DE2014200A1 - Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von stabilen Bakterienvarianten - Google Patents

Description

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β München _a2l._3toi,Jo*»rtli_96-15g515p .. 34.3.1970

ALBERT ROLLAND S.A., Paris (Prankreich)

Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von stabilen Bakterienvarianten

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten, ausgehend von pathogenen oder nicht pathogenen Bakterien, Die Bakterienvarianten zeigen eine gegenüber den Bakterien, aus denen sie entstanden sind, vollständig unterschiedliche Morpho- * logio,

Die Vorstellung von Bakterien, die bei einer von den bekannten Bakterien vollständig unterschiedlichen Morphologie der Fortpflanzung fähig sind, geht zurück auf die ersten Untersuchungen der L-Fonnen durch KLieneheiger, Diene spontan aufgetre teneiv Formen wurden (nach dem L L.-lter Institut) LI«Formen genannt ο * Sie mirtlen von Dienes als wirkliche Bjkierienvarianten und nicht Symbio.nben identi-

7591-caa. :)5)-Nö-r ('/)

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fizlert. Klieneberger-Nobel und Tulaene Schlüssen sich dieser Meinung an.

Die L-Formen wurden lange Zeit als das Ergebnis von Laboratoriumsmanipulationen betrachtet und im erweiterten Sinne als künstlich» Kreationen, indessen konnte die Existenz von spontan in L-Form überlebenden normalen Bakterien für Keime beobachtet werden, denen eine extreme Polymorphie zukommt, und zwar bei Haverhlllia moniliformis und Spherophorus fundul if ormis (para influenza) , den Agentieii der post-anginösen Sepsis beim Menschen.

Pierce, Dienes, Klienebetger und Tulasne ist es gelungen, im Laboratorium eine L-Transfοrination bei zahlreichen Bakterien herbeizuführen, und zwar sowohl bei Bazillen als auch bei Kokken, wie Salmonellen, Shiga-Kruse-Bacillus, Typhusbazillen, Clostridia, Gonokckken, Streptokokken sowie Para-influenza, und zwar durch Einwirkung von Penicillin.

fOa ijibt zahlreiche andere Mittel, die in der Lage sind, eine L-Transformation hervorzurufen, wie Antibiotika, die auf diö Bakterienwände tsinwirken (Bacitracin, Cycloserin), chemische Mittel (Glysin in erhöhter Konzentration), Lyso-Enzyme (Lysozym, Lysostaphin), physikalische Mittel (ultraviolette Strahlungen) oder biologische Mittel (Phagen, komplementäre Antikörper).

Um nimm besonderen Typ von L-Formen zu bezeichnen, .surde di:x¹ Begriff der Protoplasten und Sphär oplasten eingeführt. Aid Protoplasten, ein Ausdruck botanischen Ursprungs, dei' von Wüibuli und McGuiIlen eingeführt wurde, man infultfe der Einwirkung von Penicillin oder

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Lysozytn aus Bakterien entstandene globulöse bzw. kugelige Organismen. Als Sphäroplasten werden L-Formen mit charakteristischer globulöser Morphologie bezeichnet, die ihren Ursprung von Bakterien nehmen, die sie reproduzieren können, wenn das für die Transformation bestimmende induzierende Mittel eliminiert wird (Behandlung mit Benzylpenicillin, anderen Penicillinen, Cycloserin, Lysozym bei jr 8,8, Lyeozym in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure und "Tris"-Puffer).

Die L-Formen der Bakterien werden in allgemeiner Weise " definiert als von Bakterien ausgehende globultiee Elemente, deren Wand durch diverse Faktoren modifiziert oder vollständig beseitigt worden ist. Sie sind geeignet, Ausgangspunkt für Kolonien von zwei.unterschiedlichen Typen, nach Dienes den L3B- und L3A-Typen, zu werden. Bezüglich der Morphologie- begegnet man einer Polyraorphie, deren Beschreibung Jo nach Autor und den Modalitäten des Herstellungsverfahrens schwankt; man kenntt

- .übergro'Üe kugelige Körper nach Weibulis Gewisse Bestandteile der Wand sind verschwunden, da die Bakterie ihre

Form verloren hat; A

- Fäden, die nach Klieneberger-Nobel künstliche Strukturen sein sollen, die sich durch die große Plastizität der L-Formen erklären sollen, welche sich in der Nährlösung deformieren;

- Elerneutarkorpuskeln nach Klieneberger oder Zwergformen nach Tulasne, die filtrierbare und lebensfähige inframikroskopische Elemente sind.

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Ein Entwicklungszyklus der Bakterienrarianten wurde jedoch bisher nicht nachgewiesen.

In cytologlsoher Hinsicht besteht bei den L-Formen eine Veränderung oder ein Verschwinden der Zellwand, die durch mehrere aufeinanderfolgende Schichten gebildet wird, die im wesentlichen zwei Bestandteile enthalten! N-Acetylmuraminsäure (acide ·«· muramique) und N-Acetyl-glucosaaiin· Die Wand scheint sich nicht in das osmotlsche Gleichgewicht des bakteriellen Cytoplasmas einzuschalten. Die Permeabilität der Bakterienzellen geht zurück auf die Cytoplasraaraenbran, die durch Lipoide und Proteine, enzymatische Systeme, spezifische Permeasen gebildet wird. Im Gegensatz zur Bakterie ist das Cytoplasma relativ abgesondert bzw. diskret gegenüber der Nasse der Keimbläschen.

Vas die Eigenarten der Kulturen betrifft, so haben einige der zitierten Autoren in der Absicht, die L-Formen zu erhalten, protein- und lipoidreiche Milieus verwendet* Durch Anreicherung τοπ gebräuchlichem Kulturmilieu mit ei-ηβι Rinderherzextrakt, durch Zusatz von Pepton, Pferdeoder RinderseruB in erhöhter Menge (10 - 20 fd des Milieugewichts) oder von Bierhefe.

Andere haben ein· Abhängigkeit der L-Form von Sterolen (sterols) und gewissen Lipolden ins Auge gefaßt.

Hinsichtlich der Antigenetruktur wurden als Techniken diejenigen verwendet, die für Bakterien in Gebrauch sind) sie haben jedoch nicht χα positiven Ergebnissen geführt, wobei der Fehler darin bestand, ständig das gesamte Mosaik der für die Bakterie kennzeichnenden Antigene in den Mikroorganismen wiederfinden zu wollen, die eine echte genetische

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Mutation durchgemacht hatten.

Schließlich kamen die Autoren, die das pathogene Verhalten der in vitro erhaltenen pathogenen Varianten untersucht haben, meist zu dem Schluß, daß eine Virulenz, "verbunden mit dem Unvermögen dieser Varianten, im Organismus zu überleben", nicht besteht. Xn vivo wurde die Existenz der L-Formen bei der Ratte und bei der Maus nach Injektion von Streptokokken und Behandlung mit Penicillin (Überleben von 25 Tagen im Bauchfell der Maus) festgestellte jf

Andere vom Staphylokokkus, Proteus, und vom Bacillus pyocyaneus stammende L-Formen wurden im Blut von an chronischen Infektionen Leidenden (Harnleiden) beobachtet· Ihre Diagnose konnte erst durch Rückkehr zu den Ursprungsbakterien sichergestellt werden, da die L-Varianten instabil waren.

Die Inhibition oder Auflösung der Zellwand kann partiell oder vollständig sein; man hat in dieser Hinsicht bereits den L3B-Typus beobachtet, der von einer Transformation im Phänotypus herrührt mit Möglichkeit der Rückkehr zur Ursprungsbakterie und den L3A-Typus, der als Resultat fj einer genetischen Transformation anzusehen ist, wobei die Biosynthese der steifen Bakterienwand dann definitiv gehemmt ist.

