DE102016113017A1

DE102016113017A1 - Pharmazeutische Verwendung von alpha-L-Guluronsäure

Info

Publication number: DE102016113017A1
Application number: DE102016113017.6A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2018-01-18
Also published as: WO2018011419A2; WO2018011419A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer α-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50 mg/kg/d verabreicht wird.

Description

Hintergrund
Die Erfindung betrifft ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer α-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50 mg/kg/d verabreicht wird.
Die rheumatoide Arthritis ist eine entzündliche Systemerkrankung, die überwiegend die Gelenke befällt. Eine ältere Bezeichnung für die rheumatoide Arthritis, die noch häufig benutzt wird, ist chronische Polyarthritis. Über eine Million Menschen leiden in Deutschland an rheumatoider Arthritis. Jährlich erkranken rund weitere 2000 Menschen neu daran.
Die Ursache der rheumatoiden Arthritis ist bis heute noch nicht genau bekannt. Man geht davon aus, dass es sich um eine sogenannte Autoimmunerkrankung handelt, bei der es zu einer Fehlsteuerung des körpereigenen Abwehrsystems (des Immunsystems) kommt und dieses Zellen des eigenen Körpers angreift. Die Ursachen für die anfängliche Fehlsteuerung des Immunsystems sind bis heute unbekannt. Seitens der Wissenschaft wird vermutet, dass mehrere Faktoren bei der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Möglicherweise spielen Infektionen mit Bakterien oder Viren eine Rolle. Grundsätzlich ist die Erkrankung bis heute nicht heilbar und begleitet den Patienten sein restliches Leben lang.
Zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis kommen derzeit bevorzugt langfristig wirkende Medikamente zum Einsatz. Die verwendeten Wirkstoffe werden aufgrund des langsamen Eintretens ihrer Wirkung mit einem schneller wirkenden Medikament kombiniert. Dabei handelt es sich um sogenannte „cortisonfreie Entzündungshemmer”, sogenannte nicht steroidale Antirheumatika, NSAR, beziehungsweise non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, die zu den Aspirin-ähnlichen Medikamenten zählen oder um Cortison.
Zu den NSAR gehören unter anderem die folgenden Wirkstoffe Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Indomethacin, Piroxicam, Rofecoxib, Cefecoxib sowie Meloxicam, die unter verschiedenen Handelsnamen vertrieben werden.
NSAR‘s wirken entzündungshemmend und schmerzstillend, weil sie alle Prostaglandine in ihrer Funktion hemmen. Eine typische Nebenwirkung der NSAR ist, dass sie die Magenschleimhaut angreifen, was zu Magen- und Darmerkrankungen, im schlimmsten Fall zu Magen- und Darmblutungen führen kann.
Ein Einfluss auf diese Prostaglandine wird auch anderen Substanzen zugeschrieben. So werden gemäss der EP 0506325 Oligomere oder Polymere von L-Guluronsäure und deren Epimer D-Mannuronsäure beschrieben, um die Produktion von Cytokinen wie Interleukinen IL-1, IL-6 und TNF zu hemmen.
IL-1 ist dafür bekannt, dass es die Produktion von Prostaglandinen hemmt. Die verwendeten Polysaccharide wurden dafür aus der Algen Laminaria digitata (Copolymere ”G-blocks”, die mehr als 90% L-Guluronsäure enthalten), aus den Zellen von Ascophyllum nodosum Fruchtkörpern (Copolymere ”M-blocks”, die mehr als 95% D-Mannuronsäure enthalten) bzw. aus Kulturen von Pseudomonas aeruginosa (Polymannuronsäure) isoliert.
Das Block-Copolymer Alginsäure, das aus wechselnden Anteilen von Mannuronsäure und Guluronsäure besteht, wird schon seit langem aufgrund der gelierenden Eigenschaften in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt. Seine Herstellung sowie die der Herstellung der einzelnen Monomere ist im Stand der Technik bekannt.
Zur medizinischen Verwendung von Alginaten wird in der WO 01/66119 eine weitere Anwendung zur Behandlung von Schleimhautentzüngungen im Magen beschrieben.
Guan (Chem. Abstracts 1991, 114:69045) beschreibt die Verwendung von Propylmannuronatnatriumsulfat als antithrombotisches, hypolipämisches, oder zur Behandlung von ischämischen kardiovaskulären Erkrankungen geeignetes Mittel.
US 5,952,308 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die unter anderem ein Mannuronsäuremonomer als Komplexierungsagens für ein Mineral enthalten kann, um die Aufnahme dieser Mineralien zu fördern.
Die WO 01/56404 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polymannuronaten aus marinen Algen, das gegen Fettleibigkeit und überhöhten Cholesterinspiegel eingesetzt wird.
