KR0157065B1 - 고수율의 델타 엔도톡신을 생성하는 바실루스 투린지엔시스의 돌연변이체 또는 변이체 - Google Patents
고수율의 델타 엔도톡신을 생성하는 바실루스 투린지엔시스의 돌연변이체 또는 변이체Info
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Abstract
본 발명은 많은 양의 활성 델타-엔도톡신을 생성하는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 돌연변이체 또는 변이체에 관한 것이다. 돌연변이체 또는 변이체 바실루스 투린지엔시스에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 그것의 모 바실루스 투린지엔시스 델타-엔도톡신과 같은 해충들에 대한, 예를들면 인시류(B. thuringiensis subsp. kurstaki 또는 subsp. aizawai로부터의 돌연변이체), 쌍시류(B. thuringiensis subsp. israelensis로부터의 돌연변이체) 또는 갑충류 해충(B. thuringiensis subsp. tenebrionis로부터의 돌연변이체)에 대한 활성을 가질 것이다.
Description
[발명의 명칭]
고수율의 델타 엔도톡신을 생성하는 바실루스 투린지엔시스의 돌연변이체 또는 변이체
[발명의 배경]
바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 시판제제는 해충의 생물학적 제어를 위해 널리 사용되고 있다. 이들 세균살충제의 이점은 매우 제한된 범위의 표적해충들에 대해 크게 선택적이며 미생물로 분해된다는 점이다.
바실루스 투린지엔시스의 시판제제는 불리한 영향없이 바로 추수시기까지 적용할 수 있다.
바실루스 투린지엔시스는 포자형성과정의 동안에 파라포자결정이라 불리는 하나 또는 그이상의 봉입물의 생성으로 독특하게 특징지어지는 봉상의, 호기성, 포자형성세균이다.
이들 결정은 델타-엔도톡신이라 불리는 고분자량 단백질로 구성된다. 델타-엔도톡신은 바실루스 투린지엔시스의 시중구입되는 제제의 활성성분이다. 다른 해충숙주범위들을 갖는 많은 바실루스 투린지엔시스 균주들이 확인되었다. 그것들은 그것들의 편모항원을 기준으로 다른 아종(subspecies)으로 분류된다. 특별한 관심이 있는 것은 인시류 해충의 제어에 사용되는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 쿠르스타키(B. t. subspecies kurstaki) 및 서브스페시스 아이자와이(subspecies aizawai), 쌍시류 해충의 제어에 사용되는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 이스라엘렌시스(B. t. subspecies israelensis) 그리고 갑충류 해충의 제어에 사용되는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스(B. t. subspecies tenebrionis)이다.
갑충류 독성 바실루스 투린지엔시스의 첫번째 분리는 1983년에 보고되었다(A. Krieg et al., Z. and. Ent. 96, 500-508, European Patent Publication EP 0149162 A2).
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스로 지칭되었던 분리물은 수탁번호 DSM 2803하에 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스에 기탁되었다. 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스는 투구벌레류 유충(Tenebrio molitor, Tenebrionidae, Coleoptera)의 죽은 번데기로부터 1982년에 분리되었다. 균주는 약 0.8㎛ 내지 1.5㎛의 테두리 길이를 갖는 편평한 판상형태인 하나의 포자 및 하나 또는 그이상의 살충제 파라포자결정들을 각 세포내에서 생성한다. 그것은 바실루스 투린지엔시스의 세로타입 H8a, 8b 및 패토타입 C에 속한다(Krieg et at., System. Appl. Microbiol. 9, 138-141, 1987, 미국특허 4,766,203, 1988).
그것은 일정한 잎을 먹는 투구벌레유충(Chrysomelidae)에 대해서만 독성이며, 모충(Lepidoptera), 모기(Diptera) 또는 다른 해충들에 대해서는 효과가 없다.
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스는 콜로라도 감자 투구 벌레해충에 대해서 효과적인 제어제인 것으로 나타났다. 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스로부터의 결정 및 포자 또는 분리된 결정의 섭취후 콜로라도 감자 투구벌레(Leptinotarsa decemlineata)의 유충 및 어느정도의 성충은 먹기를 중지하게 된다. 유충단계 L1-L3에서는 1-3일내에 죽는다(Schnetter et al., in Fundamental applied aspects of invertebrate pathology, eds. R.A. Samson et al., Proceedings of the 4th Int. colloquium of Invertebrate Pathology, p.555, 1986).
갑충류 활성 결정이외에 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스는 또한 방추형, 회전타원형, 또는 판상인 또다른 파라포자결정을 생성을 최근에 나타내었다(A.M. Huger A. krieg, J. Appl. Ent. 108, 490-497, 1989). 제2의 결정의 활성은 아직 알려져 있지 않다.
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 네가지 시판제품이 갑충류 해충의 제어를 위해 개발되었다. 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브로부터의 NOVODOR , 산도즈로부터의 TRIDENT및 아보트 래보러토리스 인코오퍼레이티드로부터의 DiTerra, 그리고 에코젠으로부터의 Foil.
또다른 갑충류 독성 바실루스 투린지엔시스 균주의 분리가 1986년에 보고되었다(Hernnstadt et al. Bio/Technology vol. 4, 305-308, 1986,미국특허 4,764,372, 1988). 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, M7로 지칭된 이 균주는 수탁번호 NRRL B-15939하에 노든 리즈널 리서치 래보러토리, USA에 기탁되었다. 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고를 기초로 한 시판제품은 미코젠 코오퍼레이션(Mycogen Corp.)에 의해 개발되었다.
