DE102016113018A1

DE102016113018A1 - Pharmazeutische Verwendung von beta-D-Mannuronsäure

Info

Publication number: DE102016113018A1
Application number: DE102016113018.4A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2018-01-18
Also published as: WO2018011416A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von Krebs, Störungen durch oxidativen Stress oder einer viralen Erkrankung, wobei das Uronsäure-Monomer β-D-Mannuronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

Description

Hintergrund
Die Erfindung betrifft ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von Krebs, Störungen durch oxidativen Stress oder einer viralen Erkrankung, wobei das Uronsäure-Monomer β-D-Mannuronsäure (M2000), ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
Eine der häufigsten Formen der neurodegenerativen Erkrankungen stellt die Alzheimer-Krankheit dar, welche synonym auch als Morbus Alzheimer bezeichnet und im Allgemeinen und auch im Nachfolgenden durch das Akronym „AD“ verkürzend bezeichnet wird. Die Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die insbesondere bei älteren Menschen auftritt. So tritt die Alzheimer-Krankheit in ihrer häufigsten Form bei Personen jenseits des 65. Lebensjahrs auf, wobei die entsprechenden Vorläuferformen der Alzheimer-Krankheit bzw. präklinische und/oder klinische Vorstufen der Alzheimer-Krankheit auch deutlich früher auftreten können.
Die Prävalenz neurodegenerativer Erkrankungen und insbesondere der Alzheimer-Krankheit ist stark zunehmend. So wurde die Anzahl der von der Alzheimer-Krankheit betroffenen Menschen zum Ende des Jahres 2009 auf weltweit etwa 35 Millionen Menschen geschätzt, wobei diesbezügliche Abschätzungen davon ausgehen, dass die Anzahl der von der Alzheimer-Krankheit betroffenen Personen bis zum Jahr 2050 auf über 100 Millionen Menschen ansteigt.
Die Verbreitung neurodegenerativer Demenzerkrankungen steigt weltweit stetig an, wodurch die öffentlichen Gesundheitssysteme in Zukunft schwerwiegenden sozio-ökonomischen Belastungen ausgesetzt sein werden. Die Alzheimer-Krankheit ist hierbei die am weitesten verbreitete Demenzerkrankung.
Was die Ursachen bzw. die Verteilung der Alzheimer-Krankheit anbelangt, so ist eine gewisse familiäre Häufung festzustellen, wonach nämlich etwa 15% bis 20% der erfassten Alzheimer-Fälle mit einer bestimmten familiären Häufung im Zusammenhang steht. Bei derartigen Fällen handelt es sich insbesondere um solche, bei denen neben dem Betroffenen selbst auch Personen aus dem Kreis der Geschwister, Eltern bzw. Großeltern etc. von einer Alzheimer-Krankheit betroffen sind. Nur bei einem sehr geringen Teil der Erkrankten ist auch eine genetische Prädisposition mitentscheidend, wobei es sich hierbei insbesondere um Mutationen in Präsenilin-Genen und im APP-Gen (Amyloid-Precursor-Gen) handelt. In Bezug auf die Gesamtfälle an Alzheimer-Erkrankungen beträgt der genetisch bedingte Anteil jedoch wenigster als 0,5%, so dass im Ergebnis der weitaus größere Teil der aller Alzheimer-Fälle sporadischen Ursprungs ist.
Was die Alzheimer-Krankheit als solche weiterhin anbelangt, so geht diese mit einer im zeitlichen Verlauf der Erkrankung zunehmenden Verschlechterung der kognitiven Leistungsfähigkeit einher, die in der Regel mit einer Abnahme der täglichen Aktivitäten, Verhaltensauffälligkeiten und neuropsychologischen Symptomen einhergeht. In diesem Zusammenhang wird dann im Allgemeinen auch von einer Alzheimer-Demenz gesprochen. Die Alzheimer-Demenz stellt gewissermaßen die Folge bzw. das Resultat der den Krankheitsprozess beschreibenden Alzheimer-Krankheit dar. Von einer Alzheimer-Demenz wird somit vorrangig dann gesprochen, wenn das Ausmaß der Hirnschädigung so groß ist, dass kognitive Defizite nicht mehr erfolgreich durch noch intakte Neurone kompensiert werden können. Im Allgemeinen ist der Begriff der Alzheimer-Demenz von dem Begriff der Alzheimer-Krankheit mitumfasst.
Pathognostisch für die Alzheimer-Krankheit sind die sich im Gehirn des Betroffenen bildenden Plaques, welche maßgeblich fehlerhaft gefaltete Amyloid-beta-Peptide aufweisen, sowie die sich in den Neuronen anlagernden Neurofibrillen. Die intrazellulär gelegenen Neurofibrillenbündel bestehen im Wesentlichen aus dem Tau-Protein, das dann zu Fibrillen aggregiert, wenn es übermäßig phosphoryliert ist.
Im Krankheitsverlauf wird durch das Absterben von Neuronen eine Hirnatrophie manifest; außerdem wird der Botenstoff Acetylcholin nicht mehr in ausreichenden Mengen produziert, was insbesondere auch durch eine Verminderung des Gehalts an Cholinacetyltransferase bedingt ist.
Die Amyloid-beta-Peptide, welche synonym auch als A-beta-Proteine, A-beta-Peptide, A-beta bzw. als Aβ-Peptide bezeichnet werden, entstehen aus dem so genannten Amyloid-Precursor-Protein (APP), bei welchem es sich um ein integrales Membranprotein handelt. Beim APP handelt es sich um ein so genanntes Typ I-Transmembranprotein mit einem sich auf der extrazellulären Seite befindlichen aminoterminalen Ende. Der Carboxyl-Terminus des Proteins befindet sich entsprechend auf der intrazellulären Seite. APP wird von bestimmten Proteinasen, den so genannten Sekretasen, gespalten, wobei hier insbesondere der β-Sekretase sowie der γ-Sekretase eine besondere Bedeutung zukommt. Durch die Spaltung von APP kommt es zur Freisetzung der A-beta-Peptide aus dem Vorläufer-Protein, wobei im Rahmen des so genannten amyloidogenen Wegs APP in einem ersten Schritt auf der extrazellulären Seite von der β-Sekretase geschnitten wird. In einem nachfolgenden Schritt erfolgt ein weiterer Schnitt durch die γ-Sekretase, welcher innerhalb der Transmembrandomäne von APP erfolgt und zu einer Freisetzung der A-beta-Peptide führt.