In Bezug auf die Monomere der Alginsäure, beschreibt DE 10247073 A die Herstellung und Verwendung von α-L-Guluronsäure als Wirkstoff in der Behandlung von vielfältigen Erkrankungen, wie rheumatischen Erkrankungen und Nierenerkrankungen. Nichtsdestotrotz zeigen diese Untersuchungen keine optimierten Applikationen von α-L-Guluronsäure, z.B. bezüglich der zu verabreichenden Dosis.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Verabreichung und pharmazeutischen Verwendung von α-L-Guluronsäure.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung lösen diesen Bedarf durch ihre überraschende Entdeckung, dass niedrig dosierte α-L-Guluronsäure bei der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten vergleichbare und/oder verbesserte Effekte erzielt als eine höhere Dosis. Hierbei wurde festgestellt, dass eine Dosis von weniger als 50 mg/kg/d α-L-Guluronsäure ausreichend ist um diese verbesserten Wirkeigenschaften von α-L-Guluronsäure in Patienten hervorzurufen.
Beschreibung der Abbildungen
zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf den klinischen Score von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE). In der Vorsorge-Gruppe wurde weiblichen C57BL/6-Mäusen (n = 6) intraperitoneal (IP) von Tag 0 bis Tag 20 nach Immunisierung 40 mg/kg/d α-L-Guluronsäure verabreicht. Den Mäusen in den Behandlungsgruppen A und B wurde α-L-Guluronsäure intraperitoneal mit 40 und 80 mg/kg/d verabreicht und zwar von Tag 7 bis Tag 20 nach Immunisierung. Der Grad der Krankheit wurde durch ein visuelles kumulatives Scoringsystem bewertet. Kumulative Noten von Tag 10 bis Tag 21 werden als Mittelwert±SEM angegeben. *P < 0,05 ist an jedem Datenpunkt durch Mann-Whitney-U-Test durch Vergleich von Vorsorgegruppe und Behandlungsgruppen gegen die Kontrollgruppe angegeben.
zeigt repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von histologischen Proben des Zentralennervensystems. (A) Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E Färbung) von Gehirnen zeigt, dass G2013 Therapie das Fortschreiten von Entzündungen signifikant durch begrenzen von Leukozyten-Infiltration unterdrücken kann. (B) Luxol-fast-blue-Färbung (LFB-Färbung) zeigt weniger Demyelination-Stellen in G2013 behandelten Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe. N: normal; C: Kontrollgruppe; P: Vorsorgegruppe; TA: Behandlungsgruppe A; TB: Behandlungsgruppe B.
zeigt eine Tabelle mit Vergleichswerten zu Entzündungskriterien, die aus histologischen Proben des Zentralennervensystems aus EAE Mäusen erhalten wurden.
zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf den klinischen Score von Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) in therapeutischen Gruppen.
zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von miR-155 in HEK-293hTLR4 Zellen.
zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von SHIP-1 in HEK-293hTLR4 Zellen.
zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von SOCS-1 in HEK-293hTLR4 Zellen.
Detaillierte Beschreibung
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer α-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50mg/kg/d verabreicht wird.
Der Ausdruck „Uronsäure-Monomer“, im Sinne der vorliegenden Erfindung, richtet sich auf Carbonsäuren, die formal durch Oxidation der primären Hydroxygruppe von Monosacchariden (-CH₂-OH) zur Carboxygruppe (-COOH) entstanden sind. Sie gehören zu den Zuckersäuren. Ein solches Uronsäure-Monomer ist α-L-Guluronsäure. α-L-Guluronsäure ist eine Verbindung gemäß Formel (I):
Die zu verabreichende Dosis ist weniger als 50 mg Uronsäure-Monomers (z.B. α-L-Guluronsäure) pro Kilogramm Körpergewicht eines gegebenen Patienten pro Tag (50 mg/kg/d). In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosis weniger als 49 mg/kg/d, 48 mg/kg/d, 47 mg/kg/d, 46 mg/kg/d, 45 mg/kg/d, 44 mg/kg/d, 43 mg/kg/d, 42 mg/kg/d, 41 mg/kg/d, 40 mg/kg/d, 35 mg/kg/d oder 30 mg/kg/d. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosis 0,1–49,9 mg/kg/d, 1–49,8 mg/kg/d, 3–48,5 mg/kg/d, 5–47 mg/kg/d, 8–45 mg/kg/d, 10–42,5 mg/kg/d oder 15–39.9 mg/kg/d.
Ein Patient, im Sinne der vorliegenden Erfindung, kann ein Säugetier, wie beispielsweise ein Nagetier, ein Carnivore, ein Paarhufer, ein Unpaarhufer oder ein Primat sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient ein Mensch.
Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Salze der α-L-Guluronsäure sind Natrium-α-L-Guluronsäure, Kalium-α-L-Guluronsäure, Magnesium-α-L-Guluronsäure, Calcium-α-L-Guluronsäure oder eine Kombination davon.
