JP2571842B2

JP2571842B2 - 新規なバチルス・スリンギエンシス菌株、それらの分離方法および関連する組成物

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Publication number: JP2571842B2
Application number: JP63504248A
Authority: JP
Inventors: ゴンザレス，ホセ・マヌエル，ジユニア; マカルソ，アンソニイ
Original assignee: EKOJEN Inc
Current assignee: EKOJEN Inc
Priority date: 1987-05-08
Filing date: 1988-05-04
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: EP0366668B1; ES2009606A6; JPH02501530A; CA1328239C; EP0366668A4; AU1785888A; WO1988008877A1; ATE121780T1; EP0366668A1; US5080897A; AU608855B2; DE3853680D1; GR1000470B

Description

【発明の詳細な説明】内容ページ 1.序論３ 2.発明の背景３ 2.1 商用農薬：一般の考察３ 2.2 生物学的農薬４ 2.3 バチルス・スリンギエンシス（Bacill us thuringensis）およびデルタ−エンドトキシン４ 3.発明の要約５ 4.図面の簡単な説明６ 5.発明の説明７ 5.1 バチルス・スリンギエンシス（B.thuringiensis）のキュアーおよび接合９ 5.2 HD−１変異型の分離 11 5.3 HD269−２（EV2069）の分離 13 5.4 HD263−４（EG2038）の分離 13 5.5 HD263−４−１（EG2094）の分離 13 5.6 HD263−４−5A（EG2101）の分離 14 5.7 HD269−２−７（EG2348）の分離 14 5.8 HD269−２−30（EG2371）の分離 15 5.9 HD279−72（EG2157）の分離 16 5.10 HD269−２−８（EG2349）の分離 16 5.11 HD1−19−８（EG2397）の分離 17 5.12 新規なBT菌株の分離および構成の要約 17 5.13 BT菌株を組み込んだ産生物および組成物 20 6.バイオアッセイ 24 6.1 HD−１変異型のバイオアッセイ 25 6.2 BT菌株HD269−２−30のバイオアッセイ 28 6.3 BT菌株HD269−２−７のバイオアッセイ 30 6.4 BT菌株HD269−２のバイオアッセイ 32 6.5 BT菌株HD1−19−８、HD279−72、およびHD269−２−８のバイオアッセイ 34 7.微生物の受託 35 この出願は、1987年５月８日に提出された、米国特許
出願第047,965号の一部継続出願である。

１序論本発明は、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus
thuringiensis）の新規な菌株およびそれらの分離、同
定および改良の方法に関する。これらの新しい菌株は、
鱗翅類に対する増大した活性を有する。本発明は、ま
た、これらの新規な菌株を組み込んだ殺虫剤組成物に関
する。

２発明の背景 2.1 商業的農薬：一般的考察毎年、世界の商業的重要な農作物の有意な部位は昆虫
および他の有害生物（pest）の蔓延により損失されてい
る。これらの有害生物により生ずる損害は、商業的に重
要な植物のすべての領域、例えば、食物、繊維材料およ
び種々の家庭の植物に及び、そして経済的損害は数100
万ドルになる。こうして、このような蔓延から作物の保
護はきわめて重要である。

広いスペクトルの農薬（psticides）は作物の保護に
最も普通に使用されるいるが、これらの薬剤の無分別の
使用な植物の自然の防御因子の破壊に導くことがある。
さらに、それらの活性の広いスペクトルのために、化学
的農薬は非標的有機体、例えば、有益な昆虫および破壊
的有害生物の寄生体を破壊することがある。これらは、
また、動物およびヒトに対してしばしば有害であり、こ
うして、適用するとき、環境的危険を与える。

さらに、昆虫および他の有機体は、これらの農薬に反
復して暴露するとき、これらの農薬に対してししば抵抗
性を発現する。農薬の実用性を減少することに加えて、
小さい有害生物の抵抗性系統は有益な寄生有機体の減少
のために主要な蔓延の問題となりうる。

これは広いスペクトルの農薬を使用するとき直面する
主要な問題である。必要とするものは、活性のより狭い
スペクトルと、延長した期間にわたってその活性を維持
する能力を兼備する生物分解性農薬、すなわち、それに
対する抵抗がまったくないにしても、非常により遅い農
薬である。

2.2 生物学的農薬生物農薬（biopesticides）は、また、バイオラショ
ナル（biorationals）と呼ばれ、天然に産出する病原体
を使用して、昆虫、菌・かび、および農作物の雑草の蔓
延を抑制する。このような物質は、バクテリアの成長培
地の存在または不存在下に、蔓延す因子に対して毒性の
物質（例えば、毒素）を産生するバクテリウムからなる
ことができる。このようなバクテリアは、標準の適用方
法により植物に直接適用することができ、化学的農薬に
比較して、典型的には非有機体に、および全体として環
境にそれほど有害でない。

有害生物の抑制の生物学的方法の使用は、菌・かびの
病気がカイコにおいて発見されたとき、最初に1895年に
示唆された。しかしながら、生物学的有害生物の抑制が
最初に達成されたのは、乳化病のバチルス・ポピリアエ
（Bacillus poilliae）の胞子を使用してマメコガネを
抑制した1940年であった。バチルス・スリンギエンシス
（Bacillus thuringiensis）（以後、互換的に「B.
t.」または「Bt」と呼ぶ）という名前のバクテリウム、
すなわち、幼虫および他の昆虫に対して致死的な毒素を
産生するバクテリア、は現在最も広く使用されている生
物農薬である。1960年代の終わりにおいて、HD−１、で
あるB.t.の高度に毒性の菌株は生物農薬の商業的使用の
段階を設定した。

2.3 バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuring
iensis）およびデルタ−エンドトキシンバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringien
sis）（そうでなければ、「B.t.」または「BT」として
知られている）は、広く分布している、棒状の、好気性
の、胞子形成性の微生物である。その胞子形成期の間、
BTはプロトキシン（protoxins）またはデルタ−エンド
トキシン（delta−endotoxints）として知られているタ
ンパク質を形成する。これらの毒素はBTにおいてパラ胞
子の結晶質封入体（inclusions）としてまたは胞子殻の
一部分として蓄積する。種々の感受性昆虫、例えば、鱗
翅類（Lepidoptera）およびジプテラ（Diptera）の目に
おける昆虫に対するBTの病原性は、本質的にこのパラ胞
子の結晶のためであり、この結晶は胞子形成の時にBT細
胞の乾燥重量の20％を越えることがある。

パラ胞子の結晶は摂取後にのみ活性である。例えば、
鱗翅類の昆虫により摂取後、アルカリ性pHおよび中腸内
のタンパク質分解酵素は結晶を活性化して毒性成分を放
出させる。これらの毒性成分は中腸の細胞を毒して、昆
虫の食物摂取を防止させ、究極的に死亡させる。事実、
BTは、鱗翅類の有害生物を処理するとき、有効かつ環境
的安全な殺虫剤であることが明らかとなった。

異なる菌株のBTは血清学的に異なるパラ胞子の結晶を
生成することが報告された。しかしながら、BT菌株の多
くにより産生される、副ピラミッド形の、主要な結晶の
形態の１つは、P1として知られているタンパク質から構
成されている。P1は、約130,000ダルトンの分子量を有
し、そして、また胞子殻中に存在することができる。パ
ラ胞子結晶P1の遺伝子および他のタンパク質結晶のほと
んどの遺伝子は、BT中で各種大きさの異なるプラスミド
の多数のうちの１または２以上の上に存在する。

