PT90595B - Processo para a manipulacao genetica de bacillus thuringiensis e baccillus cereus, vectores adequados para esse fim e processos para a sua preparacao, metodo para o controlo de insectos utilizando bacillus geneticamente modificados e processo para a preparacao de composicoes utilizadas no referido metodo - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE BACILLUS THURINGIENSIS

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-2O referido processo, de manipulação genética consiste, nomeadamente, em se preparar uma sus pensão de células de densidade celular adequada num meio de cultura adequado ao crescimento de B.thuringiensis, com areja_ mento apropriado, separação das células e ressuspensão num tampão de inoculação adequado a electroporação, adição de uma amostra de DNA numa concentração adequada à electroporação, introdução da mistura descrita atrás num aparelho de electroporação, aplicação de descargas eléctricas durante um período de tempo adequado, reincubação facultativa das células elec troporadas, cultura destas num meio de selecção, e selecção das células transformadas.

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Transformação de Bacillus thuringiensis presente invento descreve um processo que pela primeira vez torna possível uma manipulação genetíca directa e dirigida de Bacillus thuringiensis e da estirpe aparentada 13. cereus usando tecnologia de DNA recombinante, baseado num processo de transformação eficaz para as referidas espécies de Bacillus.

O presente invento éstá ainda relacionado com a construção de plasmídeos e vectores vai-vem e com estirpes de B. thuringiensis e/ou !3. cereus que foram transformadas com eles.

presente invento também está relacionado com um processo para a inserção e, caso se pretenda, expressão de genes ou de outras sequências de DNA úteis em Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus , mas especialmente com um processo para a inserção e expressão de genes de protoxinas.

O presente invento também inclui um processo para a clonagem directa e, caso se pretenda, expressão e identificação de novos genes ou outras sequências de DNA úteis em Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus, como resultado do qual é possível pela primeira vez estabelecer bancos de genes directamente em Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus e expressá-los nelas.

Bacillus thuringiensis pertence a um vasto grupo de bactérias gram-pósitivas, aeróbicas e formadoras de endosporos. Ao contrário das espécies de Bacillus muito próximas, B. cereus e B. anthrais, a maioria das espécies de B. thuringiensis até aqui conhecidas produzem no decurso da sua esporulação um corpo de inclusão parasporal que, considerando a sua estrutura cristalina, é geralmente referi10:57:48

do também como corpo cristalino. Este corpo cristalino é composto por proteínas protoxinas cristalinas com actividade insecticida a chamada ^-endotoxina.

Estes cristais de proteína são responsáveis pela toxicidade para insectos de B. thuringiensis. A £-endotoxina não apresenta actividade insecticida até à ingestão oral do corpo cristalino, quando o último é dissolvido no suco intestinal alcalino dos insectos susceptíveis e o componente tóxico é libertado da protoxina como resultado da proteólise limitada causada pela acção de proteases do tubo digestivo dos insectos.

A ^-endotoxina das várias estirpes de B. thuringiensis distinguem-se pela sua elevada especificidade relativamente a certos insectos alvo, especialmente no que respeita às larvas de lepidoptera, Coleoptera e Diptera e pelo seu alto nivel de actividade. Outras vantagens da utilização de ξ -endotoxinas de E3. thuringiensis reside na dificuldade óbvia que os insectos alvo têm em desenvolver resistência à proteína cristalina e no facto de as toxinas serem inofensivas para o homem, outros mamíferos, pássaros, peixes e insectos.

Desde muito cedo que se reconheceu o potencial insecticida das protoxinas de B. thuringiensis. Desde o fim dos anos vinte que preparações de B. thuringiensis têm sido usados como bioinsecticidas no controle de várias doenças provocadas por insectos em plantas cultivadas.

Com a descoberta de IB. thuringiensis var. israelensis por l^Goldberg e Margalit (1977) e B. thuringiensis var. tenebrio2) ~ nis por Krieg et al (1983) foi possível estender a gama de utilização de B. thuringiensis às larvas de mosquito e de escaravelho .

Com a introdução da engenhatia genética e das novas possibilidades dela resultante, o campo

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das toxinas de B. thuringiensis recebeu novo ímpeto.

Por exemplo, a clonagem dos genes da ,5-endotoxina em organismos hospedeiros estranhos tais como, por exemplo, em E. coli, já é rotina. Entretanto o resultado disto é que as sequências de DNA de todo numa série de genero de £-endotoxina são agora conhecidas (por exemplo

3) 4 1

Schnepf Η. E. e Whiteley H.R., 1981; Klier A. et al.,

1982; ⁵⁾Geiser M. et al., 1981; ⁶⁾Haider Μ. Z. et al., 1987).

A maior parte das espécies de B. thuringiensis contêm vários genes que codificam uma proteína com actividade insecticida. Estes genes, que são expressos apenas durante a fase de esporulação, estão na maioria dos casos situados em grandes plasmídeos transferíveis (30-150 Md) e podem portanto ser fácilmente trocados entre as várias estirpes de B. thuringiensis e entre B. thuringiensis e B. ce7) reus desde que estas sejam compatíveis ( Gonzalez J. M. et al., 1982).

Os genes da proteína de B. thutingiensis var. kurstaki pertencem a uma família de genes relacionados, várias deles já foram clonados e sequenciados. Este trabalho foi efectuado especialmente num sistema de clonagem de E. coli.

A clonagem dos genes de B. thuringiensis tem estado até agora essencialmente limitada a alguns sistemas hospedeiros exclusivamente heterólogos dos quais o sistema E. coli é o melhor estudado e compreendido.

No entanto, entretanto também foram publicados trabalhos acerca da clonagem e expressão com êxito de genes de protoxina noutros sistemas hospedeiros, tais como, por exemplo, em B. subtilis (^Killer et al. , 1982) 8 )

Pseudomonas fluorescens (Obukowicz M.G. et al.) (1986) e Saccharomyces cerevisiae (EP 0 238 441). Também decorrem com

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-6J êxito a inserção e expressão do gene da £-endotoxina em células hospedeiras vegetais (EP 0292 4353.

Na clonagem em E. coli tira-se partido do facto de alguns genes de protoxinas conterem, além dos promotores de gram-positivas, também um promotor tipo E. coli. Estas sequências de DNA tipo promotor tornam possível que genes de protoxina de B. thuringlensis sejam também expressos em sistemas hospedeiros heterólogos, desde que estes sejam capazes de reconhecer as sequências de controle atrás referidas.

Após rebentamento das células hospedeiras, as proteínas de protoxina expressas podem ser isoladas e identificadas usando métodos conhecidos.

No entanto tem sido demonstrado que os promotores tipo E. coli não estão presentes em todos 9) os genes de protoxina ( Donovam, et al., 1988) e consequentemente apenas genes de protoxinas pouco específicas que reúnem os pré-requisitos atrás referidos podem ser expressos e portanto identificados em sistemas hospedeiros heterólogos.

A clonagem dos genes fora do organismo hospedeiro natural e a utilização destas estirpes como bioinsecticidas na prática está associado a uma série de desvantagens algumas das quais são graves:

a) Expressão de gene da protoxina de B. thuringiensis a partir das sequências de expressão nativas é possível apenas em certos casos.

b) Geralmente a secreção das proteínas estranhas expressas é minima ou nenhuma.

c) O enrolamento correcto das β-endotoxinas não é sempre garantido no meio redutor das células hospedeiras heterólogas e

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-7isto poderá resultar numa alteração indesejável da actividade específica ou na gama de hospedeiros das toxinas.

d) Caso ocorra expressão, as taxas de expressão dos genes estranhos cionados entre as sequências de expressão nativa são geralmente apenas baixas.

3),10^schnepf e Whitley (1981;1985) calcularam que a toxina de B. thuringiensis clonada em E. coli constitui apenas 0,5% a 1% da proteína celular total de E. coli, enquanto que a proteína cristalina em B. thuringiensis constitui entre 30% e 40% do peso seco de cultura esporulentas. Estas discrepâncias consideráveis entre as taxas de expressão podem ser possivelmente atribuídas à ausência de sinais específicos de controle de esporulação nos sistemas hospedeiros heterólogos e a dificuldades no reconhecimento dos promotores de B. thuringiensis e/ou a problemas na modificação pós-tradução da molécula de molécula de toxina pelo hospedeiro estranho.

e) Muitas das estirpes hospedeiras geralmente usadas na expressão não são toxicológicamente tão prejudiciais como B. thuringiensis e B. cereus.

f) 13. thuringiensis e B. cereus formam um componente natural importante da flora microbiana do solo, o que não acontece para a maior parte das estirpes hospedeiras geralmente usadas na expressão.

Os problemas e dificuldades atrás referidos podem ser ultrapassados se os referidos genes de B. thuringiensis puderem ser clonadas directamente no sistema hospedeiro homólogo sempre que seja possível usar os promotores gram-positivos naturais dos genes da protoxina para a expressão .

Como no entanto não existe ainda um processo que torne B. thuringiensis, esta bactéria tão im10:57:48

portante do ponto de vista comercial, adequados à modificação genética directa e que consequentemente torne possível, por exemplo, a reinserção eficaz de um gene de protoxina clonado numa estirpe de B. thuringiensis.

A causa disto pode ser encerrada, em particular, como devido do facto de não se ter conseguido com êxito o desenvolvimento de um sistema de transformação eficaz para B. thuringiensis e para a espécie próxima B. cereus que assegure taxas de transformação elevados e consequentemente torne possível a aplicação a J3. thuringiensis de técnicas estabelecidas de rDNA.

Os processos até agora usados para produzir novas estirpes de B. thuringiensis tendo novas propriedades insecticidas baseiam-se principalmente na transferência por conjugação de genes de protoxina codificados por plasmídeos.

A reinserção satisfatória de um gene clonado da proteína cristalina de B. thuringiensis em B. thuringiensis foi até à data descrita apenas num caso (^^Klier

A. et al., 1983), mas naquele caso também, devido à ausência de um sistema de transformação adequado para B. thuringiensis era necessário recorrer à transferência por conjugação entre

B. subtilis e B. thuringiensis. Ainda, neste processo descrito por Klier et al., E. coli é usada como hospedeiro intermediário .

Os processos de transferência por conjugação, no entanto têm uma série de desvantagens graves que fazem com que pareçam inadequados para uso de rotina na modificação, genética de B. thuringiensis e/ou £3. cereus.

a) A transferência de genes de protoxina codificadora por plasmídeos através da conjugação é possível apenas entre estirpes de B. thuringiensis e entre estirpes 13. cereus e de B.

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-9thuringiensis que sejam compatíveis umas com as outras.

b) Com transferência de plasmídeos por conjugação entre estirpes mais distantes muitas vezes apenas se consegue uma frequência de transferência baixa.

c) Não existe maneira possível de regular ou modificar a expressão de genes de protoxina.

d) Não existe maneira possível de modificar o próprio gene.

e) Se estiverem presentes vários genes de protoxina numa estirpe a expressão de genes individuais pode ser altamente reduzida como resultante do elemento efeito de dosagem de genes.

f) Podem surgir instabilidades como resultado de uma possível recombinação homóloga de genes de protoxina relacionados.

Processos de transformação alternativos que têm sido usados de rotina para muitos organismos gram-positivos, mostraram-se inadequados com B. thuringiensis e com B. cereus.

Um dos processos referidos é, por exemplo a transformação directa de protoplastos bacterianos por meio de tratamento com polietilenoglicol, o qual foi usado com sucesso no caso de muitas estirpes de Streptomyces

j.j. et al. , 1978 ) e no caso de B. subtilis (^^^Chang

S. e Cohem S.N., 1979), B. megaterium (^Brown B.J. e Carlton

B.C. , 1980), Streptococcus lactis ^Kondo J.K. e Makay L.L.,

1984), S. faecalis (¹⁶^Wirth R. et al), Corynebacterium gluta17) micum ( Yoshihama M. et al, 1985) e numerosas outras bactérias gram-positivas.

Para usar este processo, as células bacterianas devem primeiro ser convertidas em protoplastos, ou seja as paredes celulares são digeridas usando enzi10:57:48

-10mas líticas.

Um outro pré-requisito para o sucesso deste processo de transformação directa é a expressão da informação nova introduzida e a regeneração dos protoplastos transformados em meio sólido complexo antes de se poder detectar a transformação, por exemplo usando uma marca selectiva.

Este processo de transformação mostrou-se inadequado para B. thuringiensis e para a estirpe aparentada B. cereus. Como resultado da elevada resistência das células de B. thuringiensis à lisozima e à fraca regenerabilidade dos protoplastos para células intactas com parede celular, as taxas de transformação conseguidas permanecem

18) baixas e díficeis de reproduzir ( Alikhanian S.J. et al.,

19) ?0)

1981; Martin P.A. et al., 1981; 'Fischer H-M et al.,

1984 ) .

Com este processo é portanto possível, no máximo, para plasmídeos muitos simples, os quais são inadequados para trabalhar com DNA recombinante, serem inseridos numa baixa frequência em células de 13. thuringiensis ou de B. cereus.

Publicações individuais sobre taxas satisfatórias de transformação que tem sido possível conseguir usando o processo descrito baseiam-se na formulação de programas de optimização muito complexas, mas estes programas são sempre aplicáveis específicamente apenas a uma estirpe particular de B. thuringiensis e envolvem gastos enormes de 21) tempo e dinheiro ( Schall D., 1986). Tais processos são portanto inadequados para a aplicação de rotina numa escala industrial.

Tal como o trabalho de investigação intensivo no campo da genética de B. thuringiensis demons

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-11tra, existe um interesse substancial no desenvolvimento de novos processos que tornariam B. thuringiensis ou a estirpe próxima B. cereus adequadas à modificação genética directa e assim tornariam possível, por exemplo, a clonagem dos genes de protoxina no sistema hospedeiro natural. Apesar desta pesquisa não existem ainda soluções satisfatórias para as dificuldades e problemas existentes.

Não existem disponíveis processos de transformação adequados que tornem possível uma transformação rápida, eficaz e reprodutível de B. thuringiensis e/ou B. cereus com uma frequência de transformação adequadamente alta e não existem vectores de clonagem adequados que permitam a aplicação também o B. thuringiensis das técnicas de DNA recombínante já estabelecido para outros sistemas hospedeiros bacterianos.

Este objectivo foi agora surpreendentemente conseguido dentro do âmbito do presente invento através do uso de passos simples do processo alguns dos quais são conhecidos.

presente invento está assim relacionado com um novo processo, baseado na tecnologia de DNA recombínante, que pela primeira vez torna possível uma manipulação genética directa, especificamente controlada e reprodutível de B. thuringiensis e de B. cereus através da transformação de Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus com eficiência elevada por meio de um processo de transformação simples usando um DNA recombínante que é adequado para a referida manipulação genética de Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus.

O presente invento relaciona-se ainda com um processo para inserção, clonagem e expressão de genes ou outras sequências de DNA úteis, mas especialmente genes de protoxina, em B. thuringiensis e/ou B. cereus que se

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caracteriza por:

a) isolamento dos referidos genes ou DNA-,

b) caso se pretenda ligação operacional dos genes ou DNA isolados a sequências de expressão que são capazes de funcionar em Bacillus thuringiensis e/ou B. cereus;

c) introdução das construções genéticas da secção b) em células de Bacillus thuringiensis e/ou 13. cereus por transformação usando vectores adequados; e

d) caso se pretenda expressão de um produto do gene correspon dente e, caso se pretenda, seu isolamento.

presente invento também inclui um processo directo para clonagem, expressão e identificação de genes ou outras sequências de DNA úteis, mas especialmente genes de protoxina, em B. thuringiensis e/ou B. cereus que se caracteriza por:

a) digestão do DNA total de Bacillus thuringiensis usando enzimas de restrição adequados;

b) isolamento entre os fragmentos de restrição resultante daqueles que apresentam tamanho adequados;

c) inserção dos referidos fragmentos num vector adequado;

d) transformação de células de Bacillus thuringiensis e/ou B. cereus com o referido vector; e

e) localização de novas sequências de DNA usando métodos de despiste adequados e, caso se pretenda, seu isolamento a partir dos transformantes.

Além dos genes estruturais é também obviamente possível usar no processo de acordo com o ín10:57:48

vento quaisquer outras sequências de DNA úteis tais como, por exemplo, sequências de DNA não codificadoras que tenham uma função reguladora como seja por exemplo DNA anti-codão.

O processo do invento abre assim um qrande número de novas possibilidades que são de estraordinário interesse dos pontos de vista comercial e científico.

Por exemplo, é agora possível pela primeira vez obter informação, num nível genético acerca da regulação de síntese de $-endotoxina, especialmente no que se refere à esporulação.

Também deve ser agora possível classificar em qual posição da molécula de toxina está(ão) a(s) região(ões) responsável(eis) pela toxicidade para insectos e até que ponto esta(as) está (estão) também associadas com a especificidade do hospedeiro.

conhecimento da organização molecular das várias moléculas de toxina e das genes de toxinas codificadores destes moléculas das várias espécies de B.thuringiensis é de extraordinário interesse prático para uma manipulação genética controlada daqueles genes que é agora possível pela primeira vez usando o processo do invento.

Além de uma modificação controlada dos próprios genes de §-endotoxina, o novo processo do invento permite também a manipulação das sequências de DNA reguladoras que controlam a expressão daqueles genes, como resultado do qual as propriedades específicas dos $-endotoxinas , como seja por exemplo, a sua especificidade de hospedeiro, o seu comportamento de reabsorção inter alia, podem ser modificadas de um modo especificamente controlado e as taxas de produção das ^-endotoxinas podem ser aumentadas, por exemplo através da inserção de sequências promotoras mais fortes e mais eficazes.

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Através de mutação especificamente controlada de genes ou subgenes seleccionados in vitro é assim possível obter novas variantes de EL thuringeinsis e/ou B. cereus.

Uma outra via possível para a construção de novas variantes de B. thuringiensis e/ou B. cereus compreende a remoção de genes ou porções de genes originárias de várias fontes de B. thuringiensis, resultando em estirpes de B. thuringiensis e/ou B. cereus com um espectro de utilização mais largo. É também possível utilizar deste modo genes de toxinas sintéticas ou semi-sintéticas na construção de novas variedades de B. thuringiensis ou B, cereus.

Em adição, o processo de acordo com o invento torna possível pela primeira vez, como resultado do momento pronunciado da frequência de tranformação e da simplicidade do processo, o estabelecimento de bancos de genes e o despiste rápido de genes modificados e novos em B. thuringiensis e/ou B. cereus.

Em particular, o processo do invento agora pela primeira vez torna possível a expressão directa de bancos de genes em B. thuringiensis e/ou B. cereus e a identificação de novos genes de protoxina em B. thuringiensis usando de preferência processos imunológicos ou biológicos conhecidos.

O tema do presente invento é portanto um processo, baseado num aumento pronunciado na eficácia de transformação de B. thuringiensis/B. cereus comparado com processos conhecidos, que pela primeira vez torna possível uma modificação genética directa do genema de B. thuringiensis e/ou B. cereus.

Em particular o presente invento relaciona-se com um processo para a transformação de B. thu10:57:48

ringlensis e/ou cereus através da inserção de DNA recombinante, especialmente plasmídeo e/ou DNA vector, nas células de B. thuringiensis e/ou B. cereus por meio de electroporação.

É preferido um processo para a transformação de B. thuringiensis e/ou B. cereus com sequên- cias de DNA codificadoras de £-endotoxina e sequências de DNA codificadora de uma proteína que possui substancialmente as propriedades de toxicidade para insectos das referidas toxinas de 13. thuringiensis.

O presente invento também se relaciona com a expressão de sequência de DNA que codificam uma £-endotoxina ou uma proteína que pelo menos tem substancialmente as propriedades tóxicas para insectos da toxina de B. thuringiensis em células de B. thuringiensis e/ou B. cereus transformadas.

presente invento também inclui um processo para a produção de vectores bifuncionais, os chamados vectores vai-vem para o tratamento ou transformação de células de B. thuringiensis e/ou B. cereus.

É preferida a construção de vectores bifuncionais que além da replicação em B. thuringiensis e/ou B. cereus também se replicam num ou mais de outros sistemas hospedeiros heterólogos, mas especialmente em células de E. coli.

presente invento relaciona-se especialmente com um processo para a produção de vectores vai-vem para B. thuringiensis e/ou B. cereus que contém uma sequência de DNA codificadora de um polipeptídeo de £-endotoxina que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou pelo menos um polipeptídeos que é substancialmente homólogo dele, ou seja que pelo menos tem substancialmente as propriedades tóxicas para insectos da toxina de B. thuringiensis. O pre10:57:48

sente invento também inclui a utilização destes vectores vaivém para a transformação de células de B. thuringiensis e/ou B. cereus e a expressão das sequências de DNA presentes nos referidos vectores vai-vem especialmente aqueles sequências de DNA presentes nos referidos vectores vai-vem especialmente aquelas sequências de DNA que codificam uma §-endotoxina de B. thuringiensis ou pelo menos numa proteína que tem substancialmente as propriedades tóxicas para insectos das toxinas de B. thuringiensis.

presente invento também inclui o uso de B. thuringiensis e/ou B. cereus como organismos hospedeiros gerais para a clonagem e expressão de DNA homólogo e especialmente também de DNA heterólogo ou uma combinação de DNA homólogo e heterólogo.

Este invento também está relacionado com os plasmídeos referidos melhor caracterizado e com os próprios vectores vai-vem, com a sua utilização para a trans formação de B. thuringiensis e/ou B. cereus e com células de B. thuringiensis e de B. cereus que foram transformados com eles.

São especialmente preferidos dentro do âmbito deste invento os vectores bifuncionais (vai-vem) pXI61 (=pK61) e pXI93 (=pK93) que, introduzidos por transformação em B. thuringiensis var. Kurstaki HDlcryB e em B. cereus 569K, foram depositadas na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Braunsschweig, Federal Republic og Germany), reconhecido como Depositário Internacional, de acordo com o tratado de Budapeste com o número DSM 4573 (pXI61, introduzido por transformação em B. thuringiensis var. kurstaki HDlcryB) e DSM 4571 (pXI93, introduzido por transformação em B. thuringiensis Var. Kurstaki HDlcryB) e DSM 4573 (pXl93, introduzido por transformação em B. cereus 569K).

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presente invento relaciona-se especialmente com novas variedades de B. thuringiensis e de B. cereus que foram transformados com uma sequência de DNA que codifica numa g-endotoxina de B. thuringiensis e que pode ser expressa, ou transformadas com uma sequência de DNA codificadora de pelo menos uma proteína que tem substancialmente as propriedades tóxicas das toxinas de B. thuringiensis

As células transformadas de B.

thuringiensis e de B. cereus e as toxinas por elas produzidas podem ser usadas na preparação de composições insecticidas com as quais o presente invento também está relacionado.

invento também está relacionado com métodos e composições para o controle de insectos usando as células transformadoras de 13. thuringiensis e/ou B. cereus ou uma preparação acelular de corpos cristalinos ( £-endotoxina) contendo protoxinas produzidas pelas referidas células transformadas de Bacillus.

Segue-se uma breve descrição das

Figuras:

Figurai: Transformação de E. coli HB 101 com pBR322 (o) e * *

B. thuringiensis HDlcryB com pBC16 (.) (/^numero de células HDlcryB sobreviventes).

Figura 2: Influência da idade de uma cultura de B. thuringiensis na frequência de transformação.

Figura 3: Influência do valor do pH da solução tampão PBS na frequência de transformação.

Figura 4: Influência da concentração de sacarose da solução tampão PBS na frequência de transformação.

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-18Figura 5: Interdependência do número de transformantes e da quantidade de DNA usada por transformação.

Figura 6: Mapa de restrição simplificado do vector vai-vem *

pXIôl. A região sombreado caracteriza as sequências originárias do pBC16 de gram-positivas restantes originárias do plasmídeo pVC18 de gram-negativas.

Figura 7: Mapa de restrição simplificado de pXI93. A região sombreada caracteriza o gene estrutural de protoxina (seta, Kurhdl) e as sequências são codificadoras 5' e 3’. A restante parte nao sombreado deriva do vector vai-vem pXI61.

Figura 8: Electroforese em gel se SDS (dodecilsulfato de sódio) poliacrilamida de extractos de culturras espoculantes de *

-B. thuringiensis HDlcryB, B. cereus 569K e seus derivados. Zl:*HDlcryB (pXI93), 2: *HDlcryB (pXI61), 3:*HDlcryB, 4:HDl, LBG B-4449, 5:*B. cereus 569K (pXI93), 6: 569kJ.

a) Coloração com Comassie-M: padrão de peso molecular, MW: peso molecular (Dalton), seta. posição da protoxina de 130 000 Daltons.

b) Transferência Western do mesmo gel, à qual foi adicionado anticorpos policlonais contra a proteína cristalina K-l de B. thuringiensis HD1. As bandas positivas foram encontradas com a ajuda de anticorpos marcados anti-cabras. Seta: posição da protoxina de 130 000 Daltons. Outras bandas: produtos de degradação de protoxina.

Figura 9: Transformação de B. subtil is LBG B-4468 com DNA do plasmídeo pBC16 usando o processo de electroporação optimizado para B. thuringiensis. (o: transformantes/pg de DNA de plasmídeo; ·: número de bactérias vivas/ml) ♦ Λ

A referencia interna pK seleccionada para a nomenclatura dos plasmídeos no Documento de Prioridade foi substituída para-a

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-19Auslandsfassung (texto de pedido estrangeiro) pela designação oficialmente reconhecida pXI.

Também, os nomes dos montantes asporogénicos de B. thuringiensis HD1 usados nos Exemplos foram mandados de cryJS para cry B.

Um aspecto essencial do presente invento diz respeito a um novo processo de transformação para B.. thuringiensis e B. cereus baseado na inserção de DNA de plasmídeo em células de B. thuringiensis e/ou B. cereus usando tecnologia de electroporação conhecida per se.

Até agora todas as tentativas para aplicar os processos de transformação já estabelecido para outros sistemas hospedeiros bacterianos a B. thuringiensis e à espécie próxima C. cereus saíram frustados , é agora possível dentro do âmbito deste invento conseguir surpreendente êxito usando tecnologia de electroporação e passos juntos.