그러나, 영양세포의 표현형 특징, 독성 파라포자결정의 특징, 플라스미드 DNA의 분석을 포함하는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, DSM 2803과 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, NRRL-B 15939의 비교연구는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고가 명백히 먼저 분리된 균주 DSM 2803, 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스와 동일함을 나타내었다(Krieg et al.: J. Appl. Ent. 104, 417-424, 1987). 더나아가서, 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스와 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고로부터의 갑충류 활성 델타 엔도톡신 유전자의 뉴클레오티드 서열과 유도된 아미노산 서열은 동일하다.
같은 배양조건하에서 상기한 제2유형의 결정들은 또한 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고에 의해서도 합성된다(A.M. Huger A. Krieg, J. Appl. Ent. 108, 490-497, 1989).
드 바르작과 프라촌(H. de Barjac E, Frachon, Entomophaga 35(2), 253-240, 1990)에 따르면, 샌 디에고 분리물은 테네브리오니스와 유사하며 다른 아종으로 간주하는 것이 정당화될 수 없다.
갑충류 해충의 제어를 위한 바실루스 투린지엔시스 균주의 이용은 갑충류 활성독소의 효율적이고 경제적인 생산과 생산된 제품의 효능에 의존한다. 이것은 차례로 갑충류 활성의 바실루스 투린지엔시스 균주의 발효에 의해 생성될 수 있는 델타 엔도톡신의 양에 의존한다.
바실루스 투린지엔시스는 살충제의 제조를 위해 다년간 사용되어 왔으나, 증가된 델타-엔도톡신 수율을 갖는 바실루스 투린지엔시스의 돌연변이체가 유리할지라도 이러한 돌연변이체가 앞서 기술된 바가 없다. 더 높은 수율의 델타-엔도톡신을 생성하는 돌연변이체가 바실루스 투린지엔시스의 더 효율적이고 경제적인 생산과 같은 비용으로 증가된 효능을 갖는 바실루스 투린지엔시스의 제조 가능성을 제공할 것이다. 이것은 차례로 사용자에게 주어진 면적에 대해 보관 및 취급되어야 하는 감소된 부피의 살충제 조제로서의 이점을 줄 것이다. 게다가, 사용자가 처분할 용기물질을 덜 갖게되어 이로써 환경에 대한 영향을 감소시킬 것이다.
돌연변이를 통한 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스에 의한 델타 엔도톡신의 생성의 개선은 앞서 보고된 적이 없었다.
투구벌레유충을 제어하는데 있어서 특별히 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 사용과 관련된 한가지 문제는 대부분의 다른 바실루스 투린지엔시스 제품 및 대부분의 다른 살충제의 1 내지 2 리터/헥타아르와 비교하여 5 내지 10리터/헥타아르와 같은 처리할 면적에 대해 비교적 많은 양의 제제의 살포를 요하는 제제의 비교적 낮은 효능 또는 강도이었다.
결국 개선된 강도의 제품에 대한 인정되는 필요가 존재한다.
이 문제를 극복하는 한 방법은 제제를 농축시키는 것이 될 것이다. 그러나, 이것은 보관 및 운반에서 얻는 절약과 비교할 때 상당히 제조원가를 부가하게 된다.
훨씬 더 훌륭한 해결책은 세포당 실질적으로 더 많은 양의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있는 현존하는 바실루스 투린지엔시스 균주의 돌연변이체를 창조하는 것이 될 것이다.
[발명의 개요]
본 발명은 결과적으로 한 관점에서 모균주보다 실질적으로 더 많은 양의 독소를 생성할 수 있는 변이체 또는 돌연변이체 바실루스 투린지엔시스 균주에 관한 것이다.
또다른 관점에서 본 발명은 아종 테네브리오니스에 속하는 바실루스 투린지엔시스 균주의 이러한 고생산성 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명의 더이상의 관점은 살충제 생성물의 제조를 위한 이러한 변이체 또는 돌연변이체 바실러스 투린지엔시스의 사용에 관한 것이며 또한 본 발명의 변이체 또는 돌연변이체 바실루스 투린지엔시스에 의해 생성된 유효 성분 델타-엔도톡신으로 이루어지는 이러한 살충제 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 한가지 관점은 문제의 델타-엔도톡신의 활성에 민감한 해충이 제어되어야 하는 면적에 본 발명에 따르는 조성물을 살포함으로써 해충을 제어하는 방법에 관련된다.
여전히 또다른 관점에서 본 발명은 모균주보다 실질적으로 더 많은 양의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있는 이러한 변이된 또는 돌연변이된 바실루스 투린지엔시스 균주를 얻기 위해 바실루스 투린지엔시스 균주를 선별하거나 또는 돌연변이시키고 선별하는 방법에 관한 것이다.
[미생물의 기탁]
본 발명을 상세히 기술할 목적으로 많은 양의 델타-엔도톡신을 생성하는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 돌연변이체를 이하 표시된 일자에 특허절차상의 목적으로 독일연방공화국 데-3300 브라운 슈바이그 마쉐르데르베그 1베에 주소를 둔 도이치 사무렁 본 마이크로오가니즈맨 운트 젤쿨투렌게앰베하에 기탁하였다. 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 DSM은 상기 조약의 규칙 9에 따라 기탁의 영속성을 제공한다.
