JPH04505998A - バシラススリンギエンシス(Bacillus Thuringiensis)の新株、その製造法及び、昆虫の制御ならびに昆虫の攻撃からの植物の保護におけるその利用 - Google Patents
バシラススリンギエンシス(Bacillus Thuringiensis)の新株、その製造法及び、昆虫の制御ならびに昆虫の攻撃からの植物の保護におけるその利用Info
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- JPH04505998A JPH04505998A JP2500368A JP50036889A JPH04505998A JP H04505998 A JPH04505998 A JP H04505998A JP 2500368 A JP2500368 A JP 2500368A JP 50036889 A JP50036889 A JP 50036889A JP H04505998 A JPH04505998 A JP H04505998A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
2、−120、−1.10“、78.50.463.43.33.31.6.0
(o、c、 ) 、8.0.7,9.5.4.4.7及び3,5メガダルトン
のプラスミド及びり、 D、Eを含むプラスミド配列を有する、請求項1に記載
のバチルス・スリンギエンシス変種アイザワイ細菌HD−12A0
3.1101メガダルトンのプラスミド及び65°メガダルトンのプラスミドを
含むプラスミド配列を有する、上記lに記載のバチルス・スリンギエンシス変種
アイザワイ細菌。
4、−120、−110”、78.65ゝ、50.43.33.30.8.0.
7.9.6.0 (o、c、 ) 、5.4.4.7及び3.5メガダルトンの
プラスミド及びり、 D、 Eを含むプラスミド配列を有する、請求項3に記載
のバチルス・スリンギエンシス変種アイザワイ細菌。
5.110+メガダルトンのプラスミド及び461メガダルトンのプラスミドを
含むプラスミド配列を有する、請求項1に記載のバチルス・スリンギエンシス変
種アイザワイ細菌。
6、〜120、〜110+、78.50.46′、43.33.31.6.0
(o、c、 L 8.0.5.4.4.7.3,5メガダルトンのプラスミド及
びり、 D、Eを含むプラスミド配列を有する、請求項5に記載のバチルス・ス
リンギエンシス変種アイザワイ細菌。
7、請求項1ないし6のいずれかに記載のバチルス・スリンギエンシス細菌によ
り産生されたトキシン蛋白質。
8、昆虫の食餌供給物又は素餌場に殺虫的に有効な量の、NRRLに寄託され受
託番号B−18046を割当てられたHD−122A、、NRRLに寄託され受
託番号18407を割当てられたHD−122B及びNRRLに寄託され受託番
号18408を割当てられたHD−122C;又はそれらの突然偏異体、組換え
体又は遺伝工学的な誘導体から選択されたバチルス・スリンギエンシス変種アイ
ザワイ細菌株を施用することを特徴とする昆虫を防除する方法。
9、該昆虫が鱗翅目昆虫である、請求項8に記載の方法。
10、請求項1ないし6のいずれかに記載されたバチルス・スリンギエンシス細
菌、又はそれらのトキシン蛋白質、及び適当なキャリヤーを特徴とする殺虫剤組
成物。
明細書
バシラス スリンギエンシス(Bacillus Thuringiensis
)の新株、その製造法及び、昆虫の制御ならびに昆虫の攻撃からの植物の保護に
おけるその利用
その利用に関しては十分言及がなされているが、それにもかかわらずプルテラ
キシロステラ(Plutella xylostella)のようなある種の昆
虫は商業的に入手できる株のバシラス スリンギエンシス(Bacillus
Thuringiensis)あるいは多(の従来の殺昆虫剤、例えばカルバメ
ート、ホスフェート、及びピレスロイドなどにより有効な制御を行うことができ
ない。
従って本発明の目的は、従来の殺虫剤に対して抵抗性を持ち、商業的の集団を強
力に制御することができ、殺有害生物剤としての所望の属性有効な新規固体及び
液体B、t、配合物において、該配合物が殺虫剤とhur ingiens i
s)株を含むことを特徴とする配合物の提供も本発明の目的である。
本発明は、P1エンドトキシンタンパク質をコードする110メガダルトンのプ
ラスミド、及びP1エンドトキシンタンパク質をコードする46又は65メガク
ルトンのプラスミドを含む新規バシラス スリンギエンシス(Bacillus
Thuringiensis)株に関する。本発明はさらに昆虫、特に鱗翅目
の昆虫及び特にプルテラ キシロステラ(Plutella xylostel
la)を、Bt1株が110メガダルトンのプラスミド及び46又は65メガダ
ルトンのプラスミドを含むB、t、配合物を殺虫剤として有効量用いて制御する
方法に関する。本発明はまた、110メガダルトンのプラスミド及び46あるい
は65メガダルトンのプラスミドを含むバシラス スリンギエンシス(Baci
llus Thuringiensis)の株を植物の葉に、殺虫剤として有効
量適用することにより該植物を昆虫の食糧となる損害から保護する方法に関する
。
その胞子形成サイクルの間にエンドトキシンを製造する。エンドトキシンは一般
にバラスポア結晶として堆積し、特定のB、t、株の殺虫剤としての有効性を決
定する第1因子である。多くの場合、胞子形成の間に異なる株のB、t、は異な
るエンドトキシンを異なる量製造することが見いだされた。例えばある株のB、
t、は非常に限られた量のエンドトキシン及びバラスポア結晶を製造するが、他
のB、t、株はB、t、細胞の乾燥重量の約15−40%に相当する結晶を製造
することができる。
従って、B、t、の新現株の殺虫活性は正しい評価によってのみ確立することが
できるということは明らかである。
ここで驚くべきことに、プルテラ キシロステラ(Plutellaxylos
tella)などのある種の昆虫の、B、t、を用いた有効な制御は、B、t、
配合物中にP1エンドトキシンタンパク質をコードする遺伝情報(遺伝子)を有
する110メガダルトンのプラスミド、及びP1エンドトキシンタンパク質をコ
ードする遺伝情報(遺伝子)を有する46又は65メガダルトンのプラスミドが
共存することに大きく起因することが見いだされた。
さらに以下のプラスミド プロファイルをメガダルトン(Md)中に含むB、t
、株、特にvar、aizawai (Serovar H7)が、該B、t、
株のひとつを含む液体配合物を植物に噴霧すると、プルテラ キシロステラ(P
lutella xylostella)の制御、及び/又は該有害生物が植物
の葉を食糧とするのを妨げるのに特に有効であることを見いだした。
本発明において、昆虫制御剤又は植物保護剤として使用するのが好ましいB、t
、株HD122−1 var、aizawai及び変種ノメガダルトン中のプラ
スミドプロファイルは以下である:HD122−1 − “野生型”−120、
−110”、78,50゜46”、43. 33. 31. 30. 6. O
開環(o、c、 )、8. 0. 7. 9. 5. 4. 4. 7゜3.5
.直鎖り、 N、 A、要素(L、D、E、 );ここで+は殺有害生物性毒素
タンパク質をコードするプラスミドを示す;
HD−122A −−120,−110”、78,50.46″″、43゜33
、 31. 8. 0. 7. 9. 6. 0 (o、c、 )、5. 4.