Diese stabile Form der L3A-Form könnte als vollständige L-Transformation anzusehen sein, während das L3B-Stadiuüi so nur öine Zwischenform darstellt.

In Anbetracht der widersprüchlichen Angaben Über Kulturen, Morphologie, Cytologie, Abwesenheit eines pathogenen

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Verhaltene der Kulturen in vitro und Existenz eine» solchen bei isolierten Varianten in vivo (instabile Varianten, die zum Ursprungsbakterlura zurückkehren), wurden die Untersuchungen nioht fortgesetzt, und zwar auch wegen der Unmöglichkeit, die L-Varianten Überleben zu lassen und zu konservieren. Da Mittel zur Erhaltung der L-Varianten nicht bekannt waren, konnten serologische Untersuchungen und eine Prüfung ihrer spezifischen pathogenen Wirkung im Vergleich zu den Ursprungsbakterien nicht unternommen werden«

Die Anmelderin hat beobachtet, daß sich Mutationen fortpflanzen können und daß die Lebensfähigkeit der Keime nicht an die Anwesenheit der Zellwand gebunden ist ι Eine zarte semipermeable Membran haftet am Cytoplasma und spielt eine beachtliche Rolle bei den Erscheinungen der osmotischen Nahrungsaufnahme und der Ausbildung neuer Zellwände bei den Tochterzellen, wenn sioh die Mutante zum Ursprungsbakterium zurückentwickelt.

Diese nicht mit einer steifen Wand (cell wali) versehenen Tind nur durch eine zarte Cytoplasmamembran begrenzten Mutanten unterscheiden sich deutlich von den Ursprungsbakterien, gleichgültig, ob diese pathogen sind oder nicht. Wegen ihrer sehr geringen Größe bzw. extremen Plastizität, wodurch sie leicht verformbar sind, können sie durch Ultrafilter hindurchgehen. Ihr morphologischer Aufbau und ihre Art der Fortpflanzung sind den herkömmlichen bakteriologischen Untersuchungsniethoden unzugänglich geblieben. Auf festem Milieu sind ihre Kolonien sehr klein (1O bis 6OO ,u) und entgehen daher oft dem unbewaffneten Auge»

im Lichtmikroskop (13OO- bis üOOOfache Vergrößerung)

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beobachtet man die Ausbildung von Ringen, Pseudomycelfäden und übergroßen kugeligen Körpern· Da jedoch zwei Punkte, deren Abstand geringer als 200 m/u ist, nicht mehr als solch« aufgelöst werden, können Einzelorganismen, deren Größe unterhalb dieser Grenze liegt, nicht mehr wahrgenommen werden. Oa diese Mutanten waiter keine Zellwand besitzen, sind die klassischen Anfttrbemethoden der Bakteriologie nicht sehr geeignet, die nur die Zellwand anfärben (insbesondere Grae-Anfärbung). ,

Mit dem Elektronenmikroskop (20 OOOfache Vergrößerung) · erkennt man Formen von Elementarkorpuskeln, deren Größe von 125 bis 150 «yu schwankt. Es konnte jedoch nicht festgestellt werden, ob diese isolierten Körper nicht nur einfach eine Phase eines FortpflanzungeZyklus wären·

Die herkömmlichen bakteriologischen Nährböden bzw· -lösungen erlauben weder die Verfolgung noch die Erhaltung von stabilen Varianten, die in Anbetracht ihrer Empfindlichkeit in bezug auf den osmotischen Druck in hypotonischem Milieu platzen. .

Die Besonderheit der Erfindung liegt wesentlich in der | Auffindung der Modalltüten, die einerseits die Gewinnung von stabilen L-Varianten ausgehend von KuItürstammen ermöglichen und andererseits ihre Konservierung bzw· Erhal- " tung. Dadurch wird die Festlegung eines Verfahrene möglich, das industriell durchgeführt werden kann und zu Bakterienvarianten führt, die morphologisch den Mycoplaemen ähnlich sind. Ihr Fortpflanzungszyklus ist vollständig definiert, ihre cytotoxische Wirkung in Vitro wurde aufgezeigt und ihre Ähnlichkeit zu den Stämmen des isolierten Mycoplasmas von "atypischen" Krankheiten herausgestellte

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Das erfindungsgemSfBe Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung bzw. Konservierung von Bakterienvarianten aus gehend von pathogenen oder nicht pathogenen Bakterien ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß aan auf pathogene oder nicht pathogen* Bakterien in einem zellfreien Milieu im Augenblick, in dem die Bakterie dabei iet, «ich su teilen, ein induzierendes Mittel einwirken läßt, das die Bakterienw; id in definitiver Weise beseitigt, und daß man die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 37 ⁰C nuf einem zellfreien Milieu kultiviert, das ir osmotischer Hineicht- durch zellpermeationsregulierende Mittel abgeglichen ist, wobei der auf die Gesamtheit dieser Mittel zurUeJ« zuführende partielle osmotlsche Druck zwischen Γ Ο und 30 Atmosphären liegt.

For di e Gewinnung und Erhaltung der Bakterienvarianten wurde aus zvci uründen ein zellfreies (acellulaire) Milieu gewählt! erstens, weil solche, nicht an Zellmaterial gebmiüere fnltu·> η industriell rentabler sind als sogenannte ze J .lhalti *;<·> Kulturen, und zweitenc, weil jeder Interpretations j rrtTTm vermieden werden sollte. Die Anmelderin hr-t i ttzbtr ■ nert vtpen des zweiten Grundes für ihre Untersuc ?πγτ tvnilieti'-the Milieus ausgewählt» die weder Seru», noch I.yso/vf , «och Antibiotika enthalten.

Dei ':k S-fi.'T'deu ^r ? t<» J aKterienstaBim wurdp in Pepton und Glucose e> ¹ ■ «Hcndef _; mit Nukl «insfiuren vtid Adenosindiphoepbat er»^« reicherte f ¥est»; eingeimpft und einer die Zellwand aus«« hf 1 t-tnden Induktion ausgesetzt·

Unter fi«- nduzierend wirkenden Faktoren sind Antibiotika zu neriini, die etif die Zellwand wirken, we sich dr,e Substrat ^Ί' ι S ji«h t., das sie inaktivieren oder Antibio-

I 0 9 £ I ': ' 1 ; B U

tika, die nicht in den Bakterienkörper eindringen sowie zellwandlösende Enzyme, ionische oder nicht ionische Detergentien, welche die Wand auflösen, physikalische Mittel, wie Strahlungen oder Plasmolyse, welche die Wand ablösen. Zur Erzielung einer genetischen Mutation und mithin einer stabilen Variante ist es jedoch unerläßlich, daß die Einwirkung des induzierenden Mittels zum Zeitpunkt der Zellteilung erfolgt, den man aus der Wachstumskurve der Bakterien und über die Bestimmung ihrer expo-, nentiellen Entwicklungsphase ermitteln kann·

Die optimale Bedingung, unter die Bakterie auf die Wirkung des induzierenden Mittels anspricht, ist der Moment der Zellteilung, der in der Tat ainer für Fehler im genetischen Code günstigen Periode entspricht.

Durch Beobachtungen dieser Teilung im Lichtmikroskop wurde festgestellt, daß die Teilung der Kernpartikeln um vieles derjenigen des Cytoplasmas vorangeht. Es war daher unerläßlich, den Rhythmus und die Regel dieser Erecheinung mit Sicherheit mathematisch zu erfassen; da festgestellt wurde, daß die Geschwindigkeit des Wachstums proportional zur Dichte (Konzentration) der lebenden Substanz und das Wachsturnsverhältnis unter den experimentellen Bedingungen konstant ist, wurde die Exponentialfunktion nach Malthus verwendet, um die Zahl der Generationen pro Stunde und darüber den Zeitpunkt der Zellteilung zu ermitteln·

Wenn man die Zeit längs der Abszisse aufträgt und längs der Ordinate die Logarithmen der nephelometrisch bestimmten Kulturdichten, so liefert die Phase exponentieilen Wachstums eine Gerade,

/ 123-3

Während der exponentiellen Phaa· ist daa Wachstums verhältnia umgekehrt proportional der Generationszeit, und aan leitet daraus die Zahl der Minuten ab, die zwischen zwei Teilungen verstreichen.

