DE10247073B4 - Verfahren zur Herstellung von monomeren Uronsäuren, insbesondere D-Mannuronsäure und D-Guluronsäure und deren Verwendung als Arzneimittel - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von monomeren Uronsäuren, das die folgenden Schritte umfasst:
a. Fermentieren eines Polyuronsäure produzierenden Bakterienstammes, dessen Epimerase-Gen inaktiviert worden ist;
b. Isolieren der Polyuronsäure aus dem Überstand der Fermentationsbrühe;
c. Hydrolysieren der Polyuronsäure von Schritt b.;
d. Isolieren des Uronsäuremonomers aus dem Verfahrenprodukt von Schritt c.,
wobei die Polyuronsäure aus einem Monomeren aufgebaut ist.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monomeren Uronsäuren, insbesondere Mannuronsäure und Guluronsäure, bevorzugt aus mikrobiell hergestelltem Polymannuronat oder Polyguluronat. Ferner wird die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben, die antiphlogistisch wirkt und zur Behandlung von Störungen des Immunsystems, insbesondere von Gelenkentzündungen verwendet werden kann.
• Die rheumatoide Arthritis ist eine entzündliche Systemerkrankung, die überwiegend die Gelenke befällt. Eine ältere Bezeichnung für die rheumatoide Arthritis, die noch häufig benutzt wird, ist chronische Polyarthritis. Über eine Million Menschen leiden in Deutschland an rheumatoider Arthritis. Jährlich erkranken rund weitere 2000 Menschen neu daran.
• Die Ursache der rheumatoiden Arthritis ist bis heute noch nicht genau bekannt. Man geht davon aus, dass es sich um eine sogenannte Autoimmunerkrankung handelt, bei der es zu einer Fehlsteuerung des körpereigenen Abwehrsystems (des Immunsystems) kommt und dieses Zellen des eigenen Körpers angreift. Die Ursachen für die anfängliche Fehlsteuerung des Immunsystems sind bis heute unbekannt. Seitens der Wissenschaft wird vermutet, dass mehrere Faktoren bei der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Möglicherweise spielen Infektionen mit Bakterien oder Viren eine Rolle. Grundsätzlich ist die Erkrankung bis heute nicht heilbar und begleitet den Patienten sein restliches Leben lang.
• Zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis kommen derzeit bevorzugt langfristig wirkende Medikamente zum Einsatz. Die verwendeten Wirkstoffe werden aufgrund des langsamen Eintretens ihrer Wirkung mit einem schneller wirkendem Medikament kombiniert. Dabei handelt es sich um sogenannte „cortisonfreie Entzündungshemmer”, sogenannte nicht steroidale Antirheumatika, NSAR, beziehungsweise non steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, die zu den Aspirin-ähnlichen Medikamenten zählen oder um Cortison.
• Zu den NSAR gehören unter anderem die folgende Wirkstoffe Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Indomethacin, Piroxicam, Rofecoxib, Cefecoxib sowie Meloxicam, die unter verschiedenen Handelsnamen vertrieben werden.
• NSAR's wirken entzündungshemmend und schmerzstillend, weil sie alle Prostaglandine in ihrer Funktion hemmen. Eine typische Nebenwirkung der NSAR ist, dass sie die Magenschleimhaut angreifen, was zu Magen- und Darmerkrankungen, im schlimmsten Fall zu Magen- und Darmblutungen führen kann.
• Ein Einfluss auf diese Prostaglandine wird auch anderen Substanzen zugeschrieben. So werden gemäss der EP 0 506 325 Oligomere oder Polymere von L-Guluronsäure und deren Epimer D-Mannuronsäure beschrieben, um die Produktion von Cytokinen wie Interleukinen IL-1, IL-6 und TNF zu hemmen.
• IL-1 ist dafür bekannt, dass es die Produktion von Prostaglandinen hemmt. Die verwendeten Polysaccharide wurden dafür aus der Algen Laminaria digitata (Copolymere ”G-blocks” die mehr als 90% L-Guluronsäure enthalten), aus den Zellen von Ascophyllum nodosum Fruchtkörpern (Copolymere ”M-blocks” die mehr als 95% D-Mannuronsäure enthalten) bzw. aus Kulturen von Pseudomonas aeruginosa (Polymannuronsäure) isoliert.
