PL166433B1 - Sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez B. thuringlensis PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania owadobójczego produktu, wytwarzanego przez B. thuringiensis, znamienny tym, ze selekcjonuje sie mutanta lub wariant B. thuringiensis sposobem selekcji wariantów lub mutantów spontanicznych Bacillus thuringiensis zdolnych do wytwarzania zna- cznie wiekszych ilosci d-endotoksyn niz szczepy wyjsciowe, polegajacym na tym, ze szczep wyjsciowy lub mutanta szczepu wyjsciowego hoduje sie w podlozu plynnym, bulion hodowli rozprzestrzenia sie na podlozu odpowiednim do selekcji szczepów nie wytwarzajacych zarodniki i/lub wytwarzajacych zarodniki sporadycznie, wybiera sie przezroczyste kolonie i hoduje sie w podlozu, które nie uplynnia sie po podgrzaniu a nastepnie szczepy rzeczywiscie nie wytwarzajace zarodników oddziela sie przez poddawanie kolonii dzialaniu podwyzszonej temperatury, po czym tak wyselekcjonowane szczepy hoduje sie w odpowiednim podlozu hodowlanym, zawiera- jacym zródla wegla, azotu i innych skladników, w ciagu odpowiedniego okresu czasu, odzyskuje sie owadobójczy produkt zawierajacy d-endotoksyny sam lub w polaczeniu z komórkami i/lub zarodnikami z podloza hodowlanego, i ewentualnie produkt ten miesza sie z zarobkami dopu- szczalnymi do stosowania w rolnictwie. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez B. thuringiensis, zwłaszcza warianty i spotaniczne mutanty B. thuringiensis.

Handlowe preparaty Bacillus thuringiensis są szeroko stosowane do biologicznego zwalczania szkodników. Zaletą tego insektycydu jest wysoka selektywność w stosunku do wąskiego zakresu owadów i podatność na rozkład biologiczny.

Handlowe preparaty Bacillus thuringiensis mogą być stosowane do czasu zbiorów bez niekorzystnych efektów.

Bacillus thuringiensis jest aerobową, sporującą bakterią w kształcie walca, wytwarzającą w czasie sporulacji jedną lub więcej inkluzji zwanych ciałami parasporalnymi. Te kryształy składają się z białek o wysokiej masie cząsteczkowej, zwanych δ-endotoksynami. δ-endotoksyny są składnikiem dostępnych w handlu preparatów Bacillus thuringiensis.

Zidentyfikowano wiele szczepów B. thuringiensis aktywnych w różnych grupach owadzich gospodarzy. Dzielą się one na różne podgatunki w oparciu o ich antygeny rzęskowe. Szczególnie interesujące są Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki i subspecies aizawa i stosowane do zwalczania szkodliwych motyli, Bacillus thuringiensis subspecies israelensis stosowany do zwalczania szkodliwych muchówek i Bacillus thuringiensis subspecies tenebriosis stosowany do zwalczania chrząszczy.

O pierwszej izolacji bakterii Bacillus thuringiensis toksycznej dla chrząszczy doniesiono w 1983 roku (A. Krieg i inni, Z and Ent., 96, 500-508, opublikowany europejski opis patentowy EP0149162 A2).

Wyizolowana bakteria, oznaczona Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis została złożona w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem DSM 2803. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis wyizolowano w 1982 roku z martwej poczwarki wołka zbożowego. Tenebrio molitor (Tenebrionidae /Wołkowate/, Coleoptera). Szczep wytwarza w każdej komórce jeden kryształ parasporalny, który jest płaski, w kształcie płytki i ma długość krawędzi od około 0,8 μm do 1,5 pm. Należy on do serotypu H8a, 8b i fenotypu C laseczki Bacillus thuringiensis (Krieg i inni, System Appl. Microbiol., 9, 138-141, 1987, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4766203, 1988).

Szczep ten jest toksyczny tylko dla kilku larw chrząszczy zjadających liście (Chrysomelidare, Stonkowate), ale nieskuteczny przeciw gąsiennicom motyli, komarom (Diptera) i innym owadom.

Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis jest skuteczny w zwalczaniu larw stonki ziemniaczanej. Po pobraniu kryształu i sporów Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis lub izolowanych kryształów, larwy i niektóre przeobrażone formy dorosłe stonki ziemniaczanej (Leptinotarsa decemlineata) przestają jeść. Stadia larwalne L1-L3 giną w ciągu 1-3 dni (Schnetter i inni., „Fundamental and Applied Aspects of invertebrate pathology“, ed. R. A. Samson i inni, Proceedings of the 4th Int. Collequium of Invertebrate Patholofy, str. 555,1986).

Ostatnio wykazano, że Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis oprócz toksycznych dla chrząszczy kryształów wytwarza także inne ciała parasporalne, które są wrzecionowate, kuliste lub płytkowate (A. M. Huger i A. Krieg, J. Appl. Ent., 108, 490-497, 1989). Aktywność drugiego kryształu nie jest obecnie znana.

166 433

Do zwalczania szkodliwych chrząszczy stosuje się cztery dostępne w handlu preparaty Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Są to NOVODOR firmy Novo Nordisk A/S, TRIDENT firmy Saneloz, Di Terra firmy Abbott Laboratories Inc., i Foil firmy Ecogen.

O wyizolowaniu innych, szkodliwych dla chrząszczy szczepów Bacillus thuringiensis, doniesiono w 1986 roku (Hernnstadt i inni, Bio/Technology, t. 4,305-308,1986, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4764 372,1988). Szczep ten oznaczony „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, M7, został zdeponowany w Northern Regional Research Laboratory, USA pod numerem NRRL B-15939. Handlowy produkt oparty na „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, został opracowany przez firmę Mycogen Corp.

