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Bereich der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein chemisch nicht modifiziertes Hyaluronanprodukt,
das ein äusserst
grosses Molekulargewicht und eine äusserst hohe Viskosität aufweist,
d.h. Null-Scherviskosität. Dieses
einzigartige Produkt ist festbeständig und gleichzeitig viskoelastisch,
und es ist bestens verträglich
als Bioersatzmaterial, zum Beispiel als Ersatzstoff für Knorpel
oder Bandscheiben. Die Erfindung bezieht sich auch auf das Herstellungsverfahren
des obigen Produktes.
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Voraussetzung der Erfindung
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Hyalronan
(Hyaluronsäure)
ist ein Naturpolysaccharid, das als solches erstmals 1934 isolierbar war,
24 Jahre später
war diese Molekularstruktur dann völlig definiert. Das erste Handelsprodukt
( Handelsmarke Healon), was 1980 zur Verwendung in der Augenchirurgie
hergestellt wurde, ist ein chemisch nicht modifiziertes Produkt.
Seitdem ist eine grosse Menge ähnlicher
Produkte hergestellt worden, einige davon enthalten ausschliesslich
Hyaluronan mit verschiedenem Molekulargewicht von 0,5 bis 8.0 Millionen
(Dalton), so wie es der Fachliteratur beschrieben ist.
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Doch
die meisten Produkte bestehen aus chemisch modifizierten Hyaluronan,
d.h. dem ursprünglichen
Hyaluronanmolekül
werden andere chemische Substanzen beigesetzt um höhere viskoelastische
Eigenschaften zu erhalten, aber dies ist immer mit riskabeln Nebeneffekten
verbunden. Das quergekoppelte Hyaluronan ist seit 1963 bekannt (T.C.
Laurent et al). Ein weiterer Mangel des quergekoppelten Hyaluronans
ist seine relativ kurze Lebensdauer im menschlichem Gewebe.
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Die
chemische Struktur des Hyaloronans hängt nicht von seiner Herkunft
ab, Hyaluronan ist ein lineares Polysacharid mit geradliniger Kette.
Das Polysacharid besteht aus wiederholten Disachariden zusammengesetzt
N-Acetyl-D- Glukosamin und Glukoronat gekoppelt mit β(1→3) und β(1→4) glykosidischen
Bindungen. Es ist allgemein bekannt, dass das Molekül des Hyaluronans
im Lösungszustand
die Konfirmation einer verhärteten
irregulären
Spirale annimmt. Hyaluronan wird mit Hilfe eines Enzymkomplexes
in den Zellmembranen produziert. Die Enzyme produzieren Hyaluronan
aus interzellulären Stoffen,
und erhaltenens Polysacharid wird unmittelbar in den Interzellulararraum
ausgescheiden.
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Die
Produktion des Hyaluronans kann auf bakterieller Synthese oder Extration
aus biologischer Herkunft geruhen, wie bei der Nabelschnur oder
vom Hahnenkamm. Das Molekulargewicht des ausgeschiedenen Stoffes
hängt unter
anderem ab von der Qualität
des Rohstoffes, von verwendeten Auslaugeverfahren, Extration, Reinigung,
Sterilisierung und vom Qualitätssystem.
Die Stämme
gewisser Streptokokkenbakterien sind fähig Hyaluronan mit einem. geringeren
Molekulargewicht zu produzieren als bei einem aus Hahnenkamm ausgelaugten
oder extrahierten Produkt.
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Von
Bakterien produziertes Hyaluronan muss einer Querkopplung unterzogen
werden damit ein Produkt mit einem grösseren Molekulargewicht entsteht,
das für
die Verwendung in der Medizin nötig ist.
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Um
die Nachteile, die mit der Verwendung von chemisch modifizierten
Substansen verbunden sind, zu vermeiden, ist es bedeutend besser
ein nicht modifiziertes Hyaluronanprodukt mit grösserem Molekulargewicht zu
verwenden.
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US-A-4141973
beschreibt eine sterile pyrogenfreie nicht antigene Fraktion der
Hyaluronsäure, die
ein durchschnittliches Molekulargewicht von Minimum 1,200,000 Dalton
(Healon) aufweist, mit einem Proteingehalt weniger als 0,5% dem
Gewicht nach. Das Verfahren ist sehr komplex und es beinhaltet viele
komplizierte Prozeduren und wiederkehrende Reinigungsphasen, so
dass dafür
mindestens 236 Stunden benötigt
werden. In US-A-4141973 werden keine verschiedenen Viskositätsangaben
erwähnt
oder behandelt, die von grosser Bedeutung für alle Typen rheologischer
Lösungen
sind, d.h. Null-Scherviskosität,
Elastizität
usw.
