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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft multivalente Stämme von Bakteriophagen, Verfahren
diese herzustellen und ihre Anwendung zur Behandlung von bakteriellen
Infektionen, insbesondere von Arzneimittel-resistenten Bakterienstämmen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Bakteriophagen (Phagen) sind eine mannigfaltige Gruppe von Viren,
deren Lebenszyklus ausschließlich
mit Bakterienzellen verbunden ist. Bakteriophagen sind durch einen
lysogenen oder lytischen Lebenszyklus gekennzeichnet. Als antibakterielle
Agenzien sind insbesondere lytische Bakteriophagen nützlich, die
sich, nachdem sie Bakterienzellen infiziert haben, welche für sie empfindlich
sind, in diesen vermehren, was zu deren totaler Zerstörung (durch
Lyse) und der Freisetzung neuer Phagen führt, welche weitere Bakterienzellen
angreifen und zerstören.
Dieser Prozess kann in vitro und in vivo stattfinden.
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Einer
der wesentlichen Merkmale von Bakteriophagen ist die bekannte hohe
Spezifität
ihrer lytischen Aktivität.
Diese Fähigkeit
wird beispielsweise zur Speziesbestimmung (Phagentypisierung) von
verschiedenen Bakterien (siehe z.B. Patentbeschreibungen
GB 2285684 ,
US 5,824,468 und
SU 543260 sowie die internationale
Patentanmeldungen WO 01/00786 und WO 01/09370) ausgenutzt. Andere
bekannte Verwendungen von Bakteriophagen umfassen ihre Nützlichkeit
als Werkzeuge in der Molekularbiologie, z.B. für die Expression und Auswahl
bestimmter Proteine (z.B. Patentbeschreibung
US 6,027,930 ) und als Sterilisierungs-
und Reinigungsmittel (z.B. Patentbeschreibung
EP 0414304 ,
EP 0290295 und
GB 2253859 sowie die internationalen Patentanmeldungen
WO 98/08944 und WO 90/03122). Modifizierte Phagen werden in der
Herstellung von Impfstoffen verwendet (z.B. WO 95/05454). Bestimmte
Proteine aus Bakteriophagen werden auch genutzt (z.B.
EP 0510907 ,
US 5,470,573 , WO 96/07329). Die Verfahren,
Bakteriophagen zu isolieren und Phagenzubereitungen zu erhalten,
sind wohlbekannt und werden ständig
vervollkommnet (z.B.
GB 829266 ,
CS 192212 ,
RU 2109055 ).
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Phagentherapie
wurde seit dem zweiten Weltkrieg in dem Institut für Mikrobiologie
und Virologie von Tbilisi, Georgien, in großem Maßstab eingesetzt. Eine Bank
verschiedener Phagenzubereitungen wird dort in der Behandlung bakterieller
Infektionen und für
die Prophylaxe verwendet.
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Zur
Verfügung
stehende Daten deuten auf eine hohe Effizienz der Phagentherapie
hin. Eine ähnliche Forschung
wurde in Polen seit mehr als 25 Jahren betrieben. In dem Bakteriophagenlabor
des Institutes der polnischen Akademie der Wissenschaften in Breslau
für Immunologie
und experimentelle Therapie wird die Phagentherapie zur Behandlung
von Infektionen verwendet, welche durch Arzneimittel-resistente
Formen von Bakterien und durch solche, die nicht für Antibiotika
empfänglich
sind, verwendet (siehe Stefan Ślopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1981,
31, 293; Stefan Ślopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1983,
31, 267; Stefan Ślopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1984,
32, 317; Stefan Ślopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1985,
33, 219; Stefan Ślopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1985,
33, 241; Stefan Ślopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1987,
35, 569; Beata Weber-Dąbrowska
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2000,
48, 31-37; Beata Weber-Dąbrowska
et al.. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2000,
48, 547-551) verwendet. Die Phagentherapie, die dort seit mehr als
14 Jahren ausgeführt
wird und welche 1473 Patienten mit eitrigen Infektionen verschiedener
Gewebe und Organe umfasste, deutet auf eine hohe Effizienz der Phagentherapie
hin.
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Eine
vollständige
Beseitgung der Krankheitssymptome und Genesung wurde in 1289 Fällen vermerkt. Es
muss betont werden, dass für
zumindest ein Dutzend oder so Fälle
die Phagentherapie die einzige Möglichkeit
für die
Beseitigung einer lebensbedrohlichen Infektion dargestellt hat.
Die durchgeführte
Therapie betraf einzelne Patienten. Sie bestand aus:
- a) dem Wachstum und dem Nachweis bakterieller Stämme, die
von einem Patienten stammenden Material isoliert wurden,
- b) der Bestimmung der Empfindlichkeit des Stammes für bestimmte
Phagen und der Auswahl eines Phagens, der die höchste lytische Aktivität für den Stamm
aufweist,
- c) der Herstellung eines Phagenlysates mit einer großen Anzahl
an Phagenpartikeln,
- d) der Herstellung einer sterilen Phagenzubereitung für die Behandlung.
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Dieses
Verfahren ist ziemlich kostspielig, arbeits- und zeitaufwändig. Manchmal
vergehen 7–10
Tage von dem Zeitpunkt der Beschaffung des Forschungsmaterials bis
zur Verfügbarkeit
der fertigen sterilisierten Phagenzubereitung für die Behandlung. Solch eine
Verzögerung
ist zu groß für einige
Krankheitsstadien. Die Phagentherapie kann mit dem Verfahren, das
bisher eingesetzt wurde, nicht im großen Maßstab durchgeführt werden.