Über die Zahl der Teilungen pro Zeiteinheit erhält man«

,u * ^{g X}2 - ^Lo« ^X1

»/ t

(t₂ - t,) Lot; 2

wobei /U das Wachsturnsverhältnis, X₁ die Kulturdichte zur Zeit t₁ und X₂ die Dichte zur Zeit t₂ ist.

Die Generationszeit ist danns t (g) =

/^U

Ansammlungsstäniffle (souches de collection) und insbesondere der Proteus Rettgeri zeigen etwa alle halbe Stunde eine Doppelteilung; bei Aktivierung des Stoffwechsels können vier Teilungen pro Stunde erhalten werden, und der phy- _ Biologische Zustand nähert sich demjenigen der pathogenen ™ Bakterien. Während aufeinanderfolgender Übertragungen zielen die Doppelteilungen auf eine größere Anzahl von Bakterien ab, ohne daß die Zeit, die zwei Generationen trennt, verändert witr'e. -

Man erhält die größte Zahl von Bakterien durch Teilung, wenn man 3 bis h aufeinanderfolgende Übertragungen während der günstigen Teilung vornimmt und bei Kenntnis der Zelltellungszeit, die neuen Kulturen bei 10 °C 5 Minuten vor der Doppe L teilung synchronisiert; man vermeidet so, (tail die bakterien, diö in der Entwicklung "voraus" sind, sici.

D098&1/ 1Γ ' fl

bereite teilen. Die relative Absenkung der Temperatur hemmt die Zellteilungsaktivität, nicht jedoch den -Stoffwechsel, der Keime; allein die für das Wachstum optimale Temperatur von 37 °C begünstigt die Teilungen»

Die Zunahme des Wachstums wird gemessen, ihr folgt eine Periode der La tense, «.fahrend der die Bakterien ihre Proteide und Lipoide synthetisieren und nach Abiauf der Generationszeit nimmt die Zelldichte erneut zu.

Auf diese Weise teilen sich nahezu all« Mikroorganie- " men zum gleichen Zeitpunkt{ um jedoch einer Überalterung der Kultur vorzubeugen, ist es zweckmäßig, da» induzi·* rend wirkende Mittel schon bei den ersten Zellteilungen einwirken zu lassen.

Die so behandelten Stämme befinden sich unter optimalen Bedingungen für die Einwirkung desinduzierenden Kittels· Sie sind im sogenannten Zustand "der Kompetenz¹*!* JSlne !*- Mutation in diesem Stadium wurde bisher nicht

Unter den im Zeitpunkt der Zellteilung der Bafctefie verwendeten induzierend wirkenden Faktoren wurde von desr Anmelderin bevorzugt die Plasmolyse; (Induktion durch gsibotischen Schick) herangezogen*

Wenn man Bazillen mit feiner Wandstruktur einem hypertonischen Milieu aussetzt, se ?ird dadurch ein Aufbreeiuen der Trennwände zwischen den ZeliöSi hervorgerufen, das durch Anfärben mit einer verdünnten Lösung von Kristallviolett und Beizen mit Tannin sichtbar gemacht werden lcastft» Si« ihrer Schutehülle beraubten Bazillen werden zu baren Korpuskeln._t die bei ras eher "liösung¹¹ iai

bakteriologischen Milieu quellen und platzen, wenn der osmotische Druck dea flüssigen Milieus nicht auf sie abge-' stellt ist.

Ea ist einaa der wesentlichen Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrana, daß im Stadium der Zellteilung, d. h. in dem Augenbliok, in dem die Zellwand wegen dieses TeI-lwagsvorganges sehr geschwächt ist, ein osmotischer Druck Ton Eumindeat 60 Atmosphären angewandt wird, um die steife fe Vand der Bakterien platzen zu lassen.

Die im ^MKompetenz^M-Zustand befindlichen Bakterienstamme werden in ainer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml ainer hypertonischen Salzlösung eingeimpft, deren osmotisoher Druck auf etwa 80 Atmosphären eingestellt 1st, und zwar während einer Zeitdauer von 12 bis 2k Stunden. Der erhöhte osmotische Druok wird durch Elektrolyte, wie Mineralsalze und 0,3 M Saccharose erhalten, die gute Stabiliaatoren für den oemotischen Druck sind.

Die Plasmolyse erfolgt unter einer Stickstoff- oder 00.-Atmosphäre bei anaeroben Bakterien und in herkömmlicher Veiae bei aeroben Bakterien« Sa wurden lebende Keime in Aerobiose durch Absenken dea rH unter 20 durch Beigabe eines Stickstoff- und Kohlendiaxydgasmllieus erhalten.

Die Anmelderin hat entdeckt, daß die Bakterien, die für die Induktion durch oemotischen Schock günstig sind, durch diejenigen gebildet werden, die kein· die Zellwand einschließende Kapsel (nicht gekapselte Bakterien) und auch keine starke Zellwand haben und deren CytoplasmaflUseigkeit nicht in Form eines Gels vorliegt. Die diesen Bedingungen entsprechenden Keime gehören zu den Enterxjbak-

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teriaceen, Mikrokokkaceen, Pseudomonadaceen, Parvobakteriaceen, Actlnomyceen und Vlbrlonaceen.

Bel dem Verfahren unter Einwirkung auf die in Zellteilung begriffenen Bakterien und unter den beschriebenen Modalitäten wurden bei ein und demselben Stamm Bakterien beobachtet, bei denen der erhöhte osmotische Druok keine Wirkung zeigte; global erlitten 70 $ ,der Bazillen eine definitive Mutation, während die übrigen Bazillen intakt blieben. Bei dem soeben beschriebenen Verfahren wurden % niemals Bakterien beobachtet, deren Wand partiell verändert worden wäre (reversible Mutation).

Die Abtrennung der erhaltenen stabilen Varianten erfolgt durch Filtration (die Varianten sind "ultraf11trierbar") und Übertragung:

- Wenn die nicht modifizierten Bakterien im KuIturniilieu in geringer Zahl vorhanden sind, sterben sie ab, wenn das Milieu für ihre Vermehrung nicht geeignet ist oder es ist ihnen ganz einfach unmöglich, bei mangelnder Absorption oder Elimination zu bestehen} .

- wenn die Zahl der nicht modifizierten Bakterien hoch ist, bildet sich in geringer Zeit eine neue Kultur unter Auflösung der wenigen transformierten Elemente! dieser Fall kann einmal auf sechs Fälle auftreten; die Bakterien haben dann möglicherweise genügend Nährreserven, um bei dem erhöhten osmotischen Druck.während der Induktionszeit überleben zu können.

Die erhaltenen stabilen Varianten sind in bezug- auf osmotische Erscheinungen sehr empfindlich. Es ist daher '

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- Mt -

notwendig, das zellfreie Milieu fUr die Erhaltung in osnotischer Hinsicht abzugleichen« Bei Hypotonie quellen die Varianten und platzen, während sie bei Hypertonie schrumpfen.

FUr ihre Erhaltung verwendet man ein Pepton und g}uoosehaltiges und an Nukleinsäure und Adenosindiphosphat angereichertes Milieu, wie es bereits für die der Induktion vorangehende Impfung verwendet wurde. Wegen der neuen ™ Struktur der Varianten ist es jedoch notwendig, das Milieu

hinsichtlich des osmotisohen Druckes abzugleichen, indem man für einen zusatzlichen Druck von 20 bis 30 Atmosphären bei 22 bis 37 ⁰C sorgt.

