JPH02275810A - 殺虫剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）発明の目的 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　：以下ＢＴｉｉ
という）の産生ずる結晶毒素を有効成分としＢＴ菌細胞
及び芽胞を含有しない鱗翅目昆虫等に対して有効な殺虫
剤（以下ＢＴ農薬という）を製造する方法に関するもの
で、農薬業界及び農業の分野で広く利用されるものであ
る。

〔従来の技術〕

ＢＴＷｉの産生ずる結晶毒素は、鱗翅目昆虫等に対して
強力な殺虫作用を示し、しかも、人畜魚介類に対して、
無害であることから、バイオ農薬として実用化されてい
る。

一般に、ＢＴ農薬は結晶毒素の他に、自己再生のための
生命体である胞子（芽胞とも言う）を含んでおシ、自然
界において、そのままの状態で散布されると、胞子が発
芽し、さらにはＢＴ菌の増殖が生じ、蚕に薬害を与える
恐れがあり、国内の養蚕業保護の立場から、胞子の二次
増殖のないＢＴ農薬が求められている。

この課題を解決するために、結晶毒素を含有するＢＴ菌
の培養液内の細菌細胞・芽胞に対して、該結晶毒素の殺
虫能を喪失せしめることなく、細菌細胞・芽胞を殺滅し
得る如き緩徐な化学的殺菌処理と同じく緩徐な物理的殺
菌処理を組合せ、それらを同時に行なうことを特徴とす
る殺虫剤の製造法が提案されている（特公昭５１−５０
４７号公報〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の方法は、細菌細胞・芽胞の殺滅方法としては優れ
ているものであり、実用化されている方法であるが、該
方法で得られた結晶毒素は、殺菌処理によυ、実用的な
濃度（ＢＴ濃薬は一般にコナガに対して１．０００乃至
２．０００倍の製剤水懸濁液として用いられる）におけ
る残存殺虫活性が低下したものとなり易く、細菌細胞・
芽胞の殺滅を完全に行なう場合１１時によってはこれを
かなりの高濃度で使用しなければ充分な殺虫性能を示さ
ない殺虫剤しか得られない事があるという問題点を有す
る方法である。

本発明者等は、上記方法における細菌細胞・芽胞の殺滅
の効率を向上させ、品質の優れた製品が得られる製造方
法を確立すべく鋭意検討を行なった。

（ロ）発明の構成 〔課題を解決するための手段〕 本発明者等は、前記問題点を解消するための検討過程に
おいて、培養液中に存在する細菌細胞、芽胞および結晶
毒素の分散性が不十分であると、細菌細胞・芽胞の殺滅
効率を低下させ、特に水溶性成分の除去分離により濃縮
された培養液においてはその低下は著しく、ひいては結
晶毒素の殺虫活性を低下させることを見出し、培養液の
殺菌時に界面活性を存在させ分散性を向上させることに
より、実用に供し得る殺虫剤を製造するに足る殺虫活性
を有する結晶毒素が安定的に得られるばかりでなく、殺
虫活性の向上した結晶毒素が得られることを見出し、本
発明を完成した。

すなわち１本発明はバチルス・チューリンゲンシスの産
生した結晶毒素を含有する培養液の殺菌を、界面活性剤
の存在下に実施することを特徴とする殺虫剤の製造方法
に関するものである。

０結晶毒素を含有する培養液 本発明において殺虫剤の原料となる結晶毒素を含有する
培養液は、結晶毒素を産生ずるＢＴ菌、例えばバチルス
・チューリンゲンシス・バリエタス・クルスタキＨＤ−
１（Ｂａｃ　ｉ　１　ｌｕｇｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ　ｖａｒ　ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ−１）等を公知の培
養方法及び条件で培養して得られる本のである。

本発明において用いられるＢＴ菌としては公知のものの
いずれでもよく、培養方法及び条件は具体的に説明する
と以下のとおりである。

ＢＴ菌は、窒素源、炭素源、ミネラルおよびビタミンに
富む天然培地を使用して培養することができるが、結晶
毒素ならびに菌体の産生は、通気攪拌条件に大きく左右
されるので、充分な好気的条件で培養することが好まし
く、それにより両者の産生量を増すことができる。培養
温度は、約２５〜３０℃、培養日数は２〜４日間でよい
。炭素源としては。