3.発明の要約本発明は、鱗翅類（Lepidoptera）目の昆虫に対する
殺虫活性を有する、バチルス・スリンギエンシス（Baci
llus thuringiensis）の生物学的に純粋な菌株を提供
する。これらの菌株は、キュアリング（以下、キュアー
ということもある）および接合（conjugation）の手順
により誘導された。

また、本発明の目的は、BT菌株における毒素タンパク
質をコードする（または遺伝情報を指定する）遺伝子を
含有するプラスミドを認識し、これにより、プラスミド
のキュアーおよび接合の実験のために特定の菌株を選択
的に使用して、特定のまたは増大した殺虫活性を有する
BTの菌株を誘導する新規な方法を提供することである。

さらに、本発明の目的は、これらの新規なバチルス・
スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）菌株で
鱗翅類（Lepidoptera）目の昆虫を抑制する方法を提供
することである。本発明の上の実施態様のすべては、以
下の本発明の説明において詳しく記載される。

4.図面の簡単な説明第１図は、BD1−１およびいくつかの誘導された菌株
からの可溶化された結晶のゲル電気泳動の写真であり、
種々の菌株におけるP1およびP2の結晶タンパク質の示差
的産生を示す。

第２図は、ゲル電気泳動の写真であり、これは、§5.
1〜5.8に記載しかつ第３図に図解するように構成され
た、NRRLに寄託された新規なBT菌株のプラスミドおよび
また、供与体および受容体として使用するBT菌株の列を
示す。

第３図は、§5.1〜5.8に記載する新規なBT菌株の構成
を示すフローチャートである。

第４図は、ゲル電気泳動の写真であり、これは、§§
5.9〜5.11に記載しかつ第５図に図解するように構成さ
れた、NRRLに寄託された新規なBT菌株のプラスミド、な
らびに供与体および受容体として使用するBT菌株の列を
示す。

第５図は、§5.9〜5.11に記載する新規なBT菌株の構
成を示すフローチャートである。

5.発明の説明一般に、本発明は、鱗翅類（Lepidoptera）目の昆虫
に対する殺虫活性を有する、新規なバチルス・スリンギ
エンシス（Bacillus thuringiensis）菌株を提供す
る。これらの菌株の生物学的に純粋な培養物は、NRRLに
寄託された。後述するバイオアッセイは、これらの菌株
の活性を確証した。したがって、BTのこれらの菌株は、
鱗翅類、ジプテラまたは甲虫類の昆虫に対して有用な殺
虫剤組成における活性成分の少なくとも１つのとして使
用するために好ましい。

本質的に、本発明は、いくつかの技術（例えば、新規
なBT菌株の分離、毒素プラスミドのキュアーおよび転移
（transfer）、同質遺伝子系統の使用、プラスミド列の
アニーリング、特異的毒性の個々の毒素プラスミドへの
帰属）を組み合わせおよび最適化して、所定の感受性昆
虫に対してより大きい毒性のためにBT菌株を変性する、
新規な系統的なアプローチを達成することからなる。

一般に、本発明は、工程：（ａ）殺虫毒素のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝
子により与えられた特定の殺虫活性を有する第１バチル
ス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）菌
株を中間のバチルス（Bacillus）受容体菌株の混合し、
前記遺伝子はプラスミドに位置し、これにより前記中間
のバチルス（Bacillus）受容体菌株は殺虫活性を与える
プラスミドを接合により獲得し、（ｂ）殺虫活性を与える前記プラスミドを獲得した、前
記中間のバチルス（Bacillus）受容体菌株を分離および
同定し、（ｃ）工程（ｂ）において分離されたトランスコンジュ
ガントの中間のバチルス（Bacillus）受容体菌株を第２
バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensi
s）菌株と混合し、これにより前記第２バチルス・スリ
ンギエンシス（Bacillus thuringiensis）菌株は、殺
虫活性を与えるブラスミドを、前記トランスコンジュガ
ントの中間のバチルス（Bacillus）受容体菌株から獲得
し、そして（ｄ）選択的に標的にした殺虫活性を有する、工程
（ｃ）の培養混合物からトランスコンジュガントを分離
および同定する、からなる、選択的殺虫活性を有するバチルス・スリンギ
エンシス（Bacillus thuringiensis）を産生する方法
を提供する。

例えば、本発明の好ましい実施態様において、第１バ
チルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensi
s）菌株は、例えば、鱗翅類活性を有し、第２バチルス
・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）菌株
（またはB.cereus）とまず混合し、これにより前記第２
バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensi
s）菌株は鱗翅類（Lepidoptera）に対する活性を獲得す
る（接合により）。毒素をエンコードするプラスミドを
獲得した菌株は、ゲル電気泳動のような方法により同定
して、そのプラスミドの列を決定し、この列はその第２
菌株中に存在することが知られているものの外に、獲得
したプラスミドを示すであろう；毒素プラスミドを獲得
した菌株を分離し、次いでそのトランスコンジュガント
（transconjugant）の菌株を、選択的殺虫活性（すなわ
ち、鱗翅類の昆虫またはジプテラまたは甲虫類と異な
る）を有する第３バチルス・スリンギエンシス（Bacill
us thuringiensis）と、接合に好適な条件下に、混合
し、これにより活性を有する前記第２バチルス・スリン
ギエンシス（Bacillus thuringiensis）は、前記トラ
ンスコンジュガント菌株から、接合により、殺虫活性を
与えるプラスミドを獲得する。したがって、生ずるBT菌
株は、鱗翅類の有害生物の異なる種（それらの各々は特
定のBT毒素に対して変化する程度の感受性を有する）、
または鱗翅類およびジプテラの昆虫、鱗翅類および甲虫
類、またはジプテラおよび甲虫類の有害生物に対して、
広い範囲の選択的活性を有する。本発明の新しいBT菌株
は、より大きい特異性および毒性の毒素プラスミドの無
尽蔵の源として働くことができ、次いでこれらはいくつ
かの受容体菌株のいずれかの中に接合により転移して、
毒素プラスミドおよび毒素タンポク質の従来未知の組み
合わせをもつ新規な菌株を発生させることができる。

本発明は、また、BTおよび適当な担体の混合物からな
る鱗翅類、甲虫類またはジプテラに対して使用するため
の新規な殺虫剤を提供する。BT菌株は、胞子、全有機
体、またはこれらの組み合わせの形態で使用することが
できる。適当な担体は、当業者に知られている、ある数
の固体または液体のいずれの１つであることもできる。

本発明のこれらのすべての面は、下に詳述しかつ下の
実施例において例示する。

5.1 バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuring
iensis）のキュアーおよび接合バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringien
sis）（BT）の殺虫性菌株は、関係する種のB.cereus
と、胞子形成の間のタンパク質の封入体、パラ胞子の結
晶の生成により区別される。結晶を構成するタンパク質
は、個々のBT菌株の毒性（すなわち、鱗翅類、ジプテ
ラ、または甲虫類のいずれの幼虫が影響を受けるか）を
決定する。毒素結晶のタンパク質をエンコードする遺伝
子は、染色体外DNA分子（プラスミド）上に位置する。
大量の毒素結晶タンパク質を構成するBT菌株は、種々の
技術のアプローチにより２またはそれ以上の明確な毒素
プラスミドを含有することが示された。ある菌株中の毒
素プラスミドの各々はそれ自体の毒素タンパク質の遺伝
情報を指定し、前記タンパク質は存在する他の毒素タン
パク質によりエンコードされる毒素タンパク質と、免疫
学的、電気泳動的、または他の技術的手段により区別す
ることができる。