Porównawcze badania Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 2803 i „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, NRRL B-15939, obejmujące charakterystykę fenotypową komórek wegetatywnych, charakterystykę toksycznych ciał parasporalnych i analizę zawartego plazmidowego DNA wykazały, że „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“ jest identyczny z wcześniej wyizolowanym szczepem DSM 2803, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg i inni, J. Appl. Ent., 104,417-424,1987). Co więcej, sekwencja nukleotydowa genu, przewidywana sekwencja aminokwasowa aktywnej przeciw chrząszczom δ-endotoksyny Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis i „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“ są identyczne.

W takich samych warunkach hodowli „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“ wytwarza także wspomniany wyżej drugi typ kryształów (A. M. Huger i A. Krieg, J. Appl. Ent., 108,490-497, 1989).

Według H. de Barjac i E. Frachon (Enthomophaga, 35/2/, 233-240,1990) szczep „san diego“ jest podobny do „tenebrionis“ i nie może być uważany za odrębny podgatunek.

Użyteczność szczepów Bacillus thuringiensis do zwalczania szkodliwych chrząszczy zależy od wydajności i ekonomiki wytwarzania aktywnych przeciw chrząszczom toksyn i od siły działania wytworzonego produktu. To z kolei zależy od ilości δ-endotoksyny, która może być wytworzona przez fermentację szczepów Bacillus thuringiensis aktywnych przeciw chrząszczom.

B. thuringiensis stosuje się od wielu lat do produkcji insektycydów, i chociaż korzystnie byłoby otrzymać mutanta B. thuringiensis wytwarzającego większą ilość δ-endotoksyny, jak dotąd nie otrzymano takiego mutanta. Mutant wytwarzający większą ilość δ-endotoksyny zapewniałby większą wydajność i zwiększyłby ekonomikę produkcji toksyn B. thuringiensis, co pozwoliłoby na wytwarzanie preparatów B. thuringiensis o większej sile po tych samych kosztach. To z kolei byłoby korzystne dla użytkownika, bo umożliwiałoby zmniejszenie objętości składowanych pestycydów, stosowanych na danym obszarze. Ponadto użytkownik stosowałby mniej pojemników, co miałoby wpływ na środowisko.

Dotychczas nie opisano wytwarzania δ-endotoksyny Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis przez mutację.

Jednym z problemów związanych z zastosowaniem B. thuringiensis subsp. tenebrionis do zwalczania larw chrząszczy jest stosunkowo mała skuteczność preparatów, co wymaga podawania stosunkowo dużych dawek preparatu na traktowane obszary, takich jak 5 do 10 litrów/ha w porównaniu do 1 do 2 litrów/ha innych preparatów B. thuringiensis i innych insektycydów.

Istnieje więc zapotrzebowanie na produkty o zwiększonej sile działania. Jedną z dróg rozwiązania problemu jest wytwarzanie stężonych preparatów. Jednakże powiększa to koszty produkcji w stosunku do oszczędności uzyskanych na przechowywaniu i transporcie.

Znacznie lepszym rozwiązaniem jest wyselekcjonowanie i hodowanie mutanta lub wariantu szczepu B. thuringiensis zdolnego do wytwarzania większej ilości 5-endotoksyny na komórkę.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez szczep B. thuringiensis zdolny do wytwarzania znacząco większych ilości toksyny niż szczep wyjściowy.

Sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez B. thuringiensis polega na tym, że selekcjonuje się mutanta lub wariant B. thuringiensis sposobem selekcji wariantów lub mutantów spontanicznych Bacillus thuringiensis zdolnych do wytwarzania znacznie większych ilości 6-endotoksyn niż szczepy wyjściowe, polegającym na tym, że szczep wyjściowy lub mutanta szczepu wyjściowego hoduje się w podłożu płynnym, bulion hodowli rozprzestrzenia się na podłożu

166 433 odpowiednim do selekcji szczepów niewytwarzających zarodniki i/lub wytwarzających zarodniki sporadycznie, wybiera się przezroczyste kolonie i hoduje się je w podłożu, które nie upłynnia się po podgrzaniu a następnie szczepy niewytwarzające zarodników oddziela się przez poddawanie kolonii działaniu podwyższonej temperatury, po czym tak wyselekcjonowane szczepy hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym, zawierającym źródła węgla, azotu i innych składników, w ciągu odpowiedniego okresu czasu, odzyskuje się owadobójczy produkt zawierający δ-endotoksyny sam lub w połączeniu z komórkami i/lub zarodnikami z podłoża hodowlanego, i ewentualnie produkt ten miesza się z zaróbkami dopuszczalnymi do stosowania w rolnictwie.

Dla celów szczegółowo opisanych w tym opisie wynalazku, mutant szczep B. thuringiensis subsp. tenebrionis wytwarzający wysokie ilości δ-endotoksyny zdeponowano, dla celów postępowania patentowego w Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zollkulturen GmbH, Mascheroderweg 16, D-3300, Braunschweig, RFN w dacie wskazanej niżej. DSM, będąca depozytariuszem międzynarodowym na mocy Traktatu Budapesztańskiego, zapewnia ciągłość depozytu w zgodzie z regułą 9 tego traktatu.