Bei den A-beta-Peptiden handelt es sich somit um ein durch die Aktivität von β- und γ-Sekretase gebildetes potenziell neurotoxisches Bruchstück aus dem Amyloid-Precursor-Protein, welches im Allgemeinen eine Länge von 37 bis 42 Aminosäuren aufweist. Der in diesem Zusammenhang entstehende Haupttyp der A-beta-Peptide ist das 40 Aminosäuren lange Aβ(1–40), während ein kleinerer Anteil aus Aβ(1–42) gebildet wird, welches entsprechend 42 Aminosäuren aufweist. Das längere Aβ(1–42) weist dabei eine höhere Tendenz zur Aggregation auf als das kleinere Aβ(1–40). Darüber hinaus können eine Reihe weiterer A-beta-Peptide entstehen, wie beispielsweise am aminoterminalen Ende trunkierte A-beta-Peptide, wie Aβ(2–40) und Aβ(2–42).
Das Block-Copolymer Alginsäure, das aus wechselnden Anteilen von Mannuronsäure und Guluronsäure besteht, wird schon seit langem aufgrund der gelierenden Eigenschaften in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt. Seine Herstellung sowie die der Herstellung der einzelnen Monomere ist im Stand der Technik bekannt.
Zur medizinischen Verwendung von Alginaten wird in der WO 01/66119 die Anwendung zur Behandlung von Schleimhautentzüngungen im Magen beschrieben.
Guan (Chem. Abstracts 1991, 114:69045) beschreibt die Verwendung von Propylmannuronatnatriumsulfat als antithrombotisches, hypolipämisches, oder zur Behandlung von ischämischen kardiovaskulären Erkrankungen geeignetes Mittel.
US 5,952,308 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die unter anderem ein Mannuronsäuremonomer als Komplexierungsagens für ein Mineral enthalten kann, um die Aufnahme dieser Mineralien zu fördern.
Die WO 01/56404 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polymannuronaten aus marinen Algen, das gegen Fettleibigkeit und überhöhten Cholesterinspiegel eingesetzt wird.
DE 10247073 A beschreibt die Herstellung und Verwendung von β-D-Mannuronsäure als Wirkstoff in der Behandlung von vielfältigen Erkrankungen, wie rheumatischen Erkrankungen und Nierenerkrankungen. Dieses Dokument beschreibt auch die Behandlung von Alzheimer mit β-D-Mannuronsäure. Nichtsdestotrotz ist in DE 10247073 A nur eine intraperitoneale Applikation von β-D-Mannuronsäure beschrieben. Unter intraperitonealer Applikation (Abkürzung i.p.) versteht man die Gabe eines Medikaments in die Bauchhöhle. Sie gehört zu den parenteralen Verabreichungsformen (parenteral bedeutet wörtlich „am Darm vorbei“, „unter Umgehung des Darmes“). Eine solche intraperitoneale Applikationsform ist für Patienten unangenehm und verlangt die Hilfe von Fachpersonal. Intraperitoneale Injektionen oder Infusionen erfolgen in der Regel nur bei Tieren, bei denen durch einen niedrigen Blutdruck kein Blutgefäß mehr angestochen werden kann, vor allem zur Gabe von Blutersatzflüssigkeiten.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Verabreichung und breiteren pharmazeutischen Verwendungen von β-D-Mannuronsäure.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung lösen diesen Bedarf durch ihre Entdeckung, dass oral verabreichte β-D-Mannuronsäure bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von Krebs, Störungen durch oxidativen Stress oder einer viralen Erkrankung überraschend Behandlungserfolge zeigt. Beispielsweise wurde hierbei festgestellt, dass eine orale Applikation von β-D-Mannuronsäure ausreichend ist um Alzheimer-Patienten erfolgreich zu behandeln.
Beschreibung der Abbildungen
zeigt eine Westernblot-Analyse um die Wirkung von Intra-Hippocampus-Injektionen von Aß bzw. von Aß und M2000-Verabreichung auf den Apoptose-Marker p53 zu bewerten. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SD. a) Quantifizierung der p53-Mengen für alle Gruppen, b) p53-Banden nach Westernblot-Analyse für alle Gruppen. * (p < 0,01) von Aß im Vergleich zur Kontrolle und Aß + M.
zeigt die Wirkung von Intra-Hippocampus-Injektionen von Aß bzw. von Aß und M2000-Verabreichung auf die MDA(Malondialdehyde)-Menge, die indikativ für oxidativen Stress und Lipidperoxidation im Hippocampus ist. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SD. * (p < 0,0001) von Aß im Vergleich zur Kontrolle und ** (p < 0,01) von Aß + M im Vergleich zur Kontrolle.
zeigt die Wirkung von Intra-Hippocampus-Injektionen von Aß bzw. Aß und M2000-Verabreichung auf die SOD(Superxoid-Dismutase)-Enzymaktivität im Hippocampus. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM. * (p < 0,01) von Aß im Vergleich zur Kontrolle und Aß + M.
zeigt einen Vergleich von enzymatischen oxidativer-Stress-Determinanten in einer Kontrollgruppe und in einer mit M2000 behandelten Gruppe.
zeigt einen Vergleich von nicht-enzymatischen oxidativer-Stress-Determinanten in einer Kontrollgruppe und in einer mit M2000 behandelten Gruppe.
zeigt die Wirkung von Beta-D-Mannuronsäure (M2000) auf antioxidative Enzyme. Der Anstieg der Genexpression der antioxidativen Enzyme GPX1 und GST ist in Blutproben von Kontrollgruppen und mit Mannuronsäure behandelten Gruppen gezeigt. Die Anzahl der Kontrollgruppen und der mit Mannuronsäure behandelten Gruppen waren 7 bzw. 8. Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM.
Detaillierte Beschreibung
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von Krebs, Störungen durch oxidativen Stress oder einer viralen Erkrankung, wobei das Uronsäure-Monomer β-D-Mannuronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
Der Ausdruck „Uronsäure-Monomer“, im Sinne der vorliegenden Erfindung, richtet sich auf Carbonsäuren, die formal durch Oxidation der primären Hydroxygruppe von Monosacchariden (−CH₂−OH) zur Carboxygruppe(−COOH) entstanden sind. Sie gehören zu den Zuckersäuren. Ein solches Uronsäure-Monomer ist β-D-Mannuronsäure (M2000). β-D-Mannuronsäure ist eine Verbindung gemäß Formel (I):
Die zu verabreichende Dosis ist weniger als 50 mg Uronsäure-Monomers (z.B. β-D-Mannuronsäure) pro Kilogramm Körpergewicht eines gegebenen Patienten pro Tag (50 mg/kg/d). In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosis weniger als 49 mg/kg/d, 48 mg/kg/d, 47 mg/kg/d, 46 mg/kg/d, 45 mg/kg/d, 44 mg/kg/d, 43 mg/kg/d, 42 mg/kg/d, 41 mg/kg/d, 40 mg/kg/d, 35 mg/kg/d oder 30 mg/kg/d. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosis 0,1–49,9 mg/kg/d, 1–49,8 mg/kg/d, 3–48,5 mg/kg/d, 5–47 mg/kg/d, 8–45 mg/kg/d, 10–42,5 mg/kg/d, 11–39.9 mg/kg/d, 5–25 mg/kg/d, 10–18 mg/kg/d, 13–17 mg/kg/d oder 15 mg/kg/d.