キュアー（curing）はプラスミドDNAの損失である。
１または２以上のプラスミド（多数の毒素プラスミドの
BT菌株における）、および可能ならば無毒のプラスミド
さえのキュアーは、残りの毒素プラスミドによりエンコ
ードされる毒素タンパク質の産生の増加に導くことがで
きる。残りの毒素プラスミドは、損失した毒素プラスミ
ドがなすより多くの潜在的毒素をエンコードする場合、
誘導された部分的にキュアーされた菌株の毒性は、タン
パク質基準で、および時には原料（raw）（投与量）基
準で、より大きいであろう。こうして、特定のプラスミ
ドのBT菌株をキュアーすることによって、それが合成す
る毒素タンパク質のタイプを変更して、所定の標的昆虫
に対してより大きい毒素を与えることができる。このこ
とが意味し得るように、毒素誘導体はその昆虫に対して
特異性であるであろう。

プラスミドのキュアーは多数の異なる方法により達成
することができる。プラスミドのキュアーは事実自発的
に低いレベルで起こり、そしてこれらの自発的にキュア
ーされた菌株は日常のスクリーニングにより検出するこ
とができる。しかしながら、キュアーは、また、培養温
度の増大により、活発に誘発することができる。これは
好ましくは段階的に、すなわち、漸進的に約37℃から約
45℃にすることによってなされる。菌株を洗浄剤，例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウムに暴露するか、あるいはDN
Aの複製を妨害する化学物質、例えば、アクリジン、臭
化エチジウムまたはノボビオシンに暴露して、また、プ
ラスミドのキュアーの頻度増加することができる。本発
明の目的に対して、高温は一般に好ましい。中程度の大
きさの範囲（約40〜90メガダルトン（Md））のBT毒素プ
ラスミドは、通常、それらを支持する菌株から他のBTま
たはB.cereus菌株中に転移することができる。受容体菌
株が結晶陰性（Cry^-）である場合、毒素プラスミドの獲
得はそれを結晶産生（Cry⁺）に転化する。この方法は接
合的プラスミドの転移（conju gative plsmid trans
fer）として知られており、そして毒素プラスミドとし
てプラスミドを同定する１つの方法である。それは、同
質遺伝子のバックグラウンドにおける毒素プラスミドを
比較することによって、個々の毒素プラスミドの毒性お
よび特異性を決定するために使用することができる。単
一の毒素プラスミドを担持するトランスコンジュガント
（すなわち、これは本来同質遺伝子の菌株であることが
できた）は、順番に供与体として使用することができ、
そして１または２以上の毒素プラスミドを既に担持する
菌株は受容体として使用し、そして追加の毒素プラスミ
ドを獲得することができる（上の節5.0および下の節5.
6、5.7、5.8、5.10および5.11に記載するように）。

5.2 HD−１変異型の分離 HD−１、すなわち、変種クルスタキ（kurstaki）（鞭
毛の血清型3ab）のBT菌株は、米国において鱗翅類の有
害生物を抑制するために最も頻繁に使用されているBT菌
株である。BD−１を広範なキュアー操作にかけて、綿植
物を攻撃する幼虫の有害生物、ことにヘリオチス（Heli
othis）種、H.virescens、以後HVと呼ぶ、およびH.ze
a、以後HZと呼ぶ、に対する特異性および活性を改良す
ることが努力された。プラスミドの含量が、１または２
以上のプラスミドの損失（例えば、部分的キュアー）ま
たはそれらのプラスミド列中により複雑な変化を有する
ことによって変更された、HD−１変異型の群を発生さ
せ、そしてHVおよびHZに対してバイオアッセイされた。

個々のプラスミドの損失は、HD1−１（野生型の菌
株）が２つの毒素プラスミド、44および115Mdの大き
さ、を含有することを示した。115−Mdのプラスミドは
２つの型の毒素タンパク質の結晶の遺伝情報を指定し
た：約130,000ダルトンの大きさのタンパク質を含有す
る、P1として知られている、複ピラミッドの結晶、およ
び68,000ダルトンの大きさのタンパク質から構成されて
いる、P2として知られている、平らな立方形の結晶。11
5−Mdのプラスミドは、少なくとも２つの明確なP1毒素
遺伝子、4.5および6.6遺伝子として知られている、を含
有する。44−Mdの毒素プラスミドはP1型タンパク質の遺
伝情報を指定し、このタンパク質は115−Mdのプラスミ
ドによりエンコードされるものと区別され、大きさがほ
ぼ2000ダルトンだけわずかに小さい。

このわずかに小さいP1タンパク質の遺伝情報を指定す
る遺伝知は、5.3型遺伝子として知られている。44−Md
毒素プラスミドを欠くHD−１変異型の培養物は、両者の
毒素プラスミドを担持し（したがってより大きい数のP1
遺伝子を含有する（HD−１）変異型により作られたもの
より小さい、複プラミッド形の（P1）結晶を作った。他
方において、このような菌株はP2結晶を作り、この結晶
はより小さいP1毒素プラスミドを支持する菌株における
ものよりも顕著に大きかった。したがって、１つのプラ
スミド、115−Md、を担持する菌株は、より大きい量のP
2毒素を作り、そしてより大きい産生されたP2対P1の比
を有した。大きい群のHD−１変異型からの結晶の電気泳
動は、P2の増加する大きさの顕微鏡観測を確証した。

第１図において、両者の毒素プラスミド（HD1−１、
−３、−５、−26）または115−Mdのプラスミドのみ（H
1−２、−11、−12、−14、−27、−30）を担持する菌
株からの毒素タンパク質は、電気泳動され、そして大き
さに従って分割された。同一の条件下に増殖させた、等
しい量の培養物をゲル上に配置した。115−Mdのみを担
持する菌株は、P1バンドの強度のほぼ50％の減少を示
し、44−Mdプラスミド上のP1毒素遺伝子の損失を反映し
た。しかしながら、P2タンパク質バンドは、これらの菌
株におけるP2タンパク質の収量の増加により引き起こさ
れる、強度の50〜100％の上昇を示した。

第１図における誘導体のいくつかはプラスミドのキュ
アーよりおおくのラジカルの変更を行った:HD1−15、−
18、−19、−21、および−23において、44−Mdプラスミ
ドは損失され、次いで115−Mdプラスミド上のP1毒素遺
伝子の１つ（「6.6」遺伝子）は自発的に欠失されたの
で、これらの誘導体は２つだけの活性毒素遺伝子、すな
わち、4.5型のP1遺伝子およびP2遺伝子を有する。第１
図における遺伝子により確証された顕微鏡の観察は、こ
の菌株の細胞がおおよそ同量のP1およびP2タンパグ質を
産生することをを示す。

5.3 HD269−２（EG2069）の分離 BT菌株HD−269は、U.S.D.Aから２つの密接に関係する
変異型の混合培養物として得られた。これらの変異型の
存在は、培養物を受け取った時、知られていなかった。
これらの変異型の両者を分離し、特徴づけ（例えば、HD
−１の変異型を使用して）そして生物学的に純粋な培養
物として確立された。一方の変異型HD269−１（EG206
8）は110Mdおよび69Mdの大きさの２つの毒素プラスミド
を含有した。他方の変異型HD269−２（EG2069）は、部
分的にキュアーされたHD269−１の誘導体であり、そし
て69−Mdの毒素プラスミドを欠いた。