Data depozytu: 10 sierpnia 1989

Znak deponenta: NB 176-1

Oznaczenie DSM: DSM 5480

Mutant DSM 5480 otrzymano przez mutację Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, szczep DSM 5526, który także zdeponowano na mocy Traktatu Budapesztańskiego, jak wykazano niżej. Data depozytu: 14 września 1989

Znak deponenta: NB 125

Oznaczenie DSM: DSM 5526

Przedmiotem wynalazku, jak wspomniano poprzednio, jest sposób selekcji wariantu lub mutanta spontanicznego szczepu Bacillus thuringiensis, wytwarzającego duże ilości aktywnej δ-endotoksyny w porównaniu do szczepu wyjściowego.

W tym kontekście, określenie „duża ilość“ korzystnie oznacza ilość co najmniej dwa razy większą lub jeszcze większą.

Mutanty, poddawane selekcjonowaniu i hodowli sposobem według wynalazku, uzyskuje się przez traktowanie szczepu wyjściowego mutagenem. Jako mutagen stosuje się każdy odpowiedni chemiczny mutagen, taki jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna lub ester etylowy kwasu metanosulfonowego, albo szczep wyjściowy poddaje się działaniu promieniowania elektromagnetycznego, takiego jak promieniowanie γ, X, lub UV.

Korzystnie, wyselekcjonowane kolonie hoduje się w normalnej pożywce hodowlanej i poddaje się końcowej selekcji w celu znalezienia mutanta wytwarzającego większą ilość δ-endotoksyny.

Odpowiednią pożywkę modyfikuje się pożywką do sporulacji zawierającą fosforan (pożywka NSMP) tak jak opisał Johnson i współpracownicy „Spores VI“, ed. P. Gerhardt i wsp., str. 248-254, 1975.

Według wynalazku jako odpowiednią pożywkę stosuje się pożywkę NSMP wzbogaconą MgCl2 oraz Gelrite firmy Kelco. W innej postaci wynalazku, w celu wytworzenia mutanta wytwarzającego dużo δ-endotoksyny, szczep wyjściowy hoduje się w pożywce płynnej i selekcjonuje się spontaniczne mutanty po dodaniu kultur bulionowych do podłoża agarowego, odpowiedniego do selekcji mutantów niesporujących lub sporadycznie wytwarzających zarodniki.

Inny sposób selekcjonowania mutanta wytwarzającego dużo δ-endotoksyny obejmuje stosowanie bezpośrednio dużej ilości mutantów, przy użyciu odwirowania lub innych sposobów izolowania odpowiednich dla dużych ilości.

Korzystnie, jako szczep wyjściowy stosuje się szczep wybrany z grupy obejmującej B. thuringiensis subsp. kurstaki, B. thuringiensis subsp. aizawai, B. thuringiensis subsp. israelensis i B. thuringiensis subsp. tenebrionis.

Korzystnie, selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant Baccillus thuringiensis zdolnego do wytwarzania dużych, w porównaniu ze szczepem wyjściowym, ilości owadobójczych δ-endotoksyn, zwłaszcza dwa razy większej ilości lub więcej, owadobójczych δ-endotoksyn, w porównaniu ze szczepem wyjściowym. Szczególnie korzystnie selekcjonuje się i hoduje się mutanta lub wariant B. thuringiensis należący do patotypu C B. thuringiensis.

166 433

Szczególnie korzystnie, selekcjonuje się i hoduje wspomniane mutanty lub warianty, wybierając mutanta lub wariant B. thuringiensis wykazującego działanie przeciwko tym samym szkodnikom co δ-endotoksyny wytwarzane przez wyjściowy B. thuringiensis, takim jak łuskoskrzydłe (mutanty B. thuringiensis subsp. kurstaki i/lub subsp. aizawai), dwuskrzydłe (mutanty B. thuringiensis subsp. israelensis) lub chrząszcze (mutanty B. thuringiensis subsp. tenobrionis).

Korzystnie także selekcjonuje się i hoduje B. thuringiensis należący do podgatunku tenobrionis, wytwarzający δ-endotoksynę działającą przeciwko chrząszczom, a zwłaszcza mutanta lub wariant B. thuringiensis tenebrionis zdolnego do wytwarzania δ-endotoksyny w ilości ponad 3-krotnie większej w porówaniu ze szczepem DSM 2803.

Szczególnie korzystnie, selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis subsp. tenebrionis zdolnego do wytwarzania parasporalnych kryształów o średniej długości krawędzi co najmiej dwukrotnie większej niż średnia długość krawędzi kryształu parasporalnego wytwarzanego przez szczep wyjściowy, zwłaszcza zdolnego do wytwarzania kryształu parasporalnego o średniej długości krawędzi wynoszącej 2^m lub więcej.

Według wynalazku, korzystnie selekcjonuje się i hoduje również mutanta lub wariant B. thuringiensis subsp. tenebrionis, wykazującego częstotliwość sporulacji 10 do 100 lub nawet 10® razy niższą, niż częstotliwość sporulacji szczepu wyjściowego bądź szczepu DSM 2803.

W szczególnej postaci wynalazku selekcjonuje się i hoduje zdeponowanego mutanta B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480. Mutant ten wykazuje więcej niż dwukrotny wzrost wytwarzania δ-endotoksyny w porównaniu ze szczepem wyjściowym (DSM 5526). Mikroskopia kontrastowo-fazowa, skaningowa i prześwietleniowa mikroskopia elektronowa tego mutanta wykazała, że wysoka produktywność wynika ze zmian regulacji wytwarzania δ-endotoksyny w stosunku do sporulacji, co powoduje wytwarzanie kryształów białka ponad pięć razy większych, niż kryształy wytwarzane przez znane i aktywne przeciw chrząszczom szczepy Bacillus thuringiensis. Dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku usunięto bliską korelację pomiędzy wytwarzaniem kryształów i sporulacją. Mutant wyselekcjonowany sposobem selekcji stosowanym w obecnym wynalazku wytwarza duże ilości δ-endotoksyny przed sporulacją.

