본 발명의 요지는 공지방법에 비하여 바실루스 투린지엔시스/바실루스 세레우스 형질전환 효율의 현저한 향상에 기본하여 최초로 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 개놈의 직접적인 유전자 조작을 가능하게 한 방법에 존재한다.
특히 본 발명은 엘렉트로포레이숀(electroporation)법에 의하여 재조합 DNA, 특히 플라즈미드 및/또는 벡터 DNA를 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포에 삽입하는 것으로써 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스를 형질전환하는 방법에 관한 것이다.
δ-내독소를 코딩하는 DNA 서열 및 바실루스 투린지엔시스 독소의 곤충 독성 특성을 실질적으로 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로써 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스를 형질전환시키는 방법이 바람직하다.
본 발명은 또한 δ-내독소를 코딩하는 DNA 서열 또는 적어도 바실루스 투린지엔시스 독소의 곤충 독성 특성을 실질적으로 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 형질의하여실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포에서 발현시키는 것에도 관한 것이다.
본 발명은 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에 대한 이작용성 벡터, 소위 셔틀 벡터의 제조 방법 및 이 셔틀 벡터의 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포의 형질전환용 용도를 포함한다.
바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 복제할 뿐 아니라 1개 이상의 다른 이형 숙주계, 특히 대장균 세포에서 복제되는 이작용성 벡터의 작성이 바람직하다.
본 발명은 바실루스 투린지엔시스에 천연적으로 존재하는 -내독소 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 또는 그와 실질적으로 상동, 즉 적어도 바실루스 투린지엔시스 독소의 곤충 독성 특성을 실질적으로 갖는 폴리팹티드를 적어도 함유하는 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스용 셔틀 벡터의 제조방법에 특히 관한 것이다. 본 발명은 또한 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포의 형질전환을 위한 이들 셔틀 벡터의 용도 및 이 셔틀 벡터상에 존재하는 DNA 서열, 특히 바실루스 투린지엔시스의 δ-내독소 또는 적어도 바실루스 투린지엔시스 독소의 곤충 독성 특성을 실질적으로 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 포함한다.
본 발명은 또한 상동 및 특히 비상동 DNA, 또는 상동 및 비상동 DNA의 결합물을 클로닝하고 발현하기 위한 일반적인 숙주 생물로서 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 상기의 상세하게 기술된 플라즈미드 및 셔틀벡터 그 자체, 그의 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 형질전환용 용도 및 이들로써 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포에도 관한 것이다.
본 발명의 범위내에서 특히 바람직한 것으로는, 형질전환에 의하여 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1cuyB 및 바실루스 세레우스 569K에 도입된 이작용성 (셔틀)벡터 pXI G1 (=pKG1) 및 pXI 93(=pK93)이다. 이들은 부다페스트 조약에 따라서, 국제 기탁기관으로 인정된 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (브로인슈바이크, 독일연방공화국)에 DSM 4573 (pXI G1, 형질전환에 의하여 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1cryB에 도입됨) 및 DSM 4571 (pXI 93,형질전환에 의하여 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1cryB에 도입됨) 그리고 DSM 4573 (pXI93, 형질전환에 의하여 바실루스 세레우스 569K에 도입됨)의 기탁 번호로 기탁되어 있다.
본 발명은 바실루스 투린지엔시스의 δ-내독소를 코딩하며 발현될 수 있는 DNA 서열로 형질전환되거나, 또는 바실루스 투린지엔시스 독소의 독성 특성을 실질적으로 갖는 적어도 1개의 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 형질 전환된 신규 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 변종에 특히 관한 것이다.
형질전환된 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 세포 그리고 이들로부터 생산된 독소를 살충제 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 본 발명은 또한 이것에도 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 상세하게 설명된 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포 또는 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의하여 생산된 프로톡신을 함유하는 무세포 결정체(δ-내독소) 제재를 사용하여 곤충을 방제하기 위한 조성물 및 그의 제조방법에도 관한 것이다.
다음은 도면의 간단한 설명이다;
제1도는 pBR 322(o)를 이용한 대장균 HB 101의 형질전환 및 pBC16(o)를 이용한 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB의 형질전환을 나타낸다(△는 *HD1cryB 세포의 생존수).
제2도는 형질전환 빈도에 대한 *바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 배양물의 연령의 영향을 나타낸다.
제3도는 형질전환 빈도에 대한 PBS완충용액의 pH값의 영향을 나타낸다.
제4도는 형질전환 빈도에 대한 PBS 완충용액의 사카로오스 농도의 영향을 나타낸다.
제5도는 형질전환체의 수와 형질전환에 사용된 DNA 양과의 상호 의존성을 나타낸다.
제6도는 셔틀벡터 *pXI61의 간단한 제한 지도이다. 빗금친 영역은 그람 양성인 pBC16으로부터 유래하는 서열이고, 나머지 영역은 그람 음성은 플라즈미드 pUC8로부터 유래한다.
제7도는 *pXI93의 간단한 제한 지도이다. 빗금친 영역은 프로톡신 구조 유전자(화살표, Kurhdl) 및 5' 및 3' 비코팅 서열을 의미한다. 나머지 빗금치지 않은 부분은 셔틀벡터 *pXI61로부터 유래한다.
제8도는 *바실루스 투린지엔시스 HD1cryB, 바실루스 세레우스 569K 및 이들의 유도체의 포자형성 배양물의 추출물을 SDS(나트륨 도데실 술페이트)/폴리아크릴아미드 갤 전기 영동시킨것이다. ( 1 : * HD1cryB(pXI93), 2 : *HD1cryB(pXI61), 3 : * HD1cry13, 4 : HD1,LBG B-4449, 5 : * 바실루스 투린지엔시스 569K(pXI 93), 6 : 569K)
a) 코마찌(Comassie)로 염색됨, M; 분자량 기준, MW: 분자량(달톤), 화살표; 130,000 단톤 프로톡신의 위치.
b) 동일한 겔의 웨스턴 블럿, 바실루스 투린지엔시스 HD1의 K-1 결정성 단백질에 폴리클로날 항체를 부가했음.
양성밴드는 표지된 항-염소 항체로써 발견하였다.
화살표; 130,000 달톤 프로톡신의 위치.
다른밴드; 프로톡신의 분해 생성물.
제9도는 바실루스 투린지엔시스에 적합한 엘렉트로포레이숀법을 사용하여 고초균 LBG B-4468을 pBC16 플라즈미드 DNA로써 형질전환 시킨것을 나타낸다.
(o; 형질전환체/㎍ 플라즈미드 DNA; o; 생존 세균의 수/m1)
* 우선권서류에서 플라즈미드 명명법으로 선택된 내부부호 pK는 외국 철원을 위해 공식적으로 인정된 부호 pXI으로 대체되었다.
또한 실시태양에 사용된 포자를 형성하지 않는 바실루스 투린지엔시스 HD1 돌연변이체에 대한 이름도 cryβ에서 cryB로 변경하였다.
본 발명의 개요는 원래 공지된 엘렉트로포레이숀 기술을 사용하여 플라즈미드 DNA를 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포로 삽입하는 것을 기본으로 한 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 신규 형질 전환방법에 관한 것이다.
다른 세균 숙주계에 대해 이미 확립된 형질전환 방법을 바실루스 투린지엔시스 및 밀접하게 관련된 바실루스 세레우스에 적용하는 본 발명까지의 모든 시도는 좌절되었으나, 이제 본 발명의 범위내에세 엘렉트로포레이숀 기술 및 그에 따른 단계들을 사용하여 놀랄만한 성공을 달성하게 되었다.
바실루스 투린지엔시스 원형질체로써 한 엘렉트로포레이숀 시험을 소비에트그룹 (22) 시바로바 앤. 일행, 1983) 에 의한 초기부터 실행되었으나 달성한 형질전환 빈도가 너무 낮아 이 방법은 바실루스 투린지엔시스 형질전환용으로는 부적합한 것으로 판단되어 더 이상의 주의를 받지 못했기 때문에 이러한 성공은 놀랍고 예기치 못한 것이라고 사료된다.
바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포의 엘렉트로포레이숀에 중요한 방법 변수를 조사함으로써 놀랍게도 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스의 요건에 이상적으로 적합한 형질 전환 방법을 개발할 수 있게 되어 플라즈미드 DNA ㎍당 106내지 108세포 범위, 특히 플라즈미드 DNA㎎당 106내지 107세포 범위의 형질전환율을 초래하는 형질전환방법을 개발하게 되었다.
플라즈미드 DNA ㎍당 102내지 최대 106형질전환체의 값과 거의 비슷한 높은 형질전환율은 지금까지 21)샬(1986)에 의해 기술된 PBT(폴리에틸렌 글리콜) 형질전환 방법으로만 달성될 수 있었다. 그러나, 높은 형질전환율은 PEG 방법이 많은 시간을 필요로하는 최적 연구에 특이적으로 적합한 바실루스 투린지엔시스균주에만 한정되었고, 따라서 이 방법은 실용상 부적합한 것으로 보고된다.
또한 이 방법의 실제 재현성은 대부분 존재하지 않거나 또는 미약하다.
이와 대조적으로, 본 발명의 방법은 원칙상 모든 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스균주에 적용가능하고 또 전통적인 PEG 형질전환 방법에 비하여 시간 소모가 적고, 보다 합리적이며 따라서 더 효과적인 형질전환방법이다.
예를 들어 본 발명의 방법에서는 전체 완전한 세포를 사용할 수 있어서 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스에 중요한 시간을 소모하는 원형질체 제조가 필요없고 또 그에 따라 복잡한 영양배지상에서 재분화시킬 필요가 없다.
또한 PEG 방법을 사용할 때 필수 방법 단계를 실행하는데 1주일까지 소모할 수 있으나 본 발명의 형질전환 방법으로는 형질전환된 세포가 수시간 (대체로 하룻밤)내에 수득될 수 있다.
본 발명의 다른 이점은 시간 단위상 형질전환될 수 있는 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포의 수에 관한 것이다.
전통적인 PEG 방법에서는 세포 성장으로 인해 너무 조밀하게 되어 재분화를 억제하는 것을 피하기 위해 소량만 동시에 접종 할 수 있는 반면 엘렉트로포레이숀 기법을 사용할 때는 다량의 바실루스 투린지엔니스 및/또는 바실루스 세레우스 세포가 동시에 접종 될 수 있다.
이로써 매우 낮은 형질전환 빈도에서도 형질전환체를 확인할 수 있는데, 이는 전술한 방법으로는 불가능하거나 또는 상당한 경비를 지출해야만 가능하다.
또한 ㎍ 범위의 DNA 양은 적어도 형질전환체 몇개를 수득하기에 충분하다.
이것은 예를 들어 바실루스 투린지엔시스 세포에서 강하게 뚜렷한 제한계 때문에 바실루스 투린지엔시스 DNA에 비하여 103정도의 형질전환 빈도 감소를 초래한는 대장균으로부터의 DNA 물질을 사용할때와 같이 매우 효과적인 형질전환계가 필요할 때 특히 중요하다.
원래 공지된 엘렉트로포레이숀 기술을 주로 기초로 한 본 발명의 형질전환 방법은 하기와 같은 특수방법 단계를 포함한다;
a) 바실루스 투린지엔시스 세포 성장에 적합하며 또 세포 성장에 충분하게 통기가 되는 베지내에 적당한 세포 밀도의 세포 현탁액을 제조하고; b) 이 세포 현탁액으로부터 세포를 분리하고 또 뒤이은 엘렉트로포레이숀에 적합한 접종 완충용액의 제현탁시키며; c) 엘렉트로포레이숀에 적합한 농도로 DNA 사료를 부가하고; d) b) 및 c)하에 기술된 뱃치를 엘렉트로포레이숀 장치에 도입시키며; e) 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포를 재조합 DNA로써 형질전환하기에 적합한 기간 동안 높은 전장 세기를 단시간 생산하기 위해 세포 현탁액위에 1회 이상 짧게 콘덴서를 방전시키고; f) 엘렉트로포레이트된 세포를 임의로 재배양하며; g) 엘렉트로포레이트된 세포를 적합한 선별 배지에 접종하고; 또 h) 형질전환된 세포를 선별한다.
본 발명의 범위내에서 특히 바람직한 본 발명 방법의 특수한 구체예로는 바실루스 투린지엔시스 세포를 먼저 통기가 적합하게되고 또 적합한 온도, 바람직하게는 20˚ 내지 35℃의 적당한 배지에서 광학밀도(OD550)가 0.1에서 1.0으로 될 때까지 배양한다.
엘렉트로포레이숀에 제공될 바실루스 배양물의 연령은 형질전환 빈도에 중요한 영향을 갖는다. 그러므로 0.1 내지 0.3, 특히 0.2의 바실루스 배양물의 광학 밀도가 특히 바람직하다. 그러나 다른 성장 단계의 바실루스 배양물, 특히 하룻밤의 배양물(제2도 참조)로서 우수한 형질전환 빈도를 달성할 수 있다는 사실에 주의해야 한다.
일반적으로 신선한 세포 또는 포자가 출발 물질로 사용되지만 급속 냉동된 세포 물질도 동일하게 사용될 수 있다. 이 세포 물질은 어느 정도량의 부동액이 부가된 적합한 액체 배지내의 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포현탁액이 바람직하다.
적합한 부동액은 물중의 삼투압적 활성 성분 및 DMSO의 혼합물 또는 적합한 완충용액이다. 부동액에 사용될 수 있는 적합한 성분은 당, 글리세롤 같은 다가 알코올, 당 알코올, 아미노산 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 포함한다.
바실루스 투린지엔시스 포자를 출발물질로 사용한 경우, 이들을 먼저 적합한 배지에 접종하고 적합한 온도, 바람직하게는 25℃ 내지 28℃에서 적합하게 통기시키면서 하룻밤 동안 배양한다. 이어 이 뱃치를 희석하고 상술한 방법으로 처리한다.
바실루스 투린지엔시스에서 포자 형성을 유도하기 위해 포자 형성을 일으키는 어떠한 배지도 사용할 수 있다. 본 발명의 범위내에서는 23) 요스텐 에이. 에이 및 로고프 엠. 에이취(1969)에 따른 GYS 배지가 바람직하다.
산소는 예를 들어 교반기를 사용하여 50 회전/분 내지 300 회전/분의 속도로 회전시키는 것에 의하여 배양물을 움직이게하여 배지에 공급하는 것이 바람직하다.
바실루스 투린지엔시스 포자 및 식물성 미생물 세포는 일반적으로 통상적인 방법에 따른 본 발명의 범위내에서 배양되며, 실용면에서 액체 영양 배지가 바람직하게 사용된다.
영양 배지의 조성물은 사용된 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 균주에 따라 약간 변화될 수 있다. 일반적으로, 호기성 바실루스종을 배양하는데 통상적으로 사용된 것과 같은 즉시 동화 가능한 탄소(C-) 및 질소(N-)원을 갖는 막연히 정의된 복합 배지가 바람직하다.
또한 비타민 및 필수 금속 이온이 필요하지만, 이들은 보통 사용된 복합 영양 배지에서 구성분 또는 불순물로서 적합한 농도로 함유되어 있다.
필요에 따라서, 필수 비타민 및 Na+, K+, Cu2+, Ca2+, Mg2+, Fe3+,
Figure kpo00002
, PO4 3-, SO4 2-, CI-, CO3 2-이온과 같은 상기 구성분과 흔적 원소 코발트 및 망간, 아연등은 그의 염 형태로 부가될 수 있다.