5.4 HD263−４（EG2038）の分離 HD−263親菌株、HD263−１（EG2035）、は大きさ110M
d、60Mdおよび44Mdの３つの毒素プラスミドを含有す
る。HD263−１はディフコ（Difco）栄養プロス中の震盪
しながら高温（42℃）において一夜増殖させ、次いで単
一のコロニーを一夜の培養物から分離した。44−Mdの毒
素プラスミドを失ったコロニーは、アガロースゲル上の
単一のコロニーのランダムスクリーニングにより、44−
Mdのプラスミドの不存在を検出することによって発見
し、そしてHD−263−４と命名した。

5.5 HD−263−４−１（EG2094）の分離 BT菌株HD1−９（EG2009）（参照、表IV）を、栄養塩
類ブロス中で受容体菌株HD73−26と一緒に増殖させるこ
とによって、供与体として使用した。栄養塩類ブロス
は、Mg⁺⁺（１ミリモルに）、Ca⁺⁺（0.7ミリモルに）お
よびMn⁺⁺（0.05ミリモルに）を補充した0.8％のディフ
コ（Difco）栄養ブロスから成っていた。プラスミドの
転移は、供与体および受容体の菌株の胞子を栄養塩類ブ
ロス中に接種し、そして菌株を一緒に31時間30℃におい
ておだやかに震盪しながら増殖させることによって実施
した。その後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマ
イシン含有平板（HD73−26はストレプトマイシンに対し
て抵抗性である）を使用することによって選択し、次い
でCry⁺コロニーを相コントラスト顕微鏡検査により同定
した。このようにして、トランスコンジュガントのHD73
−26−４（EG2236）が作られ、これはHD1−９から44＋M
dの転移可能なP1−毒素解読プラスミドを獲得した。次
いで、HD73−26−４は、その胞子およ受容体菌株HD263
−４（EG2038）の胞子を一緒に液体M27ブロス（処方は
節6.1に記載されている）中に接種し、そしてそれらを
一緒に30℃において７時間おだやかに震盪しながら増殖
させることによって、供与体として使用した。HD73−26
−４から44＋MdのP1毒素プラスミドを獲得した、トラン
スコンジュガントのHD263−４−１ EG2094）を、アガ
ロースゲル上で受容体−型（P1P2＋）コロニーのランダ
ムスクリーニングにより分離した。

5.6 HD263−４−5A（EG2101）の分離 BT菌株HD−122A（EG2175）を、受容体菌株HD73−26と
一緒に増殖させることにより、両者の菌株の胞子をM27
ブロス（組成は下の節6.1に記載されている）中に接種
し、そして一緒に８時間30℃においておだやかに震盪し
ながら増殖させることによって、供与体として使用し
た。その後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマイ
シン含有平板（HD73−26はストレプトマイシンに対して
抵抗性である）を使用することによって選択し、次いで
Cry⁺コロニーを相コントラスト顕微鏡検査により同定し
た。このようにして、トランスコンジュガントのHD73−
26−23（EG2255）が作られ、これはHD−122Aから46＋お
よび5.4Mdのプラスミドを獲得した。次いで、HD73−26
−23は、その胞子および受容体菌株HD263−４（EG203
8）の胞子を一緒に液体M27ブロス（処方は節6.1に記載
されている）中に接種し、そしてそれらを一緒に30℃に
おいて８時間おだやかに震盪しながら増殖させることに
よって、供与体として使用した。HD73−26−23から46＋
MdのP1毒素プラスミドを獲得した、トランスコンジュガ
ントのHD263−４−5A（EG2101）を、アガロースゲル上
で受容体−型（P1P2＋）コロニーのランダムスクリーニ
ングにより分離した。

5.7 HD269−２−７（EG2348） BT菌株HD−122A（EG2175）を、受容体菌株HD73−26と
一緒に増殖させることにより、両者の菌株の胞子をM27
ブロス中に接種し、そして一緒に８時間30℃においてお
だやかに震盪しながら増殖させることによって、供与体
として使用した。その後、受容体菌株のコロニーを、ス
トレプトマイシン含有平板（HD73−26はストレプトマイ
シンに対して抵抗性である）を使用することによって選
択し、次いでCry⁺コロニーを相コントラスト顕微鏡検査
により同定した。このようにして、トランスコンジュガ
ントのHD73−26−23（EG2255）が作られ、これはHD122A
から46＋および5.4Mdのプラスミドを獲得した。次い
で、HD73−26−23は、その胞子および受容体菌株HD269
−２（EG2069）の胞子を一緒に液体M27ブロス中に接種
し、そしてそれらを一緒に30℃において16時間おだやか
に震盪しながら増殖させることによって、供与体として
使用した。HD73−26−23から46＋MdのP1毒素プラスミド
を獲得した、トランスコンジュガントのHD269−２−７
（EG2348）を、アガロースゲル上で受容体−型（P1P2
＋）コロニーのランダムスクリーニングにより分離し
た。

5.8 HD269−２−30（EG2371）の分離穀粒ダスト（grain dust）から分離した、BT菌株EG2
461を、受容体菌株HD73−26と一緒におだやかに震盪し
ながら増殖させることにより、両者の菌株の胞子をM27
ブロス中に接種し、そして一緒に9.5時間30℃において
増殖させることによって、供与体として使用した。その
後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマイシン含有
平板（HD73−26はストレプトマイシンに対して抵抗性で
ある）を使用することによって選択し、次いでCry⁺コロ
ニーを相コトラスト顕微鏡検査により同定した。このよ
うにして、トランスコンジュガントのHD73−26−67（EG
2299）が作られ、これはEG2461からL.D.E.および47＋Md
のプラスミドを獲得した。次いで、HD73−26−67は、そ
の胞子および受容体菌株HD269−２（EG2069）の胞子を
一緒に液体M27ブロス中に接種し、そしてそれらを一緒
に30℃において68時間おだやかに震盪しながら増殖させ
ることによって、供与体として使用した。L.D.E.および
EG2461から47＋Mdのプラスミドを獲得した、トランスコ
ンジュガントのHD269−２−７（EG2348）を、アガロー
スゲル上で受容体−型（P1P2＋）コロニーのランダムス
クリーニングにより分離した。

5.9 HD279−72（EG2157）の分離 HD−279親菌株、HD279−１（EG2154）は、大きさ110M
d、60Md、および44Mdの３つの毒素プラスミドを含有す
る。HD279−１をルリア（Luria）寒天（１％のペプトン
0.5％の酵母エキス、0.5％のNaCl、1.2％の寒天）上で
高温（43℃）において数日間増殖させ、次いでコロニー
を単細胞から誘導し、過剰に増殖したコロニーから分離
した。60−Mdの毒素プラスミドを失ったコロニーは、ア
ガロースゲル上の単一のコロニーの再スクリーニングに
より発見し、そしてHD279−72（EG2157）と命名した。