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US-A-5681825
beschreibt eine Weiterentwicklung des Verfahrens, das in den Patent US-A-4141973
dargestellt ist, d.h. Anfertigung einer sterilen Lösung von
chemisch nicht modifizierter Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht
von 4 bis 6,5 Millionen Dalton, die zur Linderung bei chirurgischen
Operationen für
Augen und Augenzonen verwendet werden kann. Das Verfahren besteht
aus mehreren Extrationen und Fällungen
bei verschiedenen pH-Werten, es ist ein zeitlich lang wieriges zusammengesetztes
Verfahren. US-A-5681825 beschreibt die Null-Scherviskosität, des Hyaluronans, die ungefähr zehn
Mal höher
als beim obigen Healons ist, d.h. 2,500,000 mPas, aber dieser Wert
ist viel zu niedrig, um das Produkt als eine Lösung des Feststoffes qualifizieren
zu können.
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EP
A2 0320164 beschreibt die Herstellung von chemisch modifizierten
Hyaluronan, wo verschiedene querkoppelnde Aldehydgruppen kovalent mit
Molekularketten des Hyaluronans verbunden sind, d.h. eine Umformung
der Primärstrukturen
des Moleküls,
wodurch ein neues Polymer (Hylan) ensteht. Hylan weist eine Viskosität bis zu
1,000,000 mPas bei einer Scherhäufigkeit
von 0,055 Hz auf, was in der Extrapolationsbeziehung zur Null-Scherviskosität einem
Molekulargewicht von ungefähr
7 Millionen Dalton entspricht. Die erwünschten Veränderungen der physikalischen
Eigenschaften sind abzuwägen
gegen einige unerwünschte
Veränderungen
in der Bioverträglichkeit,
mehrere dieser Hyaluronanäthertypen
zeigen eine zunehmende Aktivität von
Gewebereaktionen, die sich sehr von der Reaktion auf nicht modifizierte
Hyaluronantypen unterscheidet. Dieses Verfahren benötigt 166
bis 262 Stunden für
die Herstellung. EP A2 0320164 unterscheidet sich nicht von US-A-5681825
und US-A-4141973 bezüglich
der erhaltenen Molekulargewichte.
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Alle
in den obigen Dokumenten erwähnten Produkte
haben nur ein Molekulargewicht von weniger als 8 Millionen Dalton,
ausserdem erfordern sie einen komplizierten und zeitaufwendingen
Herstellungsprozess. Der Hauptparameter aus medizinischer – und therapeutischer
Sicht ist die Null-Scherviskosität,
d.h. bei einer Null-Scherviskosität geringer als 50,000,000 mPas
haben die Produkte relativ niedrige Viskosität, Elastizität usw..
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Kurze Beschreibung der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung gewährleistet
das Erhalten von chemisch nicht modifizierten Hyaluronans mit einem
wesentlich grösserem
Molekulargewicht als bisher und kann somit vielerlei Anwendungsmöglichkeiten
in der Medizin haben.
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Diese
Erfindung ist durch Beoachtung vieler bisher unbekannter Qualitätsparameter
zusammen mit der Verwendung einer neuer Technologie in Kombination
vieler Schritte von der Bearbeitung des Rohstoffes bis zum sterilen
Endprodukt möglich
geworden. Das mit dieser Erfindung verwirklichte Herstellungsverfahren
ist sehr schnell und benötigt
höchstens
1,5 Tage.
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Das
Herstellungsverfahren des Hyaluronans mit dieser Erfindung ermöglicht es
Produkte mit Null-Scherviskosität
von 5 Millionen bis zu 30 Billionen mPas zu gewinnen, was einzigartig
ist. Dank dieser unglaublich hohen Scherviskosität besteht nun die Möglichkeit
vielfältige
bioverträgliche
Produkte für die
Verwendung in menschlichen und animalischen Organismen herzustellen.
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In Übereinstimmung
mit dieser Erfindung werden viel grössere Molekulargewichte erhalten und
bei entsprechender Kozentration können Produkte mit spezifisch
visko-elastischen Eigenschaften geschaffen werden. Bei dem Molekulargewicht
9–25 Millionen
Dalton und einer Konzentration innerhalb von 10–39 mg/ml wird die Null-Scherviskosität (von 5 Millionen
bis 30 Billionen mPas ) bei der Scherhäufigkeit 0,001 Hz mit dieser
Erfindung erreicht,
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Viskoelastische Eigenschaften
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Die
Beziehung zwischen Null-Scherviskosität, Molekulargewicht und Konzentration
ist allgemein bekannt, siehe folgende Formel: Null-Scherviskosität = 5.3 × 10–26 × (Konzentration × Mr)3,643 (Einheiten = mPas)
Mr = Molekulargewicht
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Für die Produktion
viskoelastischer Substansen mit hoher Null-Scherviskosität lassen
sich nur die Parameter für
Molekulargewicht und Konzentration verändern.