Infektionen, welche Mukoviszidose begleiten, stellen ein besonderes
Problem dar. Dies ist eine angeborene systemische Krankheit, die
die Fehlfunktion von Mukus-sekretierenden Drüsen umfasst und den Patienten
für chronische
Bronchial- und Lungenkrankheiten prädisponiert. Der abgesonderte
Schleim ist dick und klebrig, was seine Beseitigung auf natürlichen
Wegen (Husten) erschwert. Die Anreicherung und das Verbleiben des
Schleims in den Bronchien und die Beeinträchtigung seiner Entfernung
schafft günstige
Bedingungen für
bakterielle Infektionen, was zur chronischen Bronchitis und Lungenentzündung führt. Die
bedrohlichsten Krankheitserreger, die Mukoviszidose-begleitende
Infektionen hervorrufen, sind Staphylococcus aureus und Bazillen
des Genus Pseudoinorias. Ständig
wiederkehrende Infektionen durch diese Mikroorganismen führen zu
schwerwiegenden pathologischen Veränderungen in dem Atmungssystem
und einem vorzeitigen Tod. Wenige Patienten überleben mehr als 25 Jahre.
Die Behandlung solcher Infektionen mit verfügbaren Antibiotika hat weltweit,
besonders in den letzten paar Jahren, ein ernstes therapeutisches
Problem verursacht. Die Antibiotika-Therapie solcher Infektionen
wurde zunehmend weniger erfolgreich, da die größte Mehrheit der bakteriellen
Stämme
Resistenzen gegen alle Antibiotika aufweisen, darunter das Notfallantibiotikum-Vankomyzin. Es
gibt aus diesem Grund einen dringenden Bedarf, in die medizinische
Praxis ein alternatives therapeutisches Verfahren für die Behandlung
von refraktären
und hoch gefährlichen
bakteriellen Infektionen einzuführen.
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Das Ziel der
Erfindung
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In
den letzten Jahren wurde eine massive Ausbreitung bakterieller Stämme gesehen,
die gegen alle Antibiotika, inklusive dem Notfallantibiotikum Vankomyzin,
resistent waren. Demzufolge ist eine Behandlung von bakteriellen
Infektionen, welche durch diese Arzneimittel-resistenten Formen
hervorgerufen werden, mit Antibiotika wirkungslos. Diese Lage hat
dramatische therapeutische Probleme verursacht. Deshalb besteht
ein dringender Bedarf, in die medizinische Praxis alternative therapeutische
Methoden zur Behandlung von refraktären bakteriellen Infektionen
einzuführen.
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In
Anbetracht des oben genannten Zieles stellt diese Erfindung eine
Ausarbeitung eines Verfahrens zur Gewinnung multivalenter Phagenstämme, die
in der Herstellung von Zubereitungen von garantierter Wirksamkeit
in der Behandlung bakterieller Infektionen genutzt werden können, dar,
ohne die Notwendigkeit in jedem Fall einzelne Phagen zu selektieren.
In dieser besonderen Ausführungsform
liegt das Ziel der Erfindung in der Darstellung eines Verfahrens,
das es erlaubt, Phagenzubereitungen von hoher Reinheit, insbesondere frei
von Endotoxin, zu erhalten. Ein besonderes Ziel der Erfindung besteht
darin, polyvalente Phagenzubereitungen zu erhalten, welche in jedem
Fall wirksam zur Behandlung bakterieller Infektionen im Zusammenhang mit
Mukoviszidose eingesetzt werden können, ohne die Notwendigkeit
für eine
individuelle Phagenauswahl.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines multivalenten
Bakteriophagenstammes zur Verfügung,
in welchem:
- a) sich eine ausreichende Zahl
(n) verschiedener pathogener bakterieller Stämme einer bestimmten Gattung,
die statistisch in einem gegebenen Bereich auftreten, anhäuft wird,
wobei die isolierten bakteriellen Stämme vorzugsweise Arzneimittel-resistent
sind,
- b) sich eine ausreichende Zahl verschiedener Bakteriophagenstämme, die
für mindestens
einen der bakteriellen Stämme
der gegebenen Gattung spezifisch sind, anhäuft wird,
- c) die lytische Aktivität
eines angehäuften
Bakteriophagenstammes für
jeden angehäuften
bakteriellen Stamm bestimmt wird, dann der Wert p, der das Verhältnis der
Zahl von einem gegebenen Phagen lysierten Stämmen zu der Zahl aller angereicherten
Bakterienstämme
darstellt, berechnet wird.
- d) Aus dem resultierenden Werte p getestet wird, ob n die Bedingung
erfüllt: worin:
- q
- = 1 – p
- d
- ist eine Konstante,
die nicht größer als
0,1 und optimalerweise nicht größer als
10% p ist
- z1–α
- ist eine statistische
Variable der Normalverteilung abhängig vom Koeffizienzfaktor
1 – α, der nicht
kleiner als 0,95 ist,
- e) derjenige Bakteriophagenstamm selektiert wird, der das Kriterium
gemäß d) erfüllt und
einen Wert für
p von nicht weniger als 2/n, vorzugsweise nicht weniger als 0,5
aufweist.
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Es
wird der Bereich der lytischen Aktivität jedes isolierten Bakteriophagen
mit Hinblick auf die Population der pathogenen Bakterienstämme, welche
in einem gegebenen Bereich anwesend sind, bestimmt. Zu diesem Zweck
muss eine ausreichend große
Ansammlung an zufällig
gewählten
Arzneimittelresistenten Bakterienstämmen aufgehäuft worden sein. In Bezug auf
die ermittelte große
Probenmenge von Bakterien einer Populationsgröße von n Stämmen (in dem beschriebenen
Beispiel war n 845 bzw. 880 für
die Arzneimittel-resistenten Stämme
von Pseudomonas und Staphylococcus, die in Polen isoliert wurden)
wird die Erfolgsfrequenz oder das Verhältnis zwischen der Zahl an
von einem bestimmten Phagen lysierten Stämmen zu der Gesamtzahl der
untersuchten Stämme
berechnet. Diese Frequenz wird als Wahrscheinlichkeit des Erfolgs
p betrachtet. Die Wahrscheinlichkeit eines Misserfolges ist dann
q = 1 – p.
