DE102008005193A1

DE102008005193A1 - Bakteriophagenpräparation und Verwendung

Info

Publication number: DE102008005193A1
Application number: DE102008005193A
Authority: DE
Original assignee: INNOVATIONS TRANSFER UPHOFF GM; Innovations-Transfer Uphoff &cokg GmbH
Current assignee: INNOVATIONS TRANSFER UPHOFF GM; Innovations-Transfer Uphoff &cokg GmbH
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2009-07-23
Also published as: EP2234497A2; US20100291041A1; JP2011509964A; CA2740010A1; WO2009090082A3; WO2009090082A2

Abstract

Die Erfindung zeigt eine Bakteriophagenpräparation mit mindestens einem gegen mindestens einen Bakterienstamm spezifisch wirksamen Bakteriophagen in alkalischer Pufferlösung in Kombination mit mindestens einem oberflächenaktiven Mittel. Weiter zeigt die Erfindung die Verwendung einer solchen Bakteriophagenpräparation zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere für therapeutische, präventive und desinfizierende aktibakterielle Anwendung. Schließlich zeigt die Erfindung ein Desinfektionsverfahren unter Verwendung der Bakteriophagenpräparation mit niederfrequentem Ultraschall.

Description

Die Erfindung betrifft eine Bakteriophagenpräparation gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 sowie verschiedene Verwendungen derselben.
Die EP 0 414 304 B1 beschreibt eine Bakteriophagenpräparation aus einer wässrigen Zusammensetzung von mindestens 100 Teilchen/ml einer zur Lyse eines oder mehrerer Typen von Bakterien fähigen Bakteriophagen, einem nichtionischen Tensid und einem neutralen Salz. Die Bakteriophagen haben die bekannte Wirkung, bestimmte gegen Antibiotika resistente Bakterien zu lysieren. Das Tensid als oberflächenaktive Substanz dient dazu, die Benetzung der zu behandelnden Oberfläche zu verbessern sowie Schmutz zu solubisieren und zu entfernen. Das neutrale Salz, primär 0,01 bis 2,0 Gewichts% Natriumchlorid, soll dabei die Lagerstabilität verbessern.
Diese Zusammensetzung soll als Zahncreme, Mundwasser, Haushaltsreiniger gegen Haushaltsbakterien (z. B. in Toilettenschüsseln) und als Hautpflegemittel gegen pathogene Hautbakterien verwendet werden. Als mögliche weitere Zusatzstoffe werden phagenverträgliche Duftstoffe, Aromen, Lösungsmittel, Farbstoffe, Konservierungsstoffe, Bakterizide, Adsorbentien, Füllstoffe und andere Additive vorgeschlagen, welche gewöhnlich für eine bestimmte Anwendung verwendet werden.
Weiterhin ist aus EP 0 700 249 B1 und DE 100 12 026 bekannt, dass Polyhexamethylbiguanid (Polyhexanid) als kationisches Tensid eine hohe, antiseptisch nutzbare Wirksamkeit bei gleichzeitig geringer Toxizität aufweist. Auf dieser Grundlage wurde im Markt mit diesem Wirkstoff eine Vielzahl von Applikationen entwickelt, jedoch bereits in der EP 0 700 249 B1 wurde dargelegt, dass Polyhexanid gegenüber bestimmten Bakterien (speziell Pseudomonas aeruginosa) eine um nahezu Faktor 10 geringere Wirkung aufweist, im Vergleich z. B. zu Staphylococcus aureus.
Auch ist bereits in EP 0 700 249 B1 ausführliche anhand von Beispielen beschrieben, dass z. B. bei der Anwendung von Polyhexanid in Wunden ein erheblicher Wirkungsverlust eintreten kann, der durch das dort vorhandene Albumin bedingt ist; eigene mikrobiologische Untersuchungen zur Albuminwirkung bestätigen einen Wirkungsverlust um den Faktor von ca. 10. Im Unterschied zu Polyhexanid zeigen aktuelle Untersuchungen [Vautz D. et al.: Lytische Wirksamkeit von MRSA-spezifischen Phagen gegenüber den 41 definierten nationalen Referenzstämmen sowie 143 klinischen MRSA-Isolaten. ZfW (2007) 5: 280–287], dass Albumin (Bovines Serum-Albumin, BSA) bei mit Bakteriophagen sogar eine Erhöhung der lytischen Aktivität um > 1 bis > 3 log schen Aktivität um > 1 bis > 3 log-Stufen bei vergleichbaren E/T-Verhältnissen und Ausgangsbakterienkonzentrationen bewirkte.
Die gram-negative Spezies Pseudomonas, besonders Pseudomonas aeruginosa, ist die Ursache für Infektionen bei Menschen und Tieren. Staphylokokken als gram-positive Bakterien besiedeln den Menschen in Abhängigkeit von der Beschaffenheit seiner Haut zu 20% bei gesunder Haut und bis zu 100% bei vorgeschädigter Haut wie z. B. atopischer Dermatitis oder insbesondere dem Vorliegen von Wunden. Weiterhin gehören Staphylokokken zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen.