Este sucesso deve também ser considerado surpreendente e inesperado, especialmente uma vez que testes de electroporação com protoplastos de B. thuringiensis foram efectuados anteriormente por um qrupo Soviético ( Shivarova N. et al., 1983), mas as frequências de transformação conseguidas foram tão baixas que este processo foi subsequentemente encarado como inadequado para o tratamento de B. thuringiensis e consequentemente não recebeu mais atenção .

Com base em investigação dos parâmetros críticos para uma célula de B. thuringiensis e/ou B. cereus, foi agora surpreendentemente possível desenvolver um processo de transformação que está idealmente adaptado às necessidades de B. thuringiensis e B. cereus e resulta em taxas de transformação variando entre ÍC^ e 10θ células/ug de DNA de 6 7 * plasmídeo, mas especialmente entre 10 e 10 células/pg de

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DNA de plasmídeo.

Velocidade de transformação igual2 6 mente altas com valores entre 10 e um máximo de 10 transformantes/ug de DNA de plasmídeo foram até agora conseguidas apenas com o processo de transformação com PEG (polietilenogli21) col) descrito por Schall (1984). No entanto as taxas de transformação elevadas permaneceram restrigidas às estirpes de B. thuringiensis para os quais o processo do PEG foi especificamente adaptado em estudos de optimização muito demorados, o que torna este processo parecer inadequado para uso prático.

Ainda, a reprodutibilidade daquela processo na prática é em muitos casos inexistente ou fraco.

Ao contrário, o processo do presente invento é um processo de transformação que em princípio é aplicável a todos as estirpes de B. thuringiensis e de B. cereus e que é menos demorado, mais racional e consequentemente mais eficaz do que o tradicional processo de transformação com PEG.

Por exemplo no processo do invento é possível usar, por exemplo, células intactas dispensando assim a produção demorada de protoplastos crítica para 13. thuringiensis e B. cereus e a subsequente regeneração em meio nutritivo complexo.

Ainda, quando se usa o processo do PEG, a realização dos processo necessários pode demorar até uma semana, enquanto que com o processo de transformação do invento as células transformadas podem ser obtidas dentro de algumas horas (em regra durante a noite).

Uma outra vantagem do processo do invento diz respeito ao número de células de B. thuringiensis

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-21e/ou Β. cereus que podem ser transformados por unidade de tempo.

Enquanto que no processo tradicio nal com PEG apenas pequenas quantidades podem ser semeadas simultaneamente para evitar inibição da regeneração como resultado do crescimento das células ser demasiádo denso, quando se usa a técnica de electroporação grandes quantidades de células de B. thuringiensis e/ou J3. cereus podem ser semeadas simultaneamente.

Isto torna possível a detecção de transformantes mesmo com frequência de transformação muito baixas, o que com os outros processo descritos não é possível apenas com grande esforço.

Ainda, quantidades de DNA na gama dos monogramas são suficientes para se obter pelo menos alguns transformantes.

Isto é especialmente importante se fôr necessário em sistema de transformação muito eficaz, como seja por exemplo, quando se usa DNA de EL coli que tendo em conta um sistema de restrição fortemente pronunciado nas células de B. thuringiensis pode conduzir a uma redução das 3 frequências de transformação por um factor de 10 comparado com DNA de £. thuringiensis.

O processo de transformação do invento, que se baseia essencialmente na tecnologia de electroporação conhecida per se, caracteriza-se pelos seguintes passos específicos do processo:

a, Preparação de uma quantidade de células em suspensão de densidade celular adequada num meio de cultura adequado ao crescimento das células de B. thuringiensis e com arejamento adequado ao crescimento das células;

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b) separação das células de suspensão celular e ressuspensão num tampão de inoculação adequado à subsequente electroporação;

c) adição de uma amostra de DNA numa concentração adequada à electroporação;

d) introdução da mistura descrita nos pontos b) e c) num aparelho de electroporação;

e) uma ou mais descargas breves de um condensador através da suspensão celular para a produção rápida de forças de campo eléctrico altas durante um período que é adequado à transformação de células de B. thuringiensis e/ou B. cereus com DNA recombinante;

f) reincubação facultativa das células electroporadas;

g) sementeira das células electroporadas num meio selectivo adequado; e

h) selecção das células transformadas.

Numa realização específica do pro cesso do invento que é preferido dentro do âmbito do invento, as células de B. thuringiensis são primeiro incubados num meio nutritivo adequado com arejamento adequado e a uma temperatura adequada, de preferência entre 202C e 359C, até se conseguir uma densidade óptica (°^D55qJ entre 0,1 e 1,0. A ida de das culturas de Bacillus usadas na electroporação têm um efeito distinto na frequência de transformação. É especialmen te preparada uma densidade óptica das culturas de Bacillus entre 0,1 e 0,3 mas especialmente 0,2. No entanto deve-se ter em atenção o facto de ser possível conseguir boas frequências de transformação com culturas de Bacillus de outras fases do crescimento, especialmente com culturas crescidas durante a noite (ver Figura 2).

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-23De um modo geral usa-se como material de partida células frescas ou esporos mas é também igualmente possível usar material celular liofilizado. ’0 material celular é de preferência suspensões de células de B. thuringiensis e/ou B. cereus em meio líquido adequado ao qual com vantagem, se adicionou uma certa quantidade de umasolução anti-congelação.

Soluções anti-congelação adequadas são especialmente misturas de componentes osmóticamente activos e DMSO em água ou uma solução tampão adequada. Outros componentes adequados que podem ser usados nas soluções anticongelação incluem açucares, alcoóis poli-hídricos, tais como por exemplo, glicerol, alcoóis de açúcar, aminoácidos e polímeros, tais como por exemplo polietilenoglicol.

Se se usar como material de partida esporos de B. thuringiensis, eles são primeiro inoculados num meio adequado e incubados durante a noite a uma temperatura adequada, de preferência entre 25QC e 28°C e com arejamento adequado. Esta mistura é então ainda diluída e tratada como descrito atrás.

Para induzir a esporulação em B.

thuringiensis é possível usar qualquer meio que provoque tal esporulação. Dentro do âmbito deste invento é preferido um 23) meio GYS de acordo com Yousten A.A. e Rogoff M.H., (1969).

Geralmente introduz-se oxigénio no meio de cultura movimentando a cultura, por exemplo usando um agitador, sendo preferidas velocidades de rotação entre 50 revs/min e 300 revs/min.

Os esporos de B. thuringiensis e as células vegetativas de microorganismos são cultivadas dentro do âmbito do processo do presente invento de acordo com processo conhecidos, sendo de preferência usado meio nutriti10:57:48

vo líquido por questões práticas.

A composição do meio nutritivo pode variar ligeiramente dependendo da estirpe de B. thuringiensis ou B. cereus usada. Geralmente, são preferidos meios complexos com fontes de carbono (C-) e de azoto (N-) fácilmente assimiláveis e mal definidas, como as normalmente usadas na cultura de espécies aeróbicas de Bacillus.

São ainda necessários vitaminas e iões de metais essenciais, mas estes estão geralmente contidos numa concentração adequada como constituintes ou impurezas no meio nutritivo complexo usado.

Como se pretenda, os referidos constituintes, tais como por exemplo, vitaminas essenciais e também iões Na⁺, K⁺, Cu²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺, NH®, PO.^3-,

2- - 2- ⁴ \

SO^ , Cl , CO3 e os micronutrientes cobalto, manganês, zinco, etc., podem ser adicionados na forma de sais.

Além dos extractos de levedura, hidrolisados de levedura, auto-lisados de levedura e células de levedura, são fontes de azoto especialmente adequadas em particular a farinha de soja, farinha de milho, farinha de aveia, edamina (lactalbumina enzimáticamente digerida), peptona, hidrolisado de caseína, xarope de milho e extractos de carne, sem que o assunto do invento seja de alguns modos limitado por esta lista de exemplos.

A concentração preferida das fontes de N referidas é de 1,0 g/1 a 20 g/1 .

Fontes de C adequadas são especialmente glucose, lactose, sucrose, dextrose, maltose, amido cerelose, celulose e extracto de malte. A gama de concentração preferidas vai de 1,0 g/1 a 20 g/1.

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-25Além dos meios nutritivos complexos é também obviamente possível usar meios semi-sintéticos ou totalmente sintéticos que contêm os nutrientes atrás descritos numa concentração adequada.

Além do meio LB preferencialmente usado dentro do âmbito do presente invento é também possível usar qualquer outro meio de cultura adequado á cultura de B. thuringiensis e/ou B. cereus, tais como, por exemplo, Antibiotic Médium 3, meio SCGY, etc. As culturas esporuladas de B. thuringiensis são de preferência guardadas em meio GYS (agar inclinado) numa temperatura de 42C.

Após a cultura celular ter atingido a densidade celular pretendida, as células são colhidas por meio de centrifugação e suspensas numa solução tampão adequada que é preferêncialmente arrefecida em gelo antes de usada.

No decurso das investigações, verificou-se que a temperatura não é crítica e que pode portanto ser livremente escolhida dentro de uma gama larga. Uma gama de temperaturas entre 02 e 352C, de preferência entre 2QC e 152C e mais especíalmente é preferida uma temperatura de 42C. O período de incubação das células de Bacillus antes e após electroporação tem apenas um ligeiro efeito na frequência de transformação atingida (ver Tabela 1). Apenas uma incubação excessivamente longa resulta num decréscimo na frequência de transformação. Um período de incubação entre 0,1 e 30 minutos, especialmente de 10 minutos sendo preferido. No decurso das investigações, verificou-se que a temperatura não é crítica e portanto pode ser livremente escolhida dentro de uma gama larga. Uma gama de temperaturas entre 02C e 352C, de preferência entre 22C e 152C e mais especialmente uma temperatura de 42C, sendo preferida. Esta operação pode ser repetida uma ou mais vezes. As soluções tampão que são especialmente adequadas dentro do âmbito deste invento são tampões de

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fosfato osmóticaraente estabilizado que contem como agente estabilizante açúcares tais como, por exemplo, glucose ou sacarose ou alcoóis de açúcar, tais como por exemplo, manitol e tem valores de pH entre 5,0 e 6,0. São mais especificamente preferidos os tampões de fosfatos do tipo PBS tendo um valor de pH entre 2,0 e 8,0, de preferência entre 5,5 e 6,5, que contêm sacarose como agente estabilizador numa concentração de O,1M a l,0M, mas de preferência de 0,3M a 0,5M (ver Figuras 3 e 4 ) .

Amostras das células de Bacillus suspensas foram então transferidas para cuvetes ou quaisquer outros vasos adequados e incubados juntamente com uma amostra de DNA durante um período adequado, de preferência durante um período entre 0,1 e 30 minutos, mas especialmente entre 5 e 15 minutos e a uma temperatura adequada, de preferência a uma temperatura de 0SC a 352C mas especialmente a uma temperatura de 22C a 153C e mais especialmente a uma temperatura de 42C.

Quando se trabalha a baixas temperaturas é vantajoso usar cuvetes que já tenham sido pré-arrefecidas ou quaisquer outros vasos adequados pré-arrefecidos.

Ao longo de uma larga gama existe uma relação linear entre o número de células transformadas e a concentração de DNA usada para a electroporação, o número de células transformadas aumentando à medida que a concentração de DNA aumenta (ver Figura 5). A concentração de DNA preferida dentro do âmbito deste invento está na gama de 1 ng a 20 jig. Uma concentração de DNA de 10 ng a 2 pg é especialmente preferida.

Subsequentemente toda a mistura contendo células de B. thuringiensis e/ou células de B. cereus e DNA de plasmídeo ou uma outra amostra de DNA adequada é introduzida num aparelho de electroporação e sujeita a elec10:57:48

-2 7troporação, ou seja é brevemente exposta a um pulso eléctrico

O aparelho de elctropuração adequado para usar no processo do invento pode ser fácilmente adquirido de uma variedade de fabricantes, tais como, por exemplo, da Bio Rad (Richmond, CA, USA; Gene Pulsar Apparatus), Biotecnogies and Experimental Research Inc. (San Diego CA, USA; BTX Transfector 100), Promega (Madison, WI, USA; X-Cell 2000 Electroporation System), etc.

Também é obviamente possível usar qualquer outro sistema adequado no processo do invento.

Podem ser usadas várias formas de pulsos, por exemplo pulsor rectangulares ou como alternativa pulsos de crescimento exponencial.

Dentro do âmbito deste invento são preferidos os últimos. Elas são produzidos através de descarga de um condensador e não caracterizados por um aumento de voltagem inicialmente muito rápido seguido de uma fase de decaimento exponencial como função da resistência e da capacitância. A constante de tempo RC proporciona uma medida do comprimento do tempo de decaimento exponencial. Ela corresponde ao tempo necessário para a voltagem de cair para 37% da voltagem inicial (Vo).

Um parâmetro decisivo que influencia a célula bacteriana diz respeito à força do campo eléctrico que actua sobre as células, a qual é calculada a partir da razão entre a voltagem aplicada e a distância entre as placas dos electrodos.

Relacionando com into é também de grande importância o tempo de decaimento exponencial, o qual depende da configuração do aparelho usado (por exemplo a capacitância do condensador e de outros parâmetros, como seja por

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exemplo a composição da solução tampão ou o volume da suspensão celular sujeita à electroporação.

No decurso das investigações foi demonstrado por exemplo que reduzindo para metade o volume da suspensão celular sujeita à electropuração resulta num aumento da frequência de transformação por um factor de 10.

Um prolongamento do tempo de decaimento exponencial através de uma optimização da solução tampão usada também resulta num aumento distinto da frequência de transformação.

Todas as medidas que resultam num prolongamento do tempo de decaimento exponencial e consequentemente num aumento na frequência de transformação são portan to preferidos dentro do âmbito deste invento.

O tempo de decaimento preferido dentro do âmbito do processo do invento vai de aproximadamente 2 ms a aproximadamente 50 ms, mas especialmente entre apro ximadamente 8 ms e aproximadamente 20 ms. É especialmente pre ferido um tempo de decaimento exponencial entre aproximadamen te 10 ms e aproximadamente 12 ms.

Dentro do âmbito do presente invento, as células bacterianas são sujeitas durante períodos curtos de tempo a forças de campo muito altas por meio de breves descargas de um condensador através de uma suspensão celular contendo DNA; como resultado disto, a permeabilidade das células de B. thuringiensis é breve e reverssivelmente aumentada. Os parâmetros da electroporação são tão cordenados uns com os outros no decurso do processo do invento que é assegurada uma absorção óptima às células de Bacillus do DNA situado no tampão de electroporação.

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-29A capacidade marcada no condensador, dentro do âmbito deste invento, é com vantagem entre lpF e 250pF, mas especialmente entre ljiF e 50yF e mais especialmente é 25pF. A escolha da voltagem inicial não é critica e portanto pode ser livremente seleccionada, dentro de gamas largas. É preferida uma voltagem inicial Vo entre 0,2 KV e 50 KV, mas especialmente entre 0,2 KV e 2,5 KV e mais especialmente entre 1,2 KV e 1,8 KV. A distância entre as placas dos electrodos depende, inter alia, do tamanho do aparelho de electroporação. É com vantagem 0,1 cm a 1,0 cm, de preferência 0,2 cm a 1,0 cm e mais especialmente é de 0,4 cm. Os valores da força do campo que actuam sobre a suspensão celular resultam da distância entre as placas dos electrodos e a voltagem inicial marcada no condensador. Estes valores são com vantagem numa gama de 200V/cm a 50000 V/cm. Forças de campo entre 100 V/cm e 10 000 V/cm, mas particularmente entre 3 000 V/cm e 4 500 V/cm são especialmente preferidas.

A cordenação meticulosa dos parâmetros livremente escolhidos, tais como, por exemplo, capacitância, voltagem inicial, distância entre placas etc., depende até certo ponto de arquitectura do aparelho usado e pode portanto variar de caso para caso dentro de certos limites.

Em certos casos portanto, é possível exceder ou descer dos valores indicados desde que isto seja necessário para se conseguir forças de campo óptimas.

A operação de electroporação pode ser repetida uma ou mais vezes até ser atingida a frequência de transformação óptimas para o sistema em questão.

Após a electroporação, as células de Bacillus tratadas podem com vantagem ser novamente incubados, de preferência durante um período de 0,1 a 30 minutos, a uma temperatura entre 0QC e 35°C, de preferência entre 2°C a 152C. As células electroporadas são então diluídas com um meio adequado e novamente incubadas durante um período adequa10:57:48

do e novamente incubadas durante um período adequado, de preferência entre 2 e 3 horas, com arejamento adequado e uma tem peratura apropriada, de preferência entre 20°C e 359C.

As células de B. thuringiensis são então semeadas em meio sólido que contem como aditivo um agente adequado à selecção das novas sequências de DNA introduzidas na célula bacteriana. Dependendo da natureza do DNA usado, o referido agente pode ser, por exemplo, um composto com actividade antibiótica ou um corante inter alia. São especialmente preferidos os antibióticos seleccionados do grupo constituído por tetraciclina, camamicina, cloranfenicol e eritromicina dentro do âmbito deste invento para a selecção de células de Bacillus thuringiensis e/ou B. cereus.

Também são preferidos substratos cromogénicos, tais como, por exemplo, X-gal (5-bromo-4-cloro-3indolil-B-D-galactoxido), o qual pode ser detectado por via de uma reacção corada específica.

Outras marcas fenotípicas são conhecidas dos familiarizados com o tema e podem também ser usadas dentro do âmbito deste invento.

É possível usar qualquer meio nutritivo adequado à cultura de células de B. thuringiensis, ao qual se adiciona um dos meio solidificante convencionalmente empregues, como seja por exemplo, agar, agarose, gelatina, etc.

Os parâmetros do processo aqui descrito atrás detalhadamente para B. thuringiensis são aplicáveis do mesmo modo a célula de B. cereus.

Ao contrário dos processo até aqui disponíveis em trabalhos anteriores, o processo do invento para a transformação de B. thuringiensis e de‘:B. cereus

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aqui descrito atrás não está limitado ao uso de plasmídeos específicos naturais que ocorrem em B. thuringiensis e/ou B. cereus mas é aplicável a todos os tipos de DNA.

Assim é agora possível pela primeira vez transformar B^ thuringiensis e/ou B. cereus de modo controlado sendo possível usar além de DNA de plasmídeo homólogo, ou seja DNA de plasmídeo que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou na espécie próxima B. cereus, também DNA de plasmídeo de origem heteróloga.

Isto pode ser DNA de plasmídeo que ocorre naturalmente num organismo diferente de B. thuringiensis ou de espécie próxima B. cereus, como seja, por exemplo, os plasmídeos pUBllO e pC194 de Staphylococcus aureus (24 ^Horinouchi S. e Weisblum B., 1982 ; ρ_οι_ά)ς j. _e Novick R.P. 1982 ) e o plasmídeo pIM13 de B. subtilis {^^Mahler J. e Halvorm H.O. 1980), os quais são capazes de se replicarem em B. thuringiensis e/ou B. cereus ou DNA de plasmídeo híbrido construído por tecnologia de DNA recombinante a partir de DNA de plasmídeo homólogo ou de DNA do plasmídeo de plasmídeo homólogo e heterólogo. O último DNA de plasmídeo híbrido referido é mais adequado para trabalhar com DNA recombinante do que os isolados naturais.

Pode ser aqui referido como exemplo, sem que o tema do presente pedido seja de algum modo li, 2 7) mitado, os plasmídeos pBD64 ( Gryczam T. et al., 1980), pBD347 e pUBl664.

Os vectores de clonagem já estabelecidos para B. subtillis, tais como, por exemplo pBD64, podem ser de particular importância para a realização das experiências de clonagem em vários estirpes de B. thuringiensis e B. cereus.

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Além do DNA de plasmídeo, é agora possível dentro do âmbito do presente invento introduzir qualquer outro DNA em B. thuringiensis e B. cereus por transformação. 0 DNA transformado pode replicar-se autonomamente ou integrado no cromossoma. Pode ser por exemplo, um DNA vector derivado não do plasmídeo mas de um fago.

O presente invento também está relacionado com a construção de vectores bifuncionais (vectores vai-vem).

É especialmente preferido dentro do âmbito deste invento a construção e utilização de vectores tipo plasmídeo (híbrido) bifuncionais, os chamados vectores vai-vem, que são capazes de se replicarem em um ou em vários organismos hospedeiros heterólogos além de B. thuringiensis ou da espécie próxima B. cereus e que são identificados tanto em sistemas hospedeiros homólogos como heterólogos.

Organismos hospedeiros heterólogos devem ser entendidos dentro do âmbito deste invento como todos aqueles organismos que não pertencem ao grupo de B. thuringiensis/B. cereus e que são capazes de manter um DNA auto-replicativo numa condição estável.

De acordo com a definição acima é portantanto possível para organismos procarióticas e eucarióticas funcionarem organismos hospedeiros heterólogos. Nesta altura deve ser mencionado como exemplo, como representativos do grupo de organismos hospedeiros procarióticos, exemplos individuais dos géneros Bacillus, tais como, por exemplo 13. subtilis ou B. megaterium, Staphylococcus, como seja por exemplo, S_. aureus, Straptococcus como seja por exemplo Streptococcus faecalis, Streptomyces, como seja por exemplo Strepmyces spp., Pseudomonas, como seja por exemplo Pseudomonas spp. , Escherichia, como seja, por exemplo, E. coli, Agrobacterium, como seja, por exemplo, A. tumefaciens ou A. rhizoge10:57:48

-33nes, Salmonella, Erwinia, etc. Do grupo de hospedeiros eucariotas podem ser especialmente referidas leveduras e células animais e vegetais. Esta lista de exemplos não é final e não pretende limitar de algum modo o assunto do presente invento Outros representantes adequados dos grupos de organismos hos pedeiros procariótas e eucariótas são conhecidos dos entendi dos na matéria.

São especialmente preferidos dentro do âmbito deste invento B. subtilis ou B. megaterium, Pseudomonas spp e especialmente EL coli do grupo de hospedeiros procarióticos assim como levedura e células animais ou vegetais do grupo de hospedeiros eucarióticos.

São mais especialmente preferidos vectores bifuncionais que sejam capazes de se replicarem em células de B. thuringiensis e/ou B. cereus assim como em E. coli.

O presente invento também inclui a utilização dos referidos vectores bifuncionais para a trans formação de B. thuringiensis e de B. cereus.

Construiram-se vectores vai-vem usando tecnologia de DNA recombinante, plasmídeo 4 ou DNA vector de origem homólogo (B. thuringiensis, B. cereus) ou heteróloga sendo inicialmente clivado usando enzimas de restrição adequadas e depois os fragmentos de DNA contendo funções essenciais para a replicação no respectivo sistema hospedeira pretendido sendo ligados uns aos outros na presença de enzimas adequados.

Os organismos hospedeiros heterólogos atrás referidos podem actuar como fonte de DNA de plasmídeo e/ou vector de origem heteróloga.

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A união dos vários fragmentos de DNA deve ser efectuada de modo a que as funções essenciais para a replicação nos diferentes sistemas hospedeiros sejam mantidas.

Em adição, óbviamente também se pode usar DNA de plasmídeo e/ou DNA vector de origem puramente heteróloga na construção de vectores vai-vem mas pelo menos um dos parceiros heterólogos da fusão deve conter regiões de DNA que tornem possível a replicação em sistemas hospedeiros homólogos de B. thuringiensis/B. cereus.

Como uma fonte de DNA de plasmídeo e/ou DNA vector heterólogo que no entanto é capaz de se replicar num sistema hospedeiro B. thuringiensis/B. cereus pode-se referir como exemplo alguns representantes do grupo de bactérias gram-positivas, seleccionado do grupo constituído pelos géneros Staphylococcus, como seja por exemplo Staphylococcus aureus , Streptococcus, tais como por exemplo Streptococcus faecalis, Bacillus, como seja por exemplo, Bacillus megaterium ou B. subtil is, Streptomyces, como seja por exemplo Streptomyces spp., etc. Além dos representamtes do grupo de bactérias gram-positivas atrás referidas como exemplo, existe toda uma série de outros organismos conhecidos gue podem ser usados no processo do invento.

presente invento relaciona-se assim com um processo para a produção de vectores bifuncionais que são adequados à transformação de B. thuringiensis e/ou B. cereus, o qual se caracteriza por:

a) em primeiro lugar fragmentação do DNA de plasmídeo de origem homóloga ou heteróloga em fragmento usando enzimas de restrição adequadas e

b) nova ligação, na presença de enzimas adequados dos fragmentos possuidores de funções essenciais para a replicação e se10:57:48

-35lecção no respectivo sistema hospedeiro pretendido, isto sendo efectuado de modo a que as funções essenciais à replicação e selecção nos vários sistemas hospedeiros sejam mantidas

Deste modo obtem-se plasmídeos bifuncionais que contêm, além das funções necessárias à replicação em B. thuringiensis ou B. cereus, outras sequências de DNA que asseguram replicação em pelo menos um outro sistema hospedeiro heterólogo.

Para assegurar uma selecção rápida e eficaz dos vectores bifuncionais em sistemas hospedeiros homólogos e heterólogos é vantajoso dotar os referidos vectores de marcas selectivas específicas que podem ser usadas em B.. thuringiensis e/ou B. cereus assim como em sistemas hospedeiro(s) heterólogo(s), ou seja que tornem possível uma selecção rápida e não complicada. Dentro do âmbito deste invento é especialmente preferida a utilização de sequências de DNA codificadoras de resistências a antibióticos, especialmente sequências de DNA que codifiquem resistências a antibióticos seleccionados do grupo constituído por canamicina, tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina, etc.

Também são preferidos genes que codifiquem enzimas com um substrato cromogénico, como seja por exemplo, X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosido). As colónias transformadas podem então ser detectadas muito fácilmente através de uma reacção corada específica.

Outros genes de marcas fenótipicas são conhecidas dos familiarizados com a matéria e também podem ser usados dentro do âmbito deste invento.