Ee ist diese Druckdifferenz, die die Entfaltung der Varianten in einem der Bakterienkultur angepaßten Nährmilieu ermöglicht. Diese Druckdifferenz wird durch Einführung von zellpermeationsregulierenden Mitteln in das Nährmilieu erhalten) sie entspricht den partiellen osmotLsehen Drücken der Gesamtheit der regulierenden Mittel. Von den regulierenden Mitteln sind Saccharose und Mineralfe salze gut geeignet. Die mineralischen Mittel regeln in abgeglichenen Mengenverhältnissen den p„-¥ert und erleichtern den Austaueoh zwischen den L-Varianten und dem umgebenden Milieuι sie verhindern die Zerstörung der Keime und ermöglichen ihr Überleben.

Spuren von Kalium sind für das Phänomen der Permeabilität im Niveau der Zellmembran unerläßlich; Magnesium ist für die Synthesen notwendig; Natriumchlorid nimmt Einfluß auf die Zellpormeabilität und so auf die Austauschvorgänge der Varianten mit dem umgebenden Milieu. Diese Stoffe sind zusammen mit Saccharose gute Stabilisierungsmittel für den

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osmotlschen Druck· Natriuosbicarbonat ermöglicht die Auf- .* ■ rechterhaltung eine· alkalischen p^-Vertee, Phosphor ist ein wichtiges Element und Phenolrot ein Indikator für die metabolisch· Aktivität dar Keine.

In einem gut abgeglichenen Milieu bleiben die transformierten Element· Über Monate intakt, wobei eine Übertragung alle k oder 6 Wochen ausreicht. Stämme von Mutanten konnten durch dieses Verfahren mehr als 3 Jahre am Leben erhalten werden. (I

Es folgt ein nicht einschränkend·· Beispiel für die Durchführung de· «rfindungsgemäBan Verfahren»· ·

Beispiel

Es wurde von einer Entarobakterie, dem Protaue Hettgeri, auegegangen.

Zur Vermeidung von Interpretationsirrtümern wurde ein zollfreies Milieu gewählt (d. h. ein synthetisch·· Milieu, das weder Serum nooh Lyaozym noch Antibiotika enthielt)· |j

Die Bakterien wurden auf ein Milieu aus 20 g o/oo pankreätische· Pepton, 2 g o/oo Glucose, 0,10 g o/oo Nukleinslureanreicherung und 0,01 o/oo Adenoeindiphosphat, 0,01 o/öo Phenolrot als Indikator und Yasaer für 1000 ml geimpft.

Als induzierend wirkendes Mittel wurde in der Phase ·

exponentlellen Wachstums die Plasmolyse angewandt, und zwar zu einem Zeitpunkt, in dem die Basillen im Begriff der Zellteilung standen, bei dem die Zellwand wegen des Teilungsvorgangeβ sehr geschwächt ist. Unter der Wirkung eines

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oemotischen Schocks werden die Mikroorganismen, statt eingeschlossen in ihrer festen Hülle zu bleiben, in das Milieu ausgestoßen und besitzen dann als einzigen Schutz die cytoplasm! sehe Membran.

Im Fall des Proteus Rettgeri und unter den oben angegebenen Versucbsbedingungen wurde eine Generation alle 15 Minuten beobachtet, wodurch der Zeitpunkt festgelegt ist, zu dem man das Induktionsmittel einwirken lassen muß.

Die Bazillen wurden ?um Zodtpunkt der Zellteilung in einer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml hypertonische Salzlösung gebracht, deren p„-Wert zwischen 7t5 und 8,k und deren osnotischer Druck bt-i etwa 80 Atmosphären lag, und zwar wHhrend einer Dauer von 12 bis 2k Stunden.

Der osmotische Druck von etwa 80 Atmosphären wurde durch folgendes Milieu erhalten:

Komponenten

g o/oo osmotischer Druck der

einzelnen Komponenten (at)

0,3 M Saccharose
Calciumchlorid
Natriumchlorid
Natriumbic arbonat
Magnesiumchlorid 6
Magnesiumsul fat 7

Natrj nmsulfat

Kaliumchlorid

Phenr]rot

bidest. Wasser q.s.p.

h₂6

102

If l<0

1 1/4

18 0,6 0,01 t 000

7,* 3,6

36
1,27

115,3

13

0,k

= 76,97 at

TUr die Erhellung de stabilen

arianten des

mrdr --¹J ^% b?J J

C gene=! ten ns Milieu folgender Zu-

_BAD

Milieu für die	Erhaltung	der L3A-Varianten
Komponenten	g o/oo	T(·*)
pankreatisches Pepton	20,00
Nukl e insäuren	0,10
Adenosindiphosphat	0,01
Glucose	2
Saccharose (θ,3 M)	102,00	7Λ
Calciumchlorid	-	-
Natriumchlorid	18	15,7
Natriumbicarbonat	2,00	2,4
Magnesiumchlorid 6 H-O	ο,ϊο	0,1
Magnesiumsulfat 7 H„O .	ö, ^o	0,07
Natriumsulfat	- · ■ ■' -" "
Kaliumchlorid	0,^0	0,22
Phenolrot	0,01
bidest. Wasser q.s.p.	1000
		X = 25,89 afc

Da die Stämme durch Übertragungen in Abständen von k

bis 6 Wochen erhalten werden konnten, kann man annehmen, ™

daß die nach dem beschriebenen Verfahren gemäß der, Erfindung erhaltenen L-Mutantan überleben und aufgrund dieser Tatsache morphologische und cytologische Untersuchungen vornehmen und ihre Fortpflanzung sowie ihr pathogenes Verhalten studieren.

Im Verlauf von mehrjährigen Untersuchungen hat tue Anmelderin zahlreiche Analogien /tischen den nach dem erfindungsgemäOen Verfahren ausgehend /on Bakterien erhaltenun Varianten und den Myoopiasmen b^obachtut„ In Anbetracht der

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Morphologie, d·· Entwicklungszyklus und der pathogenen Virksamkeit besteht der dringende Verdacht einer Identität zwischen den erhaltenen L-Varianten und den Mycoplas-■en. Vie die Mycoplasmen sind die L-Varlanten "ultraflltrierbar" und befinden sich in der Klassifikationsskale awiaohen den Viren und den Bakterien·

Die Tatsache, daß die ihre * Zellwand verloren und nur eine zarte cytoplasmlsohe Membran Ton extremer Plastizität bewahrt haben, bringt sie den Mycoplasmen nahe, den Mitteln subakuter rezidiver latenter Infektionen, die durch fortlaufende Übertragungen isoliert wurden und hinsichtlioh ihrer Ätiologie auf irreversiblen definitiven und vererbbaren Mutationen zu beruhen scheinen.

Die erhaltenen Varianten haben ait diesen ihre Größe, ihre Ultrafiltrierbarkeit, ihren Nährbedarf im zellfreien Milieu, ihren Mangel an Resistenz gegenüber physikalischen Einwirkungen, ihre osmotische Anfälligkeit und das Aussehen der Kolonien auf festem Milieu gemeinsam! Eine tief in die Gelose inkrustierte, undurchsichtige zentrale Zone wird von einem oberflächlich transparenten Saum umgeben·

Die mikroskopischen Merkmale der Kulturen sind typisch und s-tets ähnlich unabhängig -von den Ureprungsbakterien. So unterschiedlich j Keime, wie Vibrionen, Proteus und Streptokokken geben L-Organismen von identischem Aussehen.