Der Ausdruck „Derivat“, wie hierin in Bezug auf Uronsäure-Monomer (z.B. α-L-Guluronsäure) verwendet, bezeichnet eine chemische Substanz oder Verbindung, die sich direkt oder durch Modifikation oder durch partielle Substitution von α-L-Guluronsäure abgeleitet. Bezüglich der Anzahl an Substituenten kann es sich um höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder einen Substituenten handeln.
Entzündungskrankheiten, im Sinne der Anmeldung, umfassen Autoimmunkrankheiten, akute und chronische Entzündungen und Osteoarthritis.
Autoimmunkrankheiten, im Sinne der Anmeldung, umfassen rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, progressive systemische Sklerodermie (PSS), Polymyositis-Dermatomyositis, Morbus Behçet, Spondylitis ankylosans, Psoriasisarthritis, Reiter-Syndrom und rezidivierende Polychondritis.
Nierenerkrankungen, im Sinne der Anmeldung, umfassen Glomerulonephritis und Glomerulosclerosis.
Störungen des Immunsystems, im Sinne der Anmeldung, umfassen Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen, allergisches Kontaktekzem und Hypersensivität Typ I–IV.
Neurodegenerativen Krankheiten, im Sinne der Anmeldung, umfassen Multiple Sklerose (MS) und Alzheimer-Krankheit.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Uronsäure-Monomer zur Verwendung mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen, in einer Kombinationstherapie eingesetzt. Der Ausdruck „hepatotoxische Nebenwirkungen“ bezeichnet die Eigenschaft chemischer Stoffe, die für die Hepatozyten (Leberepithelzellen) giftig sind. Diese Stoffe werden als hepatotoxische Substanzen (Lebertoxische Substanzen, Hepatotoxine, Lebertoxine oder Lebergifte) bezeichnet. Hepatotoxische Substanzen können Schädigungen der Leberepithelzelle bis zur Nekrose oder Leberdystrophie verursachen.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen wird das Uronsäure-Monomer intraperitoneal, oral, bukkal, rektal, intramuskulär, topisch, subkutan, inhalativ, intraartikulär oder intravenös verabreicht.
In ferner weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegt das Uronsäure-Monomer als Salbe, Creme, Gel, Paste, Emulsion, Tablette, Zäpfen, Puder, Pulver, Granulat, Pastille, Patch, Pflaster, Lösung, Schaum, Lotion, Öl, Shampoo, Aerosol oder Spray vor.
Der gesamte Wirkstoffgehalt der oben genannten erfindungsgemäßen (Arznei)Mittel liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,5 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des (Arznei)Mittels. Der Wirkstoffanteil wird auf die dem Fachmann bekannte Weise in Abhängigkeit von der jeweils gewählten Darreichungsform, des/der jeweils ausgewählten Wirkstoffe, und der für den jeweiligen therapeutischen Zweck geeigneten Dosis festgelegt. Die therapeutisch geeigneten Dosierungen der einzelnen Wirkstoffe sind dem Fachmann bekannt.
Die genannten (Arznei)Mittel können im Stand der Technik bekannte zusätzliche Inhaltsstoffe, wie Hilfsstoffe (Trägerstoffe, Hautschutzmittel, Desinfektionsmittel, Tenside usw.) enthalten.
Als Hilfsstoffe kommen beispielsweise folgende in Betracht: partikuläre Trägerstoffe (z.B. Talk, Zinkoxid, Stärke, Stärkederivate, Kieselgur); gelbildende Substanzen (z.B. Gelatine, Tragant, Cellulosederivate, Alginate, Polyacrylsäure); Befeuchtungsmittel (z.B. Harnstoff, Glycerin, Propylenglykol), haftklebende Polymere (z.B. Polyacrylate, sowie Klebharze); Salbengrundlagen (z.B. Vaselin, Fette, Cellulosederivate, Polyacrylsäure, Polyethylenglykole); Emulgatoren (z.B. Wollwachs, Sorbitanester, Monoglyceride); Konservierungsmittel (z.B. Benzalkoniumchlorid), Antioxidantien (z.B. Butylhydroxyanisol), Verdickungsmittel (z.B. Hydroxypropylmethylcellulose), pH-Wert-Korrigenzien; Bindemittel (z.B. Polyvinylpyrrolidon, Stärke, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyethylenglykole), Füllstoffe (z.B. mikrokristalline Cellulose, Sorbitol), Farbstoffe, Aromastoffe, Süßstoffe (z.B. Sorbitol, Aspartam); Lösemittel (z.B. Wasser, Ethanol, Ethanol-Wasser-Gemische); Lösungsvermittler (z.B. Glycerol, Propylenglykol); Haut-Penetrationsverbesserer (z.B. Propylenglykol); Weichmacher (z.B. Sorbitol, Glycerin, Phthalsäureester); Netzmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat, Polysorbate); synthetische und natürliche Öle (z.B. mittelkettige Triglyceride); Treibmittel für Aerosol oder Schaum-Sprays (z.B. Norfluran, Cryofluran, Dichlorfluormethan, Trichlorfluormethan, Propan, Butan, Isobutan, Stickstoff).
