DE2014200B2 - Verfahren zur gewinnung und erhaltung von bakterienvarianten und ihre verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten, ausgenend von pathogenen oder nicht pathogenen Bakterien. Die Bakterienvarianten zeigen eine gegenüber den Bakterien, aus denen sie entstanden sind, vollständig unterschiedliche Morphologie.

Die Vorstellung von Bakterien, die bei einer von den bekannten Bakterien vollständig unterschiedlichen Morphologie der Fortpflanzung fähig sind, geht zurück auf die ersten Untersuchungen der L-Formen durch Klieneberger. Diese spontan aufgetretenen Formen wurden (nach dem Lister Institut) Ll-Formen genannt. Sie wurden von Dienes als wirkliche Bakterienvarianten und nicht Symbionten identifiziert. Klieneberger — Nobel und T u I a s η e schlossen sich dieser Meinung an.

Die L-Formcn wurden lange Zeit als das Ergebnis von Laboratoriumsmanipulationen betrachtet und im erweiterten Sinne als künstliche Kreationen. Indessen konnte die Existenz von spontan in L-Form überlebenden normalen Bakterien für Keime beobachtet werden, denen eine extreme Polymorphic zukommt, und zwar bei Havcrhillia moniliformis und Spherophorus funduliformis (para influen/a). den Agentien der post-anginösen Sepsis beim Menschen.

Pierce, Dienes, Klieneberger und Tula s η e ist es gelungen, im Laboratorium eine fio L-Transformation bei zahlreichen Bakterien herbeizuführen, und zwar sowohl bei Bazillen aus auch bei Kokken wie Salmonellen, Shiga-Krusc-Bacilliis, Typhusbazillen, Clostridiu, Gonokokkcn. Streptokokken sowie Para-influenza. und zwar durch Einwirkung von Penicillin.

Es gibt zahlreiche andere Mittel, die in der Lage sind. sine L-Transformation hervorzurufen, wie Antibiotika, die auf die Bakterienwände einwirken (Bacitracin, Cycloserin), chemische Mittel (Glysin in erhöhter Konzentration), Lyso-Enzyme (Lysozym, I ysostaphin), physikalische Mittel (ultraviolette Strahlungen) oder biologische Mittel (Phagen, komplementäre Antikörper),

Um einen besonderen Typ von L-Formen zu bezeichnen, wurde der Begriff der Protoplasten und Sphäroplasten eingeführt Als Protoplasten, ein Aus druck botanischen Ursprungs, der von W e 1 b u 11 und McGu ill en eingeführt wurde, bezeichnet man infolge der Einwirkung von Penicillin oder Lysozym aus Bakterien entstandene globulöse bzw. kugelige Organismen. Als Sphäroplasten werden L-Formen mit charakteristischer globulöser Morphologie bezeichnet, die ihren Ursprung von Bakterien nehmen, die sie reproduzieren können, wenn das für die Transformation bestimmende induzierende Mittel eliminiert wird (Behandlung mill Benzylpenicillin, anderen Penicillinen, Cycloserin, Lysozym bei pH 8,8, Lysazym in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure und »Tris«-Puffer).

Die L-Formen der Bakterien werden in allgemeiner Weise definiert als von Bakterien ausgehende globulöse Elemente, deren Wand durch diverse Faktoren modifiziert oder vollständig beseitigt worden ist. Sie sind geeignet, Ausgangspunkt für Kolonien von zwei unterschiedüchen Typen, nach Dienes den L3B- und L3A-Typen, zu werden. Bezüglich der Morphologie begegnet man einer Polymorphic deren Beschreibung je nach Autor und den Modalitäten des Herstellungsverfahrens schwankt; man kennt:

übergroße kugelige Körper nach W e i b u 11: Gewisse Bestandteile der Wand sind verschwunden, da die Bakterie ihre Form verloren hat;
Fäden, die nach Klieneberger- Nobel künstliche Strukturen sein sollen, die sich durch die große Plastizität der L-Formen erklären sollen, welche sich in der Nährlösung deformieren;
Elementarkorpuskeln nach Klieneberger oder Zwergformen nach T u I a s η e, die filtrierbare und lebensfähige inframikroskopische Elemente sind.

Ein Entwicklungszyklus der Bakterienvarianten wurde jedoch bisher nicht nachgewiesen.

In cytologischer Hinsicht besieht bei den L-Formen eine Veränderung oder ein Verschwinden der Zellwand, die durch mehrere aufeinanderfolgende Schichten gebildet wird, die im wesentlichen zwei Bestandteile enthalten: N-Acetylmuraminsäure und N-Acetyl-glucosamin. Die Wand scheint sich nicht in das osmotische Gleichgewicht des bakteriellen Cvtoplasmas einzuschalten. Die Permeabilität der Bakterienzellen geht zurück auf die Cytoplasmamembran, die durch Lipoide und Proteine, enzymatische Systeme, spezifische Permeasen gebildet wird. Im Gegensatz zur Bakterie ist das Cytoplasma relativ abgesondert bzw. diskret gegenüber der Masse der Keimbläschen.

Was die Eigenarten der Kulturen betrifft, so haben einige der zitierten Autoren in der Absicht, die L-Formen zu erhalten, protein- und lipoidreiche Milieus verwendet. Durch Anreicherung von gebräuchlichem Kuiturniilieu mit einem Rinderherzextrakt, durch Zusatz von Pepton, Pferde- oder Rinderscrum in erhöhier Menge (10-20% des Milieugewichts) oder von Bierhefe,

Andere haben eine Abhängigkeil der L-Form von Sterolen und gewissen Lipoiden ins Auge gefaßi.

Hinsichtlich der Antigenstruktur wurden als Techniken diejenigen verwendet, die für Bakterien in Gebrauch sind; sie haben jedoch nicht zu positiven Ergebnissen geführt, wobei der Fehler darin bestand, ständig das gesamte Mosaik der für die Bakterie kennzeichnenden Antigene in dem Mikroorganismus wiederfinden zu wollen, die eine echte genetische Mutation durchgemacht hatten.

Schließlich kamen die Autoren, die das pathogene Verhalten der in vitro erhaltenen pathogenen Varianten ι ο untersucht haben, meist zu dem Schluß, daß eine Virulenz, »verbunden mit dem Unvermögen dieser Varianten, im Organismus zu überleben«, nicht besteht. In vivo wurde die Existenz der L-Formen bei der Ratte und bei der Maus nach Injektion von Streptokokken und Behandlung mit Penicillin (Oberleben von 25 Tagen im Bauchfell der Maus) festgestellt

Andere vom Staphylokokkus, Proteus und vom Bacillus pyocyaneus stammende L-Formen wurden im Blut von an chronischen Infektionen Leidenden (Harnleiden) beobachtet Ihre Diagnose konnte erst durch Rückkehr zu den Ursprungsbakterien sichergestellt werden, da die L-Varianten instabil waren.

Die Inhibition oder Auflösung der Zellwand kann partiell oder vollständig sein; man hat in dieser Hinsicht bereits den L3B-Typus beobachtet, der von einer Transformation im Phänotypus herrührt mit Möglichkeit der Rückkehr zur Ursprungsbakterie und den L3A-Typus, der als Resultat einer genetischen Transformation anzusehen ist, wobei die Biosynthese der steifen Bakterienwand dann definitiv gehemmt ist.

Diese stabile Form der L3A-Form könnte als vollständige L-Transformation anzusehen sein, während das L3B-Stadium so nur eine Zwischenform darstellt.