É especialmente preferida, dentro do âmbito deste invento, a construção de vectores vai-vem” que, além das sequências de DNA que permitem a replicação em B. thuringiensis ou B. cereus ou em ambos os sistemas hospe10:57:48

deiros, contem também regiões de DNA que são necessários à replicação noutros sistemas hospedeiros bacterianos , tais como, por exemplo, em B. subtilis B. megaterium, Pseudomonas spp, E. coli, etc.

São também preferidos os vectores vai-vem que se repliquem por um lado em B. thuringiensis ou B. cereus ou em ambos e por outro lado em sistemas hospedeiros eucarióticos seleccionados do grupo constituído por leveduras células animais e vegetais, etc.

É mais especialmente preferida a construção de vectores vai-vem que além das sequências de DNA necessárias à replicação dos referidos vectores em B. thuringiensis ou B. cereus ou em ambos os sistemas hospedeiros, também possua sequâncias de DNA que tornem possível a replicação dos referidos vectores vai-vem em E. coli.

São exemplos de tais plasmídeos de partida para a construção de vectores vai-vem para o sistema B. thuringiensis-B. cereus/E. coli, os quais porém não devem ser encarados como limitativos, o plasmídeo pBC16 de B. cereus e o plasmídeo pUC8 derivado do plasmídeo pBR322 2 8) de E^. coli ( 'Vieira J. e Messing J., 1982).

O presente invento também está relacionado com vectores bifuncionais (vai-vem) que, além das funções essenciais à replicação e selecção em sistemas hospedeiros homólogos e heterólogos, também contem um ou mais genes numa forma expressável ou outras sequências de DNA úteis. Este invento também inclui processos para a produção destes vectores, os quais se caracterizam pela inserção dos referidos genes ou outras sequências de DNA úteis nestes vectores bifuncionais com o auxílio das enzimas adequadas.

Usando os vectores vai-vem do invento e o processo de transformação atrás descrito é agora

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possível pela primeira vez introduzir em células de B. thuringiensis e/ou B. cereus por transformação, com um nível de eficácia elevado, sequências de DNA que foram clonadas fora das células de B. thuringiensis num sistema hospedeiro estranho .

Assim, é agora possível pela primeira vez para genes ou outras sequências de DNA úteis, especialmente também aquelas que possuem uma função reguladora, serem introduzidas de modo estável em células de B. thuringiensis e B. cereus e, caso se pretenda, nelas expressas como resultado do qual se obtem células de B. thuringiensis e B. cereus com novas propriedades pretendidas.

Gene(s) ou DNA homologo(s) e heterólogo(s) e gene(s) ou DNA sintético(s) de acordo com a definição dada dentro do âmbito do presente invento, assim combinações dos referidos DNAs, podem ser usados como genes no processo do invento.

A sequência de DNA codificador pode ser construída exclusivamente a partir de DNA genómico, e DNA ou DNA sintético. Uma outra possibilidade é a construção de uma sequência de DNA híbrido consistindo em cDNA e DNA genómico e/ou DNA sintético ou como alternativa uma combinação daqueles DNAs.

Naquele caso, o cDNA pode derivar do mesmo gene do DNA genómico, ou como alternativa o cDNA e o DNA genómico podem derivar de genes diferentes. Em qualquer dos casos, no entanto, tanto o DNA genómico como o cDNA podem ser preparados individualmente a partir do mesmo gene ou de genes diferentes.

Se a sequência de DNA possuir partes de mais de um gene, estes genes podem derivar de apenas um organismo, de vários organismos que pertençam a estir10:57:48

¢=0=³ pes diferentes ou de variedades do mesmo tipo ou espécies diferentes do mesmo género ou de organismos gue pertençam a mais do que um género da mesma unidade toxomómica ou de outra diferente.

Para assegurar a expressão dos referidos genes estruturais na célula bacteriana, as sequências codificadoras devem em primeiro lugar sera operacionalmente ligadas a sequências de expressão capazes de funcionarem em células de B. thuringiensis e/ou B. cereus.

As construções de genes híbridos do presente invento contêm assim, além dos gene(s) estrutural (ais), sinais de expressão que incluem sequências de promotor e de terminador assim como outras sequências reguladoras de regiões 3 e 5' não traduzidas.

Dentro do âmbito deste invento são especialmente preferidos os próprios sinais de expressão naturais de B. thuringiensis e/ou B. cereus e seus mutantes e variantes que sejam substancialmente homólogos da sequência natural. Dentro do âmbito deste invento uma sequência de DNA é substancialmente homólogo de uma segunda sequência de DNA quando pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mas especialmente pelo menos 90% das regiões activas da sequência de DNA são homólogos. De acordo com a presente definição da expressão substancialmente homólogo, dois nucleotídeos diferentes numa sequência do DNA de uma região codificadora são encaradas como homólogos se a troca de um pelo outro fôr uma mutação silenciosa.

É especialmente preferido o uso de promotores dependentes da esporulação de B. thuringiensis que asseguram a expressão como função da esporulação.

Dentro do âmbito deste invento é especialmente preferido para a transformação de 13. thurin10:57:48

-39giensis ou de Β. cereus ο uso de sequência de DNA que codifiquem um ^-endotoxina.

A região codificadora do gene quimérico do invento de preferência contem uma sequência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou, como alternativa, um polipeptídeo que seja substancialmente homólogo dele, ou seja que pelo menos tenha substancialmente as propriedades de toxicidade de uma proteína £-endotoxina cristalina de B. thuringiensis . Dentro do âmbito do presente invento, por definição um polipeptídeo tem substancialmente as propriedades de citotoxicidade da proteína ^-endotoxina cristalina de B. thuringiensis se possuir uma actividade insecticida um espectro contra larvas de insectos semelhantes ao da proteína cristalina de uma sub-espécie de B. thuringiensis. Algumas sub-espécies adequadas são por exemplo as seleccionadas do grupo constituído por Kurstaki, berliner, alesti, tolworthi, sotto, dendrolimus, tenebrionis e ispaelensis. A sub-espécie preferida das larvas de Lepidoptera é Kurstaki e, especialmente Kurstaki HD1.

A região codificadora pode assim ser uma região que ocorre naturalmente em B. thuringiensis. Como alternativa, a região codificadora pode, caso se pretenda conter também uma sequência que é diferentes da sequência em B. thuringiensis mas que é equivalente a ela considerando a degeneração do código genético.

A região codificadora do gene quimérico pode também codificar um polipeptídeo que é diferente de uma proteína £-endotoxina cristalina natural mas que ainda possui substancialmente as propriedades de toxicidade para insectos da proteína cristalina. Tal sequência codificadora será normalmente uma variante de uma região codificadora natural. Uma variante¹' de uma sequência de DNA natural dentro do âmbito deste invento deverá, por definição,

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ser entendida como uma forma modificada de uma sequência natural que, no entanto, ainda desempenha a mesma função. A variante pode ser um mutante ou uma sequência de DNA sintético que é substancialmente homólogo da correspondente sequência natural. Dentro do âmbito deste invento uma sequência de DNA é substancialmente homólogo de uma segunda sequência de DNA quando pelo menos 70% de preferência pelo menos 80%, mas especialmente pelo menos 90%, das regiões activas da sequência de DNA forem homólogas. De acordo com a presente definição da expressão ¹¹ substancialmente homólogo, dois nucleotídeos diferentes numa sequência de DNA são considerados homologos se a troca de um nucleotídeo por outro for uma mutação silenciosa.

Dentro do âmbito do presente invento, é assim possível usar qualquer gene quimérico codificador de uma sequência de aminoácidos que tenha as propriedades insecticidas de uma ^-endotoxina de £. thuringiensis e que preencher os requesitos divulgados e reivindicados. S especialmente preferido o uso de uma sequência de nucleotídeos que seja substancialmente homóloga de pelo menos parte ou partes da sequência natural que é (não) responsável(eis) pela actividade insecticida e/ou especificidade do hospedeido da toxina de B. thuringiensis.

polipeptídeo expresso pelo gene quimérico como regra também tem pelo menos algumas propriedades imunológicas em comum com uma proteína cristalina natural pois possui pelo menos alguns determinantes antigénios iguais.

Deste modo, o polipeptídeo que é codificado pelo referido gene quimérico está preferencialmente estruturalmente relacionado com a ^-endotoxina da proteína cristalina produzida por B. thuringiensis. B. thuringiensis produz uma proteína cristalina com uma subunidade que corresponde a uma protoxina tendo um peso molecular (MW) de aproximadamente 130 000 a 140 000. Esta subunidade pode ser clivada

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-41por proteases ou por bases em fragmentos insecticidadas tendo um MW de 77 000 e possivelmente mesmo menos.

Para a construção de genes quiméricos em que a região codificadora inclui tais fragmentos da protoxina ou mesmo partes mais pequenas, a fragmentação da região codificadora pode ser continuada desde que os fragmentos ou partes daqueles fragmentos tenham a actividade insecticidá necessária. A protoxina, fragmentos insecticidas da protoxina e partes insecticidas daqueles fragmentos podem ser ligados a outra moléculas, tais como polipeptídeos e proteínas .

Regiões codificadoras adequadas para usar dentro do âmbito do processo do invento podem ser obtidas a partir de genes de B. thuringiensis que codificam o gene da toxina cristalina (Whiteley et al; Pedido de Patente PCT WO86/01536 e Patente U.S. 4 448 885 e 4 467 036).

Uma sequência nucleotídica preferida que codifica uma proteína cristalina está situada entre os nucleotídeos 156 e 3623 na fórmula I ou é uma sequência mais curta que codifica um fragmento insecticida de tal proteína cristalina ( Geiser et al., 1986 e EP 238 441).

Formula I

20 30 40 50 60

GTTAACACCC TGCGTCAAAA ATTGATATTT AGTAAAATTA CTTGCACTTT GTGCATTTTT

80 90 100 110 120

TCATAAGATG AGTCATATGT TTT.AAATTGT AGTAATGAAA AACAGTATTA TATCATAATG

10:57:48

130	140	150	160	170	180
AATTGGTATC	TTAATAAAAG	AGATGGAGGT	AACTTATGGA	TAACAATCCG	AACATCAATG
190	200	210	220	230	240
AATGCATTCC	TTATAATTGT	TTAAGTAACC	CTGAAGTAGA	AGTATTAGGT	GGAGAAAGAA
250	260	270	280	290	300
TAGAAACTGG	TTACACCCCA	ATCGATATTT	CCTTGTCGCT	AACGCAATTT	CTTTTGAGTG
310	320	330	340	350	360
AATTTGTTCC	CGCTGCTGGA	TTTCTCTTAG	GACTAGTTGA	TATAATATGC	GGAATTTTTG
370	380	390	400	410	420
GTCCCTCTCA	ATGGGACGCA	TTTCTTGTAC	AAATTGAACA	GTTAATTAAC	CAAAGAATAG
4 30	440	450	460	470	480
AAGAATTCGC	TAGGAACCAA	GCCATTTCTA	GATTAGAAGG	ACTAAGCAAT	CTTTATCAAA
490	500	510	520	530	540
TTTACCCAGA	ATCTTTTAGA	GAGTGGGAAG	CAGATCCTAC	TAATCCAGCA	TTAAGAGAAC
550	560	570	580	590	600
AGATGCGTAT	TCAATTCAAT	CACATGAACA	GTCCCCTTAC	AACCGCTATT	CCTCTTTTTG
610	620	630	640	650	660
CAGTTCAAAA	TTATCAAGTT	CCTCTTTTAT	CAGTATATGT	TCAAGCTGCA	AATTTACATT
670	680	690	700	710	720
TATCAGTTTT	GAGAGATGTT	TCAGTGTTTG	GACAAAGGTG	GGGATTTGAT	GCCGCGACTA
7 30	740	7 50	760	770	780
TCAATAGTCG	TTATAATGAT	TTAACTAGGC	TTATTGCCAA	CTATACAGAT	CATGCTGTAC
790	800	810	820	830	840
GCTGGTACAA	TACCGGATTA	GAGCGTGTAT	GGGGACCGGA	TTCTAGAGAT	TGGATAAGAT

10:57:48

850	860	870	880	890	900
ATAATCAATT	TAGAAGAGAA	TTAACACTAA	CTGTATTAGA	TATCGTTTCT	CTATTTCCGA
910	920	930	940	950	960
ACTATGATAG	TAGAACGTAT	CCAATTCGAA	CAGTTTCCCA	ATTAACAAGA	GAAATTTATA
970	980	990	1000	1010	1020
CAAACCCAGT	ATTAGAAAAT	TTTGATCGTA	GTTTTCGAGG	CTCGGCTCAG	GCCATAGAAG
1030	1040	1050	1060	1070	1080
GAAGTATTAG	GAGTCCACAT	TTGATCGATA	TACTTAACAG	TATAACCATC	TATACGGATG
1090	1100	1110	1120	1130	1140
CTCATAGAGG	AGAATATTAT	TGGTCAGGGC	ATCAAATAAT	GGCTTCTCCT	GTAGGGTTTT
1150	1160	1170	1180	1190	1200
CGGGGCCAGA	ATTCACTTTT	CCCCTATATG	GAACTATGGG	AAATGCAGCT	CCACAACAAC
1210	1220	1230	1240	1250	1260
GTATTGTTGC	TCA4CTACGT	CAGCGCGTCT	ATAGAACATT	ATCGTCCACT	TTATATAGAA
1270	1280	1290	1300	1310	1320
GACCTTTTAA	IATAGGGATA	AATAATCAAC	AACTATCTGT	TCTTCACGCG	ACAGAATTTG
1330	1340	1350	1360	1370	1380
CTTATGGAAC	CTCCTCAAAT	TTGCCATCCG	CTGTATACAG	AAAAACCGGA	ACGGTAGATT
1390	1400	1410	1420	1430	1440
CGCTGGATGA	AATACCGCCA	CAGAATAACA	ACCTGCCACC	TAGGCAAGGA	TTTAGTCATC
1450	14 60	1470	1480	1490	1500
GATTAAGCCA	TGTTTCAATG	TTTCGTTCAG	GCTTTAGTAA	TAGTAGTGTA	AGTATAATAA
1510	1520	1530	1540	1550	1560
GAGCTCCTAT	GTTCTCTTCG	ATACATCCTA	GTGCTGAATT	TAATAATATA	ATTCCTTCAT

10:57:48

1570	1 580	1590	1600	1610	1620
CACAAATTAC	ACAAATACCT	TTAACAAAAT	CTACTAATCT	TGGCTCTGGA	ACTTCTGTCG
1630	1640	1650	1660	1670	1680
TTAAAGCACC	AGGATTTACA	GGAGGAGATA	TTCTTCGAAG	AACTTCACCT	GGCCAGATTT
1690	1700	1710	1720	1730	1740
CAACCTTAAG	ACTAAATATT	ACTGCACCAT	TATCACAAAG	ATATCGGGTA	AGAATTCGCT
1750	1760	1770	1780	1790	1800
ACGCTTCTAC	CACAAATTTA	CAATTCCATA	CATCAATTGA	CGGAAGACCT	ATTAATCAGG
1810	1820	1830	1840	1850	1860
CGAATTTTTC	ACCAACTATG	AGTAGTGGGA	GTAATTTACA	CTCCCGAAGC	TTTAGGACTG
1870	1880	1890	1900	1910	1920
TAGGTTTTAC	TACTCCGTTT	AACTTTTCAA	ATGGATCAAG	TGTATTTACG	TTAAGTGCTC
1930	1940	1950	1960	1970	1980
ATGTCTTCAA	TTCAGCCAAT	GAAGTTTATA	TAGATCGAAT	TGAATTTGTT	CCGGCACAAG
1990	2000	2010	2020	2030	2040
TAACCTTTGA	GGCAGAATAT	GATTTAGAAA	GAGCACAAAA	CCCGGTGAAT	GAGCTGTTTA
2050	2060	2070	2080	2090	2100
CTTCTTCCAA	TCAAATCGGG	TTAAAAACAG	ATGTGACGGA	TTATCATATT	GATCAAGTAT
2110	2120	2130	2140	2150	2160
CCAATTTAGT	TGAGTGTTTA	TCTGATGAAT	TTTGTCTGGA	TGAAAAAAAA	GAATTGTCCG
2170	2180	2190	2200	2210	2220
AGAAAGTCAA	ACATGCGAAG	CGACTTAGTG	ATGAGCGGAA	TTTACTTCAA	GATCCAAACT
2230	2240	2250	2260	2270	2280
TTAGAGGGAT	CAATAGACAA	CTAGACCGTG	GCTGGAGAGG	4 4GTACGGAT	ATTACCATCC

10:57:48

2290	2 300	2310	2320	2 330	2 340
AAGGAGGCGA	TGACGTATTC	AAAGAGAATT	ACCrTACGCT	ATTGGGTACC	TTTCATGAGT
2350	2 360	2370	2380	2390	2400
GCTATCCAAC	GTATTTATAT	CAAAAAATAG	ATGAGTCGAA	ATTAAAAGCC	TATACCCGTT
2410	2420	2430	2440	2450	2460
ACCAATTAAG	AGGGTATATC	GAAGATAGTC	AAGACTTACA	AATCTATTTA	ATTCCCTACA
.2470	2480	2490	2500	2510	2520
ATGCCAAACA	CGAAACAGTA	AATGTGCCAG	GTACGGGTTC	CTTATGGCCG	CTTTCACCCC
2530	2540	2550	2560	2570	2580
CAAGTCCAAT	CGGAAAATGT	GCCCATCATT	CCCATCATTT	CTCCTTGGAC	ATTGATGTTG
2 590	2600	2610	2620	2630	2640
GATGTACAGA	CTTAAATGAG	GACTTAGGTG	TATGGGTGAT	ATTCAAGATT	AAGACGCAAG
2650	2660	2670	2680	2690	2700
ATGGCCATGC	AAGACTAGGA	AATCTAG.AAT	TTCTCGAAGA	GAAACCATTA	GTAGGAGAAG
2710	2720	2730	2740	2750	2760
CACTAGCTCG	TGTCAAAAGA	GCGGAGAAAA	AATGGAGAGA	CAAACGTGAA	AAATTGGAAT
2770	2780	2790	2800	2810	2820
GGGAAACAAA	TATTGTTTAT	AAAGAGGCAA	AAGAATCTGT	AGATGCTTTA	TTTGTAAACT
2830	2840	2850	2860	2870	2880
CTCAATATGA	TAGATTACAA	GCGGATACCA	ACATCCCGAT	GATTCATGCG	GCAGATAAAC
2890	2900	2910	2920	2930	2940
GCGTTCATAG	CATTCGAGAA	GCTTATCTGC	CTGACCTGTC	TGTGATTCCG	GGTGTCAATG
2950	2960	2970	2980	2990	3000
CGGCTATTTT	TGAAGAATTA	GAAGGCCGTA	TTTTCACTGC	ATTCTCCCTA	TATGATGCGA

10:57:48

-463010

GAAATGTCAT

3020

TAAAAATGGT

3030

GATTTTAATA

3070 3080 3090

ATGTAGATGT AGAAGAACAA AACAACCACC

3130 3140 3150

CAGAAGTGTC ACAAGAAGTT CGTGTCTGTC

3190 3200 3210

CGTACAAGGA GGGATATGGA GAACGTTGCG

3250

ACGAACTGAA

60 GTTTAGCAAC

3270

TGTCTAGAAG

3040

ATGGCTTATC

3050

CTGCTGGAAC

3060

GTGAAACGGC

3100	3110	3120
GTTCGGTCCT	TGTTGTTCCG	GAATGGGAAG
3160	3170	3180
CGGGTCGTGG	CTATATCCTT	CGTGTCACAG
3220	3230	3240
TAACCATTCA	TGAGATCGAG	AACAATACAG

3280

AGGAAGTATA

3290

TCCAAACAAC

3300

ACGGTAACGT

3310	3320	3330	3340	3350	3360
GTAATGATTA	TACTGCGACT	CAAGAAGAAT	ATGAGGGTAC	GTACACTTCT	CGTAATCCAG

3370 3380 3390 3400 3410 3420

GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT CTGTACCAGC TGATTATGCA TCAGCCTATG

3430 3440 3450 3460 3470 3480

AAGAAAAAGC ATATACAGAT CCACGAAGAC ACAATCCTTG TGAATCTAAC AGAGGATATG

3490 3500 3510 3520 3530 3540

GGGATTACAC ACCACTACCA GCTGGCTATG TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA

3550 3560 3570 3580 3590 3600

CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAAC ATTCATCGTG GACAGCGTGC

3610 36·Ό 3630 3640 3650 3660

AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC TTTATAATGT AAGGTGTGCA AATAAAGAAT

3670 3680 3690 3700 3710 3720

GATTACTGAC TTCTATTGAC AGATAAATAA GGAAATTTTT ATATGAATAA AAAACGGGCA

10:57:48

37 30	3740	3750	3760	3770	3780
TCACTCTTAA	AAGAATGATG	TCCCTTTTTT	GTATGATTTA	ACGAGTGATA	TTTAAATGTT
3790	3800	3810	3820	3830	3840
TTTTTTGCGA	AGGCTTTACT	TAACGGGGTA	CCGCCACATG	CCCATCAACT	TAAGAATTTG
3850	3860	3870	3880	3890	3900
CACTACCCCC	AAGTGTCAAA	AAACGTTATT	CTTTCTAAAA	AGCTAGCTAG	AAAGGATGAC
3910	3920	3930	3940	39 50	3960
ATTTTTTATG	AATCTTTCAA	TTCAAGATGA	ATTACAACTA	TTTTCTGAAG	AGCTGTATCG
3970	3980	3990	4000	4010	4020
TCATTTAACC	CCTTCTCTTT	TGGAAGAACT	CGCTAAACAA	TTAGGTTTTG	TAAAAAGAAA
4030	4040	4050	4060	4070	4080
ACGAAAGTTT	TCAGGAAATG	AATTAGCTAC	CATATGTATC	TGGGGCACTC	AACGTACAGC
4090	4100	4110	4120	4130	4140
GAGTGATTCT	CTCGTTCGAC	TATGCAGTCA	ATTACACGCC	CCCACAGCAC	TCTTATGAGT
4150	4160	4170	4180	4190	4200
CCAGAAGGAC	TCAATAAACG	CTTTCATAAA	AAAGCGGTTG	AATTTTTGAA	ATATATTTTT
4210	4220	4230	4240	4250	4260
TCTGCATTAT	GGAAAAGTAA	ACTTTGTAAA	ACATCAGCCA	TTTCAAGTGC	AGCACTCACG
4270	4280	4290	4 300	4310	4320
TATTTTCAAC	GAATCCGTAT	TTTAGATGCG	ACGATTTTCC	AAGTACCGAA	ACATTTAGCA
4330	4 340	4350	4360
CATGTATATC	CTGGGTCAGG	TGGTTGTGCA	CAAACTGCAG

A região codificadora definida pelos nucleotídeos 156 a 3623 da fórmula I codifica um poli peptideo da fórmula ΙΓ.