돌연변이체 DSM 5480은 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주 DSM 5526의 돌연변이에 의해 얻어졌고 이것도 또한 이하 표시된 바와 같이 부다페스트 조약하에 기탁되었다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 일반적인 관점에서 모균주와 비교하여 많은 양의 활성 델타-엔도톡신을 생성하는 바실루스 투린지엔시스의 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다.
이와 관련해서 많은 양(high amounts)이란 표현은 바람직하게는 적어도 두배정도 또는 그이상을 의미한다.
이하 표시된 본 발명의 이 일반적인 관점과 더 구체적인 관점에서 모두, 돌연변이체 바실루스 투린지엔시스에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 그것의 모 바실루스 투린지엔시스 델타-엔도톡신과 같이 해충들에 대한, 예를들면 인시류(B. thuringiensis subsp. kurstaki 또는 subsp. aizawai로부터의 돌연변이체), 쌍시류(B. thuringiensis subsp. israelensis로부터의 돌연변이체) 또는 갑충류 해충(B. thuringiensis subsp. tenebrionis로부터의 돌연변이체)에 대한 활성을 가질 것이다.
본 발명의 이 관점의 한 구체예에서 바실루스 투린지엔시스는 아종 테네브리오니스에 속하며 생성된 델타-엔도톡신은 갑충류에 대해 활성이다.
이 관점의 바람직한 구체예에서, 변이된 또는 돌연변이된 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스는 균주 DSM 2803 보다 3배 이상 정도의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있다.
본 발명의 더이상의 구체예는 2㎛ 또는 그 이상의 평균 테두리 길이를 갖는 파라포자결정을 생성할 수 있는 변이체 또는 돌연변이된 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스 균주로 이루어진다.
본 발명의 여전히 더이상의 구체예는 모균주 또는 균주 DSM 2803의 포자 형성빈도보다 10내지 100배 또는 106배까지도 더낮은 포자형성빈도를 나타내는 변이된 또는 돌연변이된 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스 균주로 이루어진다.
더욱 특정 구체예는 기탁된 돌연변이체 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, DSM 5480으로 이루어진다.
본 발명에 대해 연구하는 동안, 모균주(DSM 5526)와 비교하여 델타-엔도톡신 생성에 있어서 2배 이상 증가를 갖는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스(DSM 5480)의 돌연변이체가 분리되었다. 이 돌연변이체의 상 대비현미경, 주사전자현미경 및 전달전자현미경은 이 돌연변이체의 고생산성이 포자형성에 관하여 델타-엔도톡신 생성의 조정에 있어서 변화에 기인하여 현존하는 갑충류 활성의 바실루스 투린지엔시스 균주에 의해 생성된 결정들보다 5배 이상까지 더 큰 단백질 결정의 생성을 가져옴을 가리킨다. 결정형성과 포자형성간의 밀접한 상관관계는 제거된 것 같고 돌연변이체는 포자형성에 앞서 많은 양의 델타 엔도톡신을 생성한다.
본 발명은 한가지 관점은 살충제 바실루스 투린지엔시스 생성물의 제조를 위한 방법에 본 발명의 변이된 또는 돌연변이된 균주의 사용에 관련되며, 이 방법에 의해 변이체 또는 돌연변이체 바실루스 투린지엔시스 균주가 탄소, 질소 및 당업자에게 공지인 다른 성분들에 대한 공급원들로 이루어지는 적합한 배지에서 적합한 시간동안 배양되며 그후 델타 엔도톡신이 회수된다.
본 발명의 더이상의 관점에서 상기한 바와같이 얻은 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신 생성물이 유효성분으로서 살충제 조성물에 사용된다.
이러한 조성물에서 본 발명의 델타 엔도톡신은 단독으로 또는 다른 생물학적 활성의 생성물과 조합하여 이용될 수도 있다.
본 발명은 또한 농학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와의 혼합물로 본 발명의 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신 생성물로 이루어지는 이러한 살충제 조성물 또는 제제들에 관련된다.
본 발명은 또한 액체형태의 살충제 조성물이 적어도 3% w/w 갑충류 살충제 결정 단백질에 해당하는 적어도 15,000 BTTU/g의 효능을 갖거나 또는 건조 형태의 살충제 조성물이 적어도 10% w/w 갑충류 살충제 결정 단백질에 해당하는 적어도 50,000 BTTU/g의 효능을 갖는 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신 생성물로 이루어지는 이러한 살충제 조성물 또는 제제들에 관련된다.
특정 구체예에서 본 발명은 DSM 2803 또는 다른 갑충류 활성 Btt 균주로부터 생성된 살충제 조성물의 적어도 두배의 효능을 갖는 DSM 5480으로부터 생성된 살충제 조성물에 관련된다.
본 발명 조성물은 농화학 조제에 대한 본분야공지의 어떤 형태도 취할 수 있는데, 예를들면 현탁액, 분산제, 수성 유제, 살포분제, 분산성 분제, 유화성 농축액 또는 과립제이다. 더욱이 직접 적용에 적합한 형태로 될 수 있고 또는 적용전에 적합한 양의 물 또는 다른 희석제와의 희석을 요하는 농축액 또는 1차 조성물로서도 할 수 있다.