• Das Block-Copolymer Alginsäure, das aus wechselnden Anteilen von Mannuronsäure und Guluronsäure besteht, wird schon seit langem aufgrund der gelierenden Eigenschaften in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt.
• Zur medizinischen Verwendung von Alginaten wird in der WO 01/66119 eine weitere Anwendung zur Behandlung von Schleimhautentzüngungen im Magen beschrieben.
• Guan (Chem. Abstracts 1991, 114:69045) beschreibt die Verwendung von Propylmannuronatnatriumsulfat als antithrombotisches, hypolipämisches, oder zur Behandlung von ischämischen kardiovaskulären Erkrankungen geeignetes Mittel.
• US 5,952,308 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die unter anderem ein Mannuronsäuremonomer als Komplexierungsagens für ein Mineral enthalten kann, um die Aufnahme dieser Mineralien zu fördern.
• Die WO 01/56404 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polymannuronaten aus marinen Algen, das gegen Fettleibigkeit und überhöhten Cholesterinspiegel eingesetzt wird.
• Zur Zeit werden viele alginathaltige oder alginatähnliche Produkte hergestellt. Die in diesen Produkten enthaltenen Alginate werden durch Extraktion aus Algen oder Mikroorganismen erhalten und sind in der Regel hochmolekular.
• Derartige hochmolekulare Blockpolymere haben eine hohe Viskosität und sind in Wasser schwerlöslich. Dadurch ist die Verwendung dieser hochmolekularen Polymere, z. B. in hohen Konzentrationen in Lebensmitteln, sehr eingeschränkt.
• Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Polymannuronat oder Polyguluronat mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10–900 kDa beinhalten eine saure/alkalische Hydrolyse [Haug, A., Larsen, B. und Smidsrod, O. (1966); Acta Chem. Scand., 20(1): 183–190 and Hirst, E. and Rees, D. A. (1965); J. Chem. Soc.; 8: 1493–1499], die Hydrolyse unter Druck und Hitze [Kimura, Y., Watanabe, K. und Okuda, H. (1996); J. Ethnopharmacology; 54: 47–54] sowie die Hydrolyse unter Verwendung von Enzymen [Romeo, T. and Preston, J. (1986); Biochemistry; 25(26): 8385–8391 und Yonemoto, Y. et al. (1991) Fermen. and Bioengin.; 72(3): 152–157].
• Schier und Waldmann (Monatshefte der Chemie, 1957, 88, 847–856) beschreiben die saure Hydrolyse von Uronsäurepolymeren, wie beispielsweise Alginsäure und Pektin, um Uronsäuren zu gewinnen.
• Bei dem Verfahren der sauer/alkalischen Hydrolyse kommt es im industriellen Maßstab zur Minderung der Produktqualität sowie zur Korrosion im Reaktor. Ferner werden große Mengen an Neutralisierungsreagentien eingesetzt, und die Handhabung der eingesetzten starken Säuren ist umständlich.
• Die internationale Patentveröffentlichung WO 95/24497 A2 beschreibt die in vitro Herstellung von Polymannuronsäure unter Verwendung eines enzymatischen in vitro Systems, nämlich von GDP-Mannuronsäure Polymerase und dem Regenerationssystem von GDP Mannuronsäure.
• Die Nachteile bei der Hydrolyse unter Druck und Hitze (100–200°C) sind die lange Reaktionszeit und die hohen Kosten, da der Prozess bei hohen Temperaturen und Drücken ausgeführt wird. Die enzymatische Hydrolyse ist aufgrund der hohen Kosten und der langen Reaktionszeit für den industriellen Maßstab ungeeignet.
• Es besteht daher ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polyuronsäuren, das sich durch einfache Handhabung und verbesserte Verfahrensergebnisse auszeichnet.