10:57:48

-48Formula II

Met	Asp	Asn	Asn	Pro	Asn	Ile	Asn	Glu	Cys	10
Ile	Pro	Tyr	Asn	Cys	Leu	Ser	Asn	Pro	Glu	20
Val	Glu	Val	Leu	Gly	Gly	Glu	Arg	Ile	Glu	30
Thr	Gly	Tyr	Thr	Pro	Ile	Asp	Ile	Ser	Leu	40
Ser	Leu	Thr	Gin	Phe	Leu	Leu	Ser	Glu	Phe	50
Val	Pro	Gly	Ala	Gly	Phe	Val	Leu	Gly	Leu	60
Val	Asp	Ile	Ile	Trp	Gly	Ile	Phe	Gly	Pro	70
Ser	Gin	Trp	Asp	Ala	Phe	Leu	Val	Gin	Ile	80
Glu	Gin	Leu	Ile	Asn	Gin	Arg	Ile	Glu	Glu	90
Phe	Ala	Arg	Asn	Gin	Ala	Ile	Ser	Arg	Leu	100
Glu	Gly	Leu	Ser	Asn	Leu	Tyr	Gin	Ile	Tyr	110
Ala	Glu	Ser	Phe	Arg	Glu	Trp	Glu	Ala	Asp	120
Pro	Thr	Asn	Pro	Ala	Leu	Arg	Glu	Glu	Me t	130
Arg	Ile	Gin	Phe	Asn	Asp	Met	Asn	Ser	Ala	140
Leu	Thr	Thr	Ala	Ile	Pro	Leu	Phe	Ala	Val	150
Gin	Asn	Tyr	Gin	Val	Pro	Leu	Leu	Ser	Val	160
Tyr	Val	Gin	Ala	Ala	Asn	Leu	His	Leu	Ser	170
Val	Leu	Arg	Asp	Val	Ser	Val	Phe	Gly	Gin	180
Arg	Trp	Gly	Phe	Asp	Ala	Ala	Thr	Ile	Asn	190
Ser	Arg	Tyr	Asn	Asp	Leu	Thr	Arg	Leu	lie	200
Gly	Asn	Tyr	Thr	Asp	His	Ala	Val	Arg	Trp	210
Tyr	Asn	Thr	Gly	Leu	Glu	Arg	Val	Trp	Gly	220
Pro	Asp	Ser	Arg	Asp	Trp	Ile	Arg	Tyr	Asn	2 30
Gin	Phe	Arg	Arg	Glu	Leu	Th r	Leu	Thr	Val	240
Leu	Asp	Ile	Val	Ser	Leu	Phe	Pro	Asn	Tyr	250
Asp	Ser	Arg	Thr	Tyr	Pro	Ile	Arg	Thr	Val	260
Ser	Gin	Leu	Thr	Arg	Glu	Ile	Tyr	Thr	Asn	270
Pro	Val	Leu	Glu	Asn	Phe	Asp	Gly	Ser	Phe	280
Arg	Gly	Ser	Ala	Gin	Cly	Ile	Glu	Gly	Ser	290
Ile	Arg	Ser	Pro	His	Leu	Met	Asp	Ile	Leu	300
Asn	Ser	Ile	Thr	Ile	Tyr	Thr	Asp	Ala	His	310
Arg	Gly	Glu	Tyr	Tyr	Trp	Ser	Gly	His	Gin	320
Ile	Met	Ala	Ser	Pro	Val	Gly	Phe	Ser	Gly	330
Pro	Glu	Phe	Thr	Phe	Pro	Leu	Tyr	Gly	Thr	340
Met	Gly	Asn	Ala	Ala	Pro	Gin	Gin	Arg	Ile	350

10:57:48

Val	Ala	Gin	Leu	Gly	Gin	Gly	Val	Tyr	Arg	360
Thr	Leu	Ser	Ser	Thr	Leu	Tyr	Arg	Arg	Pro	370
Phe	Asn	Ile	Gly	Ile	Asn	Asn	Gin	Gin	Leu	380
Ser	Val	Leu	Asp	Gly	Thr	Glu	Phe	Ala	Tyr	390
Gly	Thr	Ser	Ser	Asn	Leu	Pro	Ser	Ala	Val	400
Tyr	Arg	Lys	Ser	Gly	Thr	Val	Asp	Ser	Leu	410
Asp	Glu	Ile	Pro	Pro	Gin	Asn	Asn	Asn	Val	420
Pro	Pro	Arg	Gin	cly	Phe	Ser	His	Arg	Leu	4 30
Ser	His	Val	Ser	Met	Phe	Arg	Ser	Gly	Phe	440
Ser	Asn	Ser	Ser	Val	Ser	Ile	Ile	Arg	Ala	450
Pro	Met	Phe	Ser	Trp	Ile	His	Arg	Ser	Ala	460
Glu	Phe	Asn	Asn	Ile	Ile	Pro	Ser	Ser	Gin	470
Ile	Thr	Gin	Ile	Pro	Leu	Thr	Lys	Ser	Thr	480
Asn	Leu	Gly	Ser	Gly	Thr	Ser	Val	Val	Lys	490
Gly	Pro	Cly	Phe	Thr	Gly	Gly	Asp	Ile	Leu	500
Arg	Arg	Thr	Ser	Pro	Cly	Gin	Ile	Ser	Thr	510
Leu	Arg	Val	Asn	Ile	Thr	Ala	Pro	Leu	Ser	520
Gin	Arg	Tyr	Arg	Val	Arg	Ile	Arg	Tyr	Ala	530
Ser	Thr	Thr	Asn	Leu	Gin	Phe	His	Thr	Ser	540
Ile	Asp	Gly	Arg	Pco	Ile	Asn	Gin	Gly	Asn	550
Phe	Ser	Ala	Thr	Mec	Ser	Se r	Gly	Ser	Asn	560
Leu	Gin	Ser	Cly	Ser	Phe	Arg	Thr	Val	Gly	570
Phe	Thr	Thr	Pro	Phe	Asn	Phe	Ser	Asn	Gly	580
Ser	Se c	Val	Phe	Thr	Leu	Ser	Ala	His	Val	590
Phe	Asn	Ser	Gly	Asn	Glu	Val	Tyr	Ile	Asp	600
Arg	Ile	Glu	Phe	Val	Pro	Ala	Glu	Val	Thr	610
Phe	Glu	Ala	Glu	Tyr	Asp	Leu	Glu	Arg	Ala	620
Gin	Lys	Ala	Val	Asn	Glu	Leu	Phe	Thr	Ser	630
Ser	Asn	Gin	Ile	Gly	Leu	Lys	Thr	Asp	Val	640
Thr	Asp	Tyr	His	Ile	Asp	Gin	Val	Ser	Asn	650
Leu	Val	Glu	Cys	Leu	Ser	Asp	Glu	Phe	Cys	660
Leu	Asp	Glu	Lys	Lys	Glu	Leu	Ser	Glu	Lys	670
Val	Lys	His	Ala	Lys	Arg	Leu	Ser	Asp	Glu	680
Arg	Asn	Leu	Leu	Gin	Asp	Pro	Asn	Phe	Arg	690
Gly	Ile	Asn	Arg	Gin	Leu	Asp	Arg	Gly	Trp	700
Arg	ciy	Ser	Thr	Asp	Ile	Thr	Ile	Gin	Gly	710
Gly	Asp	Asp	Val	Phe	Lys	Glu	Asn	Tyr	Val	720

10:57:48

Thr	Leu	Leu	Gly	Thr	Phe	Asp	Glu	Cys	Tyr	7 30
Pro	Thr	Tyr	Leu	Tyr	Gin	Lys	I le	Asp	Glu	740
Ser	Lys	Leu	Lys	Ala	Tyr	Thr	Arg	Tyr	Gin	7 50
Leu	Arg	Gly	Tyr	I le	Glu	Asp	Ser	Cln	Asp	760
Leu	Glu	Ile	Tyr	Leu	Ile	Arg	Tyr	Asn	Ala	770
Lys	His	Glu	Thr	Vai	Asn	Vai	Pro	Gly	Thr	780
Gly	Ser	Leu	Trp	Pro	Leu	Ser	Ala	Pro	Ser	790
Pro	Ile	Gly	Lys	Cys	Ala	His	His	Ser	His	800
His	Phe	Ser	Leu	Asp	Ile	Asp	Vai	Gly	Cys	810
Thr	Asp	Leu	Asn	Clu	Asp	Leu	Gly	Vai	Trp	820
Vai	Ile	Phe	Lys	Ile	Lys	Thr	Gin	Asp	Gly	830
His	Ala	Arg	Leu	Gly	Asn	Leu	Glu	Phe	Leu	840
Glu	Glu	Lys	Pro	Leu	Vai	Gly	Glu	Ala	Leu	8 50
Ala	Arg	Vai	Lys	Arg	Ala	Glu	Lys	Lys	Trp	860
Arg	Asp	Lys	Arg	Glu	Lys	Leu	Glu	Trp	Glu	870
Thr	Asn	Ile	Vai	Tyr	Lys	Glu	Ala	Lys	Glu	880
Ser	Vai	Asp	Ala	Leu	Phe	Vâl	Asn	Ser	Gin	890
Tyr	Asp	Arg	Leu	Gin	Ala	Asp	Thr	Asn	Ile	900
Ala	Met	Ile	His	Ala	Ala	Asp	Lys	Arg	Vai	910
His	Ser	Ile	Arg	Clu	Ala	Tyr	Leu	Pro	Glu	920
Leu	Ser	Vai	Ile	Pro	Gly	Vai	Asn	Ala	Ala	930
Ile	Phe	Glu	Glu	Leu	Glu	Gly	Arg	Ile	Phe	940
Thr	Ala	Phe	Ser	Leu	Tyr	Asp	Ala	Arg	Asn	950
Vai	Ile	Lys	Asn	Gly	Asp	Phe	Asn	Asn	Gly	960
Leu	Ser	Cys	Trp	Asn	Vai	Lys	Gly	His	Vai	970
Asp	Vai	Glu	Glu	Gin	Asn	Asn	His	Arg	Ser	980
Vai	Leu	Vai	Vai	Pro	Glu	Trp	Glu	Ala	Glu	990
Vai	Ser	Gin	Glu	Vai	Arg	Vai	Cys	Pro	Gly	1000
Arg	Gly	Tyr	Ile	Leu	Arg	Vai	Thr	Ala	Tyr	1010
Lys	Glu	Gly	Tyr	Gly	Glu	Gly	Cys	Vai	Thr	1020
Ile	His	Glu	Ile	Glu	Asn	Asn	Thr	Asp	Glu	1030
Leu	Lys	Phe	Ser	Asn	Cys	Vai	Glu	Glu	Glu	1040
Vai	Tyr	Pro	Asn	Asn	Thr	Vai	Thr	cys	Asn	1050
Asp	Tyr	Thr	Ala	Thr	Gin	Glu	Glu	Tyr	Glu	1060
Gly	Thr	Tyr	Thr	Ser	Arg	Asn	Arg	Gly	Tyr	1070
Asp	Gly	Ala	Tyr	Glu	Ser	Asn	Ser	Ser	Vai	1080
Pro	Ala	Asp	Tyr	Ala	Ser	Ala	Tyr	Glu	Glu	1090

10:57:48

Lys	Ala	Tyr	Thr	Asp	Gly	Arg	Arg	Asp	Asn	1100
Pro	Cys	Glu	Ser	Asn	Arg	dy	Tyr	Gly	Asp	1110
Tyr	Thr	Pro	Leu	Pro	Ala	Gly	Tyr	Vai	Thr	1120
Lys	Glu	Leu	Glu	Tyr	Phe	Pro	Glu	Thr	Asp	1130
Lys	Vai	Trp	Ile	Glu	Ile	Gly	Glu	Thr	Glu	1140
Gly	Thr	Phe	Ile	Vai	Asp	Ser	Vai	Glu	Leu	1150
Leu	Leu	Met	Glu	Glu						1156

Para introduzir um gene quimérico em células de B. thuringiensis ou B. cereus por transformação usando o processo do invento, o gene é de preferência em primeiro lugar inserido num vector. A inserção é especial mente preferida num vector bifuncional do invento.

Se o que correspondente não esti ver disponível numa quantidade suficiente para a inserção em células de Bacillus, o vector pode em primeiro lugar ser amplificado por replicação numa célula hospedeira heteróloga. As células bacterianas ou as células de levedura são as mais adequadas para a amplificação de genes. Quando existe disponível uma quantidade suficiente do gene ele é inserido nas células de Bacillus. A inserção do gene em células de B. thu ringiensis ou de B^ cereus pode ser efectuado com o mesmo vector usado na replicação ou com um vector diferente. São especialmente adequados os vectores bifuncionais do invento.

Alguns exemplos de células hospe deiras bacterianas adequadas à replicação do gene quimérico incluem bactérias seleccionadas dos géneros Escherichia como

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-J

J seja E. coli, Agrobacterium, como seja A. tumefaciens ou A. rhizogenesPseudomonas, como seja Pseudomonas spp., Bacillus, como seja B. megaterium ou 13. subtilis, etc. Como resultado do processo de transformação do invento é agora possível pela primeira vez, dentro do âmbito deste invento, usar também os próprios B. thuringiensis e B. cereus como células hospedeiras. Nas Patentes US 4 237 224 e 4 468 464 estão descritos processo para clonagem de genes heterólogos em bactérias.

à replicação em E. coli de genes que codigicam a proteína cristalina de B. thuringiensis está 29) descrito por Wong et al., (1983).

Alguns exemplos de células hospedeiras de leveduras gue são adequadas à replicação dos genes do invento incluem os seleccionados do género Saccharomyces (Pedido de Patente Europeia EP 0 238 441).

Na amplificação dos genes do invento pode ser usado qualquer vector em que o gene quimérico possa ser inserido e que seja replicado numa célula hospedeira adequada, como seja bactéria ou levedura. O vector pode derivar por exemplo de um fago ou de um plasmídeo. São exemplos de vectores derivados de fagos, e que podem ser usados dentro do âmbito deste invento os vectores derivados dos fagos M13 e \ . Alguns vectores adequados derivados dos fagos M13 incluem M13mpl8 e M13mpl9. Alguns vectores adequados derivados dos fagos χ incluem Xgtll, Àgt7 e À.Cloron4.

Dos vectores que são derivados de plasmídeo e que são especialmente adequados à replicação em , 30 bactérias, podem ser mencionados como exemplo pBR322 ( Bolívar et al. , 1977), pUC18 e pUC19 (^Norrander et al. , 1983) , 32) e plasmídeos ( Bevan et al., 1983), sem que o tema do invento seja de algummodo afectado. São vectores preferidos para a amplificação dos genes em bactérias pBR322, pUC18 e pUC19.

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-53Sem implicar quaisquer limitações especialmente vectores de clonagem directa, tais como por exemplo pBD347, pBD348, pBD64 e pl)B1664 e especialmente os vectores vai-vem, os quais já foram aqui descritos detalhadamente podem ser referidos para clonagem directamente em B. thuringiensis e/ou B. cereus.

São especialmente preferidos dentro do âmbito deste invento os vectores bifuncionais (vai-vem) pXI61 (=pK61) e pXl93 (=pK93) os quais introduzidos por transformação em B. thuringiensis var. Kurstaki HDlcryB e B. cereus 569K, foram depositados na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Braunschweig, Federal Repiblic of Germany), reconhecido como depositário internacional, de acordo com os requesitos do tratado de Budapeste com o número DSM 4573 (pXI61, introduzido por transformação em B. thuringiensis var Kurstaki (HDlcryB) e DSM4571 (pXl93, introduzido por transfor mação em B. thuringiensis var. Kurstaki HDlcryB) e DSM 4573 (pXI93, introduzido por transformação em B. cereus 569K).

Para construir um gene quimérico adequado à replicação em bactéria, uma sequência de promotor, uma sequência 5' não traduzida, uma sequência codificadora e uma sequência 3' não traduzida são inseridos num vector ou são montadas na sequência correcta num dos vectores atrás descritos. Vectores adequados de acordo com o invento são aqueles que são capazes de se replicarem na célula hospedeira .

promotor, a região 5' não traduzida, a região codificadora e a região 3‘ não traduzida, caso se pretenda, são primeiro combinadas numa unidade fora do vector e depois inseridos no vector. Como alternativa, partes do generquimérico podem também ser inseridas no vector individualmente .

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-54No caso de B. thuringiensis e de B. cereus os vectores de clonagem deste passo do processo po dem ser omitidos uma vez que toda a unidade isolada a partir de 13. thuringiensis, consiste na região 5' não traduzida, na região codificadora e na região 3' não traduzida, pode ser inserida no vector.

De preferência o vector contem ainda um gene marcador que confere à célula hospedeira uma propriedade pela qual é possível reconhecer as células transformadas com o vector. São preferidos os genes marcadores que codificam resistência a antibióticos. São exemplos de alguns antibióticos adequados penicilina, cloranfenicol, eritro micina, tetraciclina, higromicina, G418 e canamicina.

São também preferidos genes marcadores que codifiquem enzimas tendo um substrato cromogénico, como seja, por exemplo, X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-/3-D-galactoxido). As colónias transformadas podem então ser detectadas muito fácilmente por meio de uma reacção corada especif ica.

A inserção ou montagem do gene no vector é efectuada por meio de processos convencionais, por 33 ) exemplo usando DNA recombinante ( Maniatis et al., 1982) e , 34 usando recombinação homologa ( Hinnen et al., 1978).

Os processos da tecnologia de DNA recombinante baseiam-se primeiro na clivagem do vector sendo a sequência de DNA pretendido inserido entre as porções clivadas de vector; os extremos da sequência de DNA pretendida são então ligados aos extremos correspondente do vector.

O vector é de preferência clivado com endonucleares de restrição adequadas. As endonucleases de restrição adequados são por exemplo aqueles que formam extremos cerces, tais como Smal, Hpal e EcoRV, assim como aque10:57:48

les que formam extremos coesivos, tais como Eco RI, Sac I e Bam HI.

A sequência de DNA pretendida normalmente existe como uma região de uma molécula de DNA maior, como seja um cromossoma, um transposon ou um fago. A sequência de DNA pretendida é nestes casos removida da sua fonte original e, como se pretenda, de tal forma modificada que os seus extremos podem ser ligados aos vectores clivados. Se os extremos da sequência de DNA pretendida e do vector clivado forem extremos cerca, eles podem então por exemplo ser ligados uns aos outros com ligases específicos para os extremos cerses, como seja DNA-ligase de T4.

Os extremos da sequência de DNA pretendida podem também ser ligados na forma de extremos coesivos aos extremos do vector clivado neste caso usa-se uma ligase específica para extremos coesivos, a qual pode também ser DNA-ligase de T4. Uma outra ligase adequada específica para extremos coesivos é, por exemplo, o DNA-ligase de E. coli.

Os extremos coesivos são com vantegem formados por clivagem da sequência de DNA pretendida e o vector com a mesma endonuclease de restrição, neste caso a sequência de DNA com interesse e o vector clivado têm extremos coesivos que são complementares uns dos outros.

Os extremos coesivos podem também ser formados através da adição de caudas homopoliméricas complementares aos extremos da sequência de DNA pretendida e do vector clivado com a ajuda de desoxinucleotidil-transferase terminal.

Como alternativa os extremos coesivos podem ser produzidos pela adição de uma sequência oligonucleotídica sintética que é reconhecida por uma endonuclea^

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-56se de restrição particular e é conhecida como adaptador e cli vagem de sequência com a endonuclease (ver, por exemplo, ^3) Maniatis et al., 1982).

É agora possível pela primeira vez, dentro do âmbito deste invento, modificar geneticamente genes de B. thuringiensis e especialmente sequências de DNA codificadoras de S-endotoxina, fora de B. thuringiensis, clonar aqueles genes e depois introduzi-los novamente em células de B. thuringiensis e/ou B. cereus, onde os referidos genes de £-endotoxina podem ser expressos (num sistema hospedeiro bacteriano homólogo).

Isto significa que é agora também possível para o genoma de B. thuringiensis ser manipulado geneticamente de modo especificamente controlado gerando em primeiro lugar grandes quantidades de plasmídeo num sistema de clonagem estranho e depois introduzido este em 13. thuringiensis por transformação.

A possibilidade de modificar os genes de ^-endotoxina e as sequências de controle que regulam a expressão daqueles genes é aqui de particular interesse

Além dos genes quiméricos, é também obviamente possível para qualquer outra construção genética quimérica ser inserida em células de Bacillus thuringien sis e/ou Bacillus cereus usando o processo do invento.

Pode-se assim cancelar por exemplo, usando o processo do invento, inserir DNA anti-codão não codificador no genoma de uma célula de Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus, de tal modo que no decurso da expressão do referido DNA de anti-codão transcreve-se um mRNA que inibe a expressão do correspondente DNA de codões. Deste modo é possível inibir de um modo especificamente controlado a expressão em Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus

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cereus de certos genes sem interesse.

Ainda além da preparação de estirpes melhoradas bem definidas de 13. thuringiensis para a preparação de bioinsecticidas melhorados, é também agora possível usar B. thuringiensis como hospedeiro geral para a clonagem e caso se pretenda, expressão de genes heterólogos e/ou homólogos.

Numa realização específica e preferida do processo do invento é ainda possível pela primeira vez cionar genes e especialmente novos genes de protoxinas, directamente no hospedeiro natural, ou seja em B. thuringiensis ou B. cereus.

Na pesquisa de novos genes de protoxina tem de se criar primeiro uma biblioteca de genes de-B. thuringiensis.

Num primeiro passo do processo, o DNA total de uma estirpe de B. thuringiensis produtores de protoxina é isolado por processos que são conhecidos per se e depois fragmentado em fragmentos individuais. O DNA de B. thuringiensis pode ser fragmentado mecanicamente, por exemplo pela acção de forças de cisalhamento, ou, de preferência, por digestão com enzimas de restrição adequadas. A digestão da amostra de DNA é parcial ou completa, dependendo da escolha das enzimas. Dentro do âmbito deste invento, a utilização de enzimas de restrição que contem sítios de reconhecimento ternários e/ou resultam de uma digestão parcial do DNA de B. thuringiensis são especialmente preferidos como sejam por exemplo, a enzima de restrição Sau IIA, mas esta preferência não implica qualquer limitação. Óbviamente, é também possível usar qualquer outra enzima de restrição adequada no processo do invento.

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Os fragmentos de restrição obtidos como descrito atrás são então separados de acordo com o seu tamanho por processo conhecidos per se. A separação dependente do tamanho de fragmentos de DNA é geralmente efectuada por processo de centrifugação, tais como por exemplo, centrifugação em gradiente de sacarose ou por processos elec troporéticos, tais como electroforese em gel de agarose ou por uma combinação daqueles processos.

As fracções contendo fragmentos do tamanho correcto, ou seja fragmentos que tendo em conta o seu tamanho são capazes de codificar uma protoxina, foram reunidas e usadas nos passos seguintes do processo.

Os fragmentos anteriomente isolados foram em primeiro lugar inseridos em vectores de clonagem adequados usando processos convencionais e depois inseridos directamente em Bacillus thuringiensis ou B. cereus, mas de preferência em estirpes de Bacillus thuringiensis sem protoxina, usando o processo de transformação do invento.

Os vectores usados podem ser pias mídeos gram-positivos, tais como por exemplo pBCl6, pUBUO, pC194 ou os vectores vai-vem descritos atrás detalhadamente. 0 vector vai-vem pXI 200, o qual é aqui descrito detalhadamente a seguir (ver Exemplo 9.1) é especialmente preferido dentro do âmbito deste invento. Os vectores adequados de preferência contêm sequências de DNA que asseguram uma identificação fácil dos clones transformados contendo vectores de entre o número imenso de clones não transformados. São especialmente preferidos sequências de DNA codificadoras de uma marca específica, que, quando expressa resulta numa característica fácilmente seleccionável, como seja por exemplo uma resistência a antibióticos. Pode aqui ser referido como exemplo uma resistência à ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, higromicina, G418 ou canamicina.

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-59São também preferidos genes marcadores que codifiquem enzimas tendo um substracto cromogéni co, como seja por exemplo, X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-J3-D-galactosido) . As colónias transformadas podem então ser detectadas muito fácilmente através de uma reacção corada específica.

Após electroporação as células tratadas de Bacillus thuringiensis ou de B. cereus são transferidas para um meio de esporulação selectivo e são incubadas até a esporulação estar completa a uma temperatura de 10SC a 40SC, de preferência entre 209C e 35SC e mais especificamente a uma temperatura de 292C a 312C. O meio de esporulação contem como substâncias selectivas de preferência um dos antibióticos atrás referidos, dependendo do vector usado de um agente solidificante adequado, como seja por exemplo, agar, agarose, gelatina, etc.

No decurso de esporulação, dá-se autolise das células em esporulação a qual é vantajosa no processo à escala industrial para o subsequente despiste uma vez que assim se dispensa o habitual rebentamento artificial.

Em clones que contêm o gene da protoxina pretendida e que expressam sob o controle do seu promotor natural, as proteínas cristalinas formadas encontram -se livremente acessíveis no meio. Estas proteínas cristalinas que existem livremente no meio podem então ser imobilizados, por exemplo com a ajuda de mambranas filtrantes ou por outros meios adequados. São membranas filtrantes adequadas as membranas de nylon ou nitrocelulose. As membranas deste tipo estão disponíveis no mercado.

As proteínas cristalinas imobilizadas deste modo podem então ser localizados e identificados muito simplesmente num processo de despiste adequado.

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Dentro do âmbito deste invento é preferido o despiste imunológico usando anticorpos específicos de protoxina. Processo de despiste imunológico são conhecidos e estão descritos detalhadamente por exemplo, em 35)Yong et al., 1982. A utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem muito especificamente uma regra ou região particular da molécula de proteína é especialmente preferida dentro do âmbito do processo do invento. Estes anticorpos podem ser usados individualmente ou como uma mistura. Ê certamente também possível usar anti-soro policlonal para o despiste imunológico. São igualmente possíveis as misturas baseadas em anticorpos monoclonais e policlonais.

Processos para a produção de anticorpos monoclonais contra proteínas de protoxima de Bacillus thuringiensis são conhecidos e estão descritos detalhadamente 36) 37) por exemplo em ^JHubor-Lukac (1984) e em ^;Hubert-Lukac et al. , (1986). Estes processos podem também ser usados no presente caso.

'-tf processo de despiste imunológico baseado em anticorpos é parte do presente invento.

Obviamente é também possível dentro do âmbito deste invento usar outros processos de despiste adequados para localizar novas sequências de DNA em B. thuringiensis e/ou B. cereus.

Células de Bacillus thuringiensis e de Bacillus cereus foram transformadas usando o processo atrás descrito e as toxinas produzidas por estas células de Bacillus transformadas, mostram-se excelentemente adequadas para o controle de insectos especialmente para o controle de insectos das ordens Lepidoptera, Diptera e Coleoptera.

Assim, o presente invento também está relacionada com um método para controlar insectos que se

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caracteriza pelo tratamento de insectos ou do seu locus a) com células de B. thuringiensis ou B. cereus ou com uma mistura das duas, que foram transformadas com um molécula de DNA recombinante contendo um gene estrutural que codifica um polipeptídeo de ^-endotoxina que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou um polipeptídeo essencialmente homólogo dele; ou como alternativa b) com uma preparação acelular de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células transformadas de Bacillus.

O presente invento também inclui composições insecticidas que além dos veículos, dispersantes ou veículos e dispersantes, contem

a) Células de B. thuringiensis ou B. cereus ou uma mistura das duas, que foram transformadas com uma molécula de DNA recombinante contendo um gene estrutural que codifica uma polipeptídeo da j-endotoxina que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou um polipeptídeo essencialmente homólogo dele; ou como alternativa

b) Uma preparação acelular de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células transformadas de Bacillus.

Para usar como insecticidas, os microorganismos transformados contendo o gene recombinante da toxina de B. thuringiensis, de preferência células mortas ou vivas de 13. thuringiensis ou B. cereus, incluindo misturas de células mortas e de células vivas de B. thuringiensis e de B. cereus, assim como proteínas de toxina produzida pelas referidas células transformadas, são usadas na forma não modificada, ou de preferência, juntamente com adjuvantes normalmente empregues em formulações deste tipo e são formulados de modo conhecido per se, por exemplo em concentrações de suspenssões, pastas de revestimento, soluções para pulverizar ou diluir, pós molháveis, pós solúveis, poeiras, granulados

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e também encapsulações por exemplo em polímeros.

Tal como a natureza das composições, os métodos de aplicação, como sejam vaporização, atomi zação, empoamento, dispersão, revestimento ou derrame, são escolhidos de acordo com os objectivos pretendidos e as circunstâncias reais.

Ainda, também é óbviamente possível usar misturas insecticidas consistindo em células de 13. thuringiensis e/ou B. cereus transformadas, mortas ou vivas e preparações acelulares de corpos cristalinos contendo uma protoxina produzida pelas referidas células transformadas de Bacillus.

As formulações, ou seja as composições ou preparações contendo as células transformadas de Bacillus, mortas ou vivas, ou suas misturas e também proteínas de toxina produzidas pelas referidas células transformadas de Bacillus e, sempre que apropriadas, adjuvantes sólidos ou líquidos, são preparadas de modo, por exemplo através da mistura de células transformadas e/ou proteínas de toxina com veículos sólidos e, sempre que adequado, compostos tensioacti vos.