Krankenhausinfektionen (nosokomialer Infektionen) machen einen Großteil aller im Hospital auftretenden Komplikationen aus und haben daher einen signifikanten Einfluss auf die Qualität der medizinischen und krankenpflegerischen Versorgung der Patienten. Die häufigsten Arten nosokomialer Infektionen auf der Intensivstation sind die beatmungs-assoziierte Pneumonie, intraabdominelle Infektionen nach einem Trauma oder nach chirurgischen Eingriffen und Bakteriämien durch intravasale Fremdkörper.
Das Vorkommen von Stämmen mit Resistenz gegenüber üblicherweise eingesetzten Antibiotika hat daher im Zusammenhang mit Pneumonien und Sepsis, dem Befall von Implantaten und von Wunden mit diesem Bakterium eine besondere Brisanz.
Bei Methicilin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) handelt es sich um den bedeutendsten Erreger nosokomialer Infektionen, dessen Häufigkeit seit dem ersten Auf treten im Jahr 1963 weltweit angestiegen ist und in Europa, einige Stämme auch weltweit, Verbreitung erfahren haben. In Deutschland gab es von 1995 bis 2001 einen Anstieg von ^~8% auf ^~20% des Anteils von MRSA an allen S.-aureus-Isolaten. Dabei variiert die MRSA-Häufigkeit in Deutschland je nach Erhebung (EARSS; PEG; GENARS; SARI; KISS) und insbesondere bei verschiedenen Krankenhäusern sowie innerhalb eines Krankenhauses je nach Risikobereich von 0 bis 35%, in Einzelfällen bis zu 60%. Intensivmedizinisch-chirurgische Stationen stehen dabei im Vordergrund und die höhere Mortalität durch MRSA-Infektionen ist belegt [Melzer M et al., Clin Infect Dis 2003; 37: 1453–1460]. Weiterhin treten außerhalb der Krankenhäuser sog. Community acquired MRSA (cMRSA) auf, welche mit Pathogenitätseigenschaften wie nekrotisierenden Haut-Weichteilinfektionen und nekrotisierender Pneumonie assoziiert sind und sich vom Genotyp her grundsätzlich von den epidemischen nosokomialen MRSA unterscheiden. Seit den 1980er Jahren treten kontinuierlich klonale MRSA-Linien mit Resistenzen gegen Makrolide und Linkosamidine, Gentamicin und z. T. gegen Oxytetrazyklin auf. Nosokomial in Krankenhäusern verbreitete MRSA sind heute zu mehr als 90% resistent gegen Fluorchinolone, so dass deren therapeutischer Einsatz die nicht-resistenten Staphylococcus aureus eliminiert und so einen Risikofaktor für die umfassende Besiedelung mit MRSA darstellt. Gegen Quinupristin/Dalfopristin waren 0,05% der untersuchten Isolate resistent. Während bisher alle vom NRZ für Staphylokokken aus Deutschland untersuchten MRSA gegen Linezolid empfindlich waren, ist auch für diesen Wirkstoff die Resistenzentwicklung absehbar. MRSA mit verminderter Empfindlichkeit gegen Glykopeptide (GISA) sind in Deutschland noch selten, ebenso Resistenzen gegen die möglichen Kombinationspartner der Glykopeptide (Rifampicin) etwa 2%, Fusidinsäure-Natrium etwa 2,5%). Jedoch ist unter den Bedingungen des weiterhin anhaltenden Selektionsdrucks durch Glykopeptidantibiotika zu erwarten, dass sich auch MRSA mit Resi stenzen gegenüber Glykopeptiden (GISA-Phänotyp) zunehmend verbreiten werden.
Weitere multiresistente Bakterienstämme, die an Krankenhausinfektionen beteiligt sind, sind Vancomycinintermediär-sensible Staphylococcus aureus (VISA)-Stämme, Vancomycin-resistente Staphylococcus aureus (VRSA)-Stämme, Vancomycin/Glykopeptid-resistente Enterokokken (VRE, GRE), Penicillin-resistente Pneumokokken sowie Mehrfachresistente gramnegative Bakterien.
Neben der Infektionsbekämpfung solcher Bakterien durch Antibiotika zeigte sich innerhalb des letzten Jahrzehnts, dass es zur Prävention von Infektionen möglich und sinnvoll ist, die nicht erwünschte Bakterienflora mittels antiseptischer Präparate zu eliminieren, um einer Infektionserkrankung vorzubeugen. Diese "Sanierung gesunder Bakterienträger" spiegelte sich in den Begriffen "Dekontamination" oder "Dekolonisation" wieder. Hierzu kommen in der Praxis verschiedene antiseptische Wirkstoffe wie Biguanide, Bisperidine, Chlorhexidin, Benzalkoniumchlorid oder quaternäre Ammoniumverbindungen zum Einsatz.
Als potentielle Alternative sowohl zur antibiotischen MRSA-Therapie als auch zur antiseptischen Dekontamination von MRSA-Trägern sind Bakteriophagen bekannt. Deren lytisches Phänomen wurde erstmals 1915 von Twort und unabhängig davon 1917 von d'Herelle beschrieben. Durch Fortschritte in der Molekulargenetik konnten Bakteriophagen als Viren identifiziert werden. Diese infizieren spezifisch jeweils nur eine Bakterienspezies durch Injektion ihrer DNA in die Bakterienzelle. Dann stellen sie den bakteriellen Stoffwechsel vollständig auf die intrazelluläre Neusynthese von bis zu 200 neuen Phagen um und setzen diese nächste Generation während des Zerfalls der Bakterienzelle frei. Bei ca. 1 Promille der Bakterienzellen wird die DNA des Phagen nur in das Bakteriengenom integriert (temperente Phagen), im Rah men der bakteriellen Teilung mit vererbt und nur unter besonderen Umweltbedingungen wieder virulent.