Die Verwendung von erfindungsgemäßen Uronsäure-Monomeren kann zusammen mit anderen, vorzugsweise chemisch reinen, Arzneistoffen und/oder pflanzlichen Arzneimitteln erfolgen, bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann solche anderen, vorzugsweise chemisch reine, Arzneistoffe oder Arzneimittel enthalten.
Beispiele:
Beispiel 1: Induktion von Multipler Sklerose (MS) und therapeutische Behandlung
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das meist genutzte experimentelle Modell zur Untersuchung von Multipler Sklerose (MS). Diese wurde in C57BL/6-Mäusen induziert, indem sie mit einem Hooke-Kit immunisiert wurden. Zu diesem Zweck wurden dreißig weibliche C57BL/6-Mäuse (10 Wochen alt), mit einem Gewicht von 18–20 g, vom Experimental Animal Center des Pasteur Institut des Iran erworben. Die Mäuse wurden mit Zugang zu Nahrung (Pellets) und Wasser nach Richtlinien des Instituts gehalten. Die Mäuse wurden per Zufallsprinzip in fünf Gruppen (je 6 Mäuse) wie folgt aufgeteilt: I: normale Gruppe (PBS behandelt); II: Kontrollgruppe (MOG_35-55-induzierte EAE und PBS behandelt); III: Vorsorgegruppe (MOG_35-55-induzierte EAE und 40 mg/kg/d G2013 behandelt von Tag 0–20); IV: Behandlungsgruppe A (MOG_35-55-induzierte EAE und 40 mg/kg/d G2013 behandelt von Tag 7–20) und V: Behandlungsgruppe B (MOG_35-55-induzierte EAE und 80 mg/kg/d G2013 behandelt von Tag 7–20). Die EAE wurde durch das Hooke-Kit (Hooke Laboratories, Inc., USA) induziert, um im Tiermodell die induzierte Pathogenese und Behandlung von MS zu untersuchen. Das Kit besteht aus zwei Komponenten; Antigen (MOG35-55) in einer Emulsion mit komplettem Freund‘schem Adjuvans (CFA) in zwei vorgefüllten Spritzen und ein Fläschchen mit lyophilisiertem Pertussis Toxin (PTX). Das gefriergetrocknete PTX wurde in PBS am Tag 0 gelöst. Den Mäusen wurde jeweils eine Emulsion von 0,1 ml subkutan am oberen und unteren Rücken injiziert. Etwa 2 Stunden nach der Injektion der Emulsion wurde die erste Dosis von PTX (0,1 ml/Maus) intraperitoneal (IP) injiziert. Dies wurde 24 Stunden später als zweite Dosis von PTX (0,1 ml/Maus) wiederholt. Die α-L-Guluronsäure (G2013) (hergestellt in der Pathobiologie Abteilung des TUMS) wurde der Vorsorgegruppe von Tag 0 bis zum Tag 20 nach der Immunisierung in der spezifischen Dosis 40 mg/kg/d IP verabreicht. Den Mäusen der Behandlungsgruppen A und B wurde 40 und 80 mg/kg/d G2013 von Tag 7 nach der Immunisierung bis zum Tag 20 IP verabreicht. Die Mäuse der normalen und Kontrollgruppe erhielten PBS (0,1 ml jeder Maus, täglich). IP-Injektion in die Mäuse aller Gruppen wurde an sechs aufeinanderfolgenden Tagen pro Woche durchgeführt. Die Mäuse wurden täglich überwacht und nach klinischen Scores beurteilt. Klinische Score von EAE Mäusen wurde wie folgt definiert: 0: keine klinischen Zeichen; 1: schlaffer Schwanz; 2: schlaffer Schwanz und Schwäche der Hinterbeine; 3: schlaffer Schwanz und komplette Lähmung der Hinterbeine (am häufigsten) oder schlaffer Schwanz mit Lähmung eines vorderen und eines hinteren Beins; 4: schlaffer Schwanz, komplette Hinterbein- und teilweise Vorderbeinlähmung; 5: Maus rollt sich spontan im Käfig oder wurde wegen Lähmung tot aufgefunden.
Für die histopathologische Analyse wurden am Tag 21 nach der Immunisierung alle Mäuse anästhesiert und Blutproben aus ihren Herzen entnommen. Zur histopathologischen Beurteilung wurden die Mäuse nach ihrer Betäubung getötet und Gehirne und Kleinhirne entfernt, um diese anschließend in neutralem 10%igen Formalin zu fixieren, sowie in Paraffin einzubetten, zu schneiden (8 μm Dicke) und mit Hämatoxilin-Eosin (H & E) zu färben um die Entzündungskriterien in meningealem und parenchymalem Gewebe zu beurteilen und mit Luxol-fast-blue (LFB) zu färben, um Demyelinisierung zu unterscheiden. Alle gefärbten Proben wurden auf einem Objektträger blind durch einen Sachverständigen Pathologen analysiert.