In Anbetracht der widersprüchlichen Angaben über Kulturen, Morpho'ogie, Cytologie, Abwesenheit eines pathogenen Verhaltens der Kulturen in vitro und Existenz eines solchen bei isolierten Varianten in vivo (instabile Varianten, die zum Ursprungsbakterium zurückkehren), wurden die Untersuchungen nicht fortgesetzt, und zwar auch wegen der Unmöglichkeit, die L-Varianten überleben zu lassen und zu konservieren. Da Mittel zur Erhaltung der L-Varianten nicht bekannt waren, konnten serologische Untersuchungen und eine Prüfung ihrer spezifischen pcthogenen Wirkung im Vergleich zu den Ursprungsbakterien nicht unternommen werden.

Die Anmelderin hat beobachtet, daß sich Mutationen fortpflanzen können und daß die Lebensfähigkeit der Keime nicht an die Anwesenheit der Zellwand gebunden ist: Eine zarte semipermeable lv;embran haftet am Cytoplasma und spielt eine beachtliche Rolle bei den Erscheinungen der osmotischen Nahrungsaufnahme und der Ausbildung neuer Zellwände bei den Tochterzellen, wenn sich die Mutante zum Ursprungsbakterium zurückentwickelt.

Diese nicht mit einer steifen Wand versehenen und nur durch eine zarte Cytoplasmamembran begrenzten Mutanten unterscheiden sich deutlich von den Ursprungsbakterien, gleichgültig, ob diese pathogen sind do oder nicht. Wegen ihrer sehr geringen Größe bzw. extremen Plastizität, wodurch sie leicht verformbar sind, können sie durch Ultrafilter hindurchgehen. Ihr morphologischer Aufbau und ihre Art der Fortpflanzung sind den herkömmlichen bakteriologischen Unter- (15 suchungsmethoden unzugänglich geblieben. Auf festem Milieu sind ihre Kolonien sehr klein (10 bis 600 μ) und entgehen daher oft dem unbewaffneten Auge.

Im Lichtmikroskop (1300- bis 2000fache Vergrößerung) beobachtet man die Ausbildung von Ringen, Pseudomycelfäden und übergroßen kugeligen Körpern. Da jedoch zwei Punkte, deren Abstand geringer als 200 αιμ ist, nicht mehr als solche aufgelöst werden, können Einzelorganismen, deren Größe unterhalb dieser Grenze liegt, nicht mehr wahrgenommen werden. Da diese Mutanten weiter keine Zellwand besitzen, sind die klassischen Anfärbemethoden der Bakteriologie nicht mehr geeignet, die nur die Zellwand anfärben (insbesondere Gram-Anfärbung).

Mit dem Elektronenmikroskop (20000fache Vergrö ßerung) erkennt man Formen von Elementarkorpuskeln, deren Größe von 125 bis 150 ΐημ schwankt. Es konnte jedoch nicht festgestellt werden, ob diese isolierten Körper nicht nur einfach eine Phase eines Fortpflanzungszyklus wären.

Die herkömmlichen bakteriologischen Nährböden bzw. -lösungen erlauben weder die Verfolgung noch die Erhaltung von stabilen Varianten, die in Anbetracht ihrer Empfindlichkeit in bezug auf den osmotischen Druck in hypotonischem Milieu platzen.

Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten vorgesehen, das von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterien aus der Gruppe der Enterobakterien, Pseudomonaden und Aktinomyceen ausgeht, wobei man zur Entfernung der Bakterienwand auf diese Bakterien in einem zellfreien Milieu ein chemisches oder biochemisches induzierendes Mittel einwirken läßt oder eine Plasmolyse durch osmotischen Schock im zellfreien Milieu unter einem osmotischen Druck größer oder gleich 60 Atmosphären ausübt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man das die Entfernung der Bakterienwand induzierende Mittel bzw. den osmotischen Schock im Zeitpunkt der Zellteilung einwirken läßt und daß man die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 37°C auf einem durch zellpermeationsregulierende Mittel, enthaltend Saccharose, Spuren von Kalium. Magnesium, Natriumchlorid, Natriumbikarbonat und Phosphor, osmotisch abgeglichenen zellfreien Nährmilieu kultiviert und überträgt, wobei der osmotische Druck der Gesamtheit dieser regulierend wirkenden Mittel zwischen 20 und 30 Atmosphären liegt.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienvarianten zur Herstellung von Impfstoffen und Reagenzien für Gerodiagnostik und Identifizierung infektiöser Agenzien atypischen Krankheiten.

Die Besonderheit der Erfindung liegt wesentlich in der Auffindung von Modalitäten, die einerseits die Gewinnung von stabilen L-Varianten, ausgehend von Kulturstämmen, ermöglichen und andererseits ihre Konservierung bzw. Erhaltung. Dadurch wird die Festlegung eines Verfahrens möglich, das industriell durchgeführt werden kann und zu Bakterienvarianten führt, die morphologisch den Mycoplasmen ähnlich sind. Ihr Fortpflanzungszykkis ist vollständig definiert, ihre cytotoxische Wirkung in vitro wurde aufgezeigt und ihre Ähnlichkeit zu den Stämmen des isolierten Mycoplasmas von »atypischen« Krankheiten herausgestellt.

Für die Gewinnung und Erhaltung der Bakterienvarianten wurde aus zwei Gründen ein zcllfreies Milieu gewählt: Erstens, weil solche, nicht an Zellmaterial gebundene Kulturen industriell rentabler sind als sogenannte zcllhaltigc Kulturen, und zweitens, weil

jeder Interpretationsirrtum vermieden werden sollte. Die Anmelderin hat insbesondere wegen des zweiten Grundes für ihre Untersuchungen synthetische Milieus ausgewählt, die weder Serum, noch Lysozym, noch Antibiotika enthalten.

Der 24 Stunden alte Bakterienstamm wurde in Pepton und Glucose enthaltendes, mit Nukleinsäuren und Adenosindiphosphat angereichertes Wasser eingeimpft und einer die Zellwand ausschaltenden Induktion ausgesetzt.

Unter den induzierend wirkenden Faktoren sind Antibiotika zu nennen, die auf die Zellwand wirken, wo sich das Substrat befindet, das sie inaktivieren oder Antibiotika, die nicht in den Bakterienkörper eindringen sowie zellwandlösende Enzyme, ionische oder nicht ionische Detergentien, welche die Wand auflösen, physikalische Mittel, wie Strahlungen oder Plasmolyse, welche die Wand ablösen. Zur Erzielung einer genetischen Mutation und mithin einer stabilen Variante ist es jedoch unerläßlich, daß die Einwirkung des induzierenden Mittels zum Zeitpunkt der Zellteilung erfolgt, den man aus der Wachstumskurve der Bakterien und über die Bestimmung ihrer exponentiellen Entwicklungsphase ermitteln kann.

Die optimale Bedingung, unter der die Bakterie auf die Wirkung des induzierenden Mittels anspricht, ist der Moment der Zellteilung, der in der Tal einer für Fehler im genetischen Code günstigen Periode entspricht.

Durch Beobachtungen dieser Teilung im Lichtmikroskop wurde festgestellt, daß die Teilung der Kernpartikeln um vieles derjenigen des Cytoplasmas vorangeht. Es war daher unerläßlich, den Rhythmus und die Regel dieser Erscheinung mit Sicherheit mathematisch zu erfassen; da festgestellt wurde, daß die Geschwindigkeit des Wachstums proportional zur Dichte (Konzentration) der lebenden Substanz und das Wachstumsverhältnis unter den experimentellen Bedingungen konstant ist. wurde die Exponentialfunktion nach M a 11 h u s verwendet, um die Zahl der Generationen pro Stunde und darüber den Zeitpunkt der Zellteilung zu ermitteln.