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Es
ist zu beachten, dass der Parameter für Konzentration ein stark begrenzender
Faktor ist. Der kolloidale osmotische Druck des Hyaluronans ist
besonders interessant im Zusammenhang mit der Verwendung des Hyaluronans
in verschiedenen Körperorganen.
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Der
kolloidale osmotische Druck hängt
von der Molekülmenge
in der Lösung
ab und ist somit mehr eine Funktion der Anzahl der Moleküle mit durchschnittlichem
Molekulargewicht als des Durchschnittwertes der Molekulargewichte.
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Das
Erhalten des Endproduktes mit dem Gewicht innerhalb 9–25 Millionen
Dalton ist äusserst schwierig,
das Verfahren ist kompliziert und erfordert grossen technologischen
Aufwand. Dieses Patent umfasst ein einzigartiges Herstellungsverfahren
für sterile
Endprodukte, es ist eine Neuigkeit von umfangreicher medizinischer
Bedeutung mit vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten für praktische
medizinische Zwecke wie zum Beispiel für Augenlinsen, Bandscheiben,
Protesen usw..
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Hyaluronan
(Hyaluronsäure)
besitzt günstige physikalische
Eigenschaften, die das Produkt besonders geesignet machen für umfangreiche
Anwendung in folgenden medizinischen Bereichen ; in der Orthopädie, Rheumatologie,
Ophtalmologie, Dermatologie, plastischer Chirurgie, Otologie, Rhinologie, Neurologie,
Urologie, kardiothorakaler Chirurgie, und zur Verhütung von
Narben- und Schwartenbildung.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Nachstehend
folgen die Beschreibung des Herstellungsverfahrens dieser Erfindung
und einige Beispiele.
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I. Herstellungsverfahren
des Hyaluronans mit sehr hohen Molekulargewicht
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Rohstoff
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Als
Rohstoff werden Kämme
spezial ausgewählter
Hähne von
der Gattung Weisser Leghorn benutzt. Sie werden dem Genotyp und
Phänotyp
nach ausgewählt,
wobei das Vorhandensein des Hyaluronanmoleküls mit einem Molekulargewicht
innerhalb von 10 bis 50 Millionen Dalton geprüft wird.
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Wasser-und
Salzextraktion und Reduzierung von Mikroorganismen
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Direkt
nach dem Scheren der Kämme
werden sie mit 70% Äthanol
im Verhältnis
1:5 behandelt. Eine Spezialausrüstung
reinigt die Kämme
von biologischen Verunreinigungen, diese Behandlung wird 3 bis 5
Mal mit frischem Äthanol
wiederholt. Als eine Alternative hierzu kann eine Lösung von
Natriumphosphat auf der zweiten Stufe hinzugesetzt werden.
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Vorbearbeitung der Kämme
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Die
Kämme werden
unmittelbar ungefähr
bis zu –15C
gefroren in feine Scheiben in Dicke von 0.001–0.1 mm geschnitten, dann schnell
bis –22C
im Gefriertunnel gefrieren lassen. Als eine Alternative zum Scheibenschneiden
können
die Kämme
fein gemahlen werden.
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Auslaugen des Hyaluronans
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In
einer verdünnten
Lösung
(0,5–2% NaCl-Lösung) wird
Hyaluronan aus dem Material in bis zu sieben Stufen in Kväve ausgelaugt.
Die Auslaugezeit variiert zwischen 3 Minuten bis zu 3 Stunden.
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Entfernung von Verunreinigungen
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Die
Lösung
wird mit adsorbierenden Stoffen wie zum Beispiel Hydroyapatite in
einer oder mehreren Stufen unter sorgfältigem Umrühren bearbeitet, danach wird
filtriert.
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Konzentration des Hyaluronans
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Die
Lösung
wird konzentriert, zum Beispiel mittels Dialyse (PEG 3000) in Vakuum.
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Verpackung und Sterilisierung
des erhaltenen Hyaluronans
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In
Bezug auf Molekulargewicht und Konzentration werden verschiedene
Produkte in verschiedene Dispensertypen verpackt. Die Produkte können mittels
Bestrahlung (16-28
kg Gray) sterilisiert werden. Als Alternative können auch Mikrowelleneinwirkung
(10–300
W, 2450 Hz) Autoklavieren oder steriles Filtrieren der verdünnten Lösung bei
angemessenen Bedingungen angewandt werden.
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II Medizinische Verwendung
des Hyaluronans
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Gemäss dieser
Erfindung lassen sich die Produkte in Bezug auf ihre rheologischen
und chemisch-physiologischen Eigenschaften sowie im Hinblick auf
ihre unterschiedlichen medizinischen Verwendungszwecke in vier Kategorein
(A–D)
einteilen. Nachstehend folgt ein Beispiel für jede Kategorie
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Beispiel A: Hyaluronan
in der Augenchirugie
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Produkte
der A-katagorie, die die Null-Scherviskosität innerhalb von 100 Millionen
bis 1 Billion mPas besitzen, sind mit einem hohen Grad von Gelierfähigkeit
mit einzigartigen viskoelastischen Eigenschaften gekennzeichnet.
