DE19844191A1 - Lipopolysaccharide aus Escherichia coli - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Lipopolysaccharide aus Escherichia coli, die gekennzeichnet sind durch die Kombination einer O-Kette des E. coli 06-Typs mit nur einer repeating unit, einem Lipoid A mit der an sich für E. coli bekannten Struktur sowie einem Kernoligosaccharid mit 4 Heptose-, 6 Glucose- und 2 Galactoseresten als wesentliche Bestandteile, ferner das Verfahren zur Gewinnung und die Verwendung dieser Lipopolysaccharide.

Description

Die Erfindung betrifft neue Lipopolysaccharide aus E. coli.

Unter Endotoxinen werden Bakterientoxine verstanden, die im Gegensatz zu Exotoxinen nicht von lebenden Bakterien ausgeschieden, sondern erst nach Autolyse freigesetzt werden. Bei den sogenannten klassischen Endotoxinen handelt es sich um hitzestabile Lipopolysaccharide, im folgenden LPS genannt, aus der äußeren Zellmembran von in der Regel gram negativen Bakterien. LPS bestehen aus dem sogenannten Lipoid A, einem Kernpolysaccharid sowie einer spezifischen O-Kette, wobei das Lipoid A für die toxische Wirkung von LPS verantwortlich ist.

Endotoxine stimulieren im Makroorganismus die Produktion von Mediatoren des Immunsystems wie Interleukin 1, abgekürzt IL-1, und Tumor-Nekrose- Faktor, abgekürzt TNFα.

Über die Zusammensetzung der Endotoxine von Enterobakterien und insbesondere E. coli sind bereits eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt worden, wobei man festgestellt hat, daß S/R-Mutanten in der Regel nur eine Wiederholeinheit, also eine repeating unit ihrer O-Kette enthalten. Man geht davon aus, daß in diesen Fällen das Gen, welches für das polymerisierende Enzym der O-Kette codiert, defekt ist und nur eine repeating unit auf das Kernoligosaccharid übertragen wird. LPS-Strukturen ähnlichen Typs, aber anderer Struktur werden häufig auch in humanpathogenen Keimen wie Neisseria, Vibrio, Campylobacter, Helicobacter usw. gefunden. Diese Keime verfügen über ein LPS, welches es ihnen ermöglicht, durch ein besonderes molekulares Mimikry, nämlich das Vorhandensein von Sialinsäure und sialinsäurehaltigen Oligosacchariden, die den Glycoproteinen und Glycolipiden der Säugetiere ähneln, sich der Immunabwehr des Wirtes zu entziehen. Für E. coli DSM 6601 wurde der O6-Serotyp festgestellt. Diese Struktur ist von P. E. Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283 untersucht und publiziert worden. Die Struktur entspricht der in Abb. 2 dargestellten Formel.

Auch das Lipoid A der Colibakterien ist von verschiedenen Forschergruppen untersucht worden, wobei sich herausgestellt hat, daß die Struktur des Lipoid A in der Regel in der Hexaacylform vorliegt und für alle Serotypen von E. coli übereinstimmt. Die Struktur der Hexaacylverbindung wurde von E. Th. Rietschel et al., Structure and conformation of the lipid A component of lipopolysaccharides; Handbook of Endotoxins (Procter, R., ed.), Vol. 1, Chemistry of Endotoxin (E. Th. Rietschel, ed.), Elsevier, Amsterdam (1984), pp. 187-220 veröffentlicht und entspricht Abb. 4.

Die spezifische O-Kette und das Lipoid A sind über einen sogenannten Core miteinander verbunden, der ein Oligosaccharid darstellt. Bisher sind fünf verschiedene Kernoligosaccharide bei E. coli bekannt; wir verweisen insoweit auf O. Holst et al., Chemical structure of the core region of lipopolysaccharide, in: Bacterial Endotoxic Lipopolysacchariides, Vol. 1, Morrison D. C. and Ryan, J. L. (eds.), Boca Raton, FL, USA (1992) pp. 135-170.

Das Oligosaccharid von E. coli K-12 enthält beispielsweise 4 mol Heptosen, 3 mol Glucose und 1 mol Galadose sowie 2-Keto-3-desoxy-D-manno­ oktulosonsäure, abgekürzt Kdo, über die die Bindung zu Lipoid A erfolgt. Die Struktur der Kernregion von E. coli K-12 ist in Abb. 3 dargestellt.