4. 7. 3. 5. L、D、E、。
HD−122B −−120,−110”、78.65’、50.43゜33、
30. 6. 0 (o、c、 ) 、8. 0. 7゜9、5.4.4.7
.3.5. L、 D、 E、 、及び
HD−122C’−−120,−110”、78,50.46”、43゜33.
31.30,6.0 (o、c、)、8.0゜5.4,4.7.3.5.L、D
、E。
Bt株HD122−1 var、aizawai及びその変種(HD−122A
、HD−1228,HD−1220)のl10Mdプラスミドは約130−14
5キロダルトン(kD)の大きさの、1種類かそれ以上のエンドトキシンタンパ
ク質をコードする遺伝情報を運ぶ。同様に46及び65Mdプラスミドは約13
0−140の大きさのエンドトキシンタンパク質をコードする遺伝情報を運ぶ。
これらのエンドトキシンタンパク質は胞子形成の時に製造され、二重ピラミッド
型結晶内包物をさらに、上記配合物のいずれかから46“又は651プラスミド
が失われると、プラスミド列が減少したB、t、配合物の殺虫活性及び植物保護
活性の大きな損失を生ずる。
上記の通り、本発明のB、t、株はプルテラ キシロステラ(旦工旦tella
xylostella)の制御に非常に有効であり、その制御に特別有用であ
る。しかし、本発明のB、t、株は種々の池の昆虫、例えば5pOdOpter
a exiqua、シロイチモンジョトウ(7)幼虫;Trichoplusi
a ni、キャベツ シャクトリムシ:He1iothis sea、ポールワ
ーム、コーン イヤワーム又はトマトフルーツワーム;He1iothis v
irescens、 タバコバヅワーム:アワヨトウ 5podoptera
Littora↓is、多podoptera frugiperda、及び5
podoptera eridaniaならびに輸入キャベツワーム、旦工ユニ
工互 1” a p a eの制御にも同様に有効である。
該昆虫の制御及び/又は昆虫が食糧とする植物の保護は一般に、1101メガダ
ルトンプラスミド及び46″′あるいは654メガダルトンプラスミドを持つB
、t、株により製造されたエンドトキシン タンパク質を殺虫剤として有効量含
む液体スプレーを植物の葉に適用することにより行う。昆虫に与えることにより
処理した植物を摂取するとB、t、エンドトキシンが昆虫の中腸に入り、そこで
昆虫の腸のアルカリ性pH及びタンパク質分解酵素がB、t、エンドトキシン配
合物のバラスポア結晶を溶解し、適用したスプレー配合物の110+及び46′
″又は654メガダルトンプラスミドにより製造させた毒素を活性化する。
このようにして活性化された毒素は中腸の細胞を崩壊させ、昆虫が食糧を摂取し
な(なり死ぬ原因となる。
110′″メガダルトンプラスミド、及び46+又は65′″メガダルトンプラ
スミドを含むB、t、株により製造されたエンドトキシンタンパク質を約110
−1O00pp、好ましくは約220−500pp含む液体配合物が昆虫の制御
及び所望の植物の保護の達成に有効である。
本発明のB、t、株はプルテラ キシロステラ(Plutellaxylos
te I Ia)ならびに他の鱗翅目の有害生物の制御に非常に有効であり、又
該昆虫の飼料に適用すると、あるいは1ヘクタール当たり約10グラム−10,
000グラムの毒素タンパク質、好ましくは1ヘクタール当たり約20グラム−
500グラムの毒素タンパク質という適用比で土壌に供給すると該昆虫有害生物
による攻撃からの植物の保護に有用であることを我々は見いだした。
本発明のB、t、株は、約15%−40% w/vの発酵不溶物を含み、発酵培
地に含まれるもの以外化学物質又は添加剤を含まない脱水発酵ブロスから成る発
酵ブロス濃厚液として調製するのが有利である。濃厚液は一般に、約1%−20
% W/VのB、t、タンパク質を含むがそれに限られるわけではない。発酵ブ
ロス濃厚液は直接殺虫剤スプレーに調製することもでき、あるいはそれをスプレ
ー乾燥し、スプレー乾燥材料を水和剤、油流動性濃厚液、水流動性調製液、水分
散性顆粒、微カプセル調剤、及び/又は他の配合物に調製することもできる。こ
れらの配合物はスプレー乾燥B、t、粉末を、界面活性剤、増粘剤、不活性固体
又は液体希釈剤などの配合物成分と混合することにより調製する。
スプレー乾燥B、t、を用いて調製することができろ水和剤配合物は1%−20
重量%のB、t、結晶:14%−20重量%の発酵不溶物;40%−60重量%
の希釈剤、例えばアタパルジャイト、カオリナイト、モントモリロナイト、ケイ
ソウ土、タルクなど:5%−10重量%の湿潤剤及び1%−3重量%の調整剤を
含むことができる。
典型的な水和剤配合物は約15%−20%のB、t、結晶:約14%−20%の
発酵不溶物:45%−55%のアタパルジャイト又はカオリン:2%の合成ケイ
酸塩調整剤;2.5%−5%のソルビタンモノオレートなどの乳化剤:0%−2
,5%のオクチルフェノキシポリエトキシエタノールなどの湿潤剤、及び0%−
約0. 5%のポリビニルピロリドンを含むことが多い。
本発明の方法で用いられるB、t、種の油流動可能な調剤は、一般に、1101
メガダルトン(megadalton)プラスミドおよび46″″または654
メガダルトンプラスミドのどちらかを有するB、t、細胞から生産されるB、t
、結晶を約10〜15重量%:発酵不溶物を約10〜15%;水添ひまし油を約
2〜3%:ラクトーゼをO〜1.0%;乳化剤を5〜10%:としてパラフィン
系もしくは鉱物系オイルの如き油を約50〜60重量%含有している。
多くの高活性殺虫剤的B、t、種がトランスコンジュゲーション(trnsco
n jugation)によって生産されるが、他の高活性B、t、種は、選択