Mutanty lub warianty spontaniczne szczepów B. thuringiensis, wyselekcjonowane i hodowane sposobem według wynalazku, są zdolne do wytwarzania produktów szkodnikobójczych, zwłaszcza owadobójczych, wchodzących w skład środków szkodnikobójczych.

δ-endotoksynę wytworzoną sposobem według wynalazku stosuje się w środkach pestycydowych jako składnik aktywny, samą lub w połączeniu z innymi produktami czynnymi biologicznie, a także z dopuszczalnymi w rolnictwie rozcieńczalnikami lub nośnikami. Środki takie mają postać kompozycji i preparatów pestycydowych, które zawierają δ-endotoksyny wytwarzane przez B. thuringiensis wyselekcjonowane i hodowane sposobem według wynalazku, w mieszaninie z dopuszczalnymi w rolnictwie rozpuszczalnikami lub nośnikami.

Mogą to być kompozycje i preparaty pestycydowe zawierające δ-endotoksyny wytwarzane przez B. thuringiensis, których skład pestycydowy w formie ciekłej ma moc przynajmniej 15000BTTU/g odpowiadające przynajmniej 3% wagowych szkodliwego dla chrząszczy białka krystalicznego, lub których skład pestycydowy w formie suchej ma moc przynajmniej 50 000 BTTU/g,odpowiadające przynajmniej 10% wagowych szkodliwego dla chrząszczy białka krystalicznego.

Kompozycje pestycydowe wytworzone z DSM 5480 mają przynajmniej dwa razy większą moc, niż kompozycja pestycydowa wytworzona z DSM 2803 lub z innych, aktywnych przeciw chrząszczom szczepów Btt.

Kompozycje takie stosuje się w postaciach znanych fachowcom, na przykład w postaci zawiesiny, emulsji wodnych, pyłów, pyłów dyspergujących, koncentratów emulgujących lub granulek. Ponadto stosuje się je w postaci odpowiedniej do bezpośredniego użycia, lub jako koncentrat pierwotnej kompozycji, który wymaga rozpuszczenia w odpowiedniej ilości wody lub w innym rozpuszczalniku przed podaniem.

Stężenie owadobójczo aktywnej δ-endotoksyny B. thuringiensis w takich kompozycjach szkodnikobójczych, stosowanej osobno lub w połączeniu z innym pestycydem, i podawanej na rośliny, korzystnie wynosi od około 0,5 do około 25% wagowych szczególnie od 1 do 15%o wagowych.

166 433

Te kompozycje pestycydowe zawierające produkty stosuje się do zwalczania szkodników, nanosząc je na obszary zaatakowane przez te szkodniki. W szczególności, kompozycje te stosuje się do zwalczania szkodników takich jak motyle, muchówki i chrząszcze, szczególnie chrząszcze, takie jak stonka ziemniaczana. Szkodniki zwalcza się, stosując ciekłą kompozycję pestycydową w dawce 2,8 litra/ha, lub 0,56 kg/ha suchej kompozycji pestycydowej.

Aktywny preparat B. thuringiensis lub kompozycję zawierającą ten preparat podaje się bezpośrednio na rośliny, na przykład przez rozpylanie cieczy lub pyłów w czasie, kiedy szkodniki zaczynają pojawiać się na roślinach. Korzystnie rozpyla się ciecz. Ogólnie ważne jest skuteczne niszczenie szkodników we wczesnych stadiach rozwoju larwalnego, ponieważ w tym okresie rośliny są narażone na największe uszkodzenia.

Przykładl . Wyizolowano mutanta B. thuringiensis subsp. tenebrionis wytwarzającego dwa razy więcej δ-endotoksyny. Mikroskopia kontrastowo-fazowa, skaningowa i prześwietleniowa mikroskopia elektronowa tego mutanta wykazała, że wysoka produktywność wynika ze zmian regulacji wytwarzania δ-endotoksyny w stosunku do sporulacji, co powoduje wytwarzanie kryształów białka ponad pięć razy większych niż kryształy wytwarzane przez znane, aktywne przeciw chrząszczom szczepy B. thuringiensis. Wydaje się, że usunięto bliską korelację pomiędzy wytwarzaniem kryształów a sporulacją w wyniku czego mutant wytwarza duże ilości δ-endotoksyny przed sporulacją. Wytwarzanie wysokowydajnego mutanta.

Zarodniki szczepu DSM 5526 B. thuringiensis subsp. tenebrionis napromieniowano promieniowaniem dawką 7 kGy. Napromieniowane zarodniki wysiano na płytki agarowe z podłożem NSMP (zmodyfikowana pożywka do sporulacji zawierająca fosforan, jak opisał Johnson i inni w „Spores VI“, ed. P. Gerhardt i inni, str. 248-254, 1975), które jest odpowiednie do selekcji mutantów bakterii niesporujących lub sporujących sporadycznie.

Płytki agarowe z NSMP inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 2-3 dni. Wybrano półprzezroczyste kolonie i przeniesiono je na podłoże NSMP gelrite (NSMP wzbogacone MgCh (0,57 g/l) i Gelrite, Kelco (20 g/l)).

