JPH05500151A - バチルス・ツリンギエンシスの新規株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルス・ツリンギエンシスの新規株 発明の背景 本発明は、胞子形成中、結晶（ｒＢｔＰＧＳＩ３８７結晶」）中に包み込まれて いる結晶蛋白質（ｒＢｔＰＧｓＩ３８７結晶蛋白質」）を生産するバチルス・ツ リンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の新規株に 関する。このＢｔＰＧＳＩ３８７株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　 ｖｏｎ　ｌｌｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（Ｄ３Ｍ″）、Ｍａｓｃｈｅｒｏ ｄｅｒ　ｌｅｇ　ＩＢ、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅ ｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙにおけるブダペスト条約の規定に基づいて 、１９８８年８月２９日付けの受け入れ番号４７８３として寄託されている。

本発明はまた、りんし目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）　、特にノクツイダエ（Ｎ ＯＣｔｕｉｄａｅ）　、例えばスポドブテラ・リトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ ａ　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓ）に対して活性を示し、そして活性を示す材料として 、ＢｔＰＧＳＩ３８７株そのまま、或は好適には、ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶また はＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質、或はそれらの活性成分（類）を含む殺虫剤組 成物に関する。

本発明は、更に、他のＢｔ株から生じ、そしてりんし目、甲虫目および／または 双し目に対して殺虫剤的活性を有する他からのＢｔトキシンもしくはプロトキシ ンをコード化する遺伝子の全部または一部を持っているベクターを有するＢｔＰ ＧＳＩ３８７株をエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ） することによって得られる、形質転換したＢ、ツリンギエンシス（「ＢｔＪ）株 に関する。

Ｂ、ツリンギエンシス（ｒＢｔＪ　）は、胞子形成時に内因性の結晶を生産する ダラム陽性菌である。この結晶は、昆虫の幼虫に対して特異的に毒性を示す蛋白 質を含んでいる。次のような３つの異なるＢｔバッタイブ（ｐａｔｈｏｔｙｐｅ ）が記述されている：りんし目、例えば毛虫に対して活性を示すバッタイブＡ； ある種のハエ目、例えば蚊およびブヨに対して活性を示すバッタイブＢ、そして 甲虫目、例えば甲虫に対して活性を示すバッタイブＣ（Ｅｌｌａｒ他、１９８６ ）。Ｂｔ胞子の大スケール生産に通常の浸漬発酵技術が用いられ得るため、この バクテリアが、殺虫剤組成物の源として商業的に魅力あるものとなった。

発明の要約 本発明に従って、バッタイブＡの新規Ｂ、ツリンギエンシス株、即ちＢｔＰＧＳ Ｉ３８７株が提供される。胞子形成中にこの株が生産するところの、ＢｔＰＧＳ Ｉ３８７結晶蛋白質、並びにＢｔＰＧＳＩ３８７ブロトキシン類およびトキシン 類は、一般に、りんし目に対する殺虫剤的活性を有し、特にノクツイダ−ｒ−（ Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）　、例えばンロナヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｓｐ、 　）　、ヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ　ｓｐ、　）およびヘリオチス（Ｈｅｌｉｏｔｈ ｉｓ　ｓｐ、　）　、ピラリダニ（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ）、例えばオストリニア ・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）およびンアトラエ７− グランシオセラ（Ｄｉａｔｒａｅａ　ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）およびゲレチ イダエ（Ｇｅｌｅｃｈｉｉｄａｅ）　、例えばマンヅカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕ ｃａ　５ｅｘｔａ）　、フトリマエア・オペルクレラ（Ｐｈｔｏｒｉｍａｅａ　 ｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ）およびワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ　 ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）に対する殺虫剤的活性を有している。ＢｔＰＧＳＩ３ ８７結晶および／またはＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質は、特に経済的に重要な 作物の主要有害生物であるところの、綿葉虫（ｃｏｔｔｏｎｌｅａｆｗｏｒｍ） 　、スポドプテラ・リトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓ ）、およびタバコ・バド・ワーム（ｔａｂａｃｃｏ　ｂｕｄｉｏｒｍ）　、ヘリ オチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に対して有益 である。

また、本発明に従って、ＢｔＰＧＳＩ３８７株は、Ｂｔプロトキシンもしくはト キシンをコード化する他からのＤＮＡ配列を用いてエレクトロポレーションする ことで形質転換される。

発明の詳細な説明 本発明に従って、ＢｔＰＧＳＩ３８７株は、受は入れ番号４７８３の下でＤＳＭ に寄託されている。この株は、次の２つの結晶蛋白質の混合物である結晶を生産 する： マンヅカ（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｐ、　）およびヘリオチス（Ｅｌｅｌｉｏｔｈｉ ｓ　ｓｐ、　）に対して特に毒性を示す１３ＱｋＤａ蛋白質（「第−ＢｔＰＧＳ Ｉ３８７ブロトキシン」）；そして シロナヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｓｐ、　）に対して特に毒性を示す１３ ５ｋＤａ蛋白質（「第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシン」）。

第一および第二ＢｔＰＧＳＩ３８７ブロトキシンのトリプシン消化で、各々、６ ０ｋＤａ蛋白質（「第−ＢｔＰＧＳＩ３８７　トキシン」）および５３ｋＤａ蛋 白質（「第二ＢｔＰＧＳＩ３８７　トキシン」）を生産する。

このＢｔＰＧＳＩ３８７株、その結晶、そのプロトキシンおよび／またはそのト キシン類は、りんし目に属する昆虫有害生物を制御するために用いられる殺虫剤 組成物中の活性材料として使用され得る。例えば、ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶は、 ＢｔＰＧＳＩ３８７株の胞子形成培地から単離され（ＭａｈｉｌｌｏｎおよびＤ ｅｌｃｏｕｒ、　１９８４）　、そしてその後、各々のプロトキシン類およびそ れらの混合物が、ＨＱｆｔｅ他の方法（１９８６）に従ってそれらの結晶から単 離され得る。

このＢｔＰＧＳＩ３８７株は、他からの１種以上の遺伝子、例えばｂｔ２遺伝子 （ここでは参照に入れられる１９８６年１月２２日出願の米国特許出願８２１． ５８２およびヨーロッパ特許出願８６／３００２９１．１）　、或は別のりんし 目に対して２〜４週間綿畑を保護するために用いられ得る。更に長期の保護（例 えば、全成長期）に対しては、追加的量の組成物を定期的に施す必要がある。