• Seitens der Erfinder wurde überraschenderweise gefunden, dass Monomere von Polyuronsäuren auf einfache Weise hergestellt, in dem Verfahren zur Herstellung einer monomeren Uronsäuren, das die folgenden Schritte umfasst:
• a. Fermentieren eines Polyuronsäure produzierenden Bakterienstammes, dessen Epimerase-Gen inaktiviert worden ist;
• b. Isolieren der Polyuronsäure aus dem Überstand der Fermentationsbrühe;
• c. Hydrolysieren der Polyuronsäure von Schritt b.;
• d. Isolieren des Uronsäuremonomers aus dem Verfahrensprodukt von Schritt c.,
wobei die Polyuronsäure aus einem Monomeren aufgebaut ist.
• Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erstmals möglich, pyrogenfreie Monomere der Polyuronsäuren und anderer Polysaccharide herzustellen.
• Bevorzugt ist als Ausgangsmaterial der Polyuronsäure dabei Polymannuronsäure oder Polyguluronsäure. Das nach dem Verfahren hergestellte Monomer ist dabei bevorzugt D-Mannuronsäure, bzw. L-Guluronsäure.
• Zur Verbesserung des Verfahrens, insbesondere zur Erhöhung der Ausbeuten und der Verbesserung der Aufarbeitung, weist die Polyuronsäure Schutzgruppen auf. Mit den Schutzgruppen sind die an der Uronsäure vorhandenen Hydroxylgruppen vor einer unerwünschten Nebenreaktion geschützt. Die Schutzgruppen werden bevorzugt aus der Gruppe, die aus C₁-C₂₀-Carboxylat, insbesondere Acetat, Sulfonat besteht, ausgewählt.
• Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polyuronsäuren werden bevorzugt aus einer pflanzlichen oder mikrobiellen Quelle gewonnen. Dabei kommen u. a. Alginate und insbesondere Zellüberstände von Bakterienkulturen als Quellen in Betracht. Bevorzugt ist der die Polyuronsäure produzierende Epimerase-negative Pseudomonas-Stamm die Spezies Pseudomonas putida.
• Zur Steigerung der Ausbeute kann der Epimerase-negative Pseudomonas-Stamm in einem Fermenter kultiviert werden, und die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen werden.
• Die Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile umfasst dabei Filtrieren, insbesondere eine Ultrafiltration, Zentrifugieren und Kombinationen der vorgenannten Verfahren.
• Nach der Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wird das Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung, unterzogen. Hierdurch wird eine nahezu vollständige Fällung der Polyuronsäure erzielt, wobei das Polymer nach dem Ausfällen zur weiteren Behandlung durch Lyophilisieren getrocknet werden kann.
• Danach wird die Polyuronsäure unter sauren Bedingungen hydrolysiert, wobei die Hydrolyse bevorzugt bei 100–140°C in einer sauren Lösung, bevorzugt verdünnte HCl, bei einem pH-Wert von 1–5 durchgeführt wird.
• Wenn eine Polyuronsäure eingesetzt wird, deren Hydroxylgruppen durch Schutzgruppen, beispielsweise Acetatgruppen ganz oder teilweise in der 2- und/oder 3-Stellung geschützt sind, werden diese Schutzgruppen vor der sauren Hydrolyse des Polymers unter alkalischen Bedingungen, bevorzugt schwach alkalischen Bedingungen im Bereich zwischen einem pH-Wert von 9 bis 13, abgespalten und die erhaltene Lösung dialysiert, um die Aufarbeitung und Reinigung des Polymers zu erleichtern.
• Die Lösung des nach der Abspaltung der Schutzgruppen erhaltenen Uronsäurepolymers wird nach der Dialyse anschließend neutralisiert und die Hydrolyse des Polymers unter sauren Bedingungen, bevorzugt schwach sauren Bedingungen im Bereich zwischen einem pH-Wert von 1 bis 5, abgespalten und das monomerenreine Uronsäure-Monomer aus der neutralen Lösung isoliert. Unter monomerenrein wird erfindungsgemäß eine Reinheit von mehr als 99%, bevorzugt 100% eines Monomeren verstanden.