단독으로 또는 다른 살충제와 조합하여 식물에 적용하여 사용할 때 본 발명 조성물의 살충제 활성인 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신의 농도는 바람직하게는 약 0.5 내지 약 25중량 퍼센트 범위이내, 특히 1 내지 15중량 퍼센트이다.
여전히 더이상의 관점에서 본 발명은 해충을 제어하는 방법에 관련되며, 여기서 전술한 관점에 따르는 살충제 조성물이 상기 해충으로 감염된 영역에 적용된다.
특정 구체예에서 제어할 해충은 인시류, 쌍시류 및 갑충류로 이루어지는 군에 속하며, 특히 콜로라도 감자 투구벌레와 같은 갑충류에 속한다.
특정 구체예에서 해충은 에이커당 1쿼어트의 액체 살충제 조성물의 적용에 의해서 또는 에이커당 0.5파운드의 건조 살충제 조성물의 적용에 의해 제어될 수 있다.
본 발명의 활성 바실루스 투린지엔시스 제제 또는 조성물은 해충이 식물에 나타나기 시작했을 때 예를들면, 분무 또는 살포에 의해 식물에 직접 적용될 수 있다. 적용의 바람직한 방식은 분무식이다. 해충발달 초기단계에서 해충의 양호한 제어를 얻는 것이 일반적으로 중요한데 이때가 식물이 최소의 손상을 당했을 시기이기 때문이다.
바실루스 투린지엔시스 균주를 돌연변이시키고 그것들의 모균주보다 실질적으로 더 많은 양의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있는 이러한 돌연변이체를 선별하는 한 방법에 있어서, 모균주는
i) 돌연변이원으로 처리되고
ii) 이와 같이 처리된 돌연변이체를 무포자발생(asporogenous) 및/또는 올리고포자발생(oligosporogenous) 균주의 선별에 적합한 배지에서 성장시키고
iii) 반투명 콜로니들을 선별하고 가열시 유동화되지 않는 배지에서 성장시키고
iv) 콜로니들을 열처리시킴으로써 진정한 무포자발생 균주들을 선별제거한다.
본 방법의 바람직한 구체예에 따르면 이와 같이 선별된 콜로니들을 보통의 생성 배지에서 성장시키고 델타 엔도톡신 생성을 증가시킬 수 있는 균주에 대한 최종선별을 수행한다.
상기 방법의 단계(i)에서 돌연변이원은 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 또는 에틸메탄술포네이트와 같은 어떤 적합한 종래의 화학적 돌연변이원이 될 수 있고, 또는 모균주를 γ-, X-선-, 또는 UV-방사와 같은 전자기 방사로 처리할 수도 있다.
단계(ii)에서 적합한 배지는 존슨외(Johnson et al., In Spores VI: eds. P. Gerhardt et at., pp. 248-254, 1975)에 의해 기술된 바와 같이 인산염을 포함하는 수정된 영양포자형성배지(NSMP배지)가 될 수 있다.
본 발명 방법의 단계(iv)에서 적합한 배지는 MgCl2및 겔라이트(Gelrite, Kelco)가 보충된 NSMP 배지가 될 수 있다.
본 발명의 고생산성의 변이체 또는 돌연변이체를 얻는 또다른 방법은 액체 배지에서 모균주를 성장시키고 무포자발생 및/또는 올리고포자발생 돌연변이체의 선별에 적합한 한천 배지상에 배양 육즙을 바른 후 자발적 돌연변이체 또는 변이체를 선별하는 것과 같은 방법이 생각될 수 있다.
본 발명의 고생산성 변이체 또는 돌연변이체에 대한 스크리닝의 다른 방법은 원심분리 또는 덩어리를 분리하는 다른 수단을 통해 직접 이들 돌연변이체의 덩어리를 사용하는 것과 같은 방법이 생각될 수 있다.
[실시예 1]
델타-엔도톡신 생성에 있어서 두배이상 증가를 갖는 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 돌연변이체가 분리되었다.
이 돌연변이체의 상 대비현미경, 주사전자현미경 및 전달전자현미경은 이 돌연변이체의 고생산성이 포자형성에 관하여 델타-엔도톡신 생성의 조정에 있어서 변화에 기인하여 현존하는 갑충류 활성의 바실루스 투린지엔시스 균주에 의해 생성된 결정들보다 5배 이상까지 더 큰 단백질 결정의 생성을 가져옴을 가리킨다. 결정형성과 포자형성간의 밀접한 상관관계는 제거된 것 같고 돌연변이체는 포자형성에 앞서 많은 양의 델타-엔도톡신을 생성한다.
[고수율 돌연변이체의 생성]
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주 DSM 5526의 포자를 γ-조사시켜 7kGy의 조사량을 제공하였다. 조사된 포자를 NSMP 한천판(Johnson et al., In Spores VI: eds. P. Gerhardt et al., pp. 248-254, 1975에 의해 기술된 바와같이 인산염을 포함하는 수정된 영양포자형성배지) 즉, 무포자 발생 및/또는 올리고포자발생 돌연변이체의 선별에 적합한 배지에 발랐다.