昆虫類を防除するための本発明の組成物は、殺虫剤的量のＢｔＰＧＳＩ３８７結 晶、或は好適には第一および第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキンンの混合物、特 にＢｔＰＧＳＩ３８７結晶の第一および第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシンの 混合物を含むことが好ましい。本発明に従ってりんし目を制御するための方法に は、好適には、保護すべき場所（領域）に対して、殺虫剤的量のＢｔＰＧＳＩ３ ８７結晶、或は好適には、第一および第二ＢｔＰＧＳＩ３８７ブロトキシンの混 合物を施すことを含む。

使用において、該ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶、或は第一および第二ＢｔＰＧｓＩ３ ８７プロトキンンもしくはトキシンの混合物、或は単離された第一もしくは第二 ＢｔＰＧｓＩ３８７ブロトキシンもしくはトキシン、或は第一および第二ＢｔＰ ＧＳＩ３８７プロトキシンを含有するＢｔＰＧＳＩ３８７株の無傷の細胞を、保 護すべき場所に施すことができる。施すべき場所には、例えば昆虫有害生物の生 息地、或は成長している植物、或は植物が成長すべき場所が含まれる。ＢｔＰＧ ＳＩ３８７結晶の第一および第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシンもしくはトキ シンの混合物、或は個々の第一もしくは第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシンも しくはトキシンを得るためには、ＢｔＰＧＳＩ３ｇ７株の細胞を通常の方法で、 適切な培養培地上に増殖させた後、酵素的劣化または洗剤などの如き通常の手段 を用いて溶解させる。次に、プロトキシンの混合物または個々のプロトキシンを 、標準技術、例えばクロマトグラフィー、抽出、電気泳動などによって分離しそ して精製し得る。その後、このトキシンの混合物または個々のトキシンが、それ らの個々のプロトキシン混合物もしくは活性なプロトキシンもしくはトキシンの 遺伝情報を指定する別のｂｔ遺伝子、および／またはｂｔ１３遺伝子（ここでは また参照に入れられるヨーロッパ特許出願８８／４０２１１５．５）　、或は甲 虫目に対して活性を示すトキシンの情報を指定する別のｂｔ遺伝子、例えばｂｔ ＰＧｓＩ２０８遺伝子またｂｔＰＧＳＩ２４５遺伝子（ここではまた参照に入れ られるヨーロッパ特許出願８９／４００４２８゜２）を用いて形質転換さね得る 。このように、より広い種類の昆虫有害生物、例えば追加的りんし目および／ま たは甲虫目を防除するために有益な、形質転換されたＢｔ株が生産され得る。通 常のクローン化用ベクター中に組み込まれた他からのＢｔ遺伝子を有するＢｔＰ ＧＳＩ３８７株の形質転換は、好適には、通常のニレクトロポレーション技術（ Ｃｈａｓｓｙ他、１９８８）を用いたよく知られている方法で行われ得る。

このＢｔＰＧＳＩ３８７株は、高収率の細胞を与えるための通常の方法（Ｄｕｉ ｍａｇｅ、　１９８１）で発酵され得る。よく理解された適切な条件（Ｄｕｌｍ ａｇｅ、１９８１）下、このＢｔＰＧＳＩ３８７株は２４時間以内に胞子形成し 、高収率でＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質を与える。

本発明の殺虫剤組成物は、該ＢｔＰＧＳＩ３８７株、或は好適にはその結晶、結 晶蛋白質、プロトキシンおよび／またはトキシンを用いて、適切な担体、希釈剤 、乳化剤および／または分散剤と一緒に調合することができる。この殺虫剤組成 物は、湿潤可能な粉剤、ベレット、粒剤または粉付は剤として、或は泡、ゲル、 懸濁液、濃縮物などとして水系もしくは非水系溶媒と一緒の液体調剤として調合 され得る。このような調剤中のＢｔＰＧＳＩ３８７株、結晶、結晶蛋白質、プロ トキシンまたはトキシンの濃度は、その調剤の性質およびその意図された使用様 式に依存している。一般に、本発明の殺虫剤組成物は、該組成物の各々の施行で 、りんし目に対して個々のプロトキシンのトリプシン消化によって得られる。二 者択一的に、ＢｔＰＧＳＩ３８７細胞を収穫した後、保護すべき場所に、それら を処理しないで生きたままか、或は死滅したもの、好適には乾燥したものを施す 。これに関して、精製したＢｔＰＧＳＩ３８７株（生きているか、或は死んでい るかのどちらか）を使用するのが好ましく、特に９０，０〜９９．９％のＢｔＰ ＧＳＩ３８７株から成る細胞マスが好適である。

ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶、第一および第二ＢｔＰｃｓＩ３ｇ？プロトキンンもし くはトキシンの混合物、個々のＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキンンもしくはトキシ ン、および／またはプロトキシンを含有しているＢｔＰＧＳＩ３８７株の収穫細 胞が、殺虫剤組成物中に使用され得る。このような殺虫剤組成物は、特別な使用 に応じて、湿潤もしくは乾燥したいくらかの通常の添加剤を用いて、種々の方法 で調合され得る。添加剤には、湿潤化剤、洗剤、安定剤、粘着剤、伸展剤および 増量剤が含まれる。組成物の例には、ペースト、粉付は用粉剤、湿潤可能な粉剤 、粒剤、毒餌およびニー・ロゾル組成物が含まれる。他のＢｔプロトキシン類お よびトキシン類、殺虫剤、並びに殺菌・殺カビ剤、殺生物剤、除草剤、および肥 料も、ＢｔＰＧＳＩ３８７株の細胞および／またはＢｔＰＧＳＩ３８７ブロトキ シンもしくはトキシンと一緒に、追加的長所または利点を与えるために使用され る。