• Als Alternative zur Herstellung der monomeren Uronsäure können auch Polymere eingesetzt werden, die aus unterschiedlichen Monomeren aufgebaut sind. Allerdings sind dann solche Polymere bevorzugt, die mehr als 50% eines Monomeren enthalten. So können beispielsweise auch verschiedene Alginate verwendet werden, die dann zur Herstellung der Monomere dienen. Beispielweise können Alginate von Braunalgen mit einem Guluronsäureanteil von 50% und mehr eingesetzt werden. Allerdings müssen diese Monomerenmischungen nach der Hydrolyse einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen werden, beispielsweise in Form einer Trennung über säulenchromatographische Verfahren unter Verwendung von chiralen Säulenmaterialien.
• Seitens der Erfinder wurde festgestellt, dass das so erhaltene Uronsäuremonomer günstige Eigenschaften bei der Behandlung verschiedener Krankheiten hervorruft, ohne dass die bekannten Nebenwirkungen der NSAR beobachtet werden.
• Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen Uronsäuremonomere, insbesondere D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure oder Mischungen davon als pharmazeutisch wirksame Substanz bei der Behandlung von Störungen des Immunsystems, rheumatischen Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Multipler Sklerose, Allergien oder Alzheimer sowie die Verwendung als Immunsuppresivum.
• Die rheumatischen Erkrankungen umfassen insbesondere rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches und Lupus erythematodes.
• Die Nierenerkrankungen umfassen Glomerulonephritis und Glomerulosclerosis.
• Die Störungen des Immunsystems umfassen Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen und Autoimmunerkrankungen.
• Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.
• Beispiel 1
• Verfahren zur Herstellung von Mannuronsäure aus gereinigtem bakteriellen Polymannuronat
• Eine 0,5%ige Polymannuronat-Lösung wurde hergestellt und auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaOH eingestellt. Diese Lösung wurde 3 h bei 20°C gerührt, um die Acetylgruppen zu entfernen. Anschließend wurde ein pH-Wert von 10 mit HCl eingestellt und eine Dialyse gegen 100-faches Volumen destilliertes Wasser durchgeführt. Das so deacetylierte Polymannuronat wurde nun vollständig hydrolysiert. Hierzu wurde der pH-Wert auf 2,3 mit HCl eingestellt und eine Inkubation von 4 h bei 135°C durchgeführt. Nach der anschließenden Neutralisierung mit Salzsäure wurde die Probe lyophilisiert und der erhaltene Rückstand für weiterführende Experimente zur Verfügung gestellt. Der Rückstand wurde mittels TLC und Anionenaustauscherchromatographie analysiert.
• Seitens der Erfinder wurden Versuche durchgeführt, um die pharmazeutische Wirksamkeit des so erhaltenen D-Mannuronsäure-Monomers zu untersuchen.
• Jüngste Untersuchungen der Erfinder zeigen, dass die Behandlung mit D-Mannuronsäure im Gegensatz zu NSAR kein nephrotisches Syndrom induzierte, was bei der Behandlung mit NSAR oftmals als Nebenwirkung zu beobachten war. Entsprechend ist so die pharmazeutische Wirksamkeit der D-Mannuronsäure erhöht, da die Verabreichung auch in höheren Dosen erfolgen kann, ohne dass die beschriebenen Nebenwirkungen auftreten.
• Weitere Untersuchungen der Erfinder werden hierzu durchgeführt.
• Im folgenden Beispiel soll die Wirksamkeit von D-Mannuronsäure bei der Behandlung von an Arthritis erkrankten Ratten verdeutlicht werden. Als Referenzsubstanz wird der Wirkstoff Indomethacin (im folgenden nur als Indomethacin bezeichnet) verwendet, der bereits seid langem als NSAR bekannt und als Amuno^® und Indomet-ratiopharm^® auf dem Markt erhältlich ist.
• Anwendungsbeispiel 1
• Arthritis wurde bei Lewis Ratten (125–150 g Körpergewicht) durch eine 0.1 ml intradermale Injektion mit 0.3 mg hitzegetöteten Mycobacterium tuberculosis in Freund's Incomplete Adjuvanz in die rechte Pfote induziert. Nach 14 Tagen wurden die Tiere mit einem Pfotenvolumen, das mindestens um 0.37 ml größer ist (gemessen mit Hilfe eines Plethysmographen) als ursprünglich, in drei verschiedene Versuchsgruppen aufgeteilt.