Wenn man die Zeit längs der Abszisse aufträgt und längs der Ordinate die Logarithmen der nephelometrisch bestimmten Kulturdichten, so liefert die Phase exponentiellen Wachstums eine Gerade.

Während der exponentiellen Phase ist das Wachstumsverhältnis umgekehrt proportional der Generationszeit, und man leitet daraus die Zahl der Minuten ab, die zwischen zwei Teilungen verstreichen.

Über die Zahl der Teilungen pro Zeiteinheit erhält man:

_ log X₂ - log X₁

" ih -*i) log 2 '

wobei μ das Wachstumsverhältnis, Xi die Kulturdichte zur Zeit ii und X₂ die Dichte zur Zeit f₂ ist.
Die Generationszeit ist dann:

Bestimmte Stämme und insbesondere Proteus rettgeri zeigen etwa alle halbe Stunde eine Doppelteilung; bei Aktivierung des Stoffwechsels können vier Teilungen pro Stunde erhalten werden, und der physiologische Zustand nähert sich demjenigen der pathogenen Bakterien. Während aufeinanderfolgender Übertragungen zielen die Doppelteilungen auf eine größere Anzahl von Bakterien ab, ohne daß die Zeit die zwei Generationen trennt verändert wird.

Man erhält die größte Zahl von Bakterien durch Teilung, wenn man 3 bis 4 aufeinanderfolgende Übertragungen während der günstigen Teilung vornimmt und bei Kenntnis der Zellteilungszeit die neuen Kulturen bei 10°C 5 Minuten vor der Doppelteilung synchronisiert; man vermeidet so, daß die Bakterien, die in der Entwicklung voraus sind, sich bereits teilen. Die relative Absenkung der Temperatur hemmt die Zellteilungsaktivität nicht jedoch den Stoffwechsel der

ίο Keime; allein die für das Wachstum optimale Temperatur von 37° C begünstigt die Teilungen.

Die Zunahme des Wachstums wird gemessen, ihr folgt eine Periode des Latenz, während der die Bakterien ihre Proteide und Lipoide synthetisieren und nach Ablauf der Generationszeit nimmt die Zelldichte erneut zu.

Auf diese Weise teilen sich nahezu alle Mikroorganismen zum gleichen Zeitpunkt; um jedoch einer Überalterung der Kultur vorzubeugen, ist es zweckmäßig, das induzierend wirkende Mittel schon bei den ersten Zellt« ilungen einwirken zu lassen.

Die so behandelten Stämme befinden sich unter optimalen Bedingungen für die Einwirkung des induzierenden Mittels. Sie sind im sogenannten Zustand »der Kompetenz«. Eine L-Mutation in diesem Stadium wurde bisher nicht beschrieben.

Unter den im Zeitpunkt der Zeillteilung der Bakterie verwendeten induzierend wirkenden Faktoren wird erfindungsgemäß auch die Plasmolyse (Induktion durch osmotischen Schock) herangezogen.

Wenn man Bazillen mit feiner Wandstrukiur einem hypertonischen Milieu aussetzt, so wird dadurch ein Aufbrechen der Trennwände zwischen den Zellen hervorgerufen, das durch Anfärben mit einer verdünnten Lösung von Kristallviolett und Beizen mit Tannin sichtbar gemacht werden kann. Die ihrer Schutzhülle beraubten Bazillen werden zu verformbaren Korpuskeln, die bei rascher »Lösung« im herkömmlichen bakteriologischen Milieu quellen und platzen, wenn der osmotische Druck des flüssigen Milieus nicht auf sie abgestellt ist.

Es ist eines der wesentlichen Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß im Stadium der Zellteilung, d. h. in dem Augenblick, in dem die Zellwand wegen dieses Teilungsvorgangs sehr geschwächt ist, ein osmotischer Druck von zumindest 60, vorzugsweise 80 Atmosphären angewandt wird, um die steife Wand der Bakterien platzen zu lassen.

Die im »Kompetenz«-Zustand befindlichen Bakterienstämme werden in einer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml einer hypertonischen Salzlösung eingeimpft deren osmotischer Druck auf etwa 80 Atmosphärer eingestellt ist und zwar während einer Zeitdauer von 12 bis 24 Stunden. Der erhöhte osmotische Druck wird durch Elektrolyse, wie Mineralsalze und 03 M Saccharose erhalten, die gute Stabilisatoren für den osmoti sehen Druck sind.

Die Plasmolyse erfolgt unter einer Stickstoff- odei COi-Atmosphäre bei anaeroben Bakterien und ii herkömmlicher Weise bei aeroben Bakterien. Ei wurden lebende Keime in Aerobiose durch Absenkei des rH unter 20 durch Beigabe eines Stickstoff- un( Kohlendioxydgasmflieus erhalten.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt daß die Bakte rien, die für die Induktion durch osmotischen Schocl günstig sind, durch diejenigen gebildet werden, die kein die Zellwand einschließende Kapsel (nicht gekapselt Bakterien) und auch keine starke Zellwand haben un

leren Cytoplasniaflüssigkeit nicht in Form eines Gels /orliegt. Die diesen Bedingungen entsprechenden Keime gehören zu den Enterobakteriaceen. Pseudomonadaceen und Actinomyceen.

Bei dem Verfahren unter Einwirkung auf die in Zellteilung begriffenen Bakterien und unter den beschriebenen Modalitäten wurden bei ein und demselben Stamm Bakterien beobachtet, bei denen der erhöhte osmotisehe Druck keine Wirkung zeigte; global erlitten 70% der Bazillen eine definitive Mutation, ι ο während die übrigen Bazillen intakt blieben. Bei dem soeben beschriebenen Verfahren wurden niemals Bakterien beobachtet, deren Wand partiell verändert worden wäre (reversible Mutation).

Die Abtrennung der erhaltenen stabilen Varianten erfolgt durch Filtration (die Varianten sind »ultrafiltrierbar«) und Übertragung:

Wenn die nicht modifizierten Bakterien im Kulturmilieu in geringer Zahl vorhanden sind, sterben sie ab, wenn das Milieu für ihre Vermehrung nicht geeignet ist, oder es ist ihnen ganz einfach unmöglich, bei mangelnder Absorption oder Elimination zu bestehen;
wenn die Zahl der nicht modifizierten Bakterien hoch ist, bildet sich in geringer Zahl eine neue Kultur unter Auflösung der wenigen transformierten Elemente; dieser Fall kann einmal auf sechs Fälle auftreten: die Bakterien haben dann möglicherweise genügend Nährreserven, um bei dem erhöhten osmotischen Druck während der Induk- ^⁰ tionszeit überleben zu können.

Die erhaltenen stabilen Varianten sind in bezug auf osmotisehe Erscheinungen sehr empfindlich. Es ist daher notwendig, das zellfreie Milieu für die Erhaltung in osmotischer Hinsicht abzugleichen: Bei Hypotonie quellen die Varianten und platzen, während sie bei Hypertonie schrumpfen.

Für ihre Erhaltung verwendet man ein Pepton und glucosehaltiges und an Nukleinsäure und Adenosindiphosphat angereichertes Milieu, wie es bereits für die der Induktion vorangehende Impfung verwendet wurde. Wegen der neuen Struktur der Varianten ist es jedoch notwendig, das Milieu hinsichtlich des osmotischen Drucks abzugleichen, indem man für einen zusätzlichen Druck von 20 bis 30 Atmosphären bei 22 bis 37° C sorgt.