上記殺虫剤組成物は、通常の方法で製造できる。プロトキシン、トキシンおよび ／またはプロトキノン含有ＢｔＰＧＳＩ３８７株細胞の使用量は、各種の要因、 例えば標的となる昆虫有害生物、用いられる組成物、組成物が施されるべき領域 の種類および使用時の一般的な気候条件に依存している。一般に、殺虫剤的プロ トキシンおよび／またはトキシンの濃度は、調剤を約１００重量％とじてこの調 剤の少なくとも約１１重量％、しばしば該調剤の約０．１５〜釣１８重量％であ る。

実際、保護領域、即ちプロトキシンおよび／またはトキシンを施した領域中で、 ある種の昆虫にＢｔＰＧＳＩ３８７ブロトキシンもしくはトキシン、或はそれら の混合物を食べさせることができる。二者択一的に、ある種の昆虫はＢｔＰＧＳ Ｉ３８７株そのままおよび生きた細胞、もしくはそれらの形質転換物を食べ、そ の結果、この昆虫はＢｔＰＧＳＩ３８７ブロトキシンのいくらかを摂取して、死 滅するか、或は損傷を受ける。

以下の実施例は本発明を説明するものである。実施例中に示されている図は下記 の通りである。

図１・次の株　１　）　Ｂｔ　ＨＤ−１２７，２）　ＢｔＰＧＳＩ３８７および ３）ＢｔＳｌからのトリプシン処理した結晶蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイ ミュノプロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）。

図２：制限部位を示している実施例３のｐＷＰ３７ブラスミドの図式図。

実施例中に特に明記されていない限り、組み換えＤＮＡを製造しそして操作する ための全ての手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、「分子クローン化−実験室マニュア ルＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　（１９８２）中に記述されている標準化された操作によって行われる。

実施例１　：　ＢｔＰＧＳＩ３８７株の特徴ＢｔＰＧＳＩ３８７株を、クンバ、 カメルーン、アフリカで採取した森の土壌から、Ｔｒａｖｅｒｓ他（１９８７） の方法で単離し、そして受け入れ番号４７８３で、１９８８年８月２９日、Ｄｅ ｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに 寄託した。

この株を、通常の標準媒体、好適にはＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、 酵母抽出液５ｇ／リットル、ＮａＣ１１０ｇ／リットルおよび寒天１５ｇ／リッ トル）上、好適には２８℃で培養され得る。長期間の保存に対しては、−７０° Ｃもしくは凍結乾燥で、５０％グリセロール含有ＬＢ液体培地の使用が好ましい 。胞子形成のため、Ｔ３培地（トリプトン３ｇ／リットル、トリプトーゼ２ｇ／ リットル、酵母抽出液１．５ｇ／リットル、５ｍｇのＭｎＣｌ２．０．０５Ｍの Ｎａ２ＰＯ＜、ｐＨ６，８、および１．５％の寒天）を２８℃で２４時間使用し 、続いて４℃で保存するのが好ましい。この生長段階中、このＢｔＰＧＳＩ３８ ７株もまた、任意の嫌気条件下で成育できるが、しかし胞子形成は好気条件下で のみ生じる。

このＢｔＰＧＳＩ３８７株の滅菌は、２０分間１２０℃（１バールの圧力）のオ ートクレーブ処理することによって行う。上記処理は、全体として、胞子および 結晶性ＢｔＰＧＳＩ３８７　トキシンを不活性化する。ＵＶ照射（２５４ｎｍ） は胞子を不活性化するが、結晶蛋白質は不活性化しない。

このＢｔＰＧＳＩ３８７株の形態学的および生化学的特徴は下記の通りである。

この株は、波状形から裂片状の縁を有する不透明で白色の外観の、フラットで不 揃いのコロニーを有しており、この細胞は、２８℃の栄養寒天（Ｄｉｆｃｏ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　ＭＩ、ＵＳＡからのｒＮＡＪ　 ）中、２４時間以内に胞子形成を行うが、一方、試験した他のＢｔ株は同じ条件 下で３日後胞子形成する。Ｔ３培地中でのＢｔＰＧＳＩ３８７株の比増殖速度は 、典型的な値のｕ　ｍａｘ＝１．７９ｈ”を有するＢｔＨＤｌ　（Ａｂｂｏｔｔ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｌ１１０、ＵＳＡ からのＢｔ　Ｋｕｒｓｔａｋｉ　Ｄｉｐｅｌ）のそれと同等である。しかしなが ら、ＢｔＰＧＳＩ３８７の指数増殖段階は、Ｔ３培地中ではより長く継続し、結 果としてＤｉｐｅｌ　Ｂｔ　ＨＤ（株よりも多くのバイオマスを生じさせる。胞 子形成中に生産されるＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質は、二角錐形の結晶中に包 み込まれる。このＢｔＰＧＳＩ３８７株の早い胞予形成の開始と共に、このよう な特性が、この株を発酵に適切なものにしている。

以下の試験で、例えば５ｎｅａｔｈ他（１９８６）が記述したようなよく知られ た方法を用いた。増殖は、２および５％ＮａＣ１を補った栄養ブイヨン（「ＮＢ Ｊ　、Ｄｉｆｃｏ）中で観察した。７％のＮａＣ１が存在している場合、いかな る増殖も観察されなかった。ＮＡ寒天上で、このＢｔＰＧＳＩ３８７株は２０． ２８および３７℃でよく増殖したが、４．１０．５０および６０℃では増殖しな かった。ＮＢ上で、この株は、ｐＨ＝５、ｐＨ＝６およびｐＨ＝７で増殖し、モ してＮＢ１ｍＬ当たり１００単位のリゾチームを含有するＮＢ　（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯｌＵＳＡ） 上で増殖した。嫌気下のＮＡ上での増殖は非常に弱かった。