Gegenüber Staphylococcus aureus wurde die Phagentherapie erstmals 1921 [Bruynoghe R & Maisin J, La Presse Médicale 1921, 1195-1193] eingesetzt, wobei infizierte chirurgische Wunden innerhalb von 48 Stunden abheilten. In den nachfolgenden Weltkriegsjahren wurden mangels Antibiotika oder aufgrund von Sulfonamidresistenzen bei postoperativen Wundinfektionen Bakteriophagen eingesetzt. Über spontane bakterielle Resistenzen unter Phagentherapie wurde erstmals 1943 berichtet (Luria SE & Delbrück M, Genetics 1943, 28, 491–511). Aus der Hochzeit der Antibiotikatherapie zwischen 1966 und 1996 liegen nur ca. 30 Veröffentlichungen zur Phagentherapie vor, insbesondere aus Osteuropa; Phagen wurden in Notfall-Resistenzsituationen sowie bei der Therapie und Prophylaxe postoperativer Wundinfektionen eingesetzt. Neuere Untersuchungen mit Staphylococcus aureus infizierten Mäusen belegten wiederholt im Tierversuch die Wirksamkeit der Phagentherapie (Matsuzaki et al., Journal of Infectious Diseases 2003, 187, 613–624).
Probleme beim Einsatz der Phagentherapie als Antibiotikaersatz ergeben sich vor allem durch die geringe Stabilität von Bakteriophagen im Körper, da diese in kurzer Zeit durch Makrophagen als Fremdkörper beseitigt werden.
Derzeit werden zwei grundsätzlich unterschiedliche Ansätze zur Phagentherapie verfolgt: Einerseits wird versucht mittels gentechnischer Veränderungen wirksamere, möglichst omnipotent wirksame Phagentypen zu schaffen (Merril CR et al., Nature Reviews Drug Discovery 2003, 2, 489–497; Krylov VN, Russian Journal of Genetics 2001, 37, 715–730; Broxmeyer L et al., Journal of Infectious Deseases 2002, 186, 1155–1160). Im Gegensatz dazu steht der "klassische Therapieansatz", mit aus der Umwelt isolierten, natürlich vorkommenden Phagen, welche als Mischungen gegenüber verschie denen Bakterienisolaten einer Spezies oder gegenüber verschiedenen Bakterienspezies wirksam sind (Barrow PA & Soothill JS, Trends in Mircobiology 1997, 5, 268–271; Soothill JS, Journal of Medical Microbiology 1992, 37, 258–261).
In US 2002/0001590 A1 werden ausgewählte Bakteriophagen der Familie Myoviridae, speziell der Spezies Twort beschrieben, die wirksam MRSA-Stämme inhibieren oder abtöten können. Die Phagen werden in wässriger Lösung oder einem Puffer oder in einer Polymermatrix eingesetzt.
Einer weiteren Untersuchung [Vautz D. et al.: Lytische Wirksamkeit von MRSA-spezifischen Phagen gegenüber den 41 definierten nationalen Referenzstämmen sowie 143 klinischen MRSA-Isolaten. ZfW (2007) 5: 280–287] lag die Fragestellung zugrunde, in welchem qualitativen Ausmaß spezifisch wirksame Phagen gegenüber dem Kollektiv aller im deutschen Nationalen Referenzzentrum des Robert Koch Instituts in Wernigerode für Staphylokokken vorhandenen 41 MRSA existierten. Bei den Phagen handelte es sich ausschließlich um Mischungen von natürlichen, d. h. gentechnisch unverändert vorkommenden Viren. Es wurden dabei Phagenlösungen gefunden, die spezifisch gegen alle 41 MRSA Stämme wirksam waren.
Die Problematik nosokomialer Infektionen betrifft auch Klinikpersonal, das, ohne selbst erkrankt zu sein, Träger und damit Verbreiter von Bakterien ist. Weiter betrifft diese Problematik auch medizinische Geräte und Einrichtungsgegenstände, die mit Bakterien besiedelt sein können einschließlich multiresistenter Stämme. Dies kann auch das gesamte Klinikgebäude betreffen.
Primäres Ziel der Erfindung ist es daher, eine Bakteriophagenpräparation bereitzustellen, die gegen mindestens einen Bakterienstamm, vorzugsweise gegen alle bekannten multiresistenten Bakterienstämme, hochwirksam ist, eine gute Lagerfähigkeit besitzt und sich gut über zu behandelnde Oberflächen verteilen läßt, einschließlich an schwer zugänglichen Stellen.