例えば、蔗糖、麦芽抛、グルコース、フラクトース、糖
蜜が利用され、窒素源としては、例えば、コーンスチー
プリカー、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、綿実
粉、酵母工れる。また、ミネラルおよびビタミンは、糖
蜜、コーンスチープリカー、＃母エキスで代用すること
ができ、必要に応じては、無機塩類、ビタミン類をさら
に添加してもよい。特に、大量生産を行う場合は、深部
通気攪拌培養が好ましい。

０界面活性剤 上記の様にして培養した培養液中には、細菌細胞、芽胞
、結晶毒素の他に、培地に起因する成分、ＢＴ菌が菌体
外に排出した代謝物あるいは菌体内に含有され、自己融
解後に培養液中に放出された代謝産物等の水溶性成分が
存在するが、それをそのまま殺菌すると殺菌効率が一定
せず、特に効率の低下をもたらす水溶性成分を除去分離
した後の濃縮された培養液では特にその傾向が著しく、
完全な殺菌を目的とする場合には、殺菌条件をかなり厳
しいものとせざるを得す、ひいては結晶毒素の殺虫活性
を低下させていることを見出し。

さらにそれが培養液の分散性に起因することを見出し、
本発明を完成したものである。

本発明によれば、すなわち培養液の殺菌時に、界面活性
剤を添加存在させて培養液の分散性を向上させるという
方法により、実用的濃度で有効的な殺虫剤を極めて容易
に且つ定常的に製造することを可能にするものである。

用いられる界面活性剤としては、分散させる粒子すなわ
ち細菌細胞、芽胞および結晶毒素の粒子表面が負に帯電
していることから。

アニオン系又はノニオン系界面活性剤が好ましく、アニ
オン系界面活性剤としては、ポリアクリル酸ソーダ系、
例えばアロンＡ−２０ｐｘ（東亜合成化学工業■ｊｌｌ
り、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ系１例えばペレ
ックス隘６（化工■製）、レベノールＷＺ（化工■ｊ！
！り、ラウリル硫酸ソーダ系、例えばエマール２ＦＣ花
王■製）、ジオクチルスルホサクシネート系１例えばペ
レックス０ＴＰ（化工■製ンなどがあげられ、ノニオン
系界面活性剤としてはポリオキシエチレンエーテル系、
例えばエマルゲン９１０（化工■製）などがあげられる
。なお使用量としては殺菌を施こす培養液に対して０．
０１〜０．５０重量％の範囲が好ましく％特に好ましく
は０．０５〜０．２０重量％である。

０水溶性成分の除去 芽胞及び結晶毒素が形成された培養終了液（培養の進行
状態は１位相差顕微鏡で容易に追跡できる）中の水溶性
成分は殺菌効率を低下させるので、該水溶性成分を除去
した後の培養液を殺菌するのが好ましく、水溶性成分を
除く方法としては、通常の遠心分離法、濾過法、沈降法
などを利用して水溶液を除去する方法があげられる。特
に、大量に処理する場合には、遠心分離機あるいは膜ｆ
過材を使用する方法が好ましい。また、水溶性成分の除
去量は、前者の場合、遠心力（重力加速度）、通液イン
ターバル、洗浄インターバル等の操作条件により、後者
の場合、膜の孔径、圧力、通液速度等の操作条件により
設定することができる。

０役菌 本発明における殺菌は、細菌細胞・芽胞を殺滅するため
に行われるものであって、下記のような化学的殺菌処理
及び物理的殺菌処理方法があり、前掲の特公昭５１−５
０４７号公報に提案されているように、°単に一種類の
せるごとは困難であるから１本発明においても緩徐な化
学的殺菌処理と物理的殺菌処理とを組合せて、それらを
同時に行うことが好ましく、その方法により容易に細菌
細胞・芽胞を完全に死滅させることができ、殺虫能の優
れた肱業上極めて有用な殺虫剤を得ることができる。

Ｏ化学的殺菌処理 化学的殺菌処理方法は、ホルマリン、パラトルエンスル
ホンクロルアミドナトリウム、パラトルエンスルホン酸
ジクロルアミド、アゾビスクロロホルムアミジン、アク
リフラビン、メチレンブルー、塩化ベンザルコニウム、
塩化セチルピリジニウムなどの薬剤を上述の培養液に適
量加え殺菌する方法である。

