RU2138950C1 - Мутантный штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis dsm 5480 - продуцент дельта-эндотоксина, способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина, пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми, способ получения мутантных штаммов бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis - продуцентов дельта-эндотоксина - Google Patents
Мутантный штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis dsm 5480 - продуцент дельта-эндотоксина, способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина, пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми, способ получения мутантных штаммов бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis - продуцентов дельта-эндотоксина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2138950C1 RU2138950C1 SU5052261A SU5052261A RU2138950C1 RU 2138950 C1 RU2138950 C1 RU 2138950C1 SU 5052261 A SU5052261 A SU 5052261A SU 5052261 A SU5052261 A SU 5052261A RU 2138950 C1 RU2138950 C1 RU 2138950C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- endotoxin
- delta
- bacillus thuringiensis
- strain
- dsm
- Prior art date
Links
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims abstract description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 title description 3
- 241000193369 Bacillus thuringiensis serovar tenebrionis Species 0.000 claims abstract description 41
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 4
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013587 production medium Substances 0.000 claims description 4
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 claims 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 17
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 17
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 16
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 241000193367 Bacillus thuringiensis serovar san diego Species 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000001350 scanning transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193363 Bacillus thuringiensis serovar aizawai Species 0.000 description 2
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 2
- 241001124134 Chrysomelidae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529716 Entomophaga Species 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 1
- 241000254107 Tenebrionidae Species 0.000 description 1
- 241000145122 Tridens <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical class 0.000 description 1
- 235000012216 bentonite Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000010246 ultrastructural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам биологической борьбы с вредными насекомыми. Получен новый штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, продуцирующий 3282-4169 ВТТ US/г дельта-эндотоксина. Штамм получают путем облучения γ-излучением родительского штамма Bacillus thuringiensis DSM 2830, выращивания на среде, способствующей получению аспорогенных или олигоспорогенных мутантов, с последующим отбором полученных полупрозрачных колоний и пересевом их на среду, не содержащую летучих компонентов. Вновь полученные клетки выдерживают при 90oC в течение часа, затем их инкубируют при 30oС до получения аспорогенных колоний. Из них отбирают бактерии, засевают в производственную среду. Затем отбирают бактерии, продуцирующие максимальное количество дельта-эндотоксина. На основе полученного дельта-эндотоксина готовят композиции для борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Изобретение позволяет увеличить выход дельта-эндотоксина в 2-3 раза по сравнению с родительским штаммом и повысить эффективность в борьбе с сельскохозяйственными насекомыми. 6 с. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл.
Description
Коммерческие препараты Bacillus thuringiensis широко используются во всем мире как биологическое средство борьбы с вредными насекомыми. Достоинствами этих бактериальных инсектицидов является их высокая селективность по отношению к очень узкому кругу насекомых-мишеней и биологическая разлагаемость.
Коммерческие препараты Bacillus thuringiensis могут использоваться вплоть до сбора урожая, не оказывая при этом вредного действия. Bacillus thuringiensis представляют собой палочкообразные аэробные спорообразующие бактерии, уникальная особенность которых состоит в том, что в процессе споруляции они продуцируют одно или более включений, так называемых параспоральных кристаллов. Эти кристаллы состоят из высокомолекулярных белков, называемых дельта-эндотоксинами. Эти дельта-эндотоксины являются активным компонентом выпускаемых коммерческих препаратов Bacillus thuringiensis.
Идентифицировано большое количество штаммов Bacillus thuringiensis с различным спектром насекомых хозяев. По своим флагеллярным антигенам они разделяются на различные подвиды. Особый интерес представляют подвиды Bacillus thuringiensis kurstaki и aizawai, israelensis и tenebrionis, использующиеся для контроля соответственно чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых вредных насекомых.
Впервые сообщение о выделении токсичных по отношению к жесткокрылым Bacillus thuringiensis было опубликовано в 1983 году (A.Krieg и др., Z. and Ent. 96, 500 - 508, европейский патент EP 0149162 A2).
Этот изолят под названием Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов под номером DSM 2803. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis был выделен в 1982 году из мертвой куколки мучного червя Tenebrio molitor (Tenebrionidae, Coleoptera). Этот штамм продуцирует в каждой клетке одну спору и один или более инсектицидных параспоральных кристаллов, имеющих форму плоских пластин с кромкой длиной примерно 0,8 - 1,5 мкм. Он относится к серотипу H8a, 8b и прототипу C Bacillus thuringiensis (Krieg и др. , System. Appl. Microbiol. 9, 138-141, 1987, патент США 4766203, 1988).
Он токсичен только по отношению к некоторым питающимся листьями личинками жуков (chrysomelidae), но не оказывает действия на гусениц (Lepidoptera), комаров (Diptera) и других насекомых.
Было показано, что Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis позволяет эффективно контролировать личинок колорадского жука. После поглощения кристаллов и спор, продуцируемых Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, или выделенных кристаллов личинки и до некоторой степени взрослые особи колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) перестают есть. Личинки на стадии развития L1-L3 погибают в течение 1 - 3 дней (Schnetter и др., в Fundamental & applied aspects of invertebrate pathology, под редакцией R.A.Samson и др., Proceeding of the 4th Int. colloguium of Invertebrate Pathology, стр. 555, 1986).
Недавно было обнаружено, что помимо кристаллов, активных по отношению к жесткокрылым, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis продуцирует и другие параспоральные кристаллы, палочкообразной, сфероидальной или пластинчатой формы (A. M. Huger и A.Krieg, J. Appl. Ent. 108, 490-497, 1989). Активность этих вторых кристаллов пока не изучена.
На основе Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis были разработаны четыре коммерческих продукта для контроля жесткокрылых вредных насекомых: NOVOPOR® (фирма Novo Nordis k A/s). TRIDENT® (фирма Sandor), Di Terra® (фирма Abbott Laboratories Inc.) и Foil® (фирма Ecogen).
В 1986 году было опубликовано сообщение о выделении другого токсичного для жесткокрылых насекомых штамма Bacillus thuringiensis (Hernnstadt и др., Bio/Technology, т. 4, 305-308, 1986, патент США 4764372, 1988). Этот штамм под названием "Bacillus thuringiensis subsp. sorn diego", M7, депонирован в Northern Regional Researeh Laborotory, США под номером NRRL B-15939. На его основе фирмой Mycogen Corp. выпущен коммерческий продукт.
Сравнительные исследования Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 2803, и Bacillus thuringiensis subsp. san diego", NRRL-B15939, включавшие фенотипическую характеристику вегетативных клеток, характеристику токсического параспорального кристалла и анализ плазмида ДНК, показали однако, что "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" фактически идентичен ранее выделенному штамму DSM 2803, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg и др. , J. Appl. Ent. 104, 417-424, 1987). Кроме того, нуклеотидные последовательности и производные аминокислотные последовательности активных по отношению к жесткокрылым дельта-эндотоксинных генов Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis и "Bacillus thuringiensis suhsp. san diego" также идентичны.
В тех же самых условиях вышеупомянутые кристаллы второго типа "Bacillus thuringiensis suhsp. san diego" (A.M. Huoger & A. Krieg, J. Appl. Ent 108. 490-497, 1989).
Согласно H. de Barjac & E. Frachon (Entomophaga 35 (2), 233-240, 1990) изолят "Sandiego" аналогичен "tenebrionis", и поэтому нет оснований рассматривать их как различные подвиды.