Auch bei Untersuchungen der LPS von E. coli Stamm DSM 6601 hat sich herausgestellt, daß das Lipoid A in seiner Zusammensetzung der Hexaacylform der auch sonst für E. coli berichteten Lipoide A entspricht. Die Untersuchungen hinsichtlich der Freisetzung von IL-1 und TNFα, in humanen Monocyten bestätigen, daß offensichtlich Lipoid A die gleiche Aktivität aufweist und daher mit hoher Wahrscheinlichkeit der bekannten Struktur von Lipoid A von E. coli entspricht.

Die Struktur des spezifischen O-Antigens von E. coli DSM 6601 überrascht durch die Tatsache, daß offensichtlich nur eine einzige repeating unit regelmäßig in der Kette vorliegt, was darauf schließen läßt, daß es sich bei dem Stamm DSM 6601 um eine S/R-Mutante handelt, was für ein Humanisolat äußerst ungewöhnlich ist. Die Struktur dieser repeating unit entspricht aber, wie die serologische Analyse zeigt, dem Grundmuster der O- Kette von E. coli O6.

Völlig neue Strukturmerkmale weist aber die Core-Region beim Stamm DSM 6601 auf. Die bei der Analyse gefundenen 4 mol Heptose legen die Verwandschaft mit einer E. coli K-12-Struktur nahe, aber die Core-Region ist mit der Kernregion von E. coli K-12 diesbezüglich ähnlich, aber nicht identisch, da zusätzlich zu den 3 mol Glucose weitere 3 Glucosereste enthalten sein müssen. Ähnliches gilt für die Galaktose, denn die Struktur von K-12 beinhaltet nur 1 mol Galaktose, während beim Stamm DSM 6601 2 mol Galactose enthalten sein müssen. Die bisherigen Befunde können dahingehend interpretiert werden, daß hier eine bisher unbekannte Core- Region vorliegt, die für die biologischen Besonderheiten dieses Stammtes entscheidend sein könnte. Strukturelle Besonderheiten deutet auch die Tatsache an, daß 8 Phosphatreste pro Molekül LPS analytisch festgestellt wurden, da Lipoid A in der Regel nur 2 Phosphatreste aufweist. In dieselbe Richtung verweist auch die Tatsache, daß ein nicht-stöchiometrischer Gehalt von Pyrophosphoethanolamin bei bestimmten Analysen gefunden werden konnte, der allerdings wahrscheinlich mit dem Alter der eingesetzten Bakterienmasse und/oder den Kulturbedingungen zusammenhängen könnte.

Zusammenfassend läßt sich daher feststet ten, daß sich das LPS des Stammes DSM 6601 von den bisher bekannten LPS aus E. coli signifikant insbesondere im Zuckeranteil des Core und in der O-Kette unterscheidet. Das Lipoid A scheint biologisch dem üblichen Colityp zu entsprechen, was die Vermutung über die Rolle der Zucker bei der biologischen Wirksamkeit unterstreicht. Die beschriebenen LPS sind nicht nur zur Identifizierung der diese tragenden Colistämme geeignet, sondern weisen biologisch auch eine überraschend starke immunstimulierende Wirkung bei praktisch fehlender Toxizität auf, so daß sie als wirksame Arzneimittel und Prophylactica eingesetzt werden können.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Herstellung des LPS

Das LPS wurde aus der gewaschenen und getrockneten Bakterienmasse nach einer modifizierten Phenol/Wasser-Extraktion gewonnen; insoweit wird verwiesen auf O. Westphal et al., Bacterial Lipopolysaccharides, Extraction with Phenol-Water and Further Applications of the Procedure, Meth. Carbohydr. Chem., Vol. V (1965) pp. 83-91.