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Es
ist notwendig, die Größe n, die
eine Probe aufweisen muss, damit sie als für die allgemeine Population
der Stämme
einer gegebenen Gattung als repräsentativ
angesehen werden kann (z.B. Pseudomonas oder Staphylococcus), auszuwahlen.
Zu diesem Zweck wird der folgende Faktor eingeführt, so dass die Probe repräsentativ
ist: P(|v – p|(d)
= P(–d(v – p(d) =
1 – α
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Die
Wahrscheinlichkeit, dass der absolute Wert der Differenz zwischen
der Probenfrequenz v und der Wahrscheinlichkeit des Erfolges p kleiner
als der festgelegte Wert d ist, ist 1 – α, was einem Konfidenzgrad von 1 – α entspricht.
Der Wert von 1 – α wird normalerweise
auf 0,95 oder 0,98 gesetzt.
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Die
Zahl an Proben n sollte die folgende Bedingung erfüllen:
wobei z
1–α eine
Statistische Variable der Normalverteilung darstellt. Für 1 – α = 0,95,
z
1–α =
1,96 und für
1 – α = 0,98,
z
1–α =
2,33.
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Aufgrund
dieses Kriteriums und aufgrund des Wertes der Frequenz p, die für den beschriebenen
Phagen erhalten wurde, ist es möglich,
durch die Zuordnung von angemessenen Werten für d und für den Konfidenzbereich 1 – α, die Größenordnung
n, die für
die Bestimmung des Bereichs der lytischen Aktivität eines bestimmten
Phagens verwendet wurde, zu überprüfen und
festzustellen, ob die lytische Aktivität, die für dieses n erhalten wurde,
mit den zugeordneten Werten d und 1 – α in Hinblick auf die allgemeine
Population der bakteriellen Stämme
einer bestimmten Gattung als korrekt angesehen werden kann.
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Der
Bakteriophagenstamm wird vorzugsweise in Schritt b) aus einer Probe
isoliert, die aus der Umgebung abstammt, indem diese durch einen
Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2
bis 0,4 μm
geführt
wird, dem Filtrat Kulturmedium hinzugefügt wird und es mit einer Broth-Kultur
von Bakterien einer definierten Gattung vermischt wird, bei einer
Temperatur von ungefähr
37°C für ungefähr eine
Stunde inkubiert wird, ein Teil der Suspension entnommen und auf
Festkulturmediumplatten aufgebracht wird, bei ungefähr 37°C für 2 bis
24 Stunden inkubiert wird, eine Probe des Mediums, welches einen
individuellen kahlen Punkt umgibt, isoliert wird, in die Broth-Kultur
von Bakterien der definierten Gattung übertragen wird und inkubiert
wird, bis sich die Kultur aufhellt und das Bakteriophagenprodukt
erhalten wird, indem das Lysat durch ein Membranfilter mit einer
Porengröße von 0,2–0,4 μm geführt wird,
wobei vorzugsweise die Inokulation des Festkulturmediums und die
Re-Isolation der kahlen Flecken fünfmal wiederholt wird.
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Die
Bakterienstämme
werden vorzugsweise in Schritt c) auf festes Medium inokuliert,
worauf ein Teil der in Schritt b) erhaltenen Bakteriophagenzubereitung
abgelagert wird, bei 37°C
für ungefähr 4 Stunden
inkubiert wird, wonach die Temperatur auf ungefähr 4°C für ungefähr 2 bis 24 Stunden eingestellt
wird, wodurch die lytische Aktivität des Bakteriophagenstammes
durch das Erscheinen von mindestens individuellen kahlen Flecken
evident wird.
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Es
ist dann möglich,
eine weitere Aufreinigung des Lysats durchzuführen, insbesondere im Hinblick auf
Endotoxin, worin die Mischung, die die Bakteriophagen enthält, mit
einem Substrat in Verbindung tritt, welches Zellulose oder ein zum
Teil verestertes Derivat davon enthält, dann mit einer Lösung gespült wird,
welche Verunreinigungen, insbesondere Endotoxin, entfernt, wonach
die aufgereinigten Bakteriophagen heraus gewaschen werden. Endotoxin
kann wirksam mit Wasser, einer Lösung
einer nicht dissoziierenden Substanz, oder einer Salzlösung, die
möglicherweise
gepuffert ist, mit einer Konzentration nicht höher als 0,1 M, eluiert werden.
Die Bakteriophagenfraktion kann auch wirksam mit einer Lösung einer
nicht dissoziierenden Substanz oder einem Puffer oder einer Salzlösung, die
möglicherweise
gepuffert ist, mit einer Konzentration von mehr als 0,05 M eluiert
werden. Die Elution von Endotoxin und Bakteriophagen wird auch bei
Temperaturen zwischen –25°C und +100°C durchgeführt. Die
Endotoxin- und Bakteriophagen-Elution kann vorzugsweise unter Verwendung
einer wässrigen
Salzlösung,
welche ein organisches Lösungsmittel
enthält,
ausgeführt
werden. Das organische Lösungsmittel
wird am besten aus einer Gruppe, welche Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Isopropanol
und Aceton umfasst, ausgewählt
und als Substrat kann Zellulose, welche zum Teil mit organischer oder
inorganischer Säure
verestert wurde, benutzt werden. Es kann ein Zellulosesubstrat,
welches zum Teil mit Essigsäure,
Salpetersäure,
Schwefelige Säure
oder Phosphorsäure
verestert wurde, benutzt werden, insbesondere kann als Substrat
Zellulose verwendet werden, von welcher 0,01 bis 5% der Glukosemoleküle vorzugsweise
0,25 bis 1%, noch bevorzugter zwischen 0,5 bis 1% der Glukosemoleküle verestert
wurden.