• Die erste Behandlung der Versuchsgruppen erfolgte nach 15 Tagen nach der Induktion. Die erste Versuchsgruppe blieb unbehandelt. Der zweiten Versuchsgruppe wurden 40 mg/kg D-Mannuronsäure intraperitoneal verabreicht. Der dritten Versuchsgruppe wurde Indomethacin in einer Konzentration von 2 mg/kg in einer Suspension aus 0.5% Methylcellulose und 0.025% Tween 80 verabreicht.
• Die Behandlung mit D-Mannuronsäure bzw. Indomethacin wurde bis zum 25. Tag als letztem Versuchstag täglich wiederholt. Während dieser Zeit wurden im zweitägigen Rhythmus Volumenmessungen der Pfoten sowohl der behandelten rechten Pfote als auch der unbehandelten kontralateralen Pfote (negativ Kontrolle) durchgeführt. Zusätzlich wurden einige Tiere für histologische Untersuchungen der kontralateralen Pfote getötet.
• 1 zeigt den Effekt von Indomethacin (Indo) und D-Mannuronsäure (M-2000) verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. Nach nur 10 Behandlungstagen war das Pfotenvolumen der mit D-Mannuronsäure behandelten Tiere im Verhältnis zu der unbehandelten Pfote um 57% gesunken. Die entzündungshemmende Wirkung der Behandlung mit D-Mannuronsäure ist somit vergleichbar mit der Wirkung bei der Behandlung mit Indomethacin, bei der das Pfotenvolumen (PAW Oedema) um 60% gesunken war (P < 0.01).
• Zusätzlich wurden sowohl die Pfoten von Tieren aus der zweiten und dritten Versuchsgruppe als auch Tiere, bei denen die Arthritis nicht induziert worden war, histologisch untersucht. Dazu wurden die hinteren Extremitäten unter dem Kniegelenk abgetrennt, enthäutet und in 1% Formaldehyd-Lösung fixiert. Die Extremitäten wurden entkalkt, zerschnitten und mit Hematoxylin zur Purpurrot-Färbung des Zellkerns und mit Eosin zur Rosa-Färbung des Collagens und des Cytoskeletts der Zellen angefärbt. Die Gelenkverbindungen der tarsalen und metatarsophalangealen Gelenke wurden mikroskopisch untersucht. In jedem Gelenk wurden das Synovium, der Knorpel und das Weichgewebe auf synoviale Hyperplasie, Entzündungen, Ödeme sowie Knochen- und Knorpelabbau untersucht.
• Anhand dieser Untersuchungen sollte der entzündungshemmende Effekt der D-Mannuronsäure histologisch verdeutlicht werden. Die Ergebnisse sind in den 2a–2c (Im Uhrzeigersinn) dargestellt.
• Die unbehandelte Versuchsgruppe 1 (2a links oben) zeigt 25 Tage nach der Induktion der Arthritis deutliche morphologische Merkmale einer Arthritis in zahlreichen Gelenken (2b rechts oben). Eine signifikante zelluläre Infiltration der Gelenke war bereits am 14 Tag, ohne ein Anzeichen von Knochen- oder Knorpelabbau sichtbar (Ergebnisse nicht dargestellt).
• Am 25. Versuchstag werden schwere Entzündungen im Hartgewebe des Knochens, dem Gelenk und dem umliegenden Weichgewebe sichtbar. Die Schädigung des Weichgewebes wird durch extensive Infiltration von Neutrophilen und Macrophagen sowie Knorpel- und Muskelabbau deutlich. Der unter dem Knorpel liegende Knochen ist in den meisten Gelenken durch eine Vielzahl von Osteoclasten stark abgebaut worden.