Возможность использования штаммов Bacillus thuringiensis для контроля жесткокрылых вредных насекомых зависит от эффективности и экономичности способа получения активных по отношению к жесткокрылым токсинов и активности получаемого продукта. Последняя в свою очередь зависит от количества дельта-эндотоксинов, которые могут быть получены путем ферментации активных по отношению к жесткокрылым штаммов Bacillus thuringiensis.
B. thurihgiensis уже давно используются для получения инсектицидов. Однако, хотя предпочтительным было бы использование мутантов B. thuringiensis с более высоким выходом дельта-эндотоксинов, однако такие мутанты не были описаны. Мутанты, продуцирующие дельта-эндотоксины с более высоким выходом, позволили бы разработать более экономичные и эффективные способы получения токсинов B. thuringiensis и дали бы возможность получать продукты B. thuringiensis такой же стоимости, но с более высокой активностью. Последнее, в свою очередь, было бы целесообразно и для потребителя с точки зрения хранения и использования меньших количеств пестицидных композиций для обработки определенных площадей. Кроме того, в этом случае потребителю понадобится меньшее количество контейнеров для хранения таких композиций, что ослабит воздействие их на окружающую среду.
В литературе отсутствует описание усовершенствования способов получения дельта-эндотоксинов с помощью Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis путем мутации.
Одна из проблем использования для контроля личинок жуков в частности B. thuringiensis subsp. tehebrinis связана со сравнительно низкой активностью этих композиций, что требует применения довольно больших количеств их для обработки определенных площадей, а именно 5 - 10 л/га по сравнению с 1 - 2 л/га большинства других продуктов B. thuringiensis и других инсектицидов.
Отсюда следует необходимость получения продуктов с более высокой активностью.
Одним из путей решения этой проблемы является получение более концентрированных препаратов. Это однако привело бы к удорожанию их производства, которое не компенсировалось бы экономией при хранении и транспортировке.
Более изящным решением было бы создание мутантов существующих штаммов B. thuringiensis, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов на клетку.
Краткое описание сущности изобретения.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к вариантным или мутантным штаммам Bacillus thuringiensis, способным продуцировать значительно большие количества токсинов, чем родительский штамм.
Настоящее изобретение относится также к таким обладающим высокой продуцирующей способностью варианты или мутантам B. thuringiensis, относящимся к подвидам tenebrionis.
Предметом настоящего изобретения являются также использование таких вариантов или мутантов штаммов Bacillus thuringiensis для получения пестицидных продуктов и пестицидные композиции, включающие в качестве активного компонента дельта-эндотоксины, продуцированные вариантом или мутантом штаммов Bacullus thuringiensis в соответствии с изобретением.
Предметом настоящего изобретения далее является способ контроля вредных насекомых путем обработки заявляемыми композициями площадей с подлежащими контролю вредными насекомыми, чувствительными к содержащимися в композициях дельта-токсинам.
Предметом настоящего изобретения являются, кроме того, способы селекции или мутации и селекции штаммов B. thuringiensis для получения их вариантов или мутантов, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов, чем их родительский штамм.
Депонирование микроорганизмов
В целях подробного описания настоящего изобретения мутант Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, продуцирующий большие количества дельта-эндотоксина, был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Mascheroderueglb, D-3300 Braunschulig, Федеративная Республика Германия. Это было сделано в целях патентования на указанную ниже дату. DSM, будучи международным депозитарием в соответствии с Будапештским договором, обеспечивает постоянство депонированных микроорганизмов в соответствии с параграфом 9 указанного договора.
В целях подробного описания настоящего изобретения мутант Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, продуцирующий большие количества дельта-эндотоксина, был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Mascheroderueglb, D-3300 Braunschulig, Федеративная Республика Германия. Это было сделано в целях патентования на указанную ниже дату. DSM, будучи международным депозитарием в соответствии с Будапештским договором, обеспечивает постоянство депонированных микроорганизмов в соответствии с параграфом 9 указанного договора.
Дата депонирования - 10 августа 1989 года
Регистрационный номер депозитора - NB 176-1
Обозначение в DSM - DSM 5480
Мутант DSM 5480 был получен путем мутации штамма Basillus thuringiensis subsp. tehibrionis DSM 5526, который также был депонирован в соответствии с Будапештским договором в нижеуказанный срок под нижеуказанным номером.
Регистрационный номер депозитора - NB 176-1
Обозначение в DSM - DSM 5480
Мутант DSM 5480 был получен путем мутации штамма Basillus thuringiensis subsp. tehibrionis DSM 5526, который также был депонирован в соответствии с Будапештским договором в нижеуказанный срок под нижеуказанным номером.
Дата депонирования - 14 сентября 1989 года
Регистрационный номер депозитора - NB 125
Обозначение в DSM - DSM 5526
Подробное описание изобретения
Предметом настоящего изобретения являются варианты или мутанты Bacillus thuringiensis, продуцирующие активные дельта-эндотоксины в значительно больших количествах по сравнению с их родительским штаммом.
Регистрационный номер депозитора - NB 125
Обозначение в DSM - DSM 5526
Подробное описание изобретения
Предметом настоящего изобретения являются варианты или мутанты Bacillus thuringiensis, продуцирующие активные дельта-эндотоксины в значительно больших количествах по сравнению с их родительским штаммом.
Под выражением "в значительно больших количествах" в данном описании имеется в виду по меньшей мере в два или большее число раз больших количествах.
И в случае вышеуказанного предмета изобретения в его общем аспекте, и в случае более конкретных его аспектов, о которых будет сказано ниже, дельта-эндотоксины, продуцируемые мутантом B. thuringiensis, активны по отношению к тем же вредным насекомым, что и дельта-эндотоксины, продуцируемые их родительским штаммом, а именно к чешуекрылым (мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. kurstaki и subsp. aizawai), двукрылым (мутанты штамма B. thuringiensis subsp. inraelensis) или жесткокрылым (мутанты штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionis).
Одним из предметов настоящего изобретения является штамм B. thuringiensis, относящийся к подвиду tenibrionis. Продуцируемый им дельта-эндотоксин обладает активностью по отношению к жесткокрылым.
В этом плане по предпочтительному варианту осуществления изобретения вариант или мутант штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionis способны продуцировать более чем в три раза большее количество дельта-эндотоксина по сравнению со штаммом DSM 2803.
В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретения включает варианты или мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis, способные продуцировать параспоральный кристалл с длиной кромки 2 или более мкм.
Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение включает варианты или мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis с частотой споруляции в 10-100 или даже в 106 раз меньше частоты споруляции родительского штамма DSM 2803.
В частности, настоящее изобретение относится к депонированному штамму B. thuringiensis subsp. tenebrionsis DSM 5480.
В процессе работы над настоящим изобретением был выделен мутант штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionsis (DSM 5480), продуцирующий в два с лишним раза большее количество дельта-эндотоксина, чем его родительский штамм (DSM 5526). Данные фазоконтрастной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии свидетельствуют о том, что высокая продуцирующая способность этого мутанта связана с изменениями регуляции продуцирования дельта-эндотоксина по сравнению со споруляцией, следствием чего является продуцирование кристаллов белка более чем в пять раз крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными штаммами Bacillus thuringiensis, активными по отношению к жесткокрылым. По-видимому, в данном случае пропадает тесная связь между образованием кристаллов и споруляцией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до начала споруляции.
Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предметом его является использование заявляемых вариантов или мутантом штаммов для получения инсектицидных препаратов на основе B.thuringiеnsis. В соответствии с предлагаемым способом вариант или мутант штамма B. thuringiensis выращивают в подходящей культуральной среде, включающей источники углерода, азота и другие компоненты, известные специалисту в данной области, в течение определенного времени, после чего из среды извлекают образующиеся дельта-эндотоксины.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения полученные вышеописанным образом дельта-эндотоксины B. thuringiensis используют в качестве активного компонента пестицидных композиций.
В таких композициях дельта-эндотоксины в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться как сами по себе, так и в комбинации с другими обладающими биоцидной активностью продуктами.
Настоящее изобретение относится далее к таким пестицидным композициям или препаратам, включающим дельта-эндотоксин в соответствии с настоящим изобретением в смеси с приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства разбавителями или носителями.
Предметом настоящего изобретения, кроме того, являются такие пестицидные композиции или препараты, включающие дельта-эндотоксин B. thuringiensis, в жидкой форме с активностью не менее 15000 BTTU/г, что соответствует концентрации инсектицидного по отношению к жесткокрылым кристаллического белка как минимум 3 весов.%, или в твердой форме с активностью не менее 50000 BTTU/г, что соответствует концентрации инсектицидного по отношению к жесткокрылым кристаллического белка как минимум 10 весов.%.
Предметом настоящего изобретения, в частности, являются пестицидные композиции на основе DSM 5480, имеющие по меньшей мере вдвое большую активность по сравнению с пестицидными композициями на основе DSM 2803 или других активных по отношению к жесткокрылым штаммов Btt.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены в любой форме, используемой при получении агрохимикатов, например, в форме суспензии, дисперсии, водной эмульсии, порошка для опыливания, диспергируемого порошка, концентрата эмульсии или гранулята. Кроме того, они могут выпускаться в виде препаратов, готовых для непосредственного употребления, или в виде концентратов или первичных композиций, которые перед употреблением необходимо разбавлять определенным количеством воды или другого разбавителя.
Концентрация обладающих инсектицидной активностью дельта-эндотоксинов B. thuringiensis в композициях в соответствии с настоящим изобретением при использовании их индивидуально или в комбинации с другими пестицидами для обработки растений предпочтительно находится в пределах от примерно 0,5 до примерно 25, наиболее предпочтительно 1-15 весов.%.
Предметом настоящего изобретения является также способ контроля вредных насекомых, по которому зараженные такими насекомыми площади обрабатывают пестицидной композицией в соответствии с изобретением.
Указанными вредными насекомыми, в частности, являются насекомые, относящиеся к группе чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых, предпочтительно к жесткокрылым, таким как колорадский жук.
По предпочтительному варианту осуществления изобретения контроль вредных насекомых может осуществляться путем обработки площадей жидкими (из расчета 1,14 л/0,4 га) или твердыми (из расчета 227 г/0,.4 га) пестицидными композициями.
Активные препараты или композиции B. thuringiensis в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться непосредственно для обработки растений, например, путем опрыскивания или опыливания, в момент появления на них вредных насекомых. Предпочтительным способом обработки является опрыскивание. Как правило, желательно производить обработку на ранних стадиях развития личинок, так как в это время ущерб, наносимый растениями, является минимальным.
По одному из способов мутации штаммов Bacillus thuringiensis и селекции мутантов, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов, чем их родительские штаммы, родительский штамм;
I) обрабатывают мутагеном;
II) обработанные мутанты выращивают на среде, подходящей для селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных штаммов;
III) отбирают полупрозрачные колонии и выращивают их в среде, не летучей при нагревании; и
IV) отбирают истинно аспорогенные штаммы, подвергая колонии термообработке.
I) обрабатывают мутагеном;
II) обработанные мутанты выращивают на среде, подходящей для селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных штаммов;
III) отбирают полупрозрачные колонии и выращивают их в среде, не летучей при нагревании; и
IV) отбирают истинно аспорогенные штаммы, подвергая колонии термообработке.
По предпочтительному варианту этого способа отобранные таким образом колонии выращивают в обычной производственной питательной среде и окончательно отбирают штаммы, способные продуцировать большие количества дельта-эндотоксина.
На стадии (I) указанного способа в качестве мутагена можно использовать любой подходящий химический мутаген, например N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин или этилметансульфонат. По другому варианту родительский штамм может быть подвергнут электромагнитному облучению, например γ-, рентгеновскому или УФ-облучению.
На стадии (II) подходящей средой может быть модифицированная питательная споруляционная среда, включающая фосфат (NSMP-среда), описанная Johnson'om и др. в "Spores VI" под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975.
На стадии (IV) предлагаемого способа в качестве подходящей среды можно использовать среду NSMP с добавкой MgCl2 и Gelrite, Kelco.
По другому варианту обеспечивающие высокие выхода варианты или мутанты в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены путем выращивания родительского штамма в жидкой среде и отбора спонтанных мутантов или вариантов после распыления культуральной жидкости на агарной среде, пригодной для селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.
В качестве других методов выделения, обеспечивающих высокий выход вариантов или мутантов в соответствии с настоящим изобретением можно упомянуть отделение массы таких мутантов непосредственно путем центрифугирования или с помощью других средств, используемых для разделения масс.
Пример 1
Выделяли мутант B. thuringiensis subsp. tenebrionis, обеспечивающий получение дельта-эндотоксина в два с лишним раза большем количестве. Фазоконтрастная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия свидетельствует о том, что высокая продуцирующая способность этого мутанта связана с изменениями регуляции продуцирования дельта-эндотоксина по сравнению со споруляцией, что приводит к продуцированию кристаллов белка в пять с лишним раз более крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными активными по отношению к жесткокрылым штаммами Bacillus thuringiensis. По-видимому, в этом случае исчезает тесная взаимосвязь между образованием кристаллов и споруляцией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до споруляции.
Выделяли мутант B. thuringiensis subsp. tenebrionis, обеспечивающий получение дельта-эндотоксина в два с лишним раза большем количестве. Фазоконтрастная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия свидетельствует о том, что высокая продуцирующая способность этого мутанта связана с изменениями регуляции продуцирования дельта-эндотоксина по сравнению со споруляцией, что приводит к продуцированию кристаллов белка в пять с лишним раз более крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными активными по отношению к жесткокрылым штаммами Bacillus thuringiensis. По-видимому, в этом случае исчезает тесная взаимосвязь между образованием кристаллов и споруляцией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до споруляции.
Получение обладающего высокой продуцирующей способностью мутанта
Споры штамма DSM 5526 B. thuringiensis subsp. tenebrionis облучали γ-излучением дозой 7 кГи. Облученные споры распределяли на агаровых пластинках NSMP (модифицированная питательная споруляционная среда, включающая фосфат, описанная Johnson'om и др. в "Spore VI", под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975) - среде, подходящей для отделения аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.
Споры штамма DSM 5526 B. thuringiensis subsp. tenebrionis облучали γ-излучением дозой 7 кГи. Облученные споры распределяли на агаровых пластинках NSMP (модифицированная питательная споруляционная среда, включающая фосфат, описанная Johnson'om и др. в "Spore VI", под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975) - среде, подходящей для отделения аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.