このＢｔＰＧＳＩ３８７株は、中心が楕円形の胞子を生じるグラム陽性ロッド（ １，７〜２．４Ｘ４．４〜７．Ｑｕｍ）を形成する。１日経った細胞は弱いカタ ラーゼ陽性であるが、しかしＡＰＩ−２０Ｅ試験片（ＡＰＩ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　 Ｓ、　Ａ、、Ｍｏｎｔａｌｉｅｕ−Ｖｅｒｃｉｅｕ、　Ｆｒａｎｃｅ）を用いた とき、それらは、いかなるゼラチナーゼおよびトリプトファンデアミナーゼ活性 を示さなかった（即ち、それらはＧＥＬ−およびＴＤＡ−である）。この細胞は また、ＡＰＩ−２０Ｅ試験片を用いたとき、それらは、いかなるベーターガラク トシターゼ、リジンデカルボキンラーゼまたはオルニチンデ力ルホキノラーゼ活 性を示さず（即ち、それらは、０ＮＰＧ−１ＬＤＣ−および０ＤＣ−である）、 そしてそれらは、ＡＰＩ−２０Ｅ試験片に従って、それらの単−Ｃ源としてクエ ン酸塩を使用しない（即ち、それらは、ＣＩＴ−である）。ＡＰＩ−２０Ｅ試験 片を用いたとき、この細胞は＋１２３もインドールも生成しない（即ち、それら はＨ２Ｓ−およびＩＮＤ−である）。このＢｔＰＧｓＩ３ｇ７株は、ＡＰＩ−２ ０Ｅ試験片を用いたとき、アルギニンデヒドロラーゼおよびウレアーゼ活性を示 しく即ち、これはＡＤＨ＋およびＩＪＲＥ＋である）、それはスキムミルク寒天 中でカゼインを急速に分解し、そしてそれは、５ｎｅａｔｈ他（１９８６）の操 作を用いてフェニルアラニンを弱く脱アミノ化した。

ＡＰＩ−５０Ｃ１ＩＢ試験片（ＡＰＩ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＳＡ）によって示される ような、異なる糖類からの２４時間後の酸生産を、以下の表１に列挙す。

表１＝他の公知のバチルス属との比較におけるＢｔＰＧＳＩ３８７株の酸生産（ 十＝酸生産ニー＝酸生産なし；Ｗ＝弱い反応）表　１＝　（続き） Ｂｔ　ｔｅｎｅ＝受は入れ番号２８０３の、ＤＳＭ＃ＡらのＢａｃｉｌｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　５ｕｂｓｐ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓｏ Ｂｔ　ｄａｒｍ＝受は入れ番号４４４７の、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　ｆｔ１ｒ　Ｌａ ｎｄｗｉｒｔｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ　ｕｎｄ　 Ｇａｒｕｎｇｓｂｉｏｌｏｇｉｅ　ｄｅｒ　ＥｉｄｇｅｎＱｓｓｉｓｃｈｅ　Ｔ ｅｃｈｎのＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　５ｕｂｓｐ、　ｄ ａｒｍｓｔａｄｉｅｎｓｉｓｏＢ、　ｃｅｒ＝受は入れ番号２０９８の、Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｕｍ　ｖｏｏｒ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅＳＧｈｅｎｔ。

Ｂｅｌｇｉｕｍ　（“ＬＮＧ”　）　からのＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓｏ Ｂ、　５ｕｂｔ＝受は入れ番号Ｎ′ＲＲＬ　Ｂ−２３７の、Ａｇ’ｒｉｃｕｌｔ ｒｕａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＳ　Ｐｅｏ ｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓＳ　ＵＳＡからのＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｂｔｉｌｉｓ ０異なる抗生物質に対する感受性を、オキソイド・イソセンシテスト（Ｏｘｏｉ ｄ　ｌ５ｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔ）寒天上のオキソイド・感受性試験盤（Ｏｘｏｉ ｄＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅ５ｔ　Ｄｉｓｃｓ）を用いて試験した（ Ｏｘｏｉｄ　Ｌｔｄ、の“ＣＭ４７２”　、Ｂａｓｉｎｇｔｏｋｅ、　Ｈａｍｐ ｓｈｉｒｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）　ｏその結果を以下の表２に示す。

表２：異なるバチルスを接種した寒天上で２４時間後観察される抑止領域の直径 （ｍｍ） ＢｔＰＧｓＩ３ｇ７株および他のバチルスの酵素スペクトルを以下の表３に示す 。表３中の結果は、拡張ＡＰＩ−ＺＹＭ試験片（ＡＰＩ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｓ、 　Ａ、　）を用いて得られた。エステラーゼ−、ペプチダーゼ−（Ａ円、ＡＰ２ 、ＡＰ３、ＡＰ４、ＡＰ５およびＡＰ５試験片）およびオシダーゼ試験片に、５ ０ｕ　Ｉ細胞懸濁液（１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を接種した。オンダーゼ反応の結果 が、２５ｕｌの０、１　Ｎ　ＮａＯＨを用いて４時間培養（２８℃）した後得ら れ、そして他の結果は、２５ｕ１のＺＹＭ　ＡおよびＺＹＭ　Ｂ試薬（ＡＰＩ番 号７０４８）を用いて得られた。表３にその結果のい（っかを示す。

表３二ＢｔＰＧＳＩ３８７株および他のバチルスの酵素スペクトルＢｔＳ１＝受 は入れ番号４２８８の、ＤＳＭからのバチルス・ツリンギエンシス表３中の酵素 スペクトルの意味 ０＝反応なし １＝非常に弱い反応（５ｎＭの基質加水分解）２＝弱い反応（１０ｎＭの基質加 水分解）３＝反応（２０ｎＭの基質加水分解） ４＝強い反応（３０ｎＭの基質加水分解）５＝非常に強い反応（＞４０　ｎＭの 基質加水分解）ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶は、密度勾配遠心分離によってＢｔＰＧ ＳＩ３８７株から単離された（ＨＯｆｔｅ他、１９８６）、二者択一的に、この 結晶は、ｐＨ１０の５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３および５ｍＭのジチオトレイトール （ＤＴＴ”）中の胞子結晶混合物から選択的に溶解させた後、この懸濁液を、孔 の直径が０、４５　ｕｍのフィルターを通して濾過することで得られる。

ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質の抗原性は、モノクローンおよびポリクローン抗 体に対して試験したとき、よく知られたＢｔ　ＨＤ−１２７株（Ｂｏｆｔｅ他、 １９８ｇ）、バッタイブＡトキンン（図１）からの結晶蛋白質のそれと同様であ り、そしてよく知られたＢｔ　１１１０−１　（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、１９８３ ）　、Ｂｔ　ｂｅｒｌｉｎｅｒ　（Ｉｌｏｆｔｅ他、１９８６）　、Ｂｔ　ｔｅ ｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよびＢｔ　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ　（Ｃｈｕｎｇｊａｔ ｕｐｏｒｎｃｈａｉ他、１９８８）株からの結晶蛋白質のそれとは異なる。Ｂｔ 株からの結晶蛋白質に対して用いられるポリクローンおよびモノクローン抗血清 は、ラビットおよびマウス中で上昇しくＨＯｆｔｅｅ、１９８８）　、そしてこ れらの抗血清の反応をＥＬＩＳＡ　（ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅ５ｃｅ、　１９ ７８）中で試験した。その結果を以下の表４に要約する。

表４：モノクローンおよびポリクローン抗体を用いた定量による、異なるＢｔ１ 株の溶解した結晶蛋白質のＥＬＩＳＡ抗　体 表４（続き） 抗体８２，１．２ｆ１７．５４１、ｌＢ１２．５Ｄ１１．４Ｆ１１および９Ｈ１ １は、Ｂｔ　ｂｅｒｌｉｎｅｒ結晶に対して上昇するモノクローン抗体である。

抗体２Ｄ１１．４Ｂ１０および４Ａ２は、Ｂｔ　ＨＤ−１２７の精製した６３　 ｋＤａ　トキシンに対して上昇するモノクローン抗体である。

抗体２Ａ１０はＢｔ　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓに対して上昇するモノクローン抗 体である。

抗体ＡＢｔ２は精製したＢｔ２　トキシンに対して上昇するポリクローン抗体で ある。

抗体ＡＢｔｔｅｎは精製したＢｔ　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）キノンに対して上 昇するポリクローン抗体である。

抗体ＡＢｔ１５は精製したＢｔ１５トキシンに対して上昇するポリクローン抗体 である。

ＢｔＰＧＳＩ３８７株からのトリプシン消化した結晶蛋白質のパターンをまた、 図１に示すように、Ｂｔ株ＨＤ−１２７およびＢｔＳｌからの結晶のパターンと 比較した。５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１０，５ｍＭのＤＴＴ中、結晶を一晩 ３７℃で溶解することによって、各々のＢｔ株からの結晶蛋白質をトリプシン消 化させた。トリプシンを加える前に（ｌｕｇ）リブシン／２５ｕｇ蛋白質）、０ ．５ＭのＨＣＩを加えることによってｐＨを９に調整した。

このトリプシン消化を行うことによって、ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶中に各々６３ ｋＤａおよび６０　ｋＤａの２種のトリプシンフラグメント（図１）が存在して いることが見いだされた。モノクローン抗体２Ｈ７［これは、マンヅカ・セクス タ（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ）およびヘリオチス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｓ ｐ、　）に対して毒性を示すタイプＡの蛋白質が存在していることを示す］およ びモノクローン抗体４Ｂ１０　［これは、シロナヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ 　ｓｐ、　）に対して毒性を示すタイプＣの蛋白質の存在を示すコを用いたイミ ュノブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）　（Ｐｅｆｅｒｏｅｎ、 　１９８８）は、このＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質が免疫学的にＢｔ　ＨＤ− １２７の結晶蛋白質に関係していることを明らかに示し、そしてＢｔＰＧＳＩ３ ８７結晶蛋白質中にタイプＡ　（６０ｋＤａ）およびタイプＣ（６３ｋＤａ）　 トキシンの両方が存在していることを立証した。

この結晶蛋白質を、Ｌａｍｂｅｒｔ他（１９８７）の操作に従うクマシーブリリ アントブルーＲ−２５０を用いて染色した１２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）上でも分析した。

ＥｃｏＲＩで消化させたＨＤ−１２７およびＢｔＰｃｓＩ３８７から単離した全 ＤＮＡのサザーンブロッティング分析を行った結果、プローブとして、ｂｔ１５ 遺伝子（ヨーロッパ特許出願８９／４０１４９９．２）からの６２０ｂｐ　Ｃ１ ａＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを用いると、異なる雑種形成パターンが見いださ れた。このことは明らかに、この２つの株が異なることを示している。

′　実施例２・ＢｔＰｃＳＩ３８７結晶の殺虫剤活性ＢｔＰＧｓＩ３８７株の予 備培養物を、２８℃で一晩、穏やかに振とう（２００ｒｐｍ）ｌ、た１００ｍＬ の遮断フラスコ中の１０ｍＬのＬＢ培地中で増殖させた。その後、１２５ｍＬの Ｔ３培地に、充分な量の該予備培養物を接種して、光学密度が１２５の培養物を 得た。次に、この培養物を、１リツトルの遮断フラスコ中、穏やかに撹拌しなが ら（１２０ｒｐｍ）２８℃で２４時間増殖させた。胞子形成後、Ｄｕｌｍａｇｅ （１９８１）の方法に従って、胞子−結晶混合物を遠心分離で回収した後、アセ トンで乾燥した。この胞子−結晶混合物を水中に懸濁し、そしてこの懸濁液を人 工栄養物の表面上に塗布した後、２時間乾燥させた。

このＢｔＰＧＳＩ３８７胞子−結晶混合物を含有している塗布物の殺虫剤活性を 、りんし目の幼虫に対して評価した。この幼虫を、ＢｔＰＧＳＩ３８７胞子−結 晶混合物を塗布した該人工栄養物上、および他のＢｔ胞子−結晶混合物を含有し ている水系懸濁液を塗布した人工栄養物上に置いた。このＢｔＰＧＳＩ３８７結 晶のＬＣ５０は、試験した他のＢｔ胞子−結晶混合物のＬＣ５０よりも有意に低 かった。この結果を以下の表５に要約する。

表５．スボドブテラ・リトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　１ｉｔｔｏｒａｌｉ ｓ）およびヘリオチス・ビレセンス（［Ｉｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎ ｓ）の幼虫に対するＢｔＰＧＳＩ３８７、Ｂｔ　ＨＤ−１２７およびＢｔ　ＨＤ −１株からの胞子−結晶混合物の毒性 Ｓ、　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓに対する活性Ｈ，ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに対する活性 ＢｔＰＧＳＩ　３８７胞子−結晶混合物のＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質は、数 時間後、幼虫に対して食べることを停止させ、そして数日内に死滅させ、この死 亡率は該人工栄養物上の結晶蛋白質の濃度関数であった。幼虫によって食物摂取 されたとき、この虫の牛腸のアルカリ条件でこの結晶が溶解し、そして個々のＢ ｔＰＧＳＩ３８７ブロトキシンが放出された。これらのプロトキシンは、虫の牛 腸プロテアーゼによって蛋白分解的に処理されて、ＢｔＰＧ５Ｉ３８７　）キシ ンを生じた。