Die Ähnlichkeit mit den Mvcoplaamen zeigt sich auch hinsichtlich der morphologischen und cytologischen Aspekte der erhaLtenen L-Varianten*

Da die Ze L L wand ftir die Gram-Anf ärbung verantwortlich

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ist, ist es nicht weiter verwunderlich, daß die durch Verschwinden ihrer Zellwand modifizierten Bakterien Gram-ne-Ratiν sind« Die erhaltenen L-Varianten werden durch klassische AnfMrbemittel der Cytologie und Histologie angefärbt. Die in dünner Schicht getrockneten, nicht fixierten Präparate werden in 10 Miauten durch ein Bad nach Shorr Trichoae Stein (hinterlegte Zusammensetzung von Gurr) angefärbt und mit tert.-Butylalkohol gespült, d. to., einem Lösungsmittel, das den Farbstoff nicht von den Strukturen beseitigt, auf denen er fixiert ist. Die Zellen sind heikel und deformier- ■ bar. Ihre Morphologie ist variabel und man findet: kugelige Körper, Ringe, kleine Körnungen, Ovoide, kokkobasilläre Kiirper mit Schlüssel-, Komma- und Frageseichenfora, feine spiralförmige Bazillen in granulösen Ketten oder Fäden, die auch isoliert, gekrümmt oder gewunden sein können (s. Fig. 2 bis 1».)

Die von Sabin gegebene Definition der Mycoplasmen zeigt analoge morphologische Aspekte. "Die Organismen Tom Typ der Pleuropneumonie der Rinder (bovides) können auf einem Milieu vegetieren, das keine lebenden Zellen enthält, wobei sie Mikrokolonien mit 10 bis 20 /u Durchmesser bilden, mit Extremen von 600 #u» Im Mikroskop beobach- ™ tet man Formationen in Ringform, kugelige Körper, Pseudomyeelfäden u'nd Elementarkörper. *

Die beobachteten cytoiputschen Strukturen sind die gleichen für die erhaltenen L-»1Tarlanten und die MycopLasmenι feine Begrenzungsmembran, vakuoläres bzw* Tesikulares Aussehen des Cytoplasmas, Bildung von Eleaientarkörpern durch Sprossung, Differenziation von Zonen mit Ribοsomen und eines zentralen Retikulums von Kernaaterie.

b:^ der Bakterie im Übermaß vorhandene

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masse ist reduziert und gegen die Innenachicht der Membran zusammengezogen. Der Kern nimmt nahezu das gesamte Volumen ein. Er zeigt sich in Form von zahlreichen Körnchen variabler Größe und Form, die untereinander durch feine Fäden verbunden sind.

Die Körnchen sind ziemlich dicht. Die Kerne erleiden Teilungen und Wiedervereinigungen, ohne daß Teilungen des Cytoplasmas folgen, die bei Reifung die voluminöse Kernmaeee der Kugelkörper bilden.

Hinsichtlich des Stoffwechsel« scheinen die stabilen Varianten und die Mycoplasmen beide die gleichen Erfordernisse zu haben. Kulturversuche nach Üblichem Verfahren bei vollständig zerstörter Zellwand bleiben oft negativ und erfordern eine Anreicherung des Milieus. Die Kultur von Mycoplasmen ist selbst schwierig und die verwendeten Kulturmedien haben empirische Zusammensetzungen· Im zellfdreien Milieu sind mehrere Wochen, bisweilen mehrere Monate, erforderlich, bis eine Entwicklung zu sehen ist. Die Kulturen dürfen erst nach einer Aufbewahrungszeit von Uo Tagen unter den günstigen Bedingungen als negativ bezeichnet werden.

Antibiotika, die auf die Bakterienwand einwirken, haben - nicht mehr als die Antibiotika, die überhaupt nicht in die Bakterie eindringen - keinerlei Wirkung auf die erhaltenen L-Varianten oder auf die Mycoplasmen; allein die Antibiotika, die auf die Mechanismen der übertragung, der Übermittlung der genetischen Information und der Proteinsymthese einwirken, haben eine Wirkung, und sie elnd die einsmgen, die tatsächlich in das Innere des Cyteplaseas eindringen.

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Schließlich pflanzen sich die stabilen L-Varianten wie die Mycoplasmen nicht durch Zellteilung fort·

Nach den Arbeiten von Turner scheinen die Mycoplasmen einen Entwicklungezyklus zu besitzen· der Entwicklung·zyklus von L-Bakterienvarianten konnte dagegen bisher nicht bewiesen werden. Bislang konnte durch keinerlei Versuche gezeigt werden, daß die Zwergformen lebensfähig sein können und daß die Fäden nicht Überreste von zerplatzten Elementen sind.

Durch kreuzweise Übertragung und fortlaufende Anfärbungen von Kulturen stabiler Varianten gemäß der Erfindung mit Unna-Blau (metachromatische Anfärbung) etwa alle Stunden und dank systematischer Wiederholungen der Beobachtungen unter den gleichen Arbeitsbedingungen konnte der Fortpflanzungszyklus der stabilen Varianten festgestellt werden. So konnten die Eigenschaften ihrer synocytischen Struktur (plasmodialer und syncytialer Zustand) beobachtet werden und die ganz besondere Bedeutung dieses vollständigen biologischen Zyklus (diploide und haploide Phase), obligatorisch die Erscheinung der Chromatinverminderung an dünneu Schichten aufgezeigt werden.

Die sphäroidale Phase geht stets der Mycelphase voran· Ebenso scheint es so, daß während der granulösen Phase freigesetzte Körnchen nicht lebensfähig sind; sie können nicht stärker werden und einen neuen Zyklus rückbilden· Der Ausgangspunkt eines Zyklus ist gegeben durch die letzte Entstehung von Sphäroiden von losgelösten fadenartigen Enden oder verzweigten Armen, die ihr Sphäroid Isoliert zurücklassen.

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Der Zyklus dauert 6 bis 10 Tag· und kann sich wlhrend ■•hrerer Monate in geeigneten Milieu erneuern* Zu Beginn sind die Phasen siemlioh synchronisiert} ait Alterung der Kulturen tritt eine funktioneile Ordnung·störung auf, und die (einzelnen) Phasen finden sich gleichseitig nit den L3.A-Variant en wieder, die eine Vorliebe für Pseudonycelfornen zu haben scheinen (Entwicklung·pause in latenten Zustand).

Für das Studiu« der Zyklen oder den Nachweis der pathogenen Fähigkeit der Varianten nüssen die Übertragungen während der sphXroidalen Phase im nahezu reinen Zustand derselben vorgenomnen werden. Aufgrund dieser Beobachtung kann die von den verschiedenen Autoren erzeugte Verwirrung verstanden werden, die die L-Foraen untersucht und die Verararang der Kulturen der Varianten in Verlauf von Übertragungen festgestellt haben.

Es wurde festgestellt, daß die erhaltenen Varianten einen Entwicklungezyklus nit mehreren Phasen besitzen und einen Organisationstyp, der nicht mehr derjenige der Bakterie ist, von der sie sich ableiten.

Während eines Zyklus durchlaufen sie vier gut individualisierte Perioden, die «an jedoch nioht als die einzig nfglichen dieses konplexen Prozesses betrachten kann; diese Perioden folgen aufeinander, gemäß einer gut bestimmten Ordnung!

- »Phäroidale Phase (Fig. k bis 7)t Die Elenente sind isoliert, von schleimigen Aussehen und ganz allgemein in Anhäufungen mit anderen verbunden; zunächst nimmt das Volumen der Sphäroide (0,5 bis 2 /u) zu, dann bilden sie

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cytoplaamische Auswuchs·, die Chromatinkorpuekeln einechlleßen, welche 1, 2 oder Mehrere kurze und dünne Fäden aussenden, deren Enden frei oder nach einer Art Spvossung Träger von neuen kugeligen oder ovalen Teilchen sind} die Fäden bleiben an zentralen Sphäroid haften oder lösen sich davon.