효모 추출액, 효모 가수분해물, 효모 자가분해물 및 효모 세포이외에, 특히 적합한 질소원은 콩가루, 옥수수가루, 귀리가루, 에다민(효소적으로 분해된 탁트알부만), 팹톤, 카제인 가수분해물, 콘 스팁 리커(corn steep liquors) 및 육엑스 이며, 이 예에 의해 본 발명의 주제는 제한되지 않는다.
상술한 N-공급원의 바람직한 농도는 1.0g/l내지 20g/l이다.
C-공급원은 특히 클루코오스, 락토오스, 수크로오스, 덱스트로오스, 말토오스, 녹말, 세레로즈, 셀틀로오스 및 맥아추출액이 적합하다. 농도 범위는 1.0g/l내지 20g/l이 바람직하다.
복합 영양 매지 이외에 적합한 농도로 상술한 영양소를 함유하는 반합성-또는 완전한 합정 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 범위내에서 바람직하게 사용되는 LB 배지이외에, 항생물질 배지3, SCGY 배지 등과 같이 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스를 배양하는데 적합한 기타 배지도 또한 사용할 수 있다. 포자형성된 바실루스 투린지엔시스 배양물은 GYS 배지(경사진한천)상, 4℃에서 보관하는 것이 바람직하다.
세포 배양물이 소망하는 세포 밀도에 도달된 후, 원심분리에 의하여 세포를 채집하고 또 얼음으로 먼저 냉각된 적합한 완충용액에 현탁시킨다.
조사과정중 온도는 중요하지 않으므로 넓은 범위에서 자유로이 선정할 수 있다. 0℃ 내지 35℃, 바람직하게는 2℃ 내지 15℃ 또 보다 특히 4℃의 온도 범위가 바람직하다. 엘렉트로포레이숀 전후의 바실루스 세포의 배양 기간은 도달되는 형질전환 빈도에 대해 영향을 조금만 미친다. (표 1참조). 과도하게 긴 배양만이 형질전환 빈도의 감소를 초래한다. 0.1 내지 30분, 특히 10분의 배양기간이 바람직하다. 조사과정중 온도는 중요하지 않으므로 넓은 범위에서 자유로이 선정할 수 있다. 0℃ 내지 35℃, 바람직하게는 2℃ 내지 15℃ 또 보다 특히 4℃온도가 바람직하다. 이 조작은 1회 이상 반복될 수 있다. 본 발명의 범위내에서 특히 바람직한 완충용액은 안정화재로서 글루코오스 또는 사카로오스와 같은 당류, 또는 만니톨과 같은 당 알코올을 함유하며 또 5.0 내지 8.0으로 고정된 pH값을 갖는 삼투압적으로 안정화된 인산염 완충용액이다. 보다 특히 5.0 내지 8.0, 바람직하게는 5.5, 내지 6.5의 pH값을 가지며 안정화제로서 0.1M 내지 1.0M, 바람직하게는 0.3M 내지 0.5M의 농도로 사카로오스를 함유하는 PBS형의 인산 염완충용액이 바람직하다(제3도 및 제4도 참조).
현탁된 바실루스 세포 분량을 큐벳 또는 기타 적합한 용기로 옮기고 DNA 시료와 함께 적당한 기간동안, 바람직하게는 0.1 내지 30분 동안, 특히 5 내지 15분간, 또 적당한 온도, 바람직하게는 0℃ 내지 35℃, 특히 2℃ 내지 15℃ 또 보다 특히 4℃에서 배양한다.
저온에서 조작할 때는 이미 냉각된 큐벳 또는 기타 적당하게 냉각된 용기를 사용하는 것이 유리하다.
형질전환된 세포의 수 및 엘렉트로포레이숀에 사용된 DNA 농도사이는 광범위에 걸쳐 선형 관계이며, DNA 농도가 증가함에 따라 형질전환된 세포의 수가 증가한다(제5도참조). 본 발명의 범위내에서 바람직한 DNA 농도는 1ng 내지 20㎍ 범위이다. 10ng 내지 2㎍의 DNA 농도가 특히 바람직하다.
바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포 그리고 플라즈미드 DNA 또는 기타 적합한 DNA 사료를 함유하는 전체 벳치를 엘렉트로포레이숀 장치로 도입하고 엘렉트로포레이숀 처리, 즉 전기적 자극에 잠시동안 노출시킨다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합한 엘렉트로포레이숀 장치는 예를 들어 바이오 라드(미합중국 캘리포니아 리치몬드 소재; Gene Pulser Apparatus), 바이오테크놀로지즈 엔드 익스페리멘탈 리서치 인코오포레이티드(미합중국 캘리포니아 산디에고 소재; BTX Transfector 100), 프로메가(미합중국 위스콘신 마디손 소재; X-cell 2000 Electroporation system)등과 같은 여러 제조사로부터 용이하게 구입할 수 있다.
본 발명의 방법에 적합한 다른 장치도 또한 사용할 수 있다.
예를 들어 직사각형 펄스 또는 지수적으로 분해하는 펄스 등 각종 펄스 형태를 사용할 수 있다.
지수적으로 분해하는 펄스가 본 발명의 범위내에서 바람직하다.
이것은 콘덴서를 방전하는 것에 의하여 생성되며 또 전압에따라 초기에 매우 급속하게 증가하고 또 저항 및 용량의 함수로서 지수적 분해상을 나타내는 것을 특징으로 한다. 시간상수 RC는 지수적 분해시간 길이를 측정하게 한다. 이것은 초기 전압(Vo)의 37%까지 분해하는데 필요한 시간과 같다.
세균 세포에 영향을 미치는데 중요한 변수의 하나는 세포에 가해지는 전장의 세기에 관한 것으로, 전극판사이의 거리에 가해지는 전압의 비율로 계산한다.
이와관련하여 보다 중요한 것은 지수적분해 시간이다. 이것은 사용된 장치의 구조(예를 들어 콘덴서의 용량) 및 예를 들어 엘렉트로포레이숀에 제공된 완충용액의 조성물 또는 세포 현탁액의 부피와 같은 다른 변수에 따라 다르다.
조사과정에서 엘렉트로포레이숀에 제공된 세포 현탁액의 부피를 1/2로 감소시키면 형질전환 빈도가 10배정도 증가함을 밝혀냈다.
사용된 완충용액을 최적화함으로써 지수적 분해시간을 연장시키면 또한 형질전환 빈도를 현저하게 증가시킨다.
그러므로 지수적 분해 시간을 연장시키고 그에따라 형질전환 빈도를 향상시키는 모든 장치는 본 발명의 범위내에서 바람직하다.
본 발명의 범위내에서 바람직한 분해 시간은 약 2분 내지 약 50분, 특히 약 8분 내지 약 20분이다. 약 10분 내지 약 12분의 지수적 분해시간이 가장 바람직하다.
본 발명의 범위내에서, DNA 함유 세포 현탁액을 가로질러 콘덴서를 잠깐 방전시키는 것에 의하여 매우높은 전장 세기를 단 기간동안 세균세포에 작용시킨 결과 바실루스 투린지엔시스 세포의 투과성은 잠시동안 그리고 가역적으로 향상된다. 엘렉트로포레이숀 빈수는 본 발명의 방법 과정중에 서로 밀접하게 관련되어 있어서 엘렉트로포레이숀 용액중에 있는 DNA의 바실루스 세포로의 최적 흡수를 확실히 한다.
본 발명의 범위내에서 콘덴서의 용량은 1㎌ 내지 250㎌가 유리하고, 특히 1㎌ 내지 50㎌ 보다 특히 25㎌가 유리하다. 초기 전압의 선정은 중요하지 않으므로 광범위내로 자유로이 선정할 수 있다. 0.2kV 내지 50kV, 특히 0.2kV 내지 2.5kV 보다 특히 1.2kV 내지 1.8kV의 초기 전압이 바람직하다. 전극판사이의 거리는 엘렉트로포레이숀 장치의 크기에 따라 다르다. 0.1cm 내지 1.0cm, 바람직하게는 0.2cm 내지 1.0cm, 보다 특히 0.4cm가 유리하다. 세포 현탁액에 작용하는 전극판 사이의 거리로부터의 전장 값 및 초기 전압은 콘덴서에 고정되어 있다. 이들 값은 100V/cm 내지 50,000V/cm 범위내가 유리하다. 100V/cm 내지 10,000V/cm, 특히 3,000V/cm 내지 4,500V/cm의 전장 세기가 특히 바람직하다.
예를 들어 용량, 초기 전압, 전극간 거리등과 같은 자유로이 선정 가능한 변수의 조정은 사용된 장치의 구조에 따라 어느 정도 다르므로 제한 범위내에서 경우별로 변경할 수 있다. 그러므로 어떤 경우에는 지시된 제한값을 초과하거나 또는 그 이하로 될 수 있는데 이것은 최적 전장 세기를 얻기 위해 필요한 것이어야 한다.
실제의 엘렉트로포레이숀 조작은 심의중인개에 대한 최적 형질전환 비율이 달성될 때까지 1회 이상 반복할 수 있다.
엘렉트로포레이숀후, 처리된 바실루스 세포는 0.1 내지 30분동안, 0℃ 내지 35℃ 바람직하게는 2℃ 내지 15℃온도에서 재배양한다. 이어 엘렉트로포레이트된 세포를 적합한 배지로 희석하고 또 적합한 기간동안, 바람직하게는 2 내지 3시간 동안, 적당히 통기시키면서 또 적합한 온도, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃에서 다시 배양한다.
이어 세균 세포에 도입된 신규 DNA 서열을 선별하기 적합한 약재를 첨가제로서 함유하는 고체 배지에 바실루스 투린지엔시스 세포를 접종시킨다. 사용된 DNA의 성질에 따라서 상기 약재는 예를 들어 항생활성 화합물 또는 그중에서도 염료일 수 있다. 테트라시클린, 카나마이신, 클로람패니콜 및 에리트로마이신으로 구성된 군으로부터 선정된 항생물질이 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포를 선별하기 위해 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다.
비색 반응에 의해 확인될 수 있는 X-갈 (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-칼랄토시드)와 같은 색소원 기질이 또한 바람직하다.
기타 표현형 마이커는 기술자에게 공지되어 있고 또 본 발명의 범위내에서 사용될 수 있다.
또한 바실루스 투린지엔시스 세포를 배양하기 적합한 어떤 영양 배지도 사용가능하며, 또 이 배지에 예를 들어 한천, 아가로오스, 젤라틴등과 같은 통상적으로 사용되는 배지 응고제중의 하나가 부가된다.
바실루스 투린지엔시스에 대하여 자세하게 진술된 방법 변수는 바실루스 세레우스 세포에도 동일하게 적용된다.
종래 기술에서 여태까지 사용한 방법과는 달리 진술된 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스의 형질전환에 대한 본 발명의 방법은 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에 존재하는 특수한 천연적 플라즈미드의 사용에만 한정되지 않고 모든 형태의 DNA에 이용가능하다.
따라서 최초로 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스를 제어된 방법으로 형질전환시킬 수 있게 되어 상동 플라즈미드 DNA, 즉 바실루스 투린지엔시스 또는 밀접하게 관련된 바실루스 세레우스에 천연적으로 존재하는 플라즈미드 DNA외에 비상동 기원의 플라즈미드 DNA도 사용할 수 있게 되었다.
이것은 바실루스 투린지엔시스 또는 밀접하게 관련된 바실루스 세레우스 이와의 생물에 천연적으로 존재하는 플라즈미드 DNA일 수 있다. 그 예로는 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 복제 할 수 있는 황색포도상구균으로 부터의 플라즈미드 pUB110 및 pC194 (24)호리노우찌 에스. 및 바이즈 불륨 비이, 1982; 25)폴락 제이. 및 노비크 알. 피이, 1982) 및 고초균으로 부터의 플라즈미드 pIM13 (말러 제이. 및 할보손 에이취. 오, 1980), 또는 재조합 DNA 기술에 의하여 상동 플라즈미드 DNA 또는 비상동 플라즈미드 DNA 또는 상동 및 비상동 플라즈미드 DNA의 결합물로부터 작성된 하이브리드 플라즈미드 DNA가 있다. 마지막의 하이브리드 플라즈미드 DNA가 다른 천연 단리물에 비하여 재조합 DNA와 작업하기가 훨씬 적합하다.
본 발명의 주제를 제한하지 않는 예로 플라즈미드 pBD64 (27) 그리크잔 티. 일행, 1980), pBD347, pBD348 및 pUB1664를 들 수 있다.
pBD64와 같이 고초균에 대하여 이미 확립된 클로닝 벡터는 각종 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스균주에서 클로닝 실험을 행하는데 특히 중요하다.
플라즈미드 DNA이외에 본 발명의 범위내에서 다른 DNA를 형질전환법으로 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스에 도입할 수 있다. 형질전환된 DNA는 자율적으로 복제하거나 또는 크로모좀에 통합된다. 플라즈미드가 아니라 피지로부터 유래한 벡터 DNA일 수 있다.
본 발명은 또한 이작용성 벡터(셔틀벡터)의 작성에도 관한 것이다.
바실루스 투린지엔시스 또는 밀접하게 관련된 바실루스 세레우스 이외에 1개 또는 수개의 이형 숙주 생물에서 복제할 수 있고 또 상동 및 이형 숙주계 모두에서 확인될 수 있는 이작용성 (하이브리드) 플라즈미드 벡터, 소위 셔틀벡터의 작성과 그 사용이 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다.
이형 숙주 생물이라함은 본 발명의 범위내에서 바실루스 투린지엔시스/바실루스 세레우스군에 속하지 않고 또 안정한 상태로 자기 복제 DNA를 유지할 수 있는 모든 생물을 의미한다.
그러므로 상기 정의에 따라서 원핵 생물 및 진핵 생물 모두가 이형 숙주 생물로 작용할 수 있다.
원핵 숙주 생물군의 대표로서 예를 들면 고초균 또는 거대균과 같은 바실루스속, 황색 포도상 구균과 같은 포도상 구균속, 대변연쇄상구균과 같은 연쇄상 구균속, 스트랩토마이세스종과 같은 스트랩토마이세스속, 슈도모나스종과 같은 슈도모나스속, 대장균과 같은 에세리히아속, 아그로박테륨 튜매파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rbizogenes)와 같은 아그로박테륨속, 살모 낼라속, 에르위니아속등을 들 수 있다. 진핵 숙주군으로 부터는 특히 효모와 동물 및 식물 세포를 들 수 있다. 열거한 예를 최종적인 것이 아니며 또 어떤 의미로든 본 발명의 주제를 제한하지 않는다. 원핵 및 진핵 숙주 생물군으로부터 기타 적합한 대표에는 기술자에게 공지되어 있다.
원핵 숙주군으로부터 고초균 또는 거대균, 슈도모나스종 및 특히 대장균 뿐만 아니라 진핵 숙주군으로 부터의 동식물 세포가 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다.
바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포에서뿐 아니라 대장균에서도 복제할 수 있는 이작용성 벡터가 특히 바람직하다.
본 발명은 또한 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스를 형질전환시키기 위한 상기 이작용성 벡터의 용도도 포함한다.
셔틀 벡터는 상동(바실루스 투린지엔시스, 바실루스 세레우스) 또는 비상동 기원의 플라즈미드 및/또는 벡터 DNA를 먼저 적합한 제한 효소로 절단한 다음 각각 소망하는 숙주계에서 복재하는데 필수적인 기능을 함유하는 DNA 단편을 적합한 효소 존재하에서 서로 연결시키는 재조합 DNA 기술을 이용하여 작성한다.
전술한 이형 숙주생물은 비상동 기원의 플라즈미드-및/또는 벡터 DNA의 공급원으로 작용할 수 있다.
각종 DNA 단편을 연결하는 것은 상이한 숙주계에서 복제하는데 필수적인 기능이 포함되도록 실행되어야 한다.