実施例３　：　ＢｔＰＧＳＩ３８７株のエレクトロポレーションこの株の殺虫剤 スペクトルを増大させるため、以下に示すように、プラスミドｐＷＰ３７１３を 用いてエレクトロポレーションする。ｐＷＰ３７１３は、図２に示されるプラス ミドｐＷＰ３７から誘導される。ｐＷＰ３７１３は、甲虫目、特にコロラドじゃ がいも甲虫（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｂｅｅｔｌｅ）に対して殺虫剤 活性を有する結晶プロトキシンをコード化するｂｔ１３遺伝子（ヨーロッパ特許 出願８８／４０２１１５．５）を含有している。ｐＷＰ３７は、ＥｃｏＲＩ／ウ シのアルカリ性ホスファターゼ（“ＲＡＰ”）処理したｐＧＫＶ２プラスミド（ ｖａｎ　ｄｅｒＶｏｓｓｅｎ他、１９８５）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ部位中に、 ｐＬＫ３７からのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩポリリンカーフラグメント（Ｂｏｔｔｅ ｒｍａｎおよびＺａｂｅａｕ、　１９８７）を挿入することによって作られる。

このｂｔ１３遺伝子を、ＢＡＰ処理したｐＷＰ３７の［１ｉｎｄＩＩＩ制限部位 中にクローン化して、ｐＷＰ３７１３を生じさせる。

エレクトロポレーション操作 １、８ｔＰＧＩ３８７株の新鮮な培養物（ＬＢプレート上）から、１８０ｒｐｍ で振とうしている１００ｍＬの三角フラスコ中に３７℃で一晩、２０ｍＬのＴＬ Ｂ　（トリプトン２％；酵母１％；ＮａＣ１２％；ｐＨ７，３）を接種する。

２、段階１からの予備培養物４ｍＬを４００ｍＬの予め温めたＴＬＢ（２リット ルのフラスコ中）に接種した後、１８０ｒｐｍで振とうしながら３時間半〜４時 間３７°Ｃで培養する。

３、Ｇ５３０−ターを用いて、４℃で１０分間、１０．００Ｏｒ　ｐ　ｍて細胞 を遠心分離する。

４、このペレットを２００ｍＬの無菌蒸留水中に懸濁させた後、段階３と同様に して遠心分離する。

５、このペレットを３０ｍＬの無菌蒸留水中に懸濁させ、この細胞を予め重量を 計っておいた試験管に移し、そして５３４０一ター中４℃で１０分間、１０．０ ００　ｒ　ｐ　ｍで遠心分離する。

６　上澄み液を廃棄し、３０％のポリエチレングリコール１０００溶液（Ｍｅｒ ｃｋ　５ｃｈｕｃｈａｒｄｔ、　Ｍｕｎｉｃｈ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｐｕｂ ｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ）中に細胞ペレットを回収したが、この容積（ｍ Ｌ）は該細胞ペレット重量（ダラム）の５倍に相当する。

７、　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で、段階６からの１００ｕ　１のバクテリア細胞 を、水中もしくはトリス１０ｍＭ　ｐＨ７，５およびＥＤＴＡ　ｌ　ｍＭ中のＤ ＮＡ溶液１０ｕ　ｌと混合し；エレクトロポレーションを行うまでこの管を氷上 で保存する。

８、この細胞懸濁液を、Ｂｉｏｒａｄ　Ｐｕ１ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒに連 結したＢｉｏＲａｄＧｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　（Ｂｉｏｒａｄ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎｏ、　１４１４１Ｊａｒｂｏｒ　Ｗａｙ、　ＳｏｕｔｈＲ ｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ　９４８０４　ＵＳＡ）のエレクトロポレーション用キ ュベツト（幅２ｍｍ）に移し；　２５ｕＦの電気容量を用いそして該コントロー ラーを４００　０ｈｍｓにセットして、１０００〜１４００ボルトの範囲の単一 電気パルスを与える。

９．１．９ｍＬのＬＢ培地（希釈度１／２０）を用いて、このエレクトロポレー ションした細胞を回収した後、１５ｍＬの無菌プラスチック管に移す。

１０　ロータリー振とう機上、３７℃で９０分間培養する。

１１、エリスロマイ／ンを含有しているＬＢ−寒天皿上にこの形質転換した（エ リスロマイシン耐性）細胞をプレートアウトさせる。

１２．３７°Ｃで一晩培養する。

このエレクトロポレーション操作を用いると、１０２〜１０４の形質転換体／ｕ ｇＤＮＡの形質転換効率を得ることができる。しかしながら、他のプラスミド類 、例えばｐｃ１９４　（Ｍａｈｉ１１ｏｎ！、１９８９）もまた、上記エレクト ロポレーション操作で適切に使用され得る。

ｐｆＰ３７１３で形質転換したＢｔＰＧＳＩ３８７株は、りんし目および甲虫目 に対して殺虫剤活性を有する。この形質転換したＢｔＰＧＳＩ３８７株またはそ のプロトキシンおよび／またはトキシンの混合物は、従って、りんし目および甲 虫目昆虫有害生物に対する殺虫剤組成物中の活性材料として使用され得る。更に 、ｐＷＰ３７中に、ＢｔＰＧＳＩ３８７株の染色体のＤＮＡ、或はＢｔＰＧＳＩ ３ｇ７株のプラスミドＤＮＡと相同性を示すフランキング配列が存在しているた め、相同組換えを可能にし、結果として染色体挿入体、或は宿主プラスミド中の 挿入体として新規な遺伝子を有する形質転換されたＢｔ株を生じさせる。