- Mvcelphaae (Fir. 8 bis 10)ι Ton regulären Sphäroidaggregaten gehen Fäden aus, dl· aich au Ketten von mehreren 10 yu Länge verlängern und sich unter Bildung eineβ wirkliohen Mycela verflechten oder verzweigen.

- Granulös« Phase (Fig. 11, Iibia, 12, 12bis)ι Die Fäden und primitiven aphäroiden Foraien verwiachen sich, während sich die Einschlüsse aufteilen aber durch eine dünne Schicht von viskosen Sekret aii te inander verbunden bleiben, was der Kultur das Aussehen von Kokkenketten oder irregulären Gruppen von diversen Mlkrokokken gibt.

- Desintegrationsphase (Fig. 13)ι Die Elemente degenerieren, die Granulationeketten brechen auf, die Partikel verstreuen sich in das extraselluläre Milieu; unter den realisierten Versuchsbedingungen sind diese Teilchen nicht lebensfähig.

Zwischen der dritten und der vierten Phase werden die primitiven Bakterien auf ihre einfachete Ausdrucksform reduziert t ein Chromatinteilchex»_¥ umgeben von einer sehr verformbaren fluiden Substanz·

Man kann daraus schließen, daß die erhaltenen L-Varianten nicht nur überleben, aondern aich. «it einer Ihnen eigenen Fortpflanzungeweise fortpflanzen, und «war analog zu

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- 2k -

derjenigen, die bei Mycoplasmen beobachtet wird (Fig, 17 und 18). Man findet hier die gleiche Möglichkeit zur Bildung von Fäden während der Mycelphase wieder und die gleiche Temdenss zum parasitären Leben während der sphäroidalen Phase; dje Sphäroide sind die "Ruhe*-Formen (mykrocytische Keime), die in der Lage sind, über sehr lange Zeiten in Ruhe zu bleiben, zu überleben und unter schlechten Bedingungen zu tiberdauern„

Ein Zyklus dauert etwa 10 Tagej er umfaßt im zellfreien Milieu xwei Phasen des Gedeihens, eine Phase der
Dekadenz und eine Degenerationsphase, wobei die während
der granulösen Phase freigesetzten ephäroiden Elemente einen identischen Zyklus reproduzieren»

l)ic nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen L-Var J an ten sind 1 obensf Hhip,, können eich in einem gut de finierteil Entwicklung szryklus fortpflanzen, und es ergibt sich das Problem ihrtis Überlebens im Or gani emus und ihre path.-f:enc Rollet

Die erhaltenen L-Varianten rufen bei der Zelle einen cytop ithügeneii und cytotoxischen Effekt hervor»

7ur Stützung diesel Annahme wurden die gemäß der Erfindung erhaltenen Varianten Von Proteue Rettgeri entnommen und auf Vaginalzellen geimpft, die mit einem Ayre-Spatel durch Schaben la Niveau des hinteren Drittels des
Schfidengewftlbes nach Desinfektion gesammelt wurden. Die in Hanks-F.l'" sipkeit in Suspension gebrachten Zellen wurden freinpf-. r»it einer reinen Kultui von L-Varianten, die np'-v den oben he β ehr !ebenen Verfahren erhalten worden waren, ' nd zwnx während der Spheroidal-Phaee (ungestielte

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Sphäroide) und in einer Menge von etwa 0,1 ml pro 1 bis

2 ml Suspension. _, ,

Die Verwendung einer direkten Entnahme wurde bevorzugt, da man mögliche Interpretationeirrtümer bei Verwendung von Präparaten des Pasteur-Institutes vermeiden wollte, denen 100 Einheiten Penicillin pro ml und 125 ng Thalliumacetat pro 1 1 Milieu beigegeben sind.

Bei den Zellen wurde nach einer Zeit von 2 bis 6 Tagen eine cytotoxische Wirkung beobachtet. Die gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varlanten sind im Cytoplasmabereich der Zelle lokalisiert, und zwar nahe dem Kern und in ovoi— den Granulationen, ring- oder kreuzförmigen Körpern oder sphärolden Elementen, die Arten von Einschlüssen bilden) sie werden umgeben von einer feinen Haut, welche sie deutlich vom Cytoplasma (der befallenen Zelle) abgrenzt j die Kerne werden in dieser Zeitspanne wenig berührt ('s· Flg. k).

Eine Vergleichsentnahme, die nicht mit stabilen L-Varianten geimpft worden war, zeigte keine Degenerationserscheinungen und keine toxischen Wirkungen» Die durchgeführte Untersuchung wäre nicht verläßlich, wenn disse Vörgleichsaellen in der gleichen Zeit ebenfalls anomale Degenerationen zeigen würden.

Andere Versuche wurden unter Verwendung von Niereneplthelzellen vom Affen (geliefert vom Paatetir-*Institut) durchgeführt. Die erfindungsgemäß erhaltenen. L~Varianten wurden wie im vorangehonden Fall direkt in das Milieu eingeimpft in einer Menge von 0,1 ml pro 1 ml Suspension, ^obei die L·»Varianten sich in der sphäroidalen Phase, in aktiver MuI fciplikablonsperiode, befanden»

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Bei den Nierenzellen zeigte sich die Infektion ziemlich rasch, im allgemeinen 3 bis k Tage naoh Impfung. Bei den zum Vergleich beobachteben nicht geimpften Nierenzellen wurde nichts beobachtet; bei den mit stabilen Varianten geimpften Zellen war es dagegen möglich, die verschiedenen Phasen des Entwicklungszyklus: Fäden, Körnchen und Sphäroide (s. Fig. )5 und 16) in den Zellen wiederzufinden.

Bei beiden Zelltypen wurde für die Sichtbarmachung der stabilen Varianten die Anfärbung naoh Shorr (hinterlegte Zusammensetzung des Färbemittels naoh Gurr) angewandt. Bei den Nierenzellen gibt heiße May-Grunwald-Giemsalöeung nach Fixierung mit Methylalkohol gute Ergebnisse.

Die Vermehrung der mycoplasmaähnlicheii L-Varianten hängt von der ZeLIe ab; in der Tat können mehrere Fälle auftreten:

1. Die Zelle ist gegenüber der eingeimpften Variante unempfindlich: sie verdaut die fremden Proteine, die sie unter Synthese der arteigenen Proteine assimiliert. Die Zelle überlebt und man findet die - in den Stoffwechsel einbezogenen - den Keim aufbauenden Elemente abhängig von ihrer chemiechen Natur in den die Zelle aufbauenden Elementen wieder. In diesem Stadium sind die Versuche, die Varianten durch Einimpfen des integrierten Materials in andere Zellen nachzuweisen, negativ: Dieses ist die Grundlage der Immunität.

2. Die Zeil·-* Läßt sich nicht einnehmen, aber alt; i>t unfähig, alle anwesenden Elemente in ihren Stoffwechaui elnzulioülühua; üioias ist der Fall der nicht in Erscheinung tretenden Infektion (Träger von Keimen)} diese In-

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fektlon zeigt eich nicht in einer Veränderung der Morplio- · logle der Zellkultur, sondern durch eine.funktionell« metabolische oder biochemische Störung, die mit dem Überleben der Zelle und demjenigen der stabilen Varianten vereinbar ist (s. Fig. 15 und 16).

Diese latente Infektion kann auf die Nachkommenden , übertragen werden. Die L-Varianten besitzen ADN und ARN| diese Nukleinsäuren können dem genetischen Potential der Zelle im Verlauf einer Teilung eingebaut werden und integrierender Teil der Chromosomen werden.

Ohne induzierenden Schock pflanzt sich die Zelle normal fort. Findet ein Schock statt, treten die erhaltenen Varianten ohne Vorbereitung oder Inkubation spontan wieder· in Erscheinung. Die vom Parasiten befallene Zelle kann erneut eine Resistenz entgegensetzen.