또한 완전히 비상동 기원의 플라즈미드 DNA 및 /또는 벡터 DNA도 셔틀벡터의 작성에 사용될 수 있으나, 비상동 융합 상대의 적어도 하나는 바실루스 투린지엔시스/바실루스 세레우스 숙주계에서 복제를 가능하게 하는 DNA 영역을 함유하여야 한다.
바실루스 투린지엔시스/바실루스 세레우스에서 복제할 수 있는 비상동 기원의 플라즈미드 DNA 및/또는 벡터 DNA의 공급원으로 황색 포도상 구균과 같은 포도상구균속, 대변연쇄상 구균과 같은 연쇄상 구균과 같은 연쇄상구균속, 거대균 또는 고초균과 같은 바실루스속, 스트렙토마이세스종과 같은 스트렙토마이세스속으로 구성된 군으로 부터 선정된 그람 양성 세균의 대표류를 예로 들 수 있다. 상기 예로 열거한 그람 양성 세균의 대표류이외에 기술자에게 공지된 기타 생물계열도 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 a) 먼저 적합한 제한 효소를 사용하여 상동 또는 비상동 기원의 플라즈미드 DNA를 단편으로 절단하고 또 b) 각종 숙주계에서 복재 및 선별하는데 필수적인 기능이 포함되도록 각각 소망하는 숙주계에서 복제 및 선별하는데 필수적인 영역을 함유하는 단편들을 적합한 효소 존재하에서 연결시키는 것을 포함하는, 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스를 형질전환시키는데 적합한 이작용성 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이렇게 하여 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스에서 복제하는데 필수적인 영역이외에 적어도 1개의 다른 이형 숙주계에서의 복제를 보장하는 DNA 서열을 함유하는 이작용성 플라즈미드를 수득한다.
상동 및 이형 숙주계 모두에서 이작용성 벡터를 신속하고 효과적으로 선별하기 위해서는 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에서 뿐 아니라 이형 숙주계에서도 사용될 수 있는 즉 신속하고 간단하게 선별 가능하게 하는 특이적 선별 가능한 마커를 갖는 벡터를 제공하는 것이 유리하다. 항생물질 내성을 코딩하는 DNA 서열, 특히 카나마이신, 테트라시클린, 클로람페니몰, 에리트로마이신등으로 구성된 군으로부터 선정된 항생물질에 대한 내성을 코딩하는 DNA 서열을 사용하는 것이 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다.
X-갈 (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-칼락토시드)와 같은 색소원 기질을 갖는 효소를 코딩하는 유전자 또한 바람직하다. 형질전환된 클로니는 비색 반응에 의하여 쉽게 확인될 수 있다.
기타 표현형 마커 유전자는 기술자에 공지되어 있고 또 본 발명의 범위내에서 이용될 수 있다.
바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 또는 양 숙주계에서 복제를 가능하게 하는 DNA 서열 뿐 아니라 예를 들어 고초균, 거대균, 슈도모나스종, 대장균등과 같은 기타 세균 숙주계에서 복제하는데 필요한 DNA 영역을 또한 함유하는 셔틀벡터의 작성이 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다.
한편으로는 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 또는 양쪽에서 또 다른 한편으로는 효모, 동식물 세포등으로 구성된 군으로부터 선정된 진핵 숙주계에서 복제하는 셔틀벡터가 또한 바람직하다.
바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 또는 양쪽계에서 상기 벡터의 복제에 필요한 DNA 서열 뿐 아니라 대장균에서 셔틀 벡터의 복제를 가능하게 하는 DNA 서열을 함유하는 셔틀벡터의 작성도 더욱 특히 바람직하다.
바실루스 투린지엔시스 - 바실루스 세레우스/ 대장균계용 셔틀벡터의 작성을 위한 출발 플라즈미드의 예로는 바실루스 세레우스 플라즈미드 pBC16 및 대장균 플라즈미드 pBR322 (28)비에이라 제이. 및 메싱 제이, 1982)로부터 유도된 플라즈미드 pUC8를 들 수 있고 이 예로써 어떠한 제한을 의미하지 않는다.
본 발명은 또한 상동 및 이형 숙주계에서 복제 및 선별하는데 필수적인 기능뿐아니라 표현 가능한 형태의 1개이상의 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열을 함유하는 이작용성(셔틀)벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열을 적합한 효소를 이용하여 이작용성 벡터에 삽입하는 것을 포함하는 이들 벡터의 제조방법을 포함한다.
본 발명의 셔틀벡터 및 진술한 형질전환 방법을 사용함으로써 투린지엔시스 세포외의 외래 숙주계에서 바실루스 투린지엔시스에 클론된 DNA 서열을 형질전환법에 의하여 고도의 효율로 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포에 최초로 도입할 수 있다.
따라서 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열, 특히 조절 기능을 갖는 유전자 또는 기타 유용한 DNA 서열이 최초로 안정한 방법으로 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 세포에 도입되며 또 필요에 따라서 그 속에서 발현할 수 있게되어 그 결과 신규의 소망스런 특성을 갖는 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 세포를 수득한다.
본 발명의 범위내에서 주어진 정의에 따른 상동 및 비상동 유전자 또는 DNA 및 합성 유전자 또는 DNA 뿐아니라 이들 DNA의 결합물은 본 발명의 방법에서 유전자로서 사용될 수 있다.
코딩 DNA 서열은 개놈 DNA만, cDNA만 또는 합성 DNA만으로 작성될 수 있다. cDNA 및 개놈 DNA 및/또는 합성 DNA로 구성되고나, 또는 이들 DNA의 결합물로 구성된 하이브리드 DNA 서열로된 작성도 가능하다.
이 경우 cDNA는 개놈 DNA인 동일한 유전자로부터 유래하거나, 또는 cDNA 및 개놈 DNA 양쪽 모두 상이한 유전자로부터 유래할 수 있다. 그러나 어떤 경우든 개놈 DNA 및/또는 cDNA 모두는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 개별적으로 제조될 수 있다.
DNA 서열이 1개 이상의 유전자의 부분을 함유하면, 이들 유전자는 1개의 동일한 생물로부터, 상이한 균주 또는 동일류의 변종 또는 동일속의 상이한 종에 속하는 수개의 생물로부터, 또는 동일한 또는 서로 상이한 분류 단위의 1개속 이상에 속하는 생물로부터 유래할 수 있다.
상기 구조 유전자의 세균 세포에서의 발현을 확실히 하기 위해 코딩 유전자 서열은 우선 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포에서 작용할 수 있는 발현 서열에 기능적으로 연결되어야 한다.
따라서 본 발명의 하이브리드 유전자 조립체는 구조 유전자 이외에 프로모터 및 터미네이터 서열 모두를 발현 시그널 뿐아니라 3' 및 5' 비번역 영역의 기타 조절 서열도 함유한다.
바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 그 자체 및 그의 돌연 변이체 및 변종의 천연적 서열과 실질적으로 상동한 천연적 발현 시그널이 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다. 본 발명의 범위내에서 DNA 서열의 활성 영역의 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 특히 적어도 90%가 상동일 때 1개 DNA 서열은 제2DNA 서열과 실질적으로 상동이다. 실질적으로 상동이라는 표현의 본 발명의 정의에 따르면 1개 튜클레오티드를 다른 뉴클레오티드에 교환한 것이 침묵 돌연변이이면 코딩 영역의 DNA 서열내에 있는 2개의 상이한 뉴클레오티드는 상동으로 간주한다.
포자 형성 작용으로 발현율 확실하게 하는 바실루스 투린지엔시스의 포자 형성 의존 프로모터의 사용이 특히 가장 바람직하다.
δ-내독소를 코딩하는 DNA 서열을 사용하는 것이 본 발명의 범위내에서 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스를 형질전환하는데 특히 바람직하다.
본 발명의 키메라 유전자의 코딩 영역은 바실루스 투린지엔시스에서 천연적으로 존재하는 폴리팹티드 또는 이와달리 상기와 실질적으로 상동인, 즉 바실루스 투린지엔시스의 결정성 δ-내독소 단백질의 독성 특성을 적어도 실질적으로 갖는 폴리팹티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 폴리팹티드가 바실루스 투린지엔시스 아종의 결정성 단백질의 살충활성과 유사한 범위로 곤충 유충에 대해 살충 활성을 가지면, 본 발명의 범위내에서 정의에 의하여 폴리팹티드는 바실루스 투린지엔시스의 결정성 δ-내독소 단백질의 독성 특성을 실질적으로 갖는다. 적합한 아종으로 예를 들어 쿠르스타키, 배드리니, 알레스티, 톨워터, 소토, 댄드로리무스, 테네브리오니스 및 이스라엘렌시스으로 구성된 군으로부터 선정된 것을 들 수 있다. 나비목 유충에 대한 바람직한 아종은 쿠르스타키, 특히 쿠르스타키 HD1이다.
따라서 코딩영역은 바실루스 투린지엔시스에서 천연적으로 존재하는 영역일 수 있다. 이와달리 코딩 영역은 필요에 따라서 바실루스 투린지엔시스에 있는 서열과는 상이하지만 유전 암호에서 퇴보에 의하여 바실루스 투린지엔시스에 있는 서열과 동일한 서열을 또한 함유할 수 있다.
키메라 유전자의 코딩 영역은 또한 천연적으로 존재하는 결정성 δ-내독소 단백질과는 상이하지만 결정성 단백질의 곤충 독성 특성을 실질적으로 갖고 있는 폴리팹티드를 또한 코딩한다. 이러한 코딩 서열은 보통 천연적인 코딩 영역의 변종이다. 본 발명의 범위내에서 정의에 의하여 천연적인 DNA 서열의 변종은 동일한 기능을 충족시키는 천연적인 서열의 변형 형태로 이해될 수 있다. 변종은 돌연변이체 또는 합성 DNA 서열일 수 있고 또 상응하는 천연적 서열과 실질적으로 상동이다. DNA 서열의 활성 여역의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 90%가 상동이면 본 발명의 범위내에서 1개 DNA 서열은 제2DNA 서열과 실질적으로 상동이다. 실질적으로 상동이라는 표현의 발명의 정의에 따르면, 1개 튜클레오티드를 다른 것으로 대체한 것이 침묵 돌연변이이면 코딩영역의 DNA 서열에 있는 2개의 상이한 뉴클레오티드는 상동으로 간주된다.
따라서 본 발명의 범위내에서 바실루스 투린지엔시스 δ-내독소의 살충 특성을 가지고 또 기재되고 청구된 요건을 만족시키는 아미노산을 코딩하는 어떤 키메라 유전자도 사용가능하다. 바실루스 투린지엔시스 독소의 살충활성 및/또는 숙주 특이성에 관여하는 천연적 사업의 일부(들)과 적어도 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
대체로 키메라 유전자의 표현되는 폴리팹티드는 동일한 항원 결정기를 적어도 몇 개 갖기 때문에 천연적인 결정성 단백질과 공통으로 적어도 약간의 면역학정 특성을 갖는다.
따라서 상기 키메라 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 바실루스 투린지엔시스에 의해 제조된 결정성 단백질의 δ-내독소와 구조적으로 관련된 것이 바람직하다. 바실루스 투린지엔시스는 약 130,000 내지 140,000의 분자량을 갖는 프로톡신에 상응하는 하부단위를 갖는 결정성 단백질을 제조한다. 이 하부 단위는 프로테아제 또는 알칼리에 의해 분자량 70,000 이하의 살충성 단편으로 절단될 수 있다.
코딩영역이 프로톡신의 단편 또는 더 작은 부분을 포함하는 키메라 유전자를 작성하기 위해, 단편이 살충활성에 필수적인 단편 또는 단편의 부분 길이가 될 때까지 코딩영역을 단편화시킬 수 있다. 프로톡신, 프로톡신의 살충성 단편 및 이들 단편의 살충성 부분은 폴리펙티드 및 단백질과 같은 다른 분자에 결합될 수 있다.
본 발명의 범위내에서 사용하기에 적합한 코딩영역은 결정성 독소 유전자를 코딩하는 바실루스 투린지엔시스의 유전자로부터 얻을 수 있다. (휘트리 일행, PCT 출원 WO 86/01536호 및 미합중국 특허 4 448 885 호 및 동 4 467 036호). 결정성 단백질을 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 식 I에서 뉴클레오티드 156과 3623사이에 존재하거나 또는 이러한 결정성 단백질의 살충성 단편을 코딩하는 더 짧은 서열이다. (5) 가이저 일행, 1986 및 유럽특허 238 441호).
[식 1a]
Figure kpo00003
[식 1b]
Figure kpo00004
[식 1c]
Figure kpo00005
[식 1d]
Figure kpo00006
[식 1e]
Figure kpo00007
[식 1f]
Figure kpo00008
[식 2a]
Figure kpo00009
[식 2b]
Figure kpo00010
[식 2c]
Figure kpo00011
[식 2d]
Figure kpo00012
본 발명의 방법을 사용하는 형질전환법에 의해 키메라 유전자를 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 세포로 도입하기 위해서 바람직하게는 무엇보다도 먼저 유전자를 벡터에 삽입한다. 본 발명의 이작용성 벡터내로 삽입하는 것이 특히 바람직하다.
상응하는 유전자의 양이 바실루스 세포내로 삽입되기에 충분하지 못한 경우, 벡터는 무엇보다도 먼저 이형 숙주 세포내에서 복제에 의해 증식될 수 있다. 세균 세포 또는 효모 세포가 유전자의 증식에 가장 적당하다. 충분한 양의 유전자가 준비되면 바실루스 세포내로 삽입한다. 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 세포내로의 유전자 삽입은 복제에 사용된 것과 같은 벡터 또는 다른 벡터를 사용하여 행할 수 있다. 본 발명의 이 작용성 벡터가 특히 적합하다.
키메라 유전자의 복제에 적합한 세균 숙주 세포의 몇가지 예로는 대장균과 같은 에세리히아속, 아그로박테륨 튜매파시엔스 또는 아그로박테륨 리조게네스와 같은 아그로박테륨속, 슈도모나스 종과 같은 슈도모나스속, 거대균 또는 고초균과 같은 바실루스속등으로부터 선택된 세균이 있다. 본 발명의 형질전환법의 결과, 최초로 본 발명의 범위내에서 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 자체를 숙주세포로서 사용할 수 있게 되었다. 이형 유전자를 세균내에서 클로닝하는 방법은 미합중국 특허 4 237 224호 및 동 4 468 464호에 기재되어 있다.
바실루스 투린지엔시스의 결정성 단백질을 코딩하는 유전자를 대장균내에서 복제하는 것은 29) 웡(Wong)일행(1983)에 의해 기술되었다.
본 발명의 유전자의 복제에 적합한 효모 숙주 세포의 몇가지 예로는 효모균속에서 선택된 것들이 있다. (유럽 특허원 EP 0 238 441호).
키메라 유전자가 삽입될 수 있고 세균 또는 효모와 같은 적합한 숙주세포내에서 복제되는 벡터라면 어느것이든지 본 발명의 유전자의 증식에 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 파지(phage) 또는 플라즈미드로부터 유도될 수 있다. 파지로부터 유도되고 본 발명의 영역내에서 사용될 수 있는 벡터의 예로는 M-13 파지 및 λ-파지로부터 유도된 벡터가 있다. M13 파지로부터 유도된 적합한 벡터에는 M13mp18 및 M13mp19가 있다. λ-파지로부터 유도된 적합한 벡터에는 λ gt11, λgt7, λ Charon4가 있다.