Płytki agarowe z NSMP gelrite inkubowano w temperaturze 90°C w ciągu 1 godziny, a następnie w ciągu 1-2 dni w temperaturze 30°C.

Selekcjonowano mutanty dobrze rosnące na płytkach NSMP gelrite. W ten sposób odrzucono wszystkie niesporujące kolonie, które nie rosną po ogrzaniu.

Wyselekcjonowane mutanty hodowano na wytrząsarce w butelkach zawierających pożywkę dostępną w handlu. Ilość wytworzonej δ-endotoksyny określono metodą immunologiczną opisaną poniżej.

Selekcconowano tylko mutanty wytwarzające ilości δ-endotoksyny znacząco większe niż szczep wyjściowy.

Cechy morfologiczne wyseleklonowanych mutantów na podłożu stałym i płynnym określono przy pomocy mikroskopii kontrastowo-fazowej (X 2500) i skaningowej i prześwietleniowej mikroskopii elektronowej. Liczono liczbę zarodników i kryształów i określano wielkość kryształów białkowych.

Jeden z otrzymanych mutantów (DSM 5480) został wybrany ze względu na swoją zdolność do wytwarzania δ-endotoksyny.

Ilość δ-endotoksyny wytwarzanej przez mutanta DSM 5480 jest porównywalna z DSM 2803 oryginalnie wyizolowanego Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, szczep DSM 5526, stosowanego do wytwarzania NOVODOR, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis szczep NB 178, wyizolowany z produktu Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis TRIDENT firmy Sandoz, Bacillus thuringiensis tenebrionis TRIDENT z roku 1989, szczep NB 198, wyizolowany z produktu Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis TRIDENT firmy Sandoz z 1990 roku, „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, szczep NRRL-B-15939 i szczep NB 197 wyizolowany z produktu M-ONE zawierającego „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“ firmy Mycogen z 1990 roku. Jak pokazano w tabeli 1 i w przykładzie II, mutanty wyselekcjonowane sposobem według wynalazku wytwarzają 2-3,5 razy więcej δ-endotoksyny niż aktywny przeciw chrząszczom, dostępny obecnie szczep Bacillus thuringiensis.

166 433

Przykładu. W przykładzie tym porównano wydajność wytwarzania δ-endotoksyny wytwarzanej przez mutanta DSM 5480, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis z wydajnością wytwarzania δ-endotoksyny przez Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis szczep DSM 2803 (oryginalnie wyizolowany Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis), DSM 5526 (szczep produkcyjny firmy Novo-Nordisk), NB 178 i NB 198 (szczepy produkcyjne firmy Sandoz), Bacillus thuringiensis subsp. san diego, szczep NRRL-B 15939 i NB 197 (szczepy produkcyjne firmy Mycogen) w podłożu dostępnym w handlu. Każdy ze szczepów hodowano 17 godzin w temperaturze 30°C na skosach agarowych o następującym składzie, wyrażonym w gramach na litr wody destylowanej:

Pepton, Difco 5 g/litr

Ekstrakt mięsny, Difco 3 g/litr

Agar, Difco 20 g/litr pH *70» ml zawiesiny komórek każdego szczepu przeniesiono następnie do 100 ml pożywki produkcyjnej w 50 ml kolbie Erlenmeyera z przegrodzonym dnem. Pożywka produkcyjna składała się z następujących składników (w gramach na litr wody):

mąka sojowa 50 g/ikr hydrolizat skrobiowy 40 g/ikr

KH 2 PO4 7,77g/^itr

K2HPO4 4_;53β/1ήΓ pH Ifi

Zaszczepione kolby inkubowano w temperaturze 30°C na wytrząsarce (250 obr/min). Po 96 godzinach inkubacji immunologicznie określono ilość wytworzonej δ-endotoksyny w bulionie hodowlanym.

Ilość δ-endotoksyny wytwarzanej przez poszczególne szczepy określono metodą immunoelektroforezy rakietkowej (RIE) i testu immunofotometrycznego (PIA) przy użyciu przeciwciał powstałych przeciwko oczyszczonym kryształom białkowym Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.

Odważono 400 mg bulionu z każdej hodowli i do każdej próbki dodano 7 ml buforu fosforanu trójsodowego (0,125 M, pH 12).

Zawiesinę wytrząsano w ciągu 1 godziny w celu rozpuszczenia białek δ-endotoksyny.

Próbki wirowano następnie w ciągu 15 minut z szybkością 3.500 obrotów/minutę, supernatant testowano metodą RIA w obecności surowicy odpornościowej powstałej przeciwko oczyszczonym kryształom białkowym B. thuringiensis subsp. tenebrionis. Ilość δ-endotoksyny określano w stosunku do standardu o znanej zawartości kryształów białkowych.

Określano także stężenie kryształów białkowych metodą immunofotometryczną. Kryształy białkowe rozpuszczono w roztworze alkalicznym. Rozpuszczone białka wytrącono przeciwciałami. Szybkość tej reakcji określono turbidometrycznie. Ilość δ-endotoksyny określono w stosunku do wzorca o znanej zawartości kryształów białkowych.

Antygeny krystaliczne do produkcji przeciwciał stosowanych w tych testach otrzymano z kryształów wyizolowanych z B. thuringiensis subsp. tenebrionis.

Poliklonalne przeciwciała powstały po nastrzykiwaniu podskórnym co dwa tygodnie królików dawką 0,25 mg antygenu krystalicznego.

Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 1a i 1b. Wydajności δ-endotoksyny wyrażono w BTTU/g (jednostek na gram pożywki bulionowej, określona metodą immunoforezy rakietkowej RIE, lub metodą immunofotometryczną, PIA). Wartość dla czystych kryształów białkowych B. thuringiensis subsp. tenebrionis wynosi 500 000 BTTU/g. Wartości w tabeli 1 stanowią wartości średnie z 6-7 niezależnych fermentacji, a w tabeli 1b z 3 niezależnych fermentacji.

166 433

Tabela 1a

Wytwarzanie δ-endotoksyny przez szczepy Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis na wytrząsarce

Szczep .	Ilość ó-endotoksyny (BTTU/g)
RIE	PIA
DSM 2803	676	12931
NRRL-B 15939	747	1126
NB 178	986	1728
DSM 5526	1097	1860
DSM 5480	2382	4169

Tabela 1b

Wytwarzanie δ-endotoksyny przez szczepy Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis na wytrząsarce

Szczep	Ilość δ-endotoksyny, RIE (BTTU/g)
NB 197	1103
NB 198	1237
DSM 5480	2867

Z tabel la, 1b wynika, że szczep DSM 5480 wytwarza ponad trzy razy więcej δ-endotoksyny niż wyjściowy szczep B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803: „Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, szczep NRRL-B 15939 i ponad dwa razy więcej niż szczepy stosowane obecnie do przemysłowej produkcji preparatów Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.

Mikroskopia kontrastowo-fazowa i skaningowa oraz prześwietleniowa mikroskopia elektronowa mutanta DSM 5480 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis wykazała, że wytwarzane przez niego kryształy białkowe są dużo większe niż odpowiednie kryształy białkowe wytwarzane przez Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis szczepy DSM 2803, DSM 5526, NB 178, NB 198 i “Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, szczepy NRRL-B 15939, NB 197.

Pożywkę bulionową mutanta DSM 5480, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis poddano testowi na aktywność przeciw larwom stonki ziemniaczanej. Zwiększona ilość δ-endotoksyny wytwarzanej przez mutanta DSM 5480 określona metodami imunologicznymi znalazła odbicie w aktywności biologicznej przeciw larwom stonki ziemniaczanej.

Przykład III. W tym przykładzie porównano sporulację i wytwarzanie kryształów parasporalnych B. thuringiensis subsp. tenebrionis, szczepy DSM 2803, DSM 5526, NB 178, NB 198, mutant DSM 5480 i „B. thuringiensis subsp. san diego“, szczepy NRRL-B 15939 i NB 197 w podłożu stałym i płynnym.

Każdy szczep hodowano 2 dni w temperaturze 30°C na płytkach agarowych o następującym składzie wyrażonym w gramach na litr destylowanej wody:

Pepton, Difco 5 g/litr

Ekstrakt mięsny, Difco 3 g/litr

Agar, Difco 20 g/litr pH 7,0

Każdy szczep hodowano także na pożywce płynnej. Wszystkie szczepy hodowano w ciągu 17 godzin w temperaturze 30°C na skosach agarowych. 5 ml zawiesiny komórek każdego szczepu przeniesniono do 500 ml kolb Erlenmeyera z przegrodzonym dnem, zawierających 100 ml pożywki.

Pożywka składała się z następujących składników w podanych niżej ilościach: (wyrażonych w gramach na litr wody).

Pożywka płynna

Ekstrakt drożdżowy 5 g/litr

Trypton 5 glltr

Glukoza 1 g/lkr

KH 2 PO4 0,8gikr pH 7,0

166 433

Zaszczepione kolby inkubowano w temperaturze 30°C na- wytrząsarce (250 obrotów/minutę) w ciągu 96 godzin.

Morfologię szczepów na podłożu stałym i płynnym badano codziennie metodą mikroskopii kontrastowo-fazowej ( X 2500). Liczbę przetrwalników i kryształów liczono oraz określano wielkość kryształów parasporalnych. Kilka wyselekcjonowanych próbek badano także metodą skaningowej i prześwietleniowej mikroskopii elektronowej.

Wszystkie szczepy B. thuringiensis subsp. tenebrionis, szczepy DSM 2803, DSM 5526, NB 178 i NB 198, „B. thuringiensis subsp. san diego“, szczepy NRRL-B 15939 i NB 197 przetrwalnikują dobrze w obu pożywkach. Przed lizą komórek każda komórka zawierała przetrwalnik i kryształ parasporalny. Kryształ miał długość od 0,4 do 0,9-1,1 wm, do czasu lizy komórki. Średnia długość wynosiła 0,6-0,7 -wm.

Mutant DSM 5480 wytwarzał tylko niewiele przetrwalników (<10^{5 *} przetrwalników/ml) w podłożu stałym i podłożu płynnym. Przed lizą komórek większość komórek zawierała długi kryształ białkowy, ale nie zawierała przetrwalników. Wielkość kryształów białkowych wynosiła od 0,4-0,7-wm do 5,0-wm, średnia długość wynosiła 2,2-2,3 pm.

Ultrastrukturalna analiza komórek z tych różnych podłóż metodą prześwietleniową mikroskopii elektronowej wykazała, że sporulacja mutanta rozpoczynała się, ale nie była całkowita do czasu lizy komórki. Sporulacja w różnych komórkach osiągała różne stadium. W komórkach, w których sporulacja osiągnęła zaledwie II etap (tworzenie przesłony presporalnej), kryształ białkowy wypełniał wnętrze komórki.

W pożywce produkcyjnej (przykład II) mutant wytwarzał większą liczbę sporów (10⁷ - 10⁸ sporów/ml). W tym podłożu częstość sporulacji mutanta była 10-100 razy niższa niż w przypadku szczepu wyjściowego.