Os veículos usados e.g. para poei ras e pós dispersáveis, são normalmente agentes de enchimento minerais naturais tais como calcite, talco, caulino, montemorilonite ou atapulgite. Para melhorar as propriedades físicas é também possível adicionar ácido silicico altamente disperso ou polímeros absorventes altamente dispersos. Veículos adsortivos granulados adequados são do tipo poroso, por exemplo pumice, tergila moída, sepiolite ou bentonite; e veículos não adsorventes adequados são, por exemplo, calcite ou areia. Em adição, pode-se usar um grande número de materiais pré-granulados de natureza inorgânica ou orgânica, e.g. especialmente dolomite ou resíduos vegetais pulverizados.

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São compostos tensioactivos adequados, tensioactivos não iónicos, catiónicos e/ou anionicos tendo boas propriedades dispersantes e molhantes. O termo tensioactivo também será compreendido como incluindo misturas de tensioactivos.

Tanto os chamados sabões solúveis em água como os compostos tensioactivos sintéticos solúveis em água são tensioactivos anionicos adequados.

São sabões adequados os sais de metais alcalinos, sais de metais alcalinos terrosos, ou sais de amónio não substituídos de ácidos gordos superiores (Ο^θC₁₂), e.g. s ais de sódio ou potássio de ácido oleico ou esteárico ou misturas de ácidos gordos naturais os quais podem ser obtidos e.g. a partir de óleo de coco ou de sebo. Também se deve referir os sais de ácidos gordos de metiltaurino, tais como, por exemplo, sal sódico do ácido cis-2-(metil-9-octadecenilamina)-etanossulfónico (quantidade nas formulações de preferência aproximadamente 3%).

No entanto, mais frequentemente são usados os chamados tensioactivos sintéticos, especialmente sulfonatos gordos, sulfatos gordos, derivados benzimidazole sulfonados ou alquilarilsulfonatos ou alcoóis gordos, tais como, por exemplo, 2,4,7,9-tetrametil-5-decine-4,7-diol (quantidade nas formulações de preferência aproximadamente 2%).

Os sulfonatos ou sulfatos gordos são geralmente na forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcalinos terrosos ou sais de amónio não substituídos ou substituídos e contem um radical alquilo ^cg-^c22 ^{que cont}é^m também a fracção alquilo dos radicais acilo, e.g. sal de sódio ou cálcio do ácido linhossulfónico, de dodecilsulfato de de uma mistura de sulfatos de alcoóis gordos obtidos a partir de ácidos gordos naturais. Estes compostos também compreendem os sais de aditivos álcool gordo sulfatado ou sulfonado/

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-64•J /óxido de etileno. Os derivados sulfonados de benzimidazole de preferência contêm 2 grupos de ácido sulfónico e um radical de ácido gordo contendo 8 a 22 átomos de carbono. São exemplos de alquilarilsulfonatos os sais de sódio, cálcio ou trietanolamina do ácido dodecilbenzenossulfónico, ácido butilnaftalenossulfónico ou de um condensado do ácido naftalenossulfónico e formaldeído.

São também adequado os correspondentes fosfatos, e.g. sais de éster do ácido fosfórico de um aditivo de p-nonilfenol com 4 a 14 moles de óxido de etileno.

Tensioactivos não iónicos são de preferência derivados éter de poliglicóis de alcoóis alifáticos ou cicloalifáticos, ácidos gordos saturadas ou insaturadas e alquilfenóis, os referidos derivados contendo 3 a 30 grupos éter de glicol e 8 a 20 átomos de carbono na fracção hidrocarboneto (alifático) e 6 a 18 átomos de carbono na frac ção alquilo dos alquilfenóis.

Outros tensioactivos não-iónicos adequados são os aditivos solúveis em água de óxido de polietileno com polipropilenoglicol, etilenodiaminapolipropilenoglicol e alquilpopolipropilenoglicol contendo 1 a 10 átomos de carbono na cadeia alquilo, aditivos estes que contêm 20~a 250 grupos éter de etilenoglicol e 10 a 100 grupos éter de propilenoglicol. Estes compostos geralmente contêm 1 a 5 unidades de etilenoglicol por unidade de propilenoglicol.

São exemplos de tensioactivos não iónicos nonilfenolpolietoxietanóis, éteres de poliglicóis de óleo de castor, aditivos de polipropileno/óxido de polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol e octilfenoxipolietoxietanol. Esteres de ácidos gordos de polioxietilenossorbitano, e.g. trioleato de polioxietilenossorbitano, são também tensioactivos não iónicos adequados.

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-65Tensioactivos cationicos são de preferência sais de amónio quaternários que contêm, com substituintes em N, pelo menos um radical alquilo ^Cg^-C22 ^{e outros} substituintes, alquilo inferior não substituído ou halogenado, radicais benzilo ou hidroxi-alquilo inferior. Os sais são de preferência na forma de haletos, metilsulfatos ou etilsulfatos, e.g. cloreto de esteariltrimetilamónio ou brometo de benzildi(2-cloroetil)etilamónio.

Os tensioactivos normalmente empregues em formulações estão descritos inter alia, nas seguintes publicações:

38)

1986 International McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, N.J. USA; Helmut Stache Tensid-Taschenbuch Cari Hanser-Verlag Munich/Vienna 1981.

As composições agroquímicas geralmente contêm 0,1 a 99%, de preferência 0,1 a 95%, das células transformadas de Bacillus vivos ou mortos ou misturas das duas ou de proteínas de toxinas produzidas pelas referidas células transformadas de Bacillus, 99,9 a 1%, de preferência 99,8 a 5%, de um adjuvante sólido ou líquido e 0 a 25%, de preferência 0,1 a 25% de um tensioactivo.

Se bem que os produtos comerciais sejam de preferência formulados como concentrados, o utilizador final empregará normalmente formulações diluídas.

As composições podem também conter outros auxiliares tais como anti-espumantes, reguladores de viscosidade, agentes de ligação ou de agregação pegajosos assim como fertilizantes ou outros ingredientes activos para obtenção de efeitos especiais.

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-66As células transformadas de Bacil_ lus, mortas ou vivas ou suas misturas, contendo os genes re combinantes da toxina de B. thuringiensis assim como as pro teínas de toxina produzidas pelas referidas células transformados de Bacillus, são excelentemente adequados para contro lar pragas de insectos. Os insectos destruidores de plantas da ordem Lepidoptera deverão ser aqui preferencialmente men cionados, especialmente os dos géneros Pieris, Heliothis, Spo doptera e Plutella, tais como, por exemplo, Pieris brassicae, Heliothis virescens, Heiiothis zea, Spodoptera littoralis e Plutella xylostella.

Outras pragas de insectos que podem ser controladas pelas preparações insecticidas atrás descritas são por exemplo escaravelhos da ordem Coleoptera, es pecialmente os da família Chrysomelidae, tais como, por exemplo, Diabrotica undecimpunctata, D. longicornis , D.. virgif era, D. undecimpunctata howardi, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata, etc, assim como insectos da ordem Diptera tais como, por exemplo, Anopheles sergentii, Uranatenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes segypti, Culex pipiens, etc.

As quantidades em que as células de Bacillus ou as proteínas de toxina produzidas por elas são usadas depende das condições respectivas, tais como,por exemplo, das condições climáticas, das condições do solo, do crescimento da planta e da altura da aplicação.

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-6 7Exemplos de formulações para materiais contendo toxina de B.

thuringiensis

Nos exemplos de formulações que se seguem o termo células de Bacillus é usado para significar as células de B. thuringiensis e/ou B. cereus contendo um gene recombinante de B. thuringiensis do invento (As figuras dadas são percentagens por peso).

F1. Granulados

Células de Bacillus e/ou pro teina de toxina produzida por estas células

Caulino ácido silicico altamente disperso

a) b)

5% 10%

94%

1% atapulgite - 90%

As células de Bacillus e/ou a proteina de toxina produzida por estas células são em primeiro lugar suspensas em cloreto de metileno, depois a suspensão é pulverizada sobre o veículo e o agente de ressuspensão é subsequentemente removido por evaporação sob vácuo.

F2 . Poeiras	a)	b)
Células de Bacillus e/ou proteina de toxina produzida por estas células	2%	5%
ácido silicico altamente
disperso	1%	5%
talco	97%

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caulino - 90%

As poeiras prontas a usar são obt_i das através da mistura de veículos com as células de Bacillus e/ou com proteína de toxina produzida por estas células.

F3'. Pós molháveis	a)	b)	c)
Células de Bacillus e/ou proteínas de toxina produzida por estas células	25%	50%	75%
linhosulfonato de sódio	5%	5%	-
laurilsulfato de sódio	3%	-	5%
diisopropilaf talenossul- fonato de sódio		6%	10%
éter de oactilfenolpolietilenoglicol (7-8 moles de áxido de etileno)		2%
ácido silicico altamente disperso	5%	10%	10%
caulino	62%	27%

As células de Bacillus e/ou proteína de toxina produzida por estas células são cuidadosameri te misturadas com os adjuvantes e a mistura resultante é então triturado num moinho adequado, dando pós molháveis, os quais podem ser diluídos com água para dar suspensões da concentração pretendida.

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-69F4. Granulados extrudidos

Células de Bacillus e/ou proteina de toxina pro duzida por estas células 10% linhossulfonato de sódio 2% carboximetilcelulose 1% caulino 87%

As células de Bacillus e/ou proteina de toxina produzida por estas células são misturadas com os adjuvantes, cuidadosamente trituradas e a mistura é subsequentemente humedecida com água. A mistura é extrudida e depois seca numa corrente de ar.

F5. Granulado revestido

Células de Bacillus e/ou proteina de toxina pro duzida por estas células 3% polietilenoglicol 200 3% canlino 94%

As células de Bacillus e/ou proteína de toxina produzida por estas células homogéneamente misturadas foram uniformemente aplicadas num misturador, ao caulino humedecido com polietilenoglicol. Os granulados re vestidos não poeirentos foram assim obtidos.

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F6. Concentrado de suspensão

Células de Bacillus e/ou proteína de toxina produzida por estas células etilenoglicol nonilfenolpolietilenoglicol (15 moles de áxido de etileno ) sal trietanolamina do ácido alquilbenzenossulfónico* carboximetilcelulose óleo de silicone na forma de uma emulsão aquosa a 75% água

40%

10%

6%

3%

1%

0,1%

39%

W * Λ

Alquilo e de preferencia alquilo linear tendo entre 10 e 14, especialmente entre 12 e 14, átomos de carbono, tais como, por exemplo, sal trietanolamina do ácido n-dodecilbenzenossul fónico.

As células de Bacillus e/ou proteína de toxina produzida por estas células homogeneamente misturadas foram intimamente misturadas com os adjuvantes, dando concentrado de suspensão a partir do qual se podem obter suspensões de qualquer concentração pretendida por diluição com água.

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EXEMPLOS

Técnicas gerais de DNA recombinante

Uma vez que muitas das técnicas de DNA recombinante usadas neste invento são técnicas de rotina para especialistas, é dada uma breve descrição das técnicas geralmente usadas de modo a que estes detalhes gerais não necessitem de ser dados nos próprios Exemplos de Execução

A menos que seja expressamente indicado, todos estes métodos 33) estão descritos no trabalho de referência por Maniatis et al., 1982.

A. Clivagem com endonucleases de restrição

A mistura de reacção conterá tipicamente cerca de 50 pg/ml a 500 pg/ml de DNA na solução tampão recomendada pelo fabricante, New England Biolabs, Beverly, MA.. Adiciona-se entre 2 e 5 unidades da endonuclease de restrição por cada jig de DNA e a mistura de reacção é incubada à temperatura recomendada pelo fabricante durante uma a três horas. A reacção é parada por aquecimento a 652C durante 10 minutos ou por extracção com fenol seguido de precipitação do DNA com etanol. Esta técnica está também descrita , „ 33) nas paginas 104 a 106 do trabalho de referencia Maniatis et al.

B. Tratamento do DNA com polimerase para produzir extremos cerses

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pg/ml a 500 jig/ml de fragmentos de DNA são adicionados a uma mistura de reacção no tampão recomendado pelo fabricante, New England Biolabs. A mistura de reacção contém os quatro trifosfatos de desoxinucleotídeo nas concentrações de 0,2 mM. Adiciona-se uma DNA-polimerase adequada e a reacção decorre durante 30 minutos a 15SC e é então parada por aquecimento durante 10 minutos a 65SC. Para os fragmentos obtidos por clivagem com os endonucleases de restrição que produzem extremos coesivos 5', como sejam Eco RI e Bam HI, usa-se o fragmento grande, ou fragmento Klenow da DNA-polimerase. Para fragmentos obtidos usando endonucleases que produzem extremos coesivos 3', como seja Pst I e Sac I, usa-se DNA-polimerase de T4. A utilização destas duas enzimas está descrita nas pá~ 3 3) ginas 113 a 121 do trabalho de referencia Maniatis et al.

C. Electroforese em gel de agarose e limpeza dos fragmentos de DNA para remover contaminantes do gel.

A electroforese em gel de agarose é efectuada num aparelho horizontal como descrito nas páginas 150 a 163 do trabalho de referência Maniatis et al.

O tampão usado corresponde ao tampão Tris-bõrato ou Tris-acetato ali descrito. Os fragmentos de DNA são corados com 0,5 pg/ml de brometo de etídio o qual está presente no gel ou no tampão do tanque durante a electroforese ou só é adicionado após a electroforese, conforme se pretender. O DNA é tornado visível por iluminação com luz ultra-violeta de grande comprimento de onda. Se se tiver de separar os fragmentos do gel usa-se uma agarose que gelifique a temperatura baixa, adquirida à Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Após electroforese o fragmento pretendido foi removido, colocado num pequeno tubo de plástico aquecido a 652C durante cerca de 15 minutos extraído três vezes com fenol e precipitado duas vezes com etanol. Este método foi ligeiramente alterado comparado com

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-73, 33) o método descrito por Maniatis et al na pagina 170.

Como alternativa, o DNA isolado do gel de agarose com a ajuda do Geneclean 101 Inc, La Jolla, CA, USA).

pode ser Kit (Bio

D. Remoção dos fosfatos terminais 5' dos fragmentos de DNA.

Durante os passos de clonagem em plasmídeo, o tratamento do vector plasmídeo com fosfatase reduz a recirculerização do vector (discutido na página 13 do trabalho de referência Maniatis et al. ) . Após clivagem do DNA com a endonuclease de restrição adequada, adiciona-se uma unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela, a qual se pode adquirir à Boehringer-Mannheim, Mannhein. O DNA é incubado durante uma hora a 37°C e depois extraído duas vezes com fenol e precipitado com etanol.

E. Ligação dos fragmentos de DNA

Se se tiver de ligar uns aos outros fragmentos de DNA com extremos coesivos, cerca de 100 ng de cada um dos fragmentos são incubados numa mistura de reacção de 20 jil a 40 pl com cerca de 0,2 unidade de DNA-ligase de T4 de New England Biolabs no tampão recomendado pelo fabricante. A incubação decorre durante 1 a 20 horas a 15SC. Se os fragmentos de DNA a ligar tiveram extremos cerses, eles são incubados como descrito atrás mas a quantidade de DNA-ligase de T4 é aumentada para 2 a 4 unidades.

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-74F. Transformação de .E. coli com DNA

Na maior parte das experiências usou-se E. coli estirpe HB101. O DNA foi introduzido em E.

coli usando o processo do cloreto de cálcio descrito por 33)

Maniatis et al., paginas 250 a 251.

G. Despiste de plasmídeos em E. coli

Após transformação, as colónias de 1Ξ. coli resultante foram examinadas quanto â presença do plasmídeo pretendido por um processo rápido de isolamento de plasmídeos. Os dois processos mais vulgarmente usados estão , 33) descritos nas paginas 366 a 369 do trabalho de Maniatis et al.

H. Isolamento em larga escala de DNA de plasmídeo

Processos para o isolamento em larga escala de plasmídeos de E. coli estão descritos nas / 33) páginas 88 a 94 do trabalho de referência Maniatis et al.

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Meios e Soluções Tampão

Meio LB triptona extracto de levedura

NaCl

Zg/V

Meio antibiótico N° 3 (Difco Laboratories)

	Zg/V
extracto de carne bovina	1,5
extracto de levedura	1,5
peptona	5
glucose	1
NaCl	3,5
K„HPO. 2 4	3,68
KH_PO. 2 . 4	1,32

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-76Meio SCGY casaminoácidos extracto de levedura glucose ^K2^HPO4

KH₂P°4

Na^-citrato (nh₄)₂so₄ MgSO₄ . 7H₂O

Zg/i7

0,1

0,2

Meio GYS (^^^Youstein & Rogoff, 1969) /3/17 glucose extracto de levedura (nh₄)₂so₄

K₂H^p°₄

MgSO₄ . 7H₂O CaCl₂ 2H₂O MnSO₄ . H₂0

0,5

0,2

0,08

0,05 pH ajustado a 7,3 antes da autoclavagem.

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-πTampão PBS

sacarose

MgCl₂ tampão de fosfatos, pH 6,0

400

Tampão TBST /mM/

Tween 20

Tris/HCl* (pH 8,0) NaCl

0,05% (p/v)

150

Tween 20: laurato de polietoxissorbitano ^frTris/HCl: ,^-Tris(hidroximetil)metilamino-hidrocloreto

A referência interna pK escolhida para designar os plasmídeos no Documento de Prioridade foi substituída na Auslandsfassung (texto entregue em estrangeiro) pela referência oficialmente reconhecida pXI.

Também, a designação para os mutantes asporogénicos de B. thuringiensis HDl usados nos Exemplos das Realizações foi alterada de cry^ para cry^B.

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EXEMPLO 1

Transformação de B. thuringiensis usando electroporação

Exemplo 1.1: 10 ml de um meio LB (triptona 10g/l, extracto de levedura 5 g/1, NaCl 5 g/1) foram inoculados com esporos de 39 )

B. thuringiensis var. Kurstaki HDlcryB ( Stahly D.P. et al., 1978), uma variante de B. thuringiensis var. Kurstaki HD1 sem plasmídeos.

Esta mistura é incubada durante a noite a uma temperatura de 27®C usando um agitador rotativo a 50 revs/min. Subsequentemente a cultura de B. thuringiensis foi diluída 100 vezes em 100 a 400 ml de meio LB e depois cultivada a uma temperatura de 30SC usando um agitador rotativo a 250 revs/min até se atingir uma densidade óptica ^(OD550n.' °'²·

As células foram colhidas por centrifugação e suspensas em 1/40 do volume de tampão PBS arrefecido em gelo (400 mM sacarose, 1 mM MgCl^, tampão de fosfatos 7 mM pH 6,0). A centrifugação e suspensão subsequente das células de B. thuringiensis em tampão PBS foi repetida uma vez mais.

As células pré-tratadas deste modo podem ser sujeitas a electroporação directamente ou como alternativa após a adição de glicerina à solução tampão /20% (p/v)_7 e guardadas entre -20®C e -70®C e usadas mais tarde.

Amostras de 800 pl das células arrefecidas em gelo são então transferidas para cuvetes pré-arrefecidas, 0,2 pg de DNA do plasmídeo pBCl6 (^O^Bernhard K. et al., 1978) (20 pg/ml) é subsequentemente adicionado e toda a mistura é incubada a 42C durante 10 minutos.

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-Ί9-

Se se usar material celular conge lado a temperaturas muito baixas, uma amostra adequada de células é primeiro descongelada em gelo ou à temperatura ambieri te. 0 tratamento subsequente é análogo ao processo usado para o material celular fresco.

A cuvete é então introduzida num aparelho de electroporação e as células de B. thuringiensis presentes na suspensão são electroporadas pela acção de volta gens entre 0,1 kV e 2,5 kV através de uma única descarga de um condensador.

O condensador usado tem uma capacitância de 25uF e a distância entre os eléctrodos na cuvete é de 0,4 cm, o qual, quando a descarga ocorre resulta, dependendo do valor marcado, numa força de campo decrescendo exporencialmente com picos iniciais de 0,25 kV/Cm a 6,25kV/cm. O tempo de decaimento exponencial está na gama de 10 ms a 12 ms

Nas experiências de electropora ção descritas pode ser usado por exemplo um aparelho de electroporação da firma Bio Rad (Gene Pulser Apparatus, #Ί65-2075, Bio Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, CA 94804, USA).

Também é obviamente possivel usar qualquer outro aparelho adequado no processo do invento.

Após mais 10 minutos de incubação a 43C, a suspensão de células é diluida com 1,2 ml do meio LB e incubada durante 2 horas a uma temperatura de 30°C usando um agitador rotativo ou 250 revs/min.

Diluições adequadas são então semeadas em agar LB (meio LB solidificado com agar, 15 g/1), o qual contem como aditivo um antibiótico adequado à selec ção do novo plasmídeo obtido. No caso de pBC16 este é tetra10:57:48

ciclina, ο qual é adicionado ao meio numa concentração de mg/ml.

As frequências de transformação conseguidas para B. thuringiensis HDlcryB e pBC16 em função da voltagem inicial aplicada para uma dada distância entre as placas estão apresentadas na Figura 1.

A expressão do DNA inserido pode ser detectada através da resistência à tetraciclina. Às 2 horas após a introdução de pBC16 por transformação de B. thurin giensis dá-se a expressão fenotipica completa da resistência à tetraciclina introduzida (ver Tabela 2).

EXEMPLO 1.2

A transformação de células de B. thuringiensis é efectuada exactamente como descrito no Exemplo 1.1, exceptuando o volume da suspensão celular sujeito a electroporação ser neste caso 400 μΐ.

A frequência de transformação, pode ser aumentada por um factor de 10 através desta medida.

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EXEMPLO 2

Transformação de B. thuringiensis HDlcryB com uma série de plasmídeos diferentes

A maior parte dos testes são efectuados com o plasmídeo pBC16, um plasmídeo que ocorre naturalmente em B. cereus. Em adição outros plasmídeos naturais podem ser inseridos com êxito em células de B. thurinqiensis, tais 25 ) como, por exemplo, pUBUO ( Polack J. e Novik R.P., 1982), pcl94 (24)Horinouchi S. e Wesblum B., 1982) e pIM13 Mahler I. e Halvorson H.O. 1980) (ver Tabela 3).

Também variantes destes plasmí deos que sejam mais adequadas do que os isolados naturais para trabalhar com DNA recombinante podem ser introduzidos por transformação em B. thuringiensis estirpe HDlcryB usando o processo do invento, tais como, por exemplo, o vector de clonagem em B. subtilis pBD64 (27)Gryczan T. et al. 1980) e os plasmídeos pBD347, pBD348 e pUB1664 (ver Tabela 3; os plasmídeos pBD348 e pUB1664 ser obtidos do Dr. W. Schurter, CIBAGEIGY AG, Basle).

Os resultados de transformação na

Tabela 3 mostram claramente que usando o processo de transfor mação do invento, conseguem-se frequências de trasnformação 5 7 que, com uma excepçao, estão todas na gama de 10 a 10 , in dependentemente do DNH de plasmídeo usado.

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EXEMPLO 3

Construção de um vector vai-vem para Bacillus thringiensis

Os vectores bifuncionais existentes para E. coli e B. subtilis, tais como por exemplo, pHV33 (^^Primrose S.B. e Ehrlich S.D., Plasmid, 6 : 193-201, 1981) não são adequados para £3. thuringiensis HDlcryB (ver Tabela 3).

Para a construção de um vector bifuncional potente, em primeiro lugar o fragmento grande Eco RI de pBCl6 é inserido com a ajuda de DNA ligase de T4 no sitio Eco RI do plasmideo plJCB ( 'Vieira J. e Messing J. 1982) E. coli são células então transformadas com esta construção. Uma construção reconhecida como correcta por análise de res trição foi designada pX162.

Segue-se a remoção do sítio de clivagem Eco RI situado distalmente da região de poliadaptado res de pUC8. pX162 é linearizado por uma digestão parcial com Eco RI. Os extremos coesivos Eco RI são preenchidos com polymerase Klenow e ligados uns aos outros novamente com DNA liga^ se de T4. Após introdução em E. coli por transformação, numa construção reconhecida como correcta por análise de restrição é seleccionada e designada pX161. Na figura 6 está apresentado um mapa de pX161 com os sitios de clivagem das enzimas de restrição que clivam pX161 apenas uma vez.

Esta construção pode ser introduzida directamente em B. thuringiensis HDlcryB usando o proces so de transformação descrito no Exemplo 1.

Tendo em conta as fortes barrei ras de restrição nas estirpes de B. thuringiensis, as taxas

10:57:48

-83de transformação são mais baixas quando se usa DNA de pXI61 derivado de Eh coli do que quando se usa DNA de plasmídeo derivado de B. thuringiensis HDlcryB (ver Tabela 3). No entan to pXI61 provou ser muito adequado para fazer as experiências de clonagem em B. thuringiensis.

EXEMPLO 4

Inserção do gene Kurhdl da delta-endotoxina em estirpes de

B. thuringiensis e de B. cereus

A sequência de DNA codificadora da proteína delta-endotoxina Kurhdl usada no âmbito deste invento para inserção e expressão em B. thuringiensis e B. cereus deriva do plasmídeo pK36, que foi depositado em 4 de Março de 1986 com o Número de Depósito DSM 3668 de acordo com os requesitos do tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Patente, na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Federal Republic of Germany, que foi reconhecido com o Depósito Inter· nacional.

Uma descrição detalhada do processo para identificação e isolamento dos genes de <$-endotoxina e para a construção do plasmídeo pK36 está inserida no Pedido de Patente Europeia EP 0 238 441 e é parte do presente invento na forma de uma referência.