플라즈미드로부터 유도되고 세균내에서 복제하기에 특히 적합한 벡터중에서, pBR322 (30) 볼리바르(Bolivar)일행, 1977), pUC18과, pUC19(31)노란더(Norrander)일행, 1983) 및 Ti-플라즈미드 (32)베반(Bevan)일행, 1983)를 예로 들 수 있으나, 본 발명의 주제를 그것으로 제한하지는 않는다. 세균 내 유전자의 증식에 바람직한 벡터는 pBR322, pUC18 및 pUC19이다.
아무런 제한도 부여하지 않으면서, 특히 예컨대 pBD347, pBD348, pBD64 및 pUB1664와 같은 직접적 클로닝 벡터와 특히 상기에서 상세하게 설명된 셔틀 벡터가 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스에 직접 클로닝하는데 있어서 언급될 수 있다.
본 발명의 범위내에서 특히 바람직한 것은 형질전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1cryB 및 바실루스 세레우스 569K 내로 도입되는 이작용성(셔틀)벡터 pXI61(=pK61) 및 pX193(=pK93)이며, 이들은 부다페스트 조약의 요건에 따라 국제 기탁 기관으로 승인된 Deutsche saumlung von Mikroorganismen
(브로인슈바이크, 독일연방공화국)에 DSM 4573 (형질전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1cryB 내로 도입된 pXI61)과 DSM 4571 ( 형질전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1cryB내로 도입되는 pXI93) 및 DSM 4573(형질진한법에 의해 바실루스 세래우스 0589K내로 도입되는 pXI93)의 번호로 기탁되어 있다.
세균내 복제에 적절한 키메라 유전자를 작성하기 위해서, 프로모터 서열, 5' 비번역 서열, 코딩 서열 및 3' 비번역 서열을 벡터내로 삽입하거나 또는 상기 벡터 중의 하나내에 올바른 서열로 조립한다. 본 발명에 따른 적합한 벡터는 숙주 세포내에서 복제될 수 있는 것이다.
필요한 경우, 프로모터, 5' 비번역 영역, 코딩 영역 및 3' 비번역 영역은 모두 벡터 밖에서 하나의 단위로 결합된 후 벡터내로 삽입될 수 있다. 다르게는 키메라 유전자의 각 부위를 개별적으로 벡터내로 삽입할 수 있다.
바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 클로닝벡터의 경우, 5'비번역 영역, 코딩 영역 및 3'비번역 영역으로 구성된 전체 단위가 바실루스 투린지엔시스로부터 단리되어 벡터내로 삽입될 수 있기 때문에 이 단계가 생략될 수 있다.
뿐만 아니라, 벡터는 바람직하게는 벡터로 형질전환된 세포를 인식할 수 있는 특성을 숙주 세포에 부여하는 마커 유전자를 함유한다. 항생물질 내성을 코딩하는 바커 유전자가 바람직하다. 적합한 항생물질의 예로는 암피실린, 클로람패니콜, 애리트로마이신, 테트라시클린, 히그로마이신, G 418 및 카나마이신이 있다.
또 바람직한 것은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-칼라토시드)와 같은 색소원 기질을 갖는 효소를 코딩하는 마키 유전자이다. 형질전환된 클로니는 비색 반응에 의해서 용이하게 검출될 수 있다.
벡터내로의 유전자 삽입 또는 벡터내 유전자의 조립은 표준방법, 예를 들어 재조합 DNA (233)마니아티스(Maniatis)일행, 1982)를 사용하거나 또는 상동 재조합법 (34) 힌넨(Hinnen)일행, 1978)을 이용하여 행한다.
재조합 DNA 기술 방법은 무엇보다도 벡터를 절단하고 소망의 DNA 시일을 벡터로 절단부위 사이에 삽입하는 것이 기초를 두고 있다; 소망의 DNA 서열은 말단은 상응하는 벡터의 밀단과 연결된다.
벡터는 바람직하게는 적합한 제한 효소에 의해 절단된다. 적합한 제한 효소로는, 예를 들어 Eco RI, Sac I 및 Bam HI와 같이 짐착 말단을 형성하는 것 뿐만이 아니라 Sma I, Hpa I 및 Eco RV와 같은 무딘 말단을 형성하는 것이 있다.
소망의 DNA 서열은 통상 염색채, 플라즈미드, 전이인자 또는 파지와 같은 더 큰 DNA 분자의 영역으로 존재한다. 이 경우 소망의 DNA 서열은 원래의 DNA로부터 절단되어 필요한 경우 말단이 절단 벡터의 말단과 결합할 수 있도록 변형된다. 소망의 DNA 서열과 절단된 벡터의 말단이 무딘 말단이면 예를 들어, T4 DNA 리가재와 같은 무딘 말단에 특이적인 리가제와 함께 서로 결합시킬 수 있다.
소망의 DNA 서열의 말단이 절단된 벡터의 말단과 점착 말단의 형태로 결합할 수 있는 경우, 역시 T4 DNA 리가제일 수 있는 점착 말단에 특이적인 리자제가 사용된다. 점착 말단에 특이적인 다른 적합한 리가제는 예컨대 대장균 DNA 리가제이다.
소망의 DNA 서열과 벡터를 동일한 제한 효소로 절단하는 것에 의하여 유리하게 점착 말단을 형성한다. 이 경우, 소망의 DNA 서열과 절단된 벡터는 서로 상보적인 짐착 말단을 갖는다.
대옥시뉴클레오티딜 말단 전이효소(Terminal deoxynucleotidy1 transferase
)를 사용하여 소망의 DNA 서열 및 절단된 벡터의 말단에 상보적인 동종 중합체 꼬리를 첨가함으로써 점착 말단을 작성 할 수도 있다.
다르게는, 특징 제한 효소에 의해 인식되고 링커로서 공지된 합성 올리고뉴클레오티드 서열을 첨가하고 이 서열을 제한효소로 절단함으로써 점착 말단을 제조할 수 있다(예컨대 33) 마니아티스(Maniatis)일행, 1982 참조).
그러므로 본 발명의 영역 내에서, 최초로 유전자를 클론하기 위하여 바실루스 투린지엔시스 외부에서 바실루스 투린지엔시스 유전자, 특히 δ-내독소를 코딩하고 있는 DNA 서열을 유전적으로 변형시킨 후 상기 δ-내독소 유전자가 발현될 수 있는 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스균 세포(동종의 세균 숙주계 내)내로 반환할 수 있게 되었다.
이것은 곧 우선 이종의 클로닝계 내에서 다량의 플라즈미드 물질을 생성한 후 이것을 형질 전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 내로 도입함으로써 특이적으로 조절된 방식으로 바실루스 투린지엔시스의 개놈을 유전적으로 증식할 수 있다는 것을 의미한다.
δ-내독소 유전자 및 이들 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열의 변형 가능성이 여기에서는 특히 흥미롭다.
키메라 유전자 외에 다른 어떤 키메라 유전자 조립체도 본 발명의 방법을 사용하여 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포 내로 삽입할 수 있다.
따라서, 예컨대 본 발명의 방법을 사용하여 비코딩 안티-센스 DNA를 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포의 개놈내로 삽입시킴으로써 상기 안티-센스 DNA의 발현 과정에서 상응하는 센스 DNA의 발현을 저해하는 mRNA가 전사되도록 할 수 있다. 이런 방식으로 특징의 바람직하지 않은 유전자가 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스내에서 발현하는 것을 특이적으로 저해할 수 있다.
뿐만아니라 개량된 생물적 살충제를 제조하기 위한 개량되고 잘 규정된 바실루스 투린지엔시스 균주의 제조외에 클로닝 및 필요한 경우 비상동 및/또는 상동의 유전자를 발현시키기 위한 일반적인 숙주로서 바실루스 투린지엔시스를 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법의 특이적이고 바람직한 실시태양으로, 최초로 신규 유전자 및 특히 신규 프로톡신 유전자를 천연 숙주, 즉 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스내로 직접 클론할 수 있게 되었다.
신규 프로톡신 유전자를 탐색하기 위해서 우선 바실루스 투린지엔시스의 유전자 라이브러리를 만든다.
방법의 제1단계에서, 프로톡신-생산 바실루스 투린지엔시스균주의 전체 DNA를 공지 방법으로 단리한 후 각각의 단편으로 절단한다. 바실루스 투린지엔시스 DNA는 기계적으로, 이를테면 전단력의 작용에 의해, 또는 바람직하게는 적절한 제한 효소의 작용에 의해 단편으로 될 수 있다. DNA 시료는 효소의 선택에 따라 부분적으로 또는 완전하게 분해된다. 본 발명의 범위 내에서는, 제한효소 Sou HIA와 같이 4개의 인식부위를 포함하고 및/또는 바실루스 투린지엔시스 DNA를 부분적으로 분해하는 제한 효소를 사용하는 것이 특히 바람직하지만, 이런 것이 어떤 제한을 의미하지는 않는다. 분명히, 다른 어떤 적합한 제한 효소라도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
상기에서와 같이 수득된 제한 단편은 공지 방법에 의해 크기별로 분리된다. DNA 단편의 크기 별 분류는 사카로오스 구배 원심분리와 같은 원심분리법, 또는 아가로스 겔 전기영동과 같은 전기영동법, 또는 이들 방법의 조합에 의해 행해진다.
적당한 크기의 단편, 즉 크기로 인해 프로톡신을 코딩할 수 있는 단편을 포함하는 부분을 모아서 다음의 방법 단계에 사용한다.
우선 앞서 단리한 단편을 표준 방법을 사용하여 적합한 클로닝 벡터내로 삽입한 다음 본 발명의 형질전환법을 사용하여 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스, 바람직하게는 바실루스 투린지엔시스의 프로톡신 없는 균주내로 삽입한다.
사용되는 벡터는 pBC16, pUB110, pUB194와 같은 그람-양성 플라즈미드, 또는 상기에서 상세히 설명된 셔틀 벡터일 수 있다. 하기 (실시예 9.1 참조)에서 상세히 설명되는 셔틀 벡터 pXI200이 본 발명의 범위내에서 특히 바람직하다. 적합한 벡터는 바람직하게는 형질전환되지 않은 다수의 클론중에서 형질전환된 벡터-함유 클론을 용이하게 확인할 수 있도록 하는 DNA 서열을 함유한다. 특히 발현시 항생물질 내성과 같이 용이하게 선별될 수 있는 특징을 부여하는 특이적 마커를 코딩하고 있는 DNA 서열이 바람직하다. 여기에서는 예로서 암피실린, 클로람페니몰, 에리트로마이신, 테트라시클린, 히그로마이신, G418 또는 카나마이신에 대한 내성을 언급할 수 있다.
또한 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-칼라토시드)와 같은 색소원 기질을 갖는 효소를 코딩하고 있는 마커 유전자가 바람직하다. 형질전환된 콜로니는 비색 반응에 의해 용이하게 검출될 수 있다.
일렉트로포레이숀후 처리된 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스를 선택적 포자형성 배지로 옮기고 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃, 더욱 바람직하게는 29℃ 내지 31℃의 온도에서 포자형성이 종결될 때까지 배양한다. 포자형성 배지는 선택적 기질로서 바람직하게는 사용한 벡터에 따라 상기의 항생물질중의 하나, 및 한천, 아가로스, 젤라틴등과 같은 적합한 응고제를 함유한다.
포자 형성과정에서, 포자형성 세포의 자가 분해가 일어나는데, 이것은 세포를 인위적으로 파쇄할 필요가 없기 때문에 공업적 규모의 후속 스크리닝에 유리하다.
소망의 프로톡신 유전자를 함유하고 천연 프로모터의 조절하에서 발현되는 클론에서, 형성된 결정성 단백질은 배지내에서 자유롭게 존재한다. 배지내에서 자유롭게 존재하는 이들 결정성 단백질은 막 필터 또는 다른 적합한 수단에 의해 고정화 될 수 있다. 적합한 막 필터는 이를테면 나일론 또는 니트로샘물로오스막이다. 이런 종류의 막은 시장에서 손쉽게 구입할 수 있다.
이렇게 고정화된 결정성 단백질은 적절한 스크리닝 방법으로 매우 간단하게 위치 및 종류를 확인 할 수 있다.
프로톡신-특이성 항체를 사용하는 면역학적 스크리닝이 본 발명의 범위내에서 바람직하다. 면역학적 스크리닝법은 공지된 것이며 예컨대 35)영(Young)일행, 1983 내에 상세하게 기술되어 있다. 단백질 분자의 특징 부위를 매우 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 사용하는 것이 본 발명에 따른 방법의 범위내에서 바람직하다. 이들 항체는 단독 또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 그러나 또한 면역학적 스크리닝에 폴리클로날 항힐청도 사용할 수 있다. 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 혼합물도 사용가능하다.
바실루스 투린지엔시스 프로톡신 단백질에 대한 모노클로날 항체의 제조법은36)Huber-Lukac(1984) 및37)Huber-Lukac 일행 (1986)에 상세히 설명되어 있다. 이들 방법을 본 발명에 사용할 수 있다.
항체에 기초를 둔 면역학적 스크리닝법은 본 발명의 한 부분이다.
본 발명의 영역내에서 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스내의 신규 DNA 서열의 위치를 확인하는데 다른 적당한 스크리닝법을 사용할 수도 있다.
상기의 방법에 의해 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 세포 및 이들 형질전환된 바실루스 세포에 의해 생성된 독소는 곤충의 방재, 특히 나비목, 피리목 및 딱정벌레목 곤충을 방제하는데 특히 적합하다.
따라서 본 발명은 a) 바실루스 투린지엔시스 내에서 자연적으로 생성되는 δ-내독소 폴리펩티드 또는 실질적으로 그와 상동인 폴리펩티드를 코딩하는 구조 유전자를 함유하는 제조합 DNA 분자로 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스, 또는 그 둘의 혼합물로; 또는 다르게는 b) 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의해 생성되는 프로톡신을 함유하는 무세포 결정체 제재로 곤충 또는 그 서식지를 처리하는 것을 포함하는 곤충 방제법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 통상 사용되는 담체, 분산제 또는 담체 및 분산제외에 a) 바실루스 투린지엔시스 내에서 자연적으로 생성되는 δ-내독소 폴리펩티드 또는 실질적으로 이와 상동인 폴리펩티드를 코딩하는 구조 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자로써 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 세포, 또는 그 둘의 혼합물; 또는 다르게는 b) 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의해 생성되는 프로톡신을 함유하는 무세포 결정체 제재를 함유하는 살충제 조성물도 포함한다.
살충제로서의 용도에 있어서, 재조합 바실루스 투린지엔시스 독소 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물, 특히 생존 및 사멸 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 세포의 혼합물을 포함해서 형질전환된 생존 또는 사멸 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 세레우스 세포 뿐 아니라 상기 형질전환된 세포에 의해 생성된 독소 단백질이 변형되지 않은 형태로 사용되거나, 또는 바람직하게는 재형분야에서 통상 사용되는 보조제와 함께 공지 방법으로 현탁 농축액 , 피복가능한 페이스트, 직접분부가능하거나 또는 희석가능한 용액, 수화제, 수용제, 살포제, 과립제, 및 예컨대 중합체 성분 내로의 캡슐제로 제재화된다.
조성물의 성질과 함께 분무, 원자화, 살포, 흩뿌리기, 피복 또는 붓기와 같은 사용 방법은 의도하는 목적과 주위환경에 따라 선택된다.
뿐만 아니라 형질전환된 생존 또는 사멸 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스 세포 및 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의해 생성되는 프로톡신을 포함하는 무세포 결정체 제재로 구성된 살충제 혼합물을 사용할 수 있다.