• Die Pfoten von Lewis-Ratten aus der 2. Versuchsgruppe (Behandlung mit D-Mannuronsäure 2c unten zeigten sowohl eine verringerte entzündliche Zellinfiltration als auch eine verringerte Anzahl von Osteoclasten im unter dem Knorpel liegenden Knochen. Auch die Schädigung des Ödems und der Knochenabbau in den Pfoten sind weitestgehend reduziert.
• Diese Ergebnisse galten auch für die 3. Versuchsgruppe, die mit Indomethacin behandelt worden war. Die Behandlung mit D-Mannuronsäure als auch Indomethacin erhält das Hyalin im Gelenksknorpel, und es ist eine saubere Trennlinie zwischen Gelenkknorpel und verkalktem Knorpel zu erkennen.
• Durch Mittelung der Ergebnisse der histologischen Untersuchungen aller Versuchstiere in den einzelnen Gruppen konnte ein Durchschnittswert für den histologischen Schaden (Histological damage score) ermittelt werden, der es erlaubt, die Ergebnisse der Gruppen darzustellen (3).
• Der Vergleich der Versuchsgruppen 2. (behandelt mit D-Guluronsäure) und 3. (behandelt mit Indomethacin) mit der Versuchsgruppe 1. (unbehandelt) zeigte deutlich geringere histologisch detektierbare Gewebsschädigungen in den Versuchsgruppen 2. und 3.
• Ein weiteres Ergebnis der Versuche spiegelt sich in den Gewichtsveränderungen der Versuchstiere wieder. Diese Gewichtsmessungen sind vom 15. bis zum 25. Versuchstag durchgeführt worden. Die Versuchsgruppe 1. (unbehandelt) wies einen deutlichen Gewichtsverlust gegenüber Lewis-Ratten auf, bei denen keine Arthritis induziert worden ist.
• Dagegen ist der Gewichtsverlust bei den Tieren aus der Versuchsgruppen 2. (behandelt mit D-Guluronsäure) und 3. (behandelt mit Indomethacin) deutlich geringer (Ergebnisse nicht dargestellt).

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung von monomeren Uronsäuren, das die folgenden Schritte umfasst: a. Fermentieren eines Polyuronsäure produzierenden Bakterienstammes, dessen Epimerase-Gen inaktiviert worden ist; b. Isolieren der Polyuronsäure aus dem Überstand der Fermentationsbrühe; c. Hydrolysieren der Polyuronsäure von Schritt b.; d. Isolieren des Uronsäuremonomers aus dem Verfahrenprodukt von Schritt c., wobei die Polyuronsäure aus einem Monomeren aufgebaut ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polyuronsäure Polymannuronsäure oder Polyguluronsäure ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Polyuronsäure Schutzgruppen aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Schutzgruppen aus der Gruppe, die aus Carboxylat, insbesondere Acetat, Sulfonat besteht, ausgewählt werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der die Polyuronsäure produzierende Bakterienstamm aus Schritt a) ein Pseudomonas-Stamm ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der die Polyuronsäure produzierende Pseudomonas-Stamm die Spezies Pseudomonas putida ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Isolierung der Polyuronsäure die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile Filtrieren, Zentrifugieren, und Kombinationen umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei nach der Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile das Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung, unterzogen wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polyuronsäure unter sauren Bedingungen hydrolysiert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Hydrolyse bei 100–140°C in einer sauren Lösung bei einem pH-Wert von 1–5 durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei vor der Hydrolyse die Schutzgruppen unter alkalischen Bedingungen abgespalten werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahrensprodukt von Schritt c. neutralisiert wird und das Uronsäure-Monomer aus der neutralen Lösung isoliert wird.
14. Verwendung eines Uronsäure-Monomers, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen des Immunsystems, rheumatischen Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Multipler Sklerose, Allergien sowie Alzheimer.
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Uronsäure-Monomer D-Mannuronsäure oder L-Guluronsäure ist.
16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die rheumatischen Erkrankungen rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis und systemisches Lupus erythematodes umfassen.
17. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Nierenerkrankungen Glomerulonephritis und Glomerulosclerosis umfassen.
18. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Störungen des Immunsystems Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen umfassen.
19. Verwendung nach Anspruch 14 zur Kombinationstherapie mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen.