SU1448995A3 - Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR.теNевRIоNSIS дл производства инсектицидного препарата против насекомых СоLеортеRа Spp. - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к сельско- Хоэ йственндй микробиологии, в уаст- ности к производству инсектицидных Препаратов, и касаетс  штамма бактерий , с помощью которого получают инсектицидный препарат. Цель изрбре- тени  - получение нового штамма бактерий патотипа С, позвол ющего получить инсектицидный пр-епарат против Col.eoptera. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. tenebrionis депонирован в коллекции ФРГ под № DSM 2803. Инсектицидный препарат, полученный на основе указанного штамма, предназначен дл  уничтожени  ольхового листоеда и картофельного жука. Титр спор в препарате составл ет 3 « -«Ю спор/МП, LC JP составл ет 5 спор/мл при опрыскивании Lj-личинок Leptinotarsa deumlimata, 1 табл. СУ)

Description

4

J

СХ) ;О

ел

см

Изобретение OT IOCHTCH к сельско- , хоз йственной микробиологии, в частности к ттроизводству инсектицидных препаратов, и касаетс  штамма бакте™ рий, с помощью которого получают инсектицидный препарат.

Цель изобретени  получение нового ттатла патотипа С, позвол ющего получить инсектицидный препарат про- тив Coleoptera spp.

Штамм Bacillus thuringiensis varo tenebrionis патотип С выделен из бо™ льных личинок мучного хрущака (Тепе- ; brio molitor L), депонирован в кол- ; лекции ФРГ под номером DSM 2803,

Штамм амеет следующие культураль- но-морфологические признаки.

Вегетативна  клетка имеет зкгутики. Палочки размером около 1,0x4 - 8 мм Граммпрло сительиые. Клетка споры содержит нар ду с субтёрминальными эл липсоидальными спорами (0,8x1,4 - . 1,6 мм) пг-распоровый кристалл плоской пластинчатой формы и с очертани ми .параллелограмма, ромба или квадрата (ок. 0,8-1,5 мкм длины кромок),

При выЕ ащивании штамма в течение 24 ч при на стерильной среде (ОХ01Д СМ-З), содержащей, г/л

М сной экстракт Lab Lemco 1,0 Дрожжевой экстракт 2,0 Пептон5,0

NaCli.

Агар15,0

рН .7,4

образуютс  круглые беловатые колонии диаметром около 5 мм, шероховатые с неровными кра ми. Спорообразование и образование параспоровых кристаллов происходит приблизительно через 48 ч

При культивировании штамма на кальций-казеинатном агаре (MERCK 5409 состава, г/л

М сной экстракт Merck 3,0 Пептон. 5,00

Казеин по Hainmarsten 2,50 NaCl, 5эОО

0,15 13,50

ВодаОстально

с добавлением сухого обезжиренного молока 5,0 г на 1 л среды, имеющей рН 7,0, при указанных услови х обра зуютс  круглые беловатые бактериальные колонии, вокруг которых имеютс  прозрачные ореолы (протеиназа-положи- тельна ). Эбразование спор и параСа (ОН); Агар

O

5

0 5

0

5

0

5

„

0

споровых кристаллов происходит примерно через 48 ч.

На селективном агаре дл  Bacillus cereus (ОХ01Д 617), содержащем, г/л: Пептон1,00

Маннитол10,00

NaCl2,00MgS04-0 ,10

40,25

Na-пировиноградна  кислота10,00

Бромтимоловый

голубойо,12

АгарЦ 500

ВодаДо 1 л

при рН 7,.2, с добавлением  ичного желтка, (стерильно) 25,00 мл/л, через 24 ч инкубации при образуютс  колонии, окрашенные в голубоватый цвет (маннитол-отрицательный), что характерно дл  бактерий Bacillus се- reus/B, thuringiensis. Однако в про- тивопол ожность В.- ce reus .и также другим многим бактери м Bacillus thurin giensis - вокруг бактериальных колоний истамм В, thuringiensis var. tenebrions DSM 2803 не наблюдаетс  никакого осажденного ореола (-лецити- наза-отрицательна ). Спорообразование и образование параспоровых кристаллов происход т приблизительно через 48 ч, ,

Физиолого-биохимические признаки, Факультативный анаэроб, но споруг, л ци  осуществл етс  строго в аэроб- ных услови х. Оптимальна  температура роста вегетативных клеток составл ет 25-30 С. Автоклавирование в течение 15 мин при (соотнет- ственно 1 бар избыточного давлени ) полностью инактивирует споры и кри- cтaJшичecкий токсин. Ультрафиолето- вое облучение при 254 нм инактивирует споры при соответствующей дозе, но : не кристаллический токсин, ;

Отношение к источнику углерода: из глюкозы, манноз ы и сахарозы образует кислоты и аустил метилкарбанал, но не, газ 5 не усваивает лактозу, целлобиозу, салицин, арабинозу, ксилозу и манниТо Гидролизует эскулин и крахм Л,

Отношение к источнику азота; как ед1 нственный источник азота не использует сернокислый аммоний. Дл  роста требует аминокислоты такие, как глутаминовую кислоту, 0,3%-ную). Однако особые факторы роста не требует .

Образует каталазу, нитратредукта- зу и протеиназу. 1е образует лизин- декарбонкснлазу,- фенилаланин, уреазу и лецитиназу,.