されたプラスミドをそこに移す前に、複合トキシンプラスミドから最初に1個以
上のプラスミドを除去する必要があり得る。プラスミドの損失はキユアリング(
curing)と呼ばれ、モしてキユアリングがある種のトキシン蛋白質の優位
をもたらすことができることを見い出した。従って、B、t、種のキユアリング
は、B、t、種の毒性を増大させるばかりでなく、与えられたこん虫、即ちこん
虫種またはこん虫目に対する該B9t0種の選択性または特性を増大させる手段
として用いられ得る。
本発明を更に以下に示す実施例を用いて説明する。
実施例1
培地C−2M上でのバチルスツリンギイエンシス(Bacillus thur
ingiensisXB、 t、 )種HD−122A変種アイザワイ(EG2
175)製造のための発酵方法
発酵用の接種材料は、EG2175としても知られている種HD−122A変種
アイザワイ(aizawai)の無菌胞子懸濁液からなっている。これは、栄養
塩類かんでん(NSA)(表I)上のこの種の単一単離コロニーからの白金耳を
、遮断した2リツトルの三角フラスコ中の500+alのC−2培地中に無菌的
に接種することによって調製する。このフラスコを30℃で48時間振とうしく
300RPM)、それによって、充分に胞子を生じさせた培地を生じさせる。こ
れは数週間安定であり、そして好適的な冷蔵庫で保存される。次に、使用に先立
って、一定分量の種菌を無菌的に取り出し、そして100マイクロリツトルをN
SA (表■)上に融合性表面ローンとして置き、純度を確認する(30℃で培
養)。
融合性領域と単離されたコロニーを含有している二番目の画線プレートは、NS
Aかんてん上に生じさせ、DNAを両方のコロニーから抽出し、そしてGonz
alezの方法(出典1)に従って、該融合性領域を公知の種EG2175の標
準に対してEckhardtアガロースゲル上を流す。グラスを、位相差顕微鏡
、油浸漬、100OXで検査し、そして(b)グルコース濃度をYSIまたは同
様の装置を用いて測定する。発泡は重要ではないが、必要ならば、MazuDF
204消泡剤(Mazer Chemicai、 Gurnee IL)を無菌
的に添加してもよい。
この発酵器中の細胞は12〜16時間で胞子を生じ始め、そして一般に、充分に
胞子を生じさせた後、24−36時間で細胞溶解させる。胞子の生成は、相の輝
き、卵形の中心を有する胞子、およびまた細胞の境または胞子のう内の若干相の
輝きがある蛋白質の結晶によって示される。
細胞溶解は、遊離胞子、および胞子のうからの結晶の放出によって示される。
この培養物を、中空繊維、即ちクロス・フロー膜システム、例えばB。
■1con PilotPeol Oを用いるか、或いはディスク・スタック遠
心分離機、例えばAlfa−Lavel A X 213を用いて収穫する。1
06ミルのPM500繊維を用いたRomiconにおいては、再循環速度を、
入口と出口の圧力を各々10および40PSIに保持する値に保つ。濃縮容積が
元の薄い容積の5〜15%に減少するまで、収穫を継続する。好適には、その後
、等容積の水道水を用いて再びパルプ状しそして再び濃縮することによって、2
回濃縮物を洗浄する。遠心分離を用いる場合、位相差顕微鏡で上澄液中に蛋白質
の結晶がいくつか見られるように、流速および排出頻度を調整する。
表■
普通塩類寒天
(NSA)
普通ブイヨン(ディフコ) 8
寒天 15
MgC1□・6820 0.2
CaC12・2■、0 0.103
MnC12・41LzOo、 ot
記:塩類は単純な普通寒天(NA)では生じないところをB、t。
の良い胞子形成を得るのに必要とされる。
表lI
C−20媒体 C−2媒体
gIII/1gl1/l
グルコース IO中 グルコース IQ+11マルコールカゼインB バクトペ
プトン(Marcor Ca5efn B) 2 (Bacto Pepton
e) 2アンバーレツクス1003酵母Est、 ディフコ酵母抽出物(Aa+
berex 1003 Yeast Est、 ) 2 (Difco Yea
st Extract) 2K12PO40,3113,11
Mg5O,・7Hz0 0.3 mgso4・7120 0.3CaC14・2
[1tOo、 I CaC1z・2■20 0. lMnC1z”4H200,
058MnC1z”4HzOO,058(NH4)tSO42,0(NH4)2
SO42,0ZnSO4−7H,o o、005 Zn504−7n2o o、
005CIISO4・5Hz0 0.005 CuSO4・5tlt0 0.0
05(殺菌前に添加)
pH7,2;5N Na0FlまたはH2SO4で要求されるようにして調製f
l+無水物として、1水和物[例えばセレローズ(cerelose)]を使用
した場合、この100%を使用。別途50−70%溶液として殺菌し、そして殺
菌した冷却媒体に平衡して殺菌的に添加。
(2)濃縮溶液として調製し、別途殺菌し、そして培養器中に殺菌した冷却媒体
に平衡して殺菌的に添加。
参考文献1ニジエイ・エム・ゴンザレス、エイチ・チー・ダルメイジ、ビー・シ
ー・カールトン(Gonzalez、 J、 M、 Dulmage、 H,T
、 Carlton、 B、 C,)プラスミド 第5巻、351−365頁(
1981)前に示したように、HD122−1 (EG2179)は、プラスミ
ドを通じて他の変種(HD−122A、H3−1228,HD−122C)の元
となっている野生種または親株のB、t、であると考えられる。四つの程合ては
、栄養塩類かんでん上に、生物学的に純粋な培養物として単離され、そしてプラ
スミド配列に関して特徴づけられる。
HD122−1 (EG2179)は下記のプラスミド配列を有する=3.5.