Ein Patient, im Sinne der vorliegenden Erfindung, kann ein Säugetier, wie beispielsweise ein Nagetier, ein Carnivore, ein Paarhufer, ein Unpaarhufer oder ein Primat sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient ein Mensch.
Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Salze der β-D-Mannuronsäure sind Natrium-β-D-Mannuronsäure, Kalium-β-D-Mannuronsäure, Magnesium-β-D-Mannuronsäure, Calcium-β-D-Mannuronsäure oder eine Kombination davon.
Der Ausdruck „Derivat“, wie hierin in Bezug auf Uronsäure-Monomer (z.B. β-D-Mannuronsäure) verwendet, bezeichnet eine chemische Substanz oder Verbindung, die sich direkt oder durch Modifikation oder durch partielle Substitution von β-D-Mannuronsäure abgeleitet. Bezüglich der Anzahl an Substituenten kann es sich um höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder einen Substituenten handeln.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird das Uronsäure-Monomer intraperitoneal, oral, bukkal, rektal, intramuskulär, topisch, subkutan, inhalativ, intraartikulär oder intravenös verabreicht. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Uronsäure-Monomer oral verabreicht. In weiter bevorzugten Ausführungsformen wird das Uronsäure-Monomer oral verabreicht zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Das Uronsäure-Monomer kann oral in Form einer Flüssigkeit oder in fester Form (z.B. als Pastillen, Tabletten, Pulver usw.) verabreicht werden, wobei die Verabreichung in flüssiger Form bevorzugt ist.
In ferner weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegt das Uronsäure-Monomer als Salbe, Creme, Gel, Paste, Emulsion, Tablette, Zäpfen, Puder, Pulver, Granulat, Pastille, Patch, Pflaster, Lösung, Schaum, Lotion, Öl, Shampoo, Aerosol oder Spray vor.
Der gesamte Wirkstoffgehalt der oben genannten erfindungsgemäßen (Arznei) Mittel liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,5 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des (Arznei) Mittels. Der Wirkstoffanteil wird auf die dem Fachmann bekannte Weise in Abhängigkeit von der jeweils gewählten Darreichungsform, des/der jeweils ausgewählten Wirkstoffe, und der für den jeweiligen therapeutischen Zweck geeigneten Dosis festgelegt. Die therapeutisch geeigneten Dosierungen der einzelnen Wirkstoffe sind dem Fachmann bekannt.
Die genannten (Arznei) Mittel können im Stand der Technik bekannte zusätzliche Inhaltsstoffe, wie Hilfsstoffe (Trägerstoffe, Hautschutzmittel, Desinfektionsmittel, Tenside usw.) enthalten.
Als Hilfsstoffe kommen beispielsweise folgende in Betracht: partikuläre Trägerstoffe (z.B. Talk, Zinkoxid, Stärke, Stärkederivate, Kieselgur); gelbildende Substanzen (z.B. Gelatine, Tragant, Cellulosederivate, Alginate, Polyacrylsäure); Befeuchtungsmittel (z.B. Harnstoff, Glycerin, Propylenglykol), haftklebende Polymere (z.B. Polyacrylate, sowie Klebharze); Salbengrundlagen (z.B. Vaselin, Fette, Cellulosederivate, Polyacrylsäure, Polyethylenglykole); Emulgatoren (z.B. Wollwachs, Sorbitanester, Monoglyceride); Konservierungsmittel (z.B. Benzalkoniumchlorid), Antioxidantien (z.B. Butylhydroxyanisol), Verdickungsmittel (z.B. Hydroxypropylmethylcellulose), pH-Wert-Korrigenzien; Bindemittel (z.B. Polyvinylpyrrolidon, Stärke, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyethylenglykole), Füllstoffe (z.B. mikrokristalline Cellulose, Sorbitol), Farbstoffe, Aromastoffe, Süßstoffe (z.B. Sorbitol, Aspartam); Lösemittel (z.B. Wasser, Ethanol, Ethanol-Wasser-Gemische); Lösungsvermittler (z.B. Glycerol, Propylenglykol); Haut-Penetrationsverbesserer (z.B. Propylenglykol); Weichmacher (z.B. Sorbitol, Glycerin, Phthalsäureester); Netzmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat, Polysorbate); synthetische und natürliche Öle (z.B. mittelkettige Triglyceride); Treibmittel für Aerosol oder Schaum-Sprays (z.B. Norfluran, Cryofluran, Dichlorfluormethan, Trichlorfluormethan, Propan, Butan, Isobutan, Stickstoff).
Die Verwendung von erfindungsgemäßen Uronsäure-Monomeren kann zusammen mit anderen, vorzugsweise chemisch reinen, Arzneistoffen und/oder pflanzlichen Arzneimitteln erfolgen, bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann solche anderen, vorzugsweise chemisch reine, Arzneistoffe oder Arzneimittel enthalten.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Uronsäure-Monomer einem Patienten in Form einer Vorläuferverbindung, bevorzugt eines β-D-Mannuronsäure-Homo-Oligomers, verabreicht wird. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das β-D-Mannuronsäure-Homo-Oligomer 3 bis 15 β-D-Mannuronsäure-Monomere oder besteht aus diesen. Die Anzahl an Monomeren in der Vorläuferverbindung kann auch 4 bis 13, 5 bis 10 oder 6 bis 8 betragen.
Der Begriff „Viruserkrankung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Krankheit, die ein Virus als Erreger aufweist. Beispiele für virale Erkrankungen sind Hepatitis B, Hepatitis C, Influenza, erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), Gelbfieber, Masern, Mumps, Pocken, Poliomyelitis, Röteln, Windpocken und Herpes (Zoster). Die zu behandelnden Viruskrankheiten werden von Viren hervorgerufen, die aus den folgenden Virusfamilien stammen können: Retroviren, Togaviren, Influenzaviren, Hepatitisviren, Paramyxoviren, Pockenviren, Picornaviren und Herpesviren.