Es ist diese Druckdifferenz, die die Entfaltung der Varianten in einem der Bakterienkultur angepaßten Nährmilieu ermöglicht. Diese Druckdifferenz wird darch Einführung von zellpermeationsreguHerenden Mitteln in das Nährmilieu erhalten; sie entspricht den partiellen osmotischen Drücken der Gesamtheit der regulierenden Mittel. Von den regulierenden Mitteln sind Saccharose und Mineralsalze gut geeignet. Die mineralischen Mittel regeln in abgeglichenen Mengen-Verhältnissen den pH-Wert und erleichtern den Austausch zwischen den L-Varianten und dem umgebenden Müieu; sie verhindern die Zerstörung der Keime und ermöglichen ihr Überleben.

Spuren von Kalium sind für das Phänomen der Permeabilität im Niveau der Zellmembran unerläßlich; •Magnesium ist für die Synthesen notwendig; Natriumchlorid nimmt Einfluß auf die ZeHpermeabilität und so auf die Austauschvorgänge der Varianten mit dem umgebenden Milieu. Diese Stoffe sind zusammen mit Saccharose gute Stabilisierungsmittel für den osmotischen Druck. Natriumbicarbonat ermöglicht die Auf-™»*ti»rlialtiine eines alkalischen pH-Wertes. Phosphor ist ein wichtiges Element und Phenolrot ein Indikator für die metabolische Aktivität der Keime.

In einem gut abgeglichenen Milieu bleiben die transformierten Elemente über Monate intakt, wobei eine Übertragung alle 4 oder 6 Wochen ausreicht. Stämme von Mutanten konnten durch dieses Verfahren mehr als 3 Jahre am Leben erhalten werden.

Es folgt ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel

Es wurde von einer Enterobakterie, dem Proteus rettgeri, ausgegangen.

Zur Vermeidung von Interpretationsirrtümern wurde ein zellfreies Milieu gewählt (d. h. ein synthetisches Milieu, das weder Serum noch Lysozym noch Antibiotika enthielt). Die Bakterien wurden auf ein Milieu aus 20 g pankreatisches Papton, 2 g Glucose. 0,10 g Nukleinsäureanreicherung und 0,01 g Adenosindiphosphat. 0,01 g Phenolrot als Indikator und Wasser ad 1000 ml geimpft.

Als induzierend wirkendes Mittel wurde in der Phase exponentiellen Wachstums die Plaamolyse angewandt, und zwar zu einem Zeitpunkt, in dem die Bazillen im Begriff der Zellteilung standen, bei dem die Zellwand wegen des Teilungsvorganges sehr geschwächt ist. Unter der Wirkung eines osmotischen Schocks werden die Mikroorganismen, statt eingeschlossen in ihrer festen Hülle zu bleiben, in das Milieu ausgestoßen und besitzen dann als einzigen Schutz die cytoplasmische Membran.

Im Fall des Proteus rettgeri und unter den oben angegebenen Versuchsbedingungen wurde eine Generation alle 15 Minuten beobachtet, wodurch der Zeitpunkt festgelegt ist, zu dem man das Induktionsmittel einwirken lassen muß.

Die Bazillen wurden zum Zeitpunkt der Zellteilung in einer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml hypertonische Salzlösung gebracht, deren pH-Wert zwischen 7,5 und 8,4 und deren osmotischer Druck bei etwa 80 Atmosphären lag. und zwar während einer Dauer von 12 bis 24 Stunden.

Der osmotisehe Druck von etwa 80 Atmosphären wurde durch folgendes Milieu erhalten:

Komponenten	g	102	osmotischer Drucl
		4	der einzelnen
		40	Komponenten (at)
03 M Saccharose	1	7,4
Calciumchlorid	14	3.6
Natriumchlorid	—	36
N atriumbicarbonat	18	1.27
Magnesiumchlorid 6H2O	0,6	153
Magnesiumsulfat 7H2O	0,01
Natriumsulfat	1000	13
Kalziumchlorid	0,4
Phenolrot
bidest. Wasser

2 = 76.97 at

Für die Erhaltung der stabilen L-Varianten c Proteus rettgeri wurde ein bei 37°C gehaltenes Mil folgender Zusammensetzung verwendet:

609 552/

Milieu für die Erhaltung der L3A-Varianten:

Komponenten	g	20,00	π (at)	7.4
Pankreatisches Popton	0,10		—
Nukleinsäuren	0,01		15.7
Adenosindiphosphat	2		2.4
Glucose	102.00		0,1
Saccharose (0,3 M)	—	0,07
Calciumchlorid	18	—
Natriumchlorid	2,00	0,22
Natriumbicarbonat	0,10
Magnesiumchlorid 6H2O	0,40
Magnesiumsulfat 7H2O	—
Natriumsulfat	0,40
Kaliumchlorid	0,01
Phenolrot	1000
bidest. Wasser

Σ = 25,89 at

20

Da die Stämme durch Übertragungen in Abständen von 4 bis 6 Wochen erhalten werden konnten, kann man annehmen, daß die nach dem beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen L-Mulanten überleben und auf Grund dieser Tatsache morphologische und cytologische Untersuchungen vornehmen und ihre Fortpflanzung sowie ihr pathogenes Verhalten studieren.

Im Verlauf von mehrjährigen Untersuchungen wurden zahlreiche Analogien zwischen den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von Bakterien erhaltenen Varianten und den Mycoplasmen beobachtet. In Anbetracht der Morphologie, des Entwicklungszyklus und der pathogenen Wirksamkeit besteht der dringende Verdacht einer Identität zwisehen den erhaltenen L-Varianten und den Mycoplasmen. Wie die Mycoplasmen sind die L-Varianten »ultrafiltrierbar« und befinden sich in der Klassifikationsskala zwischen den Viren und den Bakterien.

Die Tatsache, daß die ihre Zellwand verloren und nur eine zarte cytoplasmische Membran von extremer Plastizität bewahrt haben, bringt sie den Mycoplasmen nahe, den Mitteln subakuter rezidiver latenter Infektionen, die durch fortlaufende Übertragungen isoliert wurden und hinsichtlich ihrer Ätiologie auf irreversiblen definitiven und vererbbaren Mutationen zu beruhen scheinen.

Die erhaltenen Varianten haben mit diesen ihre Größe, ihre Uli-afiltrierbarkcit, ihren Nährbedarf im gellfreten Milieu, ihren Mangel an Resistenz gegenüber physikalischen Einwirkungen, ihre osmotische Anfälligkeit und das Aussehen der Kolonien auf festem Milieu gemeinsam: Eine tief in die Gelose inkrustierte, undurchsichtige zentrale Zone wird von einem oberflächlich transparenten Saum umgeben.

Die mikroskopischen Merkmale der Kulturen sind typisch und stets ähnlich unabhängig von den Ursprungsbakteriei. So unterschiedliche Keime, wie Vibrionen, Proteus und Streptokokken geben L-Orga- »livmen von identischem Aussehen.

Die Ähnlichkeit mit dem Mycoplasmen zeigt sich auch hinsichtlich der morphologischen und cytologischen Aspekte der erhaltenen L-Varianten.