제재, 즉 형질전환된 생존 또는 사멸 바실루스 세포 또는 그의 혼합물 및 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의해 생성된 독소단백질, 및 적절한 경우 고체 또는 액체 보조제로 이루어진 조성물 또는 조제물은 예를 들어 형질전환된 세포 및/또는 독소 단백질과 고체 담체 및 적절한 경우 표면-활성 화합물(계면 활성제)을 긴밀하게 혼합하는 공지 방식에 의해 제조된다.
예를 들어 살포제 및 분산성 산제에 사용되는 고체담체는 보통 방해석, 활석, 카올린, 몬모릴로나이트 또는 아타펄자이트와 같은 천연광물질 충전제이다. 물리적 특성을 개선시키기 위하여 고분산 규산 또는 고분산 흡수성 중합체를 부가할 수도 있다. 적당한 과립형의 흡착성 담체는 예를 들어 부석, 깨어진 벽돌, 세피오라이트 또는 벤토나이트와 같은 다공형이고; 또 적당한 비흡수성 담체는 방해석 또는 모래와 같은 물질이다. 또한 예를 들어 특히 돌로마이트 또는 분말화된 식물잔유분과 같은 유기성 또는 무기성의 선과립형 물질도 다수가 사용될 수 있다. 적당한 계면활성 화합물은 양호한 유화, 분산 및 습윤특성을 갖는 바이오성, 양이온성 및/또는 음이온성 계면활성제이다. 계면활성제란 용어는 계면활성제의 혼합물을 포괄하여 의미한다.
적당한 음이온성 계면활성제는 수용성 비누 및 수용성 합성 계면활성화합물 모두일 수 있다.
적당한 비누는 예를 들어 올레산이나 스테아르산, 또는 코코닛유 또는 동물유로부터 수득할 수 있는 천연지방산 혼합물의 나트륨염 또는 칼륨염과 같은, 고급지방산 (CIC-C22)의 알칼리금속임, 알칼리토금속염 또는 비치환되거나 또는 치환된 암모늄염이다. 시스-2-(메틸-p-옥타데케닐아미노)-에탄술폰산의 나트륨염과 같은 지방산 매틸타우린염도 언급할 수 있다 (제재내의 함량은 바람직하게는 약 3%).
그러나, 특히 지방 술포네이트, 지방 술페이트, 술폰화된 벤즈이미다졸 유도체 또는 알킬아립술포네이트 또는 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올과 같은 지방 알코올(제재내 함량은 약 2%)과 같은 소위 합성계면활성제가 더욱 자주 사용된다.
지방술포네이트 또는 술페이트는 통상적으로, 예를 들어 리그노슬폰산, 도데실술페이트 또는 천연지방산으로부터 수득한 지방 알코올술페이트 혼합물의 나트륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리금속염, 알칼리토금속염 또는 비치환되거나 치환된 암모늄염의 형태로 존재하며 또 아실 라디칼의 알킬 잔기를 포함하는 C8-C22알킬라디칼을 함유한다. 이들 화합물은 또한 황산화된 및 술폰화된 지방 알코올/에틸렌옥사이드 부가물의 염도 포함한다. 술폰화된 벤즈이미다졸 유도체는 바람직하게는 2개의 술폰산기 및 탄소원자수 8내지 22개인 지방산 라디칼 1개를 함유한다. 알킬아릴술포네이트의 예로는 도대실젠술폰산, 디부틸나프탈렌술폰산, 또는 나프탈렌술폰산과 포름알데히드의 축합물의 나트륨염, 칼슘염 또는 트리에탄올아민염을 들 수 있다.
또한 예를 들어 p-노닐페놀과 에틸렌 옥사이드 4내지 14몰의 부가물의 인산에스테르염과 같은 상응하는 인산염도 적당하다.
바이온싱 계면활성제는 바람직하게는 지방족 또는 지환족 알코올, 또는 포화 또는 불포화 지방산 및 알킬페놀의 폴리글리콜 에테르 유도체이며, 이 유도체는( 지방족 ) 탄화수소 부위에 3 내지 30개 글리콜 에테르기 및 8 내지 20개 탄소원자를 함유하고, 또 알킬페놀의 알킬부위에 6 내지 18개 탄소원자를 함유한다.
이밖에 적당한 비이온성 계면활성제는 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌디아미노폴리프로필렌 글리콜 및 알킬 사슬에 1내지 10개 탄소원자를 함유하는 알킬폴리프로필렌 글리콜의 수용성 부가물이며, 이 부가물은 20 내지 250개 에틸렌 글리콜 에테르기 및 10 내지 100개 프로필렌 글리콜 에테르기를 함유한다. 이들 화합물은 통상 프로필렌글리콜 단위체당 1 내지 5개 에틸렌 클리콜 단위체를 함유한다.
비이온성 계면활성제의 대표적인 예로는 노틸페놀폴리에톡시에탄올, 피마자유 폴리글리콜 에테르, 피마자유 티옥실레이트, 폴리프로필렌/폴리에틸렌 옥사이드 부가물, 트리부틸패녹시폴리 애톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 및 옥틸 패녹시폴리애톡시에탄올을 들 수 있다. 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르 또한 비이온성 계면활성제로 적당하다.
양이온성 계면활성제는 바람직하게는 N-치환제로서 1개 이상의 Cg-C22알칼라디칼, 또 다른 치환제로서 비치환되거나 또는 할로겐화된 저급 알킬, 벤질 또는 히드록시-저급 알킬라디칼을 함유하는 4급 암모늄염이다. 이들 염은 예를 들어 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드 또는 벤질디(2-클로로에틸) 에틸암모늄 브로마이드와 같은 할라이드, 메틸술페이트 또는 에틸술페이트 형태가 바람직하다.
조제 분야에서 통상 사용되는 계면활성제는 특히 하기 간행물에 기재되어 있다;
Figure kpo00013
농약 조성물은 통상 형질전환된 생존 또는 사멸 바실루스 세포 또는 그 혼합물 또는 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의해 생산되는 독소 단백질 0.1 내지 99%, 바람직하게는 0.1 내지 95%, 고체 또는 액체 보조제 99.9 내지 1%, 바람직하게는 99.8 내지 5%, 계면활성제 0 내지 25%, 바람직하게는 0.1 내지 25%를 함유한다.
시판 제품이 농축물의 형태로 제조되는데 반해 최종 사용자는 통상 희석 제재로 사용할 것이다.
조성물은 비료 또는 특이 효과를 얻기 위한 다른 활성성분 뿐만 아니라 안정화제, 소포제, 점도조절제, 길합제, 짐착제와 같은 다른 보조제도 포함할 수 있다.
재조합 바실루스 투린지엔시스 독소 유전자를 포함하는 생존 또는 사멸 바실루스 세포 또는 그 혼합물 뿐만 아니라 상기 형질전환된 바실루스 세포에 의해 제조된 독소 단백질은 해충을 방제하는데 특히 적합하다. 나비목의 식물파괴곤충, 특히 피에리스 브라씨카에(Pieris brassicae), 헬리오티스 비레스센스(Heliothis virescens), 헬리오티스 제아(Heliothis zea), 스포도프테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis) 및 플루델라 크실로스텔라(Plutella xylostella)와 같은 피에리스 헬리오티스, 스포도프테라속의 곤충이 여기에서 언급될 수 있다.
상기의 살충제에 의해 방제될 수 있는 다른 해충은 예컨대, 딱정벌레목의 딱정벌레, 특히 디아브로티카 운대심푼크타타(Diabrotica undecimpunctata), 디아브로티카 론기코르니스(longicornis), 디아브로티카 비르기페라(virgifera), 디아브로티카 운대심푼크타타 호와르디(undecimpunctata howardi), 아겔라스티카 알니(Agelastica alni), 랩티노타르사 데켐리네아타(Leptinotarsa decemlineata)등과 같은 크리소멜리다에(Cbrysomelidae)과의 딱정벌레 뿐만아니라, 아노펠레스 세르겐티아(Anopheles sergentii), 우라나테니아 운구이쿨라타(Uranatenia unguiculata), 쿨렉스 우니비타루스(Culex univittatus), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti), 쿨렉스 피피엔스(Culex pipiens)등과 같은 파리목의 곤충이 있다.
마실루스 세포 또는 그에 의해 생성되는 독소 단백질의 양은 날씨조건, 토양조건, 식물생장 및 사용시기와 같은 개별적인 조건에 따라 다르게 사용된다.
[바실루스 투린지엔시스 독소를 함유하는 물질의 제재예]
하기 제형실시예에서 바실루스 세포라는 용어는 본 발명의 재조합 바실루스 투린지엔시스 유전자를 포함하는 바실루스 투린지엔시스 및/또는 바실루스 세레우스의 세포를 의미한다. (주어진 숫자는 중량%이다).
F1. 과립제
a) b)
바실루스 세포 및/또는 이들
세포에 의해 생성된 독소 단백질 5% 10%
카올린 94% -
고분산규산 1% -
아타필자이트 - 90%
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해 생성되는 독소 단백질을 우선 메틸렌 클로라이드내에 현탁하고, 이어 현탁액을 담체에 분무한 후 현택제를 진공하에서 증발시킨다.
F2. 살포제
a) b)
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에
의해 생성되는 독소 단백질 2% 5%
고분산규산 1% 5%
활석 97% -
카올린 - 90%
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해 생성되는 독소 단백질과 담체를 긴밀하게 혼합함으로써 즉시 사용할 수 있는 살포제를 수득한다.
F3. 수화제
a) b) c)
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에
의해 생성되는 독소 단백질 25% 50% 75%
리그노술폰산 나트륨 5% 5% -
라우릴황산 나트륨 3% - 5%
디이소프로필나프탈렌술폰산 나트륨 - 6% 10%
옥틸페놀폴리에틸렌 글리콜
에테르(에틸렌 옥시드 7 내지 8몰) - 2% -
고분산 규산 5% 10% 10%
카올린 62% 27% -
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해 생성되는 독소 단백질을 보조제와 조심스럽게 혼합한 후 생성되는 혼합물을 적합한 분쇄기에서 분쇄하여 물로 희석하면 소망하는 농도의 현탁액이 되는 수화제를 수득한다.
F4. 압출 과립제
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해
생성되는 독소 단백질 10%
리그닌술폰산 나트륨 2%
카르복시메틸샐룰로오스 1%
카올린 87%
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해 생성되는 독소 단백질을 보조제와 혼합한 후 조심스럽게 분쇄하고 혼합물을 물로 습윤시킨다.
혼합물을 압출하여 기류중에서 건조시킨다.
F5. 피복 과립제
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해
생성되는 독소 단백질 3%
폴리에틸렌 글리콜 200 3%
카올린 94%
혼합기내에서, 균일하게 혼합된 바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해 생성되는 독소 단백질을 폴리에틸렌 글리콜로 습윤시킨 카올린에 균일하게 투여한다. 이렇게 하여 분진없는 피복 과립제를 수득한다.
F6. 현탁농축액
바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해
생성되는 독소 단백질 40%
에틸렌 글리콜 10%
노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜
(에틸렌 옥시드 15몰) 6%
알킬벤젠술폰산 느리에탄올아민 염*3%
카르복시메틸셀룰로오스 1%
75%수성 유제 형태의 실리콘유 0.1%
물 39%
*알킬은 바람직하게는 n-도대실벤젠술폰산 트리에탄올아민염과 같이 10 내지 14, 특히 바람직하게는 12 내지 14의 탄소 원자를 갖는 직쇄 알킬이다.
균일하게 혼합된 바실루스 세포 및/또는 이들 세포에 의해 생산되는 독소 단백질을 보조제와 함께 긴밀하게 혼합하면 물로 희석하여 어떤 소망의 농도의 현탁액이라도 얻을 수 있는 현탁농축액을 수득한다
[실시예]
[일반적인 재조합 DNA 수법]
본 발명에 사용된 다수의 재조합 DNA 수법은 숙련자에게 일상적인 것이기 때문에, 일반적으로 사용되는 수법에 대해 하기에 간단히 설명하며 실시태양에서 일반적인 설명을 하지 않아도 되도록 한다. 특별히 다르게 지적하지 않는 한 이들 방법은 모두 33)마니아티스(Maniatis) 일행 (1982)에 의한 참고문헌에 기재되어 있다.
A. 제한 효소를 사용한 절단
반응 혼합물은 제조자인 메사추세츠의 비버리에 소재하는 뉴잉글랜드 바이오랩사가 추천한 완충 용액내에 약 50㎍/ml 내지 500㎍/ml의 DNA를 함유한다. DNA ㎍당 2 내지 5 단위의 제한 효소를 첨가하고 제조자가 추천한 온도에서 1 내지 3시간 동안 반응 혼합물을 배양한다. 65℃에서 10분간 가열하거나 또는 페놀로 추출한 후 에탄올로 DNA를 침전시킴으로써 반응을 중단시킨다. 이 수법은 34)마니아티스 일행의 참고 문헌 104 내지 106페이지에 기술되어 있다.
B. 무딘 말단 생성을 위한 DNA의 중합 효소 처리
제조자인 뉴 잉글랜드 바이오랩사가 권장하는 완충용액내의 반응 혼합물에 50㎍/ml 내지 500㎍/ml의 DNA 단편을 첨가한다. 반응 혼합물은 대옥시뉴클레오티드 삼인산염을 4가지 모두 0.2mM의 농도로 함유한다. 적절한 DNA 중합 효소를 첨가하고 15℃에서 30분간 반응시킨 후 65℃에서 10분동안 가열함으로써 반응을 중단시킨다 Eco RI 및 Bam HI와 같은, 5'짐착 말단을 생성하는 제한 효소에 의해 절단되어 수득되는 단편에는 DNA 중합효소의 큰 단편 혹은 클레노우(Klenow) 단편이 사용된다. Pst I 및 Sac I과 같은, 3' 짐착 말단을 생성하는 제한 효소에 의해 수득되는 단편에는 T4 DNA 중합효소가 사용된다.
이들 두 효소의 용도는 33)마니아티스 일행의 참고 문헌 113 내지 121 페이지에 기재되어 있다.
C. 아가로스 겔 진기영동 및 겔 불순물 제거를 위한 DNA 단편의 세척 33)마니아티스 일행의 참고문헌 150 내지 163 페이지에 기재되어 있는 바와 같이 평형 장치내에서 아가로스 겔 진기영동을 실시한다. 사용된 완충용액은 상기 문헌에 기재되어 있는 트리스-붕산염 완충액 또는 트리스-아세트산염이다. 전기 영동 동안에 겔 또는 완충액 탱크에 존재하거나 또는 전기 영동이 종결될 때까지 첨가되지 않는 에티디움 브로마이드 0.5㎍/ml로 DNA 단편을 염색한다. 장파 자외선으로 비추어서 DNA를 볼 수 있도록 한다. 단편을 겔로부터 분리하려면 미조리주 세인트루이스에 소재하는 시그마 캐미컬사로부터 구입한 저온에서 겔화되는 아가로스를 사용한다. 전기 영동 후, 소망의 단편을 절제하여 작은 플라스틱 튜브에 넣고 65℃에서 약 15분간 가열하고 페놀로 3회 추출하며 에탄올로 2회 침전시킨다. 이 방법은 33)마니아티스 일행에 의해 170 페이지에 기재된 것에 비해 약간 변화한 것이다.
달리는, 'Geneclean Kit' (미합중국 캘리포니아 라졸라 소재, 바이오 101 인코오포레이티드사 제품)를 사용하여 아가로스 겔로부터 DNA를 단리할 수 있다.
D. DNA 단편으로부터 5' 말단 인산의 제거
플라즈미드 클로닝 과정 동안에 플라즈미드 벡터를 탈인산 가수분해 효소로 처리하면 벡터가 다시 환상으로 되는 것을 감소시킨다. (33) 마니아티스 일행 참고 문헌 13 페이지에 논의되어 있음). 적절한 제한 효소로 DNA를 절단한 후 만하염 소재의 베링거-만하임사로부터 수득한 송아지 장의 알칼리성 탈인산 가수분해 효소를 첨가한다. DNA를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 페놀로 2회 추출하고 에탄올로 침전시킨다.