NSMP-한천판을 30℃에서 2-3일간 배양시켰다. 반투명 콜로니들을 집어내고 NSMP 겔라이트 판(MgCl2(0.57g/ℓ) 및 Gelrite, Kelco(20g/ℓ) 가 보충된 NSMP 배지)에 이동시켰다.
NSMP 겔라이트 판을 90℃에서 1시간동안 배양시킨 다음 30℃에서 1-2일간 더 배양시켰다.
NSMP 겔라이트 판에서 잘 성장한 돌연변이체를 선별하였다. 이런식으로 모든 무포자발생 돌연변이체를 그것들은 열처리후 성장하지 못하기 때문에 선별제거하였다.
선별된 돌연변이체는 시판 배지를 함유하는 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 생성된 델타-엔도톡신의 양을 하기하는 면역학적 방법에 의해 결정하였다.
모균주보다 상당히 더 많은 양의 델타-엔도톡신을 생성하는 돌연변이체만을 선별하였다.
고형 배지상에서 및 액체 배지에서 선별된 돌연변이체의 형태학을 상 대비 현미경(2500배)에 의해서 및 주사 및 전달 전자 현미경에 의해 연구하였다. 포자 및 결정의 수를 계수하고 단백질 결정의 크기를 결정하였다.
얻은 돌연변이체 가운데, 델타-엔도톡신을 생성하는 탁월한 능력에 대해 한가지(DSM 5480)를 선별하였다.
돌연변이체 DSM 5480에 의해 생성된 델타 엔도톡신의 양을 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 원래분리물 DSM 2803, NOVODOR의 제조에 사용된 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주 DSM 5526, Sandoz의 1989년 바실루스 투린지엔시스 테네브리오니스 제품 TRIDENT로 부터 분리된 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주 NB 178, Sandoz의 1990년 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스 제품 TRIDENT로부터 분리된 균주 NB 198, 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, 균주 NRRL-B-15939, 및 Mycogen의 1990년 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고 제품 M-ONE로부터 분리된 균주 NB 197과 비교하였다. 실시예 2의 표 I에 나타낸 바와 같이 본 발명의 수율개선된 돌연변이체는 오늘날 시판되는 바실루스 투린지엔시스의 갑충류 활성균주보다 2-3.5배 만큼의 델타 엔도톡신을 생성한다.
[실시예 2]
이 실시예에서, 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 돌연변이체 DSM 5480의 델타 엔도톡신 수율을 시판 배지에서의 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스 균주 DSM 2803(바실루스 투린지엔시스 서브 스페시스 테네브리오니스의 원래 분리물), DSM 5526(Novo-Nordisk의 제조균주), 및 NB 178과 NB 198(Sandoz의 제조균주), 그리고 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, 균주 NRRL-B 15939 및 NB197(Mycogen의 제조균주)의 델타 엔도톡신 수율과 비교하였다.
각각의 균주들을 증류수 리터당의 그램으로 표현된 다음 조성의 한천 사면 배지에서 30℃에서 17시간동안 성장시켰다.
각 균주로부터 세포의 현탁액 5㎖를 그다음 500㎖ 배플바닥삼각플라스크에서 제조 배지 100㎖에 이동시켰다. 제조 배지는 표시된 양으로 (수도물 리터당 그램으로 표현됨) 다음 성분들로 구성되었다.
접종된 플라스크에서 진탕하면서(250rpm) 30℃에서 배양시켰다. 배양 96시간후, 배양육즙을 면역학적 방법에 의해 델타 엔도톡신 수율에 대해 분석하였다.
개개 균주들에 의해 생성된 델타 엔도톡신의 양을 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스로부터의 정제된 단백질 결정들에 대해 일어난 항체들을 사용하여 로켓면역전기영동(RIE)과 광도계 면역분석법(PIA)에 의해 결정하였다.
각 배양육즙 400mg을 평량하였다. 7㎖ 인산나트륨 완충력(0.125M, pH 12)을 각 샘플에 첨가하였다. 델타 엔도톡신 단백질을 용해시키기 위해 현탁액을 1시간동안 진탕시켰다.
그다음 샘플을 3,500rpm에서 15분간 원심분리시키고 상징액을 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스로부터의 정제된 단백질 결정들에 대해 일어난 항혈청에 대해 로켓면역전기영동에 의해 델타-엔도톡신에 대해 시험하였다. 이미 알고 있는 양의 결정 단백질을 갖는 표준과 비교하여 델타 엔도톡신의 양을 결정하였다.
결정 단백질의 농도를 또한 광도계 면역 분석법에 의해 결정하였다. 결정 단백질을 알칼리성 용액에 용해시켰다. 용해된 단백질을 그것들의 항체를 사용하여 침전시켰다. 이 반응의 속도를 탁도계로 구하였다. 델타-엔도톡신의 양을 이미 알고 있는 양의 결정 단백질을 갖는 표준과 비교하여 결정하였다.
분석법에서 사용된 항체의 생성을 위한 결정항원은 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스로부터 분리된 결정들로부터 얻었다.
토끼를 매 2주마다 0.25mg의 결정항원을 피하주사함으로써 폴리클로날 항체를 일으켰다.
얻은 결과를 다음 표 Ia 및 Ib에 나타내었다.