Пластинки агара NSMP инкубировали при 30oC в течение 2 - 3 дней, отбирали полупрозрачные колонии и переносили их на гельритовые пластины NSMP (среда NSMP с добавкой 0,57 г/л MgCl2 и 20 г/л Gelrite, Kelco).
Гельритовые пластины NSMP инкубировали в течение часа при 90oC и затем в течение 1 - 2 дней при 30oC.
Отбирали хорошо развивающиеся в этих условиях на гельритовых пластинах NSMP мутанты. Таким образом удавалось отсеивать все аспорогенные мутанты, так как они переставали размножаться после термообработки.
Отобранные мутанты выращивали во встряхиваемых колбах с производственной питательной средой. Количество продуцируемого дельта-эндотоксина определяли иммунологическими методами, описание которых приведено ниже.
Отбирали только мутанты, продуцирующие значительно большие количества дельта-эндотоксина, чем родительский штамм.
Морфологию выделенных мутантов на твердой среде и в жидких средах изучали с помощью фазоконтрастной микроскопии (х 2500) и сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Подсчитывали количество образующихся спор и кристаллов и определяли размер кристаллов белка.
Из полученных мутантов был выделен один (DSM 5480), отличающийся исключительной способностью продуцировать дельта-эндотоксин.
Количество дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480, сравнивали с количеством дельта-эндотоксина, продуцируемого DSM 2803, исходным изолятом Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, штаммом DSM 5526 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, используемым для получения NOVODOR®, штаммом NB178 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, выделенным из продукта фирмы Sandoz TRIDENT® 1989 на основе Bacillus thuringiensis tenebrionis, штаммом NB 198, выделенным из продукта фирмы Sandoz TRIDENT® 1990 на основе B. thuringiensis subsp. tenebrionis, штаммом NRRL-B-115939 "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" и штаммом NB 197, выделенным из продукта фирмы Mycogen Mo-ONE® от 1990 на основе B. thuringiensis subsp. san diego". Как видно из таблицы 1 примера 2, мутант повышенной эффективности в отношении выхода в соответствии с настоящим изобретением продуцирует в 2 - 3,5 раза большее количество дельта-эндотоксина, чем известные активные по отношению к жесткокрылым штаммам Bacillus thuringiensis.
Пример 2
В данном примере сравнивались количества дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480 Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis и штаммами Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis DSM 2803 (исходный изолят Bacullus thuringiensis subsp. tenebrionis), DSM 5526 (производственный штамм фирмы Novo-Nordisk) и NB 178 и NB 198 (производственные штаммы фирмы Sandoz), а также Bacullus thuringiensis subsp. san diego, штаммами NRRL-B 15939 и NB 197 (производственные штаммы фирмы Mycogen) в производственной среде. Каждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 17 часов при 30oC на косячках агара следующего состава (в г/л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
мясной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
5 мл суспензии клеток каждого штамма переносили затем в baffle-донные колбы Эрленмейера на 500 мл со 100 мл производственной питательной среды. Производственная питательная среда имела следующий состав (количества компонентов указаны в г на л водопроводной воды):
соевая мука - 50 г
гидролизованный крахмал - 40 г
KHPPO4 - 1,77 г
K2HPO4 - 4,53 г
pH - 7,0
Инокулированное содержимое колб инкубировали при 30oC при встряхивании (250 об. /мин). После инкубации в течение 96 часов культуральную жидкость анализировали на содержание дельта-эндотоксина иммуногологическими методами.
В данном примере сравнивались количества дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480 Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis и штаммами Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis DSM 2803 (исходный изолят Bacullus thuringiensis subsp. tenebrionis), DSM 5526 (производственный штамм фирмы Novo-Nordisk) и NB 178 и NB 198 (производственные штаммы фирмы Sandoz), а также Bacullus thuringiensis subsp. san diego, штаммами NRRL-B 15939 и NB 197 (производственные штаммы фирмы Mycogen) в производственной среде. Каждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 17 часов при 30oC на косячках агара следующего состава (в г/л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
мясной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
5 мл суспензии клеток каждого штамма переносили затем в baffle-донные колбы Эрленмейера на 500 мл со 100 мл производственной питательной среды. Производственная питательная среда имела следующий состав (количества компонентов указаны в г на л водопроводной воды):
соевая мука - 50 г
гидролизованный крахмал - 40 г
KHPPO4 - 1,77 г
K2HPO4 - 4,53 г
pH - 7,0
Инокулированное содержимое колб инкубировали при 30oC при встряхивании (250 об. /мин). После инкубации в течение 96 часов культуральную жидкость анализировали на содержание дельта-эндотоксина иммуногологическими методами.
Количество дельта-эндотоксина, продуцируемого тем или иным штаммом, определяли с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Лауреллу (RIE) и фотометрического иммуноанализа (RIA), с использованием антител по отношению к очищенным кристаллам белка из Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
Отбирали по 400 мг культуральной жидкости из каждого опыта, добавляли к отобранным пробам по 7 мл тринатрийфосфатного буфера (0,125 М, pH 12) и встряхивали суспензии в течение часа для солюбилизации дельта-эндотоксионных белков.
Пробы затем центрифугировали при 3500 об. /мин в течение 15 минут и анализировали надосадочную жидкость на содержание дельта-эндотоксина с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Лауреллу в сыворотку по отношению к очищенным кристаллам белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis. Для определения количества дельта-эндотоксина использовали стандарты с известным содержанием кристаллов белка.
Концентрацию кристаллического белка также определяли с помощью фотометрического иммуноанализа. Кристаллические белки растворяли в щелочном растворе. Растворенные белки осаждали их антителами. Скорость реакции определяли турбодиметрически. Для определения количества дельта-эндотоксина использовали стандарты с известным содержанием кристаллического белка.
Используемые в ходе анализа для получения антител кристаллические антигены получали из кристаллов, выделенных из B. thuringiensis subsp. tenebrionis.
Поликлональные антитела индуцировали путем инъекции кроликам подкожно раз в две недели 0,25 мл кристаллического антигена.
Полученные результаты приведены в нижеследующих таблицах 1a и 1b. Выхода дельта-эндотоксина выражали в BTTU/г (единицы на г культуральной жидкости, определенные с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Лауреллу (RIE) или фотометрического иммуноанализа (RIA)). Величина, полученная для чистого кристаллического белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis, равна 50000 BTTU/г. Величины, приведенные в таблице 1a (см. в конце описания), представляют собой средние из 6 - 7, а в таблице 1b - из 3 независимых опытов по ферментации.
Из таблиц Ia и Ib видно, что DSM 5480 продуцирует в три с лишним раза больше дельта-эндотоксина, чем родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 2803) и "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" штамм NRRL-B 15939) и в два с лишним раза больше, чем используемые в настоящее время для получения коммерческих продуктов штаммы Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
Фазоконтрастная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, мутанта DSM 5480, показали, что кристаллы белка, продуцируемые этим мутантом, намного крупнее соответствующих кристаллов белка, продуцируемых штаммами Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198, а также штаммами "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197.