０物理的殺菌処理 物理的殺菌処理方法は、加熱、超音波、放射線などによ
シ、上述の培養液を殺菌する方法である。

Ｏ殺虫活性の測定法 結晶毒素の殺虫活性を定量的に把握する方法としては、
コナガを用いた殺虫試験により半数致死濃度を求め、残
存殺虫活性を定量的に測定するという方法を採用した。

すなわち。

適当に希釈した試料液夫々に対する検定供試昆虫の死亡
率を測定し、試料液の濃度と死亡率との関係から半数致
死濃度を求め殺虫活性の高低を比較する方法である。

Ｏ調剤 ＢＴ菌の培養を界面活性剤の存在下に殺菌処理を行い、
必要に応じて、固液分離、精製を行うことで、死滅した
芽胞と結晶毒素から成る殺虫剤が得られる。

かかる殺虫剤は、通常、公知の方法で粉剤としたり、あ
るいは溶剤に懸濁させて裂創とすることが出来る。

そして、その有効成分量は、対象昆虫によって異なるが
１通常公知の範囲で用いられ。

また他の殺虫剤などと併用されてもさしつかえない。

〔作用〕

結晶毒素を有する培養液を界面活性剤の存在下に殺菌す
るという方法によれば、殺菌処理をより緩徐（例えば、
化学殺菌剤の使用量が軽減する）にすることが可能で、
結晶毒素の殺虫活性の低下を防止できるばかりでなく。

品質の一定した殺虫剤を定常的に供与でき、かつ従来の
ものよシ殺虫活性を高めることができるという作用を本
発明は奏するものである。

〔実施例〕

以下実施例を用いて、更に詳細に本発明を説明する。

なお、生残細胞・芽胞数及び残存殺虫活性の測定法は以
下のとおりである。

生残細胞・芽胞数測定 試料液１ｄを採り、無菌水にて適宜希釈し。

Ｎｕｔｒｉｅｎｔ−Ｂｒｏｔｈ−寒天培地（肉エキス１
チ。

ポリペプトン１チ、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．
５チ：ｐＨ７，０）上に流し、３０℃にて４８時間培養
し、発生するコロニー数を数えて、これより試料中の生
残芽胞数（ケ廓）を計算する。

残存殺虫活性測定 試料液を無菌水にて適宜希釈し、５ないし、７濃度段階
の検定液を５０ｍＡ’ずつ用意する。

この検定液にキャベツ生葉（２００ｄ）ヲ１分間浸漬し
た後、風乾する。これを大型シャーレに敷き、各区（濃
度区ン２０頭のコナガ３令幼虫を放飼し、７２時間後に
死重数を数え、死亡率（＠を算出する。この結果をフィ
ニ−（Ｆｉｎｎｅｙ）の図解法（Ｆｉｎｎｅｙ、Ｄ、Ｊ
、（１９４７）ｐｒｏｂｉｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖ　、　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　３１８　ｐｐ
）を用いて解析し、半数致死濃度（検定液に含有する試
料液の濃度（ｐｐｍ　）として表示する）を求める。

実施例１゜ バチルス・チューリンゲンシス・バリエタス・クルスタ
キＨＤ−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓｖａｒ　ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−１）　　を坂
ロフラスコ中のＣ培地（グルコース１１　コーンスチー
フリヵー１％、Ｍｎ　　ｌｐｐｍ：ｐ）（７，０）５０
ａ＋ｌに接稽し、５０℃、３日間振盪培養する。３日培
養後の培養液α８ｔを日立連続遠心分離用ローター（容
量１ｔ）に入れ、８，０ＯＯＸ、？で回分遠心分離（４
℃、１０分間）を行い、２０倍濃縮液を得る（濃縮液中
の固形分濃Ｎ、＝８％）。

固液５１づつを試験管に分注し、これに界面活性剤溶液
ならびに化学薬品溶液を合わせたも０５ｍ１を添加混合
し、殺菌処理を行った。

界面活性剤としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ソー
ダ、ジオクチルスルホサクシネート（商品名：ペレック
スＯＴＰ化工■製）以上、アニオン系界面活性剤、エマ
ルゲン９１０（商品名：化工■製）以上ノニオン系界面
活性剤を用い、稀釈された培養液中の濃度で０．０１〜
０、２５　％の範囲になるよう設定した。また、化学薬
品としては、ホルマリン（混合液中の濃度力２．１％）
とパラトルエンスルホンクロルアミトナ）　ＩＪウム（
混合液中の濃度が０．２９％）を用い、殺菌処理は、前
者は７０℃、１０分間加熱、後者は６０℃、１０分間加
熱とした。同殺菌処理を１０回くり返し、殺菌処理後に
薬品を除去した無菌水懸濁液の生残芽胞数を測定した。