델타 엔도톡신 수율은 BTTU/g(배양육즙 g당의 단위, 로켓면역전기영동, RIE, 또는 광도계 면역분석법, PIA에 의해 구함)으로 표현하였다. 순수한 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스 결정단백질에 대해 사용된 값은 500,000 BTTU/g이다. 이하 표 Ia에 표시된 값들은 6-7가지 독립 발효들의 평균이며, 표 Ib의 값들은 3가지 독립 발효들의 평균이다.
표 Ia 및 Ib로부터 DSM 5480은 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 원래균주, DSM 2803과 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, 균주 NRRL-B15939 보다 3배 이상 만큼의 델타 엔도톡신을 생성하며 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스의 시판제품의 제조에 오늘날 사용되는 균주보다 2배 이상의 델타 엔도톡신 양을 생성함을 나타낸다.
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 돌연변이체 DSM 5480의 상 대비현미경, 주사전자현미경 및 전달전자현미경은 이 돌연변이체에 의해 생성된 단백질 결정이 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주 DSM 2803, DSM 5526, NB 178 및 NB 198, 그리고 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, 균주 NRRL-B 15939 및 NB 197에 의해 생성된 해당 단백질 결정들보다 훨씬 더 큼을 나타내었다.
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 돌연변이체 DSM 5480의 배양육즙을 콜로라도 감자 투구벌레유충에 대한 활성에 대해 시험하였다. 면역학적 방법에 의해 결정한 바 돌연변이체 DSM 5480에 의해 생성된 델타-엔도톡신의 증가된 양은 콜로라도 감자 투구벌레유충에 대한 생물학적 활성에 반영되었다.
[실시예 3]
이 실시예에서 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주들 DSM 2803, DSM 5526, NB 178과 NB 198, 및 돌연변이체 DSM 5480, 그리고 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고, 균주 NRRL-B 15939및 NB 197에 있어서 포자형성 및 파라포자결정형성을 고체 배지와 액체 배지에서 비교하였다.
각각의 균주들을 증류수 리터당 그램으로 표현된 다음 조성물의 한천판에 30℃에서 2일간 성장시켰다.
각각의 균주들을 액체 배지에서 또한 성장시켰다. 모든 균주들을 한천 경사배지에서 30℃에서 17시간동안 성장시켰다. 각 균주로부터의 세포의 현탁액 5㎖를 그다음 각각 100㎖의 배지를 함유하는 500㎖ 배플바닥삼각 플라스크에 이동시켰다.
배지는 표시된 양으로 (수도물 리터당 그램으로 표현됨) 다음 성분들로 구성되었다.
액체 배지 :
접종된 플라스크를 96시간동안 진탕(250rpm)하면서 30℃에서 배양시켰다.
고체 배지 및 액체 배지에서의 균주의 형태학을 상 대비현미경 (2500배)에 의해 매일 연구하였다. 포자 및 결정의 수를 계수하고 파라포자 결정의 크기를 결정하였다. 두세 선택된 샘플들을 주사 및 전달전자현미경에 의해 또한 연구하였다.
바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 테네브리오니스, 균주 DSM 2803, DSM 5526, NB 178 및 NB 198, 바실루스 투린지엔시스 서브스페시스 샌 디에고 균주 NRRL-B 15939 및 NB 197은 모두 두 배지에서 잘 포자형성하였다. 세포용해전에 각 세포는 포자 및 파라포자결정을 함유하였다. 결정의 크기는 세포용해시에 길이가 0.4 내지 0.9-1.1㎛이었다. 단백질 결정의 평균크기는 길이가 0.6-0.7㎛이다.
돌연변이체 DSM 5480은 고체 배지에서 및 정의된 액체 배지에서 단지 적은 포자들( 106포자/㎖)을 생성하였다. 세포용해전에 대부분의 세포들은 거대한 단백질 결정을 함유하였으나 포자는 함유하지 않았다. 단백질 결정의 크기는 0.4-0.7㎛내지 5.0㎛이었다. 단백질 결정의 평균크기는 길이가 2.2-2.3㎛이다.
전달전자현미경에 의한 이들 배지로부터의 세포의 초미세구조분석은 돌연 변이체에서 포자형성과정이 시작되기는 하나 세포용해시에 완결되지 않음을 나타내었다. 포자형성과정은 각종 세포들에서 다른 단계들에 이르렀다. 포자형성이 단지 단계II (전포자 격막형성)에 이른 세포들에서 단백질 결정들은 전체세포들을 가득 채웠다.
제조배지 (실시예 2)에서 돌연변이체는 많은수의 포자들(107- 108포자/㎖)을 생성하였다. 이 배지에서 돌연변이체의 포자형성빈도는 모균주보다 10-100배 더 낮았다.
따라서 돌연변이체는 정상의 포자들을 생성하는 능력을 보유하였다. 그러나, 돌연변이체의 포자형성빈도는 강하게 배지의존인 것 같다.
개개 균주들에 의해 생성된 단백질 결정들의 크기를 표 IIa 및 IIb에 나타내었다.
표 IIa 및 IIb로부터 돌연변이체 DSM 5480은 오늘날 구입되는 갑충류 활성의 어떤 B.t. 균주들보다 훨씬 더 큰 단백질 결정들을 생성함이 분명하다.
얻은 데이타로부터 포자형성에 관하여 델타 엔도톡신 생성의 조정은 돌연변이체에서 변화되었음을 나타낸다.