Серологическа  характеристика штамма DSM 2803 (соответственно схема

Токсин кодирован геном, содержащимс  в плазмиде. Токсин образуетс  также в аспорогенных мутантах, получаемых обработкой зтилметансульфона- том. Способность к образованию токсина можно перенести путем переноса плазмида или гена на другие разновидности Bacillus thuringiensis или

серотипизировани  дл  В, thuringiensip|o другие бактериальные системы. Инсекпо de BARIACSBONNEPOI дл  Н-антигег- нов или SEKIJIMA 4ONO дл  О-антиге. нов):

Н-серотип 8а8Ь

0-серотип IX.15

Маркерным признаком штамма  вл етс  DSM 2803 (антибиограмма), задержка роста следуюп4ими антибиотиками: эрит- роми1дином, налидиксиновой кислотой нитрофурантоином и тетрациклином.

Рост штамма не подавл етс  ампициллином , колистином MS, Ко-тримок- салом, пенициллином G, метициллином

и сульфадиазином.

Пример . парат получают следующим образом.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var tenebrions DSM 2803 культивируют в колбах Эрлейнмейера

тицидное действие основано на присутствии закодированного в плазмиде токсина .

Дл  применени  в качестве инсектицида Bacillus thuringiensis var. tenebrionsis или получаемый из них инсектицидный препарат.или токсин смешивают. известным способом с обычными добавками (наполнител ми, при- 20 липательныи добавками, смачивающими средствами и т.д.) и перевод тв удоб-. ную дл  применени  форму. Инсектицид такого состава можно примен ть в виде порошка, суспензии, гранул та и т.п.

Инсектицидный пре- 25 Предпочтительно примен ть очищенную

спорулированную культ зу в виде суспензии с добавкой смачивающего средства , например в виде суспензии с добавкой смачивающего средства, наприобъемом 250 т, содержащей 50 ма ере-до мер, 0,1% Citowet (BASF). На гектар ды, включающей, %; дрожжевой экстракт обрабатываемого пол  разливают 10, предпочтительно 10 -10 спор и эквивалентное количество токсичных кристаллов.

Действие штамма на ; личинки

0,5, триптон 0,5, глико за 0,1, 0,08, имеющей рН 7,0, при 25-30 С до образовани  спор. Затем биомассу отдел ют центрифугированием и промывают водой или бз ерным раствором. Титр спор в препарате составл ет 3 10 спор/мл. LCj5-5 -10 спор/мл дл  L личинок Leptino tarsa deumeimata.

Инсектицидным активным началом предлагаемого штамма  вл етс  кристаллический токсин. Кристаллическую массу можно вьщелить, отдел   и очища  кристаллы от остатков клеток и спор после лизиса спорангиев, с помощью , например, метода градиента плотности.

Определен молекул рный вес с помощью электрофореза SOS-полиакрила- мида э геле методом Леммли. Найдены две основные полосы ок. 6500pOD и 70000D. Меньшие полосы меньшей интенсивности находились, в пределах 20000-400000.

С помощью токсина можно получить антитела, которые в иммунодиффузион- ном тесте Оучтерлони (Ouchterlony) не показывают перекрестной реакции с другими токсинами патотипа А или В.

35

жесткокрылых осз ществл етс  по схеме,, известной по патотнпу А: в стечение нескольких часов происходит прекращение питани  и через несколько дней

4Q наступает смерть в зависимости от дозы. Токсичное действие основано на том, что ацителий средней кишки повреждаетс  растворенньм в кишечном соке кристаллическим токсином. Поид врежденные клетки кишок насекомых отдел ют одна от другой от базальной мембраны и дрейфуют в просвет кишечника . Вследствие нарушени  кишечного барьера бактериальные клетки могут проникать в гемоцоэль и завершить в нем процесс дезинтеграции септицемией .

Новый инсектицид (патотип С) показывает избирательное инсектицидное действие против Coleoptera, например , против ольхового листоеда или картофельного жука. На личинок действие значительно сильнее, чем на взрослых насекомых. Действие не наб50

55

Токсин кодирован геном, содержащимс  в плазмиде. Токсин образуетс  также в аспорогенных мутантах, получаемых обработкой зтилметансульфона- том. Способность к образованию токсина можно перенести путем переноса плазмида или гена на другие разновидности Bacillus thuringiensis или

другие бактериальные системы. ИнсекДействие штамма на ; личинки

35

жесткокрылых осз ществл етс  по схеме,, известной по патотнпу А: в стечение нескольких часов происходит прекращение питани  и через несколько дней

4Q наступает смерть в зависимости от дозы. Токсичное действие основано на том, что ацителий средней кишки повреждаетс  растворенньм в кишечном соке кристаллическим токсином. Поид врежденные клетки кишок насекомых отдел ют одна от другой от базальной мембраны и дрейфуют в просвет кишечника . Вследствие нарушени  кишечного барьера бактериальные клетки могут проникать в гемоцоэль и завершить в нем процесс дезинтеграции септицемией .

Новый инсектицид (патотип С) показывает избирательное инсектицидное действие против Coleoptera, например , против ольхового листоеда или картофельного жука. На личинок действие значительно сильнее, чем на взрослых насекомых. Действие не наб50

55

людалось на Lepidoptera, HangtHMep, мучном хрущаке (Ephestia kShniella Zell), капустной моли (Plutella хуФормула изобретени 

lostella L.) и на Dipteraj например

, 5

Штамм бактерий Bacillus thuringi- ensis var. tenebrionis DSM ( 2803

мошке желтой лихорадки (Aedes aegypbi дл  производства инсектицидного преL .). В таблице приведены результаты

биотестов.

парата против насекомых Coleoptera. spp.

Токсичное действие полученного инсектицида на различные насекомые

10 /см

10 у см . 2,5x10 /см

4x10 /см

лихорадки

1/4489956

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   +

   +

   5x107 см