E. DNA 단편의 결합
상보적인 점착 말단을 갖는 단편을 서로 결합시키는 경우, 각 단편 약 100ng을 제조자 추천의 완충용액내의 뉴 잉글랜드 바이오랩으로 부터의 T4 DNA 리가제 약 0.2 단위와 함께 20 μl 내지 40μl의 반응 혼합물내에서 배양한다. 15℃에서 1 내지 20시간 동안 배양한다. 무딘 말단을 갖는 DNA가 결합되는 경우, T4 DNA 리가제의 양을 2 내지 4 단위로 증가시키는 것을 제외하고는 상기와 같이 배양한다.
F. 대장균에서의 DNA 형질전환
대부분의 실험에 대장균 HB101주를 사용한다. 33)마니아티스 일행에 의해 250 내지 251 페이지에 설명된 염화 칼슘 방법을 사용하여 DNA를 대장균내로 도입한다.
G. 플라즈미드 확인을 위한 대장균 스크리닝
형질전환 후, 소망하는 플라즈미드의 존재 여부를 알아보기 위해 생성된 대장균 클로니를 급속 플라즈미드 단리법으로 검사한다. 통상적으로 사용되는 2개 방법이 33)마니아티스 일행의 참고문헌 366 내지 369페이지에 기재되어 있다.
H. 플라즈미드 DNA의 대규모 단리
대장균으로부터 플라즈미드를 대규모로 단리하는 방법이 33)마니아티스 일행의 참고문헌 88 내지 94 페이지에 기재되어 있다.
배지 및 완충용액
LB 배지 [g/l]
트립톤 10
효모 추출액 5
NaCl 5
항생 배지 제3호(Difco Laboratories) [g/l]
소의 육엑스 1.5
효모 추출액 1.5
펩톤 5
포도당 1
MaCl 3.5
K2HPO43.68
KH2PO41.32
SCGY 배지 [g/l]
카사미노산 1
효모추출액 0.1
포도당 5
K2HPO414
KH2PO46
시트르산 나트륨 1
(NH4)2SO42
MgSO4·7H2O 0.2
GYS 배지(22)유스텐 엔드 로고프, 1969) [g/l]
포도당 1
효모추출액 2
(NH4)2SO42
K2HPO40.5
MgSO4·7H2O 0.2
CaCl2·2H2O 0.08
MnSO4·H2O 0.05
오오토클레이빙 전에 pH를 7.3으로 조절하였다.
PBS 완충액 [mM]
사카로오스 400
MgCl21
인산염 완충액, pH 6.0 7
TBST 완충액 [mM]
Tween 20*0.05%(w/v)
Tris/HCl*(pH8.0) 10
NaCl 150
*Tween 20; 라우르산 폴리에톡시소르비탄
*Tris/HCl; α,α,α-트리스(히드록시메틸)메틸아미노히드로클로라이드
우선권서류에서 플라즈미드를 명명하는데 선택한 내부 기호 pK를 본 명세서에서는 공식적으로 인정된 기호 pXI를 바꾸었다.
또한, 실시태양에서 사용된 바실루스 투린지엔시스 HDl 돌연변이체의 명칭도 cryβ에서 cryB로 바꾸었다.
[실시예 1; 엘렉트로포레이숀을 이용한 바실루스 투린지엔시스의 형질전환]
[실시예 1.1]
LB 배지(트립톤 10g/l, 효모 추출액 5g/l, NaCl 5g/l) 10ml에 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HDl의 무플라스미드 변이체인 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HDlcryB( 39)스타리디. 피. 일행, 1978)의 포자를 접종한다.
50회전/분의 회전 진탕기를 사용하여 뱃치를 27℃의 온도에서 하루밤 동안 배양한다. 이어 LB 배지 100ml 내지 400ml에서 바실루스 투린지엔시스 배양액을 100배로 희석하고 광학 농도 (OD550)가 0.2로 될 때까지 30℃의 온도에서 250회전/분의 회전 진탕기를 사용하여 더 배양한다.
원심분리법으로 세포를 모아 1/40 부피의 얼음-냉각된 PBS 완충용액(사카로오스 400mM, MgCl21mM, pH6.0의 인산염 완충용액 7mM)에 현탁시킨다. 원심분리 및 바실루스 투린지엔시스 세포를 PBS 완충액내에 현탁시키는 것을 다시 한번 반복한다.
이렇게 미리처리된 세포는 곧바로 엘렉트로포레이팅 되거나, 또는 다르게는 완충용액(20% (중량/부피))에 글리세린을 첨가한 후에 -20℃ 내지 -70℃에서 저장되어 후에 적절한 시점에서 사용된다.
얼음-냉각된 세포 800㎕ 분량을 미리 냉각된 큐벳에 넣고 pBC16 플라즈미드 DNA ( 40)번하드 케이. 일행, 1978) 0.2㎍(20㎍/㎖)를 첨가한 후 혼합물 전체를 4℃에서 10분간 배양한다.
급속 냉동된 세포 물질을 사용하는 경우, 먼저 적절한 분량의 냉동 세포를 얼음내 또는 상온에서 행동시킨다. 그 다음의 처리는 갓 생긴 세포 물질에 사용하는 방법과 같다.
이어 큐벳을 엘렉트로포레이숀 장치에 넣고 콘덴서의 1회 방전으로부터 생긴 0.1kV 내지 2.5kV의 전압의 작용으로 현탁액 내에 존재하는 바실루스 투린지엔시스 세포를 엘렉트로포레이팅한다.
사용된 콘덴서는 전기용량이 25㎌이고 큐벳 내 전극간의 거리는 0.4cm인데, 방전시킬 때 장치에 따라 0.25kV/cm 내지 6.25kV/cm의 초기 피이크 값을 갖는 전장의 세기를 지수적으로 감소시킨다. 지수적 붕괴 시간은 10 내지 12분의 범위이다.
예컨대 바이오라드사로 부터의 엘렉트로포레이숀 장치(Gene Pulser Apparatus, H165-2075, 바이오라드, 미합중국 캘리포니아 94804 리치몬드 하버웨이 사우쓰 1414 소재)를 기술된 엘렉트로포레이숀 실험에 사용할 수 있다.
또한 어떠한 다른 적절한 장치라도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
4℃에서 10분간 더 배양한 후, 세포 현탁액을 LB배지 1.2ml으로 희석하고 250회전/분의 회전 진탕기를 사용하며 30℃의 온도에서 2시간동안 배양한다.
새로이 수득된 플라즈미드를 선택하기에 적합한 항생 물질을 보조제로서 함유하는 LB 한천(한천으로 응고된 LB배지, 15g/l)상에 적절한 희석액을 접종한다. pBC16의 경우에는 테트라시클린을 20mg/l의 농도로 배지에 첨가한다.
주어진 전극사이의 거리에서 가해진 초기 전압의 작용으로 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB 및 pBC16에 대해 획득된 형질전환 빈도를 제1도에 나타내었다.
발생하는 테트라시클린 내성에 의해 삽입된 DNA의 발현을 검출한다. 형질전환법으로 pBC16을 바실루스 투린지엔시스로 도입한 후 2시간이 지나자마자 새로이 도입된 테트라시클린 내성을 갖는 완전한 표현형이 발현된다(표 2참조).
[실시예 1,2]
엘렉트로포레이숀에 사용된 세포 현탁액의 부피가 이 경우 400㎕인 것을 제외하고는 실시예 1.1과 똑같은 방법으로 바실루스 투린지엔시스 세포의 형질전환을 실행한다.
이 분량으로 형질전환 빈도는 10배정도 증가될 수 있다.
실시예 2; 다수의 상이한 플라즈미드를 시용한 바실루스 투린지엔시스의 형질전환
대부분의 시험은 바실루스 세레우스의 천연적으로 존재하는 플라즈미드인 pBC16으로 행하지만, pUB110( 25)폴락 제이. 및 노빅 알.피.1982), pC194 ( 24)호리노우찌 에스. 및 바이즈불룸 비., 1982) 및 pIM13 ( 26)말러 아이. 및 할보르손 에이취. 오., 1980)과 같은 기타 천연적으로 존재하는 플라즈미드 또한 바실루스 투린지엔시스 세포 내로 성공적으로 삽입될 수 있다.(표 3 참조).
또한, 고초균 클로닝 벡터 pBD64(27)그림크잔 티.일행, 1980) 및 플라즈미드 pBD347, pBD348 및 pUB1664와 같이 천연 단리체보다 제조합 DNA와의 작용에 더 적합한 이들 플라즈미드의 변이체도 형질전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 내로 도입될 수 있다(표 3 참조; 플라즈미드 pBD347, pBD348 및 pUB1664는 더블유. 슈르터 박사, 시바 -가이기 아게, 바젤로부터 제공받을 수 있다).
표 3에 나타낸 형질전환 결과에서, 본 발명의 형질전환법을 사용하면 1가지 예외만 제외하고는 사용된 플라즈미드 DNA에 관계없이 형질전환 빈도가 모두 105내지 107의 범위내에 있다는 것을 명확히 알 수 있다.
[실시예 3; 바실루스 투린지엔시스의 셔틀 벡터 작성]
pHV33( 프림로즈 에스. 비. 및 에리히 에스. 디., Plasmid, 6:193-201, 1981)과 같은 대장균 및 고초균의 이작용성 벡터의 존재는 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB에 적합하지 않다(표 3 참조).
강력한 이작용성 벡터를 작성하기 위해서, 우선 T4 DNA 리가재를 사용하여 pBC16의 큰 Eco RI 단편을 플라즈미드 pUC8(28)비에이라 제이. 및 에싱 제이,. 1982)의 Eco RI 위치에 삽입한다. 이 조립물로 대장균을 형질전환 시킨다. 제한 분석에 위해 옮다고 인정된 조립물을 pXI62라고 명명한다.
이어 말초부에 위치하는 Eco RI 절단 부위를 pUC8 폴리링커 영역으로부터 제거한다. 부분적인 Eco RI 분해로 pXI62를 선형으로 만든다. 클레노우 중합효소로 점착성 Bco RI 말단을 만들고 T4 DNA 리가제를 이용하여 결합시킨다. 형질 전환법에 의해 대장균 내로 도입한 다음, 제한 분석에 의해 옳다고 인정된 조립물을 선택하여 pXI61이라고 명명한다. pXI61을 단 1회만 절단하는 제한 효소의 절단 부위를 갖는 pXI61의 지도를 제6도에 나타내었다.
실시예 1에 기재된 형질 전환법을 사용하여 이 조립물을 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB에 직접 도입할 수 있다.
바실루스 투린지엔시스 균주내의 강력한 제한 장애로 인하여 대장균으로부터 유래한 pXI61 DNA를 사용할 때에는 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB로부터 유래한 플라즈미드 DNA를 사용할 때보다 형질 전환율이 더 낮다(표 3참조). 뿐만아니라 pXI61은 바실루스 투린지엔시스 내의 클로닝 실험을 행하는데 매우 적합하다고 판명되었다.
[실시예 4; 쿠르들(Kurhdl) δ-내독소 유전자의 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 균주 내로의 삽입]
본 발명의 범위 내에서 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 내로의 삽입 및 발현에 사용되는 쿠르들 δ-내독소 단백질을 코딩하고 있는 DNA 서열은 특허 절차상의 미생물의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 요구에 따라 국제적 기탁기관으로 인정된 독일연방 공화국 Deutche Sammlung von Mikroorganismen 에 1986년 3월 4일 기탁번호 DSM 3668로 기탁된 플라즈미드 pK36으로부터 유래한다.
δ-내독소 유전자의 확인 및 단리법과 플라즈미드 pK36의 조립법에 대한 상세한 설명ㄷ은 참고문헌의 형태로서 본 발명의 일부인 유럽 특허원 EP 0 238 441호에 기재되어 있다.
pK36 플라즈미드 DNA를 제한 효소 Pst I 및 Bam HI로 완전히 분해시키고 쿠르들 δ-내독소 유전자(식(I) 비교)를 함유하는 4.3Kb 단편을 아가로스 겔로부터 단리한다. 미리 Pst I과 BAm HI로 분해시키고 송아지 위장으로 부터의 알칼리성 탈인산 가수분해 효소로 처리한 pXI61내로 이 단편을 삽입한다. 대장균 HB101을 형질 전환시킨 후, 제한 분석에 의해 옳다고 인정된 조립물을 단리하여 pXI93이라고 명명한다. pWI93의 제한 지도를 제7도에 나타내었다.
두가지 상이한 방법으로 pXI93을 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB 내로 도입할 수 있다.
a) 실시예1에 기재된 본 발명의 형질 전환법을 사용하여 대장균의 pXI93 단리체로써 직접 바실루스 투린지엔시스 세포를 형질전환 시킨다.
b) 창 및 코헨, 1979에 의해 설명된 바와 같이 형질 전환법에 의해 우선 pXI93을 고초균내로 도입한다. 형질전환체 내에 포함되어 있는 완전하고 손상되지 않은 pXI93을 단리한 후 실시예 1에서 설명한 엘렉트로포레이숀법을 사용하는 형질전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB 내로 도입한다.
두 방법 모두 제한 분석에 의해 증명될 수 있는 완전무결한 pXI93 플라즈미드를 포함하는 형질전환체를 생성한다.
[실시예 5; 바실루스 투린지엔시스 내에서 δ-내독소 유전자의 발현 증거]
바실루스 투린지엔시스HDlcryB, HDlcryB(pXI61), HDlcryB(pXI93) 및 HDl의 포자형성 배양액을 배율 400의 위상차 현미경 하에서 비교한다. pXI93을 포함하는 균주 및 HD1에서만 전형적인 비피리미달 단백질 결정을 발견할 수 있었다. 동일 배양액의 추출물을 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동법으로 분리한다. 쿠르들 유전자 생성물에 상응하는 130,000 달톤의 단백질 밴드는 겔 상에서 플라즈미드 pXI93을 함유하는 균주 및 HD1에서만 검출될 수 있다(제8a도).
웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis; 제8b도)에서, 이 130,000 달톤 단백질과 그의 분해 생성물은 휴버-루카흐, 1982에 의해 설명된 방법에 따라 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1의 결정성 단백질에 대하여 미리 제조된 폴리클로날 항체와 특이적으로 반응한다. 이 방법에 대해서는 참고문헌으로 본 발명에 포함되어 있는 유럽 특허원 EP 238 441호에 상세하게 설명되어있다. 독소를 코딩하고 있는 영역의 상류인 플라즈미드 pXI93 상에 위치하는 것은 상기에 기술된 포자형성-의존 직렬 프로모터 ( 29)윙 에이치. 찌. 일행, 1983)를 포함하는 156 Bp DNA 영역이다. 이 서열은 δ-내독소 유전자가 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 및 바실루스 세레우스 569K 내에서 발현하는데 적합하다.
[실시예 6; 재조합 바실루스 투리지엔시스 HD1cryB(pXI93)의 독성의 증거]
바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 및 HD1cryB(pXI93)을 포자형성 배지(GYS 배지)내 25℃에서 배양한다. 위상차 현미경으로 점검하여 포자형성이 완료되면 포자 및(존재하는 경우) 프로톡신 결정을 원심분리법으로 모아 분무 건조한다. 생성된 분말을 헬리오티스 비레스센스(담배 짝벌레)L-1 유충의 먹이와 다양한 농도로 혼합한다. 6일후에 유충의 치사율을 확인한다. 기대한 바대로, 프로톡신 유전자가 없는 균주 HD1cryB는 헬리오티스 비레스센스에 대해 독성이 없는데 반해 플라즈미드 pXI93으로 형질전환된 균주는 투어량에 따라 헬리오티스 비레스센스를 사멸시킨다(표 4). 이것은 엘렉트로포레이숀법에 의해 생성된 재조합 균주가 생물적 살충제로 사용될 수 있음을 증명한다.