Культуральную жидкость мутанта Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480 испытывали на активность по отношению к личинкам колорадского жука. Большее количество дельта-эндотоксина, продуцированного мутантом DSM 5480 (это было установлено с помощью иммунологических методов) отражалось на биологической активности по отношению к личинкам колорадского жука.
Пример 3
В данном примере сравнивались процессы споруляции и образования параспоральных кристаллов под действием штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198 и мутанта DSM 5480, а также штаммов "B. thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197 на твердой и в жидкой средах.
В данном примере сравнивались процессы споруляции и образования параспоральных кристаллов под действием штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198 и мутанта DSM 5480, а также штаммов "B. thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197 на твердой и в жидкой средах.
Каждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 2 дней при 30oC на агаровых пластинах следующего состава (в г на л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
мясной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
Каждый из перечисленных штаммов выращивали также в жидкой среде. Все штаммы выращивали на агаровых косячках в течение 17 часов при 30oC. По 5 мл суспензии клеток каждого из штаммов переносили затем в baffle-донные колбы Эрленмейера на 500 мл со 100 мл питательной среды.
пептон, Difco - 5 г
мясной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
Каждый из перечисленных штаммов выращивали также в жидкой среде. Все штаммы выращивали на агаровых косячках в течение 17 часов при 30oC. По 5 мл суспензии клеток каждого из штаммов переносили затем в baffle-донные колбы Эрленмейера на 500 мл со 100 мл питательной среды.
Питательная среда имела следующий состав (в г на л водопроводной воды):
Жидкая среда
дрожжевой экстракт - 5 г
триптон - 5 г
глюкоза - 1 г
KH2PO4 - 0,8 г
pH - 7,0
Инокулированное содержание колб инкубировали при 30oC в течение 96 часов при встряхивании (250 об./мин).
Жидкая среда
дрожжевой экстракт - 5 г
триптон - 5 г
глюкоза - 1 г
KH2PO4 - 0,8 г
pH - 7,0
Инокулированное содержание колб инкубировали при 30oC в течение 96 часов при встряхивании (250 об./мин).
Морфологию штаммов на твердой среде и в жидкой среде изучали ежедневно с помощью фазоконтрастной микроскопии (х 2500). Подсчитывая количество спор и кристаллов, а также определяли размер параспоральных кристаллов. Отдельные пробы изучали, кроме того, с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.
Все штаммы B. thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198) и "B. thuringiensis subsp. san diego" (NRRL-B 15939 и NB 197) хорошо спорулировались в обеих средах. Перед лизисом каждая клетка содержала спору и параспоральный кристалл. К моменту лизиса клетки длина кристаллов находилась в пределах от 0,4 до 0,9 - 1,1 мкм. Средняя длина кристаллов равнялась 0,6 - 0,7 мкм.
Мутант DSM 5480 продуцировал лишь небольшое количество спор (< 106 спор/мл) на твердой среде и в вышеуказанной жидкой среде. Перед лизисом в большинстве клеток находился огромный кристалл, но не было спор. Размер кристаллов белка находился в пределах от 0,4 - 0,7 до 5,0 мкм. В среднем длина кристалла составляла 2,2 - 2,3 мкм.
Ультраструктурный анализ клеток, выращенных в этих средах, выполненный с помощью просвечивающей электронной микроскопии, показал, что процесс споруляции в мутанте начался, но не закончился к моменту лизиса клеток. В различных клетках процесс споруляции дошел до разных стадий. В клетках, в которых процесс споруляции достиг лишь стадии 11 (образование предспоры Septum), кристаллы белка заполнили весь объем клеток.
В производственной питательной среде (пример 2) указанный мутант продуцировал большее количество спор (107 - 108 спор/мл). В этой среде частота споруляции мутанта в 10 - 100 раз меньше, чем в случае родительского штамма.
Таким образом, мутант сохранял свою способность продуцировать нормальные споры. Однако частота споруляции, по всей видимости, сильно зависит от состава питательной среды.
Размеры кристаллов белка, продуцируемых отдельными штаммами, приведены в таблицах IIa и IIb (см. в конце описания).
Из таблиц IIa и IIb видно, что мутант DSM 5480 продуцирует значительно более крупные кристаллы белка, чем любой из известных штаммов B.t., активных по отношению к жесткокрылым.
Из полученных данных следует, что регуляция продуцирования дельта-эндоксина в отношении споруляции претерпела изменение в мутанте.
По-видимому, мутант продуцирует кристаллы белка до развития спор, благодаря чему клетки оказываются в состоянии продуцировать дельта-эндотоксин в течение более длительного времени. В результате к моменту лизиса клеток продуцируются значительно более крупные кристаллы, чем в случае родительского штамма.
В зависимости от наличия в питательной среде тех или иных питательных веществ и размера кристаллов белка к моменту споруляции нормальные споры начинают развиваться до лизиса клеток.
Пример 4
В данном примере мутант Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью использовался для получения высокоактивных продуктов для контроля личинок колорадского жука.
В данном примере мутант Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью использовался для получения высокоактивных продуктов для контроля личинок колорадского жука.
Ферментацию DSM 5480 осуществляли в описанной в примере 2 производственной питательной среде в аэрируемом промышленном фенментере с перемешивающим устройством. Через 96 часов культуральную жидкость отделяли путем центрифугирования в непрерывной центрифуге.
Концентрированную расслоившуюся эмульсию, содержащую активные кристаллы белка, стабилизировали путем добавления микробных консервирующих добавок и pH ее устанавливали равным 5,0.
Часть этой эмульсии высушивали в распылительной сушилке и затем использовали для получения смачивающегося порошка. Оставшуюся часть эмульсии непосредственно использовали для получения двух водных текучих концентратов (FC).
Смачивающийся порошок имел состав, приведенный в таблице Ш. Состав обеих жидких текучих композиций приведен в таблице IV (см. в конце описания).
Поверхностно-активные вещества были выбраны из большого числа суспензий вспомогательных добавок и смачивателей, обычно использующихся при получении пестицидов для сельского хозяйства.
В качестве антислеживающего агента использовали гидрофильный диоксид кремния, а инертный носитель был выбран из числа обычно использующихся инертных наполнителей, таких как бентониты, неорганические соли и глины.
В качестве консервирующих добавок в FC использовали добавки, применяющиеся в пищевой и косметической промышленности. В качестве регулятора pH использовали неорганическую кислоту.
Пример 5
Для проверки биологической активности мутанта Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью по отношению к основному вредному насекомому, личинкам колорадского жука, были проведены полевые испытания. Для сравнения использовали два коммерческих продукта: Triden® и M-one®. В качестве культуры, на которой проводились испытания, использовали картофель.
Для проверки биологической активности мутанта Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью по отношению к основному вредному насекомому, личинкам колорадского жука, были проведены полевые испытания. Для сравнения использовали два коммерческих продукта: Triden® и M-one®. В качестве культуры, на которой проводились испытания, использовали картофель.
Растения картофеля трижды опрыскивали испытуемым препаратом: 20 июля, 27 июля и 3 августа (второе поколение личинок). В конце описания (табл. IVa) приведены используемые препараты и дозировки.
Средний % контроля личинок колорадского жука по сравнению с необработанными контрольными растениями приведен в таблице V. Необработанные контрольные растения были очень сильно поражены колорадским жуком: 370 личинок на 20 растений I-го и 904 личинки на 20 растений 8-го августа.