Da die Zellwand für die Gram-Anfärbung verantwortlich ist, ist es nicht weiter verwunderlich, daß die durch Verschwinden ihrer Zellwand modifizierten Bakterien gramncgativ sind. Die erhaltenen L-Varianten werden durch klassische Anfärbcmittel der Cytolo

55

60

65 gie und Histologie angefärbt. Die in dünner Schicht getrockneten, nicht fixierten Präparate werden in 10 Minuten durch ein Bad nach Shorr Trichome Stain (hinterlegte Zusammensetzung von Gurr) angefärbt und mit tert.-Butylalkohol gespült, d. h. einem Lösungsmittel, das den Farbstoff nicht von den Strukturen beseitigt, auf denen er fixiert ist. Die Zellen sind heikel und deformierbar. Ihre Morphologie ist variabel, und man findet kugelige Körper, Ringe, kleine Körnungen, Ovoide, kokkobazilläre Körper mit Schlüssel-, Komma- und Fragezeichenform, feine spiralförmige Bazillen in granulösen Ketten oder Fäden, die auch isoliert, gekrümmt oder gewunden sein können (s. F i g. 2 bis 4).

Die von S ab i η gegebene Definition der Mycoplasmen zeigt analoge morphologische Aspekte. »Die Organismen vom Typ der Pleuropneumonie der Rinder können auf einem Milieu vegetieren, das keine lebenden Zellen enthält, wobei sie Mikrokolonien mit 10 bis 20 μ Durchmesser bilden, mit Extremen von 600 μ. Im Mikroskop beobachtet man Formationen in Ringform, kugelige Körper, Pseudomycelfäden und Elementarkörper.«

Die beobachteten cytologischen Strukturen sind die gleichen für die erhaltenen L-Varianten und die Mycoplasmen: feine Begrenzungsmembran, vakuoläres bzw. vesikuläres Aussehen des Cyptoplasmas, Bildung von Elementarkörpern durch Sprossung, Differenziation von Zonen mit Ribosomen und eines zentralen Retikulums von Kernmaterie.

Die bei der Bakterie im Übermaß vorhandene Cytoplasmamasse ist reduziert und gegen die Innenschicht der Membran zusammengezogen. Der Kern nimmt nahezu das gesamte Volumen ein. Er zeigt sich in Form von zahlreichen Körnchen variabler Größe und Form, die untereinander durch feine Fäden verbunden sind.

Die Körnchen sind ziemlich dicht. Die Kerne erleiden Teilungen und Wiedervereinigungen, ohne daß Teilungen des Cytoplasmas folgen, die bei Reifung die voluminöse Kernmasse der Kugelkörper bilden.

Hinsichtlich des Stoffwechsels scheinen die stabilen Varianten und die Mycoplasmen beide die gleichen Erfordernisse zu haben. Kulturversuche nach üblichem Verfahren bei vollständig ze störter Zellwand bleiben oft negativ und erfordern eine Anreicherung des Milieus. Die Kultur von Mycoplasmen ist selbst schwierig, und die verwendeten Kulturmedien haben empirische Zusammensetzungen. Im zellfreien Milieu sind mehrere Wochen, bisweilen mehrere Monate, erforderlich, bis eine Entwicklung zu sehen ist. Die Kulturen dürfen erst nach einer Aufbewahrungszeit von 40 Tagen unter den günstigen Bedingungen als negativ bezeichnet werden.

Antibiotika, die auf die Bakterienwand einwirken, haben - nicht mehr als die Antibiotika, die überhaupt nicht in die Bakterie eindringen - keinerlei Wirkung auf die erhaltenen L-Varianten oder auf die Mycoplasmen; allein die Antibiotika, die auf die Mechanismen der Übertragung, der Übermittlung der genetischen Information und der Proteinsynthese einwirken, haben eine Wirkung, und sie sind die einzigen, die tatsächlich in das Innere des Cytoplasmas eindringen.

Schließlich pflanzen sich die stabilen L-Varianten wie die Mycoplasmen nicht durch Zellteilung fort.

Nach den Arbeiten von Turner scheinen die Mycoplasmen einen Entwicklungszyklus zu besitzen. Der Entwicklungszyklus von L-Bakterienvarianten konme dagegen bisher nicht bewiesen werden. Bislang

konnte durch keinerlei Versuche gezeigt werden, daß die Zwergformen lebensfähig sein können und daß die Fäden nicht Überreste von zerplatzten Elementen sind.

Durch kreuzweise Übertragung und fortlaufende Anfärbungen von Kulturen erfindungsgemäß erhaltener stabiler Varianten mit Unna-Blau (metachromatische Anfärbung) etwa alle Stunden und dank systematischer Wiederholungen der Beobachtungen unter den gleichen Arbeitsbedingungen konnte der Fortpflanzungszyklus der stabilen Varianten festgestellt werden. So konnten die Eigenschaften ihrer synocytischen Struktur (plasmodialcr und syncytialer Zustand) beobachtet werden und die ganz besondere Bedeutung dieses vollständigen biologischen Zyklus (dilpoide und haploide Phase), obligatorisch die Erscheinung der Chromaiinvermindcrung an dünnen Schichten aufgezeigt werden.

Die sphäroidale Phase geht stets der Mycelphase voran. Ebenso scheint es so, daß während der granulösen Phase freigesetzte Körnchen nicht lebensfähig sind; sie können nicht stärker werden und einen neuen Zyklus rückbilden. Der Ausgangspunkt eines Zyklus ist gegeben durch die letzte Entstehung von Sphäroiden von losgelösten fadenartigen Enden oder verzweigten Armen, die ihr Sphäroid isoliert zurücklassen.

Der Zyklus dauert 6 bis 10 Tage und kann sich während mehrerer Monate im geeigneten Milieu erneuern. Zu Beginn sind die Phasen ziemlich synchronisiert; mit Alterung der Kulturen tritt eine funktionell Ordnungsstörung auf, und die (einzelnen) Phasen finden sich gleichzeitig mit den L3A-Varianten wieder, die eine Vorliebe für Pseudomycelformen zu haben scheinen (Entwicklungspause im latenten Zustand).

Für das Studium der Zyklen oder den Nachweis der pathogenen Fähigkeit der Varianten müssen die Übertragungen während der sphäroidalen Phase im nahezu reinen Zustand derselben vorgenommen werden. Auf Grund dieser Beobachtung kann die von den verschiedenen Autoren erzeugte Verwirrung verstanden werden, die die L-Formen untersucht und die Verarmung der Kulturen der Varianten im Verlauf von Übertragungen festgestellt haben.

Es wurde festgestellt, daß die erhaltenen Varianten einen Entwicklungszyklus mit mehreren Phasen besitzen und einen Organisationstyp, der nicht mehr derjenige der Bakterie ist, von der sie sich ableiten.

Während eines Zyklus durchlaufen sie vier gut individualisierte Perioden, die man jedoch nicht als die einzig möglichen dieses komplexen Prozesses betrachten kann; diese Perioden folgen aufeinander gemäß einer gut bestimmten Ordnung:

Sphäroidale Phase (Fig.4 bis 7): Die Elemente sind isoliert, von schleimigem Aussehen und ganz allgemein in Anhäufungen mit anderen verbunden; zunächst nimmt das Volumen der Sphäroide (0,5 bis 2 μ) zu, dann bilden sie cytoplasmische Auswüchse, die Chromatinkorpuskeln einschließen, welche J, 2 oder mehrere kurze und dünne Fäden aussenden, deren Enden frei oder nach einer Art Sprossung Träger von neuen kugeligen oder ovalen Teilchen sind; die Fäden bleiben am zentralen Sphäroid haften oder lösen sich davon.