돌연변이체는 포자의 발달에 앞서 단백질 결정들을 생성하고 이로써 델타 엔도톡신 생성에 대해 더 긴 기간 세포들을 제공하는데 이것은 모균주에서 보다 세포용해시기에 의해 훨씬 더 큰 단백질 결정들의 생성을 가져오는 것 같다.
포자형성시기에 의해 세포들에서의 유용한 영양분과 단백질 결정들의 크기에 따라 정상의 포자가 세포용해시기전에 발달될 것이다.
[실시예 4]
이 실시예에서 고수율의 Btt 돌연변이체 DSM 5480을 콜로라도 감자 투구벌레 유충의 제어를 위한 고효능의 제품을 생성하기 위해 사용하였다.
DSM 5480을 공기가 통하는 교반된 제조 발효 탱크에서 실시예 2에 기술된 제조발효배지에서 발효시켰다. 96시간후, 육즙을 연속원심분리기에서 원심분리에 의해 회수하였다.
활성 단백질 결정들을 함유하는 농축된 크림을 미생물 보존제의 첨가에 의해 안정화시키고 pH를 5.0으로 조절하였다.
농축된 크림의 한 부분을 분무건조시키고 흡습성 분제의 조제를 위해 후에 사용하였다. 농축된 크림의 나머지는 두가지 수성 유동성 농축액(FC)의 조제를 위해 직접 사용하였다.
흡습성 분제는 표 III에 기술된 것과 같이 조제하였다.
두 FC의 조제는 표 IV에 기술되어 있다.
순수한 결정단백질 500,000 BTTU/g의 값을 사용할 때 조제중 활성 단백질의 함량은 다음과 같다:
세정제는 농학적 살충제 제품에서 보통 사용되는 현탁액조제 및 흡습제의 넓은 선택범위중에서 선택되었다.
점결방지제는 친수성 실리카이며 비활성 충전제는 벤토나이트, 무기염류 또는 점토와 같은 일반적으로 사용되는 비활성 충전제로부터 선택되었다.
FC에서 사용된 보조제는 식품 및 화장품 보존제의 군으로부터 선택되었다. pH 조절제는 무기산이다.
[실시예 5]
주표적해충인 콜로라도 감자 투구벌레유충에 대한 고수율의 Btt 5480의 생물학적 효과를 입증하기 위해 현장시도를 행하였다. 두가지 시판제품 Trident와 M-one을 비교하였고 농작물은 감자이었다. 농작물에 7월 20일, 7월 27일, 및 8월 3일 (제2발생유충)에 3회 분무하였다. 사용한 제품 및 투여량은 다음과 같다.
미처리 대조군과 비교한 CPB의 평균 % 제어를 표 V에 제공한다. 콜로라도 감자투구벌레 압박은 미처리 대조군에서 매우 심하였다. 즉, 8월 1일에 20포기 당 370마리 유충 및 8월 8일에 20포기당 904마리 유충.
이들 결과는 고수율 돌연변이체 DSM 5480으로 만든 제품은 현장에서 콜로라도 감자투구벌레유충의 제어에 효과적임을 나타낸다. 고수율 균주에 의해 생성된 결정 단백질은 1.5qts NOVODORFC로서 충분히 활성이며 Trident 4 qts 만큼의 양호한 결과를 주며 M-one 2 qts 만큼 양호하다.
Claims (41)
- 균주 DSM 2803과 비교하여 최소한 2 배이상의 살충제 델타-엔도톡신을 생성할 수 있는 바실루스 투린지엔시스 균주 DSM 2803의 돌연변이체 또는 변이체로서, 상기 돌연 변이체 또는 변이체 균주에 의해 생성된 델타-엔도톡신은 균주 DSM 2803의 델타 엔도톡신과 동일한 해충들에 대한, 예를들면 인시류(B. thuringiensis subsp. kurstaki 및/ 또는 subsp. aizawai로부터의 돌연변이체), 쌍시류(B. thuringiensis subsp. israelensis로부터의 돌연변이체) 또는 갑충류 해충(B. thuringiensis subsp. tenebrionis 및/ 또는 B. thuringiensis subsp. San Diego 로부터의 돌연변이체)에 대한 활성 및 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제1항에 있어서, 돌연변이체 또는 변이체 바실루스 투린지엔시스는, 바실루스 투린지엔시스의 패토타입 C에 속하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 바실루스 투린지엔시스는 아종 테네브리오니스에 속하며, 생성된 델타-엔도톡신은 갑충류에 대하여 활성인 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제3항에 있어서, 돌연변이된 또는 변이된 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스는, 균주 DSM 2803보다 3배 이상의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제3항에 있어서, 돌연변이된 또는 변이된 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 균주는, 균주 DSM 2803의 파라포자결정의 평균 테두리 길이보다 최소한 2배 긴 평균테두리 길이를 갖는 파라포자결정을 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제5항에 있어서, 돌연변이된 또는 변이된 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 균주는 2㎛ 또는 그 이상의 평균테두리 길이를 갖는 파라포자결정을 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제3항에 있어서, 돌연변이된 또는 변이된 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 균주는 균주 DSM 2803의 포자형성빈도보다 10 내지 100배 또는 106배까지도 더 낮은 포자형성빈도를 나타내는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 또는 변이체.
- 제1항에 있어서, 돌연변이체는 기탁된 돌연변이체 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 DSM 5480 또는 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 DSM 5526인 것을 특징으로 하는 돌연변이체.