47 g der gefriergetrockneten Bakterien, die zuvor zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen wurden, wurden nach Westphal und Jann entsprechend einer modifizierten Vorschrift extrahiert. Die Modifikation bestand in einer anschließenden Enzymbehandlung (DNAse, RNAse, Proteinase K) des wäßrigen Extraktes, welche dazu dient, eventuelle Fremdproteine und DNA/RNA-Bestandteile zu entfernen. Hierzu wird die wäßrige Phase (ca. 1,2 l) bei Raumtemperatur mit je 20 mg RNAse (Ribonuclease A, bovine pancreas, Sigma) und 20 mg DNAse (Dnase I, bovine pancreas, grade II, Sigma) versetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 30 h gerührt. Anschließend werden 20 mg Proteinase K (Tritirachium album, Boehringer, Mannheim) zugegeben und weitere 12 h gerührt. Die Suspension wird sodann 24 h bei 4°C dreimal gegen 15 l destillierten Wassers dialysiert und danach gefriergetrocknet. Der enzymbehandelte Extrakt wird erneut in destilliertem Wasser aufgenommen, so daß eine Endkonzentration von 50 mg/ml erreicht wird. Diese Suspension wird dreimal in der Kälte zentrifugiert (155.000 × g, 4°C, 4 h). Das Sediment (LPS) wird in 150 ml destilliertem Wasser aufgenommen und noch einmal drei Tage gegen Wasser dialysiert und danach lyophilisiert (Ausbeute LPS: 1,45 g, 3.1% m/m).

Beispiel 2 Analyse der LPS aus E. coli Stamm DSM 6601

Hexosamin (HexN) (bedeutet hier Glukosamin + Galaktosamin, GlcN + GalN) wurde nach dem modifizierten Morgan-Elson-Test bestimmt (Strominger, J.L., Park, J.T. Thompson, R.E. J. Biol. Chem. 234, 3263-3268 (1959)), aber alternativ auch mittels eines Aminosäureanalysators von LKB (Alpha plus 4151). Im Gegensatz zum Morgan-Elson-Test kann bei diesem Analyseverfahren nicht nur GlcN und GalN getrennt bestimmt und quantifiziert werden, sondern es kann darüber hinaus auch noch die Anwesenheit von GlcN-Phosphat, 2-Ethanolamin und 2- Ethanolaminphosphat, welche häufig in LPS vorkommen, parallel ermittelt werden. Gas-Flüssigkeitschromatographie (GC) wurde an einem Varian 3700 GC oder Hewlett Packard (HP Serie 5890 Serie II) Gaschromatograph auf einer Kapillarsäule (fused-silica SPB-5®, 30 m, Supelco Säule) durchgeführt. Die kombinierte Gas-Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie (GC- MS) erfolgte an einem Massenspektrometer (HP Modell 5989), das mit einer HP-1 Kapillarsäule (30 m, Hewlett Packard) ausgerüstet war. Die GC- bzw. GC-MS Analysen wurden für die Bestimmung der Neutralzucker (Glc, Gal, Hep, Man) als deren Alditolazetate angewandt (Sawardeker, J.S., Slonerker, J.H. Jeanes, A. Anal. Chem. 37, 1602-1604 (1967)) sowie für die Bestimmung und Quantifizierung der Fettsäuren als deren Fettsäuremethylester-Derivate nach starker Methanolyse (2M HCl/MeOH, 120°C, 16 h) (Wollenweber, H.-W. and Rietschel, E.Th., Analysis of lipopolysaccharide (lipid A) fatty acids, J. Microbiol. Meth. 11, (1990) 195-211) und Extraktion mit Chloroform. Bei beiden GC-Analyseverfahren wurde bei 150°C (isotherm für 3 min) gestartet und mittels eines linearen Temperaturgradienten von 5°C/min bis 320°C erhöht. Phosphat wurde nach Lowry et al. (Lowry, O.H., Roberts, N.R., Leiner, K.Y., Wu, M.KL. Farr, A.L., J. Biol. Chem. 207, 1-17 (1954)) und die 2-Keto-3-desoxy-D-manno­ oktulosonsäure (Kdo) mittels des Thiobarbitursäuretestes bestimmt (Waravdekar, V. C. & Saslaw, L. D., J. Biol. Chem. 234, 1945-1950 (1959)).