4.7.5.4.7.9.8.0、−6.0(開いた円) L、 D、E。
30.31.33.43.46′″、50.78.1104、−120(メガド
ルトンで表したプラスミドの大きさ)下記のように、単離された三種の変種はH
D122−1とは異なる。
HD−122A (EG2175)には30Mdプラスミドが欠乏している。
HD−1228(EG2176)には31Mdプラスミドが欠乏しており;
46”Mdが651Mdl−キシンプラスミドに置き換えられている。
HD−1220(EG2177)には7.9Mdプラスミドが欠乏している。
メガドルトン(Md)で表したこれらのHD122変種のプラスミドの形は、こ
ん虫押制剤または植物保護剤としての本発明における使用のために好適であり、
そして以下のように示すことができる。
HD−122A−−120、−110”、78.50.46′″、43.33.
31.8.0.7.9.6.0 (o、c、) 、5.4.4.7.3.5、L
、 D、 E、 。
HD−122B−−120、−110’、78.65゛、50.43.33.3
0.6.0 (o、c、) 、8.0.7.9.5.4.4.7.3.5、L、
D、 E、 、およびHD−122C−−120、−110″″、78.50
.46+、43.33.31.30.6.0 (o、c、) 、8. C15,
4、バシラス・チュリンジエンシス変異りルスタキ株HD−263はU。
S、 D、 A、カルチャー・コレクション(U、S、D、 A、cultur
ec。
11ection)から得られる。
このカルチャーの代表的な単一コロニーを単離しそして野生型又は親株として選
ぶ。このコロニー、HD−263−1(EG2035)は下記のプラスミドアレ
イ:1.4.4.9.5.0.5.2.5.4.7゜5.43.44+、60+
、110+及び130(メガダルトン、Md、で表したサイズ)を有する。
HD−263は、イリノイ州、ペオリアのNRRLカルチャ・コレクション、U
、S、D、 A、からNRRL−HD−263として入手可能HD263親株、
HD−263−1(EG2035)は、サイズl10Md、60Md及び44M
dの3種の毒素プラスミドを含有している。
HD−263−1をディフコ普通ブイヨン中で高められた温度(42°C)で−
夜振とうさせながら増殖させ、次いで単一コロニーをこの一夜培養物から単離す
る。44Md毒素プラスミドを失ったコロニーを、44Mdプラスミドの不存在
を検出するためのアガロースゲル上の単一コロニーのランダムスクリーニングに
より発見しそしてHD263−4と名付ける。
バシラス・チュリンジエンシス菌株HD−122A (EG2175)と受容株
HD73−26の両者の胞子をM27グロス(下記6.1節に記載の組成)に接
種しそしてこれらの株を穏やかに振とうさせながら30℃で8時間−緒に増殖さ
せることによって、バシラス・チュリンジェンシス菌株HD−122Aを受容株
HD73−26と一緒に増殖させることにより、バシラス・チュリンジエンシス
菌株HD−122A (EG2175)を供与菌として使用した。その後、受容
株のコロニーをストレプトマイシン含有プレートを使用することにより選び出し
くHD73−26はストレプトマイシンに対して耐性である)、次いでCry”
(結晶生産性)コロニーを位相差顕微鏡により同定する。このようにして、接合
体(transconjugant)HD73−26−23 (EG2255)
を造り出し、この接合体HD73−26−23は、HD−122Aから46+及
び5.4Mdプラスミドを取得した。次いで、HD73−26−23の胞子と受
容株HD263−4 (EG2038.)の胞子をM27グロスに一緒に接種し
そして穏やかに振とうさせながら30℃で8時間それらを一緒に増殖させること
により、HD73−26〜23を供与菌として使用する。HD73−26−23
から46+及びP1毒素プラスミドを取得した接合体HD263−4−5A (
EG2101)が、アガロースゲル上の受容菌型(PIP2+)コロニーのラン
ダムスクリーニングにより選び出された。
バシラス・チュリンジエンシス変異りルスタキ株HD279 (EG2154)
は、U、S、 D、 A、カルチャー・コレクションから得られる。
このカルチャーの代表的な単一コロニーを単離しそして野生型又は親株として選
ぶ。このコロニー、HD279−1 (EG2154)は、下記のプラスミドア
レイ、1.4.4.9.5,0.5.2.5.4.7゜2.765、L、 D、
E、 、43.44+、48.60+、110+及び130(メガダルトン、
Mdで表したサイズ)を有する。
HD279は、イリノイ州、ベオリアのNRRLカルチャー・コレクション、U
、S、D、A、 からNRRL−HD−279として入手可能HD−279の親
種、HD279−1 (EG2154)はl10Md、60Md及び44Mdの
大きさの三種のトキシンプラスミドを含んでいる。HD279−1は高温(43
℃)で数日間ルリア寒天(11%ペプトン、0.5%酵母抽出物、0.5%Na
Cl、1.2%寒天) 上テ増殖し、次いで単一細胞から由来するコロニーを成
長過度(over−grown)のコロニーから単離する。アガロースゲル上で
ランダムにスクリーニングすることにより60Mdl−キシンプラスミドを失っ
たコロニーが見出され、HD279−72 (EG2157)と命名される。
実施例7
プルテラ・キロステラに対する昆虫防除剤としての試験バチルス・ツリンギエン
シスの評価
次ぎの評価では、乾燥したB、t、粉末を充分な量の50150の水/アセトン
混合物中に分散して、評価されるB、t、株を30ないし11000ppとする
。使用物質が完全に懸濁することを確実にするために、次いで混合物を約5分間
超音波装置中に入れる。