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Die
pathogenen Bakterienstämme
gehören
vorzugsweise zu den Gattungen Staphylococcus oder Pseudomonas.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Medikament zur Behandlung
oder Prävention
von Infektionen, die durch bakterielle Pathogene verursacht werden,
welches einen aktiven Wirkstoff und eine mögliche pharmazeutisch zugelassene
Trägersubstanz
beeinhaltet, sodass der aktive Wirkstoff einen multivalenten Bakteriophagenstamm,
welcher für
die Bekteriengattung spezifisch ist und welcher nach dem Verfahren
dieser Erfindung hergestellt wurde, umfasst.
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Gemäß der Erfindung
kann das Medikament die Eigenschaft aufweisen, dass es als ein multivalenter für Bakterien
der Gattung Staphylococcus spezifischer Bakteriophagenstamm, zumindest
einen Bakteriophagenstamm ausgewählt
aus S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM
F/00004), S5 (PCM F/00005), S6 (PCM F/00006) und S7 (PCM F/00007),
vorzugsweise die Phagen S1, S2 und S4 oder S5 enthält. Gemäß eines
Aspektes der Erfindung dient dieses hergestellte Medikament, zur
Behandlung oder Prävention
von Infektionen, die in Personen auftreten, die von Mukoviszidose
betroffen sind und, als multivalenter Bakteriophagenstamm, welcher
für Bakterien
der Gattung Staphylococcus spezifisch ist, enthält es zumindest einen Bakteriophagenstamm
ausgewählt
aus F/00002, F/00004 und F/00007.
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Gemäß der Erfindung
sollte das Medikament die Eigenschaft aufweisen, dass es als multivalenter Bakteriophagenstamm,
welcher für
Bakterien der Gattung Pseudomonas spezifisch ist, zumindest einen
Bakteriophagenstamm, ausgewählt
aus P1 (PCM F/00008, P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011),
P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015),
P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM
F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022),
P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM
F/00026) und P20 (PCM F/00027), optimalerweise Phagen P7, P20 und
P6, enthält.
Das gemäß eines
bestimmten Aspektes der Erfindung hergestellte Medikament dient
zur Behandlung oder Prävention
von Infektionen, die in Personen auftreten, die von Mukoviszidose
betroffen sind und es enthält
als multivalenter Bakteriophagenstamm, welcher für Bakterien der Gattung Pseudomonas
spezifisch ist, zumindest einen Bakteriophagenstamm ausgewählt aus
F/00010, F/00013 und F/00018.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Anwendung eines multivalenten
Bakteriophagenstammes, der gemäß des Verfahrens
der Erfindung hergestellt wurde, für die Entwicklung eines Medikaments
zur Behandlung oder Prävention
von bakteriellen Infektionen, welche durch bakterielle Pathogene
verursacht werden.
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Für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Infektionen, welche durch
Bakterien der Gattung Staphylococcus hervorgerufen werden, ist der
Einsatz mindestens eines Bakteriophagenstammes ausgewählt aus
S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004),
S5 (PCM F/00005), S6 (PCM F/00006) und S7 (PCM F/00007), optimalerweise
Phagen S1, S2 und S4 oder S5, von Vorteil. Für die Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung oder Prävention
von Infektionen, welche durch Bakterien der Gattung Staphylococcus
in Personen, die an Mukoviszidose leiden, hervorgerufen werden,
ist die Verwendung von mindestens einem Bakteriophagenstamm ausgewählt aus
F/00002, F/00004 und F/00007 von Vorteil.
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Für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Infektionen, welche durch
Bakterien der Gattung Pseudomonas hervorgerufen werden, ist die
Verwendung von zumindest einem Bakteriophagenstamm ausgewählt aus
P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011),
P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015),
P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM
F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022),
P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM
F/00026) und P20 (PCM F/00027), optimalerweise aus den Phagen P7,
P20 und P6, vorteilhaft. Für
die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention
von Infektionen, welche durch die Bakterien der Gattung Pseudomonas
in Personen, welche an Mukoviszidose leiden, hervorgerufen werden,
ist die Verwendung von zumindest einem Bakteriophagenstamm ausgewählt aus
F/00010, F/00013 und F/00018 vorteilhaft.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein multivalenter Bakteriophagenstamm,
welcher für
Bakterien der Gattung Staphylococcus spezifisch ist, und der aus
S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004),
S5 (PCM F/00005), S6 (PCM F/00006) und S7 (PCM F/00007), optimalerweise aus
S1, S2, S4 und S5, ausgewählt
wird.
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist auch ein multivalenter Bakteriophagenstamm,
welcher für
Bakterien der Gattung Pseudomonas spezifisch ist, und aus P1 (PCM
F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011),
P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015),
P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM
F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022),
P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026)
und P20 (PCM F/00027), optimalerweise aus P7, P20 und P6 ausgewählt wird.
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Für die Forschung
wurde unsere eigene Sammlung von Phagen verwendet, die gegen Bakterienarten aktiv
sind, die die häufigsten
Krankheitserreger von bakteriellen Infektionen in Menschen darstellen.