Tak więc mutant zachowuje zdolność do wytwarzania normalnych przetrwalników, jednakże zależy ona w dużej mierze od podłoża.

Wielkość kryształów białkowych wytwarzanych przez poszczególne szczepy pokazano w tabelach 2a i 2b.

Tabela 2a

Wielkość kryształów białkowych wytwarzanych przez aktywne przeciw chrząszczom dostępne obecnie szczepy B. thuringiensis

Długość kiyształu białkowego (μη)

Szczep

	Minimum	Maksimum	Średnia
DSM 2803	0,4	0,9	0,7
NRRL-B 15939	0,4	0,9	0,7
NB 178	0,5	0,9	0,7
DSM 5526	0,4	0,9	0,7
DSM 5480	0,7	5,0	2,3

Tabela 2b

Wielkość kryształów białkowych wytworzonych przez aktywne przeciw chrząszczom dostępne obecnie szczepy B. thuringiensis

Długość kryształu białkowego (μη)

Szczep

	Minimum	Maksimum	Średnia
NB 197	0,4	0,7	0,6
NB 198	0,4	1,1	0,7
DSM 5480	0,4	4,2	2,0

Z tabel 2a i 2b wynika, że mutant 5480 wytwarza dużo większe kryształy białkowe niż wszystkie znane obecnie szczepy B. thuringiensis aktywne przeciw chrząszczom.

Z uzyskanych danych wynika, że w szczepie zmutowanym, zmieniła się regulacja produkcji δ-endotoksyny w stosunku do sporulacji.

Mutant wydaje się wytwarzać krystaliczne białko zanim rozwinie spory, dając w ten sposób komórkom dłuższy czas na wytwarzanie δ-endotoksyny i w rezultacie komórki produkują dużo więcej krystalicznego białka zanim nastąpi liza, niż w szczepie wyjściowym.

166 433 11

W zależności od dostępnych składników odżywczych i rozmiarów kryształów białkowych w komórkach do czasu sporulacji, przed lizą komórek rozwijają się normalne spory.

Przykład IV. W tym przykładzie zastosowano bardzo wydajnego mutanta Btt DSM 5480 do wytwarzania produktu o dużej mocy działania do zwalczania larw stonki ziemniaczanej.

Szczep DSM 5480 fermentowano w produkcyjnym podłożu fermentacyjnym opisanym w przykładzie II, z napowietrzaniem i wstrząsaniem w produkcyjnym tanku fermentacyjnym. Po 96 godzinach pożywkę odzyskano przez odwirowanie na wirówce o działaniu ciągłym.

Stężony krem, który zawierał aktywne białko krystaliczne, stabilizowano przez dodanie środków konserwujących i doprowadzono pH do 5,0.

Jedną część stężonego kremu suszono rozpyłowo a następnie zastosowano do wytwarzania zwilżalnego proszku. Resztę stężonego kremu zastosowano bezpośrednio do wytwarzania dwóch wodnych płynnych koncentratów (FC).

Zwilżalny proszek miał skład podany w tabeli 3 skład dwóch preparatów FC podano w tabeli 4.

Tabela 3

Skład zwilżalnego proszku NOYODOR

Składnik	% wagowy
wysuszony rozpyłowo stężony krem Btt	40
detergenty	9
środek zapobiegający zlepianiu	1
obojętny wypełniacz	50

Tabela 4

Skład preparatu PC NOVODOR

Składnik	NOVODOR FC1 % wagowy	NOVODOR FC 2 % wagowy
stężony krem Btt	80,00	55,00
konserwanty	4,00	4,00
środki przeciw zamarzaniu	9,10	19,00
detergenty	2,50	2,50
regulator pH	2,85	2,85
woda	1,55	16,55
	100,00	100,00

Dla wartości 500 000 BTT U/g czystego krystalicznego białka zawartość aktywnego białka krystalicznego wynosiła:

% krystalicznego białka Btt

NOVODORWP — 70,8 KBTTU/g 14,18

NOVODOR FC1 — 74,7 KlTU/U/g 4,94

NOVODOR FC2 — 14,2 KBTTU/g 2,84

Detergenty wybrano z dużej grupy pomocniczych środków rozpraszających i środków zwilżających zwykle stosowanych do produkcji rolniczych pestycydów.

Jako środek zapobiegający zlepianiu zastosowano krzemionkę hydrofilową, a jako obojętny wypełniacz zastosowano zwykle stosowane obojętne wypełniacze takie jak bentonity, sole nieorganiczne lub materiały ilaste.

Konserwanty do FC wybrano z grupy konserwantów do żywności i kosmetyków. Jako regulator pH zastosowano kwas nieorganiczny.

Przykład V. Prowadzono próby polowe w celu udowodnienia działania biologicznego wysoko wydajnego mutanta Btt DSM 5480 w stosunku do głównego docelowego szkodnika larwy stonki ziemniaczanej. Porównano dwa handlowe produkty Trident i M-one. Obiektem uprawnym były ziemniaki.

Obiekt uprawny opryskano 3 razy: 20 lipca, 27 lipca i 3 sierpnia (druga generacja larw). Zastosowano produkty i dawki, jak w tabeli 5.