次いでヘッド・キャベツ(head cabbage)又はチャイニーズ・キャ
ベツ(chinese cabbage)の葉を試験溶液に浸漬するか又は溶液
を噴霧し、そして湿潤した葉を乾燥させる。処理された葉を湿潤した濾紙で内張
すしたベトリ皿(150X20mm)中に入れ、10匹の第三主船ダイヤモンド
バック・モス(DiaIIlondback Moth)−プルテラ・キロステ
ラ幼虫を接種する。試験が開始されてから24.72及び120時間後の死亡率
を記録し、そして結果を記録する。試験開始後72時間において昆虫の索餌率を
も測定する。
この評価で使用されたB、t、株はメガダルトンで報告されたプラスミドの配列
により下記のように特定される。
HD263−1 (EG2035):英国からの原型株、クルスタキ変種。
プラスミド、130.110.60、アミン−末端基、43.7゜5.5.4.
5.2.5.0.4.9.1.4Md0トキシンプラスミド:110(PL、P
2) 、60 (PL) 、44(Pl)。
HD263−4 (EG2038):44−Md)キシンプラスミドで養生(c
ure)されたHD263−1株。
トキシンプラスミド:110(PI、P2)、60 (PL)。
HD263−4−5A (EG2101):HD−122Aの46Md(Pi)
)キシンプラスミドを獲得した受容体としてHD263−4を用いるトランス接
合体。
トキシンプラスミド:110(PL、P2) 、60 (Pl)及び46(PL
)。
ディベル(Dipel)は比較として使用されたアボット(AbbOtt)研究
所の製品である、バチルス・スリンギエンシスである。
これらの評価においては未処理の対照も使用される。
下記の表3に報告された農場噴霧試験において得られたデータによれば、HD−
122Aからの46MdプラスミドはHD236−4株の活性を増大することが
示されている。HD236−1、HD236−4及びHD236HD122−4
−5Aのl10MdプラスミドはHD122−1、HD122A、HD122B
及びHD122Cのl10Mdプラスミドと異なる殺虫性蛋白質をコード化する
ことに留意しなければならない。
表III
抗プルテラキロステラ(Plutella xylostell、a)に対する
植物スブレンに適用したB、 t、化合物の効果
(ppm) (72時間)
FID263−1 50 13.0 100.0 100.0 普通100 5
0.0 100.0 100.0 普通200 8g、0 100.0 100
.0 ゆるやか400 75.0 100.0 100.0 よりゆるやが■D
263−4 100 0.0 63.0 63.0 速い200 13.0 4
3.0 43.0 速い400 22.0 100.0 100.0 ゆるやか
600 60.0 100.0 100.0 ゆるやかHD263−4−5A
50 25.0 100.0 100.0 普通100 25.0 100.0
100.0 普通200 50.0 100.0 100.0 ゆるやか40
0 75.0 100.0 100.0 よりゆるやかディペル(Dipel)
300 40.0 100.0 100.0 ゆるやか比較 0.0 0.0
10.0 速い0−損害なし
1=僅かに又は葉の約1ないし5%の区域が消耗される。
3=軽く又は葉の約10ないし20%の区域が消耗される。
5=中程度又は葉の約30ないし40%の区域が消耗される。
7=著しく又は葉の約50ないし60%の区域が消耗される。
9=激しく又は葉の約70以上の区域が消耗される。
等級2.4.6、又は8は単に観察された損害が上記に指示された等級の間に入
ることを意味し、そして少数点を付けて示された等級は6個の植物からの平均等
級である。
この試験において噴霧乾燥されたB、t、試料は約10重量%のB。
t、結晶:22.5%のB、t、発酵固形物:52.75%のカオリナイト(ク
レー)希釈剤;8%の湿潤剤5%の非イオン性乳化剤及び2%の合成コンディシ
ョニング剤から成る湿潤性粉末として製造される。
キャベツ植物は農場の条件を模倣するが、スクリーン室中に導入される昆虫に対
して侵入を制限するスクリーン(screen)室内で成長させる。
この試験において、ダイヤモンド・モス幼虫(プルテラ・キロステラ)を導入し
、幼虫をキャベツ植物に侵入させる。植物体に試験組成物を4日間隔で噴霧し、
そして植物体当たりの1−2虫齢及び3−4虫齢の幼虫の数を計測し、処理が開
始した後、1日目及び4日目及び7日目に索餌による損害を評価する。
本試験で用いられる損害率体系(damage rating system)
は、以下の通りである。 損害率体系
0=損害なし
1=わずか又は、葉の面積の約1から5%が損害を受けた(consua+ed
)。
3=軽い又は、葉の面積の約IQから20%が損害を受けた。
5=中程度又は、葉の面積の約30から40%が損害を受けた。
7=かなり又は、葉の面積の約50から60%が損害を受けた。
9=ひどく又は、葉の面積の約70%以上が損害を受けた。
2.4.6又は8の評価は、単に、上記に示した評価はの間の損害が観察された
ことを示し、小数で示された評価は、6株の植物の評価の平均値である。
得られたデータを下記の表4に報告する。
表IV
プルテラキロステラ(PLutella xylostella)を制御するB
、 t、試験組成物の評価及びその組成物を適用することによるキャベツの損害
の制御の評価(vt/wt) ha 1−2 3−4 1−2 3−4 1−2
3−4 (7日)HD279 6.8% 30 8.8 0.9 6.6 0
.9 6.4 2.3 3.960 5.5 0.5 3.2 0.5 3.3
1.0 3.61’1D279−72 6.15% 30 g、5 1.3
4.9 0.8 4.0 1.4 2.860 8.9 1.9 4.8 1.