Mycelphase (F i g. 8 bis 10): Von regulären Sphäroidaggregaten gehen Fäden aus, die sich zu Ketten von mehreren 10 μ Länge verlängern und sich unter Bildung eines wirklichen Mycels verflechten oder verzweigen.

Granulöse Phase (Fig. 11. 11 bis. 12. 12 bis): Die und nrimitiven sphäroiden Formen verwischen sich, während sich die Einschlüsse aufteilen, aber durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret miteinander verbunden bleiben, was der Kultur das Aussehen von Kokkenketten oder irregulären Gruppen von diversen Mikrokokken gibt.

Desintegrationsphase (Fig. 13): Die Elemente degenerieren, die Granulationsketten brechen auf, die Partikeln verstreuen sich in das cxtrazelluläre Milieu; unter den realisierten Versuchsbedingungen sind diese

ίο Teilchen nicht lebensfähig.

Zwischen der dritten und der vierten Phase werden die primitiven Bakterien auf ihre einfachste Ausdrucksform reduziert: Ein Chromatinteilchen, umgeben von einer sehr verformbaren fluiden Substanz.

Man kann daraus schließen, daß die erhaltenen L-Varianten nicht nur überleben, sondern sich mit einer ihnen eigenen Fortpflanzungsweisc fortpflanzen, und zwar analog zu derjenigen, die bei Mycoplasmcn beobachtet wird. Man findet hier die gleiche Möglichkeit zur Bildung von Fäden während der Mycelphase wieder und die gleiche Tendenz zum parasitären Leben während der sphäroidalen Phase; die Sphäroide sind die »Ruhe«-Formen (mykrocytische Keime), die in der Lage sind, über sehr lange Zeiten in Ruhe zu bleiben, zu überleben und unter schlechten Bedingungen zu überdauern.

Ein Zyklus dauert etwa 10 Tage; er umfaßt im zellfreien Milieu zwei Phasen des Gedeihens, eine Phase der Dekadenz und eine Degenerationsphase, wobei die während der granulösen Phase freigesetzten sphäroiden Elemente einen identischen Zyklus reproduzieren.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen L-Varianten sind lebensfähig, können sich in einem gut definierten Entwicklungszyklus fortpflanzen, und es ergibt sich das Problem ihres Überlebens im Organismus und ihre pathogene Rolle:

Die erhaltenen L-Varianten rufen bei der Zelle einen cytopathogenen und cytotoxischen Effekt hervor.
Zur Stützung dieser Annahme wurden die gemäß der Erfindung erhaltenen Varianten von Proteus rettgeri entnommen und auf Vaginalzellen geimpft, die mit einem Ayre-Spatel durch Schaben im Niveau des hinteren Drittels des Scheidengewölbes nach Desinfektion gesammelt wurden. Die in Hanks-Flüssigkeit in Suspension gebrachten Zellen wurden geimpft mit einer reinen Kultur von L-Varianten, die nach oben beschriebenen Verfahren erhalten worden waren, und zwar während der Sphäroidal-Phase (ungcstielte Sphäroide) und in einer Menge von etwa 0.1 ml pro 1 bis 2 ml

so Suspension.

Die Verwendung einer direkten Entnahme wurde bevorzugt, da man mögliche Interpretationsirrtümer bei Verwendung von Präparaten des Pasteur-Instituts vermeiden wollte, denen 100 Einheiten Penicillin pro ml und 125 mg Thalliumacetat pro 1 1 Milieu beigegeben sind.

Bei den Zellen wurde nach einer Zta von 2 bis 6 Tagen eine cytotoxische Wirkung beobachtet. Die gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten sind im Cytoplasmabereich der Zelle lokalisiert, und zwar nahe dem Kern und in ovoiden Granulationen, ring- oder kreuzförmigen Körpern oder sphäroiden Elementen, die Arten von Einschlüssen bilden; sie werden umgeben von einer feinen Haut, welche sie deutlich zum

6s Cytoplasma (der befallenen Zelle) abgrenzt; die Kerne werden in dieser Zeuspanne wenig berührt (s. F i g. 4).

Eine Vergleichsentnahme, die nicht mit stabilen L-Varianten geimpft worden war. zeigte keine Degene-

rationserscheinungen und keine toxischen Wirkungen. Die durchgeführte Untersuchung wäre nicht verläßlich, wenn diese Vergleichszellen in der gleichen Zeit ebenfalls anomale Degenerationen zeigen würden.

Andere Versuche wurden unter Verwendung von NiereriepjthelzeUen vom Affen durchgeführt Die erfindungsgemäß erhaltenen L-Varianten wurden wie im vorangehenden Fall direkt in das Milieu eingeimpft in einer Menge von 0,1 ml pro 1 ml Suspension, wobei die L-Varianten sich in der sphäroidalen Phase, in aktiver Multiplikationsperiode, befanden.

Bei den Nierenzellen zeigte sich die Infektion ziemlich rasch, im allgemeinen 3 bis 4 Tage nach Impfung. Bei den zum Vergleich beobachteten nicht geimpften Nierenzellen wurde nichts beobachtet; bei den mit stabilen Varianten geimpften Zellen war es dagegen möglich, die verschiedenen Phasen des Entwicklungszyklus: Fäden, Körnchen und Sphäroide (s. F i g. 15 und 16) in den Zellen wiederzufinden.

Bei beiden Zelltypen wurde für die Sichtbarmachung der stabilen Varianten die Anfärbung nach Shorr (hinterlegte Zusammensetzung des Färbemittels nach Gurr) angewandt Bei den Nierenzellen gibt heiße May-Grunwald-Giemsalösung nach Fixierung mit Methylalkohol gute Ergebnisse.

Die Vermehrung der rnycopiasmaähnlichen L-Varianten hängt von der Zelle ab; in der Tat können mehrere Fälle auftreten:

1. Die Zelle ist gegenüber der eingeimpften Variante unempfindlich: Sie verdaut die fremden Proteine, die sie unter Synthese der arteigenen Proteine assimiliert. Die Zelle überlebt und man findet die — in den Stoffwechsel einbezogenen — den Keim aufbauenden Elemente abhängig von ihrer chemischen Natur in den die Zelle aufbauenden Elementen wieder. In diesem Stadium sind die Versuche, die Varianten durch Einimpfen des integrierten Materials in andere Zellen nachzuweisen, negativ: Dieses ist die Grundlage der Immunität.

2. Die Zelle läßt sich nicht einnehmen, aber sie ist unfähig, alle anwesenden Elemente in ihren Stoffwechsel einzubeziehen: Dieses ist der Fall der nicht in Erscheinung tretenden Infektion (Träger von Keimen); diese Infektion zeigt sich nicht in einer Veränderung der Morphologie der Zellkultur, sondern durch eine funktionell metabolische oder biochemische Störung, die mit dem Überleben der Zelle und demjenigen der stabilen Varianten vereinbar ist (s. F i g. 15 und 16).

Diese latente Infektion kann auf die Nachkommenden übertragen werden. Die L-Varianten besitzen ADN und ARN; diese Nukleinsäuren können dem genetischen Potential der Zelle im Verlauf einer Teilung eingebaut werden und integrierender Teil der Chromosomen werden.

Ohne induzierenden Schock pflanzt sich die Zelle normal fort. Findet ein Schock statt, treten die erhaltenen Varianten ohne Vorbereitung oder Inkubation spontan wieder in Erscheinung. Die vom Parasiten befallene Zelle kann erneut eine Resistenz entgegensetzen.