3· Die Zelle zeigt keine Resistenz! Die L-Bakterlenvarianten drücken ihren Stempel der Zelle auf, die während ihrer Überlebensperiode Nukleoproteide vom Typ der L-Variante produziert. Die Zelle stirbt durch Verschwinden der normalen Strukturen. Es findet eine Zelldegeneration statt (s. Fig. Ik).

In dieser Fig. Xk sieht man bei 1 eine Anhäufung von Varianten (Mycelphase) und bei 2 den praktisch des Cytoplasmas beraubten Kern der Zelle.

Wirtzelle und vergiftende Mikroorganismen sind - die eine wie die anderen - ausgestattet mit einer genetischen Kontinuität; vom Augenblick an, in dem sich einer von beiden auf Kosten des anderen vex'melirti oder sobald einer dem

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anderen ergänzendes Strukturmaterial leiht, das für den Aufbau von dessen Nukleoproteidraaterial erforderlich ist, findet der Konflikt Wirtzelle - L-Variante seine Verlängerung in der genetischen Kontinuität desjenigen, der überlebt.

Die pathogene Rolle der mycoplasmaähnlichen L-Varianten wurde auch durch den Versuch einer Bestimmung ihres möglichen paihogenen Virkens studiert.

In der Tat konnte die Holle bei isolierten Keimen eines menschlichen Organismus beider Genese einer Läsion bestätigt werden, indem ihre biologischen Merkmale mit den klinischen Gegebenheiten und den Umständen der Isolierung konfrontiert wurdens

Ee isf dio Isolierung eines Mycoplasmas in mehreren Entnahmen beim gleichen KranliPii bei pathologischen Produkten gleichen Ursprungs, es ist vor allem die Anwesenheit diesel· Mycoplasmeii in den Exairesestückon, wodurch die pathogene Eigenschaft von MycopJ asmeri erkannt werden konnte.

Man befindet .«ich nun In Gegenwart von virulenten Formen, die "ii typ! r ehe" Krankheiten hei\'orrufen, wobei der Keim nicht mehr die normale Morphologie der Bakterie hat und schwierig nachzuweisen ist; nndererseits widersteht dieser Keim den üblichen therapeutischen Mitteln, insbesondere gevif-sPTJ 3Hi ibi ott sehen Mitteln, deren Rolle es 1st, auf die T?ak tei i onwand hemmend /u wirken, ohne die Ln-benpfHhigkeit d<« J»ies 7m verhindern,

iJi ρ MycopJ n?men werden nicht mehr als einfaches Saprophyte« bfifniclilci , sondern als j ! π >#ene Agentien, deren

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in der Humanpathologie beobachtete klinische Manifestationen zusammengefaßt werden können unter der allgemeinen Bezeichnung "Mycoplasmoeen".

Außer diesen morphologischen und cytologischen Eigenschaften haben Kulturmerkmale, das Aussehen der Kulturen und das Studium der Empfindlichkeit gegenüber antibiotischen Mitteln sowie die Fortschritte hinsichtlich der serologischen Identifissierungsmethoden es ermöglicht, die antigene Struktur einer gewissen Anzahl von Isolierten Myeoplasmenstämmen von Entnahmen humanen Ursprungs, wie Bronchialaspiration, Pleuralflüssigkeit, Ganglionen, Serosites, Exairesestücke und Mark zu erkennen.

Das Phänomen der Neutralisation von Antigenen bildet, da es sowohl bei Mycoplasmen als auch bei den gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten auftritt, einen Annäherungspunkt, In identischer Weise kann jede Gattung von Varianten serologisch durch ein "Mosaik" von .Antigenen definiert werden.

Agglutinationstests und Komplementfixierung beweisen, daß in diesem Bereich keine volls tändige Identität zwischen den erhaltenen stabilen L-Varianten und den Bakterien, von denen sie sich ableiten, besteht. '

Es ist klar, daß die durch das Verfahren erhaltenen L-Varianten nicht das der ,Zellwand der Bakterie eigene antigene Rüstzeug haben können, insbesondere nicht das Flagellatenantigen H. Dagegen kann man im Mosaik der Antigene der mycoplasinaähnllchen L-Varianten die Antigene des Zellkörpers, der Membran und der Protoplasmaböstandtaile der Ursprungsbakterien wiederfinden»

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Es ist so, daß parallel serologische Untersuchungen durch Inhibition dos Wachstums und Kompleraentfixierungstests durchgeführt werden können, und zwar durch Untersuchung der Antikörper in dünner Schicht nach der Methode von Ouchterlony und fluoreszierenden Antikörpern, um die Anwesenheit der gleichen serologischen Gruppen in den Mycoplasmen und den erhaltenen L-Varianten festzustellen, die sich von Bakterien ableiten·, von denen sie nach den durch das klinische Bild gegebenen Informationen Mutanten φ sein könnten.

Das oben angegebene, für einen bestimmten Bacillus spezifische Beispiel wurde von der Anmelderin für weitere Bakterien reproduziert, und man konnte so ausgehend von diversen Bakterien zu den tnycoplasmaähnlichen stabilen Varianten in genügend großer Menge gelangen; diesen Bakterienvarianten kommt eine bedeutende Rolle bei Xnfektio-ηβφ, und zwar sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin zu.

Bei der Durchführung des Verfahrens ausgehdn von Bak-

_ terien sehr unterschiedlichen Typs konnte man zu myooplas-

^ inaähnlichen L-Varianten gelangen, die mit diversen Mycoplasmen vergleichbar sind, deren infektiöse Rolle man von atypischen Krankheiten und der Aiibigenspezlfitat her kennt.

Jeder Stamm bildet eine diskrete serologische Gruppe, die durch ein Mosaik von spezifischen Antigenen gebildet wird. Es ist dadurch möglich, die serologischen Relationen zwischen den L3A-Bakterienvarianttm und den isolierten Mycoplaumen festzulegen.

So gelangt man, wenn Juan das Verfaiiren auf Mikrokukken anwendet, zu dentm die Streptokokken A and D sowie diu

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Staphylokokken gehören und auf ENTEROBAKTERIEN (Klebaiella. Proteus. Salmonella. Shigella) zu L-^Bakterienvarianten, analog den bereits bekannten Mycoplasment Mycoplasma pneumoniae. Mycoplaama hominle. Mycoplaanm mycoidee, Mycoplasma bovigenltalium. Mycoplaama T.

Insbesondere erhält man ausgehend von einem hämolytischen Streptokokkua eine stabile L-Variante, die vollstän·*- dig dem Negroni-Agens gleicht, das aus leukämischein Mark isoliert wurde und das man dem Mycoplasma hominis Typ 2 . zugeordnet hat*

Auegehend von NEUSSERIACEEN (Neisseria gonorrhoreae) erhält man eine atabile Variante, die dem Mycoplaama hominis sehr ähnlich ist, das als allgemein nicht pathogen bekannt ist und gelegentlich zu einem Bartholin-Abezeß führen kann; diesea Mycoplasma wird als das Agens von gewissen nicht durch Gonokokken hervorgerufenen Urethriten betrachtet (s. Mg. 17 und 18).

Es folgen als nicht einschränkende Beispiele einige Fälle der Anwendung von erfindungsgemäß erhaltenen mycoplasmaähnlichen L-Varianten.

Aufgrund der Leichtigkeit der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden reine Stämme von Bakterienvarianten erhalten, die pathogene Eigenschaften haben Und Antigenextrakte frei von Zellen.*

Die antigene Realität der nach dem Fabrikationsverfahren erhaltenen Varianten wurde mit Hilfe eines Serums aufgezeigt, das durch Injektion dieser Varianten beim Kaninchen erhalten, wurde. Zu diesem Zweck wurde ausgehend

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von stabilen I,—Vari anten des Proteus ein zellfreier Antigenextrakt hergestellt.