Dieses Ziel wird durch eine Bakteriophagenpräparation gemäß Anspruch 1 erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen dieser Bakteriophagenpräparation sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Bakteriophagenpräparation zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische oder präventive antibakterielle Anwendung bereitzustellen, das insbesondere zur Anwendung in Wunden und Wundbereichen, im Nasen-Rachenraum, im Haut- und Schleimheutbereich, Urogenitalbereich und im Bereich des Auges anwendbar ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein für antibakterielle Anwendungen geeignetes Desinfektionsmittel bereitzustellen, das beispielsweise zur Desinfizierung der Hände von Ärzten und Klinikpersonal, aber auch zur Desinfizierung von Gegenständen geeignet ist.
Diese Ziele werden durch die in den Patentansprüchen 12 bis 20 angegebenen Merkmale gelöst.
Die Funktion des oberflächenaktiven Stoffes ist es, einerseits das Ein- bzw. Vordringen der Bakteriophagen zu den Bakterien auf der Haut, in Wunden oder sonstigen auch unzugänglichen Körperstelle und -höhlen (z. B. Nasen-Rachen-, Urogenital-Raum) zu ermöglichen bzw. zu beschleunigen sowie an unzugänglichen Oberflächen, wie z. B. rauhen Oberflächen oder engen Spalten. Damit wird eine drastische und gegenüber dem Stand der Technik effektivere Reduktion der Bakterien erreicht.
Als oberflächenaktives Mittel hat sich besonders ein kationisches Tensid, wie Polyhexanid, gezeigt.
Eine gute Lagerfähigkeit und eine Steigerung der Wirksamkeit wird durch die im Anspruch 1 angegebene alkalische Pufferlösung erreicht, wobei sich gezeigt hat, daß Bakteriophagen in alkalischem Millieu – im Vergleich zu neutralen oder sauren pH-Werten nicht nur besser lagerungsfähig sind (d. h. mit geringeren Aktivitätsverlusten), sondern im alkalischen Bereich mit einem pH-Wert größer 7,5 pH, z. B. in Kombination mit Polyhexanid, auch eine wesentlich höhere Wirksamkeit gegenüber den zu lysierenden Bakterien aufweisen.
Sehr geringe Polyhexanid-Konzentrationen wirken gegenüber Bakterien nur hemmend, töten diese jedoch nicht ab. Andererseits werden Bakteriophagen bei diesen Polyhexanid-Konzentrationen nicht zerstört und auch ihn ihrer Wirksamkeit nicht behindert, so dass die durch Polyhexanid gehemmten Bakterien durch die Bakteriophagen weiterhin unbeeinträchtigt lysiert werden können.
In der Anwendungspraxis werden die Bakterien somit entweder durch lokal hohe Konzentrationen vom Polyhexanid kurzfristig abgetötet oder bei sehr geringen Konzentrationen durch das Polyhexanid gehemmt und dann von den Bakteriophagen lysiert.
Der bakterizide Erfolg der Bakteriophagen hängt davon ab, ob diese einen passenden Rezeptor auf der Bakterienoberfläche finden. Dabei hat sich die Kombination der Bakteriophagen mit Tensiden, Enzymen, Alkoholen, reinigenden Stoffen wie Alginaten und niederfrequentem Ultraschall als positiv erwiesen. Diese Kombinationspartner verbessern die Möglichkeit des Vordringens sowohl der antiseptischen Hemmstoffe als auch der Bakteriophagen zu den Bakterien bzw. – im Falle niederfrequenten Ultraschalls – das Erreichen deren spezifischen Rezeptoren durch mechanische/mechano-akustische Einwirkung.
Da antimikrobielle Stoffe in sehr geringen Konzentrationen eine Hemmwirkung jedoch keine Abtötungswirkung erreichen, wird den Bakteriophagen ermöglicht, die gehemmten Bakterienzellen zur Vermehrung zu nutzen und diese abschließend zu lysieren.
Weiterhin bewirkt die Kombination von Bakteriophagen mit antimikrobiell wirkenden chemischen Substanzen bereits in gegenüber dem Stand der Technik wesentlich geringeren Konzentrationsbereich (der Hemmwirkung), dass die bekannten Wirkungslücken antimikobieller chemischer Stoffe durch Bakteriophagen geschlossen werden.
Weiter läßt sich feststellen, daß bei der Desinfektion eine wesentliche Wirkungsverbesserung auftritt, wenn die Bakteriophagenpräparation mit niederfrequentem Ultraschall aufgebracht wird, der vorzugsweise im Frequenzbereich kleiner 120 kHz liegt und eine Leistung im Bereich von 0,05 bis 1,5 W/cm² hat. Hierdurch erreicht man eine bessere Verteilung der Bakteriophagenpräparation über die zu desinfizierende Oberfläche und ein Lö sen von Schmutzpartikeln, so daß die Bakteriophagen besseren Zugang zu den zu bekämpfenden Bakterien haben.
Eine weitere Verbesserung der Wirkung erhält man dadurch, daß die Bakteriophagenpräparation vor oder während des Auftragens auf eine erhöhte Temperatur erwärmt wird, die vorzugsweise im Bereich zwischen 20°C und 45°C liegt.
Mit der vorliegenden Erfindung werden somit Besiedelungen oder Infektionen durch Bakterien, insbesondere Besiedlungen der Haut, Schleimhaut, Körperöffnungen, -höhlen oder von Wunden sowie anderen unzugänglichen Körperstellen, z. B. mit Antibiotika resistenten Bakterien wie insbesondere Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), drastisch reduziert.