Tabelle

Komponentenanalyse von E. coli LPS extrahiert aus dem Stamm DSM 6601

Die nach dem beschriebenen Verfahren gewonnenen LPS-Präparate wurden zusammen mit Vergleichs-LPS der Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Für die Darstellung der SDS-PAGE-Analyse des LPS wurde mit 14% Polyacrylamidgelen gearbeitet (U.K., Laemmli, Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685 (1970). Die LPS-Banden wurden mittels der empfindlichen alkalischen Silberfärbemethode angefärbt (C.M. Tsai et al., C.F., A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamid gels, Anal. Biochem., 119, 1982, 115-119).

Das Ergebnis der Untersuchungen ist in Abb. 1 dargestellt.

Beispiel 3 Biologische Aktivität a) IL-1-Aktivität

Die IL-1-Aktivität wird mittels eines MNC-Proliferationsassays in einem Kulturüberstand bestimmt. Humane Monozyten (MNC) werden aus dem peripheren Blut freiwilliger Spender isoliert (8 × 10⁵ MNC/200 ml) und diese in ein Glas überführt und gleichzeitig mit Testsubstanz versetzt. Für die Testung der biologischen Aktivität in vitro werden die Zellen zunächst mit LPS stimuliert (10 ng/ml). Nach einer Inkubationszeit von 8 Stunden werden 150 ml des Kulturüberstandes auf Cytokinfreisetzung hin untersucht. Die IL- 1-Aktivität wird mittels eines Fibroblasten-Proliferationsassays in einem Kulturüberstand bestimmt. Die dazu notwendigen Fibroblasten wurden aus humaner Vorhaut gewonnen. Die Proliferation dieser Fibroblasten wurde durch IL-1 gesteigert. Durch einen Vergleich der Dosiswirkungskurve des Kulturüberstandes mit der Kurve des Standards in einer Probitanalyse wird die biologische Aktivität im Kulturüberstand bestimmt. Das LPS aus einem bekannten endotoxisch aktiven Bakterienstamm (Salmonella friedenau) dient als Referenz (positive Kontrolle) und ist daher in der Abb. 6 mit aufgeführt.

b) TNFα-Aktivität

Die TNFα-Aktivität in einem Kulturüberstand wird in einem Zytotoxizitätsassay mit der TNF-empfindlichen Zellinie L929 bestimmt. Der Vergleich der Dosiswirkungskurve des Kulturüberstandes mit der Kurve des Standards in einer Probitanalyse läßt die Bestimmung der TNF-Aktivität zu. Auch hier dient ein bekannt endotoxisch aktives LPS aus Salmonella friedenau als positive Kontrolle.

Die Ergebnisse sind in der Abb. 5 graphisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß sich hinsichtlich der IL-1 und der TNFα-Ausschüttung keine signifikanten Unterschiede zwischen dem LPS aus Salmonella friedenau, das als Standard und Positivkontrolle dient, und dem LPS aus dem Stamm DSM 6601 feststellen lassen (Abb. 5, Bild 1 und 2, unten). Dies wird auch dadurch bestätigt, daß das Lipoid A des Stammes DSM 6601 fast deckungsgleich aktiv mit dem hoch aufgereinigten Lipoid A von E. coli (Abb. 5, Darstellung 1 und 2, oben) ist.

Claims (6)

1. Lipopolysaccharid (LPS) aus Escherichia coli, gekennzeichnet durch die Kombination einer O-Kette des E. coli O6-Typs mit nur einer repeating unit, eines Lipoid A mit der an sich für E. coli bekannten Struktur sowie einem Kernoligosaccharid mit 4 Hep-, 6 Glc- und 2 Gal-Resten als wesentlichen Bestandteilen.

2. LPS nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 8 Phosphatresten pro Molekül LPS.

3. LPS nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 0,5 mol P-Etn pro Molekül LPS.

4. Verfahren zur Gewinnung von LPS nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gewaschene und getrocknete E. coli Bakterienmasse in an sich bekannter Weise einer Phenol/Wasserextraktion unterworfen und der so gewonnene Extrakt einer Behandlung mit RNAsen/DNAsen und Proteinase K unterzogen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli Stamm DSM 6601 eingesetzt wird.

6. Verwendung von Lipopolysaccharid aus E. coli Stamm DSM 6601 nach Anspruch 1 bis 3 für mikrobiologische, biotechnische, analytische, diagnostische und/oder medizinische Zwecke.