[실시예 7; 다양한 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 종 균주의 엘렉트로포레이숀]
실시예 1에 설명된 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB에 대한 형질전환법을 다른 균주에 대해서도 사용할 수 있다.
시험된 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 균주 모두는 본 방법에 의해 간단하고 효율적으로 형질전환될 수 있다.(표 5)
실험용 바실루스 세레우스 균주로 우수한 형질전환 빈도를 획득할 수 있다. 시험된 다른 바실루스 투린지엔시스 변이체(변종 이스라엘렌시스, 변종 쿠르스타키)에도 같은 것을 사용한다. 대조해보면, 엘렉트로포레이숀법에 의한 고초균의 형질전환은 매우 불충분하다.
한편, 고초균에 대한 원형질체 의존 PEG법을 사용하여 4×106/㎍ 플라즈미드 DNA의 형질전환율을 획득하였다.
엘렉트로포레이숀 기술을 사용하여 얻은 고초균의 저조한 형질전환률은 제9도에서 볼 수 있는 바와 같이 부적당한 전압과 같은 잘못 선택된 매개변수, 또는 전기적 펄스에 의해 야기된 높은 치사율과 연관된 것은 아니다.
[실시예 8; β-갈락토시다제(galactosidase)유전자를 사용한 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB의 형질전환]
8.1. 바실루스 투린지엔시스 프로톡신 유전자의 첫 번째 AUG 코돈 바로앞에 BAm HI 제한 절단 부위의 삽입
플라즈미드 piWiTh5 (엠. 가이저 박사, 스위스 연방 바젤에 소재하는 시바-가이기 아개로부터 제공받을 수 있음)로 부터의 β-갈락토시다재 유전자를 바실루스 투린지엔시스 쿠르들 δ-내독소 유전자 프로모터에 연결시키기 전에 먼저 AUG 시발코돈 영역에 위치하는 프로톡신 유전자의 DNA 서열을 변형시켜야 한다.
1.8KB HincII-Hind III 단편을 포함하는 단일-가득 파지 M13mp8을 사용하여 δ-내독소 유전자의 5' 영역을 함유하는 그 유전자를 올리고뉴클레오티드 특이적으로 돌연변이시키는 것에 의하여 변형시킨다.
우선 제한 효소 Hind III 및 Hind II로 플라즈미드 pK 36(실시예4참조)3㎍을 분해시킨다. 생성한 1.8kb 단편을 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 겔로부터 단리한다.
이와 병행하여, M13mp8 RF 파지 DNA (미합중국 매사추세츠 01915, 비버리 토저 로드에 소재하는 바이오랩사 또는 다른 어떠한 제조자) 100ng을 제한효소 Sma I 및 Hind III로 분해시키고, 페놀로 처리하며, 에탄올을 첨가하여 침전시킨다. 이렇게 처리된 파지 DNA를 미리 단리한 프로톡신 단편 200ng과 혼합하고 T4 DNA 리가재를 첨가하여 프로톡신 단편에 결합시킨다.
대장균 JM103을 형질감염시킨후, 6개의 백색 플라크를 선택하여 제한 매핑(mapping)으로 분석한다.
β-갈락토시다제 유전자와 바실루스 투린지엔시스의 쿠르들 δ-내독소 유전자 프로모터 사이의 결합이 올바르게 이루어진 단리체를 선택하여 M13mp8/Hinc-Hind로 명명한다.
DNA 합성 장치(APPLIED BIOSYSTEM DNA SYNTHESIZER)를 사용하여 하기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성한다; (5')GTTCGGATTGGGATCC
ATAAG(3')
쿠르들 δ-내독소 유전자의 153 내지 173위치에 이르는 부위에서 이 합성 올리고뉴클레오티드는 M13mp8/Hinc-Hind DNA에 대해 상보적이다(식 I 비교). 그러나 식 I에서 재생성된 서열과 비교할 때 상기에서 재생성된 올리고뉴클레오티드 서열에는 162 및 163위치에 잘못된 짝짓기가 있어서 Bam HI 제한 절단 부위의 형성이 필요하게 된다. 돌연변이의 일반적인 과정은 제이. 엠. 졸리 및 엠. 스미드에 의해 설명되어 있다. (43)제이. 엠. 졸러 및 엠. 스미드; 19). 단일-가닥의 M13mp18/Hinc-Hind 파지 DNA 약 5㎍을 전체 부피가 40㎕가 되도록 인산화된 올리고뉴클레오티드 0.3㎍과 혼합한다. 이 혼합물을 65℃에서 5분간 가열하고 먼저 50℃로 냉각한 후 점차적으로 4℃까지 냉각한다. 완충용액, 뉴클레오티드 삼인산염, ATP, T4 DNA 리가재 및 DNA 중합효소의 큰 단편을 첨가하고 설명된 방식으로 (43)제이. 엠 졸러 및 엠. 스미드)15℃에서 밤새도록 배양한다. 아가로스 겔 전기영동 후 환상의 이중-가닥 DNA를 정제하고 형질전환법으로 대장균 균주 JM103내로 삽입한다. 다르게는, 대장균 균주 JM107을 사용할 수 있다.
32P-표지된 올리고뉴클레오티드와 교잡한 서열을 알아보기 위해 생성된 플라크를 검사한다; DNA 제한 효소 분석법으로 파지를 검사한다.
Bam HI 절단 부위가 프로톡신 유전자의 첫 번째 AUG 코돈 바로 앞에 위치하는 올바른 조립체를 포함하는 파지를 M13mp8/Hinc-Hind/Bam이라 명명한다.
8.2. β-갈락토시다제 유전자의 δ-내독소 프로모터의 결합
8.2.1; δ-내독소 프로모터는 M13mp8/Hinc-Hind/Bam 파지 DNA의 162 Bp Eco RI/Bam HI 단편 상에 있다. RF 파지 DNA를 제한 효소 Bam HI으로 분해시킨다. 5' 말단에 생성된 돌출부를 제조자의 지시에 따라 뭉빈(Mung Bean) 핵산분해효소(바이오랩사)로 처리하여 제거한다. 이어, DNA를 제한 효소 Eco RI으로 분해시키고 아가로스 겔 전기영동을 행한 후 162 Bp 단편을 아가로스 겔로부터 단리한다.
β-갈록토시다제 유전자를 플라즈미드 piWiTh5로 부터 단리한다. 우선 piWiTh5 DNA를 단일 Hind III 절단 부위에서 절단한다. DNA 중합효소의 클래노우 단편을 사용하여 3' 오목한 말단을 생성시키고 ( 33)마니아티스 일행, 1983, 113 내지 114 페이지) 변형된 DNA를 제한 효소 Sal I으로 분해시킨다. β-칼락토시다제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 아가로스 갤 전기영동법으로 단리한다.
벡터 pWI61(실시예 3 참조)를 제한 효소 Eco RI과 Sal I으로 분해시키고 미리 단리된 2개의 단편을 벡터 pXI61내로 삽입한다.
이들 결찰 혼합물을 대장균 균주 HB101 또는 JM107내에서 형질전환 시킨 후, 제한 분석 및 색소원 기질 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-칼락토시드)에 관한 β-갈락토시다제 활성에 의해 올바르게 결합된 클론을 선택한다. 올바른 유전자 조립물을 포함하는 클론을 pXI80이라고 명명한다.
8.2.2; 또 다른 실시태양에서, M13mp8/Hinc-Hind/Bam을 Eco RI과 Bam HI로 절단하고 겔 전기영동으로 단리함으로써 δ-내독소 프로모터를 포함하는 162 Bp Eco RI/Bam HI 단편을 단리한다.
이 실예에서 또한 플라즈미드 piWiTh5로부터 β-갈락토시다제 유전자를 단리한다(실시예 8.1. 참조). 이 경우, 플라즈미드 DNA를 제한 효소 Bam HI와 Bgl II로 분해시키고 겔 전기영동후 큰 단편을 아가로스 겔로부터 용출시킨다.
시판되는 상품으로 구입할 수 있는 (실시예 9.1. 참조) 벡터 pHY300 PLK (# PHY-001; 일본국 530 오사카 키타꾸 도지마 하마 2쪼매 2-8 소재의 도요보 코오포레이숀 리미티드사제조)을 제한 효소 Eco RI 및 BgI II로 분해시킨다. 미리 단리된 2개의 단편을 벡터 pHY300 PLK내로 삽입한다.
결찰 혼합물 전체를 형질전환법에 의해 대장균 균주 JM107 (미합중국 20850 메릴랜드 록크빌 스톤스트리트 아베뉴 411엔 소재의 베데스다 리서치 라보라토리즈(BRL)사제)내로 도입한다. β-갈락토시다재 활성을 갖는 클론을 제한 분해법으로 더 분석한다. 올바른 유전자 조립물을 갖는 클론을 pXI101이라고 명명한다.
8.3. 형질전환법에 의한 플라즈미드 pX180 또는 pXI101의 고초균 및 바실루스 투린지엔시스내로의 도입
우선 창 및 코헨에 의해 설명된 공지의 시험법에 따른 형질전환법은 pXI80 또는 pXI101 플라즈미드 DNA를 고초균 원형질재내로 도입한다. (13)창 밑 코엔, 1979).
올바른 클론을 선택하고 형질전환될 DNA를 표준 방법으로 단리한 후 엘렉트로포레이션의 방법으로 형질전환에 의해 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 세포내로 도입한다(실시예 1 참조).
형질전환된 바실루스 투린지엔시스 세포를 첨가제로서 X-gal을 포함하는 GYS 한천(포자형성 배지)상에 접종한다.
포자가 형성되기 시작하면 올바르게 형질전환된 클론이 청색으로 변한다.
반면, pXI61 벡터에 의해 형질전환된 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 균주는 같은 조건하에서 백색으로 남아 있는다.
제한 분석을 하면 올바르게 형질전환된 클론과 함께 손상되지 않은 pXI80 또는 pXI101 플라즈미드가 바실루스 투린지엔시스 세포내에 존재한다는 것을 알 수 있다.
8.4. 포자형성-의존 프로모터의 조절하에 있는 β-갈락토시다제 유전자
플라즈미드 pXI80 또는 pXI101을 포함하는 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 세포를 상기에서 설명한 대로GYS 배지 상에서 배양한다. 성장기(증식기 및 포자형성기) 동안에 44)제이. 에이치. 밀러에 의해 설명된 시험법에 따라 β-갈락토시다재 분석을 행한다(Experiments in Molecular Genetics, Cold-Sprign Harbor Laboratory, 1972, 실험 48 및 49).
상기 시험법과의 특유한 차이점은 색소원 기질로서의 X-gal의 사용 및 약 1시간 후에 세포에 의해 생성되는 착색 가수분해 생성물의 측정법에 관한 것이다.
이어 세포를 원심분리법으로 제거하고 상청액의 광학 밀도를 650nm의 파장에서 확인한다(0D650).
포자 형성의 작용으로서 광학 밀도의 증가가 관찰된다. 반면, 형질전환되지 않은 바실루스 투린지엔시스 세포는 색소원 기질 X-gal을 가수분해하지 못한다.
[실시예 9; 바실루스 투린지엔시스내에서 유전자 뱅크(bank)의 제조]
9.1. pXI200의 작성
플라즈미드 pXI200은 도요보 코오포레이숀 리미티드로부터 구입할 수 있는 플라즈미드 pHY300 PLK의 유도체이다 (#PHY-001; 도요보 코오포레이숀 리미티드사제품, 일본국 530 오사까 기타꾸 도지마 하마 2쪼매 2-8 소재). 유럽 특허원 EP 162 725호에 기재되어 있는 조립물인 플라즈미드 pHY300은 암피실린(ampR) 및 테트라시클린(tetrR)내성 유전자를 모두 함유하고 있다.
플라즈미드 pHY300 PLK를 Bg1 I과 Pvu I으로 완전히 분해시킨다. 그 결과 생성되는 제한 단편을 아가로스 겔 전기 영동법으로 분리한다. 4.4Kb 단편을 아가로스 겔로부터 단리하여 정제한 후 T4 DNA 리가재로 재결찰시킨다.
결찰 혼합물 전체를 형질전환법으로 대장균 HB101 내로 도입한다. 형질전환된 대장균 HB101 세포를 20㎍/ml 테트라시클린을 함유하는 선택성 L-한천 상 37℃에서 배양한 후, 태트라시클린-내성(Tcr) 형질전환체를 선택한다. 그러면 암피실린-감수성(Aps) 클론 (100㎍/ml암피실린)으로부터 0.3Kb Pvu I/Bg 1 I 단편과 함께 Apr 유전자에서 Pst I 절단부위를 상실한 플러즈미드를 단리할 수 있게 된다. 이 플라즈미드를 pXI200이라고 명명한다.
9.2. 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB내에서 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HDI의 프로톡신 유전자의 클로닝
바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1의 DNA 전체 (50㎍)를 제한 효소 Pst 1 및 Hpa 1과 함께 배양함으로써 완전히 분해시킨다. 이렇게 얻어진 제한 단편을 연속 사카로오스 구배(5% (중량/부피)내지 23% (중량/부피))로 옮기는데, 여기에서 단편은 밀도 구배 원심분리법에 의해 크기별로 분리되어 500㎕ 분액으로 수집된다. 원심분리는 15℃의 온도 및 최대 2.4×105g에서 16시간 동안 TST 41-로부터 (Kontron Ausschwingrotor)내에서 행해진다. 이어, 단편 크기를 결정하기 위하여 각 50㎕의 분량을 아가로스 겔(트리스 아세트산 EDTA 또는 트리스 붕산 EDTA 내의 0.8%(중량/부피) 아가로스 겔; 33) 마니아티스 일행, 1982 참조)로 옮긴다. 3Kb 내지 6Kb의 단편을 포함하는 분획을 모아서 에탄올 침전법에 의해 10㎕의 부피로 농축한다.
실시예 9.1에서 설명한 셔틀 벡터 pXI200 5㎍을 제한 효소 Pst 1과 Sma 1으로 분해시킨다. 생성되는 제한 단편의 5'인산기를 송아지 장의 알칼리성 탈인산 가수분해 효소로 처리하여 제거한다. 미리 단리된 HD1 DNA 0.2㎍ 내지 0.3㎍을 pXI200 벡터 DNA 0.5㎍과 혼합하고 T4 DNA 리가재 0.1U(소위 바이스 단위 (Weiss Unit); T4 DNA 리가재 1단위는 37℃의 온도에서 20분 동안 피로 인산염 1nM(32P)을 노리트(Norit)-흡수 가능 물질로 전환시키기에 충분한 효소 활성에 해당한다)를 첨가하여 14℃에서 하룻밤동안 배양한다. 결찰 혼합물 전체를 엘렉트로포레이숀 방법에 의한 형질전환법으로 직접 바실루스 투린지엔시스 HD1cryB 세포내로 도입한다(실시예 1 참조). 엘렉트로포레이팅된 바실루스 투린지엔시스 세포를 선별제로서 테트라시클린 20㎍/ml를 함유하고 있는 선택성 포자형성 한천상에 접종한 후 포자가 완전히 형성될 때까지 25℃의 온도에서 배양한다.