5.10 HD269−２−８（EG2349）の分離 BT菊株HD−232B（EG2167）を、受容体菌株HD73−26と
一緒に増殖させることにより、供与体として使用した。
両者の菌株の胞子をM27ブロス中に接種し、そして一緒
に８時間30℃においておだやかに震盪しながら増殖させ
た。その後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマイ
シン含有平板（HD73−26はストレプトマイシンに対して
抵抗性である）を使用することによって選択し、次いで
Cry⁺コロニーを相コントラスト顕微鏡検査により同定し
た。このようにして、トランスコンジュガントのHD73−
26−25（EG2257）が作られ、これはHD232Bから50⁺、L.
D.E.、9.6、5.4、および1.4Mdのプラスミドを獲得し
た。次いで、HD73−26−25は、その胞子および受容体菌
株HD269−２（EG2069）の胞子を一緒に液体M27ブロス中
に接種し、そしてそれらを一緒に30℃において16時間お
だやかに震盪しながら増殖させることによって、供与体
として使用した。HD232Bから50⁺、L.D.E.、9.6、5.4、
および1.4MdのP1毒素プラスミドを獲得し、およびまたH
D73−26−25から9.6Mdおよび1.4Mdのプラスミドを獲得
し、そしてHD269−２に対して自然の7.5Mdのプラスミド
失った、トランスコンジュガントのHD269−２−８（EG2
349）を、アガロースゲル上で受容体−型（P1P2＋）コ
ロニーのランダムスクリーニングにより分離した。

5.11 HD1−19−８（EG2397）の分離 BT菌株HD−137A（EG2161）を、受容体菌株HD73−26と
一緒に増殖させることにより、供与体として使用した。
両者の菌株の胞子をM27ブロス中に接種し、そして一緒
に８時間30℃においておだやかに震盪しながら増殖させ
た。その後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマイ
シン含有平板（HD73−26はストレプトマイシンに対して
抵抗性である）を使用することによって選択し、次いて
Cry⁺コロニーを相コントラスト顕微鏡検査により同定し
た。このようにして、トランスコンジュガントのHD73−
26−34（EG2266）が作られ、これはHD137Aから42⁺Mdの
プラスミドを獲得した。次いで、HD73−26−34は、その
胞子および受容体菌株HD1−19（EG2019）の胞子を一緒
に液体M27ブロス中に接種し、そしてそれらを一緒に30
℃において７時間おだやかに震盪しながら増殖させるこ
とによって、供与体として使用した。HD73−26−34から
42⁺MdのP1毒素プラスミドを獲得した、トランスコンジ
ュガントのHD1−19−８（EG2397）を、アガロースゲル
上で受容体−型（P1P2＋）コロニーのランダムスクリー
ニングにより分離した。

5.12 新規なBT菌株の分離および構成の要約 HD−263およびHD−269の部分的にキュアーしたおよび
トランスコンジュガントの誘導体を包含する、本発明に
関係するいくつかの菌株の由来および含量を表１に記載
し、それらのいくつかはNRRLに寄託されている。

表１ HD7−１（EG2180）：フランスからの原形菌株var.クル
スタキ（kurstaki）。

プラスミド：50、50、7.5、5.4、5.2、4.9Md。

毒素プラスミド:50（P1） HD73−26（EG2205）：50、50、7.5、5.4および5.2Mdの
プラスミドの損失およびストレプトマイシン抵抗性の付
加により、原形菌株HD73−１から誘導された。

プラスミド:4.9Md 毒素プラスミド：なし（結晶陰性） HD263−１（EG2035）：英国からの原形菌株var.クルス
タキ（kurstaki）。

プラスミド:130、110、60、44、43、7.5、5.4、5.2、5.
0、0.4、９、1.4Md。

毒素プラスミド:110（P1、P2）、60（P1）、44（P1） HD263−４（EG2038）:44−mdの毒素プラスミドのキュア
ーした菌株HD263−１。

毒素プラスミド:110（P1、P2）、60（P1） HD263−４−１（EG2094）:HD−１の44−Md（P1）毒素プ
ラスミドを獲得した受容体としてHD263−４を使用した
トランスコンジュガント。

HD263−４−5A（EG2101）:HD−122Aの46Md（P1）毒素プ
ラスミドを獲得した受容体としてHD263−４を使用した
トランスコンジュガント。

HD269−１（EG2068）：英国からの原形菌株var.クルス
タキ（kurstaki）。

プラスミド:130、110、69、49、44、7.5、5.4、5.2、5.
0、4.9および4.9Md。

毒素プラスミド:110（P1、P2）、69（P1） HD269−２（EG2069）:69Mdの毒素プラスミドの自発的損
失によりHD269−１から誘導された。

HD269−２−７（EG2348）:HD−122Aから46（P1）Mdの毒
素プラスミドを獲得した受容体としてHD269−２を使用
するトランスコンジュガント。

HD269−２−30（EG2371）:EG2461から47Md（P1）毒素プ
ラスミドを獲得した受容体としてHD269−２を使用する
トランスコンジュガント。

HD1−１（EG2001）：米国からの原形菌株var.クルスタ
キ（kurstaki）。

プラスミド:130、115、53、51、44、29、9.6、5.4、5.
2、5.0、4.91.4MdおよびL.D.E.。

毒素プラスミド:115（P1、P2）、44（P1） HD1−９（EG2009）:130、115、51、9.6および5.4Mdのプ
ラスミドおよびL.D.E.の損失により原形攪拌HD1−１
（米国）から誘導された。

プラスミド:53、44、29、5.2、4.9、1.4Md。

毒素プラスミド:44（P1） HD−122A（EG2175）：米国から原形菌株var.アイザワイ
（aizawai）。

プラスミド:120、110、78、50、46、43、3.3、31、6.0
（O.C.）、8.0.5.4、4.7、3.5MdおよびL.D.E.。

毒素プラスミド:110（P1）、46（P1） EG2461:米国カンサス州の穀粒ダストの試料（コムギ）
から分離された新規なBT。

プラスミド:120、110、47、44、34、L.D.E.、6.0（O.
C.）、8.2、8.0、0.7.2、7.0および3.5Md。

毒素プラスミド:110（P1）、47（P1） HD279−72（EG2157）:60Mdの毒素プラスミドの損失によ
りHD279−１から誘導された。

HD73−26−25（EG2257）:HD−232B（EG2167）から50
⁺（P1）、9.5、5.4、1.4MdのプラスミドおよびL.D.E.を
獲得した受容体としてHD73−26を使用するトランスコン
ジュガント。

HD269−２−８（EG2349）:HD73−26−25（EG2257）から
50⁺（P1）、9.6およびブラスミドおよびL.D.E.を獲得
し、そして7.5Mdのプラスミドを有する受容体としてHD2
69−２を使用するトランスコンジュガント。

HD73−26−34（EG2266）:HD−137A（EG2161）から42⁺Md
（P1）毒素プラスミドを獲得した受容体としてHD73−26
を使用するトランスコンジュガント。

HD1−19−８（EG2397）:HD73−26−34（EG2266）から42
⁺Md（P1）毒素プラスミドを獲得した受容体としてHD1−
19（EG2019）を使用するトランスコンジュガント。

「L.D.E.」はほぼ10Mdの大きさの線状DNA要素であ
る。

「OC」はプラスミドのDNAが開いた円として主として
存在することを示す。

「＿」haプラスミドが毒素プラスミドであることを示
す。

NRRLに寄託された新規なBT菌株のプラスミドおよびそ
れらの分離に使用した主な前駆体のプラスミドの列は、
第２図および第４図においてゲル上で示されている。節
5.3〜5.11に記載する本発明の新規なBT菌株の構築の通
路を第３図および第５図に要約する。