3. Die Zelle zeigt keine Resistenz: Die L-Bakterienvarianten drücken ihren Stempel der Zelle auf, die während ihrer Überlebcnsperiode Nukleoproteide vom Typ der L-Variante produziert. Die Zelle stirbt durch Verschwinden der normalen Strukturen. Es findet eine Zelldegeneration statt (s. F i g. 14).

In dieser Fig. 14 sieht man bei 1 eine Anhäufung von Varianten (Mycelphase) und bei 2 den praktisch des CvtoDlasmas beraubten Kern der Zelle.

Wirtzelle und vergiftende Mikroorganismen sird die eine wie die anderen — ausgestattet mit -;iner genetischen Kontinuität; vom Augenblick an, in dem sich einer von beiden auf Kosten des anderen vernrehrt, 5 oder sobald einer dem anderen ergänzendes Strukturmaterial leiht das für den Aufbau von dessen Nukleoproteidmaterial erforderlich ist, findet der Konflikt Wirtzelle—L-Variante seine Verlängerung in der genetischen Kontinuität desjenigen, der Qberlebt.

Die pathogene Rolle der mycoplasmaähnlichen L-Varianten wurde auch durch den Versuch einer Bestimmung ihres möglichen pathogenen Wirkens studiert

In der Tat konnte die Rolle bei isolierten Keimen, eines menschlichen Organismus beider Genese einer Läsion bestätigt werden, indem ihre biologischen Merkmale mit den klinischen Gegebenheiten und den Umständen der Isolierung konfrontiert wurden:

Es ist die Isolierung eines Mycoplasmas in mehreren Entnahmen beim gleichen Kranken bei pathologischen Produkten gleichen Ursprungs, es ist vor allem die Anwesenneit dieser Mycoplasmen in den Exairesestükken, wodurch die pathogene Eigenschaft von Mycoplasmen erkannt werden konnte.

Man befindet sich nun in Gegenwart von virulenten Formen, die »atypische« Krankheiten hervorrufen. wobei der Keim nicht mehr die normale Morphologie der Bakterie hat und schwierig nachzuweisen ist; andererseits widersteht dieser Keim den üblichen therapeutischen Mitteln, insbesondere gewissen amibiotischen Mitteln, deren Rolle es ist, auf die Bakterienwand hemmend zu wirken, ohne die Lebensfähigkeit des Keims zu verhindern.

Die Mycoplasmen werden nicht mehr als eirfaches Saprophyten betrachtet sondern als pathogene Agentien, deren in der Humanpathologie beobachtete klinische Manifestationen zusammengefaßt werden können unter der allgemeinen Bezeichnung »Myeoplas-

mosen«.

Außer diesen morphologischen und cytologischen Eigenschaften haben Kulturmerkmale, das Aussehen der Kulturen und das Studium der Empfindlichkeit gegenüber antibiotischen Mitteln sowie die Fortschritte hinsichtlich der serologischen Identifizierungsmethoden es ermöglicht die antigene Struktur einer gewissen Anzahl von isolierten Mycoplasmenstämmen von Entnahmen humanen Ursprungs, wie Bronchialaspiration, Pleuralflüssigkeit Ganglionen, Serosites, Exairese-

so stücke und Mark zu erkennen.

Das Phänomen der Neutralisation von Antigener bildet da es sowohl bei Mycoplasmen als auch bei der gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten auftritt einen Annäherungspunkt In identischer Weise kanr jede Gattung von Varianten serologisch durch eit »Mosaik« von Antigenen definiert werden.

Agglutinationstests und Komplementfixierung bewei sen, daß in diesem Bereich keine vollständige Identitä zwischen den erhaltenen stabilen L-Varianten und dei

(So Bakterien, von denen sie sich ableiten, besteht.

Es ist klar, daß die durch das Verfahren erhaltene L-Varianten nicht das der Zellwand der Bakterie eigen antigene Rüstzeug haben können, insbesondere nicr das Flagetlatenantigen H. Dagegen kann man ii

G.s Mosaik der Antigene der mycoplasmaähnüchen L-V; rianten die Antigene des Zellkörpcrs, der Membran un der Protoplasmabestandteile der Ursprungsbakterie wiederfinden.

Es ist so, daß parallel serologische Untersuchungen durch Inhibition des Wachstums und Komplementfixieruitgsiests durchgeführt werden können, und zwar durch Untersuchung der Antikörper in dünner Schicht nach der Methode von Ouchterlony und fluoreszierenden Antikörpern, um die A Wesenheit der gleichen serologischen Gruppen in den Mycoplasmen und den erhaltenen L-Varianten festzustellen, die sich von Bakterien ableiten, von denen sie nach den durch das klinische Bild gegebenen Informationen Mtiian.ien sein könnten.

Das oben angegebene, für einen bestimmten Bacihus spezifische Beispiel wurde für weitere Bakterien reproduziert, und man konnte so, ausgehend von diversen Bakterien, zu den mycoplasmaähnlichen stabilen Varianten in genügend großer Menge gelangen; diesen Bakterienvarianten kommt eine bedeutende Rolle bei Infektionen, und zwar sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin zu.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ausgehend von Bakterien sehr unterschiedlichen Typs, konnte man zu mycoplasmaähnlichen L-Varianten gelangen, die mit diversen Mycoplasmen vergleichbar sind, deren infektiöse Rolle man von atypischen Krankheiten und der Antigenspezifität her kennt.

jeder Stamm bildet eine diskrete serologische Gruppe, die durch ein Mosaik von spezifischen Antigenen gebildet wird. Es ist dadurch möglich, die serologischen Relationen zwischen den L3A-Bakterien-Varianten und den isolierten Mycoplasmen festzulegen.

So gelangt man, wenn man das Verfahren auf Mikrokokken anwendet, zu denen die Streptokokken A und D sowie die Staphylokokken gehören und auf Enterobakterien (Klebsieila, Proteus, Salmonella, Shigella) zu L-Bakterienvarianten, analog den bereits bekannten Mycoplasmen: Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma T.

Insbesondere erhält man, ausgehend von einem hämolytischen Streptokokkus, eine stabile L-Variante, die vollständig dem Negroni-Agens gleicht, das aus leukämischem Mark isoliert wurde und das man dem Mycoplasma hominis Typ 2 zugeordnet hat

Es folgen als Beispiele einige Fälle der Anwendung von erfindungsgemäß erhaltenen mycoplasmaähnlichen L-Varianten.

Es wurden reine Stämme von Bakterienvarianten erhalten, die pathogene Eigenschaften haben und Antigenextrakte frei von Zellen.

Die antigene Realität der nach dem Fabrikationsverfahren erhaitenen Varianten wurde mit Hilfe eines Serums aufgezeigt, das durch Injektion dieser Varianten beim Kaninchen erhalten wurde. Zu diesem Zweck wurde, ausgehend von stabilen L-Varianten des Proteus, ein zellfreier Antigenextrakt hergestellt
. Die Extraktion der antigenen Prinzipien erfolgte durch Einwirkenlassen einer wäßrigen Lösung von 1/2-normaler Trichloressigsäure auf eine Suspension von vorangehend gewaschenen Keimen bei einem pH-Wert von 1 bis 2 und einer Temperatur von 0⁰C. Der Antigenextrakt liegt vor in Form einer keinesfalls dialysierbaren opaleszierenden Lösung. Getrocknet ist er thermostabil, in wäßrigem Milieu dagegen thermolabil.