8 4.3 1.6 3.7HD122^ 12% 15 .7.7 0.2
4.0 0.3 4.2 0.8 2.330 8.1 0.4 5.3 0.
2 4.5 0.5 2.660 2.0 0.2 0.5 0.0 0.5
0.6 1.0デイベル 12% 60 11.8.2.3 5.7 1.4
4.6 1.9 4.9(Dipel、) 120 11.6 2.8 7.7
1.1 6.6 1.8 4.9240 10.6 1.1 7.8 1.1
7.5 1.8 4.3未処理 9.8 5.8 9.7 4.4 6.3
3.8 7.4fll atは活性成分またはトキシンプロティンを示す。
上記のデータから、1ヘクタール当たり15グラムのl10Mdプラスミドおよ
び46Mdプラスミドを有するHD−122Aのトキシン蛋白質は1ヘクタール
当たり60グラムのl10Mdプラスミドおよび46もしくは65Mdプラスミ
ドを含有していないHD−122AのB。
t、菌株と比較してプルテラ・キロステラ(P 1utella xylost
ella)の攻撃に対して良好な昆虫抑制および良好な植物保護を与えることが
わかる。
この評価では、下記のプラスミド配列ニブラスミド類:120.110.78.
50.46.43.33.31.6.0 (0,C,) 、8. O15,4,
4,7,3,5Md並びにり、D、E、トキシンプラスミド類:110 (PL
) 、46 (Pi)を有するB、 t、菌株HD−122A (EG2175
)、変種アイザワイ(aizawai)を噴霧乾燥したB、t、粉末状で製造し
、そして液体噴霧液の形状で適用するための水和剤に調合した。調合された組成
物は、10重量%のB、t、結晶、22.25%のB、t、発酵固体分、52.
75%のカオリナイト(クレー)希釈剤、8%の湿潤剤、5%の非イオン性乳化
剤および2%の合成シリケート調整剤からなっていた。
B、 t、水和剤の製造において使用できる他の希釈剤、湿潤剤および分散剤に
は、アタパルガイドおよびベントナイト希釈剤、テトラメチルジシネジオール、
ナトリウムアルキルスルホネートおよびノニルフェノールエトキシレート湿潤剤
並びにナトリウムナフタレンスルホン酸分散剤が包含される。
これらの評価で使用されている損害評価システムは下記の如くである:損害評価
システム
0=損害なし
1=僅か、すなわち葉の面積の約1−5%が消費された3=軽い、すなわち葉の
面積の約10−20%が消費された5=中程度、すなわち葉の面積の約30−4
0%が消費された7=重い、すなわち葉の面積の約50−60%が消費された9
=ひどい、すなわち葉の面積の約70%以上が消費された2、4.6または8の
評価は単に観察された損害が上記の評価間にあることを意味しており、そして小
数付きで示されている評価は6つの植物の平均的評価である。 これらの試験で
は、抗プルテラ・キロステラ(P 1utella xylostella)が
ひどく感染していることが既知の畑区域で成長しているキャベツ植物に試験化合
物の水性分散液をスプレーした。
キャベツ植物へのスプレー適用は、1ヘクタール当たり約15−490グラムの
活性化合物を供給するのに充分な量で行われた。第4回スプレー適用後3日およ
び6日に、1区域当たり6つの植物を幼虫数および植物損害に関して試験した。
これらの評価を下表Vに報告する。
表■
抗プルテラ キOステラ(PluteLla xylostella)に対する
4日間隔でND−112A及びディペル(DipeL)を適用した場合の効果の
比較処理物 gm ai/ 幼虫/植物1 損害率2tlD−122A 15
6.7 3.7 9.3 3.0 3.8 4.912% 30 5.6 0.