O DNA do plasmídeo pK36 foi comple tamente digerido com as enzimas de restrição Pst I e Bam HI e o fragmento de 4,3 Kb, que contem o gene da delta-endotoxi10:57:48

-84na Kurdhl (cf. fórmula I), foi isolado de um gel de agarose. Este fragmento foi então inserido em pXI61, o qual foi préviamente digerido com Pst I e Bam HI e tratado com fosfatase alcalina de estômago de vitela. Após a transformação de E. coli HB101, uma construção reconhecida como correcta por análise de restrição foi isolada e designada pXl93. Na Figura 7 está reproduzido um mapa de restrição de pXI93.

pXI93 pode ser introduzido em B. thuringiensis HDlcryB de 2 maneiras diferentes.

a) Células de B. thuringiensis são transformadas directamente com um pXl93 isolado de E. coli usando o processo de transformação do invento descrito no Exemplo 1.

b) pXI93 é primeiro introduzido em células de B. subtilis por transformação, como descrito por Chang e Cohen, 1979. O DNA do plasmídeo pXI93 completo e intacto contido num transformante é isolado e depois introduzido em B. thuringiensis HDlcryB por transformação usando o processo de electroporação descrito no Exemplo 1.

Ambos os métodos resultam em trans formantes que contêm o plasmídeo pXl93 intacto.

EXEMPLO 5

Evidência da expressão do gene da delta -endotoxina em B.

thuringíénsis

Culturas em esporulação de B.

thuringiensis HDlcryB, HDlcryB (pXI61), HDlcryB (pXI93) e HDl

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foram comparadas ao microscópio de contraste de fase numa amplificação de 400. Os cristais bipiramidais de proteína típicos podem ser detectados apenas na estirpe contendo pXl93 e em HD1. Os extractos de algumas culturas foram separadas electroforéticamente num gel de SDS-poliacrilamida.

Uma banda de proteína de 130 000 Daltons, gue corresponde ao produto do gene Kurhdl, foi detectada apenas para a estirpe contendo o plasmídeo pXI93 e em HD1 (Figura 8a).

Numa análise de transferências Western (Figura 8b), esta proteína de 130 000 Daltons e os seus produtos de degradação reagem especificamente com anticorpos policlonais gue foram préviamente preparados contra a proteína cristalina de B. thuringiensis var. Kurstaki HDl de 42) acordo com o processo descrito por Huber-LukacH., 1982.

Uma descrição detalhada deste processo pode ser encontrado no Pedido de Patente Europeia EP 238 441, o qual é parte deste invento na forma de uma referência. Localizada no plasmídeo pXI93, a montante da região codificadora da toxina, está numa região de DNA de 156 pb que contem o promotor dependente „ 29) da esporulaçao atras descrito ( Wong H.C. et al., 1983).

Esta sequência é adequada à expressão abundante do gene da delta-endotoxina em B. thuringiensis HDlcryB e B. cereus 569K.

EXEMPLO 6

Evidência da Toxicidade de B. thuringiensis recombinante

HDlcryB (pXI93)

B. thuringiensis HDlcryB e HDlcryB (pXI93) foram cultivados a 252C em meio de esporulação (meio

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-86-J

GYS). Quando a esporulação está completa, que é testado usando um microscópio de contraste de fase, os esporos e (se presentes) os cristais de protoxina são colhidos por centrifugação e secos. O pó resultante é misturado em várias concentrações com o alimento de larvas L-l de Heliothis virescens (budworm do tabaco). A mortalidade das larvas foi avaliada passados seis dias.

Conforme esperado, a estirpe HD1 cryB sem o gene da protoxina não é tóxica para Heliothis virescens, enquanto que a estirpe transformada com o plasmídeo pXl93 provoca numa mortalidade dependente da dosagem de H. virescens (Tabela 4). Isto demonstra que as estirpes reconbinantes produzidas por electorporação, podem de facto ser usadas como bioinsecticidas.

EXEMPLO 7

Electroporação de várias estirpes de B. thuringiensis e B.

Cêrêús protocolo de transformação para 13. thuringiensis HDlcryB descrito no Exemplo 1 pode também ser aplicado a outras estirpes.

Todas as estirpes testadas de 13. thuringiensis var. Kurstaki podem ser muito simplesmente e eficazmente transformadas por este processo (Tabela 5).

Frequências de transformação excelentes podem também ser conseguidas com uma estirpe de la10:57:48

boratório de B. cereus. 0 mesmo se aplica a outras variedades de 13. thuringiensis testados (var. israelensis, var. Kurstoki) Ao contrário a transformação de B. subtilis pelo processo de electroporação é muito fraco.

Usando o método para protoplastos dependente de PEG em B. subtilis conseguem-se taxas de transformação de 4 χ lO^/jig de DNA de plasmídeo.

As taxas de transformação baixas de B. subtilis obtidas usando a técnica de electroporação não estão associadas à escolha incorrecta de parâmetros, tais como por exemplo, uma voltagem inadequada, ou com uma taxa de mortalidade elevada causada pelos pulsos eléctricos, como se pode ver pela Figura 9.

EXEMPLO 8

Transformação de B. thuringiensis HDlcryB com o gene da p~

-galactosidase

8,1. Inserção de um sítio de clivagem de restrição Bam Hl directamente antes do primeiro codão AUG do gene da protoxina de B. thuringiensis

Antes do gene da ^-galactosidase do plasmídeo piWiTh5 (adquirido do Dr. M. Geiser, CIBA-GEIGY AG, Basle, Switzerland) poder ser ligado ao promotor do gene da ^-endotoxina Kurhdl de B. thuringiensis, a sequência de DNA do gene da protoxina situada na região do codão de inicia10:57:48

-88\_u

--5-¾ ção AUG deve ser primeiro modificada.

Esta modificação é efectuada por mutagénese dirigida com oligonucleotídeos, usando o fago M13 mp8 de cadeia simples, que contem o fragmento HincII-HindIII de l,8kB do gene da -endotoxina contendo a região 5' daquele gene.

Em primeiro lugar 3 ug do plasmídeo pK36 (jcf. Exemplo 4) foram digeridas com enzimas de restrição HindIII e HincII. O fragmento resultante de 1,8 kb foi purificado por electroforese em gel de agarose e depois isolado do gel.

Paralelamente com isto, 100 ng de DNA do fago MBmp8 FR (Biolab Tozer Road, Beverly MA, 01915, USA ou de qualquer outro fabricante) foram digeridas com as enzimas de restrição Sma I e Hind III, tratados com fenol e precipitadas pela adição de etanol. O DNA fágico tratado deste modo foi então misturado com 200 ng do fragmento de protoxina préviamente isolado e ligado a ele pela adição de DNA-ligase de T4.

Após a transfecção de J3. coli

JM103, seleccionaram-se 6 placas brancas e analisaram-se por mapeamento de restrição.

Um isolado em que a ligação entre o gene da p-galactosidase e o promotor do gene da -endotoxina Kurhdl de B. thuringiensis foi efectuada correctamente foi seleccionado e designado M13mp8/Hinc-Hind.

Num aparelho de síntese de DNA (Applied Biosystem DNA Synthesizer ) sintetizou-se um oligonucleotídeo com a seguinte sequência:

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(5¹) GTTCGGATTGGGATCCATAAG (3¹)

Este aligonucleotídeo sintético é complementar do DNA de M13mp8/Hinc-Hind numa região que vai da posição 153 à posição 173 do gene da §-endotoxina Kurdhl (cf. fórmula I). A sequência aligonucleotídica reproduzida atrás tem um desemparelhamento nas posições 162 e 163, no entanto, comparada com a sequência reproduzida na Fórmula I, de tal forma que é necessário a formação de um sítio de clivagem de restrição Bam HI. 0 processo geral para mutagénese , 4 3 ) esta descrito por J. M. Zoller e M. Smith ( J.M. Zoller e

M. Smith; 19). Aproximadamente 5 pg de DNA do fago M13mpl8/Hi -Hind da cadeia simples foi misturado com 0,3 pg de oligonucleotídeos fosforilados num volume total de 40 pl. Esta mistura foi aquecida durante 5 minutos a 65°V, arrefecida primei ro até 50°C e depois gradualmente até 4SC. Tampão, trifosfatos de nucleotídeos, ATP, DNA-ligase de T4 e o fragmento gran de da DNA-polimerase foram então adicionados e a mistura in43) cubada durante a noite a 152C como o descrito ( J.M. Zoller e M. Smith). Após electroforese em gel de agarose, o DNA de cadeia dupla circular foi purificado e inserido em EN coli es tirpe JM103 por transfecção. Como alternativa pode ser usada E. coli estirpe JM107.

As placas resultantes foram examinadas quanto às sequências que hibridam com oligonucleotí32 deo marcado com P; os fagos foram examinados por analise do DNA com endonucleases de restrição.

Um fago que contém uma construção correcta em que um sítio de clivagem Bam HI está situado directamente atrás do primeiro codão AUG do gene da protoxina foi designado M13mp8/Hinc-Hind/Bam.

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-908.2. Ligação do gene da ^-galactosidase ao promotor da zf-endotoxina

8.2.1: O promotor da £-endotoxina está num fragmento EcoRI/Bam HI de 162 pb do dna do fago M13mp8/ Hinc-Hind/Bam. 0 DNA fágico RF foi digerido com a enzima de restrição Bam HI. As projecções resultante nos extremos 5' foram removidas por tratamento com nuclease Mung Bean (Biolabs) de acordo com as introduções do fabricante. Subsequentemente, o DNA já digerido com a endonuclease de restrição Eco RI e após electroforese em gel de agarose, o fragmento de 162pb foi isolado do gel de agarose.

gene da ^3-galactosidase foi isolado do plasmídeo piWiTH5. O DNA de piWitbõ foi primeiro clivado no sitio único de clivagem Hind III. Os extremos protuberantes 3' foram preenchidos usando o fragmento Klenow da 33 )

DNA-polimerase (cf. Maniatis et al., 1983, pagina 113-114) e o DNA modificado foi então digerido com a enzima de restrição Sal I. O fragmento de DNA contendo o gene da J3-galactosidase foi isolado por electroforese em gel de agarose.

O vector pXI61 (cf. Exemplo 3) foi digerido com as enzimas de restrição Eco RI e Sal I e os dois fragmentos préviamente isolados foram inseridos no vector pXI61.

Após transformação de E. coli estirpe HB101 ou JM107 com esta mistura de ligação os clones correctamente ligados foram seleccionados por análise de restrição e pela sua actividade de g-galactosidade relativamente ao substrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-J3-D-galactosido) . Um clone contendo a construção genética correcta foi designado pXl80.

10:57:48

-918.2.2:

Numa realização alternativa, o

fragmento Eco RI/Bam Hl de 162 pb contendo o promotor da g-endotoxina foi isolado por clivagem de M13mp8/Hinc-Hind/Bam com Eco RI e Bam Hl, seguido de separação por electroforese em gel.

O gene da ^3-galactosidase foi isolado do plasmídeo piWith5 neste caso também (cf. Exemplo 8.1) O DNA do plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição Bam Hl e Bgl II e o fragmento grande foi eluido do gel de agarose após electroforese em gel.

O vector pHY300 PLK (=PHY-001; Toyobo Co., Ld., 2-8 Dojiima Hama 2-Chome, Kita-ku, Osaka,

530 Japan) que pode ser adquirido comercialmente (cf. Exemplo 9.1) foi digerido com as enzimas de restrição Eco RI e Bgl II Os dois fragmentos préviamente isolados foram então inseridos no vector pHY300 PLK.

Toda a mistura de ligação foi então introduzida por transformação em E. coli estirpe JM107 (Bethesda Research Laboratories (BRL), 411 N, Stonestreet Avenue, RocKville, M.D. 20850, USA). Um clone tendo actividade de ^3-galactosidase foi ainda analisado por digestões de restrição. Um clone contendo uma construção genética correcta foi designado pXIlOl.

8.3 Introdução do plasmídeo pXI80 ou pXIlOl por transformação de B,subtilis e B. thuringiensis

O DNA do plasmídeo pXI80 ou pXIlOl foi primeiro introduzido em protoplastos de B. subtil is por

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transformação de acordo com um protocolo conhecido descrito 13 ) por Chang e Cohen ( Chang e Cohen, 1979).

Seleccionou-se um clone correcto, o DNA a ser usado em transformação foi isolado por processos convencionais e introduzido por transformação em células de B. thuringiensis HDlcryB através de electroporação (cf. Exemplo 1) .

As células transformadas de B. thu ringiensis foram semeadas em agar GYS (meio de esporulação) que contem X-gal como aditivo.

Os clones correctamente transforma dos quando a esporulação começa ficam azuis.

Uma estirpe de B. thuringiensis HDlcryB transformado pelo vector pX161 por outro lado permanece branca nas mesmas condições.

A análise de restrição mostra que com clones correctamente transformados um plasmídeo pX180 ou pXIOl intacto está presente em células de B. thuringiensis.

8.4 Gene da j3-galactosidase sob o controle de um promotor dependente da esporulação

Células de B. thuringiensis

HDlcryB contendo o plasmídeo pX180 ou pXIOl foram cultivadas em meio GYS como descrito atrás. Em diferentes alturas da fa. se de crescimento (tanto durante a fase de crescimento vegetativo como durante a fase de esporulação) fez-se um ensaio

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para B-galactosidase de acordo com o protocolo descrito por 44 )

J.H. Miller (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, Experiência 48 e 49).

As diferenças individuais relativamente ao protocolo atrás mencionado dizem respeito à utilização de X-gal como substrato cronogénico e à medição do produto de hidrólise corado que é formado pelas após aproximadamen te 1 hora.

As células foram então removidas por centrifugação e a densidade óptica do sobrenadante medida num comprimento de onda de 650 nm (OD,.„).

□ ou

Observou-se um aumento na densidade óptica em função da esporulação. As células de B. thuringiensis não transformadas, por outro lado não podem hidroli sar o substrato cromogénico X-gal.

EXEMPLO 9

Criação de bancos de genes em Bacillus thuringiensis

9,1, Construção de pX1200

O plasmídeo pX1200 é um derivado do plasmídeo pHY300 PLK, o qual pode ser obtido comercialmente à Toyobo Co., Ltd. ( PHY-001; Toyobo Co., Ltd., 2-8 Dojima Hama 2-Chome, Kita-ku, Osaka, 530 Japan). O plasmídeo pHY300, a construção do qual está descrito no Pedido de Patente Euro10:57:48

-94peia EP 162 725, contem um gene de resistência à ampicilina (amp ) e um gene de resistência à tetraciclina (tetr ).

plasmídeo pHY300 PLK foi completamente digerido com Bgll e Pvu I. Os fragmentos de restrição resultantes foram então separados por electroforese em gel de agarose. O fragmento de 4,4 Kb foi isolado do gel de agarose, purificado e depois novamente ligado com DNA-ligase de T4.

Toda a mistura de ligação foi in troduzida por transformação em E. coli HB101. Após incubação das células transformadas de E. coli HB101 a 379C num agar L selectivo contendo 20 jug/ml de tetraciclina os transformantes resistentes à tetraciclina (Ter) foram seleccionados.Foi então possível isolar a partir de um clone sensível à ampici lina (Aps) (100 jig/ml de ampicilina) um plasmídeo que perdeu o sitio de clivagem Pst I no gene Apr juntamente com o fragmento Pvu I/Bgl I de 0,3 Kb. Este plasmídeo foi designado pX1200.

9.2 Clonagem de genes de protoxina de Bacillus thuringiensis var. kurstaki HDl em Bacillus thuringiensis HDlcryB

O DNA total (50 ug) de Bacillus thuringiensis var kurstaki HDl foi completamente digerido por incubação com as enzimas de restrição PstI e Hpal. Os fragmen tos de restrição assim obtidos foram transferidos para um gra diente contínuo de sacarose /5% (w/v)_7 onde se separaram de acordo com o tamanho por centrifugação em gradiente de densidade e foram colhidos em fracções de 500 ul. A centrifugação foi efectuada num rotor TST 41 (Kontron Ausschwingrotor) a uma temperatura de 19°c e 2,4 x 10^ g durante um periodo de

10:57:48

horas. Subsequentemente para determinar o tamanho dos fragmentos, amostras de 50 pl foram traferidas para um gel de agarose /7),8% (p/v) de agarose em Tris acetato EDTA ou 33 )

Tris borato EDTA; ver Maniatis et al., 19827. As fracções contendo fragmentos entre 3 Kb e 6 Kb foram reunidas e concentradas para um volume de 10 pl por precipitação com etanol .

pg do vector vai-vem pXI200 descrito no Exemplo 9.1 foram digeridos com as enzimas de restrição Pst I e Sma I. Os grupos fosfato 5' dos fragmentos de restrição resultantes foram então removidos por tratamento com fosfatese alcalina de intestino de vitela. 0,2 pg a 0,3 pg do DNA de HV1 préviamente isolado foi então misturado com 0,5 pg do DNA vector de pXI 200 e incubado durante a noi te a 14SC com a adição de 0,1 U de DNA-ligase de T4 (as chamadas Unidades Weiss; uma unidade de DNA-ligase de T4 corresponde a uma actividade enzimática suficiente para converter 1 nH / P/ de pirofosfato a uma temperatura de 37QC e num período de 20 minutos em material não absorvível por Norit). Toda a mistura de ligação foi então introduzida por transformação directamente em células de Bacillus thuringien sis HDlcryB por meio de electroporação (cf. Exemplo 1). As células de B. thuringiensis sujeitas a electroporação foram então semeadas em agar selectivo de esporulação contendo 20 pg/ml de tetraciclina como agente selectivo e incubadas a uma temperatura de 25VC até a esporulação estar completa.

9.3. Produção de anticorpos monoclonais contra a proteína protoxina de B. thuringiensis

10:57:48

-96A produção de anticorpos monoclonais contra a £-endotoxina de Bacillus thuringiensis var. Kurstaki HD1 foi efectuada de modo análogo à descrição em 36^Huber-Lukaç (1984) e em *⁷Huber-Lukacet al., (1986).

As células de hibridona usadas na produção de anticorpos são produtos de fusão das células de mieloma Sp2/O-Ag (descrito em Shulman et al., 1978; podem ser adquiridas à American Type Culture Collection em Rockville, Maryland, USA) e células do baço de ratinhos Balb/c que foram préviamente imunizados com ^-endotoxina de B. thuringiensis var. Kurstaki HD1.

Deste modo é possivel obter anticorpos monoclonais que são especificamente dirigidos contra a j-endotoxina de B. thuringiensis. São especialmente preferidos os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a um efeito de epítopo na metade N-terminal da proteína de protoxina (por exemplo o anticorpo 54.1 da referência Huber-Lukac et al., 1986) ou que reconhecem um epítopo na parte constante da proteína em protoxinas activas em Lepidoptera, a parte C-terminal (por exemplo o anticorpo 83.16 da referência Huber-Lukac et al., 1986).

É no entanto também possível usar outros anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais no despiste imunológico que se segue (cf. Exemplo 9.4).

9.4, Despiste imunológico

Os anticorpos monoclonais produzidos de acordo com o Exemplo 9.3 ou outros anticorpos monoclo10:57:48

-9 7nais adequados foram usados no despiste imunológico.

Em primeiro lugar, as proteínas cristalinas presente na forma livre após a esporulação das células de B. thuringiensis são ligadas por meio de membranas de transferência (por exemplo membrana de transferência Pall Biodyne; Pall Ultrafine Filtration Corporation, Glen Cove, N.Y.) através da aplicação das membranas filtrantes sobre as placas durante um período de aproximadamente 5 minutos. Os filtros foram subsequentemente lavados durante 5 minutos com tampão TBST /1),05% (p/v) de Tween 20, 10 mM Tris/HCl (pH 8,0) 150 mM NaCl em água bidestilada_7 e depois , para bloquear a ligação inespecífica, incubados numa mistura de tampão TBST e 1% (p/v) de leite desnaturado durante 15 a 30 minutos.

Os filtros preparados deste modo foram então incubados durante a noite com os anticorpos específicos para protoxina /mistura dos anticorpos 54.1 e 83.16

7) ( Huber-Lukac et al. , (1986)7- Os anticorpos não ligados foram removidos por lavagem dos filtros três vezes com tampão TBST durante 5 a 10 minutos de cada vez. Para detectar a protoxina ligada a anticorpos, os filtros foram incubados com um outro anticorpo. O segundo anticorpo usado é um anticorpo anti-ratinho marcado com fosfatose alcalina, o qual pode ser adquirido comercialmente, por exemplo à Bio-Rad /Katalog #170 -6520, conjugado de anticorpos de cabra anti-IgG (H + L) de ratinho-fosfatase alcalina,/. Após um período de incubação de 30 minutos os anticorpos secundários não ligados foram removidos como descrito atrás por lavagem dos filtros com tampão TBST três vezes (durante entre 5 e 10 minutos de cada vez).

Os filtros foram então incubados com uma mistura de substrato consistindo em NBT /cloreto de p'-nitro azul tetrazólio; cloreto de nitro-azul tetrazólio/ e BCIP /sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosf ato-p-toluidina_7. A reacção enzimática foi efectuado de acordo com as instruções do fabricante /Bio-Rad; 1414 Harbour Way South, Richmond CA, 94804, USA/.

10:57:48

-98Os clones positivos, ou seja os que contêm protoxina, podem ser reconhecidos muito fácilmente pela sua coloração violeta. Esta ocorre como resultado da reacção enzimática da fosfatase alcalina com a mistura de substratos atrás referidos. Cerca de 800 e 1000 transformantes resultarem da transformação descrita no Exemplo 9.2 com a mistura de ligação indicada naquele Exemplo. Destes transformantes 2 colónias apresentam claramente sinais positivos na reacção enzimática acima descrita.

DNA de plasmídeo foi isolado a partir de clones positivos nos quais a expressão do gene da protoxina pode ser detectado através da reacção enzimática descrita. Os genes clonados da protoxina podem ainda ser caracterizados e finalmente identificados por análise de restrição e comparação com mapas de restrição conhecidos.

Ambos os clones contêm um plasmídeo recombinante com uma inserção de 4,3 kb. As digestões de restrição subsequentes com Hind III, Pou II, Eco RI e Xba I permitem a identificação do gene na inserção por comparação com os mapas de restrição conhecidos dos genes da endotoxina de B. thuringiensis var. Kurstaki HDl. Em ambos os casos o gene é Kurhdl, o qual é também conhecido como o gene da pro, 5) toxina de 5,3 kb e esta descrito em Geiser et al., 1986.

Este gene, clonado directamente em B. thuringiensis e identificado por despiste imunológico, hibrido com um fragmento Bam HI/Hind III de 1847 pb do gene de 5,3 kb no plasmídeo pk36 (^Geiser et al. , 1986). Em SDS/

PAGE ambos os clones apresentam uma banda de 130000 Daltons * 46) típica da protoxina, a qual numa transferência Western ( Towbin et al, 1979) reage especificamente com os anticorpos monoclonais descritos {ver Exemplo 9.4).

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-99Tabelas

Tabela 1: Influência do tempo de incubação a 42C, antes e de pois da electroporação, na frequência de transformação. B. thuringiensis HDlcryB foi transformado usando o processo de electroporação com 0,2 jig de pBC16 por mistura.

10:57:48

-100

CO	20	20	tO O r4 X r- r4
r-	O CM	O —t	<D O i-4 X m ΠΊ
kO	O CM	LTl	kO O r-4 X σ» c4
m	O CM	O	<O O r4 X in CM
	o CM	o CM	\D O «-4 X m CM
co	O	O CM	kO o í-4 X CM CM
CM	m	o CM	LD O i—i X r—1 CM
i—1	o	O CM	<O O r—t X kO CM
Exemplo	pré-incubação* (minutos)	Subsequente incubação (minutos)	Frequência de transformação (Transformantes/pg de DNA de plasmídeo)

Ο ίΠ3

Ο

Π5 ο

α ο

Μ +J υ

φ γΗ φ

ω <

ζ

G

Φ

Τ3

Ο

IfD ο

•Η

Ό

Π3 (0

1)

5-ι

-μ β

φ

Μ*

Φ ,§ íá·

Incubação a 42C entre electroporação e o começo do período de expressão.

10:57:48

-101Tabela 2: Expressão da resistência à tetraciclina de pBC16 após introdução em B. thuringiensis HDlcryB por transformação

B. thuringiensis HDlcryB foi transformado com DNA do plasmídeo pBCl6 usando o protocolo de electroporação de acordo com o invento. Após vários períodos de incubação em meio LB a 30°C as células transformadas foram seleccionadas por sementeira em agar LB contendo 20 ug/ml de tetraciclina.

Tempo levado até expressar a resistência à tetraciclina (horas)	Frequência de transformação (transformantes/ ug de DNA)	Números células	de vivas
0,5	0	4	xlO8
1	1,6 x 106		109
2	8,8 x 106	1,4	xlO9
3	8 x 106	1,6	xlO9

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-102-

Tabela 3: Transformação de B. thuringiensis estirpe HDlcryB com vérios plasmídeos

Plasmídeo Origem marca de resistência'*' I gram negativa ] gram positiva	Frequência de transformação^
plasmídeos naturais
pBC16 pUBUO pC194 pIM13	B. cereus Staphylococcus aureus S. aureus B. subtilis	-	Tc Km, Ble Cm Qn	1,9 χ 106 3,3 χ 106* 6 χ 106* 1,8 χ 105
plasmídeos modíficados/vectores de clonagem
pBD64 pBD347 pBD348 pUB1664	pUBUO replicon pIM13 replicon pIM13 replicon pUBUO replicon	-	Km, Qn Qn Sn, Qn Qn, Em	5 χ 106 2,9 χ 105 1,1 χ 105 3,5 χ 104
vectores vai-vem
pHV33 pK61	pBR322/pC194 pUC8/ pBC16	Amp, Tc Amp	Qn Tc	< 50* 2,8 χ 104

1: Tc: tetraciclina; Km: canamicina; Ble: bleomicina; Qn: cloranfenicol; Sn: eritromicina

2: Todo o DNA de plasmídeo deriva de B. thuringiensis com excepção do isolado* de B. subtilis LBG4468.

10:57:48

-103Tabela 4: Bioteste de B. thuringiensis HDlcryB e HDlcryB (pXI93) contra Heiiothis virescens.

Culturas esporuladas secas por vaporização (esporos e (se presentes) cristais de protoxina) foram misturadas nas quantidades indicadas, com a comida de larvas L-l de Heliothis virescens.