166 433

Tabela 5

Moc działania % krystalicznego

Objętość produktu/ha KBTTU/g białka w preparacie

NOVODOR FC2	2,8 litra	14,2	2,84
	4,2 iitra	14,2	2,84
	7,0 litra	14,2	2,84
	8,4 litra	14,2	2,84
TRIDENT	11,2 litra	5,5	1,10
M-one	5,6 litra	8,9	1,78

Średni procent zwalczenia larw CPB w porównaniu ze zwalczeniem larw, nie poddanych działaniu preparatu przedstawiono w tabeli 6. Napór stonki ziemniaczanej na terenie nie traktowanym preparatami był bardzo duży: 370 larw na 20 roślin w dniu 1 sierpnia i 904 larwy na 20 roślin w dniu 8 sierpnia.

Tabela 6

Środek .	% zwalczania
1 sierpnia	8 sierpnia
NOVODOR FC2	2,8 litra	99	99
NOVODOR FC2	4,2 litra	95	100
NOVODOR FC2	7,0 litra	98	99
NOVODOR FC2	8,4 litra	100	100
TRIDENT	11,2 litra	94	98
M-one	5,6 litra	98	98

Wyniki te jasno dowodzą, że produkty otrzymane z wysoko wydajnego mutanta DSM 5480 są skuteczne do zwalczania larw stonki ziemniaczanej na polach. Krystaliczne białko wyprodukowane przez wysoko wydajny szczep jest całkowicie aktywne i w ilości 4,2 litra FC NOVODORu daje równie dobre rezultaty jak Trident w objętości 11,2 litra i jak M-one w objętości 5,6 litra.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania owadobójczego produktu, wytwarzanego przez B. thuringiensis, znamienny tym, że selekcjonuje się mutanta lub wariant B. thuringiensis sposobem selekcji wariantów lub mutantów spontanicznych Bacillus thuringiensis zdolnych do wytwarzania znacznie większych ilości δ-endotoksyn niż szczepy wyjściowe, polegającym na tym, że szczep wyjściowy lub mutanta szczepu wyjściowego hoduje się w podłożu płynnym, bulion hodowli rozprzestrzenia się na podłożu odpowiednim do selekcji szczepów niewytwarzających zarodniki i/lub wytwarzających zarodniki sporadycznie, wybiera się przezroczyste kolonie i hoduje się w podłożu, które nie upłynnia się po podgrzaniu a następnie szczepy rzeczywiście niewytwarzające zarodników oddziela się przez poddawanie kolonii działaniu podwyższonej temperatury, po czym tak wyselekcjonowane szczepy hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym, zawierającym źródła węgla, azotu i innych składników, w ciągu odpowiedniego okresu czasu, odzyskuje się owadobójczy produkt zawierający δ-endotoksyny sam lub w połączeniu z komórkami i/lub zarodnikami z podłoża hodowlanego, i ewentualnie produkt ten miesza się z zaróbkami dopuszczalnymi do stosowania w rolnictwie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyselekcjonowane kolonie hoduje się w normalnym podłożu produkcyjnym i przeprowadza się końcową selekcję szczepu zdolnego do zwiększonej produkcji δ-endotoksyny.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako podłoże stosuje się zmodyfikowane podłoże odżywcze do sporulacji, zawierające fosforan.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako podłoże stosuje się podłoże z dodatkiem MgCh i Gelrite, Kelco.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako szczep wyjściowy stosuje się szczep wybrany z grupy obejmującej B. thuringiensis subsp. kurstaki, B. thuringiensis subsp. aizewai, B. thuringiensis subsp. israelenis i B. thuringiensis subsp. tenebrionis.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant Baccillus thuringiensis zdolnego do wytwarzania dużych, w porównaniu ze szczep wyjściowym, ilości owadobójczych δ-endotoksyn.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis zdolnego do wytwarzania dwa razy większej ilości, lub więcej owadobójczych δ-endotoksyn w porównaniu ze szczepem wyjściowym.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis należący do patotypu C B. thuringiensis.
9. 9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis wykazującego działanie przeciwko tym samym szkodnikom co 6endotoksyny wytwarzane przez wyjściowy B. thuringiensis, takim jak łuskoskrzydłe (mutanty B. thuringiensis subsp. kurstaki i/lub subsp. aizewai), dwuskrzydłe (mutanty B. thuringiensis subsp. israelensis) lub chrząszcze (mutanty B. thuringiensis subsp. tenobrionis).
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje B. thuringiensis należący do podgatunku tenobrionis wytwarzający δ-endotoksynę działającą przeciwko chrząszczom.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis tenebrionis zdolnego do wytwarzania δ-endotoksyny w ilości większej niż 3krotnie większej w porówaniu ze szczepem DSM 2803.
12. 12. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis subsp. tenebrionis zdolnego do wytwarzania parasporalnych kryształów o średniej długości krawędzi co najmiej dwukrotnie większej niż średnia długość krawędzi kryształu parasporalnego wytwarzanego przez szczep wyjściowy.

    166 433
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis subsp. tenebrionis zdolny do wytwarzania kryształu parasporalnego o średniej długości krawędzi wynoszącej 2μιη lub więcej.
14. 14. Sposób według zastrz. 9 albo 12, albo 13, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta lub wariant B. thuringiensis subsp. tenebrionis, wykazującego częstotliwość sporulacji 10 do 100 lub nawet 10® razy niższą, niż częstotliwość sporulacji szczepu wyjściowego.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że selekcjonuje się i hoduje mutanta B. thuringiensis subsp. tenebrionis wykazującego częstotliwość sporulacji 10 do 100 lub nawet 10® razy niższą niż częstotliwość sporulacji szczepu DSM 2803.
16. 16. Sposób według zastrz. 12, mamiemy tym, że selekcjonuje się i hoduje zdeponowanego mutanta B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.