Jede Krebsart kann in Übereinstimmung mit dem vorliegenden erfinderischen Verfahren behandelt werden. Ein „Krebs“, wie hierin verwendet, beinhaltet Krebs, insbesondere solche epithelialen Ursprungs, welche gekennzeichnet sind durch anomale zelluläre Proliferation und die Abwesenheit von Kontaktinhibition, was durch Tumorbildung in Erscheinung treten kann. Der Begriff umfasst Krebs als solchen, der in Tumoren lokalisiert ist, ebenso wie solchen, der nicht in Tumoren lokalisiert ist, wie z. B. Krebszellen, die sich von einem Tumor ausgehend lokal inversiv ausdehnen. Folglich ist die vorliegende Erfindung anwendbar als eine lokale Adjuvanztherapie für resizierte Krebse ebenso wie als lokales Kontrollmittel für das Tumorwachstum, wie z. B. Karzinome der Blase, der Brust, des Kolons, der Niere, der Leber, der Lunge, der Ovarien, des Pankreas, des Enddarms und Magens, sowie als Behandlung eines Sarkoms, z. B. Fibrosarkoms oder Rhabdosarkoms, eines hematopoetischen Tumors der lymphoiden oder myeloiden Linie oder andere Tumore, einschließlich, jedoch nicht auf diese limitiert, Melanom, Teratokarzinom, Neuroblastom oder Gliom.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Krebs Leukämien, Seminome, Melanome, Teratome, Gliome, Darm-, Colon-, Rektal-, Kolorektal-, Magen-, Gastrointestinal-, Speiseröhren-, Hals, Nasen, Ohren (HNO)-, Nieren-, Nebennieren-, Schilddrüsen-, Lymphknoten-, Brust-, Prostata-, Gebärmutter-, Ovarial-, Endometrial-, Leber-, Pankreas-, Haut-, Gehirn- und Lungenkrebs und deren Metastasen.
„Leukämie“, wie hierin verwendet, umfasst – ist allerdings nicht beschränkt auf – akute myeloische Leukämie (AML), chronische myeloische Leukämie (CML), akute lymphatische Leukämie (ALL) und chronische lymphatische Leukämie (CLL).
Die Verbindung zur Verwendung der vorliegenden Erfindung kann mit weiteren Arzneimitteln und/oder Verfahren der Krebsbehandlung kombiniert werden. Beispiele für solche Verfahren beinhalten die Bestrahlung, Chirurgie und Chemotherapie.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Störungen durch oxidativen Stress Arteriosklerose, Katarakt (grauer Star), Netzhautdegeneration, Arzneimitteltoxizität und Reperfusionsschäden nach Gewebeischämie.
Der Ausdruck „Netzhautdegeneration“, wie hierin verwendet, umfasst – ohne darauf beschränkt zu sein – Retinitis pigmentosa (RP), Usher-Syndrom, Makuladegeneration, Stargardt, die Best'sche Erkrankung und die progressive Zapfendystrophie.
Der Ausdruck „Arneimitteltoxizität“, wie hierin verwendet, bezieht sich darauf wie giftig oder schädlich ein Stoff (Arzneimittel) ist. Arzneimitteltoxizität tritt ein, wenn eine Personeine zu große Mengel eines Arzneimittels im Körper, hauptsächlich im Blutkreislauf, angesammelt hat und diese Konzentration innerhalb des Körpers zu negativen Auswirkungen führt. Arzneimitteltoxizität kann auftreten, wenn die gegebene Dosis zu hoch ist oder die Leber oder Nieren sind nicht in der Lage das Medikament aus dem Blutstrom zu entfernen, so dass die Arzneimittel im Körper zu akkumulieren.
Als Reperfusionsschaden wird ein Krankheitsprozess bezeichnet, der durch die wiederhergestellte Durchblutung nach einer Minderdurchblutung (Ischämie) einer Extremität (z. B. infolge des Tourniquet-Syndroms) oder eines Organs ausgelöst wird. Der Begriff Reperfusionsparadox bezeichnet den scheinbaren Widerspruch, dass die erneute Durchblutung zu zusätzlichen Schäden führen kann.
Beispiele:
Beispiel 1: Induktion einer experimentellen Alzheimer-Erkrankung und therapeutisches Protokoll
Die therapeutische Wirkung von β-D-Mannuronsäure (M2000) auf die Alzheimer-Krankheit (AD) wurde durch Morris-Wasserlabyrinth-Experimente nachgewiesen und zur immunologischen Bewertung wurden Western-Blot-Analyse, Apoptose-(pro-Caspase-3, Bax/Bcl-2), enzymatische (SOD) und nicht-enzymatische oxidative Stresstests (MAD) durchgeführt. Für diesen Zweck wurden männliche Forty Wistar-Ratten (Gewicht 180–220 g) in diesen Experimenten verwendet, die von der Fakultät für Pharmazie, Tehran University of Medical Science erworben wurden. Jede Ratte wurde in einem Käfig gehalten und die Käfige wurden Standardlaborbedingungen (Temperatur: 23˚C ± 2˚C, relative Luftfeuchtigkeit: 30–70%; Hell-Dunkel-Zyklus: 12/12 h) ausgesetzt. Alle der Ratten hatten unbeschränkten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Experimente wurden von der Ethikkommission für Pflege und Verwendung von Labortieren der University Teheran of Medical Science (Code: 9021324001) und vom Graduierten-Rat der Iran University of Medical Science (Code: 24403) genehmigt. Die Ratten wurden in 4 Gruppen eingeteilt: normale Kontrollgruppe (C), Scheinoperationsgruppe (S), der eine Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) in den Hippocampus injiziert wurde, eine Alzheimer-Gruppe (Aß), der 50 ng/ml/Seite von Aß mit einer Hamilton-Spritze in den Hippocampus injiziert wurde und eine M2000-Gruppe (Aβ + M), die zusätzlich zur Aß-Injektion täglich M2000 über ihre Wasserversorgung erhalten hat. β-D-Mannuronsäure (M2000) wurde den Ratten für 6 Wochen verabreicht (2 Wochen vor der Aβ-Injektion bis 4 Wochen nach der Aβ-Injektion).
Aβ_1-42 wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erworben. Es wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst. Die Lösung wurde anschließend bei 37° C für 5 Tage inkubiert und wurde auf eine 50 ng/μl Lösung mit PBS am Testtag verdünnt. Den Ratten wurde per intraperitonealer Injektion Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) verabreicht und dann wurden sie in eine stereotaktische Vorrichtung gegeben (Stölting, Wood Dale, IL, USA). Die stereotaktische Operation zur Intra-Hippocampus-Injektion von Aß wurde nach dem Atlas von Paxinos und Watson (anterior-posterior, 3/08 mm; lateral, ± 2,2 mm; dorsal-ventral 2,2 mm vom Bregma) durchgeführt. Der CA1-Bereich des Hippocampus wurde detektiert und die Injektion wurde dann mit einer Hamilton-Spritze durchgeführt (50 ng/μl/Seite). Jede Injektion dauerte 1 min. Um die Diffusion von Aß zu erleichtern, wurde die Injektion in die linke Seite nach 60 Sek. durchgeführt. Schließlich wurde der Kopf der Ratten wieder verschlossen.