Concentração de esporos e cristais de protoxina (pg/g de alimento)	Mortalidade de (%) de H. virescens causada por:
HDl cryB	HDl cryB (pXI93)
200	0	57
100	0	43
50	3	27
25	0	10
12,5	0	0

Tabela 5: Capacidade de transformação de B.. thuringiensis, B.

cereus e B. subtilis. Todas as estirpes foram transformadas com o plasmídeo pBC16 de acordo com o processo da electroporação descrito no Exemplo 1.

10:57:48

-104Estirpe

Frequência de transformaçao

B. thuringiensis var. Kurstaki

HDlcryB 1

HDldipel 0,25

HD1-9 0,9

HD 73 0,1

HD 191 0,5

B. thuringiensis var. thuringiensis

HD 2-D6-4 13,8

B. thuringiensis var. israelensis

LBG B-4444 2,6

B. cereus

569 K 7,5

B. subtilis

LBG B-4468 0,0002 valores relativos baseados na frequência de transformação, definido com 1, conseguido com B. thuringiensis var. Kurstaki HDlcryB.

Depósito de tnicroorganismos

Uma cultura de cada um dos microorganismos enumerados abaixo que foram usados dentro do âmbito do presente invento foi depositado no Deutsche Sammlung

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-105von Mikroorganismen, reconhecido como Depositário Internacional , em Braunschweig, Republica Federal da Alemanha, de acordo com os requesitos do tratado de Budapeste para o Reco nhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Patente. O referido Depositário Internacional publicou uma declaração respeitante à viabilidade das amostras de positadas

10:57:48

Depositário de Microorganismos

Microorganismos	Data do deposito	Número do Depósito	Data do certificado de viabilidade
HB 101 (pK36) (E. coli HB101 transformado com DNA do plasmídeo pK36)	4. Março 1986	DSM 3668	7. Março 1986
*HD1 cryB (Bacillus thu- ringiensis var. Kurstaki HDl cryB	4. Maio 1988	DSM 4574	4. Maio 1988
*HD1 cryB (*pK 61) (B. thuringiensis HDl cryB transformado com DNA do plasmídeo *pK61)	4. Maio 1988	DSM 4572	4. Maio 1988
*HD1 cryB (*pK 93) (B. thuringiensis HDl cryB transformado com DNA do plasmídeo *pK93)	4. Maio 1988	DSM 4571	4. Maio 1988
569 K (Bacillus cereus 569 K)	4. Maio 1988	DSM 4575	4. Maio 1988
569 K (*pK 93) (B. cereus 569 K trans- formado com DNA do plasmídeo *pK93)	4. Maio 1988	DSM 4573	4. Maio 1988

10:57:48

-107A referência interna pK seleccionada para a designação dos plasmídeos no Documento de Prioridade foi substituída para a Auslandsfassung (texto de pedido em estrangeiro) pela designação reconhecida oficialmente pXI.

Também, a designação dos mutantes de B. thuringiensis HD1 asporogénicos usados nos Exemplos de Realização foi mudada de cry^3 para cryB.

10:57:48

-108Referência de Literatura

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LITERATURA DE PATENTES

EP 162 725 EP 238 441 WO 86/01536

US-P 4 448 885
US-P	4	447	036
US-P	4	237	224
US-P	4	468	464

10:57:48

-110-

Claims (7)

1. lã. - Processo para a manipulação genética directa, dirigida e reprodutível de B. thuringiensis usando tecnologia de DNA recombinante, caracterizado por compreender a transformação de B. thiringiensis com elevada eficácia através de um processo simples de transformação usando um DNA recombinante adequado à referida manipulação genética de 13. thuringiensis .
2. 2ã. - Processo para a manipulação genética directa, dirigida e reprodutível de B. cereus usando tecnologia de DNA recombinante, caracterizado por compreender a transformação de B. cereus com elevada eficácia através de um processo simples de transformação usando um DNA recombinan te adequado à referida manipulação genética de ER cereus.
3. 3ã. - Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por se efectuar a transformação de B. thuringiensis ou de ER cereus usan do electroporação.
4. 4ã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a transformação de B. thuringiensis ou de B. cereus compreender os seguintes passos:

   a) preparação de uma suspensão de células de densidade ce lular adequada num meio de cultura adequado ao crescimento de células de B. thuringiensis e com arejamento apropriado para o crescimento das células;

   b) separação das células da suspensão celular e resuspensão num tampão de inoculação adequado à subsequente electropo10:57:48

   -111- raçao;

   c) adição dê uma amostra de DNA numa concentração adequada à electroporação;

   d) introdução da mistura descrita nos pontos b) e c) num aparelho de electroporação;

   e) uma ou mais descargas breves de um condensador através da suspensão celular para a produção a curto prazo de intensidades de campo eléctrico altas durante um período que é adequado à transformação de células de B. thuringiensis e/ou de B. cereus com DNA recombinante;

   f) reincubação facultativa das células electroporadas;

   g) cultura das células electroporadas num meio de selecção adequado; e

   h) selecção das células transformadas.

   55. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender a utilização de esporos de B. thuringiensis para a preparação da suspensão celular referida no ponto 4a).

   65. - Processo de acordo com a reivindicação 4, que é caracterizado por compreender a utilização de células de Bacillus thuringiensis e/ou Bacillus cereus para a electroporação da suspensão celular referida no ponto 4e).

   75. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por, para a cultura de células

   10:57:48

   -112de B. thuringiensis,

   a) se usarem meios nutritivos complexos com fontes de carbono e azoto fácilmente assimiláveis como normalmente empregue na cultura de espécies aeróbicas da Bacillus;

   a^) caso se pretenda, podem ainda ser adicionados vitaminas e iões metálicos essenciais aos meios referidos em a) ; ou

   b) se usarem semi-sintéticos gue meios nutritivos totalmente contêm sintéticos ou betuma fonte de carbono e azoto complexa ou como alternativa definida é fácilmente assimilável ou uma combinação das duas e também vitaminas essenciais e iões metálicos.
5. 8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida suspensão de células de Bacillus ter uma densidade óptica 0,1 e 1,0.
6. 9ã. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tampão de inoculação referido no ponto b) ser um tampão fosfato osmóticamente estabilizado .

   103. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido tampão fosfato conter açucares ou álcoois de açúcares como agente estabilizante.
7. 10:57:48

   -113- lli. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido agente estabi lizante ser sacarose, que está presente numa concentração entre O,1M e 1,OM.

   121. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido tanpão fosfato ter um valor entre pH 5,0 e pH 8,0.

   131. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a incubação das células de Bacillus ser efectuada a uma temperatura entre Osc e 35°C antes, durante e após a electroporação.

   141. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a incubação das células de Bacillus ser efectuada a uma temperatura entre 2°C e 159C antes, durante e após a electroporação.

   151. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a concentração da amostra de DNA adicionada ir de lng a 20pg.

   16i. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida amostra de DNA ser DNA vector.

   171. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por no decurso da electroporação as células bacterianas, durante um período curto, serem submetidas a uma força de campo eléctrico alta através de bre

   10:57:48

   -114ves descargas de um condensador através da suspensão celular contendo DNA, como resultado das quais a permeabilidade das células de B. thuringiensis ou de B. cereus é aumentada de modo a que a DNA na suspensão seja adsorvido às células de Bacillus.

   18ã. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as intensidades de campo estarem entre lOOV/cm e 50 OOOV/cm.

   19ã. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as intensidades de campo estarem entre 100 V/cm e 10 000 V/cm.

   20ã. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tempo de decaimento expo rencial do pulso que actua sobre a suspensão de células de Bacillus estar dentro de uma gama que vai de aproximadamente 2 ms a aproximadamente 50 ms.

   21a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender a cultura das células electroporadas, após uma fase subsequente de incubação adequada, em meio sólido contendo um aditivo adequado à selecção das células de Bacillus transformadas.

   22ã. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o referido aditivo ser um antibiótico adequado à selecção de B. thuringiensis ou de B. cereus, seleccionado do grupo constituído por tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, eritromicina.

   10:57:48

   -115-

   239. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o referido aditivo ser um substracto cromogénico adequado à selecção B. thuringiensis ou de 13. cereus.

   249. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por o DNA recombinante usado para a transformação de B. thuringiensis ou de B. cereus ser de origem homóloga ou heteróloga ou ser uma combinação de DNA homólogo e heterólogo.

   259. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado o referido DNA recombinante conter um ou mais genes estruturais e sequências reguladoras delimitante 3' e 5' que são capazes de funcionar em Bacillus thuringiensis ou em Bacillus cereus ou em ambos, sequências estas que estão operacionalmente ligadas ao(s) gene(s) estrutural(ais) e portanto asseguram a expressão do(s) referido(s) gene(s) estrutural(ais) em Bacillus thuringiensis ou em Bacillus cereus ou em ambos.

   269. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por o referido gene estrutural codificar um polipeptídeo de £-endotoxina natural em B. thuringiensis ou em polipeptídeo substâncialmente homólogo, ou seja que pelo menos possui substancialmente as propriedades de toxicidade de um polipeptídeo cristalino de j-endotoxina de 13. thuringiensis

   279. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a referida sequência de DNA codifidora da endotoxina ξ ser substancialmente homóloga de uma parte ou partes da sequência codificadora da endotoxi10:57:48

   -116- na £ natural que é (são) responsável(eis) pela actividade insecticida .

   285. _ Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido DNA ser DNA vector.

   295. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido DNA vector ser derivado de DNA de plasmídeo.

   305. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o referido DNA vector ser derivado de DNA fágico.

   315. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, o caracterizado por compreender a utilização, na transformação, de vectores bifun cionais que além de serem capazes de se replicarem em B. thuringiensis ou na espécie próxima B. cereus, ou ambas, são capazes de se replicarem em pelo menos um outro, ou como alternativa em vários outro, organismos hospedeiro heterólogoeque são identificáveis em ambos os sistemas hospedeiros, homólgo e heterólogo.

   325. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos hospedeiros heterólogos serem

   a) organismos procarióticos seleccionados do grupo constituído pelos géneros Bacillus, Staphylococcus, Streptococeus, Streptomyces, Pseudomonas, Escherichia, Agrobacterium

   10:57:48

   -117-

   Salmonella, Erwinia, etc., ou

   b) organismos eucarióticos seleccionados dos grupos cons tituídos por células de levedura, células animáis e vegetais, etc. .

   333. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o referido organismo hospedeiro heterólogo ser B. coli.

   34â. - Processo para a preparação de vectores bifuncionais adequados à transformação de B. thuringiensis e 13. cereus, caracterizado por compreender:

   a) em primeiro lugar, se partir o DNA do plasmídeo de origem homóloga ou heteróloga em fragmentos usando enzimas de restrição adequadas e

   b) depois se ligar novamente uns aos outros, na presença das enzimas adequadas, os fragmentos contendo as funçõe essenciais para a replicação e selecção no respectivo sistema hospedeiro pretendido, isto sendo efectuado de modo a que as funções essenciais para a replicação e selecção nos diferentes sistemas hospedeiros sejam mantidos.

   35ê. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por compreender a utilização de DNA de plasmídeo de origem puramente heteróloga.

   363. - Processo de acordo com uma das reivindicações 34 e 35, caracterizado por

   10:57:48

   -118a) o referido DNA de plasmídeo homólogo ser DNA que ocorre naturalmente em Bacillus thuringiensis ou B. cereus ou é substancialmente homólogo dele,

   b) o referido DNA de plasmídeo heterólogo ser DNA que está presente naturalmente em b^) organismos procarióticos seleccionados do grupo constituído pelos géneros Bacillus , Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Pseudomonas , Escherichia , Agrobacterium Salmonella,.Erwinia, etc.

   b£) organismos eucarióticos seleccionados do grupo constituído por leveduras, células animais ou vegetais, etc., ou ser substancialmente homólogo dele.

   37â. - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o referido DNA de plasmídeo heterólogo ser um DNA que ocorre naturalmente em EL coli ou que é substancialmente homólogo dele.

   385. - Processo para a preparação de vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 34, que, além das funções essenciais à replicação e selecção em sistemas hospedeiros homólogos e heterólogos também contem um ou mais genes numa forma expressável ou outras sequências de DNA úteis, caracterizado por os referidos genes ou sequências de DNA úteis serem inseridas nos referidos vectores bifuncionais usando enzimas adequados.

   395. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por os referidos genes ou outras sequências de DNA úteis serem de origem homóloga, heteróloga ou sintética ou como alternativa consistem numa com10:57:48

   -119- binação dos referidos genes ou sequências de DNA.

   40ê. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por os referidos genes consistirem em um ou mais genes estruturais e em sequências reguladoras delimitantes 3' e 5' capazes de funcionarem em B. thuringiensis ou B. cereus ou em ambos, sequências que estão operacionalmente ligadas ao gene ou genes estruturais e portanto asseguram assim a expressão do referido gene ou genes estruturais em B. thuringiensis ou B. cereus ou em ambos.

   41â. - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por as referidas sequências reguladoras serem sinais de expressão que incluem sequências de promotores e de terminadores assim como outras sequências reguladoras das regiões 3' e 5' não traduzidas.

   42§. - Prccesso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por os referidos sinais de expressão ocorrerem naturalmente em B. thuringiensis ou em B. cereus ou em ambos ou serem mutantes e variantes destes sinais de expressão naturais que são substancialmente homólogos da sequência natural.

   43â. - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por os referidos sinais de expressão incluírem um promotor dependente da esporulação de B. thuringiensis .

   44ã. - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por oreferido gene estrutural codificar um polipeptídeo de ^-endotoxina que ocorre natural10:57:48

   -120mente em B. thuringiensis ou um polipeptídeo substancialmente homólogo dele, ou seja que pelo menos possua substancialmente as propriedades de toxicidade do polipeptídeo de uma g-endotoxina de B. thuringiensis.

   45θ. - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por o referido gene estrutural ser uma sequência de DNA codificadora de uma §-endotoxina que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou como alternati va ser uma variante de uma sequência de DNA natural que é pelo menos substancialmente homóloga da correspondente sequên cia natural.

   46ã. - Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o referido-polipeptídeo ser substancialmente homólogo de um polipeptídeo de £-endotoxina de uma sub-espécie adequada de B. thuringiensis, seleccionada do grupo constituído por kurstaki, berliner, alesti, sotto, tolworthi, dendrolimus, tenebrionis e israelensis.

   47â. - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora de ^-endotoxina ser substancialmente homóloga de pelo menos uma parte ou partes da sequência codificadora de -endotoxina natural que é(são) responsável(eis) pela actividade insecticida.

   48â. - Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora de ^-endotoxina ser um fragmento de B. thuringiensis var. Kurstaki HDl situado entre os nucleotídeos 156 e 3623 na fórmula I ou ser qualquer fragmento mais pequeno que ainda codifica um polipeptídeo tendo propriedades de

   10:57:48

   -121 toxicidade para insectos.

   Fórmula I

   10 20 30 40 50 60 GTTAACACCC TGGGTCAAAA ATTGATATTT AGTAAAATTA GTTGCACTTT GTGCATTTTT 70 80 90 100 110 120 TCATAAGATG AGTCATATGT TTTAAATTGT AGTAATGAAA AACAGTATTA TATCATAATG 130 140 150 160 170 180 AATTGGTATC TTAATAAAAG AGATGGAGGT AACTTATGGA TAACAATCCG AACATCAATG 190 200 210 220 230 240 AATGCATTCC TTATAATTGT TTAAGTAACC CTGAAGTAGA ACTATTAGGT GGAGAAAGAA 250 260 270 280 290 300 TAGAAACTGG TTACACCCCA ATCGATATTT CCTTGTCGCT AACGCAATTT CTTTTGAGTG 310 320 330 340 350 360 AATTTGTTCC CGGTGCTGCA TTTGTGTTAG CACTAGTTGA TATAATATGG GGAATTTTTG

   10:57:48

   -122

   370 380 390 400 410 420 GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAATTGAACA GTTAATTAAC CAAAGAATAG 430 440 450 460 470 480 AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA 490 500 510 520 530 540 TTTACGCAGA ATCTTTTAGA GAGTGGGAAG CAGATCCTAC TAATCCAGCA TTAAGAGAAG 550 560 570 580 590 600 AGATGCGTAT TCAATTCAAT GACATGAACA GTGCCCTTAC AACCGCTATT CCTCTTTTTG 610 620 6 30 640 650 660 CAGTTCAAAA TTATCAAGTT CCTCTTTTAT CAGTATATGT TCAAGCTGCA AATTTACATT 670 680 690 700 710 720 TATCAGTTTT CAGAGATGTT TCAGTGTTTG GACAAAGGTG GGGATTTGAT GCCGCGACTA 730 740 7 50 7 60 770 780 TCAATAGTCG TTATAATGAT TTAACTAGGC TTATTGGCAA CTATACAGAT CATGCTGTAC 790 800 810 820 8 30 840 GCTGGTACAA TACGGGATTA GAGCGTCTAT GGGGACCGGA TTCTAGAGAT TGGATAAGAT 850 860 870 880 890 900 ATAATCAATT TAGA4GAGAA TTAACACTAA CTGTATTAGA TATCGTTTCT CTATTTCCGA 910 920 930 940 950 960 ACTATGATAG TAGAACGTAT CCAATTCGAA CAGTTTCCCA ATTAACAAGA GAAATTTATA 970 980 990 1000 1010 1020 CAAACCCAGT ATTAGAAAAT TTTGATGGTA GTTTTCGAGG CTCGGCTCAG CGCATAGAAG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GAAGTATTAG GAGTCCACAT TTGATGGATA TACTTAACAG TATAACCATC TATACGGATG

   10:57:48

   -123cr

   1090 1100 1110 1120 1130 1140 CTCATAGAGG AGAATATTAT TGGTCAGGGC ATCAAATAAT GGCTTCTCCT GTAGGCTTTT 1150 1160 1170 1180 1190 1200 CGGGGCCAGA ATTCACTTTT CCGCTATATG GAACTATGGG AAATGCAGCT CCACAACAAC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTATTGTTGC TCAACTAGGT CAGGGCGTGT ATAGAACATT ATCGTCCACT TTATATAGAA .1270 1280 1290 1300 1310 1320 GACCTTTTAA TATAGGGATA AATAATCAAC AACTATCTGT TCTTGACGGG ACAGAATTTG 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CTTATGGAAC CTCCTCAAAT TTGCCATCCG CTGTATACAG AAAAAGCGGA ACGGTAGATT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CGCTGGATGA AATACCGCCA CAGAATAACA ACGTGCCACC TAGGCAAGGA TTTAGTCATC 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GATTAAGCCA TGTTTCAATG TTTCGTTCAG GCTTTAGTAA TAGTAGTGTA AGTATAATAA 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GAGCTCCTAT GTTCTCTTGG ATACATCGTA GTGCTGAATT TAATAATATA ATTCCTTCAT 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CACAAATTAC ACAAATACCT TTAACAAAAT CTACTAATCT TGGCTCTGGA ACTTCTGTCG 1630 1640 1650 1660 1670 1680 TTAAAGGACC AGGATTTACA GGAGGAGATA TTCTTCGAAG AACTTCACCT GGCCAGATTT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 CAACCTTAAG AGTAAATATT ACTGCACCAT TATCACAAAG ATATCGGGTA AGAATTCGCT 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ACGCTTCTAC CACAAATTTA CAATTCCATA CATCAATTGA CGGAAGACCT ATTAATCAGG

   10:57:48

   -124

   1810 1820 1830 1840 1850 1860 GGAATTTTTC AGCAACTATG AGTAGTGGGA GTAATTTACA GTCCGGAAGC TTTACGACTG 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TAGGTTTTAC TACTCCGTTT AACTTTTCAA ATGGATCAAG TGTATTTACG TTAACTGCTC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ATGTCTTCAA TTCAGGCAAT GAAGTTTATA TAGATCGAAT TGAATTTGTT CCGGCAGAAG .1990 2000 2010 2020 2030 2040 TAACCTTTGA GGCAGAATAT GATTTAGAAA GAGCACAAAA GGCGGTGAAT GAGCTGTTTA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CTTCTTCCAA TCAAATCGGG TTAAAAACAG ATGTGACGGA TTATCATATT GATCAAGTAT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 CCAATTTAGT TGAGTGTTTA TCTGATGAAT TTTGTCTGGA TGAAAAAAAA GAATTGTCCG 2170 2180 2190 2200 2210 2220 AGAAAGTCAA ACATGCGAAG CGACTTAGTG ATGACCGGAA TTTACTTCAA GATCCAAACT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 TTAGAGCGAT CAATAGACAA CTAGACCGTG GCTGGAGAGG AAGTACGGAT ATTACCATCC 2290 2 300 2310 2320 2330 2340 AAGGAGCCGA TGACCTATTC AAAGAGAATT ACGTTACGCT ATTGGGTACC TTTGATGAGT 2350 2360 2370 2380 2390 2400 GCTATCCAAC GTATTTATAT CAAAAAATAG ATGAGTCGAA ATTAAAAGCC TATACCCGTT 2410 2420 2430 2440 2450 2460 ACCAATTAAG AGGGTATATC GAAGATAGTC AAGACTTACA AATCTATTTA ATTCGCTACA 2470 2480 2490 2500 2510 2520 ATGCCAAACA CGAAACAGTA AATGTGCCAG GTACGGGTTC CTTATGGCCG CTTTCAGCCC

   10:57:48

   -125

   2530 2540 2550 2560 2570 2580 CAAGTCCAAT CGGAAAATGT GCCCATCATT CCCATCATTT CTCCTTGGAC ATTGATGTTG 2590 2600 2610 2620 2630 2640 GATGTACAGA CTTAAATGAG GACTTAGGTG TATGGGTGAT ATTCAAGATT AAGACGCAAG 2650 2660 2670 2680 2690 2700 ATGGCCATGC AAGACTAGGA AATCTAGAAT TTCTCGAAGA GAAACCATTA GTAGGAGAAG 2710 2720 2730 2740 2750 2760 CACTAGCTCG TGTCAAAAGA CCGGAGAAAA AATGGAGAGA CAAACGTGAA AAATTGGAAT 2770 2780 2790 2800 2810 2820 GGGAAACAAA TATTGTTTAT AAAGAGGCAA AAGAATCTGT AGATGCTTTA TTTGTAAACT 2830 2840 2850 2860 2870 2880 CTCAATATGA TAGATTACAA GCGGATACCA ACATCGCGAT GATTCATGCG GCAGATAAAC 2890 2900 2910 2920 2930 2940 GCGTTCATAG CATTCGAGAA GCTTATCTGC CTGAGCTGTC TGTGATTCCG GGTGTCAATG 2950 2960 2970 2980 2990 3000 CGGCTATTTT TGAAGAATTA GAAGGGCGTA TTTTCACTGC ATTCTCCCTA TATGATGCGA 3010 3020 3030 3040 3050 3060 GAAATGTCAT TAAAAATCGT GATTTTAATA ATGGCTTATC CTGCTGGAAC GTGAAAGGGC 3070 3080 3090 3100 3110 3120 ATGTAGATGT AGAAGAACAA AAC.AACCACC GTTCGGTCCT TGTTGTTCCG GAATGGGAAG 3130 3140 3150 3160 3170 3180 CAGAAGTGTC ACAAGAAGTT CGTGTCTGTC CGGGTCGTGG CTATATCCTT CGTGTCACAG 3190 3200 3210 3220 3230 3240 CGTACAAGGA GGGATATGGA GAAGGTTGCG TAACCATTCA TGAGATCGAG AACAATACAG

   10:57:48

   -126

   3250 3260 3270 3280 3290 3300 ACGAACTGAA GTTTAGCAAC TGTCTAGAAG AGGAAGTATA TCCAAACAAC ACGGTAACGT 3310 3320 3330 3340 3350 3360 GTAATGATTA TACTGCGACT CAAGAAGAAT ATGAGGGTAC GTACACTTCT CGTAATCGAG 3370 3380 3390 3400 3410 3420 GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT CTGTACCAGC TCATTATGCA TCAGCCTATG 3430 3440 3450 3460 3470 3480 AAGAAAAAGC ATATACAGAT GGACGAAGAG ACAATCCTTG TGAATCTAAC AGAGGATATG 3490 3500 3510 3520 3530 3540 GGGATTACAC ACCACTACCA GCTGGCTATG TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA 3550 3560 3570 3580 3590 3600 CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAAC ATTCATCGTG GACAGCGTGG 3610 3620 3630 3640 3650 3660 AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC TTTATAATGT AAGGTGTGCA AATAAAGAAT 3670 3680 3690 3700 3710 3720 GATTACTGAC TTGTATTGAC AGATAAATAA GGAAATTTTT ATATGAATAA AAAACGGGCA 3730 3740 3750 3760 3770 3780 TCACTCTTAA AAGAATGATG TCCGTTTTTT GTATGATTTA ACGAGTGATA TTTAAATGTT 3790 3800 3810 3820 3830 3840 TTTTTTGCGA AGGCTTTACT TAACGGGGTA CCGCCACATG CCCATCAACT TAAGAATTTG 3850 3860 3870 3880 3890 3900 CACTACCCCC AAGTGTCAAA AAACGTTATT CTTTCTAAAA AGCTAGCTAG AAAGGATGAC 3910 3920 3930 3940 3950 3960 ATTTTTTATG AATCTTTCAA TTCAAGATGA ATTACAACTA TTTTCTGAAG AGCTGTATCG

   10:57:48

   -127

   3970

   TCATTTAACC

   4030

   ACGAAAGTTT

   4090

   GAGTGATTCT

   4150

   CCAGAAGGAC

   4210

   TCTGCATTAT

   4270

   TATTTTCAAC

   4330

   CATGTATAIC

   3980 3990 4000 4010 4020 CCTTCTCTTT TGGAAGAACT CCCTAAAGAA TTAGGTTTTG TAAAAAGAAA 4040 4050 4060 4070 4080 TCAGGAAATG AATTAGCTAC CATATCTATC TGGGGCAGTC AACGTACAGC 4100 4110 4120 4130 4140 CTCGTTCGAC TATGCAGTCA ATTACACGCC GCCACAGCAC TCTTATGAGT 4160 4170 4180 4190 4200 TCAATAAACG CTTTGATAAA AAAGCGGTTG AATTTTTGAA ATATATTTTT 4220 4230 4240 4250 4260 GGAAAAGTAA ACTTTGTAAA ACATCAGCCA TTTCAAGTGC AGCACTCACG 4280 4290 4 300 4310 4320 GAATCCCTAT TTTAGATCCG ACGATTTTCC AAGTACCGAA ACATTTAGCA 4340 4350 4360 CTGGGTCAGG TCGTTGTGCA CAAACTCCAG

   10:57:48

   -1284 Λ ^-^=2====^=^

   496. - Vectores bifuncionais, caracterizado por além de serem capazes de se replicarem em B. thuringiensis ou na espécie próxima B. cereus, ou em ambas, são capazes de se replicarem em pelo meros um ou mais sistemas hospedeiros heterólogos.