Die beschriebenen praktischen Beispiee betreffen multivalente Bakteriophagen,
die auf Staphylococci-Stämme
(Staphylcoccus aureus), die Methicillin-resistenten Stämme davon
umfassend, und auf den Blaueiterbazillus (Pseudomonas aeruginosa),
die besonders bei an Mukoviszidose Erkrankten auftreten, lytisch
wirken. Diese Arten sind momentan die Ursache ernsthafter Erkrankungen,
welche zu einer hohen Mortalität
führen.
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Die Vorteile
der Erfindung
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Die
Einführung
in die Therapie polyvalenter Phagenzubereitungen, welche multivalente
Phagen, die durch die Erfindung hergestellt wurden, enthalten, stellt
eine bedeutende Entwicklung zur Bekämpfung bakterieller Infektionen
dar, welche für
Antibiotikabehandlung nicht empfänglich
sind. Mit dieser neuen Technologie sind auch gewisse wirtschaftliche
Vorteile verbunden. Sie erlaubt eine wesentliche Verminderung der
Materialkosten und verkürzt
die Zeit zwischen dem Sammeln von Material für die Untersuchung bis zur
Herstellung einer therapeutischen Phagenzubereitung. Dank dieser
wird die Phagenzubereitung auf den Patienten warten und nicht der
Patient auf die Herstellung der individuellen Phagenzubereitung.
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Die
große
Reichweite der lytischen, aus mehreren multivalenten Phagen zusammengesetzten
Phagenzubereitungen, die nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt
wurden, stellt im Hinblick auf ihre Anwendung zur Behandlung bakterieller
Infektionen einen sehr wichtigen Vorteil dar. Es ist wohlbekannt,
dass mit einer Frequenz von ungefähr 10 × 10–7 innerhalb
bakterieller Populationen Arten auftreten können, die gegen einen Bakteriophagen
resistent sind. In Gegenwart von zwei Phagen beträgt die Frequenz
einer solchen Mutation ungefähr
1 × 10–14 und
mit drei Phagen nur 1 × 10–21.
Mit einer solchen Anordnung existiert das Problem von Phagen-resistenten
Bakterienstämmen
praktisch nicht.
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Die
hohe Anwendbarkeit der beispielhaft erläuterten Medikamente, die aus
multivalenten Phagen zusammengesetzt sind, verdient eine spezielle
Betonung. Sie können
generell in der medizinischen Praxis eingesetzt werden und erlauben
es, mit bedrohlichen bakteriellen Infektionen erfolgreich fertig
zu werden. Es ist auch möglich,
die gemäß der Erfindung
herstellbaren Phagen für
die Herstellung von Medikamenten zur äußeren Anwendung zu nutzen und
sie z.B. in der Behandlung und Prävention dermatologischer Infektionen
einzusetzen. Es wurde gezeigt, dass orale Verabreichung von Phagenlysaten,
welche gemäß dieser
Erfindung hergestellt wurden, die Widerstandsfähigkeit gegen eine mögliche zukünftige bakterielle
Infektion erhöht.
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In
einigen Fällen
kann die Phagentherapie zusammen mit einer Antibiotikatherapie verwendet
werden.
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Es
wurde gezeigt, dass polyvalente Phagenzubereitungen, die zur Behandlung
von bakteriellen Infektionen eingesetzt wurden, höchst wirksam
sind. Eine besondere Effektivität
wurde bei der Behandlung von Sepsis (88% Heilung) und bei der Behandlung
von Infektionen von Patienten mit Mukoviszidose beobachtet.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
die Resultate der Analyse der Statistik, die für die Phagen S1–S7 erhalten
wurden.
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2 zeigt
die Resultate der Analyse der Statistik, die für die Phagen P1–P20 erhalten
wurden.
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3 zeigt
die Resultate der statistischen Analyse der Wirksamkeit von ausgewählten Phagenstämmen hinsichtlich
bakterieller Stämme,
die zu der Gattung Staphylococcus gehören und aus Mukoviszidose-Patienten
isoliert wurden.
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4 zeigt
die Resultate der statistischen Analyse der Wirksamkeit von ausgewählten Phagenstämmen hinsichtlich
bakterieller Stämme,
die zu der Gattung Pseudomonas gehören und aus Mukoviszidose-Patienten
isoliert wurden.
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Zu
einem besseren Verständnis
wird das Wesentliche der Erfindung untenstehend anhand von Beispielen
erklärt.
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Beispiel 1. Bakteriophagen-Isolation
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Bakteriophagen
für Staphylococcus
und Pseudomonas wurden aus kommunalen Abwässern isoliert. Das Abwasser
wurden durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2
bis 0,4 μm
geführt,
welcher Bakterien einfängt,
aber es den Bakteriophagen erlaubt, durchzulaufen. Ausgehend von
dem entstehenden Filtrat wurde konzentriertes Flüssigkulturmedium hinzugefügt und verschiedene
Verdünnungen
des Filtrats wurden mit jungen Broth-Kulturen von Bakterien (Staphylococcus
aureus oder Pseudomonas aeruginosa) vermischt. Die Proben wurden
bei 37°C
für eine
Stunde inkubiert, wonach von jeder Probe mit einer Pipette 0,2 ml
Suspension abgezogen wurde und auf Agarmedium-enthaltende Platten
mit Hilfe eines Glasstabs aufgebracht und die Platten über Nacht
bei 37°C
inkubiert wurden. Falls der gesuchte Phage auf den Platten, die mit
einer angemessenen Verdünnung
des die jungen Bakterienkulturen enthaltenden Filtrats inokuliert
waren, vorhanden war, wurde ein einheitliches (nebulöses) Bakterienwachstum
und gesondert durchsichtige kleine Bereiche, die so genannten kahlen
Flecken, beobachtet, welche normalerweise mehrere Millionen Phagenpartikel
enthielten. Ein einzelner kahler Punkt zusammen mit dem umgebenden
Agar wurde mit Hilfe einer Platinschlaufe herausgeschnitten, dann
zu einer frischen Broth-Kultur mit Bakterien überführt und inkubiert, bis die
Kultur sich aufgehellt hatte. Nachdem sie durch einen Membranfilter
der Porengröße zwischen
0,2 und 0,4 μm,
welcher alle Bakterien, die in dem Lysat verblieben waren, zurückhält, geführt wurde,
enthielt das Filtrat ausschließlich
Bakteriophagen. Das Animpfen verschiedener Verdünnungen mit den gewonnenen
Phagen zusammen mit den entsprechenden Bakterien auf Agarmedium
und die Re-Isolation der kahlen Stellen wurde fünfmal durchgeführt, was
die Gewinnung einer reinen Phagenlinie ermöglichte.
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Beispiel 2. Die Bestimmung
der Anfälligkeit
von Staphylococcus aureus-Stämmen
für Bakteriophagenmikroorganismen,
welche für
sie spezifisch sind.
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Die
Anfälligkeit
wurde unter Verwendung des von Wahl beschriebenen Kulturmediums
bestimmt. Platten mit diesem Medium wurden bei einer Temperatur
von 37°C
für 30
Minuten getrocknet, mit einer jungen 4-Stunden Broth-Kultur von
Staphylococcus aureus bedeckt, welche durch Schütteln gemischt wurde, der Überschuss
der Suspension wurde mit einer Pipette entfernt und nochmals für 30 Minuten
bei 37°C
getrocknet. Auf einer Platte, welche in sechs Segmente unterteilt
war, wurde die Anfälligkeit
des zu untersuchenden Stamms für
sechs verschiedene aber spezifische Bakteriophagen bestimmt. Ein
Tropfen einer 1/10 Bakteriophagenverdünnung wurde auf die Oberfläche eines
jeden Segmentes platziert. Die Platten wurden in einem Ofen bei
37°C für ungefähr 4 Stunden
inkubiert, wonach sie in einem Kühlschrank
bis zu dem darauf folgenden Tag gestellt wurden. Im Fall einer hohen
Anfälligkeit
des Stammes für
den definierten Phagen werden durchsichtige Bereiche an dem Ort
sichtbar, wo der Phage auf das Kulturmedium eingeführt wurde,
welches gleichmäßig mit
Bakterienwachstum bedeckt war; diese sind das Ergebnis einer totalen
Zerstörung
der Bakterienzellen (Lyse). Eine geringere Anfälligkeit des Stammes offenbart
sich durch das Erscheinen einzelner kahler Flecken.
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Beispiel 3. Die Bestimmung
der Anfälligkeit
von Pseudomonas-Stämmen
für Bakteriophagenmikroorganismen,
welche für
sie spezifisch sind.
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Das
Verfahren zur Bestimmung der Sensitivität war ähnlich zu dem, welches in Beispiel
2 beschrieben wurde. In diesem Fall jedoch war das Stammmedium Agar
mit einem Phosphatpufferzusatz und die Inkubationszeit der Platten,
auf denen der Phage abgesetzt wurde, betrug fünf Stunden.
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Beispiel 4. Auswahl von
Phagen mit dem breitesten Wirkungsspektrum hinsichtlich Staphylococcus-
und Pseudomonas-Stämmen – Herstellung
multivalenter Phagenstämme.
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Bakteriophagen
wurden gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert. Es wurde die Anfälligkeit
von 845 Arzneimittel-resistenten klinischen Stämmen verschiedener Staphylococcus
Arten, die aus ganz Polen isoliert wurden, für Phagen aus der Sammlung Stophylococcus-spezifischer
Bakteriophagen und die Anfälligkeit
von 880 Arzneimittelresistenten klinischen Stämmen verschiedener Pseudomonas
Arten für Phagen
aus der Sammlung Pseudomonas-spezifischer Bakteriophagen bestimmt.
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Eine
Analyse der Anfälligkeiten
beider Stammgruppen für
die jeweiligen Phagen ermöglichte
die Auswahl von Phagen mit einer unerwartet hohen Aktivität und einem
breiten Spektrum lytischer Wirkung. Diese Phagen werden in Tabelle
1 und 2 gezeigt.
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Tabelle
1. Phagen für
Staphylococcus mit hoher lytischer Aktivität hinterlegt bei der polnischen
Sammlung von Mikroorganismen (PCM), Breslau, Polen.
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Tabelle
2. Phagen für
Pseudomonas mit hoher lytischer Aktivität hinterlegt bei der polnischen
Sammlung von Mikroorganismen (PCM), Breslau, Polen.
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Die
Ergebnisse für
die Phagen S1–S7
und P1–P20
wurden einer statistischen Analyse unterworfen, um festzustellen,
ob die p-Werte, die für
die einzelnen Phagen erhalten wurden, für die allgemeine Population der
jeweiligen Bakteriengattungen als korrekt angesehen werden können. Die
Ergebnisse werden in den 1 und 2 gezeigt.
Die berechneten Werte für
n waren für
die meisten Bakteriophagen niedriger als die Zahl der Bakterienstämme der
Forschungsproben, was darauf hinweist, dass die Bereiche der lytischen
Spektren mindestens hinsichtlich der klinischen Stämme, die
in Polen auftreten, richtig sind. In Anbetracht dieser Ergebnisse
können
die Phagen, die in Tabelle 1 und 2 aufgeführt sind, hinsichtlich dieser
Erfindung als multivalente Phagen angesehen werden.
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Unerwarteterweise
zeigten im Fall der Phagen für
Staphylococcus drei der sieben aktivsten, d.h. S1, S2 und 54 oder
S5, eine lytische Aktivität
für 95%
der untersuchten Staphylococcus-Stämme. Auch zeigten drei der
21 für
Pseudomonas ausgewählten
Phagen, d.h. P7, P20 und P6, eine lytische Aktivität für 87% der untersuchten
Pseudomonas-Stämme.
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Man
kann auch Patienten, die an Mukoviszidose leiden, als einen „gegebenen
Bereich der Entstehung einer bakteriellen Infektion" so wie sie in dem
Kern der Erfindung definiert ist, betrachten. In der Untersuchung der
in dieser Patientengruppe aufgetretenen Pathogene wurden 137 bakterielle
Stämme
verwendet, von welchen 84 als Pseudomonas und 53 als S. aureus identifiziert
wurden. Alle Stämme
wurden aus von Mukoviszidose-Patienten stammendem Material aus ganz
Polen isoliert. Eine Analyse der Anfälligkeit der untersuchten Pseudomonas
und S. aureus Stämme
für Phagen
ermöglichte
die Auswahl von Phagen mit der größten lytischen Aktivität und dem
breitesten Wirkungsbereich. Unerwarteterweise zeigten im Falle von
Phagen für Pseudomonas
drei der 21 aktiven Phagen, d.h. F/00010, F/0013 und F/00018, eine
lytische Aktivität
für 75% der
Pseudomonas-Stämme
(für die
Erfolgswahrscheinlichkeit siehe 3, in welcher
Phage 3 = F/00010, Phage 6 = F/00013, und Phage 11 = F/00018). Unter
den ausgewählten
Phagen für
Staphylococcus, zeigten drei, d.h. F/00002, F/00004 und F/00007,
eine lytische Aktivität
für 98%
der Staphylococcus-Stämme
(für die Erfolgswahrscheinlichkeit
siehe 3, in welcher Phage 1 = F/00002, Phage 3 = F/00004
und Phage 4 = F/00007).
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Beispiel 5. Vermehrung
von Phagen für
Staphylococcus und von Phagen für
Gramnegative Bazillen, Herstellung von Phagenlysaten.
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Ungefähr 5% Phagenlysat
wurde zu jungen, 4-Stunden-Kulturen von Staphylococcus aureus (logarithmische
Phase) in Broth-Medium mit Glukosezusatz gegeben. Die Teströhrchen oder
Flaschen wurden durch Schütteln
gemischt und für
3 Stunden bei 37°C
inkubiert. Nach dem Auftreten einer klaren Kultur (Lyse) wurden die
Proben bis zum folgenden Tag kühl
gehalten. Um alle verbleibenden unlysierten Bakterienzellen zu entfernen,
wurde das Lysat durch einen Membranfilter der Porengröße 0,2–0,4 μm geführt. Die
Konzentration lebender Phagenpartikeln wurde durch die Zweischichtenmethode
von Gratia ermittelt. Eine inkubierte Kultur ohne den Zusatz von
Phagenlysat diente als Kontrolle.
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Vermehrung
von Phagen für
gram-negative Bazillen (Pseudomonas). Zur Vermehrung von Phagen
für Pseudomonas
wurde Peptonwasser verwendet. 5% Phagenlysat wurde zu einer jungen,
4-Stunden-Kultur von Pseudomonas aeruginosa gegeben, die Teströhrchen oder
Flaschen wurden durch Schütteln
gemischt und die Proben wurden bei 37°C für 5 Stunden inkubiert. Nachdem
sich die Kultur geklärt
hatte, wurden die Proben bis zum folgenden Tag in einem Kühlschrank
aufbewahrt und wonach sie durch einen Membranfilter der vorher genannten
Porengröße gefiltert
wurden. Die Anzahl an lebenden Phagenpartikeln in dem Lysat wurde
nach einem Verfahren von Gratia bestimmt.
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Das
sterile Broth-Phagenlysat zeigt eine lang anhaltende lytische Aktivität. Solang
man sie kalt hält, bewahren
sie ihre Vitalität
für mehrere
Jahre, in Einzelfällen
für über 10 Jahre.
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Beispiel 6. Die Herstellung
und Anwendung polyvalenter Phagenzubereitungen.
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Das
sterile Broth-Lysat herstellbar nach dem in Beispiel 5 beschriebenen
Verfahren, welches aus den in Beispiel 4 ausgewählten Phagen mit einem breiten
Spektrum an lytischer Aktivität,
entstand oder deren konzentrierte oder weiter aufgereinigten Formen
(siehe das folgende Beispiel), diente zur Herstellung der polyvalenten
Phagenmedikamente.
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Die
beispielhaft aufgeführte
polyvalente Phagenzubereitung für
Staphylococcus ist eine Mischung, die verschiedene Mengen der Phagenlysate
S1, S2 und S4 oder S5 oder Derivate dieser Lysate enthält. Für Infektionen,
die durch Staphylococcus in Mukoviszidose-Patienten entstehen, sollten
Zubereitungen aus Phagen F/00002, F/00004 und F/00007 verwendet
werden.
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Die
beispielhaft aufgeführte
polyvalente Phagenzubereitung für
Pseudomonas stellt eine aus verschiedenen Mengen der Phagenlysate
P7, P20 und P6 oder Derivaten dieser Lysate bestehenden Mischung
dar. Für
Infektionen, die durch Pseudomonas in Mukoviszidose-Patienten entstehen,
sollten Zubereitungen aus Phagen F/00010, F/00013 und F/00018 verwendet
werden.
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Das
Medikament wird oral dreimal täglich,
30 Minuten vor den Mahlzeiten, nach vorangegangener Neutralisierung
der Magenflüssigkeiten
(z.B. mit einem Gel Alumini phosphorici, gereinigtem Soda- oder
VIchy-Wasser), in einer Menge, der 10 ml Lysat entsprechen, verabreicht.
Sollte die Zubereitung direkt in Wunden appliziert werden, sollte
dies dreimal in einem Zeitraum von 24 Stunden gemacht werden. Bei
einer örtlichen
Anwendung sollte die Wunde nicht mit Desinfektionsmittel gereinigt
werden, da dies zu einer Inaktivierung der Phagen führen könnte. Falls
notwendig, können
die Wunden mit einem sterilen Kulturmedium oder einer 0,9%igen physiologischen
NaCl-Lösung
gereinigt werden.
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In
bestimmten Fällen
kann die Phagentherapie zusammen mit einer Antibiotikatherapie eingesetzt werden.
Die polyvalenten Phagenzubereitungen, die zur Behandlung von bakteriellen
Infektionen eingesetzt wurden, zeigten eine hohe Wirksamkeit. Eine
besondere Effizienz wurde bei der Behandlung von Sepsis (88% Heilungsgrad)
und von Infektionen, die in Mukoviszidose-Patienten auftreten, beobachtet.
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Beispiel 7. Weitere Aufreinigung
von Bakteriophagenzubereitungen, Entfernung von Endotoxin aus Mischungen,
die Bakteriophagen enthalten.
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In
mehreren medizinischen Anwendungen werden auch wegen der Verabreichungsmethode
(z.B. intravenös)
Bakteriophagenzubereitungen von hoher Reinheit benötigt; insbesondere
sollten sie frei von bakteriellem Endotoxin sein. Dem Verfahren
dieser Erfindung folgend wurde die Affinität von Bakteriophagen an ein Substrat
verwendet, welches Zellulose oder optimalerweise ein verestertes
Derivat davon umfasst. In diesem Beispiel wurde ein kommerziell
erhältliches
sulfatiertes Zellulosederivat verwendet, welches sich durch einen niedrigen
Veresterungsgrad (8 μmol/ml
Gel) auszeichnet. Das Substrat wurde dazu verwendet, Endotoxin aus der
Bakteriophagen-enthaltenden Mischung zu entfernen. Nach der Spülung des
Substrats und der Entfernung des Endotoxins stellt die Elution der
adsorbierten Bakteriophagen den nächsten Reinigungsschritt dar.
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1
ml Substrat, welches das sulfatierte Zellulosederivat enthält, wurde
in eine sterile Chromatographiesäule
gefüllt.
Der Ausfluss von Substrat aus der Säule wurde verhindert, indem
der untere Teil der Säule
mit Glaswolle, die mit 70% Ethanolgetränkt war, abgedichtet wurde.
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Es
wurden die folgenden Elutionspuffer hergestellt:
- Puffer
I: 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,6;
- Puffer II: 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,6, enthaltend 1 M Natriumchlorid.
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Die
Salze, welche in die Zusammensetzung des Eluenten aufgenommen wurden,
wurden für
1 Stunde bei 145°C
gebacken.
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Die
Lösungen
wurden unter Verwendung von destilliertem nicht-pyrogenen Wasser
hergestellt.
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Vor
der Chromatographie wurde 1 ml Substrat in eine Chromatographiesäule gefüllt, die
mit 5 ml Puffer I und dann mit 5 ml Puffer II durchspült wurde.
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Die
Säule wurde
für die
eigentliche Chromatographie vorbereitet, indem sie mit 10 ml Puffer
I gespült wurde.
Die Beseitigung von Endotoxin wurde erreicht, indem der hochmolekulare
Anteil des aus dem Molekularsiebverfahren an Sepharose 4B enthaltenem,
konzentrierten Bakteriophagenlysat Ps PCM F/00018 verwendet wurde.
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0,2
ml der Bakteriophagenmischung wurde in eine Chromatographiesäule überführt, die
1 ml Substrat enthielt, welches sulfatiertes Zellulosederivat enthielt.
Ein Anteil von 0,2 ml Volumen wurde abgenommen. Die erste Fraktion
wurde mit 3 ml Puffer I eluiert. Unter diesen Bedingungen floss
ungebundenes Endotoxin aus der Säule.
Die zweite Fraktion wurde mit Puffer II eluiert. Fraktion II enthielt
die gereinigten Bakteriophagen.
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Die
Ergebnisse der Einheiten von Endotoxin in den Fraktionen:
Das
Material, das der Chromatographie mit einem Substrat, welches ein
sulfatiertes Zellulosederivat enthielt, ausgesetzt wurde, enthielt
2500 Endotoxineinheiten/ml. Die mit Puffer I eluierte Fraktion enthielt
600-1000 Endotoxineinheiten/ml und die mit Puffer II eluierte Fraktion
enthielt Bakteriophagen ohne Endotoxin (ungefähr 1 Einheit/ml).
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Der
Anteil an Endotoxin in den Bakteriophagenzubereitungen wurde nach
dem Gelverfahren der Firma Charles River Endosafe, Charleston, USA
bestimmt. Die multivalenten Bakteriophagenstämme der vorliegenden Erfindung
wurden gemäß den Verordnungen
des Budapest-Übereinkommens
hinterlegt und deren Einzelheiten werden in der folgenden Tabelle
3 dargestellt.
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Tabelle
3: Hinterlegung von Bakteriophagenstämmen
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