Die Verhaltenstests wurden mit Morris-Wasserlabyrinth(MWM)-Equipment durchgeführt. Diese Tests wurden einen Monat nach der Operation durchgeführt. Das Equipment ist ein schwarzer kreisförmiger Pool mit 136 cm Durchmesser und 35 cm Tiefe, der mit Wasser gefüllt ist, wobei die Temperatur bei 25 ± 2° C liegt. Das Schwimmbecken wurde in vier Quadranten unterteilt und eine unsichtbare Platte aus Plexiglas wurde 1 cm unter der Wasseroberfläche in einem der Quadranten (Zielquadrant) angebracht. Dieser Test umfasst einen Trainingsprozess von 4 Tagen und einen eintägigen Testdurchlauf. Jeder Trainingstag umfasst einen Block von vier Studien. In jedem Block wurde eine Ratte zufällig in einen Quadranten des Pools ausgesetzt. Eine Kamera wurde über dem Pool angebracht, die an einen Computer angeschlossen wurde, der die Ethovision Software (Noldus Information Technology, Wageningen, Niederlande) enthielt und die geschwommene Strecke der Ratte wurde aufgezeichnet. In jedem Versuch hatte die Ratte 90 Sek. Zeit um die Plattform frei schwimmend zu finden, wenn sie innerhalb dieser Zeit die Plattform nicht finden könnte, wurde sie von einem Forscher manuell trainiert die Zielplattform zu finden. Danach konnte sich die Ratte für 20 Sek. auf der Plattform auszuruhen bevor sie wieder an einem zufälligen Startpunkt in einem anderen Quadranten ausgesetzt wurde. In anderen Blocks und an Ruhetagen wurden diese Prozesse wiederholt. Die Software berechnet drei Parameter einschließlich Fluchtlatenz (die Zeit, die benötigt wird um die Plattform zu finden), zurückgelegte Strecke (die Weglänge, die benötigt wird um die Plattform zu erreichen) und Geschwindigkeit (Schwimmgeschwindigkeit) für Versuche aus allen 4 Tagen. Am fünften Tag (Testtag) wurden die Ratten in einem Testdurchlauf getestet. An diesem Tag wurde die Plattform aus dem Pool entfernt und die Ratte wurde zufällig im Pool in einem der Quadranten ausgesetzt und für 90 Sek. schwimmen gelassen. Der Zweck dieses Tests war es, herauszufinden, wie lange die Ratte im Zielquadranten schwimmen kann. Es wird herausgestellt, dass alle Versuche zur gleichen Zeit durchgeführt wurden (08.00 bis 12.00). In diesen Durchläufen wurde die Plattform mit Aluminiumfolie abgedeckt und wurde 1 cm über der Wasseroberfläche in einem Quadranten, der dem Zielquadranten gegenüberliegt, angebracht. Die visuellen Fähigkeiten der Ratten wurden durch Sehtests bestätigt.
Zur Amyloidplaqueerkennung wurde eine Ratte für eine Homogenisierung ihres Gehirns zufällig ausgewählt. Das Gehirn wurde isoliert und in 15% Formalin für 48 Stunden aufbewahrt. Paraffinschnitte wurden in einer Schichtdicke von 6 Mikron nach Färben in einer Kongorot-Lösung (Merck, Darmstadt, Deutschland) erstellt. Schließlich wurden Plaques durch ein optisches Mikroskop mit einer Vergrößerung von 400 beobachtet.
Zur Messung der SOD(Superoxiddismutase)-, CAT(Katalase)- und MDA(Malondialdehyd)-Mengen im Hippocampus-Gewebe wurde 1 ml verdünnte Protease-Inhibitor-Lösung zu 60 ml PBS, in der Hippocampus-Gewebe verdünnt wurde, gegeben. Dann wurden die Proben für 1 Minute homogenisiert und für 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Schließlich wurde der Überstand zur Bestimmung der SOD- und CAT-Aktivität abgenommen und die MDA-Menge durch ein Kit nach Herstellerangaben (Zellbio GmbH, Ulm, Deutschland) nachgewiesen. Rinderserumalbumin (BSA) wurde für den Kalibrierungsprozess als Standard verwendet und die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode mit einer Lösung von Biorad Biotechnology (Hercules, Kalifornien, USA) gemessen.
Die Ergebnisse der Verhaltenstests für alle Trainingstage zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll- und Scheinoperationsgruppe. Die Ergebnisse der Verhaltenstest einschließlich Fluchtlatenz, zurückgelegte Strecke und Schwimmgeschwindigkeit in verschiedenen Rattengruppen ergab, dass die Aß-Gruppe eine deutliche erhöhte Fluchtlatenz hat (p < 0,001) und dass auch die zurückgelegte Wegstrecke im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht ist (p = 0,016). Im Gegensatz dazu zeigte die Aß + M-Gruppe eine signifikante Abnahme in der Fluchtlatenz (p < 0,0001) und bei der Wegstrecke (p = 0,004) im Vergleich zur Aß-Gruppe was bedeutet, dass die M2000-Verabreichung diese Parameter positiv beeinflusst. Des Weiteren zeigte die Gruppe mit Aß-Injektion und M2000-Verabreichung keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen in Bezug auf die Schwimmgeschwindigkeit.
Die Ergebnisse der Verhaltenstests über die einzelnen Trainingstage zeigen in der Kontrollgruppe, dass die Fluchtlatenz eine signifikante Verbesserung vom ersten auf den zweiten Tag (p < 0,0001) erfahren hat und dass sich dann keine signifikanten Unterschiede in den weiteren Tagen (dritter und vierter Tag) für die Fluchtlatenzzeit ergeben haben. Es gab keine signifikante Differenz zwischen der zurückgelegten Strecke am zweiten und dritten Tag im Vergleich zum ersten Tag. Jedoch gab es eine signifikante Reduktion am dritten Tag (p < 0,01) und vierten Tag (p < 0,001) im Vergleich zum ersten Tag. In der Aß-Gruppe wurde die Fluchtlatenz am zweiten Tag (p < 0,001) und vierten Tag (p < 0,0001) im Vergleich zum ersten Tag verringert, während ein deutlicher Anstieg am dritten Tag beobachtet wurde. Darüber hinaus gab es eine statistisch signifikante Differenz zwischen dem zweiten und dritten Tag (p < 0,01) und dem dritten Tag im Vergleich zum vierten Tag (p < 0,001). Im Gegensatz zu den anderen Gruppen erhöhte sich am dritten Tag die zurückgelegte Strecke signifikant und als Folge davon gab es einen signifikanten Unterschied nur zwischen dem ersten und vierten Tag (p < 0,001) und dem dritten und vierten Tag (p < 0,01). In der Aß + M-Gruppe verbesserte sich die zurückgelegte Strecke vom ersten bis zum letzten Tag. Es gab einen signifikanten Unterschied am zweiten und dritten Tag (p < 0,001) im Vergleich zum ersten Tag. Auch konnte eine signifikante Verbesserung der Fluchtlatenz am zweiten, dritten und vierten Tag (p < 0,0001) im Vergleich zum ersten Tag festgestellt werden. Bezüglich der Schwimmgeschwindigkeit könnte in allen Gruppen zwischen und während den verschiedenen Tagen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.