Zur Nitrit-Beurteilung wurde NO₂ in den Serumproben durch das Griess-Verfahren, das auf der Beurteilung des NO₂ Endprodukts basiert, untersucht. Das Griess-Verfahren nutzt eine kolorimetrische Reaktion für die Messung von NO₂ (Nitrit) in einer wässrigen Lösung. Griess-Reagenz wurde durch Lösung von 1g Sulfanilamid in 100 ml Phosphorsäure 5% gemischt mit 0,1 g Naphtylethylendiamine-HCl (NED) in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Serumprobe (50 μl) wurde mit 50 μl Griess-Reagenz für 10 min bei Raumtemperatur gemischt. Die Absorption wurde an einem ELISA-Reader Instrument bei 540 nm gemessen.
Die Konzentration von Nitrit wurde bestimmt durch eine Standardkurve von 0,1 M Natriumnitrit in destilliertem Wasser.
Die Ergebnisse in Verbindung mit klinischen Befunden zeigen, dass sich der klinische Verlauf und der Grad der Erkrankung zwischen der Vorsorgegruppe, den Behandlungsgruppen und der Kontrollgruppe unterscheiden. Der mittlere Score-Wert der Krankheit war in den Kontrollmäusen höher als in der Vorsorge- und den Behandlungsgruppen ( ). Auch war die EAE-Inzidenz geringer und der Beginn der EAE war in der Vorsorgegruppe und den Behandlungsgruppen im Vergleich zu den Kontrollmäusen verzögert. Diese Effekte führten zu einer signifikanten klinischen Verbesserung und einer verzögerten Progression der Erkrankung während der 21 Tage der Beobachtung, was anzeigt, dass α-L-Guluronat (G2013) die Progression von EAE inhibiert.
Die repräsentativen Bilder der H & E- und der LFB-gefärbten Gewebeschnitte aus allen Gruppen zeigen, dass EAE-Mäuse, die G2013 erhalten haben, signifikant verringerte Entzündungskriterien und Demyelinisierung aufweisen verglichen mit Kontrollmäusen ( ). Die Ergebnisse in veranschaulichen, dass der Grad der Entzündung, die in den histopathologischen Studien des Zentralennervensystems (CNS) beobachtet wurde, mit dem klinischen Grad von EAE korreliert.
Die NO-Produktion wurde signifikant in der Vorsorgegruppe (10,61 ± 1,80 μM/dL, p > 0,05) und Behandlungsgruppe B (10.71 ± 1.47μM/dL, p > 0,05) verringert im Verglich mit den Kontrollmäusen (13,00 ± 1,00 μM/dL), jedoch die NO-Produktion in der Behandlungsgruppe A nicht signifikant reduziert (11.16 ± 2.15μM/dl, p > 0,05). In der normalen Gruppe war die NO-Produktion 5,85 ± 0.53μM. Daher bewirkt G2013 eine Verringerung der NO-Konzentration in Serum und dies war in Übereinstimmung mit den klinischen Befunden. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die α-L-Guluronsäure (G2013) Therapie das Fortschreiten der Krankheit in einem Versuchsmodell von MS verringern kann.
Beispiel 2: Therapeutischer Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) in einem experimentellen Model von rheumatoider Arthritis
Die Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) als experimentelles Modell der rheumatoiden Arthritis wurde in DBA/1J Mäusen induziert und die therapeutische Wirksamkeit von α-L-Guluronsäure (G2013) wurde in diesen Tieren in Radboudumc, Experimentelle Rheumatologie Abteilung von Radboudumc, Niederlande getestet. Männliche DBA/1J Mäuse wurden erhalten von Janvier-Elevage (Le Genest St. Isle, Frankreich). Alle Mäuse wurden in Filter-Top-Käfigen unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Standardnahrung und Wasser wurden ihnen ad libitum zur Verfügung gestellt. Die verwendeten Mäuse waren zwischen 10 und 14 Wochen alt. Alle Tierverfahren wurden von der institutionellen Ethikkommission in Radboudumc, Nijmegen, genehmigt. Freund-Adjuvans (FCA) und Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37Ra) wurden von Difco, Detroit, MI erhalten. Rindercollagen vom Typ II (CII) wurde von den Erfindern hergestellt, wie beschrieben von Joosten (Joosten LAB, et al, 1996). Um CIA zu induzieren wurde Rinderkollagen Typ II (CII) in 0,05 M Essigsäure in einer Konzentration von 2 mg/ml verdünnt und in gleichen Volumina mit Freund‘schem Komplett-Adjuvans (FCA) emulgiert (2 mg/ml M. tuberculosis). Die DBA/1J Mäuse wurden intradermal an der Basis des Schwanzes mit 100 μg CII immunisiert. An Tag 21 erhielten die Mäuse eine intraperitoneale (i.p.) Booster-Injektion von 100 μg CII, das in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst war. Der Beginn der Arthritis trat in der Regel ein paar Tage vor oder nach der Booster-Injektion auf. Die Mäuse wurden sorgfältig drei Mal pro Woche visuell nach Erscheinungen von Arthritis in den peripheralen Gelenken untersucht und Bewertungen für die Krankheitsaktivität wurden wie zuvor beschrieben vergeben (van den Berg WB, et al, 1994). Der klinische Grad der Arthritis (Arthritis-Score) wurde auf einer Skala von 0–2 für jede Pfote benotet, entsprechend den Veränderungen in Rötung und Schwellung in den Zehen oder in anderen Teilen der Pfoten. Die G2013-Behandlung wurde vor dem Auftreten klinischer Symptome der Krankheit begonnen (Tag 21) oder während der etablierten Arthritis (makroskopische Arthritis-Scores von 0,25 bis 1,25 auf einer Skala von 0–8) und für 14 Tage fortgesetzt. Die Behandlung mit G2013 wurde bei einer Dosis von 25 oder 50 mg/kg/d durch intraperitoneale (i.p.) Injektion verabreicht. Anti-TNF (Enbrel) wurde als positive Kontrolle der Behandlung verwendet und 3 mal pro Woche IP injiziert. Für die Messung der Zytokine wurde die Luminex Multianalyt-Technologie in Kombination mit dem Miliplex Zytokin/Chemokin-Magnetic-Bead-Panel-Kit (Millipore) nach dem Herstellerprotokoll verwendet, um die Mengen von IL-1, IL-6, IL-10 und KC Zytokinen in behandelten und nicht-behandelten Maus-Seren zu messen. Für die histologische Analyse wurden isolierte Gelenke in 10% Formalin, 5% entkalkter Ameisensäure für 4 Tage fixiert und anschließend entwässert und in Paraffin eingebettet. Standard Frontalschnitte von 7 mm wurden auf SuperFrost-Objektträgern (Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) montiert. Hämatoxylin und Eosin(H & E)-Färbung und Safranin-O-Färbung wurden durchgeführt, um die Gelenkpathologie zu studieren. Der pathologische Grad in den Gelenken wurde auf einer Skala von 0–3 (0 = keine Pathologie, 3 = maximal Zellularität) wie zuvor beschrieben (Lubberts, Arthritis Rheum 2004) für die folgenden fünf Parameter bewertet: Gelenkentzündung, Proteoglycan (PG) Erschöpfung aus der Knorpelmatrix, Chondrozyten-Tod, Knorpel-Oberflächenerosion und Knochenerosion.
Histopathologische Veränderungen wurden auf fünf semiseriellen Abschnitten mit einem Abstand von 140 mm bewertet. Die Bewertung erfolgte blind in durch zwei unabhängige Beobachter.
Die Ergebnisse in der therapeutischen Gruppe mit niedriger Dosis (25 mg/kg, G2013) IP Injektion zeigen eine therapeutische Wirksamkeit von α-L-Guluronsäure (G2013) durch das Abmildern des Fortschreitens der Krankheit im experimentellen Modell der rheumatoiden Arthritis (RA) im Vergleich zur Kontrollgruppe und den anti-TNF behandelten Tieren durch in der Behandlung von RA ( ).
Beispiel 3: Immunsuppressive Effekte von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von microRNA 155 und seinen zytosolischen Zielen
In Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen ist die Genexpression von microRNA 155 und seiner zytosolischen Ziele, die die Signaltransduktion von miR-155 vermitteln (z.B. SHIP-1 und SCOS-1), nützlich für die Bestimmung des Grads der Krankheitsprogression und therapeutischer Wirkungen von Arzneimitteln. HEK293 hTLR4-Zellen, eine humane embryonale Nierenzelllinie, wurden in RPMI1640 Medium (Gibco, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, USA), 1X Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum und 2 mM L-Glutamin bei 37° C unter einer befeuchteten Atmosphäre bei 95% Luft und 5% CO₂ kultiviert. Zählen und bestimmen der Lebensfähigkeit erfolgten unter Verwendung von Trypan-Blau. Zellen wurden in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 24-stündiger Kultivierung in normalem Wachstumsmedium wurden die Zellen mit α-L-Guluronsäure (G2013) für 24 h wie folgt behandelt: niedrige Dosis (5 μg/ml), hohe Dosis (15 μg/ml) und pures Medium (Kontrolle). Gesamt-RNA wurde aus der Kontrollprobe und behandelten Proben unter Verwendung des Hybrid-R-Mini-Kits (GeneAll, Süd-Korea) nach Angaben des Herstellers extrahiert. Die Reinheit der isolierten RNA wurde per NanoDrop^® ND-1000 (Isogen Life Science) geprüft, um spektrophotometrische Verhältnisse von A_{260 nm}/A_{280 nm} ~ 2 und A_{260 nm}/A_{230 nm} ≥ 2 zu gewährleisten. Nach der Isolierung der RNA aus den Zellen wurde unter Verwendung des RT-for-RCR-Kit (GeneAll, Süd-Korea) cDNA präpariert. Die Amplifikation von SHIP1 (vorwärts: 5'-GCC TAC ACC AAG CAG AAA GC-3'; revers: 5'-GGA CCG TTC TTG GAG ACA AA-3') und SOCS1 (vorwärts: 5'-AGA GCT TCG ACT GCC TCT TC-3'; revers: 5'-GAT GCG CTG GCG GCA CAG CT-3') mRNA wurde mittels quantitativer PCR (QPCR) (Applied Biosystem) mit SYBR Premix Ex Tq (Takara, Japan) durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 95° C für 3 Minuten (1 Zyklus) und 94° C für 20 s, 60° C für 30 s und 72 ° C für 40 s (40-Zyklen). Die relative mRNA-Häufigkeit wurde durch Normalisierung gegen ß-Actin-mRNA unter Verwendung des 2^-ΔΔCT-Verfahrens bestimmt (Ct bezieht sich auf den Schwellenwert). Die