- 바실루스 투린지엔시스 균주 DSM 2803의 돌연변이된 또는 변이된 균주의 사용에 의해 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신 생성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 돌연변이 또는 변이된 균주는, 균주 DSM 2803과 비교하여 최소한 2 배이상의 살충제 델타-엔도톡신을 생성할 수 있으며, 상기 돌연변이체 또는 변이체를 탄소, 질소, 및 다른 성분들에 대한 공급원으로 이루어지는 적합한 배지에서 적합한 시간동안 배양시키고, 그후 델타 엔도톡신으로 이루어지는 살충제 생성물을 단독으로 또는 배지로부터의 세포들 및/또는 포자들과 조합하여 회수하고 이 생성물을 임의적으로 농학적으로 허용되는 부형제와 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제9항에 따라 얻은 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신 생성물을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 델타 엔도톡신 생성물은 단독으로 또는 다른 생물독적 활성의 생성물과 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 농학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 혼합하여 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신 생성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물 또는 제제.
- 제10항에 있어서, 균주 DSM 2803에 의하여 생성된 살충제 조성물보다 2배 이상의 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
- 최소한 3% w/w 갑충류 살충제 결정단백질에 해당하는 최소한 15,000 BTTU/g의 효능을 갖는 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신을 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 살충제 조성물.
- 최소한 10% w/w 갑충류 살충제 결정단백질에 해당하는 최소한 50,000 BTTU/g의 효능을 갖는 바실루스 투린지엔시스 델타 엔도톡신을 포함하는 것을 특징으로 하는 건조 살충제 조성물.
- DSM 2803 또는 다른 갑충류 활성의 Btt 균주로부터 생성된 델타 엔도톡신을 포함하는 살충제 조성물보다 최소한 2배의 효능을 갖는 바실루스 투린지엔시스 균주 DSM 5480으로 부터 생성된 델타 엔도톡신을 포함하는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 살충제 조성물중의 희석제 또는 담체는 표면활성제와 선택적으로 결합되는 고체 또는 액체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제10항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
- 바실루스 투린지엔시스 균주를 돌연변이시키고 그들의 모균주보다 실질적으로 더 많은 양의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있는 돌연변이체를 선별하는 방법에 있어서, i) 모균주를 화학적 돌연변이제로 처리하거나 또는 전자기 방사선으로 조사하고, ii) 이와 같이 처리된 돌연변이체를 무포자발생 및/또는 올리고포자발생 균주의 선별에 적합한 배지에서 성장시키고, iii) 반투명콜로니들을 선별하고 가열시 유동화되지않는 배지에서 성장시키고, iv) 콜로니들을 열처리시킴으로써 진정한 무포자발생균주들을 선별제거하고, v) 델타 엔도톡신 생성을 증가시킬 수 있는 균주를 위한 최종 선별이 행하여지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 돌연변이제는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 에틸메탄술포네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 γ-, X선, 또는 UV- 방사선인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 단계(ii)에서, 상기 배지는 인산염을 포함하는 수정된 영양포자형성배지(NSMP 배지)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 단계(iv)에서, 상기 배지는 MgCl2및 겔라이트, 켈코(Gelrite, Kelco)가 보충된 NSMP 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 모균주는 바실루스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키, 바실루스 투린지엔시스 아종 아이자와이, 바실루스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스, 및 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스로 이루어지는 군에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 모균주는 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 모균주는 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 균주 DSM 5526인 것을 특징으로 하는 방법.
- 모균주보다 실질적으로 더 많은 양의 델타 엔도톡신을 생성할 수 있는 바실루스 투린지엔시스 균주의 변이체 또는 천연 돌연변이체를 선별하는 방법에 있어서, i) 모균주를 액체 배지에서 배양하고, ii) (i)로부터의 배양육즙을 무포자발생 및/또는 올리고포자발생균주의 선별에 적합한 배지에 바르고, iii) 반투명 콜로니들을 선별하고 가열시 유동화되지 않는 배지에서 성장시키고, iv) 콜로니를 열처리시킴으로써 진정한 무포자발생균주를 선별제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 이와 같이 선별된 콜로니들을 보통의 생성배지에서 성장시키고, 델타 엔도톡신 생성을 증가시킬 수 있는 균주에 대한 최종 선별을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 단계 (ii)에서, 상기 배지는 인산염을 포함하는 수정된 영양포자형성배지(NSMP 배지)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 단계 (iv)에서, 상기 배지는 MgCl2및 겔라이트, 켈코(Gelrite, Kelco)가 보충된 NSMP 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 모균주는, 바실루스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키, 바실루스 투린지엔시스 아종 아이자와이, 바실루스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 및 바실루스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스로 이루어지는 군에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 살충제 조성물중의 희석제 또는 담체는 표면활성제와 선택적으로 결합되는 고체 또는 액체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 살충제 조성물중의 희석제 또는 담체는 표면활성제와 선택적으로 결합되는 고체 또는 액체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 살충제 조성물중의 희석제 또는 담체는 표면활성제와 선택적으로 결합되는 고체 또는 액체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
- 제15항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
- 제16항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
- 제17항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
- 제32항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어 방법.
- 제33항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
- 제34항에 따르는 살충제 조성물을 해충이 감염된 영역에 적용시키는 것을 특징으로 하는 해충의 제어방법.
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