言うに及ばず、本発明は、受は入れ番号４７８３としてＤＳＭに寄託されている ＢｔＰＧＳＩ３８７株に限定されるものではない。むしろ、本発明にはまた、該 ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶蛋白質、プロトキシンまたはトキシンと同じ性質を本質 的に有している結晶蛋白質、プロトキシンまたはトキシンを生産するＢｔＰＧＳ Ｉ３８７株のいかなる突然変異株または変異体も含まれる。これに関して、Ｂｔ ＰＧＳｒ３８７株の変異体には、１）グリセロール基質上で酸生産および／また は２）マンノースおよびサッカロース基質上で酸生産を行う変異体が含まれる。

これに関連してまた、ＢｔＰＧＳＩ３８７株の変異体にはまた、図１に示される ように、トリプシン処理された結晶蛋白質のパターンがＢｔＰＧＳＩ３８７株の それとは若干具なる変異体も含まれる。

参照 １、Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ、Ｊ、およびＺａｂｅａｕ、　Ｍ、、ＤＮＡ６．５８３ −５９１　（１９８７）。

２　、Ｃｈａｓｓｙ　Ｂ、　Ｍ、　、Ｍｅｒｃｅｎｊｅｒ　Ａ、およびＦｌｉｃ ｋｉｎｇｅｒ　Ｊ、、Ｔｒｅｎｄｓｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．３ ０３−３０９　（１９８８）。

３、Ｃｈｕｎｇｊａｔｕｐｏｒｎｃｈａｉ、Ｗ、、Ｈｏｆｔｅ、　ＨｌＳｅｕｒ ｉｎｃｋ、　Ｊ、、Ａｎｇｓａｔｈａｎｏｓｏｍｂａｔ、　ＣおよびＶａｅｃｋ 、　Ｍ、、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３．９−１６１９８８）。

４、Ｄｅｂｌａｅｒｅ、Ｒ，、Ｂｉｊｔｅｂｉｅｒ、　Ｂ、、Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ 、　Ｈ，、Ｄｅｂｏｃｋ、　Ｆ、、５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａ ｇｕ、　ＭおよびＬｅｅｍａｎｓ、　Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　１３．４７７７−４７８８　（１９８５）。

５、Ｄｕｌｍａｇｅ、Ｈ，Ｔ著、「昆虫の生物学的制御のためのバクテリア製造 」　（“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌ、 ｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔｓ＋j ；　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　Ｃｒｏｐ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎＳＰａｐａｒｉｚａｓ、Ｄ、Ｃ，編集、Ｏｓｍｕｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｓ、　ＴｏｔｏｗａＳＮ、　Ｊ、　、　ＵＳＡ、　１２９−１４１頁（１９８１ ）。

６、Ｅｌｌａｒ、Ｄ、Ｊ、、Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｂ、Ｈ，、Ｄｒｏｂｎｉｅｗｓｋ ｉ、　Ｓ、Ａ、およびＲａ１ｄｅｒ、　Ｍ、Ｚ、著「無を推動物の病理学に関す る基礎および応用的観点」　（“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉ ｅｄ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ”　）　Ｓａ■ ｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、、Ｖｌａｋ、　Ｊ」、およびＰｅｔｅｒｓ、　Ｄ、編集（１ ９８６）　７−１０頁。Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＣＣｏ１１ｏｑｕｉ　 ｏｆ　Ｉｎｖｅｒ■ ｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ。

７、ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅ５ｃｅ、　５ｃａｎｄ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５ ｕｐｐ１．７、（１９７８）。

８、Ｇｉｅｌｅｎ、　Ｊ、、　Ｄｅ　Ｂｅｕｋｅｌｅｅｒ、　Ｍ、、５ｅｕｒｉ ｎｃｋ、Ｊ、、Ｄｅｂｏｅｃｋ、　Ｆ、、Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ、　Ｈ，、Ｌｅｍｍ ｅｒｓ、　Ｍ、、　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍおよび５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、 、ＥＭＢＯＪ３．８３５−８４５　（１９８４）。

９．　Ｈｏｆｔｅ、ｎ、、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　ｔｈｅｓｉｓ　ａｔ　ｔ ｈｅ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｇｈｅｎｔ、　Ｂｅｌｇｉｕｍ 、　（１９８８）。

１０、Ｈｏｆｔｅ、　Ｆｉ、、Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ、　ＦＪ、、５ｅｕｒｉｎｃｋ 、　Ｊ、、Ｊａｎｓｅｎｓ、　Ｓｏ、Ｍａａｇｕ、　ＬＺａｂｅａｕ、　Ｍ、お よびＶａｅｃｋ、　Ｍ、、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６１．２７３ −２８０　（１９８６）。

１１、ＢＯｆｔｅ　Ｈ，およびｆｈｉｔｅｌｅｙ　Ｈ，Ｒ，、Ｍｉｃｒｏｂｉｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ。

５３．２４２−２５５　（１９８９）。

１２、ＨＯｆｔｅ、　［１，、Ｖａｎ　Ｒｉｅ、　Ｊ、、Ｊａｎｓｅｎｓ、　Ｓ ｏ、Ｖａｎ　Ｈｏｕｔｖｅｎ、　Ａ、、Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ、　Ｈ，およびＶ ａｅｃｋ、　Ｍ、　、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｒ＋ｍｅｎｔａ ｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ　５４．２０１０−２０１７　（１９８８）。

１３、）ｌａｎｃｅ、Ｇ、、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｓａｌｍ、　Ｔ、およびＶｉｓｓ ｅｒ、Ｂ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６．６２４０　 （１９８８）。

１４、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｖ、、Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５　（１ ９７０）。

１５、Ｌａｍｂｅｒｔ、　Ｂ、、Ｌｅｙｎｓ、　Ｆ、、Ｖａｎ　Ｒｏｏｙｅｎ、 　Ｌ、、Ｇｏｓｓｅｌｇ、　Ｆ、、Ｐａｐｏｎ、　Ｙ、およびＳｗｉｎｇｓ、　 Ｊ、、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ。

ｇｙ　５３．１８６６−１８７１　（１９８７）。

１５、Ｍａｈｉｌｌｏｎ　Ｊ、、Ｃｈｕｎｇｊａｔｕｐｏｒｎｃｈａｉ　Ｗ、、 Ｄｅｃｏｃｋ　Ｊ、、ＤｉｅｒｉｃｋｘＳｏ、Ｍｉｃｈｉｅｌｓ　Ｆ、　、　Ｐ ｅｆｅｒｏｅｎ　Ｍ、およびＪｏｏｓ　Ｈ，、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　６０．２０５−２１０　（１９８９）。