Als oberflächenwirksame Substanz wird bevorzugt ein kationisches Tensid verwendet. Auch sonstige antiseptisch wirkende Substanzen, reinigende Substanzen, Alkohole und/oder Enzyme können verwendet werden.
Bevorzugt wird ein "Bakteriophagenpool" verwendet, der dabei mindestens eine speziesspezifische Bakteriophagenpopulation mit mindestens einem polyvalenten Bakteriophagenstamm, welche spezifisch gegen die besiedelnden Bakterien wirkt.
Gegenüber Besiedelungen mit verschiedenen Bakterienarten können Mischungen aus Bakteriophagen als Bakteriophagenpool zur Anwendung kommen, welche gegenüber den jeweiligen verschiedenen Bakterienarten wirksam sind.
Die Bakteriophagenpopulationen bestehen bevorzugt aus nicht gentechnologisch veränderten Bakteriophagen. Stark bevorzugt sind natürlich vorkommende Bakteriophagen. Andererseits können natürlich auch gentechnologisch modifizierte Bakteriophagen eingesetzt werden.
Im "Bakteriophagenpool" können auch Bakteriophagenpopulation kombiniert werden, welche dann gegenüber verschiedenen Bakterienspezies wirksam sind.
Als für den "Bakteriophagenpool" geeignet gelten lytisch wirksame Bakteriophagen, lysogene Bakeriophagen, die zu einem späteren Zeitpunkt in den lytischen Zyklus übergehen, sowie nicht lytische Bakteriophagen, die Stoffe produzieren, die den Bakterien schaden. Stark bevorzugt sind lytisch wirksame Bakteriophagen.
Bakteriophagen können aus Klinikabwässern auf dem Fachmann bekannte Weise gewonnen und gegen mindestens einen Bakterienreferenzstamm, bevorzugt gegen je einen von 5 bis 20 Bakterienreferenzstämmen mit dem Tropftest und/oder dem Plaque-Forming-Unit-Test auf Wirksamkeit untersucht werden.
Bevorzugt sind polyvalente Bakteriophagen, welche gegenüber verschiedenen Isolaten einer Spezies wirksam sind.
Die vorzugsweise lytisch wirksamen Bakteriophagen werden in geeigneten Bakterien, vorzugsweise der Spezies Staphylococcus und Pseudomonas kultiviert. Die resultierenden Lysate werden nach den bekannten Methoden weiter behandelt, um daraus einen Bakteriophagenpool herzustellen. Dieser sollen keine lebenden Organismen, Toxine oder Bruchstücke der Bakterienzellwände mehr enthalten. Beispielsweise können die Lysate durch bekannte Verfahren wie Ultrafiltration und oder Ultrazentrifugation gereinigt werden, um diese Anforderungen zu erfüllen.
Die Bakteriophagen oder weitere erfindungsgemäße Darreichungsformen können in Ampullen oder anderen Gebinden verpackt werden. Der ungefähre Bakteriophagentiter des Gebindes kann durch Bestimmung der Vorverdünnung ermittelt werden, die geeignet ist, eine bestimmte Anzahl von Bakterien eines Test-Stamms zu lysieren. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Bakteriophagenpools mit mindestens 10³ pfu, bevorzugt 10⁶ bis 10¹⁰ pfu, stark bevorzugt 10⁷ bis 10⁹ pfu spezifisch wirkende Bakteriophagen hergestellt.
Zur Bestimmung der Spezies-Spezifität der Bakteriophagenpools werden die Bakteriophagen im Rahmen von Lysetests mit geeigneten Referenzstämmen unterschiedlicher Bakterienspezies getestet.
Der Bakteriophagenpool wird durch Kombinationen puffernder Salze im alkalischen pH-Bereich stabilisiert, wobei pH-Werte zwischen 7,5 und 9,5 möglich sind, bevorzugt werden jedoch pH-8 bis pH-9,5 stark bevorzugt pH-8,2 bis pH-9.
Der Bakteriophagenpool wird in Verbindung mit mindestens einer oberflächenaktiven Substanz eingesetzt. Geeignete oberflächenaktive Substanzen umfassen unter anderem Tenside, Alkohole, antiseptische und Desinfektions-Wirkstoffe, Reinigungswirkstoffe, Enzyme, Konservierungsstoffe, niederfrequente Ultraschallanwendung und/oder Kombinationen davon.
Geeignete Tenside sind bevorzugt amphotere Tenside wie Sultaine oder Betaine. Dabei finden bevorzugt Betaine Verwendung mit Alkylketten aus 5 bis 21 C-Atomen, bevorzugt 10 bis 15 C-Atomen, weiter bevorzugt 11 bis 13 C-Atomen. Stark bevorzugt sind Undecylensäureamidopropyl-Betain und Cocamidopropyl-Betain. Die Tenside werden dabei zur Kombination mit Bakteriophagen eingesetzt als in einer Konzentration von 0.001 bis 10.0 Gew.-%, bevorzugt 0.003 bis 5.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.005 bis 2.0 Gew.-%, stark bevorzugt 0.005 bis 0.1 Gew.-% zugesetzt.