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Beim
Augenblinzeln finden grosse Verschiebungen statt, deshalb sollte
die Augenflüssigkeit
eine hohe Null-Scherviskosität
besitzen, um solche grossen Verschiebungen sichern zu können. Dies
funktioniert bei niedriger Molekülkonzentration
mit hohem Molekulargewicht, wobei gute viskoelastische Eigenschaften
gewährleistet
werden.
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Ein
A-Produkt entspricht diesen Anforderungen
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Beispiel B: Hyaluronan
als Helfer in Transplantationsbereichen
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Produkte
der B-Kategorie, die die Null-Scherviskosität innerhalb von 1–10 Billionen mPas
besitzen, können
als ein "Gummiball" gekennzeichnet werden,
der sehr hohen Druck auf lange Zeit: aushalten kann während er
um seine eigene Achse rotiert. Produkte dieser Kategorie können als Transportstoffe
in Transplantationen verwendet werden, zum Beispiel bei Insulin
produzierenden Beta-Zellen. Bei Transplantation von Beta-Zellen,
die in der unregelmässigen
Hyaluronanspirale eingeschlossen sin, gelingt es eine Aktivierung
des Abstossmechanismuses zu vermeiden. Die Beta-Zellen behalten
ihre Lebensfähigkeit
in Hyaluronan und können
somit die Insulinproduktion fortsetzen.
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Ein
B-produkt besitzt die hierfür
nötigen
Eingenschaften
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Beispiel C: Hyaluronan
als Muskelstütze
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Produkte
der C-Kategorie, die die Null-Scherviskosität innerhalb von 10–20 Billionen mPas
besitzen, haben konstante viskoelastische Eigenschaften, völlig unabhängig von
zeitlichen Faktoren. Ein Verwendungsbereich, wo eine hohe Null-Scherviskosität erforderlich
ist, ist bei Inkontinenz, wo das Material viskoelastisch wie ein
Gummiball sein soll, um das schwache Gewebe und die verfallene Muskulatur
zu stützen.
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Ein
C-Produkt besitzt solche Eigenschaften.
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Beispiel D: Hyaluronan
als Ersatzstoff für
Knorpel und Knochen
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Produkte
der D-Kategorie, die die Null-Scherviskosität innerhalb von 20–30 Billionen mPas
besitzen, können
als feste beständige
Stoffe mit einzigartiger Funktion gekennzeichnet werden. Diese Stoffe
sind gleichzeitig viskös
und elastisch.
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Bei
der Vergrösserung
des Molekulargewichts verleihen zwischenmolekulare Kräfte dem
Molekül
eine gewisse Stabilität,
wobei eine doppelte Spirale entsteht, wo sich Makromoleküle des Hyaluronans
zusammenschliessen, d.h. bei sehr hohen Molekulargewicht verhalten
sich die Moleküle
wie quergekoppelte Makromoleküle.
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Produkte
der D-Kategorie können
als Ersatztstoff für
Knorpel und dank ihrer hohen Toleranz auch als Ersatzstoff für beschädigte Scheiben
(Bandscheiben) benutzt werden.
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Das
Hyaluronanprodukt bleibt in der Form von einer sehr dünnen Schicht
zwischen den Knochen liegen, selbst bei extremer Druckbelastung
wie bei Ausrenkung oder Knorpelbeschädigung in den Gelenken.
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Reinheitsgrad
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Die
Produkte gemäss
dieser Erfindung haben bezüglich
Endotoxin EU/ml einen Reinheitsgrad, der verglichen mit Healon (Handelsmarke)
eine Verbesserung von mehr als 30% darstellt
- – Sterile
Lösung
des Hyaluronans gemäss
dieser Erfindung hat folgende charkteristische werte:
- – Proteingehalt
weniger als 100μg/g
- – Absorbierbarkeit
der 1% Lösung
bei 257 nm beträgt
maximal 1.5 und bei 280 nm maximal 1.5
- – Maximaler
Eisengehalt 0.1 mg/g
- – Maximaler
Kupfergehalt 0.1 mg/g
- – Maximaler
Azetongehalt 2 mg/g
- – Maximaler Äthanolgehalt
6 mg/g
- – Maximaler
Endotoxingehalt nach Limulus 0.35 EU/ml
- – pH-Wert
von 7.0 bis 7.5
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Für diese
Erfindung wird Hyaluronsäure
vorzugsweise in der Form von Sodiumsalz verwendet. Die Lösung der
Hyaluonsäure
wird mit einem physiologisch geeingneten Dämpferstoff versehen.