ｌ　７　、Ｍａｈｉｌｌｏｎ　ＪおよびＤｅｌｃｏｕｒ　Ｊ、、Ｊ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３．６９−７３　（１９８４）。

１８、Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、およびＧ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、　、　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５．４９９−５６０　（１９８０）。

１９、　０ｄｅ１１．Ｊ、Ｔ、、Ｎａｇｙ、　Ｊ、およびＣｈｕａ、　ＮＸＮａ ｔｕｒｅ　３１３．８１０−８１２　（１９８４）。

２０、Ｐｅｆｅｒｏｅｎ、　Ｍ著、「分子生物学における方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、３巻：　Ｎｅｗ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　３９５−４０２頁、ＪｏｈｎＭ、編集、１ ｌａｌｋｅｒ、　Ｂｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８８）。

２１　、　３ｎｅａｔｈ、　Ｐ、、Ｍａｉｒ、　Ｎ、、５ｈａｒｐｅ、　Ｍ、お よび！Ｊａｌｔ、　Ｊ、、（１９８６）著、Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ 　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　２巻、１１０４ −１１３９頁、ＶｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編集、Ｂａｌｔｉｍｏｒ ｅＳＬｏｎｄｏｎ０２２、Ｔｒａｖｅｒｓ、　Ｒ，Ｓ、、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｂ、 Ａ、Ｗ、およびＲｅ１ｃｈｅｌｄｅｒｆｅｒ、　Ｃ，Ｆ。

著、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｒ＋ｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ　５３．１２６３−１２６６　（１９８７）。

２３、Ｖａｅｃｋ、　Ｍ、、Ｒｅｙｎａｅｒｔｓ、　Ａ、、ＨＯｆｔｅ、　Ｈ， 、Ｊａｎｓｅｎｓ、　Ｓ、、ＤｅＢｅｕｃｋｅｌｅｅｒ、　Ｍ、、Ｄｅａｎ、　 Ｃ，、Ｚａｂｅａｕ、　Ｍ、、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、およびＬｅｅｍ ａｎｓ、　Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２７．３３−３７　（１９８７）。

２４、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｏｓｓｅｎ、　Ｊ、、Ｋｏｋ、　Ｊ、およびＶｅｅｎ ｅｍａ、　Ｇ、、ＡＩ）ｐｌｉｅｄａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｉｌ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５０．５４０−５４２　（１９８５）。

２５、Ｖｅｌｔｅｎ、　Ｊ、、Ｖｅｌｔｅｎ、　Ｌ、、Ｈａｉｎ、　Ｒ，および ５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、ＥＭＢＯＪ３．２７２３−２７３０　（１９８４）。

２６、Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｒｒａ、　Ｊ、および Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、Ｇｅｎｅ３３．１０３−１１９　（１９８５）。

２７、　Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｔ、、Ｇａｒｃｉａ、　Ｊ、Ａ、およびＤｕｌｍ ａｇｅ、　ＨＡＴＳＪ、　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏｌ、　４１．１２ ２−１３０　（１９８３）。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年６月１１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＢｔＰＧＳＩ３８７株、詳細には純粋な形状の、更に詳細には９０．０〜９ ９．９％純度のＢｔＰＧＳＩ３８７細胞。 ２．ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶、或はＢｔＰＧＳＩ３８７結晶の第一および第二Ｂ ｔＰＧＳＩ３８７プロトキシン類またはトキシン類の混合物、詳細には第一およ び第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシン類の混合物。 ３．ＢｔＰＧＳＩ３８７株、ＢｔＰＧＳＩ３８７結晶、或は第一および第二Ｂｔ ＰＧＳＩ３８７プロトキシン類またはトキシン類の混合物から成る群から選択さ れる活性成分を含む、詳細にはりんし目に対する、殺虫剤組成物。 ４．請求の範囲３の殺虫剤組成物に有害生物を接触させることを特徴とする、昆 虫有害生物、特にりんし目、詳細にはノクツイダエ（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、ゲ レチイダエ（Ｇｅｌｅｃｈｉｉｄａｅ）およびピラリダエ（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ ）、より詳細にはシロナヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｓｐ．）、ヘリオチス（ Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｓｐ．）、ヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓｓｐ．）、オストリニア・ ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ジアトラエア・グランジ オセラ（Ｄｉａｔｒａｅａｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、フトリマエア・オベル クレラ（Ｐｈｔｈｏｒｍａｅａｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ）およびペクチノフォラ 。ゴシピエラ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）を制御する ための方法。 ５．クローン化ベクター中に組み込まれた他からのＤＮＡを用いてＢｔＰＧＳＩ ３８７株をエレクトロポレーションすることを特徴とする、Ｂｔプロトキシンま たはトキシンをコード化する他からのＤＮＡ配列を有するＢｔＰＧＳＯＩ３８７ 株を形質転換するための方法。 ６．請求の範囲５の方法により製造される形質転換されたＢｔＰＧＳＩ３８７株 。 ７．請求の範囲６の該形質転換ＢｔＰＧＳＩ３８７株または該形質転換ＢｔＰＧ ＳＩ３８７株により生産される結晶または結晶蛋白質を含む殺虫剤組成物。 ８．ＢｔＰＧＳＩ３８７株を培養した後、任意にこのＢｔＰＧＳＩ３８７結晶を 単離しそして精製した後、任意にこのＢｔＰＧＳＩ３８７結晶からの第一および 第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシン類または第一および／または第二ＢｔＰＧ ＳＩ３８７プロトキシン類の混合物を単離しそして精製した後、任意に該第一お よび／または第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシン類をトリプシン消化させて、 第一および／または第二ＢｔＰＧＳＩ３８７トキシン類を生じさせることを特徴 とする、請求の範囲２のＢｔＰＧＳＩ３８７結晶、或は第一および第二ＢｔＰＧ ＳＩ３８７プロトキシン類またはトキシン類の混合物、或は第一および／または 第二ＢｔＰＧＳＩ３８７プロトキシン類またはトキシン類の製造方法。