miRNA cDNA wurde unter Verwendung von MystiCq^® MikroRNA cDNA Synthesis Mix (Sigma-Aldrich) gemäß den Herstellerangaben erzeugt. Die qPCR wurde unter Verwendung eines spezifischen miR-155 Primers, 5'-UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU-3' (Sigma-Aldrich), und SYBR Premix EX Tq (Takara, Japan) durchgeführt. Die Bedingungen für die qPCR waren wie folgt: 95° C für 30 s, 94° C für 5 s, 60° C für 30 s und 70° C für 15 s (40-Zykluen). Der Thermocycler One-Step Real Time (Applied Biosystem) wurde für die qPCR verwendet und die Daten wurden analysiert unter Verwendung von GraphPad Prisma 5-Software basierend auf der Methode von One-Way-Anova-Varianz und des Student-t-Test. Relative miRNA-Häufigkeit wurde durch Normalisierung gegen U6 snRNA mit der 2^-ΔΔCT-Methode bestimmt.
Die Ergebnisse der α-L-Guluronsäure behandelten Zellen zeigen eine signifikante Abnahme der Expression von microRNA 155 im Vergleich zur Kontrollgruppe ( ) und eine signifikante Erhöhung der Genexpression von SHIP-1 ( ) und SOCS-1 (Abbildung 6) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dies zeigt die immunsuppressiven Eigenschaften von α-L-Guluronsäure (G2013).
Beispiel 4: Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Differenzierung, die Reifung und die Funktion von menschlichen dendritischen Zellen
Herkömmliche DC-basierte Immunsuppressiva haben nennenswerte Nebeneffekte das Risiko von Infektionskrankheiten und Krebs zu erhöhen. Das Ziel dieser Experimente ist es die sichere Anwendung von α-L-Guluronsäure zu zeigen, so dass sich keine Effekte auf die Differenzierung, Reifung und Funktion von dendritischen Zellen ergeben. Die in vitro Differenzierung von menschlichen Monozyten in dendritische Zellen (DCs) wurde wie von Sreevalsan beschrieben mit geringen Modifikationen durchgeführt [Sreevalsan T, 2009]. Sechs menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch eine Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro) Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Monozyten wurden aus peripheren mononukleären Blutzellen unter Verwendung von anti-CD14 Microbeads (Miltenyi Biotec) gereinigt. Die Monozyten (> 95% Reinheit) wurden bei 37° C in 24-well Platten (700000 Zellen pro Vertiefung) in 3 ml serumfreiem AIM V Medium (Invitrogen), enthaltend 100 ng/ml Human-Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) (PeproTechs) und Human-Interleukin-4 (IL-4, 20 ng/ml, R&D Systems), kultiviert. Die Zellen wurden mit zwei verschiedenen Dosierungen von G2013 kultiviert. Zum einen einer 6 μg/well niedrig Dosierungslösung und zum anderen einer 12 μg/well hoch Dosierungslösung. 6 Vertiefungen wurden als Kontrolle ausgewählt (nicht behandelt mit G2013). Insgesamt 0,5 ml frisches Medium mit GM-CSF und IL-4 wurde den Zellkulturen am dritten Tag hinzugefügt. Um die DC-Reifung zu induzieren wurden am fünften Tag die Zellkulturen über 24 Stunden mit Lipopolysaccharid (LPS, 1 μg/ml, Katalog-Nr. L2654, Sigma-Aldrich) in Kontakt gebracht. Zwei Dosen von α-L-Guluronsäure(G2013)-Lösung wurden 4 Stunden vor der LPS Zugabe in die Vertiefungen gegeben. Die geernteten Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und in 100 μl PBS, das mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid zur Färbung supplementiert wurde, resuspendiert. Die Zellen wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Fc-Rezeptor-Blockierungslösung (BioLegend, San Diego, USA) inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 4° C für 30 min mit den folgenden monoklonalen Maus-anti-human-Antikörper inkubiert (MAb): FITC-konjugierte mAbs gegen die Zelloberflächenmoleküle CD83, CD14 und PE-konjugierte mAbs gegen CD1a, CD86 und PECY5-konjugierte mAbs gegen MHCII (eBiosciences, USA). In allen Experimenten wurden Isotyp-Kontrollen verwendet, die geeignete mAb der gleichen Ig-Klasse oder Unterklasse waren. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal in PBS, das mit 0,5% BSA und 0,1% Natriumazid supplementiert war, gewaschen und in PBS mit 0,99% Paraformaldehyd resuspendiert. Durchflusszytometrie wurde auf einem Cytomics FC-500-Zytometer (Beckman Coulter) durchgeführt und alle nachfolgenden Analysen wurden durch die FlowJo Software (Tree Star) analysiert. DC Cytokin-Produktion wurde jeweils in den Überständen der DCs Kulturen (IL-12p70 und IL-10) nachgewiesen. Überstände wurden gesammelt und bei –70° C bis zur Verwendung eingefroren. Zytokin-Konzentrationen wurden durch ein Enzym-gebundenes Immunosorbent Assay (ELISA) Kit (BenderMed System, Österreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.