9.3. 바실루스 투린지엔시스 프로톡신 단백질에 대한 모노클로날 항체의 제조
36)휴버-루카(1984) 및 37)휴버-루카 일행(1986)의 설명과 유사한 방법으로 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1의 내독소에 대한 모노클로날 항체를 제조한다.
항체 제조에 사용하는 하이브리도마 세포는 Sp2/0-Ag 골수종 세포 (45)슐만 일행, 1978에 의해 설명됨; 미합중국 매릴랜드 록크빌의 American Type Culture Collection으로부터 구입할 수 있음)와 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1의 δ-내독소로 미리 면역시킨 Balb/c 마우스 비장세포의 융합 생성물이다.
이 방법에서, 바실루스 투린지엔시스 내독소에 대해 특이적으로 유도되는 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 특히 바람직한 것은 프로톡신 단백질의 N-말단 절반 내의 특이항원 결정부위에 특이적으로 결합하거나 (예컨대 휴버-루카 일행, 1986 참고문헌의 항체 54.1), 또는 레피도프태라-활성 프로톡신에 일정한 단백질 부위인 C-말단 절반 내의 특이항원결정 부위를 인식하는 (예를 들어 휴버-루카 일행, 1986 참고문헌의 항체 83.16) 모노클로날 항체이다.
그러나, 다른 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 모두 후속의 면역학적 스크리닝에 사용될 수 있다(실시예 9.4 참조).
9.4. 면역학적 스크리닝
실시예 9.3에 따라 생성된 모노클로날 항체, 또는 다른 적절한 항체를 면역학적 스크리닝에 사용한다.
우선, 필터막을 약 5분간 플레이트에 가하는 것에 의한 막전이법 (예컨대 Pall Biodyne transfer membrane; Pall Ultrafine Fltration Corporation, Glen Cove, N.Y.)으로 바실루스 투린지엔시스 세포의 포자 형성후에 유리한 형태로 존재하는 결정성 단백질을 결합시킨다. 이어 필터를 TBST 완충용액 (0.05%(중량/부피) Tween 20, 10mM Tris/HCl (pH 8.0), 2차 증류수 내의 150mM NaCl)으로 5분간 세척한 후 비특이적 결합을 막기 위하여 TBST 완충용액과 1% (중량/부피) 탈지유의 혼합물내에서 15내지 30분간 배양한다.
이렇게 제조된 필터를 프로톡신-특이성 항체 154.1 및 83.16 항체 혼합물 (37)휴버-루카 일행, 1986))와 함께 하룻밤 동안 배양한다. 필터를 TBST 완충액으로 매회 5 내지 10분씩 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다. 항체-결합 프로톡신을 검출하기 위하여 필터를 다른 항체와 함께 배양한다. 사용되는 2차 항체는 바이오라드 (카탈로그 번호 #170-6520, 염소의 항 마우스 lgG(H+L)-알칼리성 탈인산 가수분해 효소 집합체)로부터 구입할 수 있는, 알칼리성 탈 인산 분해효소로 표지된 항마우스 항체이다. 30분간 배양한 후 결합되지 않은 2차 항체는 상기와 같이 필터를 TBST 완충액으로 3회 (매회 5 내지 10분동안)세척함으로써 제거한다. 필터를 NBT (p-니트로 블루 태트라졸륨 클로라이드; 니트로 -블루 테트라졸륨 클로라이드)와 BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트-p-롤루이딘 염)으로 구성된 기질 혼합물과 함께 배양한다. 제조자(미합중국 94804 리치몬드 하버웨이 사우쓰 1414 소재의 바이오라드사)의 지시에 따라 효소 반응을 행한다.
양성, 즉 프로톡신-함유 클론은 보라색 착색으로 인해 매우 용이하게 확인될 수 있다. 이 착색은 알칼리성 탈인산 가수분해 효소와 상기의 기질 혼합물과의 효소 반응의 결과로서 일어난다. 실시에 9.2에 나타낸 결찰 혼합물로써 실시에 9.2에 기재된 바와 같이 형질전환시킨 결과 800 내지 1000 형질전환체가 생긴다. 이들 형질전환체 중에서 2개 콜로니가 상기 효소 반응에서 명백한 양성 표시를 나타낸다.
상기 효소 반응에 의해 프로톡신 유전자의 발현이 검출될 수 있는 양성 클론으로부터 플라즈미드 DNA를 달리한다. 클로닝된 프로톡신 유전자는 제한 분석 및 공지 제한 지도와의 비교에 의해 더욱 특징적이되어 궁극적으로 확인될 수 있다.
양 클론은 모두 4.3Kb의 삽입체가 있는 재조합 플라스미드를 포함한다. 이어 Hind III, Pvu II, Eco RI 및 Xba I으로 제한 분해시키면 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HDI의 내독소 유전자의 공지 제한 지도와 비교함으로써 삽입체 상에서 유전자를 확인할 수 있다. 두 경우 모두에서, 유전자는 5.3Kb 프로톡신 유전자로 공지되어 있으며 5)가이지일행, 1986에 기재되어 있는 Kurbdl이 유전자이다.
바실루스 투린지엔시스내에서 직접적으로 클로닝되고 면역학적 스크리닝에 의해 확인되는 이 유전자는 또한 플라즈미드 pK36내의 5.3Kb 유전자의 1847 Bp Bam III/Hind III 단편과 교잡한다 (5)가이지 일행, 1986). SDS/PAGE에서, 두 클론은 모두 프로톡신에 전형적인 130,000 달톤의 밴드를 나타내는데, 이것은 웨스턴 블롯 (46)토우빈 일행, 1979)법에서 상기 (실시예 9.4참조) 모노클로날 항체와 특이적으로 반응한다.
[표 1]
형질진환 빈도에 대한 엘렉트로포레이숀 전후 4℃에서의 배양시간의 영향
엘렉트로포레이숀법을 사용하여 벳치당 0.2㎍ pBC16으로 바실루스 투린지앤시스 HDlcryB를형질전환시켰다.
Figure kpo00014
* DNA 첨과와 엘렉트로포레이숀 사이의 4℃배양.
** 엘렉트로포레이숀과 발현시작기 사이의 4℃ 배양.
[표 2]
형질전환법에 의해 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB 내로 도입된 후 pBC16의 테트라시클린 내성의 발현.
본 발명에 따른 엘렉트로포레이숀법을 사용하여 pBC16 플라즈미드 DNA로 바실투스 투린지엔시스 HDlcryB를 형질진환시켰다. 30℃ 및 LB배지에서 다양한 기간동안 배양한 후, 20㎍/㎖ 태트라시클린을 함유하는 LB 한천상에 집종함으로써 ㅕㅇ질전환된 세포를 선별한다.
Figure kpo00015
본 발명에 따른 엘렉트로포레이숀법을 사용하여 pBC16 플라즈미드 DNA 바실루스 투린지엔시스 HDlcryB를 형질전환시켰다. 30℃ 및 LB배지에서 다양한 기간동안 배양한 후, 20㎍/ml 테트라시클린을 함유하는 LB 한천상에 접종함으로써 형질전환된 세포를 선별한다.
[표 3]
Figure kpo00016
1; Tc; 테트라시클린; Km; 카나마이신; Ble; 볼레오마이신; Cm; 클로람페니콜; Em; 에리트로마이신
2; 고초균 LBG4468로부터 단리된 *을 제외하고 플라즈미드 DNA는 모두 바실루스 투린지엔시스로부터 유래한다.
[표 4]
핼리오티스 비레스센스에 대한 바실루스 루린지앤시스 HDlcryB 및 HDlcryB (pXI93)의 생물시험.
분무 건조된 포자형성 배양물(포자 및 (존재하는 경우) 프로톡신 결정)을 지정된 양만큼 헬리오티스 비레스센스 L-1 유충의 먹이에 혼합한다.
Figure kpo00017
[표 5]
바시루스 투린지엔시스, 바실루스 세레우스 및 고초균 균주의 형질전환 가능성. 실시예 1에 기재된 엘렉트로포레이숀법에 따라 모든 균주를 플라즈미드 pBC16으로 형질전환시켰다.
Figure kpo00018
실시예 1에 기재된 엘렉트로포레이숀법에 따라 모든 균주를 플라즈미드 pBC16으로 형질전환시켰다.
[미생물 기탁]
본 발명의 영역내에서 사용되는 하기 기술된 각 미생물의 배양주는 특허절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인을 위한 부다페스트 조약의 요구에 따라 국제적 기탁 기관으로 인정된 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, (독일연방공화국 브로인슈바이크 소재)에 기탁되었다. 상기 국제 기탁기관에 의해 기탁된 시료의 생존 진술서가 발행되었다.
[미생물 기탁]
Figure kpo00019
우선권 서류에서 플라즈미드를 명명하기 위해 선택한 내부 보호 pK를 외국출원을 위해 공식적으로 인정된 명칭 pXI로 바꾸었다.
또한 바람직한 실시태양에서 사용되는 무포자성 바실루스 투린지엔시스 HD1 돌연변이체의 명칭을 cryβ에서 cryB로 바꾸었다.
[참고 문헌 a]
Figure kpo00020
[참고 문헌 b]
Figure kpo00021
[특허 문헌]
Figure kpo00022

Claims (14)

  1. 곤충 또는 이들의 서식지를 A) 세균숙주 세포 또는 이들의 혼합물, 또는 B)세균 숙주 세포에 의해 생산된 프로톡신을 함유하는 무세포 결정체 제제로써 처리하는 것을 포함하고, 상기 세균 숙주 세포는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus Thuringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 세포로 구성된 군으로부터 선정되며 또 (a) 도입될 DNA를 단리하고; (b) 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 세포로 구성된 군으로부터 선정된 세균 숙주세포에서 비상동 클로닝계로 복제할 수 있는 클로닝 벡터에 상기 단리된 DNA를 클로딩하며; (c) 상기 세균세포에 존재하는 제한을 극복하기에 충분한 형질전환율로 상기 클론된 벡터 DNA를 엘렉트로포레이션(electroporation)법에 의해 상기 세균세포로 직접적으로 도입하고; 또 (d) 이렇게 하여 형질전환된 세균세포를 배양한 다음 클로닝된 벡터 DNA를 단리하는 것을, 포함하는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선정된 그람 양성 세균에 DNA 서열을 삽입하여 클로닝하는 방법에 의해 수득할 수 있는 곤충의 방제방법.
  2. 곤충 또는 이들의 서식지를 A) 세균 숙주 세포 또는 이들의 혼합물, 또는 B) 세균 숙주 세포에 의해 생산된 프로톡신을 함유하는 무세포 결정체 제제로써 처리하는 것을 포함하고, 상기 세균 숙주 세포는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 세포로 구성된 군으로부터 선정되며 또 (a) 도입될 DNA를 단리하고 또 경우에 따라서 이렇게 단리된 DNA를 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 세포로 구성된 군으로부터 선정된 세균세포에서 작용할 수 있는 발현서열과 결찰시키고; (b) 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 세포로 구성된 군으로부터 선정된 세균 숙주세포에서 비상동 클로닝계로 복제할 수 있는 클로닝 벡터에 상기 단리된 DNA를 클로닝하며; (c) 상기 세균세포에 존재하는 제한을 극복하기에 충분한 형질전환율로 상기 클론된 벡터 DNA를 엘렉트로포레이션법에 의해 상기 세균세포로 직접적으로 도입하고; 또 (d) 이렇게 하여 형질전환된 세균세포를 배양한 다음 클로닝된 벡터 DNA 및 발현된 유전자 생성물을 단리하는 것을 포함하는, 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)로 구성된 군으로부터 선정된 그람 양성 세균에 DNA 서열을 삽입하여 클로닝하고 발현시키는 방법에 의해 수득할 수 있는 곤충의 방제방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형질전환법이 a) 세포가 성장하기에 충분하게 통기되는 배지에서 숙주세포 현탁액을 제조하고; b) 상기 세포 현탁액으로부터 성장한 세포를 분리하여 성장 세포를 접종 완충용액에 재현탁시키며; c) 클론된 DNA를 엘렉트로포레이숀에 적합한 농도로 포함하는 DNA 시료를 완충용액에 부가하고; d) 단계 c)의 벳치를 엘렉트로포레이숀 장치에 도입하며; e) 상기와 같이 도입된 뱃치를 일회 이상 커패시터 방전처리시켜 세균 숙주세포를 재조합 DNA로 형질전환시키기에 충분한 시간동안 세균 세포막을 도입 DNA에 대해 투과성으로 만들만큼 충분히 높은 전계 강도를 생성하고; f) 형질전환된 세균 숙주세포를 선별하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세균 숙주세포에 도입될 DNA가 상동 또는 비상동 기원의 재조합 DNA이거나 또는 상동 및 비상동 DNA의 결합물인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 재조합 DNA가 1개 이상의 구조 유전자 및 상기 세균 숙주세포에서 작용할 수 있고 또 구조 유전자와 기능적으로 연결되어 상기 세균 숙주세포에서 구조 유전자의 발현을 확실하게는 3' 및 5' 측 조절서열을 함유하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 구조 유전자가 바실루스 투린지엔시스에서 천연적으로 존재하는 δ-내독소 폴리팹티드, 또는 δ-내독소 폴리팹티드와 실질적으로 상동이고 상기 결정성 δ-내독소 폴리팹티드의 독성 특성을 실질적으로 갖는 폴리팹티드를 코딩하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 δ-내독소 코딩 DNA 서열이 살충활성에 관여하는 천연적 δ-내독소 코딩 서열의 적어도 부분 또는 부분(들)과 실질적으로 상동인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 폴리팹티드가 쿠르스타키(kurstaki), 베르리네르(berliner), 알레스티(alesti), 소토(sotto), 톨워르티(tolworthi), 덴드롤리무스(dendrolimus), 테네브리오니스(tenebrionis) 및 이스라엘렌시스(israelensis)로 구성된 군으로부터 선정된 적합한 바실루스 투린지엔시스 아종의 δ-내독소 폴리펩티드와 실질적으로 상동인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 δ-내독소 코딩 DNA 서열이 하기 식 1에서 뉴클레오타이드 156 내지 3623 사이에 위치하는 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠르스타키 HD1의 DNA 단편이거나, 또는 곤충 독성 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 보다 짧은 DNA 단편인 방법;
    [식 1a]
    Figure kpo00023
    [식 1b]
    Figure kpo00024
    [식 1c]
    Figure kpo00025
    [식 1d]
    Figure kpo00026
    [식 1e]
    Figure kpo00027
    [식 1f]
    Figure kpo00028
    [식 1g]
    Figure kpo00029
    [식 1h]
    Figure kpo00030
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (b)에서 사용된 클로닝 벡터가 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 세포로 구성된 군으로부터 선정된 세균세포에서 복제할 수 있을 뿐 아니라 적어도 다른 한 개의 이형 숙주생물에서 복제할 수 있고 또 상동 및 이형 숙주계 모두에서 확인될 수 있는 이작용성 벡터인 방법.
  11. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 또는 제9항에 있어서 곤충이 나비목, 파리목 또는 딱정벌레목의 곤충인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 곤충이 나비목의 곤충인 방법.
  13. 통상적으로 사용되는 담체, 분산제 또는 담체 및 분산제와 함께 a)제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항, 제9항 또는 제12항에 따른 방법에 따라서 제조된 세균 숙주 세포 또는 이들의 혼합물, 또는 b)제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항, 제9항 또는 제12항에 따른 방법에 따라서 제조된 세균 숙주 세포에 의해 생산된 프로톡신을 함유하는 무세포 결정체 제제를 포함하는 곤충 방제용 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 DNA가 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스로 구성된 군으로부터 선정된 세균 공여체의 총 DNA를 분해시키는 것에 의해 수득되는 방법.
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