Приведенные результаты убедительно свидетельствует о том, что препараты, полученные на основе мутанта DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью обладают высокой эффективностью в отношении контроля личинок колорадского жука при полевых испытаниях. Кристаллы белка, продуцируемые штаммом с высокой продуцирующей способностью, проявляют 100%-ную активность при использовании их в виде NOVODOR®FC при расходе 1,71 л, а также дают хорошие результаты при использовании их в виде TRIDENT'а при расходе 4,56 л и M-one' а при расходе 2,28 л.
Claims (15)
1. Мутантный штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480 - продуцент дельта-эндотоксина.
2. Способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина путем выращивания штамма бактерий Bacillus thuringiensis на питательной среде, содержащий источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением продукта, содержащего дельта-эндотоксин, отличающийся тем, что из бактерий Bacillus thuringiensis используют штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что продукт выделяют в индивидуальном виде или в комбинации с клетками бактерий и/или со спорами и смешивают его с наполнителем, приемлемым для сельского хозяйства.
4. Пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, отличающаяся тем, что она содержит дельта-эндотоксин, полученный из штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
5. Пестицидная композиция по п.4, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит разбавитель или носитель, приемлемый для сельского хозяйства.
6. Жидкая пестицидная композиция, отличающаяся тем, что она содержит разбавитель и дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, с активностью не менее 15000 ед/г, что соответствует концентрации в препарате эндотоксина, активного по отношению к жесткокрылым насекомым, не менее 3,0 вес.%.
7. Жидкая пестицидная композиция по п.6, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
8. Твердая пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин и носитель, отличающаяся тем, что она содержит дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, с активностью 50000 ед/г, что соответствует концентрации в препарате эндотоксина, активного по отношению к жесткокрылым насекомым не менее 10 вес.%.
9. Твердая пестицидная композиция по п.8, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
10. Способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми путем обработки растений препаратом, содержащим дельта-эндотоксин, отличающийся тем, что используют препарат, содержащий дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
11. Способ получения мутантных штаммов бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis продуцентов дельта-эндотоксина, отличающийся тем, что родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis обрабатывают мутагеном, обработанные мутанты выращивают на среде, способствующей получению аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов, из полученных колоний отбирают полупрозрачные колонии и из них бактерии пересеивают на твердую питательную среду, не содержащую летучие компоненты, выдерживают при температуре 90oC в течение часа, а затем инкубируют при температуре 30oC до получения аспорогенных колоний, из них отбирают клетки бактерий, засеивают на производственную питательную среду и отбирают штаммы, продуцирующие наибольшее количество дельта-эндотоксина.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве мутагена используют ультрафиолетовые излучения.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве питательной среды, способствующей получению аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов, используют споруляционную среду, содержащую фосфат.
14. Способ по пп. 11-13, отличающийся тем, что в качестве питательной среды для пересева клеток бактерий используют среду NSMP, дополнительно содержащую 0,57 г/л MgCl2 и 20 г/л гельрита Kelco.
15. Способ по пп.11-14, отличающийся тем, что в качестве родительского штамма используют штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803.
Приоритет по пунктам:
17.11.89 - по пп.1, 2, 4, 5, 10-15 и п.3, исключая признак, касающийся выделение эндотоксина в комбинации с клетками и/или спорами;
12.12.89 - по пп.6-9 и п.3 - признак, касающийся выделения эндотоксина в комбинации с клетками или спорами.
17.11.89 - по пп.1, 2, 4, 5, 10-15 и п.3, исключая признак, касающийся выделение эндотоксина в комбинации с клетками и/или спорами;
12.12.89 - по пп.6-9 и п.3 - признак, касающийся выделения эндотоксина в комбинации с клетками или спорами.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK580589A DK580589D0 (da) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | Mutant |
DK5805/89 | 1989-12-12 | ||
DK627489A DK627489D0 (da) | 1989-12-12 | 1989-12-12 | Mutant |
DK6274/89 | 1989-12-12 | ||
PCT/DK1990/000294 WO1991007481A1 (en) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Mutants or variants of bacillus thuringiensis producing high yields of delta endotoxin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2138950C1 true RU2138950C1 (ru) | 1999-10-10 |
Family
ID=26067985
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5052261A RU2138950C1 (ru) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Мутантный штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis dsm 5480 - продуцент дельта-эндотоксина, способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина, пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми, способ получения мутантных штаммов бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis - продуцентов дельта-эндотоксина |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0585215B1 (ru) |
JP (1) | JP2950614B2 (ru) |
KR (1) | KR0157065B1 (ru) |
AT (1) | ATE184645T1 (ru) |
AU (1) | AU647056B2 (ru) |
BG (1) | BG61699B1 (ru) |
CA (1) | CA2068734C (ru) |
DE (2) | DE585215T1 (ru) |
DK (1) | DK0585215T3 (ru) |
ES (1) | ES2060568T3 (ru) |
FI (1) | FI103130B (ru) |
GR (2) | GR940300021T1 (ru) |
HU (1) | HU214685B (ru) |
NO (1) | NO305131B1 (ru) |
RO (1) | RO109862B1 (ru) |
RU (1) | RU2138950C1 (ru) |
SK (1) | SK281286B6 (ru) |
TR (1) | TR28902A (ru) |
WO (1) | WO1991007481A1 (ru) |
YU (1) | YU48440B (ru) |
Families Citing this family (139)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6270760B1 (en) * | 1989-12-18 | 2001-08-07 | Valent Biosciences, Inc. | Production of Bacillus thuringiensis integrants |
US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
IL99928A0 (en) * | 1990-11-08 | 1992-08-18 | Agricultural Genetics Co | Biological control of pests |
US5264364A (en) * | 1991-01-31 | 1993-11-23 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
ZA932792B (en) * | 1992-05-12 | 1993-11-16 | Aeci Ltd | Insecticide composition |
WO1994028724A1 (en) * | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis strains capable of producing large amonts of insecticidal crystal proteins |
IL110299A0 (en) * | 1993-07-15 | 1994-10-21 | Novo Nordisk Entotech Inc | Formation of and methods for the production of large bacillus thuringiensis crystals with increased pesticidal activity |
WO1997027305A1 (en) * | 1996-01-26 | 1997-07-31 | Abbott Laboratories | Production of bacillus thuringiensis integrants |
US5804180A (en) * | 1996-07-17 | 1998-09-08 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis strains showing improved production of certain lepidopteran-toxic crystal proteins |
US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
US5965428A (en) * | 1996-10-08 | 1999-10-12 | Ecogen, Inc. | Chimeric lepidopteran-toxic crystal proteins |
KR100458765B1 (ko) * | 2001-12-24 | 2004-12-03 | 학교법인 동아대학교 | 파리목 해충에 대해 방제효과를 가지는 바실러스슈린지에스 균주 및 이를 이용한 미생물 살충제의 제조방법 |
WO2014056780A1 (en) | 2012-10-12 | 2014-04-17 | Basf Se | A method for combating phytopathogenic harmful microbes on cultivated plants or plant propagation material |
WO2014082879A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
WO2014082871A1 (en) | 2012-11-27 | 2014-06-05 | Basf Se | Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides |
US20150313229A1 (en) | 2012-11-27 | 2015-11-05 | Basf Se | Substituted [1,2,4] Triazole Compounds |
EP2928873A1 (en) | 2012-11-27 | 2015-10-14 | Basf Se | Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides |
WO2014086854A1 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Basf Agro B.V., Arnhem (Nl) | Compositions comprising a quillay extract and a plant growth regulator |
WO2014086850A1 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Basf Agro B.V., Arnhem (Nl) | Compositions comprising a quillay extract and a fungicidal inhibitor of respiratory complex ii |
WO2014086856A1 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Basf Agro B.V., Arnhem (Nl) | Compositions comprising a quillay extract and a biopesticide |
EP2746255A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
WO2014095555A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746279A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2746278A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746277A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2935224A1 (en) | 2012-12-19 | 2015-10-28 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2935236B1 (en) | 2012-12-19 | 2017-11-29 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides |
WO2014095534A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
EP2746266A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides |
WO2014095381A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2746256A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds |
EP2746262A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds for combating phytopathogenic fungi |
EP2746263A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Basf Se | Alpha-substituted triazoles and imidazoles |
US20150329501A1 (en) | 2012-12-19 | 2015-11-19 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides |
EP2746260A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746258A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746257A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2746259A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
WO2014124850A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
BR112015018853B1 (pt) | 2013-03-20 | 2021-07-13 | Basf Corporation | Mistura, composição agroquímica, método para controlar fungos fitopatogênicos, método para proteção do material de propagação dos vegetais e semente revestida |
WO2015011615A1 (en) | 2013-07-22 | 2015-01-29 | Basf Corporation | Mixtures comprising a trichoderma strain and a pesticide |
WO2015036059A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
WO2015036058A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Basf Se | Fungicidal pyrimidine compounds |
CN106061254B (zh) | 2013-10-18 | 2019-04-05 | 巴斯夫农业化学品有限公司 | 农药活性羧酰胺衍生物在土壤和种子施用和处理方法中的用途 |
US10053432B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-08-21 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
US20160318897A1 (en) | 2013-12-18 | 2016-11-03 | Basf Se | Azole compounds carrying an imine-derived substituent |
WO2015104422A1 (en) | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Basf Se | Dihydrothiophene compounds for controlling invertebrate pests |
EP2924027A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-09-30 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole fungicidal compounds |
US9968092B2 (en) | 2014-04-17 | 2018-05-15 | Basf Se | Combination of novel nitrification inhibitors and biopesticides as well as combination of (thio)phosphoric acid triamides and biopesticides |
EP2962568A1 (en) | 2014-07-01 | 2016-01-06 | Basf Se | Mixtures comprising a bacillus amyliquefaciens ssp. plantarum strain and a pesticide |
EP2949649A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Basf Se | Fungicide substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2949216A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Basf Se | Fungicidal substituted alkynyl [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2952512A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
EP2952506A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds |
EP2952507A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-09 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds |
CN107075712A (zh) | 2014-10-24 | 2017-08-18 | 巴斯夫欧洲公司 | 改变固体颗粒的表面电荷的非两性、可季化和水溶性聚合物 |
CN111742937A (zh) * | 2015-01-16 | 2020-10-09 | 瓦伦特生物科学有限责任公司 | 苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种组合制剂 |
WO2016128239A1 (en) | 2015-02-11 | 2016-08-18 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a pyrazole compound and a biopesticide |
AU2016231152A1 (en) | 2015-03-11 | 2017-09-28 | Basf Agrochemical Products B.V. | Pesticidal mixture comprising a carboxamide compound and a biopesticide |
CN107592790B (zh) | 2015-03-11 | 2022-03-25 | 巴斯夫农业化学品有限公司 | 包含羧酰胺化合物和生物农药的农药混合物 |
EP3111763A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-04 | BASF Agro B.V. | Pesticidal compositions comprising a triazole compound |
EP3383183B1 (en) | 2015-11-30 | 2020-05-27 | Basf Se | Compositions containing cis-jasmone and bacillus amyloliquefaciens |
EP3205209A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-16 | Basf Se | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides |
US20190200612A1 (en) | 2016-09-13 | 2019-07-04 | Basf Se | Fungicidal mixtures i comprising quinoline fungicides |
WO2018149754A1 (en) | 2017-02-16 | 2018-08-23 | Basf Se | Pyridine compounds |
JP7160486B2 (ja) | 2017-03-28 | 2022-10-25 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺生物剤化合物 |
WO2018184882A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Basf Se | Pyridine compounds |
US20210179620A1 (en) | 2017-06-16 | 2021-06-17 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
WO2018234202A1 (en) | 2017-06-19 | 2018-12-27 | Basf Se | SUBSTITUTED PYRIMIDINIUM COMPOUNDS AND DERIVATIVES FOR CONTROLLING HARMFUL ANIMALS |
WO2018234488A1 (en) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | Basf Se | SUBSTITUTED CYCLOPROPYL DERIVATIVES |
EP3453706A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-13 | Basf Se | Pesticidal imidazole compounds |
WO2019057660A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Basf Se | INDOLE AND AZAINDOLE COMPOUNDS HAVING 6-CHANNEL SUBSTITUTED ARYL AND HETEROARYL CYCLES AS AGROCHEMICAL FUNGICIDES |
WO2019072906A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Basf Se | IMIDAZOLIDINE PYRIMIDINIUM COMPOUNDS FOR CONTROL OF HARMFUL ANIMALS |
WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
US11512054B2 (en) | 2017-12-21 | 2022-11-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
JP7479285B2 (ja) | 2018-01-09 | 2024-05-08 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 硝化阻害剤としてのシリルエチニルヘタリール化合物 |
WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
AU2019226360A1 (en) | 2018-02-28 | 2020-08-27 | Basf Se | Use of alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors |
CA3089381A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Basf Se | Use of pyrazole propargyl ethers as nitrification inhibitors |
WO2019166560A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Basf Se | Use of n-functionalized alkoxy pyrazole compounds as nitrification inhibitors |
WO2019175712A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Basf Corporation | New uses for catechol molecules as inhibitors to glutathione s-transferase metabolic pathways |
WO2019175713A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Basf Corporation | New catechol molecules and their use as inhibitors to p450 related metabolic pathways |
WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
WO2020002472A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Basf Se | Use of alkynylthiophenes as nitrification inhibitors |
EP3826983B1 (en) | 2018-07-23 | 2024-05-15 | Basf Se | Use of substituted 2-thiazolines as nitrification inhibitors |
WO2020020765A1 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Basf Se | Use of a substituted thiazolidine compound as nitrification inhibitor |
EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
EP3887357A1 (en) | 2018-11-28 | 2021-10-06 | Basf Se | Pesticidal compounds |
US20230031024A1 (en) | 2018-12-18 | 2023-02-02 | Basf Se | Substituted pyrimidinium compounds for combating animal pests |
EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
EP3730489A1 (en) | 2019-04-25 | 2020-10-28 | Basf Se | Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides |
EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