   509. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 49, caracterizados por os referidos organismos hospedeiros heterólogos serem

   a) organismos procarióticos seleccionados do grupo constituído pelos géneros Bacillus, Staphylococcus, Streptomyces , Pseudotnonas , Escher ichia, Agrobacterium , Salmonella , Erwinia, etc.

   b) organismos eucarióticos seleccionados do grupo constituído por leveduras, células animais e vegetais, etc.

   51a. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 50, caracterizados por o referido organismo hospedeiro heterólogo ser E. coli.

   529. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 49, caracterizados por os referidos vectores funcionais serem compostos por DNA de plasmídeo de origem homóloga ou heteróloga que codifica pelo menos parcialmente funções necessárias à replicação e selecção em B. thuringiensis ou na espécie próxima B. cereus, ou em ambas, e também em pelo menos um ou mais organismos hospedeiros heterólogos .

   10:57:48

   -129535. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por os referidos vectores bifuncionais serem compostos por DNA de plasmídeo de origem puramente heteróloga.

   545. - Vectores bifuncionais de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 e 53, caracterizados por

   a) o referido DNA de plasmídeo homólogo ser DNA que ocorre naturalmente em Bacillus thuringiensis ou em B. cereus ou em ambos ou como alternativa é substancialmente homólogo dele,

   b) o referido DNA de plasmídeo heterólogo ser DNA que ocorre naturalmente em b^) organismos procarióticos seleccionados do grupo constituído pelos géneros Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Pseudomonas, Escherichia, Agrobacterium Salmonella, Erwinia, etc., b^) organismos eucarióticos seleccionados do grupo cons tituído por levedura, células animais e vegetais, etc., ou ser substancialmente homólogo dele.

   555. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por o referido DNA de plasmídeo heterólogo ser um DNA que ocorre naturalmente em E. coli ou ser substancialmente homólogo dele.

   56â. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 49, caracterizados por conterem um ou mais genes na forma expressável, ou outras sequências de

   10:57:48

   -130-

   DNA útil além das funções essenciais à replicação e selecção em sistemas hospedeiros homólogos e heterólogos.

   57a. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 56, caracterizados por os referidos genes ou sequências de DNA útil serem de origem homóloga, heteróloga ou sintética ou como alternativa consistem numa combinação dos referidos genes ou sequências de DNA.

   58â. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 56 , caracterizados por os referidos genes consistirem num ou mais genes estruturais e em sequências reguladoras delimitantes 3' e 5' capazes de funcionarem em B. thuringiensis ou em B. cereus ou em ambos, sequências estas que estão operacionalmente ligadas ao gene ou genes estruturais e assim asseguram a expressão do referido gene ou genes estruturais em B. thuringiensis ou B. cereus- ou em ambos

   59â. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 58, caracterizados por as referidas sequências reguladoras serem sinais de expressão que incluem sequências de promotores e de terminadores assim como outras sequências reguladores de regiões 3' e 5' não traduzidas .

   60ã. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 59, caracterizados por os referidos sinais de expressão ocorrerem naturalmente em B. thuringiensis ou em B. cereus ou em ambos ou serem mutantes e varian tes destes sinais de expressão naturais que são substancialmente homólogos da sequência natural.

   10:57:48

   -131-

   613. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por os referidos sinais de expressão incluírem um promotor dependente da esporulação de B. thuringiensis.

   62ã. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por o referido gene estrutural codificar um polipeptídeo de ^-endotoxina que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou um polipeptídeo substancialmente homólogo dele, ou seja gue pelo menos tem substancialmente as propriedades de toxicidade de um polipeptídeo de ^-endotoxina cristalina de B. thuringiensis.

   63â. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por o referido gene estrutural ser uma sequência de DNA codificadora de $-endotoxina que ocorre naturalmente em B. thuringiensis ou como alternativo ser uma variante de uma sequência de DNA natural que é pelo menos substâncialmente homólogo da correspondente sequência natural.

   64ã. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por o referido polipeptídeo ser substâncialmente homólogo de um polipeptídeo de J-endotoxina de uma sub-espécie adequada de B. thuringiensis , seleccionada do grupo constituído por kurstaki, berliner alesti, sotto, tolworthi, dendrolimus, tenebrionis e israelen sis.

   65â. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora da J-endotoxina ser substancialmente homóloga de pelo menos parte ou partes da sequência

   10:57:48

   -132- natural que é(são) responsável{eis) pela actividade insectici da.

   663. - Vectores bifuncionais de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora de £-endotoxina serem fragmento de DNA de B. thuringiensis var kurstaki HD1 situada entre os nucleotídeos 156 e 3623 na fórmula I ou ser qualquer fragmento de DNA mais curto que ainda codifica um polipeptídeo tendo propriedades de tóxic-insectos.

   10:57:48

   -133-

   Fórmula I 10 20 30 GTTAACACCC TGGGTCAAAA ATTGATATTT 70 80 90 TCATAAGATG AGTCATATGT TTTAAATTGT 130 140 150 AATTGGTATC TTAATAAAAC AGATGGAGGT

   40 50 60

   AGTAAAATTA GTTGCACTTT GTGCATTTTT

   100 110 120 AGTAATG.AAA AACAGTATTA TATCATAATG

   160 170 180

   AACTTATGGA TAACAATCCG AACATCAATG

   190 200 210 220 230 240 AATGCATTCC TTATAATTGT TTAAGTAACC CTGAAGTAGA AGTATTAGGT GGAGAAAGAA 250 260 270 280 290 300 TAGAAACTGG TTACACCCCA ATCGATATTT CCTTGTCGCT AACGCAATTT CTTTTGAGTG

   10:57:48

   -134

   310 320 330 340 350 360 AATTTGTTCC CGGTGCTGGA TTTGTGTTAG GACTAGTTGA TATAATATGG GGAATTTTTG 370 380 390 400 410 420 GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAATTGAACA GTTAATTAAC CAAAGAATAG 430 440 450 460 470 480 AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA 490 500 510 520 530 540 TTTACGCAGA ATCTTTTAGA GAGTGGGAAG CAGATCCTAC TAATCCAGCA TTAAGAGAAG 550 560 570 580 590 600 AGATGCGTAT TCAATTCAAT GACATGAACA GTGCCCTTAC AACCGCTATT CCTCTTTTTG 610 620 630 640 6 50 660 CAGTTCAAAA TTATCAAGTT CCTCTTTTAT CAGTATATGT TCAAGCTGCA AATTTACATT 670 680 690 700 710 720 TATCAGTTTT GAGAGATGTT TCAGTGTTTG GACAAAGGTG GGGATTTGAT GCCGCGACTA 7 30 740 750 760 770 780 TCAATAGTCG TTATAATGAT TTAACTAGGC TTATTGGCAA CTATACAGAT CATGCTGTAC 790 800 810 820 830 840 GCTGGTACAA TACGGGATTA GAGCGTGTAT GGGGACCGGA TTCTAGAGAT TGGATAAGAT 850 860 870 880 890 900 ATAATCAATT TAGAAGAGAA TTAACACTAA CTGTATTAGA TATCGTTTCT CTATTTCCGA 910 920 930 940 950 960 ACTATGATAG TAGAACGTAT CCAATTCGAA CAGTTTCCCA ATTAACAAGA GAAATTTATA 970 980 990 1000 1010 1020 CAAACCCAGT ATTAGAAAAT TTTGATGGTA GTTTTCGACG CTCGGCTCAG GGCATAGAAG

   10:57:48

   -135

   1030 1040 1050 1060 1070 1080 GAAGTATTAG GAGTCCACAT TTGATGGATA TACTTAACAG TATAACCATC TATACGGATG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CTCATAGAGG AGAATATTAT TCGTCAGGGC ATCAAATAAT GGCTTCTCCT GTAGGGTTTT 1150 1160 1170 1180 1190 1200 CGGGGCCAGA ATTCACTTTT CCGCTATATG GAACTATGGG AAATGCAGCT CCACAACAAC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTATTGTTGC TCAACTAGGT CAGGGCGTGT ATAGAACATT ATCGTCCACT TTATATAGAA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 GACCTTTTAA TATAGGGATA AATAATCAAC AACTATCTGT TCTTGACGGG ACAGAATTTG 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CTTATGGAAC CTCCTCAAAT TTGCCATCCG CTGTATACAG AAAAAGCGGA ACGGTAGATT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CGCTGGATGA AATACCGCCA CAGAATAACA ACGTGCCACC TAGGCAAGGA TTTAGTCATC 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GATTAAGCCA TCTTTCAATG TTTCGTTCAG GCTTTAGTAA TAGTAGTGTA AGTATAATAA 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GAGCTCCTAT GTTCTCTTGG ATACATCGTA GTGCTGAATT TAATAATATA ATTCCTTCAT 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CACAAATTAC ACAAATACCT TTAACAAAAT CTACTAATCT TGGCTCTGGA ACTTCTGTCG 1630 1640 1650 1660 1670 1680 TTAAAGGACC AGGATTTACA GGAGGAGATA TTCTTCGAAG AACTTCACCT GGCCAGATTT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 CAACCTTAAG AGTAAATATT ACTGCACCAT TATCACAAAG ATATCGGGTA AGAATTCGCT

   10:57:48

   -136-

   1750 1760 1770 1780 1790 1800 ACGCTTCTAC CACAAATTTA CAATTCCATA CATCAATTGA CGGAAGACCT ATTAATCAGG 1810 1820 1830 1840 1850 1860 GGAATTTTTC AGCAACTATG AGTAGTGGGA GTAATTTACA GTCCGGAAGC TTTAGGACTG 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TAGGTTTTAC TACTCCCTTT AACTTTTCAA ATGGATCAAG TGTATTTACG TTAAGTGCTC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ATGTCTTCAA TTCAGGCAAT GAAGTTTATA TAGATCGAAT TGAATTTGTT CCGGCAGAAG 1990 2000 2010 2020 2030 2040 TAACCTTTGA GGCAGAATAT GATTTAGAAA GAGCACAAAA GGCGGTGAAT GAGCTGTTTA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CTTCTTCCAA TCAAATCGGG TTAAAAACAG ATGTCACGGA TTATCATATT GATCAAGTAT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 CCAATTTAGT TGAGTGTTTA TCTGATGAAT TTTGTCTGGA TCAAAAAAAA GAATTGTCCG 2170 2180 2190 2200 2210 2220 AGAAAGTCAA ACATGCGAAG CGACTTAGTG ATGAGCGGAA TTTACT.TCAA GATCCAAACT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 TTAGAGGGAT CAATAGACAA CTAGACCGTG GCTGGAGAGG AAGTACGGAT ATTACCATCC 2290 2300 2310 2320 2330 2340 AAGGAGGCGA TGACGTATTC AAAGAGAATT ACGTTACGCT ATTGGGTACC TTTGATGAGT 2350 2360 2370 2380 2390 2400 GCTATCCAAC GTATTTATAT CAAAAAATAG ATGAGTCGAA ATTAAAAGCC TATACCCGTT 2410 2420 2430 2440 2450 2460 ACCAATTAAG AGGGTATATC GAAGATAGTC AAGACTTAGA AATCTATTTA ATTCGCTACA

   10:57:48

   2470 2480 2490 2 500 2510 2520 ATGCCAAACA CGAAACAGTA AATGTGCCAG GTACCGGTTC CTTATGGCCG CTTTCAGCCC 2530 2540 2550 2560 2570 2580 CAAGTCCAAT CGGAAAATGT GCCCATCATT CCCATCATTT CTCCTTCCAC ATTGATGTTG 2590 2600 2610 2620 2630 2640 GATGTACAGA CTTAAATGAG GACTTAGGTG TATGGGTGAT ATTCAAGATT AAGACGCAAG 2650 2660 2670 2680 2690 2700 ATGGCCATGC AAGACTAGGA AATCTAGAAT TTCTCGAAGA GAAACCATTA GTAGGAGAAG 2710 2720 2730 2740 2750 2 760 CACTAGCTCG TGTGAAAAGA GCGGAGAAAA AATGGAGAGA CAAACGTGAA AAATTCGAAT 2770 2780 2790 2800 2810 2820 GGGAAACAAA TATTGTTTAT AAAGAGGCAA AAGAATCTGT AGATGCTTTA TTTGTAAACT 2830 2840 2850 2860 2870 2880 CTCAATATGA TAGATTACAA GCGGATACCA ACATCGCGAT GATTCATGCG GCAGATAAAC 2890 2900 2910 2920 2930 2940 GCGTTCATAG CATTCGAGAA GCTTATCTGC CTGAGCTGTC TGTGATTCCG GGTGTCAATG 2950 2960 2970 2980 2990 3000 CGGCTATTTT TGAAGAATTA GAAGGGCGTA TTTTCACTGC ATTCTCCCTA TATGATGCGA 3010 3020 3030 3040 3050 3060 GAAATGTCAT TAAAAATGGT GATTTTAATA ATGGCTTATC CTGCTGGAAC GTGAAAGGGC 3070 3080 3090 3100 3110 3120 ATGTAGATGT AGAAGAACAA AACAACCACC GTTCGGTCCT TGTTGTTCCG GAATCGCAAG 3130 3140 3150 3160 3170 3180 CAGAAGTGTC ACAAGAACTT CGTGTCTGTC CGCGTCGTGG CTATATCCTT CGTGTCACAG

   ns~

   3190 3200 3210 3220 3230 3240 CGTACAAGGA GGGATATGGA GAACGTTGCG TAACCATTCA TGAGATCGAG AACAATACAG 3250 3260 3270 3280 3290 3300 ACGAACTGAA GTTTAGCAAC TGTGTAGAAG AGGAAGTATA TCCAAACAAC ACGGTAACGT 3310 3320 3330 3340 3350 3360 GTAATGATTA TACTGCGACT CAAGAAGAAT ATGAGGGTAC GTACACTTCT CGTAATCGAG 3370 3380 3390 3400 3410 3420 GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT CTCTACCAGC TGATTATGCA TCAGCCTATG 34 30 3440 3450 3460 34 70 3480 AAGAAAAAGC ATATACAGAT GGACGAAGAG ACAATCCTTG TGAATCTAAC AGAGGATATG 3490 3500 3510 3520 3530 3540 GGGATTACAC ACCACTACCA GCTGGCTATG TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA 3550 3560 3570 3580 3590 3600 CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAAC ATTCATCGTG CACAGCGTGG 3610 3620 3630 3640 3650 3660 AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC TTTATAATGT AAGGTGTGCA AATAAAGAAT 3670 3680 3690 3700 3710 3720 GATTACTGAC TTGTATTGAC ACATAAATAA GGAAATTTTT ATATGAATAA AAAACCGGCA 3730 3740 3750 3760 3770 3780 TCACTCTTAA AAGAATGATG TCCGTTTTTT GTATCATTTA ACGAGTGATA TTTAAATGTT 3790 3800 3810 3820 3830 3840 TTTTTTGCGA AGGCTTTACT TAACGGGGTA CCGCCACATG CCCATCAACT TAAGAATTTG 3850 3860 3870 3880 3890 3900 CACTACCCCC AAGTGTCAAA AAACGTTATT CTTTCTAAAA AGCTAGCTAG AAAGCATGAC

   10:57:48

   -139

   3910 3920 3930 3940 3950 3960 ATTTTTTATG AATCTTTCAA TTCAAGATGA ATTACAACTA TTTTCTGAAG AGCTGTATCG 3970 3980 3990 4000 4010 4020 TCATTTAACC CCTTCTCTTT TGGAAGAACT CGCTAAAGAA TTAGGTTTTG TAAAAAGAAA 4030 4040 4050 4060 4070 4080 ACGAAAGTTT TCAGGAAATG AATTAGCTAC CATATGTATC TGGGGCAGTC AACGTACAGC 4090 4100 4110 4120 4130 4140 GAGTGATTCT CTCGTTCGAC TATGCAGTCA ATTACACGCC GCCACAGCAC TCTTATGAGT 4150 4160 4170 4180 4190 4200 CCAGAAGGAC TCAATAAACG CTTTGATAAA AAAGCGGTTG AATTTTTGAA ATATATTTTT 4210 4220 4230 4240 4250 4260 TCTGCATTAT GGAAAAGTAA ACTTTCTAAA ACATCAGCCA TTTCAAGTGC AGCACTCACG 4270 4280 4290 4300 4310 4320 TATTTTCAAC GAATCCGTAT TTTAGATGCG ACGATTTTCC AAGTACCGAA ACATTTAGCA 4330 4340 4350 4360 CATGTATATC CTGGGTCAGG TGGTTGTGCA CAAACTGCAG

   10:57:48

   -140-

   673. - Vector bifuncional caracterizado por ser preparado de acordo com um dos processos de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 48.

   683. - Vector funcional pX161 (pk61), caracterizado por ser introduzido em B. thuringiensis ver, Kurstaki HDlcryB (DSM 4572) por transformação.

   693. - Vector funcional pXi93(pk93) caracterizado por ser introduzido em B. thuringiensis ver Kurstaki HDlcryB (DSM 4571) e B. cereus 569k(DSM 4573) por transformação.

   703. - Célula hospedeira caracterizada por conter um vector bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69.

   713. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 70, caracterizada por ser um microorganismo.

   723. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por ser uma bactéria.

   73â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por ser E. coli.

   74â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por ser B. thuringiensis ou B. cereus.

   10:57:48

   -141-

   755. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por ser uma célula eucariótica seleccionada do grupo constituído por leveduras e células animais e vegetais.

   765. - B. thuringiensis, caracterizado por ser transformado com um vector bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69.

   775. - B. thuringiensis, Var

   Kurstaki HDlcryB, caracterizado por ser transformado com um vector bifuncional de acordo com a reivindicação 66.

   785. - B. thuringiensis Vai' Kurstaki HDlcryB, caracterizado por o vector bifuncional pX161 (pk61) e depositado com o número DSM 4572.

   795. - B. thuringiensis Var

   Kurstaki HDlcryB, caracterizado por ser transformado com o vector bifuncional pX193(pk93) e depositado com o número DSM 4571.

   805. - B. cereus, caracterizado por ser transformado com um vector bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69.

   815. - 13, cereus 569k, caracterizado por ser transformado com um vector bifuncional pXl93(pK93) e depositado com o número DSM 4573.

   10:57:48

   -14282ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por se utilizar vectores bifuncionais de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69 para a transformação de E3. thuringiensis ou B. cereus ou ambos.

   83a. - Processo de acordo com a reivindicação 82, caracterizado por B. thuringiensis Var. Kurstaki HDlcryB ser transformado com um vector bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69.

   84ã. - Método para o controlo de insectos caracterizado por compreender o tratamento de insectos ou do seu locus

   a) com células de B_. thuringiensis ou £R cereus ou com uma mistura dos dois, que foram transformadas com uma molécula de DNA recombinante contendo um gene estrutural que codifica um polipeptídeo de -endotoxina natural em B. thuringiensis ou um polipeptídeo substâncialmente homólogo; ou como alternativa

   b) com uma preparação acelular de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células de Bacillus transformados.

   85ê. - Método de acordo com a reivindicação 84, caracterizado por compreender a utilização de misturas insecticidas consistindo em células vivas ou mortas de B. thuringiensis e/ou 13. cereus de acordo com a secção e preparações acelulares de corpos cristalinos contendo numa protoxina que é produzida pelas referidas células de Bacillus, de acordo com a secção b).

   10:57:48

   -143869. - Método para o controlo de insectos caracterizado por compreender o tratamento de insectos ou do seu locus

   a) com células de B^. thuringiensis ou de B. cereus, ou com uma mistura das duas, que foram transformadas com um vector bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 69; ou como alternativa

   b) com uma preparação acelular de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células de Bacillus transformados.

   879. - Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado per compreender a utilização de misturas insecticidas consistindo em células transformadas mortas ou vivas de B. thuringiensis e/ou B. cereus de acordo com a secção a) e preparações acelulares de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células de Bacillus transformadas, de acordo com a secção b).

   889. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 87, caracterizado por os insectos serem insectos das ordens Lepidoptera, Diftera ou Coleoptera.

   899. - Método de acordo com a reivindicação 88, caracterizado por os insectos serem insectos da ordem Lepidoptera.

   909. - Processo para a preparação de uma composição para o controlo de insectos, caracterizado por se incluir na referida composição:

   10:57:48

   -144-

   a) células de B. thuringiensis ou de 13, cereus ou uma mistura das referidas células de Bacillus que foram transformadas com uma molécula de DNA recombinante contendo um gene estrutural que codifica um polipeptídeo de -endotoxina que ocorre naturalmente em B, thuringiensis ou um polipeptídeo substancialmente homólogo dele; ou como alternativa

   b) preparações acelulares de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células transformadas de Bacillus, juntamente com veículos, agentes dispersantes ou veículos e agentes dispersantes convencionalmente empregues.

   915, _ Processo de acordo com a reivindicação 90, caracterizado por se preparar uma composição para o controlo de insectos contendo misturas insecticidas cosistindo em células transformadas vivas ou mortas de 13. thuringiensis e/ou B. cereus de acordo com a secção a) preparações acelulares de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células transformadas de Bacillus, de acordo com a secção b) juntamente com veículos, agentes dispersantes ou veículos e agentes dispersantes convencionalmente empregues.

   925. - Processo para a preparação de uma composição para o controlo de insectos, caracterizado por se incluir na referida composição:

   a) Células de B. thuringiensis ou B. cereus ou uma mistura das referidas células de Bacillus que foram transformadas com um vector bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 54; ou como alternativa

   b) Uma preparação acelular de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas célu10:57:48

   -145- las transformadas de Bacillus, juntamente com veículos, agentes dispersantes ou veículos e agentes dispersantes convencio nalmente empregues.

   93ã. - Processo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado por se preparar uma composição para o controlo de insectos contendo misturas insecticidas consistindo em células transformadas mortas ou vivas de 13. thuringiensis e/ou B. cereus de acordo com a secção a) e preparações acelulares de corpos cristalinos contendo uma protoxina que é produzida pelas referidas células de Bacillus transformadas, de acordo com a secção b), juntamente com veículos, agentes dispersantes ou veículos e agentes dispersantes convencionalmente empregues.

   945. - Processo para a inserção, clonagem e expressão de genes em Bacillus thuringiensis carac terizado por compreender:

   a) isolamento dos referidos genes;

   b) caso se pretenda ligação operacional dos genes iso lados a sequências de expressão que são capazes de funcionar em Bacillus thuringiensis;

   c) introdução de construções genéticas da secção b) em células de Bacillus thuringiensis por transformação usando vectores adequados; e

   d) caso se pretenda expressão de um produto do gene correspondente e, caso se pretenda, seu isolamento.

   10:57:48

   -146-J

   955. - Processo para a inserção, clonagem e expressão de genes ém Bacillus cereus caracterizado por compreender:

   a) isolamento dos referidos genes;

   b) caso se pretenda, ligação operacional dos genes isolados a sequências de expressão que são capazes de funcionar em Bacillus cereus;

   c) introdução de construções genéticas da secção b) em células de Bacillus cereus por transformação usando vectores adequados; e

   d) caso se pretenda expressão de um produto do gene correspondente e, caso se pretenda, seu isolamento.

   965. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 e 95, caracterizado por o referido gene ser um gene de protoxina de Bacillus thuringiensis.

   975. - Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 94 e 95, caracterizado por as referidas sequências de expressão incluírem um promotor dependente da esporulação de Bacillus thuringiensis.

   985. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 e 95, caracterizado por serem usados vectores de clonagem directa.

   10:57:48

   -147993. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 e 95, caracterizado por serem usados vectores bifuncionais (vai-vem).

   1003. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 e 95^' caracterizado por um lugar dos genes serem inseridas outras sequências de DNA úteis nas células de Bacillus e aí clonados.

   1013. - Processo para a clonagem directa, expressão e identificação de novos genes ou outras sequências de DNA úteis em Bacillus thuringiensis caracterizado por compreender:

   a) digestão do DNA total de Bacillus thuringiensis usando enzimas de restrição adequadas;

   b) isolamento de entre os fragmentos de restrição resultantes, aqueles de tamanho adequado;

   c) inserção dos referidos fragmentos num vector adequado ;

   d) transformação de células de Bacillus thuringiensis com o referido vector; e

   e) isolamento de novas sequências de DNA a partir dos transformantes-por meio de processos de despiste adequados .

   1023. - Processo para aclonagem directa, expressão e identificação de novos genes ou outras sequências de DNA úteis em Bacillus cereus, caracterizado por compreender:

   10:57:48

   -148-

   a) digestão do DNA total de Bacillus thuringiensis usando enzimas de restrição adequado;

   b) isolamento a partir dos fragmentos de restrição resultantes daqueles que possuem tamanho adequado;

   c) inserção dos referidos fragmentos num vector adequado ;

   d) transformação de células de Bacillus cereus com o referido vector; e

   e) localização de 3 novas sequências de DNA por meio de processos de despiste adequados, e, caso se pretenda, seu isolamento a partir dos transformantes.

   1035. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 102, caracterizado por o referido novo gene ser um gene de protoxina.

   104a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 e 102, caracterizado por serem usados os vectores de cloeagem directa.

   1055. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 e 102, caracterizado por serem usados os vectores vai-vem.

   106ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 e 102, caracterizado por ser usado um processo de despiste imunológico para localizar as novas sequências de DNA.

   10:57:48

   -149107â. - Processo para a clonagem e expressão de DNA homólogo e, especialmente também de DNA heterólogo ou uma combinação, de DNA homólogo e heterólogo, caracterizado por se utilizar a B. thuringiensis e/ou B. cereus como organismos hospedeiros gerais.