その結果を表１に示す。

表１に見られるように、濃縮を行った培養固形分の高い
液を用いた場合、殺菌処理液の生残菌数にばらつきが認
められ、殺菌処理が均一に行えないが、この濃縮液に界
面活性剤を添加することで、殺菌処理の不均一性をなく
せることが判明した。なお、界面活性剤の添加量は、実
際に殺菌を施こす稀釈液中の濃度で、０．０５〜０．２
０％（濃縮液に対して、０．１〜０．４０チに相当）が
望ましく、また、殺菌処理液の残存殺虫活性も該濃度範
囲では、はとんど変わらなかった。

実施例２ バチルス・チューリンゲンシス・バリエタス・クリスタ
キＨＤ−１を坂ロフラスコ中の肉エキス・ペプトン培地
（肉エキス１チ、ボリペプ）７１１塩化＋）！ｊウム０
．２５％：　ｐＨ７，０）５０ｍに接種し、３０℃、３
日間振盪培養する。

同培養液を実施例１と同様の操作により、培養固形分８
％の濃縮液を得る。これに、界面活性剤であるペレック
スＯＴＰを混合液中の濃度が０．１％になるように添加
混合し、実施例１の条件で殺菌処理を行った。対照とし
て、ペレックスＯＴＰを添加せずに殺菌処理を行った。

殺菌処理後の生残菌数を測定した結果、１０回の殺菌処
理のうち、細菌細胞・芽胞を完全に殺滅できた回数は、
対照では、５回（ホルマリン）、６回（パラトルエンス
ルホンクロルアミドナトリウム）であったのに対し、ペ
レックスＯＴＰを添加した系では、いずれも１０回であ
った。

実施例３ バチルス・チューリンゲンシス・バリエタス・クルスタ
キ）（Ｄ−１を坂ロフラスコ中のＣ培地５０ｍに接種し
、３０℃、１０時間培養する。

同培養液１２０ｄを種菌とし、予じめ、１２ｔの２ＸＣ
培地（Ｃ培地の２倍濃度：１２０℃、１　ａｔｍ、　　
１５分滅菌）を仕込んでおいたジャーファメンター（全
書容量２０ｔ）に穐菌を接種し、ｐＨをＺＯに調整しつ
つ、３０℃で４８ｈ通気攪拌培養（回転数３　Ｑ　Ｑ　
ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ　）を行う。同培養終了液
を実施例１と同様の操作により、培養固形分８チの濃縮
液を得る。

実施例２と同様に、ペレックスＯＴＰを添加して、１０
回の殺菌処理を行ったところ、いずれも細菌細胞・芽胞
を完全に殺滅できた。

なお、培養液をそのまま殺菌処理した場合に較べて、培
養固形分換算の化学薬品使用量は大幅に削減され（ホル
マリン：約１／８．５、パラトルエンスルホンクロルア
ミドナトリウム：約１／９）、培養固形分あたりの残存
殺虫活性も飛躍的に増大した（ホルマリン：約３．３倍
、パラトルエンスルホンクロルアミドナトリウム：約３
倍〕。

（／１　発明の効果 本発明は、コナガ、モンシロチョウ、ヨトウガ、イチモ
ンジセセリなどの鱗翅目昆虫の幼虫に対して有効で、か
つ生菌体および胞子による二次増殖がない殺虫剤の製造
法に関し、結晶毒素を含有するバチルス・チーーリンゲ
ンシスの培養液を界面活性剤の存在下に殺菌処理を施す
ことで、化学薬品の使用量を大幅に削減したより緩徐な
殺菌処理を可能とし、しかも、殺菌処理後の残存殺虫活
性も高められるという優れた効果を有し、当該殺虫剤の
生産性向上ならびに品質向上及び安定性に大きく寄与す
るため、農薬業界及び漬菜の分野に広く貢献できるもの
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の産生した結晶毒素を含
   有する培養液の殺菌を、界面活性剤の存在下に実施する
   ことを特徴とする殺虫剤の製造方法。