Testdurchlaufergebnisse: Der Zweck dieser Tests war es, herauszufinden, wie lange eine Ratte im Zielquadranten nach entfernen der Plattform über 90 Sek. schwimmen kann. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aß-Injektion eine signifikante Abnahme in Bezug auf diesen Parameter (p < 0,001) im Vergleich zur Kontrollgruppe verursacht. In der Gruppe, der M2000 verabreicht wurde, hat sich die Zeit des Schwimmens im Zielquadranten im Vergleich zur Aß-Gruppe erhöht (p < 0,0001). Zusätzlich zeigte diese Gruppe keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Ergebnisse der Kongorotfärbung: Amyloid-Plaques sind das wichtigste Zeichen der Alzheimer-Krankheit. Daher wurde, um die Amyloid-Plaques-Bildung zu bestätigen, ein Schnitt des Hippocampus mit Kongorot-Lösung gefärbt. In der Aß-Gruppe wurden Amyloid-Plaques gebildet und die Zellform hatte sich abnormal verändert. Obwohl in der Aß + M2000-Gruppe Amyloid-Plaques nachgewiesen werden konnten, hatte sich die Zellform verbessert und die Amyloid-Plaque-Größe verringerte sich signifikant im Vergleich zur Aß-Gruppe.
Auswirkungen von Aß und M2000 auf das Bax/Bcl-2 Verhältnis: Bax ist eines der Proteine, das eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Apoptose spielt und das anti-apoptotische Protein Bcl-2, nimmt ebenfalls eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des Apoptosewegs ein. In diesem Experiment erhöhte die Injektion von Aß deutlich die Bax-Expression (p < 0,0001) und verringerte die Bcl-2-Expression (p < 0,01). Daher erhöhte sich das Bax/Bcl-2-Verhältnis signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe (p < 0,0001). In der Gruppe, der M2000 verabreicht wurde, sank dieses Verhältnis (p < 0,0001) im Vergleich zur Aß-Gruppe und wies keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe auf.
Auswirkungen von Aß und M2000 auf Caspase 3: Caspase 3 spielt eine wichtige Rolle im Endstadium apoptotischer Prozesse. Um die apoptotischen Prozesse während der Alzheimer-Krankheit zu verifizieren, wurde die Caspase 3 Expression durch Western-Blot gemessen. Procaspase 3 (32 KD) wurde aktiviert und in die prozessierte Caspase 3 (17 KD) umgesetzt. Die Daten zeigen die Procaspase 3 Mengen für alle Gruppen. Die Expression von Procaspase 3 nahm in Aß-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant ab. Die Procaspase 3-Expression in der Gruppe, die M2000 erhalten hatte, war gesteigert (p < 0,01).
Auswirkungen von Aß und M2000 auf p53: p53 ist eines der Proteine, das eine wichtige Rolle im Apoptose-Weg spielt. zeigt das p53-Expressionsniveau der verschiedenen Gruppen. Die p53-Menge ist in der Gruppe, die eine Aß-Injektion erhalten hat, verglichen mit der Kontrollgruppe signifikant erhöht (p < 0,001). Im Gegensatz dazu, verringert sich die p53-Menge in der Gruppe, der zusätzlich M2000 verabreicht wurde, und diese Gruppe zeigt keinen signifikanten Unterschied im Vergleich mit der Kontrollgruppe (p < 0,001).
Ergebnisse des oxidativen Stress-Tests: Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle in der Alzheimer-Krankheit. Daher wurden einige Marker des oxidativen Stress-Stoffwechselwegs einschließlich der Superoxid-Dismutase (SOD) und der Katalase-Enzyme (CAT) als Antioxidationsmittel und Malondialdehyd (MDA) als Oxidationsmittel-Marker gemessen. zeigt die MDA-Menge im Hippocampus-Gewebe aller Gruppen. Die Aß-Injektion erhöhte signifikant die MDA-Menge (p < 0,0001) im Vergleich zur Kontrollgruppe. In der Gruppe, der zusätzlich M2000 verabreicht wurde, nahm die MDA-Menge ab. Diese MDA-Abnahme ist aber nicht signifikant (p = 0,05) und auch höher als die MDA-Menge in der Kontrollgruppe (p < 0,01). Die zeigt die SOD-Aktivität im Hippocampus-Gewebe. Aß-Injektion verursacht eine signifikante Zunahme (p < 0,01) im Vergleich zur Kontrollgruppe und in der Gruppe mit zusätzlicher M2000-Verabreichung, verringerte sich die SOD-Aktivität signifikant (p < 0,01), wobei sie keinen statistischen Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte.
Zusammenfassend wurde gefunden, dass die Behandlung im Rattenmodell von AD durch M2000 eine starke Auswirkung auf das Ratten-Verhalten hat. Zusätzlich führt es auch zu einer signifikanten Hemmung der Amyloid-Plaque-Produktion. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass M2000 kann die Menge an Bax/Bcl-2, p53, MAD und SOD reduzieren kann, und zusätzlich die Menge von Procaspase 3 normalisieren kann. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass M2000 ein potenzielles Therapeutikum zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit ist.
Beispiel 2: Effekt von β-D-Mannuronsäure (M2000) auf enzymatische und nicht-enzymatische oxidativer-Stress-Parameter
Oxidativer Stress wird durch ein Ungleichgewicht zwischen oxidativen und antioxidativen Determinanten bestimmt, die zu einer freien Radikal-Ansammlung im Körper geführen kann (RS. Sohal et al., 1996 & T. Finkel, NJ. Holbrook, 2000). Die meisten der freien Radikale werden aus Sauerstoff abgeleitet, die im aeroben Stoffwechsel ROS (Reactive Oxygen Species) und RNS (Reactive Stickstoffspezies) genannt werden. Oxidativer Stress führt zu schädlichen Effekten wie Peroxidation von Membranlipiden (bestimmt durch Malondialdehyd (MDA)), Enzym-Inaktivierung, Proteinoxidation (bestimmt durch Carbonyl-Protein (PCO)), DNA-Fragmentierung und Apoptose-Aktivierung. Dieser Vorgang spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von chronischen und degenerativen Erkrankungen wie Krebs, Altern, Katarakt, Autoimmunerkrankungen, neurodegenerativen und kardiovaskulären Erkrankungen (M. Valko et al., 2007 & s. Sarban et al., 2005). Vorliegend sollen die antioxidativen Eigenschaften von M2000 im Tiermodell getestet werden, indem enzymatische (einschließlich SOD2, GPX1, CAT, GST, iNOS, MPO) und nicht-enzymatische (einschließlich PCO, MDA und TAC) oxidativer-Stress-Parameter zusammen mit der Serummenge von Cortisol und Gewichtsveränderungen untersucht wird. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt mit 15 Sprague-Dawley-Ratten (10 weiblich, 5 männlich), die 8–10 Wochen alt waren und ein Gewicht von 170 bis 220 Gramm hatten. Die Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: 1: Kontrollgruppe; ohne Behandlungen (2 männliche und 5 weibliche Tiere); 2: M200 behandelte Gruppe (3 männliche und 5 weibliche Tiere). Die Studie wurde durch den Ethikrat der Teheraner Universität der Medizinischen Fakultät (TUMS) genehmigt, die den Bestimmungen der Deklaration von Helsinki entspricht.