Geeignete Alkohole sind wasserlösliche Alkohole, bevorzugt C1 bis C4-Alkohole. Stark bevorzugt sind Ethanol, iso-Propanol und n-Propanol. Die Alkohole werden dabei zur Kombination mit Bakteriophagen in einer Konzentration von 0.1 bis 25.0 Gew.-%, stark bevorzugt 1.0 bis 10 Gew.-% zugesetzt.
Bei den geeigneten antiseptischen, Desinfektions-Mitteln sowie Konservierungsstoffen handelt es sich bevorzugt um besonders gewebeverträgliche Substanzen, besonders bevorzugt sind Biguanide, Bisperidine, Phenoxyethanol, quaternäre Ammoniumverbindungen, Tosylchloramid-Natrium und Kombinationen davon. Von den Biguaniden sind besonders bevorzugt Polyhexamethylbiguanid (Polyhexanid) und Chlorhexidin. Von den Bisperidinen ist besonders bevorzugt Octenidindihydrochlorid. Von den quaternären Ammoniumverbindungen ist besonders bevorzugt Benzalkoniumchlorid.
Die antiseptischen, Desinfektions-Mittel sowie Konservierungsstoffe werden bei der Phagenpräparation in einer Konzentration von 0.000001 bis 1.0 Gew.-% zugesetzt. Dabei werden die Biguanide bevorzugt in einer Konzentration von 0.000001 bis 1.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.000001 bis 0.3 Gew.-% eingesetzt. Die Bisperi dine werden bevorzugt in einer Konzentration von 0.01 bis 5.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.5 bis 2.0 Gew.-% eingesetzt. Phenoxyethanol wird bevorzugt in einer Konzentration von 0.05 bis 5.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.5 bis 2.0 Gew.-% eingesetzt. Die quaternären Ammoniumverbindungen werden bevorzugt in einer Konzentration von 0.01 bis 10 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.05 bis 1.0 Gew.-% eingesetzt. Tosylchloramid-Natrium (Ph Eur 4, "Chloramin T") weiter bevorzugt 0,001 bis 1 Gew.-%, bevorzugt 0.01 bis 0,5 Gew.-% eingesetzt.
Speziell bei der Wundbehandlung kommen Enzyme und Alginate als Reinigungswirkstoffe mit dem Bakteriophagenpool einzeln oder gemeinsam zur Anwendung.
Bevorzugte Enzyme sind das Trypsin, die Collagenasen NB 1 und NB 4, das Pancreatin sowie Streptase, Urokinase und Lipoxidase. Die Enzyme werden dem Bakteriophagenpool in folgenden Konzentration zugesetzt:

– Lipoxidase, 0,01 bis 1,0 mg/ml, bevorzugt 1,0 mg/ml
– Trypsin, 0,2 bis 4 mg/ml, bevorzugt 2 mg/ml
– Streptase, 5.000 bis 100.000 IU/ml, bevorzugt 10.000 IU/ml
– Urokinase, 5.000 IU/ml
– NB 1 Collagenase, 1 bis 10 PZU/ml, bevorzugt 6 PZU/ml
– NB 4 Collagenase, 1 bis 10 PZU/ml, bevorzugt 6 PZU/ml
– Pancreatin, 0,5 bis 5 mg/ml bevorzugt 2,5 mg/ml

Folgende Alginate können dem Bakteriophagenpool zugesetzt werden:

– Natrium-Alginate
– Natrium-Calzium-Alginate
– Calzium-Alginate

Die beschriebenen Formulierungen können mit den bekannten Methoden zur Herstellung von Formulierungen hergestellt werden, die zur Anwendung auf Oberflächen als Medizinprodukte, bevorzugt der Haut und auf Wunden eingesetzt werden.
Niederfrequenter Ultraschall im Frequenzbereich < 120 kHz, bevorzugt 30–100 kHz, mit Leistungen zwischen 0,05–1,5 W/cm² zeigte bei der Anwendung auf der Haut, Schleimhaut und Wunde additive und z. T. synergistische Wirkungseffekte in der Kombination mit Bakteriophagen und/oder Polyhexanid.
Die Applikation von therapeutischem Ultraschall von 0,8–3 MHz sub-aqualer Anwendung zur Stimulation der Wundheilung ist in der Literatur vielfach beschrieben [Radandt, R.R.: Niederfrequenter Ultraschall in der Wundheilung. Phys Med Rehab Kuror. Thieme Verlag Stuttgart/New York, ISSN 0940-6689 (2001) 11: 41–50]. Hieraus ist bekannt, dass Ultraschall z. B. den Wundheilungsprozess auf drei Ebenen beeinflusst, den der mechanischen Einwirkung auf die Gewebeoberfläche, er hat eine mechano-akustische Einwirkung auf dort siedelnde Mikroorganismen und zeigt thermische und nicht-thermische Effekte in tieferen Gewebeschichten.
Speziell wurde die Wirkung von Ultraschall zwischen 70 kHz und 10 MHz auf die Abtötung von Bakterien P. aeruginosa in Biofilmen in Kombination mit einem Antibiotikum (Gentamicin) in vitro untersucht [Qian Z, Sagers RD, Pitt WG. The effect of ultrasonic frequency upon enhanced killing of P. aeruginosa biofilms. Ann Biomed Eng 1997; 25,1: 69–76]. Dabei zeigte sich als Ergebnis, dass die Ultraschallbehandlung allein keine signifikante Reduktion der Mikroorganismen bewirkte. Bei der Kombination von Ultraschall und Antibiotikum wurde jedoch bei allen Frequenzen eine signifikante Wirkungssteigerung gegenüber der Kontrollgruppe (nur Antibiotikum) nachgewiesen: Es bestand eine eindeutige Korrelation zur Ultraschallfrequenz, wobei unter 70 kHz einer Wirkungssteigerung > 250% gefunden wurde ("bioakustischer Effekt").
Folgende Anwendungen niederfrequenten Ultraschalls können mit dem Bakteriophagenpool kombiniert werden:

– Frequenzbereich < 120 kHz mit Leistungen 0,05–1,5 W/cm²
– Frequenzbereich < 100 kHz mit Leistungen 0,05–1,5 W/cm²
– Frequenzbereich < 70 kHz mit Leistungen 0,05–1,0 W/cm²

Geeignete Applikationsformen für den Bakteriophagenpool in Verbindung mit oberflächenaktiven Substanzen bzw. niederfrequentem Ultraschall sind dabei Lösungen, Spülungen, (Wund-)Auflagen aus Textil oder Kunststoffen sowie Gele oder Kombinationen davon. Bevorzugt sind sterile Applikationsformen. Die Sterilisierung erfolgt hierbei über die üblichen dem Fachmann bekannten Methoden.
Die geeigneten Lösungen sind bevorzugt wässrige Lösungen und können weitere aktive Substanzen, insbesondere waschaktive und antiseptische Substanzen enthalten. Bevorzugt können diese Lösungen spezifisch präventiv zur antiseptischen Desinfektion von Oberflächen (z. B. in Operationssälen oder der Intensivstation einer Klinik) eingesetzt werden.
Die geeigneten Spülungen sind bevorzugt wässrige Lösungen, die weitere aktive, bevorzugt zur Desinfektion geeignete, auf der Haut gut verträgliche Substanzen enthalten können. Zudem können die Spülungen gepufferte iso-osmotische Lösungen mit geeignetem pH-Wert und physiologischem Salzgehalt enthalten.
Die geeignete (Wund-)Auflagen können aus Textil, z. B. herkömmliche Baumwollgaze, oder Kunstfasermaterialien oder anderen Quellstoffen bestehen.
Die geeigneten Gele beinhalten bevorzugt Glyzerin oder Polymere oder eine Kombination davon. Die Polymere sind bevorzugt Derivate von Celluloseacetat, weiter bevorzugt Hydroxyalkylcelluloseacetat, insbesondere Hydroxyethylcelluloseacetat und Hydroxypropylcelluloseacetat, sowie Polymere von Acrylsäure, weiter bevorzugt Acrylsäure-Homopolymer, das vernetzt sein kann mit Pentaerythritol-Allylether, Saccharose-Allylether oder Propylen-Allylether (Carbomer).
Geeigneten Gele enthalten Glyzerin in einer Konzentration von 1.0 bis 10.0 Gew.-%, bevorzugt 5.0 bis 8.0 Gew.-% und/oder Polymere in einer Konzentration von 0.1 bis 10.0 Gew.-%, bevorzugt 2.0 bis 6.0 Gew.-%.
Die erfindungsgemäßen Bakteriephagenpräparationen in Kombination mit oberflächenaktiven Substanzen finden Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische oder präventive antibakterielle Anwendung auf der Haut und Schleimhaut, bevorzugt im Nasen-Rachen-Raum und im Urogenitalbereich, in Wundbereichen und im Bereich des Auges.
Die Formulierungen und Verwendungen der Erfindung sind geeignet zur Beseitigung von Bakterien, wie zum Beispiel Stämme von Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Enterobacter, koliforme Keime, Klebsiella, Proteus, Listeria oder Salmonella. Die Formulierungen und Verfahren sind besonders geeignet zur Beseitigung von antibiotika-resistenten Bakterienstämmen bevorzugt von Staphylocccus und Pseudomonas, besonders bevorzugt von Staphyloccus aureus und von Pseudomonas aeruginosa. Die Formulierungen und Verfahren sind besonders stark geeignet zur Beseitigung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dienen die Formulierungen und Verfahren zur Entfernung von MRSA-Besiedelungen der Haut bevorzugt an unzugänglichen Stellen, wie dem Nasen-Rachen-Raum oder in Wunden.
Die beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden durch das folgende Beispiel näher beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt.
Beispiel
zur Herstellung einer Präparation aus Bakteriophagen (hier: wirksam gegenüber Staphylococcus aureus) und (hier: einem) oberflächenaktiven Stoff:
1. Bakteriophagenisolation und -vermehrung
Die erforderlichen Referenz-Bakteriophagen sowie die Referenz-Bakterienstämme werden der Stammsammlung entnommen.
Zur Gewinnung neuer Bakteriophagen kann eine flüssige Probe aus Klinikabwässern wird mit CaCl₂ und MgCl₂ versetzt, filtriert und anschließend sterilfiltriert. Zum Nachweis von spezifisch gegen Staphylococcus aureus lytisch wirksamen Bakteriophagen wird die flüssige Probe einem pfu-Test unterzogen. Hierzu wird die sterilfiltrierte Probe zu jeweils einer mit Flüssignährmedium verdünnten Logphasenkultur von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus gegeben.
Zur Vermehrung der gegenüber Staphylococcus aureus spezifischen Phagen wird den Bakteriophagen in einem Schüttelerlenmeyerkolben frische Bakterienkultur des jeweiligen Referenzstammes in der Log-Phase zugeführt. Um eine Resistenzbildung zu verhindern, wird die geklärte Suspension anschließend zentrifugiert und das Supernat sterilfiltriert. Der Vermehrungsschritt wird so lange wiederholt, bis eine Konzentration von 10¹⁰ Phagen/ml im pfu-Test erreicht ist.
Diese Vorgehensweise wir mit allen Stämmen von Staphylococcus aureus und deren jeweils spezifischen Phagen wiederholt, bis in der Mischung alle relevanten Bakteriophagen (Bakteriophagenpool) in der Konzentration von 10¹⁰/ml im pfu-Test nachweisbar sind.
2. Nachweis der Wirkspezifität
Zum Nachweis der Spezies-Spezifität werden die erhaltenen Phagensuspensionen im pfu-Test gegen die Bakterienstämme E. coli ATCC 11229 und P. aeruginosa ATCC 15442 eingesetzt. Dabei darf keine lytische Wirkung der eingesetzten Phagensuspensionen gegenüber den Kontrollstämmen nachgewiesen werden.
3. Herstellung der Präparation (Phagenpräparation)
Zur Herstellung der Phagenpräparation aus Bakteriophagenpool und oberflächenaktiven Stoff werden Lösungen aus gepoolter Phagensuspension mit einer Endkonzentration von 10⁷ Bakteriophagen/ml und 0.1 Gew.-% Undecy lensäureamidopropyl-Betain durch einen alkalischen Puffert stabilisiert, angesetzt und sterilfiltriert.
4. Konzentration der Bakteriophagen in der Präparation
Die Phagenpräparation wird auf deren Wirkung bezüglich aller relevanten Referenzstämme von Staphylococcus aureus im pfu-Test geprüft. Dabei konnte die volle Wirksamkeit der gepoolten Phagensuspension gegen alle relevanten Referenzstämme nachgewiesen werden.
5. Nebenwirkungsstudien
Die hergestellte Charge wird auf toxische und irritativen Reizungen ebenso untersucht wie hinsichtlich Enterotoxinen (a–g, h und i) sowie exfolantiven Toxinen a und b, dem Toxin des Toxicschock-Syndroms sowie Endotoxinen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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- EP 0700249 B1 [0004, 0004, 0005]
- DE 10012026 [0004]
- US 2002/0001590 A1 [0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Bakteriophagenpräparation zur Behandlung von durch Bakterien verursachte Besiedelungen (Kontaminationen, Kolonisationen, Infektionen und Infektionserkrankungen), dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation mindestens einen gegen mindestens einen Bakterienstamm spezifisch wirksamen Bakteriophagen in alkalischer Pufferlösung in Kombination mit mindestens einem oberflächenaktiven Mittel aufweist.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakteriophage lytisch gegenüber mindestens ein Bakterium ausgewählt aus Staphylococcus spezies, Pseudomonas spezies, Streptococcus spezies, Enterococcus spezies, Enterobacter spezies, Klebsiella spezies, Proteus Spezies, Listeria spezies und Salmonella spezies wirksam ist.
Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oder kationischen Tensiden, Alkoholen, Enzymen, Alginaten Desinfektionsmitteln, antiseptischen oder Konservierungsstoffen oder Kombinationen davon.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel Polyhexanid ist.
Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangegangen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 0.000001 bis 20.0 Gew.-% bezogen auf die gesamte Bakteriophagenpräparation vorliegt.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation als Lösung oder Suspension vorliegt.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation in Gelform vorliegt.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation Glyzerin oder ein Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Derivaten von Celluloseacetat und Polymeren von Acrylsäure aufweist.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Glyzerin in einer Konzentration von 1.0 bis 10.0 Gew.-%, bezogen auf den gesamte Bakteriophagenpool vorliegt.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer in einer Konzentration von 0.1 bis 10.0 Gew.-%, bezogen auf den gesamte Bakteriophagenpool vorliegt.
Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation in Textilfaser oder Kunstfaser, oder als Quellstoff vorliegt.
Verwendung einer Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische oder präventive antibakterielle Anwendung.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung in Wunden und Wundbereichen.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Nasen-Rachen-Raum.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Haut- und Schleimhautbereich.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Urogenitalbereich.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Bereich des Auges.
Verwendung einer Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung eines Desinfektionsmittels für antibakterielle Anwendungen.
Desinfektionsverfahren gekennzeichnet durch Auftragen der Bakteriophagenpräparation nach einem der Ansprüche 1–11 mit niederfrequentem Ultraschall mit einem Frequenzbereich < 120 kHz und einer Leistungen von 0,05–1,5 W/cm².
Desinfektionsverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakteriophagenpräparation vor dem Auftragen auf eine Temperatur zwischen 22°C und 45°C erwärmt wird.