5.13 BT菌株を組み込んだ産生物および配合物 BTは鱗翅類、ジプテラ、および甲虫類の昆虫に対する
活性をもつ効力のある殺虫性化合物として使用すること
ができる。したがって、本発明の範囲内において、これ
らのBT菌株を殺虫剤（活性成分）として単独で、あるい
はBTと他の有機体との混合物の一部分として利用するこ
とができる。BTのこれらの菌株を含有する本発明の組成
は、殺虫的に有効量で適用し、この量は因子、例え
ば、、抑制すべき特定の昆虫、処置すべき特定の植物お
よび殺虫活性組成物を適用する方法に依存する。好まし
い殺虫剤配合物は、BTを、単独で、あるいは他の有機体
とともに、所望の担体と混合することによってつくられ
る。配合物はダストとしてまたは油（植物性または鉱物
性）または水中の懸濁液として、湿潤性粉末として、あ
るいは農学上の適用に適当な他の材料中で、適当なアジ
ュバントを使用して、投与することができる。適当な担
体は固体または液体であり、そして配合技術において通
常使用する物質、例えば、天然または再生の鉱物性物
質、溶媒、分散剤、湿潤剤、増粘剤、結合剤または肥料
対応することができる。

BTを含有する本発明の組成物は、適当な昆虫の生息場
所に殺虫的に有効量で適用し、この有効量は、前述した
ように、因子、例えば、抑制すべき特定の昆虫、処置す
べき特定の植物および殺虫活性組成物を適用する方法に
依存する。

本発明の方法により保護される標的作物（すなわち、
鱗翅類、ジプテラ、および甲虫類の潜在的生息場所）
は、例えば、次の植物の種からなるが、これらに限定さ
れない：穀類（例えば、コムギ、オオムギ、ライ、オー
ト麦、イネ、モロキシおよび関連する作物）、ビート、
マメ科植物、油の植物（例えば、ポピー、オリーブおよ
びヒマワリ）、キュウリ植物、繊維の植物、柑橘類、野
菜（例えば、レタス）、落葉性樹木および針葉樹。

一般に、好ましい組成物は、通常0.1〜99％、１〜50
％の殺虫剤微生物バチルス・スリンギエンシス（Bacill
us thuringiensis）またはそれと他の活性成分との組
み合わせ、１〜99.9％の固体または液体のアジュバン
ト、および０〜25％、好ましい0.1〜10％の界面活性剤
を含有する。

固体または液体のアジュバントを含有する配合物は、
既知の方法において、例えば、活性成分を増量剤、例え
ば、溶媒、固体担体、およびある場合において、表面活
性化合物（界面活性剤）と均質に混合および／または粉
砕することによって調製される。

適当な液状担体は、植物性油、例えば、ヤシ油または
大豆油、鉱油または水である。例えば、ダストおよび分
散性粉末のために使用する固体の担体は、通常天然の鉱
物繊維、例えば、方解石、タルク、カオリンまたはアタ
パルジャイトである。物理学的性質を改良するために、
また高度に分散したケイ酸または高度に分散した吸収性
ポリマーを添加することが可能である。適当な粉砕した
吸着性担体は多孔質のタイプ、例えば、軽石、破壊煉
瓦、セプライトまたはベントナイトである。適当な非吸
着性担体はケイ酸塩または砂のような材料である。さら
に、多数の予備造粒した材料または無機または有機の混
合物、例えば、ことにドロマイトまたは粉砕した植物残
留物を使用することができる。

配合すべき活性成分の性質に依存して、適当な表面活
性化合物はすぐれた乳化性、分散性および湿潤性を有す
る非イオン性、陽イオン性および／または陰イオン性で
ある。用語「界面活性剤」は、また、界面活性剤の混合
物からなるとして理解されるであろう。

適当な陰イオン性界面活性剤は、水溶性の石鹸および
水溶性の表面活性化合物であることができる。

適当な石鹸は高級脂肪酸（C₁₀−C₁₁）のアルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩または非置換アンモニウム塩、
例えば、オレイン酸またはステアリン酸、または、例え
ば、ヤシ油またはタロウ油から得ることができる天然の
脂肪酸の混合物のナトリウム塩またはカリウム塩であ
る。さらに安定な界面活性剤は、また、脂肪酸のメチル
タウリン塩ならびに変性および未変性のリン脂質であ
る。

しかしながら、より頻繁に、いわゆる合成界面活性
剤、ことに脂肪族スルホネート、脂肪族サルフェート、
スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキルア
リールスルホネートを使用する。

脂肪族スルホネートまたはサルフェートは、通常、ア
ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換アンモ
ニウム塩の形態であり、そして一般にドデシル硫酸のC₆
−C₂₂アルキルエステル、ナトリウムまたはカリウム
塩、あるいは脂肪酸から得られたアルコールサルフェー
トの混合物である。これらの化合物は、また、脂肪族ア
ルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステ
ルおよびスルホン酸の塩類の混合物からなる。スルホン
化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは、２つのス
ルホン酸基および１つの脂肪酸基（約８〜22個の炭素原
子を含有する）を含有する。アルキルアリールスルホネ
ートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナ
フタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸／ホ
ルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムま
たはトリエタノールアミン塩である。また、対応するホ
スフェート、例えば、ｐ−ノニルフェノールと４〜14モ
ルのエチレンオキシドリン酸エステルの塩との付加物の
リン酸エステルの塩類は適当である。

非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ポリグリコー
ルエーテル誘導体または脂肪族または環式脂肪族のアル
コールまたは飽和または不飽和の脂肪酸およびアルキリ
ルフェノールであり、前記誘導体は３〜10のグリコール
エーテル基および（脂肪族）炭化水素部分中に８〜20個
の炭素原子およびアルキルフェノールのアルキル部分中
に６〜18個の炭素原子を含有する。

他の適当な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオ
キシドとアルキプロピレングリコール、エチレンジアミ
ノポリプロピレングリコールとの水溶性付加物であり、
そしてアルキルポリプロピレングリコールは１〜10個の
炭素原子をアルキル鎖中に含有し、前記付加物は20〜25
0のエチレングリコールエーテル基および10〜100プロピ
レングリコールエーテル基を含有する。

非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェノー
ルポリエトキシエタノール、ヤシ油、グリコールエーテ
ル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、ト
リブチルフェノキシポリエトキシエタノール、エチレン
グリコールおよびオクチルフェノキシエトキシエタノー
ルである。ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エス
テル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレ
エートは、また、適当な非イオン性界面活性剤である。

カチオン性界面活性剤は、好ましくは、置換基とし
て、少なくとも１つのC₈−C₂₂アルキル残基および、そ
れ以上の置換基として、低級非置換またはハロゲン化ア
ルキルベンジル、またはヒドロキシル化低級アルキルベ
ンジル残基を含有する、第四アンモニウム塩である。塩
類は好ましくはハライド、メチルサルフェートまたはエ
チルサルフェートの形態、例えば、ステアリルトリメチ
ルアンモニウムクロライドである。