Beta-D-Mannuronsäure (M2000)-Pulver wurde in Trinkwasser mit der Dosis von 45 mg/kg/Tag über drei Monate verabreicht (mit einer durchschnittlichen Tagesdosis von 35 Milliliter des Arzneimittels bei einer Konzentration von 0,25 mg/ml M2000). Die Ratten wurden gewogen und mit Ketamin (200 mg/kg, i.v.) anästhesiert. Danach wurden Blutproben aus dem Herzen durch Herzpunktur gesammelt und die molekularen Tests durchgeführt. Das Serum wurde für die Durchführung der TAC, MDA, PCO Tests und Cortisol Analyse getrennt.
Für die RNA-Extraktion und c-DNA-Synthese wurden rote Blutzellen (RBC) durch Ammoniumchlorid lysiert und für die RNA-Extraktion aus weißen Blutkörperchen (WBC) wurde mit Hilfe eines kommerziellen Kits von Gene All (Metabion, Deutschland) durchgeführt. Die Qualität und die Reinheit der extrahierten RNA wurde durch Absorption bei 260/280 nm und 260/230 nm gemessen und die Integrität durch Elektrophorese auf einem Agarose-Gel und mit Ethidiumbromid-Färbung geprüft. Die cDNA-Synthese-Kits (Gene All Co.) verwenden Oligo-(dT) und zufällige Hexamer-Primer. Das folgende Programm wurde für die cDNA-Synthese verwendet: 70° C für 10 min (ohne reverse Transkription), –20° C für 2 min (Abkühlen). Nach Zugabe von Reversen-Transkriptionsenzymen wurde die Probe für 60 min bei 42° C inkubiert und bei 95° C für 10 min weiterbehandelt, um die Reverse-Transkriptase zu inaktivieren. Entsprechend entworfene Primer (Vorwärts-Primer und Rückwärts-Primer) wurden zur Amplifikation von Β-Actin (Beta-Actin), Mn SOD (mitochondriale Matrix-Superoxiddismutase), CAT (Katalase), GPX1 (Glutathion-Peroxidase 1), GST (Glutathion-S-Transferase), iNOS (induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase), MPO (Myeloperoxidase) verwendet.
Um die M2000 Auswirkungen auf die SOD2, GPX1, CAT, GST, iNOS und MPO Genexpression zu ermitteln, wurde eine Real-Time-PCR-Charakterisierung angewendet, die das QuantiFast SYBR Green PCR Detection System (Qiagene) auf einem Rotor-Gene 6000 und einen Thermal Cycler (Corbett Research, Australien) für 40 Zyklen umfasst. PCR-Amplifikation wurde in 10 μl Reaktionsmischungen durchgeführt, die 5 μl ready-to-use SYBR Green RT-PCR Master Mix (2x), Vorwärtsprimer (1 μM), Rückwärtsprimer (1 μM) und 3 μl cDNA-Matrize (≤100 ng/Reaktion) und 2 μl RNase-freies Wasser umfassen. β-Actin wurde als Haushaltsgen verwendet und die Ergebnisse wurden auf die Werte der β-Actin-Expression normalisiert. Die relative Menge des PCR-Produkts wurde mittels der 2-ΔΔCt Formel ermittelt.
Für die biochemischen Beurteilung von TAC, MDA, PCO und Cortisol wurde eine kolorimetrische Methode verwendet, um die Gesamt antioxidative Kapazität zu messen (TAC), dies umfasste das Radikalkation von 2, 29-Azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat). Malondialdehyd (MDA) ist indikativ für den Lipidperoxidationsstatus, der nach der modifizierten Methode von Satoh durchgeführt wurde (BD. Banerjee et al., 1999). Carbonyl-Protein (PCO), das den Oxidationszustand von Proteinen wiederspiegelt, wurde nach dem Verfahren von Levine bestimmt (E.R. Stadtman et al., 2000). Die Serum-Cortisol-Konzentration wurde unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Immunoassays auf einem LIAISON^® XL bestimmt und die Ergebnisse wurden entsprechend in Mikrogramm pro Deziliter dargestellt.
Die Ergebnisse der enzymatischen oxidativen-Stress-Parameter drei Monate nach oraler Verabreichung von M2000 zeigen, dass die Genexpression der enzymatischen Parameter nach Mannuronsäure Behandlung erhöht ist (siehe und ). Bezüglich der nicht-enzymatischen oxidativer-Stress-Parameter sind die Werte für TAC und Serum-Cortisol-Konzentration nach M2000-Behandlung gesunken. Darüber hinaus wurde eine Erhöhung des Gewichts in der M2000-Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen die günstigen Wirkungen von Mannuronsäure (M2000) auf enzymatische und nicht-enzymatische oxidativer-Stress-Parameter im experimentellen Modell.
Beispiel 3: Effekt von β-D-Mannuronsäure (M2000) auf die biologische Aktivität von menschlichen dendritischen Zellen
Herkömmliche DC-basierte Immunsuppressiva haben nennenswerte Nebeneffekte das Risiko von Infektionskrankheiten und Krebs zu erhöhen. Das Ziel dieser Experimente ist es die sichere Anwendung von β-D-Mannuronsäure zu zeigen, so dass sich keine Effekte auf die Differenzierung, Reifung und Funktion von dendritischen Zellen ergeben. Die in vitro Differenzierung von menschlichen Monozyten in dendritische Zellen (DCs) wurde wie von Sreevalsan beschrieben mit geringen Modifikationen durchgeführt [Sreevalsan T, 2009]. Sechs menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch eine Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro) Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Monozyten wurden aus peripheren mononukleären Blutzellen unter Verwendung von anti-CD14 Microbeads (Miltenyi Biotec) gereinigt. Die Monozyten (> 95% Reinheit) wurden bei 37° C in 24-well Platten (700000 Zellen pro Vertiefung) in 3 ml serumfreiem AIM V Medium (Invitrogen), enthaltend 100 ng/ml Human-Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) (PeproTechs) und Human-Interleukin-4 (IL-4, 20 ng/ml, R&D Systems), kultiviert. Die Zellen wurden mit zwei verschiedenen Dosierungen von M2000 kultiviert. Zum einen einer 6 μg/well niedrig Dosierungslösung und zum anderen einer 12 μg/well hoch Dosierungslösung. 6 Vertiefungen wurden als Kontrolle ausgewählt (nicht behandelt mit M2000). Insgesamt 0,5 ml frisches Medium mit GM-CSF und IL-4 wurde den Zellkulturen am dritten Tag hinzugefügt. Um die DC-Reifung zu induzieren wurden am fünften Tag die Zellkulturen über 24 Stunden mit Lipopolysaccharid (LPS, 1 μg/ml, Katalog-Nr. L2654, Sigma-Aldrich) in Kontakt gebracht. Zwei Dosen von β-D-Mannuronsäure (M2000)-Lösung wurden 4 Stunden vor der LPS Zugabe in die Vertiefungen gegeben. Die geernteten Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und in 100 μl PBS, das mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid zur Färbung supplementiert wurde, resuspendiert. Die Zellen wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Fc-Rezeptor-Blockierungslösung (BioLegend, San Diego, USA) inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 4° C für 30 min mit den folgenden monoklonalen Maus-anti-human-Antikörper inkubiert (MAb): FITC-konjugierte mAbs gegen die Zelloberflächenmoleküle CD83, CD14 und PE-konjugierte mAbs gegen CD1a, CD86 und PECY5-konjugierte mAbs gegen MHCII (eBiosciences, USA). In allen Experimenten wurden Isotyp-Kontrollen verwendet, die geeignete mAb der gleichen Ig-Klasse oder Unterklasse waren. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal in PBS, das mit 0,5% BSA und 0,1% Natriumazid supplementiert war, gewaschen und in PBS mit 0,99% Paraformaldehyd resuspendiert. Durchflusszytometrie wurde auf einem Cytomics FC-500-Zytometer (Beckman Coulter) durchgeführt und alle nachfolgenden Analysen wurden durch die FlowJo Software (Tree Star) analysiert. DC Cytokin-Produktion wurde jeweils in den Überständen der DCs Kulturen (IL-12p70 und IL-10) nachgewiesen. Überstände wurden gesammelt und bei –70° C bis zur Verwendung eingefroren. Zytokin-Konzentrationen wurden durch ein Enzym-gebundenes Immunosorbent Assay (ELISA) Kit (BenderMed System, Österreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.
Die Expression von CD14 und CD1a (als Differenzierungsmarker) wurde in Monozyten und unreifen dendritischen Zellen mit zwei unterschiedlichen Dosen (6 und 12 μg/Vertiefung) von β-D-Mannuronsäure (M2000) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit M2000-Lösung behandelt wurden, gibt.
Um zu bestimmen, ob die Wirkung von zwei verschiedenen Dosen (6 und 12 μg/Vertiefung) einer M2000-Lösung Auswirkungen auf die Expression von CD83, CD86 und MHC II (als Reifungsmarker) hat, wurden DCs in der Anwesenheit dieser zwei verschiedenen Dosen kultiviert. Die Expression von MHC-II und der co-stimulierenden Moleküle wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten zeigen, dass die Expressionen der co-stimulierenden Moleküle und von MHC-II keine signifikanten waren Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit M2000 behandelt wurden, aufzeigen.
Die Überstände von kultivierten DCs wurden gesammelt und Zytokin-Konzentrationen durch das ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied in Zytokin-Konzentrationen (IL-12p70 und IL-10) zwischen Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit M2000 behandelt wurden (z.B. 6 μg/Vertiefung (P = 0,068) bzw. 12 μg/Vertiefung (P = 1,4) in reifen dendritischen Zellen gibt. Die Ergebnisse zeigen, dass β-D-Mannuronsäure (M2000) als sicheres Medikament keine nachteilige Wirkung auf die Differenzierung, die Reifung und die Funktion von dendritischen Zellen hat und als neuartiges Arzneimittel verwendet werden kann, das keine oder weniger Nebenwirkungen (z.B. das Risiko von Infektionskrankheiten und Krebs zu erhöhen) hat als vergleichbare auf dem Markt befindliche Produkte.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 01/66119 [0012]
US 5952308 [0014]
WO 01/56404 [0015]
DE 10247073 A [0016, 0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

RS. Sohal et al., 1996 & T. Finkel, NJ. Holbrook, 2000 [0061]
M. Valko et al., 2007 & s. Sarban et al., 2005 [0061]
BD. Banerjee et al., 1999 [0065]
E.R. Stadtman et al., 2000 [0065]

Claims

Uronsäure-Monomer zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von Krebs, Störungen durch oxidativen Stress oder einer viralen Erkrankung, wobei das Uronsäure-Monomer β-D-Mannuronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Uronsäure-Monomer intraperitoneal, oral, bukkal, rektal, intramuskulär, topisch, subkutan, inhalativ, intraartikulär oder intravenös, bevorzugt oral verabreicht wird.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Uronsäure-Monomer aus der Gruppe bestehend aus Natrium-β-D-Mannuronsäure, Kalium-β-D-Mannuronsäure, Magnesium-β-D-Mannuronsäure, Calcium-β-D-Mannuronsäure und einer Kombination davon ausgewählt ist.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50 mg/kg/d verabreicht wird.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 4, wobei das Uronsäure-Monomer einem Patienten in Form einer Vorläuferverbindung, bevorzugt eines β-D-Mannuronsäure-Homo-Oligomers, verabreicht wird.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 5, wobei das β-D-Mannuronsäure-Homo-Oligomer 3 bis 15 β-D-Mannuronsäure-Monomere umfasst oder aus diesen besteht.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Krebs Leukämien, Seminome, Melanome, Teratome, Gliome, Darm-, Colon-, Rektal-, Kolorektal-, Magen-, Gastrointestinal-, Speiseröhren-, Hals, Nasen, Ohren (HNO)-, Nieren-, Nebennieren-, Schilddrüsen-, Lymphknoten-, Brust-, Prostata-, Gebärmutter-, Ovarial-, Endometrial-, Leber, Pankreas-, Haut-, Gehirn- und Lungenkrebs und deren Metastasen umfasst.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die viralen Erkrankungen Hepatitis B, Hepatitis C, Influenza, erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), Gelbfieber, Masern, Mumps, Pocken, Poliomyelitis, Röteln, Windpocken und Herpes umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Störungen durch oxidativen Stress Arteriosklerose, Katarakt (grauer Star), Netzhautdegeneration, Arzneimitteltoxizität und Reperfusionsschäden nach Gewebeischämie umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Uronsäure-Monomer als Salbe, Creme, Gel, Paste, Emulsion, Tablette, Zäpfen, Puder, Pulver, Granulat, Pastille, Patch, Pflaster, Lösung, Schaum, Lotion, Öl, Shampoo, Aerosol oder Spray vorliegt.