7 7.4 1.1 2.9 3.860 3.4 0.3 4.4 0.8
2.4 2.4120 5.7 0.0 6.6 13 2.4 2.0240
2.7 0.0 5.6 0.3 1.80.9デイベル 30 8.8 1
.2 10.2 2.9 3.8 5.0(Dipel)WP 60 8.3
1.512.6 2.8 3.8 5.212% 120 9.3 2.1 1
1.2 4.7 4.5 4.4240 4.4 0.8 13.9 2.6
3.2 4.0490 5.6 0.3 10.2 1.9 2.8 2.7未
処理 5.8 3.8 9.1 3.8 5.7 6.423回及び4回スプレ
ー後の6日に得られたそれぞれのロー9段階評価:率は6つの個々の植物での平
均値を示す。
上記ノデータから、プルテラ・キロステラ(Plutella xyloste
lla)の抑制に関しては59gm/haで適用されたHD−122Aの方が有
効であることがわかる。
実施例10
抗プルテラ・キロステラ(P 1utella xylostella)の抑制
に関するB。
t、菌株HD−122A (EG2175)の評価この試験は透明なプラスチッ
ク屋根を有するスクリーンで覆われたビルディング中で実施された。それぞれ9
つのキャベツ植物(変種、ヴイキマ)を含有している1平方メートルの区域を適
用前にそれの周囲に配置されている1平方メートルの箱で保護して、隣接区域か
らの汚染可能性を除いた。
第1回処理の前に成虫の蛾をビルディング中に放して植物上に産卵させた。幼虫
を数え、そして1−2幼虫齢および3−4幼虫齢の2つの区分で記録した。計数
は1日目の予備処理時とその後の各適用の1日前に行われた。植物損害評価は、
処理後3日および6日に行われた。
キャベツ植物へのスプレー適用は、1ヘクタール当たり約17−240グラムの
活性化合物を供給するのに充分な量で行われた。4日間隔で4回適用し、そして
1区域当たり6つの植物を幼虫数および植物損害に関して試験した。
これらのデータを下表v■に報告する。損害評価は0−9の目盛りで測定されて
おり、そして報告されている評価は6つの個々に評価された植物の平均である。
この評価では比較用にディペルが使用された。これはノくシルス・スリンジエン
シス(Bacillus thuringiensis)変種クルスタキ(ku
rstaki)である。デルタメスリンは(5)−a−シアノ−3−フェノキシ
ベンジル(IR,3R)−3−(2,2−ジブロモビニル)−2,2−ジメチル
シクロプロパンカルボキシレートであり、そしてこれも同様に比較用に使用され
た。テフルベンズロンは1−(3,5−ジクロロ−2,4−ジフルオロフェニル
)−3−(2,6−ジフルオロベンゾイル)尿素であり、そしてこれもこの試験
で比較用に使用された。
損害評価システム
0=損傷なし
1=僅か、すなわち葉の面積の約1−5%が消費された3=軽い、すなわち葉の
面積の約10−20%が消費された5=中程度、すなわち葉の面積の約30−4
0%が消費された7=重い、すなわち葉の面積の約50−60%が消費された9
=ひどい、すなわち葉の面積の約70%以上が消費された2、4.6または8の
評価は単に観察された損害が上記の評価間にあることを意味しており、そして小
数付きで示されている評価は6つの植物の平均的評価である。
下表VI中に報告されている損害評価データは、同じ割合での商業的なり、t、
処理と比べてHD−122A処理の優秀性を明白に示している。
実際に、はとんどの場合、低割合のHD−122Aの方がそれより高割合のディ
ペルの大部分より優れていた。120グラムのa i / h aにおけるHD
−122Aも3日および6日の読み取り値の両者で化学的標準より明らかに優れ
ていた。
表VI
抗プルテラ キロステラ(PLutella xylostella)の制御の
HD−122^の評価及び鱗翅目昆虫の比較のための市販の殺虫剤との比較処理
物 glm 幼虫/植物l/ 損害率2/HD−122A 12% 30 g、
1 1.915.1 3.7 3.5 4.71otA 60 5.9 1.2
9.2 1.9 2.9 3.6120 4.4 0.2 4.6 to 1
.8 2.4HD−122A 11.8% 30 9.1 1.915.7 4
.5 4.1 5.41otB 60 7.7 1.811.7 2.4 3.
5 4.7120 5.2 0.9 7.5 0.7 2.3 3.3デイベル
12% 60 8.7 3.018.9 4.2 4.3 4.8(Dipe
l)WP 120 16.9 3.417.3 6.0 4.0 5.2240
8.3 1,017.2 2.7 3.6 4.2デイベル 20% 60
L2.6 4.7 16.7 6゜8 4.3 6.1(Dipel)2X 1
20 10.2 1.9 16.6 5.0 3.7 5.3240 17.5
3.622.0 8.0 3.7 5.4Del tamethrin 2.
5% 17 2.1 2,210.8 5.3 4.8 5.925 7.6
3.8 6.8 3.5 4.7 6.5Teflubenzuron 5%
30 5.3 2.410.2 3.8 4.9 5.445 3.2 1.7
2.7 2.1 3.1 4.3未処理 −10,63,616,55,45
,76,9I/第4回スプレー後の3日及び6日目の結果:1−2幼虫齢、3−
4幼主船273回及び4回スプレー後の6日に得られたそれぞれのロー9段階評
価:率は6つの個々の植物での平均値を示す。
実施例11
本試験は、透明なプラスチックの屋根を持つスクリーンでおおわれた建物の中で
行う。それぞれ9株のキャベツ(変種、ヴイキマ(Vikima))を含む1平
方メートルの区画を、施用(applicatfon)前にそのまわりを1平方
メートルの箱を置いて保護し、隣りの区画からの汚染を除く。
蛾の成虫を建物の中に放し、最初の施用前に、植物上に産卵させる。
幼虫を2つのカテゴリー、即ち1−2齢及び3−4齢でかぞえ、記録する。計数
は、前処理の日及びそれぞれの連続する施用の1日前に行う。
植物の損害(damage)の評価は、処理の3日後及び6日後に行う。
噴霧による施用は、ヘクタール当り約17から240グラムの活性化合物を与え
るのに十分な量でキャベツに対して行う。4日間の間隔で4回の施用を行い、1
区画につき6株の植物で幼虫の数及び植物の損害を調査した。
これらのデータは、下記の表7に報告する。被害の評価は、0から9の段階で決
定し、報告された評価は、6株の個々の評価された植物の平均値である。
一5Aは、以下のプラスミド配列(plasmid array)を持ち、プラ
スミド、130.110“、60+、46″″、43.7.5.5,4.5.2
.5.0.4,9及び1.4MD0を持つ。
プラスミド=120.110“、78.50.46+、43.33.31.6.
0 (o、c、) 、8.0.5.4.4.7.3.5Md及びLED。
下記の表7に報告された、本実験のデータは、HD263−4−5A種クルスタ
キ株の上に(over)、HD122A種アイザワイ株を用いる葉の被害の防止
に著しい改善を示す。HD−122A及びHD263−4−5Aの両方が、同じ
45”Mdの毒素プラスミド(toxin plasmid)を含むが、明らか
にHD−122Aの110”Md毒素プラスミド及び/又は、他のHD−122
^株のバックグラウンドの性質は、HD−122Aで得られる優れたプルテラ・
キロステラ制御において、重要な部分をなす。
これらの試験で用いられる損害率体系(damage rating syst
em)は、以下の通りである。
損害率体系
0=損害なし
1=わずか又は、葉の面積の約1から5%が損害を受けた(consumed
)。
3=軽い又は、葉の面積の約10から20%が損害を受けた。
5=中程度又は、葉の面積の約30から40%が損害を受けた。
7=かなり又は、葉の面積の約50から60%が損害を受けた。
9=ひどく又は、葉の面積の約70%以上が損害を受けた。
2.4.6又は8の評価は、単に、上記に示した評価はの間の損害が観察された
ことを示し、小数で示された評価は、6株の植物の評価の平均値である。
表VII
プルテラ・キロステラに対するB、 t、株+1D−122A種B、t、組成物
ai/ha 退頁率
HD−122^ 30 2.6
60 1、0
HD263−4−5^ 30 3.5
60 3、5
微生物の寄託
B、t、微生物の単離された株の胞子形成性体及び非胞子形成体の両方がこれに
包含されることは、本発明の範囲に含まれる。ここで開示された組成物及び方法
において有用な微生物の模範例(exemplary)は、下記のバチルス(B
acillus)であり、それはアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・
コレクション(NRRL) 、イリノイ州ペオリア所在に寄託され、受は入れら
れており(assigned)、寄託番号を下記にリストにした。
B、スリンギエンシス(thuringiensis)株 受託番号HD−12
2A NRRL−B−18406HD−122B NRRL−8−18407H
D−122CNRRL−B−18408HD−122−I NRRL−B−18
409HD−263NRRL−TID−263HD263−4−5A NRRL
−8−182061’1D279 NRRL−HD−279HD279−72
NRRL−8−18345本発明の側面(aspects)は、寄託された微生
物による範囲に限定されず、寄託された態様は、単なる具体例として意図したも
のである。確かに、この中に示されそして記載されたそれらに追加する発明の様
々な修飾は、前記記載から当業者にとって明らかであろう。
国際調査報告
1ms+*all*−^−euC−11−II−PCT/US 8910497
B国際調査報告
US 8904978
S^ 32588
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.NRRLに寄託され、受託番号B−18046を割当てられたHD−122 A株;NRRLに寄託され受託番号B−18407を割当てられたHD−122 B株及びNRRLに寄託され受託番号18408を割当てられたHD−122C 株;又はそれらの突然偏異体、組換え体又は遺伝工学的な誘導体から選択された バチルス・スリンギエンシス変種アイザワイ細菌。 2.−120、−110+、78、50、46+、43、33、31、6.0( o.c.)、8.0、7.9、5.4、4.7及び3.5メガダルトンのプラス ミド及びL.D.Eを含むプラスミド配列を有する、請求項1に記載のバチルス ・スリンギエンシス変種アイザワイ細菌HD−122A。 3.110+メガダルトンのプラスミド及び65+メガダルトンのプラスミドを 含むプラスミド配列を有する、上記1に記載のバチルス・スリンギエンシス変種 アイザワイ細菌。 4.−120、−110+、78、65+、50、43、33、30、8.0、 7.9、6.0(o.c.)、5.4、4.7及び3.5メガダルトンのプラス ミド及びL.D.Eを含むプラスミド配列を有する、請求項3に記載のバチルス ・スリンギエンシス変種アイザワイ細菌。 5.110+メガダルトンのプラスミド及び46+メガダルトンのプラスミドを 含むプラスミド配列を有する、請求項1に記載のバチルス・スリンギエンシス変 種アイザワイ細菌。 6.〜120、〜110+、78、50、46+、43、33、31、6.0( o.c.)、8.0、5.4、4.7、3.5メガダルトンのプラスミド及びL .D.Eを含むプラスミド配列を有する、請求項5に記載のバチルス・スリンギ エンシス変種アイザワイ細菌。 7.請求項1ないし6のいずれかに記載のバチルス・スリンギエンシス細菌によ り産生されたトキシン蛋白質。 8.昆虫の食餌供給物又は索餌場に殺虫的に有効な量の、NRRLに寄託され受 託番号B−18046を割当てられたHD−122A、NRRLに寄託され受託 番号18407を割当てられたHD−122B及びNRRLに寄託され受託番号 18408を割当てられたHD−122C;又はそれらの突然偏異体、組換え体 又は遺伝工学的な誘導体から選択されたバチルス・スリンギエンシス変種アイザ ワイ細菌株を施用することを特徴とする昆虫を防除する方法。 9.該昆虫が鱗翅目昆虫である、請求項8に記載の方法。 10.請求項1ないし6のいずれかに記載されたバチルス・スリンギエンシス細 菌、又はそれらのトキシン蛋白質、及び適当なキャリヤーを特徴とする殺虫剤組 成物。
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