6.バイオアッセイバイオアッセイは、既知量のBT粉末を含有するBT懸濁
液の既知量を、人工の寒天に基づく規定食の表面に局所
的に適用することによって実施される。この規定食はプ
ラスチックのカップ中に含有され、そしてカップごとに
表面積が均一である。多数のカップを処置投与量の各々
において処理する。液体担体を蒸発させた後、１匹の新
しく生まれた幼虫をカップの各々の中に配置し、次いで
カップに蓋をし、そしてアッセイを７日間30℃において
インキュベーションし、その時致死率を記録する。LC50
値をコンピューターのプログラムを経て決定し、このプ
ログラムは投与量−致死率のデータをプロビットに変換
し、そして試験の集団の50％が死亡する致死濃度を計算
する。タンパク質のLC50またはPLC50は、試料のLC50を
化学的アッセイにより決定した結晶タンパク質である試
料の百分率を掛けることによって計算する。

BT試料の原懸濁液は、粉末の20〜30mgを秤量して、ガ
ラスのねじこみカップのバイアル中に入れ、そして20ml
の0.005％のトリトンＸ−100を添加することによって調
製する。次いで、この懸濁液を約15秒間超音波処理す
る。

バイオアッセイは、一般に、１系列の８投与量から成
り、引き続く投与量の各々は前の投与量の1/2前の2/3で
ある。原懸濁液を使用して、最高の投与量を含有する管
を接種する。次いで、希釈を実施する。100μの適当
な懸濁液をその投与量の規定食のカップの各々の表面上
に配置する。液体を規定食の表面にわたって均一に広
げ、そして蒸発後、試験昆虫を規定食の表面上に配置す
る。

BT粉末は、次の順番の手順に従って調製することがで
きる。

１、最終のブロスまたはペリコン（Pellicon）濃縮物を
500mlの遠心びん中で20分間7000rpmで遠心する（JA−10
ローター内で）。（注、遠心前に、ブロスのpHを7.0に
調節する）。

２、上清み液を取り出し、そして廃棄する。

３、沈澱を最小量の脱イオン水中に再懸濁する。均質な
スラリーが得られるまで、磁気攪拌機上で10分間攪拌す
る。

４、４〜５体積のアセトンを添加する。

５、アセトンの懸濁液を30分間攪拌する。

６、懸濁液を10分間7500で遠心する（JR−10ロータ
ー）。

７、上清み液を廃棄し、そして沈澱をほぼ100mlのアセ
トン中に再懸濁する。

８、再懸濁した沈澱を攪拌する（ほぼ10分間または均一
なスラリーが得られるまで）。

９、ワットマン（Whatoman）＃１濾紙でスラリーを濾過
する。

10、工程７〜９を反復する。

11、最終の粉末をアルミニウムの秤量ボートに移し、そ
して一夜乾燥する。

12、収量について最終の粉末を秤量し、そして４℃にお
いて貯蔵するため60mlのポリプロピレンのびんに移す。

6.1 HD−１変異型のバイオアッセイ HD−１変異型は、バイオアッセイのために次のように
して増殖させた：胞子を50mlの無菌フラスコ内の5mlのM
27ブロス中に接種した。M27ブロスは33ミリモルのHPO₄
^＝およびH₂PO₄ ^-のアニオンの各々;98ミリモルのK⁺;0.17
％のペプトン;0.1％の牛肉エキス;150ミリモルのNaCl;
5.5ミリモルのグルコース;330μモルのMg⁺⁺、230μモル
のCa⁺⁺、および17μモルのMn⁺⁺（塩化物塩として添加し
た）から構成されている。培養物を30℃において震盪し
ながら３日間インキュベーションし、その時胞子形成お
よび結晶の形成は完結した。５μの無菌１−オクタノ
ールを泡消剤として添加し、そして培養物をかきまぜて
均質なな懸濁液を発生させ、無菌のプラスチック管に移
し、密閉し、そして５℃において貯蔵した。

鱗翅類の３種の幼虫についてのこれらの液体培養物の
バイオアッセイは、表IIに示すように、異なるHD−１変
異型が有意に異なる毒性を有することを明らかにした。

表 II 鱗翅類の異なる種に対するHD−１誘導体の毒性次に対する毒性 HZ TN SE HD1−１ 182 156 146 HD1−２ 107 78 165 HD1−12 104 117 157 HD1−19 105 NA 116 HZ＝H.zea;TN＝T.ni;SE＝S.exigua;Na＝得られず（PLC5
0はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面である） HD−１誘導体、例えば、HD1−12を受容体として接合
支配（mating）において使用し、その間受容体菌株の細
胞は供与体菌株から新しい毒素プラスミドを獲得するで
あろう。このようにして、HD1−12のトランスコンジュ
ガントが得られ、これらはHD1−12の115−Mdの自然プラ
スミド、およびBTの他の菌株から由来する１または２以
上の毒素プラスミドの両者を含有した。これらのトラン
スコンジュガントの菌株は、毒素プラスミドの新規な組
み合わせを収容し、致死的濃度／ナノグラム（ng）の毒
素タンパク質としてタンパク質基準で測定して、HD1−
１（もとの、親菌株）のそれらに関して改良された毒性
の毒素結晶をつくることを希望した。これは事実、表II
Iに示すような場合となった。

表IIIはHD1−12、HD1−12−９〜HD1−12−20の12のト
ランスコンジュガントのHVおよびHZについてのpLC50
（試験昆虫の５％を殺す毒素タンパク質の濃度）を記載
し、トランスコンジュガントの各々は異なる新しい毒素
プラスミド（12の異なる供与体菌株からの）を支持す
る。HVに対して、毒性はHD1−１より少し悪い（HD1−12
−11）からHD1−１の３倍の毒性（HD1−12−９）の範囲
に及ぶ。HZに対して、これらのトランスコンジュガント
はHD1−１ほど毒性でない（HD1−12−20）から２倍の毒
性（HD1−12−14）の範囲に及ぶ。これらのデータから
誘導することができる２つの重要な結論が存在する。BT
菌株は所定の昆虫に対して、プラスミドのキュアーおよ
び／またはプラスミドの獲得により改良することができ
る。さらに、ある種の標的な可能である；表IIIに表さ
れている12のトランスコンジュガントのうちで、HD1−1
2−９はHVに対して高度に毒性であるが、HZに対してHD1
−１ほどよくはない。逆に、トランスコンジュガントの
あるもの（例えば、HD1−12−15）はHZに対してHD1−１
よりすぐれるが、HVに対してHD1−１に劣っていた。

HD1−１、その変異型およびトランスコンジュガント
を使用して得られた結果に匹敵し得る結果は、また、本
来２またはそれ以上の毒素プラスミドを含有する、BT菌
株HD269を使用して得られた。これらの結果のいくつか
を表IVに示す。

6.2 BT菌株HD269−２−30のバイオアッセイ BT菌株HD269−２−30のバイオアッセイを、２つの異
なる粉末の配合を利用して、一般に§6.0および§6.1に
上に記載するようにして実施した。結果を下の表Ｖおよ
びVIに記載する。

表Ｖ BT Strain HD269−２−30 昆虫 PLC50 ON 3.2 HV 2.5 HZ 13.2 HZ 9.9 SE 37.9 SE 45.5 TN 15.2 TN 26.3 昆虫 ON＝Ostrinia nubilalisアワノメイガ HV＝Heliothis virescens タバコのガ HZ＝Hiliothis zea オオタバコガ SE＝Spodoptera exigua シロイチモンジヨトウ TN＝Trichoplusia ni イラクサキンウワバ（PLC50はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面であ
る）表 VI HD269−２−30のBT菌株昆虫 PLC50 HV 4.9 HZ 47.1 HZ 58.4 SE 62.6 SE 108.8 TN 24.5 TN 11.8 昆虫 HV＝Heliothis virescens タバコのガ HZ＝Hiliothis zea オオタバコガ SE＝Spodoptera exigua シロイチモンジヨトウ TN＝Trichoplusia ni イラクサキンウワバ（PLC50はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面であ
る）これらの結果が示すように、BT菌株HD269−２−30は
異なる鱗翅類の昆虫に対して変化する程度の活性を有す
る。