Injiziert beim Tier führt er zum Auftreten von spezifischen Antikörpern; so werden seine starken Verdünnungen durch ein entsprechendes antigenes Antiserum spezifisch gefällt Schließlich verhält er sich wie ein aktives Endotoxm; injiziert beim Tier löst der das Auftreten von Antitoxin aus.

Diese isolierte säurelösliche antigene Komponente L3A erscheint stark polydispers in wäßriger Lösung.

Sehr löslich in Wasser spaltet sie sich unter der Wirkung von Wärme oder einer Diastase; die Polysaccharidfraktion löst sich vom Rest des antigenen Komplexes i'.nd sprengt so eine Bindung, die weniger stark ist als diejenige, welche die Antigene des Bakterienkörpers gefangenhält

Man kann so die Bestandteile des Antigenexfraktes der L-Varianten des Proteus isolieren: ein spezifisches Polysaccharid der erhaltenen L-Varianten, das für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich ist Dieses freigesetzte Polysaccharid kann durch Zugabe mehrerer Volumen Alkohol oder Aceton gefällt werden.

Das Polysaccharid gibt dem proteischen antigenen Element seine Spezifität und ist für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen stabilen L-Varianten wurden für die Herstellung von Reagenzien für die Serodiagnostik und die Identifizierung von infektiösen Agentien von atypischen Krankheiten verwendet Diese serologischen Reagenzien ermöglichen die Untersuchung einer spezifischen Behandlung (Empfindlichkeit gegen Antibiotika oder andere therapeutische Mittel).

Sie haben auch ein gewisses Interesse für die Untersuchung der Ätiologie der isolierten Mycoplasmen in der infektiösen Pathologie.

Es ist klar, daß das Antigenmosaik, so wie es in der Zelle der intakten stabilen L-Varianten existiert andere Substanzen enthält als die Phospholipoid-, Polysaccharid- und Proteinbestandteile, aber man kann annehmen, daß allein die Polysaccharid- und proteischen Bestandteile für die Antigenmanifestation wesentlich sind.

Ein anderes Beispiel für die Anwendung besteht in der Präparation von Impfstoffen mit Hilfe von Kulturen der mycoplasmaähnlichen L-Varianten (vernünftig abgeschwächte Kulturen).

Man erhält Keime der L-Varianten, die keine Virulenz besitzen, aber eine Immunisierungswirkung, und zwar durch: Zentrifugieren der Kultur, Suspendieren des Bodensatzes vom Zentrifugieren, Waschen mit wäßriger physiologischer Lösung und Aufheizen über 30 Minuten auf 40 bis 50° C Die aseptisch gemachte Suspension der L3A-Varianten wird auf eine bestimmte Konzentration verdünnt. Man verwendet Dosen von 0,1 ml der auf Konzentrationen von 10~⁵ bis 10~⁶ verdünnten infektiösen Suspension. Man filtriert mit Hilfe von Membranen mit einem Porendurchmesser zwischen 100 und 150 πιμ.

Man kann auch inaktivierte Keime verwenden, indem man den Stamm mit Äther oder Chloroform schwächt oder durch Formaldehydbehandlung und Aufheizen auf 56° C über eine halbe Stunde.

Wegen der Anwendung eines künstlichen Kulturmilieus sind das Verfahren und die Möglichkeit der Gewinnung von mycoplasmaähnlichen Formen, ausge-

hend von Bakterien, für verschiedene Anwendungen von reeller Bedeutung.

Die Figuren sind Reproduktionen von Fotografien, deren Vergrößerung nachfolgend angegeben wird:

609 552/403

figur

Vergrößerung

1	2 500
2	2 500
3	2500
4	3 375
5	3 375
6	3 375
7	3 375
18	3 375
9	3 375
IO	3 375
Il	= 8000
Il bis	= 8000
12	= 8000
12 bis	» 8000
13	3 375
14	3 375
15	= 12000
16	« 8 000

F i g. 1 zeigt keiner Plasmolyse unterworfene Zellen von Proteus rettgeri.

F i g. 2 zeigt das pleomorphe Aussehen von Varianten des Proteus rettgeri bei gleicher Vergrößerung wie in Fig. 1.

Die Fig.3 bis 13 wurden vom Entwicklungszyklus aufgenommen. In der Phase des sphäroidalen Stadiums A vereinigen sich die Varianten zu Anhäufungen in den ersten 12 bis 72 Stunden, die der Impfung gemäß den Bedingungen der Plasmolyse folgen; die Fig.4 zeigt

vergrößert isolierte Elemente der in Fig.3 gezeigten

^A"n der /hase des sphäroidalen Stadiums B (F i g. 5 bis 7) beobachtet man die Bildung von cytoplasmischen

Auswüchsen, welche die Chromatinkorpuskeln umgeben, die Fäden aussenden, welche frei sind oder Träger neuer sphäroidalerTeilchen.

Die Mycelphase wird vom 3. bis 6. auf die Impfung folgenden Tag beobachtet F i g. 8 zeigt Mycelelemente

,o in Anhäufung; Fig.9 zeigt ein isoliertes Element, Fig. 10 den Übergang der Mycelphase in die granulöse

Die Fig 11 und 12 zeigen Fäden zu Beginn der granulösen Phase (6. oder 7. Tag nach Impfung). Die

Fäden sowie auch die primitiven sphäroiden Formen verwischen sich, die Einschlüsse zerteilen sich, bleiben aber verbunden durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret (s. Fig. 11 bis und 12 bis). Fig. 13 zeigt den Beginn der ZerfaHsphase. ,.*,·♦ _A

Fig 14 bis 16 zeigen Fälle von durch Varianten des Proteus rettgeri infizierten Zellen (F ig. 14 bis 16)

Die F i g 14 zeigt eine Nierenepithelzelle vom Affen: Bei 1 beobachtet man eine Anhäufung von sphäroiden Formen der Varianten, bei 2 stellt man fest, daß der

Kern der Zelle von einem Teil des Cytoplasmas befreu

^1StF i g la zeigt zwei epitheliale Zellen mit Kernen 3 und 6; man unterscheidet das sphäroide Element der Variante 4 und den Faden 5.

In Fig 16 erkennt man die sphäroidalen Formen 7 und 7' die durch einen Faden 9 verbunden sind; in der Zelle des Kerns 8 zeigt die Form 7 zwei weitere Fäden 10 und 11.

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten, ausgehend von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterien aus der Gruppe der Enterobakterien, Pseudomonaden und Aktinomyceen, wobei man zur Entfernung der Bakterienwand auf diese Bakterien in einem zellfreien Milieu ein chemisches oder biochemisches induzierendes Mittel einwirken läßt oder eine Plasmolyse durch osmotischen Schock im zellfreien Milieu unter einem osmotischen Druck größer oder gleich t>0 Atmosphären ausübt, dadurch gekennzeichnet, daß man das die Entfernung der Bakterienwand induzierende Mittel bzw. den osmotischen Schock im Zeitpunkt der Zellteilung einwirken läßt und daß man die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 37° C auf einem durch zellpermeationsregulierende Mittel, enthaltend Saccharose, Spuren von Kalium, Magnesium, Natri- umchlorid, Natriumbikarbonat und Phosphor, osmotisch abgeglichenen zellfreien Nährmilieu kultiviert und überträgt, wobei der osmotische Druck der Gesamtheit dieser regulierend wirkenden Mittel zwischen 20 und 30 Atmosphären liegt

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen Bakterienvarianten zur Herstellung von Impfstoffen und Reagenzien für Serodiagnostik und Identifizierung infektiöser Agenzien atypischer Krankheiten.

30