CN113923987B (zh) | 2019-05-29 | 2024-10-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于防除动物害虫的介离子咪唑鎓化合物和衍生物 |
EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
WO2021170463A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-09-02 | BASF Agro B.V. | Methods and uses of a mixture comprising alpha-cypermethrin and dinotefuran for controlling invertebrate pests in turf |
CN115443267A (zh) | 2020-04-28 | 2022-12-06 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀害虫化合物 |
EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
EP3960727A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors vi |
EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
EP4236691A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-09-06 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
EP4011208A1 (en) | 2020-12-08 | 2022-06-15 | BASF Corporation | Microparticle compositions comprising fluopyram |
CN116829521A (zh) | 2021-02-02 | 2023-09-29 | 巴斯夫欧洲公司 | Dcd和烷氧基吡唑作为硝化抑制剂的协同增效作用 |
EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
JP2024519813A (ja) | 2021-05-18 | 2024-05-21 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌剤としての新規な置換ピリジン |
US20240270727A1 (en) | 2021-05-18 | 2024-08-15 | Basf Se | New substituted pyridines as fungicide |
WO2022243109A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted quinolines as fungicides |
CN117355504A (zh) | 2021-05-21 | 2024-01-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 乙炔基吡啶化合物作为硝化抑制剂的用途 |
CN117440946A (zh) | 2021-05-21 | 2024-01-23 | 巴斯夫欧洲公司 | N-官能化的烷氧基吡唑化合物作为硝化抑制剂的用途 |
WO2022268810A1 (en) | 2021-06-21 | 2022-12-29 | Basf Se | Metal-organic frameworks with pyrazole-based building blocks |
EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
KR20240042636A (ko) | 2021-08-02 | 2024-04-02 | 바스프 에스이 | (3-피리딜)-퀴나졸린 |
CA3227653A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Wassilios Grammenos | (3-quinolyl)-quinazoline |
EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
WO2023203066A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Basf Se | Synergistic action as nitrification inhibitors of dcd oligomers with alkoxypyrazole and its oligomers |
EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
EP4361126A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv |
WO2024104823A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | New substituted tetrahydrobenzoxazepine |
WO2024104818A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
WO2024104822A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted tetrahydrobenzodiazepine as fungicides |
WO2024104815A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
EP4389210A1 (en) | 2022-12-21 | 2024-06-26 | Basf Se | Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests |
WO2024165343A1 (en) | 2023-02-08 | 2024-08-15 | Basf Se | New substituted quinoline compounds for combatitng phytopathogenic fungi |
WO2024194038A1 (en) | 2023-03-17 | 2024-09-26 | Basf Se | Substituted pyridyl/pyrazidyl dihydrobenzothiazepine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4277564A (en) * | 1980-01-09 | 1981-07-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Preparing entomocidal products with oligosporogenic mutants of bacillus thuringiensis |
CA1193564A (en) * | 1982-07-09 | 1985-09-17 | University Of Western Ontario | Mutated microorganism with toxin inclusion for pest control |
DE3346138A1 (de) * | 1983-12-21 | 1985-07-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera |
US4764372A (en) * | 1985-03-22 | 1988-08-16 | Mycogen Corporation | Compositions containing bacillus thuringiensis toxin toxic to beetles of the order coleoptera, and uses thereof |
DE3541893A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-11 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung sporenfreier, konzentrierter protein-praeparate von mueckentoxischem bacillus thuringiensis serovar. israelensis sowie mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens bzw. verfahren zur gewinnung des mikroorganismus |
JPS62146593A (ja) * | 1985-12-16 | 1987-06-30 | マイコゲン コ−ポレ−シヨン | バシラス・スリンギエンシスの安定なspo−cry+変異株の製法 |
JP2775150B2 (ja) * | 1987-03-04 | 1998-07-16 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 蚊類毒性のバシラス・ツリンギーンシス・セロバル.イスラエレンシスの、胞子不含の、濃縮した蛋白質製剤の製法並びに該方法を実施するための微生物及び該微生物を収得する方法 |
ES2063051T3 (es) * | 1987-12-24 | 1995-01-01 | Zeneca Ltd | Cepas bacterianas. |
US4999192A (en) * | 1988-02-12 | 1991-03-12 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate |
US4966765A (en) * | 1988-02-23 | 1990-10-30 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
US4996155A (en) * | 1988-03-04 | 1991-02-26 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin |
US4990332A (en) * | 1988-10-25 | 1991-02-05 | Mycogen Corporation | Novel lepidopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
-
1990
- 1990-11-14 SK SK5629-90A patent/SK281286B6/sk unknown
- 1990-11-16 RO RO92-200690A patent/RO109862B1/ro unknown
- 1990-11-16 WO PCT/DK1990/000294 patent/WO1991007481A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-16 DE DE0585215T patent/DE585215T1/de active Pending
- 1990-11-16 JP JP2515745A patent/JP2950614B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 HU HU9201628A patent/HU214685B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 YU YU218590A patent/YU48440B/sh unknown
- 1990-11-16 AU AU67364/90A patent/AU647056B2/en not_active Ceased
- 1990-11-16 KR KR1019920701171A patent/KR0157065B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 DK DK90917069T patent/DK0585215T3/da active
- 1990-11-16 AT AT90917069T patent/ATE184645T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 EP EP90917069A patent/EP0585215B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-16 DE DE69033291T patent/DE69033291T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 RU SU5052261A patent/RU2138950C1/ru active
- 1990-11-16 ES ES90917069T patent/ES2060568T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-16 CA CA002068734A patent/CA2068734C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 TR TR01097/90A patent/TR28902A/xx unknown
-
1992
- 1992-05-14 FI FI922205A patent/FI103130B/fi active
- 1992-05-15 NO NO921950A patent/NO305131B1/no unknown
- 1992-06-16 BG BG96488A patent/BG61699B1/bg unknown
-
1994
- 1994-04-29 GR GR940300021T patent/GR940300021T1/el unknown
-
1999
- 1999-11-10 GR GR990402908T patent/GR3031815T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
С.И. Алиханян Селекция промышленных микроорганизмов. - 1968, 151, 163, 197. Тезисы докладов на совещании по вопросам получения высокопродуктивных и фагоустойчивых культур энтомопатогенных бактерий. Москва, 14-16 октября 1969, c. 33-34. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2138950C1 (ru) | Мутантный штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis dsm 5480 - продуцент дельта-эндотоксина, способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина, пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми, способ получения мутантных штаммов бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis - продуцентов дельта-эндотоксина | |
US5006336A (en) | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate | |
JP2571842B2 (ja) | 新規なバチルス・スリンギエンシス菌株、それらの分離方法および関連する組成物 | |
CA1184137A (en) | Bacterial insecticide and production thereof | |
US5302387A (en) | Bacillus thuringiensis isolates active against cockroaches and genes encoding cockroach-active toxins | |
JPH10504451A (ja) | 新規の双翅類活性化合物及びバチルス チューリングエンシス株 | |
US5279962A (en) | Mutants or variants of Bacillus thuringiensis producing high yields of delta endotoxin | |
AU639896B2 (en) | Novel bacillus thuringiensis strains | |
JPH0358904A (ja) | 新規なバシラス・スリンギエンシス分離体 | |
JPH0515364A (ja) | 新規なバシラス菌株及び害虫防除剤 | |
HRP920198A2 (en) | Mutants or variants of bacillus thuringiensis producing high yields of delta toxin | |
CZ562990A3 (cs) | Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsob jeho přípravy a pesticidní prostředek, který ho obsahuje | |
PL166433B1 (pl) | Sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez B. thuringlensis PL PL PL PL PL PL | |
IL86242A (en) | Transconjugant bacillus thuringiensis strains, insecticidal compositions containing them and method for their use |