Die Expression von CD14 und CD1a (als Differenzierungsmarker) wurde in Monozyten und unreifen dendritischen Zellen mit zwei unterschiedlichen Dosen (6 und 12 μg/Vertiefung) von α-L-Guluronsäure (G2013) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit G2013-Lösung behandelt wurden, gibt.
Um zu bestimmen, ob die Wirkung von zwei verschiedenen Dosen (6 und 12 μg/Vertiefung) einer G2013-Lösung Auswirkungen auf die Expression von CD83, CD86 und MHC II (als Reifungsmarker) hat, wurden DCs in der Anwesenheit dieser zwei verschiedenen Dosen kultiviert. Die Expression von MHC-II und der co-stimulierenden Moleküle wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten zeigen, dass die Expressionen der co-stimulierenden Moleküle und von MHC-II keine signifikanten waren Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit G2013 behandelt wurden, aufzeigen.
Die Überstände von kultivierten DCs wurden gesammelt und Zytokin-Konzentrationen durch das ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied in Zytokin-Konzentrationen (IL-12p70 und IL-10) zwischen Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit G2013 behandelt wurden (z.B. 6 μg/Vertiefung (P = 0,068) bzw. 12 μg/Vertiefung (P = 1,4) in reifen dendritischen Zellen gibt. Die Ergebnisse zeigen, dass α-L-Guluronsäure (G2013) als sicheres Medikament keine nachteilige Wirkung auf die Differenzierung, die Reifung und die Funktion von dendritischen Zellen hat und als neuartiges Immunsuppressivum verwendet werden kann, das keine oder weniger Nebenwirkungen (z.B. das Risiko von Infektionskrankheiten und Krebs zu erhöhen) hat als vergleichbare auf dem Markt befindliche Produkte.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 0506325 [0007]
WO 01/66119 [0010]
US 5952308 [0012]
WO 01/56404 [0013]
DE 10247073 A [0014]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Chem. Abstracts 1991, 114:69045 [0011]

Claims

Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer α-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50 mg/kg/d verabreicht wird.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Entzündungskrankheiten Autoimmunkrankheiten, akute und chronische Entzündungen und Osteoarthritis umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Autoimmunkrankheiten rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, progressive systemische Sklerodermie (PSS), Polymyositis-Dermatomyositis, Morbus Behçet, Spondylitis ankylosans, Psoriasisarthritis, Reiter-Syndrom und rezidivierende Polychondritis umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nierenerkrankungen Glomerulonephritis und Glomerulosclerosis umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Störungen des Immunsystems Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen, allergisches Kontaktekzem und Hypersensivität Typ I–IV umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei die neurodegenerativen Krankheiten Multiple Sklerose (MS) und Alzheimer-Krankheit umfassen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 zur Kombinationstherapie mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Uronsäure-Monomer aus der Gruppe bestehend aus Natrium-α-L-Guluronsäure, Kalium-α-L-Guluronsäure, Magnesium-α-L-Guluronsäure, Calcium-α-L-Guluronsäure und einer Kombination davon ausgewählt ist.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das Uronsäure-Monomer intraperitoneal, oral, bukkal, rektal, intramuskulär, topisch, subkutan, inhalativ, intraartikulär oder intravenös verabreicht wird.
Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das Uronsäure-Monomer als Salbe, Creme, Gel, Paste, Emulsion, Tablette, Zäpfen, Puder, Pulver, Granulat, Pastille, Patch, Pflaster, Lösung, Schaum, Lotion, Öl, Shampoo, Aerosol oder Spray vorliegt.