6.3 BT菌株HD269−２−７のバイオアッセイ BT菌株HD269−２−７のバイオアッセイを、２つの異
なる粉末の配合を利用して、一般に§6.0および§6.1に
上に記載するようにして実施した。結果を下の表VIIお
よびVIIIに記載する。

表 VII HD269−２−７のBT菌株昆虫 PLC50 LD 3.2 LD 8.0 HV 2.1 HV 1.1 HV 4.0 HZ 15.1 HZ 13.0 SE 45.1 TN 13.0 昆虫 LD＝Lymantria dispar マイマイガ HV＝Heliothis virescens タバコのガ HZ＝Hiliothis zea オオタバコガ SE＝Spodoptera exigua シロイチモンジヨトウ TN＝Trichoplusia ni イラクサキンウワバ（PLC50はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面であ
る）表 VIII HD269−２−７のBT菌株昆虫 PLC50 LD 2.8 HV 4.0 HV 3.3 HV 4.3 HZ 30.6 HZ 28.9 SE 46.0 SE 66.0 SE 52.0 TN 10.5 TN 12.3 昆虫 LD＝Lymantria dispar マイマイガ HV＝Heliothis virescens タバコのガ HZ＝Hiliothis zea オオタバコガ SE＝Spodoptera exigua シロイチモンジヨトウ TN＝Trichoplusia ni イラクサキンウワバ（PLC50はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面であ
る）これらの結果が示すように、BT菌株HD269−２−７は
異なる鱗翅類の昆虫に対して変化する程度の活性を有す
る。

6.4 BT菌株HD269−２のバイオアッセイ BT菌株HD269−２のバイオアッセイを、２つの異なる
粉末の配合を利用して、一般に§6.0および§6.1に上に
記載するようにして実施した。結果を下表IXおよびＸに
記載する。

表 IX HD269−２のBT菌株昆虫 PLC50 HV 1.7 HV 1.7 HZ 8.3 HZ 16.4 HZ 9.7 SE 25.7 SE 39.4 SE 57.7 昆虫 HV＝Heliothis virescens タバコのガ HZ＝Hiliothis zea オオタバコガ SE＝Spodoptera exigua シロイチモンジヨトウ（PLC50はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面であ
る）表Ｘ HD269−２のBT菌株昆虫 PLC50 HV 1.3 HZ 9.4 HZ 18.3 SE 94.0 SE 88.0 TN 15.7 LD 15.7 昆虫 LD＝Lymantria dispar マイマイガ HV＝Heliothis virescens タバコのガ HZ＝Hiliothis zea オオタバコガ SE＝Spodoptera exigua シロイチモンジヨトウ TN＝Trichoplusia ni イラクサキンウワバ（PLC50はナノグラムの調製物/600mm²の規定食表面であ
る）これらの結果が示すように、BT菌株HD269−２は異な
る鱗翅類の昆虫に対して変化する程度の活性を有する。

6.5 BT菌株HD1−19−８、HD279−72、HD263−４−１お
よびHD269−２−８のバイオアツセイ新規な菌株HD1−19−８、HD279−72、HD263−４−１
およびHD269−２−９のバイオアッセイを、一般に§6.0
および§6.1に上に記載する手順に従って実施し、そし
て菌株HD1−Ｓ−1980（商用BT調製物の国際標準）およ
びDIPEL 2X,商業的に入手可能なBT調製物（Abbott La
boratories、イリノイ州シカゴ）の毒性と比較した。

これらの結果が示すように、これらの新規な菌株は、
一般に、既知の菌株および商用調製物に関して改良され
た毒性を有する。

7. 微生物の受託本発明の範囲内に、BT微生物の胞子形成および非胞子
形成の両者の形態の分離した菌株が含有される。ここの
開示した組成物および方法において有用な微生物の例
は、次のバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thur
ingiensis）菌株であり、これらは農学研究培養物収集
所（Agricultural Research Culture Collection）
（NRRL）、イリノイ州ペオリア、にブタペフト条約に基
づき国際寄託され、そして次に列挙した受け入れ番号を
割り当てられた： B.thuringi ensis菌株受け入れ番号 HD263−４−１Ｂ−18205 HD263−４−5A Ｂ−18206 HD269−２Ｂ−18207 HD269−２−７Ｂ−18208 HD269−２−30 Ｂ−18209 HD269−２−８Ｂ−18346 HD279−72 Ｂ−18345 HD1−19−８Ｂ−18347 寄託された実施態様は個々の例示であるので、本発明
の１つの面は受託された微生物により範囲が制限されな
い。事実、ここに示しかつ記載したものに加えて種々の
変更は前の記載および添付図面から当業者にとって明ら
かとなるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き微生物の受託番号ＮＲＲＬＢ−１８２０７微生物の受託番号ＮＲＲＬＢ−１８２０８微生物の受託番号ＮＲＲＬＢ−１８２０９微生物の受託番号ＮＲＲＬＢ−１８３４５微生物の受託番号ＮＲＲＬＢ−１８３４６微生物の受託番号ＮＲＲＬＢ−１８３４７審判番号平6−14406 (72)発明者マカルソ，アンソニイアメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08879 ローレンス・プリンストンパイク2295 (56)参考文献特開昭61−181372（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開221024（ＥＰ，Ａ) ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ，158 （１），Ｐ．45−49（1983)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】鱗翅類（Lepidoptera）の昆虫に対して殺
虫活性を示す結晶性タンパク質を産生するバチルス・ス
リンギエンシス・バール．クリスタキ（Bacillus thur
ingiensis var.kurstaki）に属する細菌であって、ブタペスト条約の規制に基づくNRRLに国際寄託され、次
の寄託番号 NRRL Ｂ−18205 NRRL Ｂ−18345 NRRL Ｂ−18207 NRRL Ｂ−18346 NRRL Ｂ−18208 NRRL Ｂ−18347 NRRL Ｂ−18209 を有する菌株の群から選ばれた細菌。
【請求項２】請求の範囲第１項記載の細菌の少なくとも
１つと適当な担体との組み合わせを含んでなる殺虫剤組
成物。
【請求項３】担体が液体の担体である、請求の範囲第２
項記載の殺虫剤組成物。
【請求項４】担体が１または２以上の界面活性剤を含有
する、請求の範囲第３項記載の殺虫剤組成物。
【請求項５】担体が固体の担体である、請求の範囲第２
項記載の殺虫剤組成物。
【請求項６】固体の担体が、方解石、タルク、カオリ
ン、アタパルジヤイト、ケイ酸塩、砂、ドロマイト、お
よび植物残留物の粉砕物から成る群より選択される、請
求の範囲第５項記載の殺虫剤組成物。
【請求項７】担体が造粒した吸収性担体である、請求の
範囲第６項記載の殺虫剤組成物。