Die Extraktion der antigenen Prinzipien erfolgte durch Einwirkenlassen einer wäßrigen Lösung von 1/2 normaler Trichloressigsäure auf eine Suspension von vorangehend gewaschenen Keimen bei einem p„-Wert von 1 bis 2 und einer Temperatur λόιι 0 C. Der Antigenextrakt liegt vor in Form einer keinesfalls dialysierbaren opaleszierenden Lösung. Getroi-.l.iiet ist ei¹ thermostabil, in wäßrigem Milieu dagegen thermolabi1,

Jn ji ziert beim Tier führt er zum Auftreten von «pezifieohp.n Antikörpern : so werden seine starken Verdünnungen durch oiii entsprechendes nntlgenes Antisemit! spezifisch gefällt. SchJ ir fjl ich verhält er eich wie ein aktives Endotoxinj injizicit beim Tier löst der das Auftreten von Antitoxin aus.

LHf'se isiiHorif säure 1ösliehe antigene Komponente L3A erscheint star)! poivdippers in wäßriger Lösung.

Sehr lufl^tl it Vnsser spaltet sie sich unter der Wirkung von VHrmr "·^:> ι einei Diastase; die Polysaccharidfr»l;-t i on T < j·,t eich ν■■·" ■ fpt dpf nn f i (jenen Komplexes und sprengt so eiiif Bindung, · veni ( r stark ist als diejenige, welche d.i f Autiperif · Dakt f ι i enki τ pt re gefangenhält.

Mrn karir f: ti Bestandteile de» AntigenextrakteB der L -Vai ·^Α antfii» d< ft us ifsoliej-en f ein sj>ezii isches PoIysacchu'id ί - .'HJ'tnen Γ-Varianten, das für die charakteri «ti r cheii ■■·.'< >·■.· ; «rhen ReaktiMT« , des Stammes verantwortljch ii?t, 'M,..., frei/ setzt <· Γη] ysaccharid kann durch

'J Π 9 8 DI / 1 2 Π 0 _BAD

Zugabe mehrerer Volumen Alkohol oder Aceton gefällt werden»

Das Polysaccharid gibt dem proteisehen antigenen Eier ment seine Spezifität und ist für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich.

Die nach dem erfindungsgeiaäßen Verfahren erhaltenen stabilen L-Varianten wurden für die Herstellung von Reagenzien für die Serodiagnostik und die Identifizierung von infektiösen Agerttlen von atypischen Krankheiten verwendet. Diese serologischen Reagenzien ermöglichen die Untersuchung einer spezifischen Behandlung (Empfindlichkeit gegen Antibiotika oder andere therapeutische Mittel),

-Sie haben auch ein gewisses Interesse für die Untersuchung der A'tiologie der isolierten Myeoplasmen in der infektiösen Pathologie.

Bs ist klar ι daß das Antigenmosaik, so wie es in der Zelle der intakten stabilen L-Varianten existiert, andere Substanzen enthält als die Phospholipoid-, Polysaccnarid- und Proteinbestandteile, aber man kann annehmen, daß allein die Polysaccharid- und proteisehen Bestandteile für die Antigenmanifestatlon wesentlich sind.

Ein anderes Beispiel für die Anwendung· des Verfahrens zur Gewinnung der stabilen Bakfcerienvät'ianten und Erhaltung derselben besteht in der Präparation von Impfstoffen mit Hil'fe von Kulturen der mycopl asmaähnl ichen L-Varianfcen (vernünftig abgeschwächte Kulturen),-

Man erhält Kalme der L-Varianten nach dem erfindmiga- gem'aßen Verfahren, dia keine Virulenz bed it ζ en aber eine

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- 3k -

Tmmunisierungswirkung, und zwar durch! Zentrifugieren der Kultur, Suspendieren des Bodensatzes vorn Zentrifugieren, Waschen mit wäßriger physiologischer Lösung und Aufheizen über 30. Minuten auf kO bis 50 C. Die aseptisch gemachte Suspension der 1-3A-Varianten wird auf eine bestimmte Konzentration verdünnt. Man verwendet Dosen von 0,1 ml der auf Konzentrationen von 10~^J bis 10~ verdünnten infektiösen Suspension. Man filtriert· mit Hilfe von Membranen mit einem Porendurchmeaser zwischen 100 und 150 ni/U.

Man kann auch inaktivierte Keime verwenden, indem man den Stamm mit Xther oder Chloroform schwächt oder durch Formaldehydbehandlung und Aufheizen auf 56 C über eine haibe S tunde.

Wegen der Anwendung eines künstlichen Kulturmilieus sind das Verfahren und die Möglichkeit der Gewinnung von mycoplasmaälmlichen Formen ausgehend von Bakterien tür verschiedene Anwendungen von reeller Bedeutung.

Die angefügten Figuren sind Reproduktionen von Fotografien, deren Vergrößerung nachfoJg end angegeben wird:

Figur Vergrößerung

1 2.500

2 2.500

3 2.500 h 3.375 5 3.375 (> 3.375 7 3.375 B 3.375

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Figur Vergrößerung

	9	7 -
1	O	18
1	1
1	Ibis
1	2
1	2b is
1	3
1	U
1	5
16
1

3.375

3.375 . *" ■ - 8.000 or 8.000 i? 8.000 =" 8.000 3-375

3.375 J

12.000

~ 8.000 Z 8.000

C 8.000

Fig. 1 zeigt keiner Plasmolyse unterworfene Zellen von Proteus Rettgeri. ■

Fig. 2 zeigt das pleotnorphe Aussehen von Varianten des Proteus Rettgeri bei gleicher Vergrößerung wie in Fig.

Die Fig. 3 bis 13 wurden vom Entwiclclungszyklus aufgenommen. In der Phase des splläroidalen Stadiums A vereinigen sich die Varianten zu Anhäufungen in den ersten bis 72 Stunden, die der Impfung gemäß den Bedingungen der Plasmolyse folgen; die Fig, k zeigt vergrößert isolierte Elemente der in Fig. 3 gezeigten Anhäufung»

In der Phase des ephäroidalen Stadiums B (Fig. 5 bis 7) beobachtet man die Bildung -iron C3rtoplasmischen Aubwüc1i~ sen, welche die Chromatinkorimskein umgeben, die Fädöis aussenden, welche frei sind oder Träger neuer ephäroidaler Teilchen. .

00S851/128Ö BADORiQiNAL

Die Mycelphase wird vom 3. bis 6. auf die Impfung folgenden Tag beobachtet. Fig. 8 zeigt Myc el el einen te in Anhäufung! Fig. 9 zeigt «in isoliertes Element, Fig. 10 den Übergang der Mycelphase in die granulöse Phase.

Die Fig. 11 und 12 zeigen Fäden zu Beginn der granulösen Phase (6* oder 7* Tag nach Impfung). Die Fäden sowie auch die primitiven sphäroiden Formen verwischen sich, die Einschlüsse zerteilen sich, bleiben aber verbunden durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret (s. Fig. 11bis und 12bis). Fig. 13 zeigt den Beginn der Zerfallsphase.

Fig. lh bis 18 zeigen Fftlle von durch Varianten des Proteus Rettgeri infizierten Zellen (Fig. Ik bis 16) und von durch Keime von atypischen Krankheiten infizierten Zellen (Fig. 17 und 18).

Die Fig. 14 zeigt eine Nierenepithelzelle vom Äffent Bei (i) beobachtet man eine Anhäufung von sphäroiden Formen der Varianten, bei (2) stellt man fest, daß der Kern der Zelle von einem Teil des Cytoplasmas befreit ist.

Fig. 15 azeigt zwei epitheliale Zellen mit Kernen (3) und (6)t man unterscheidet das sphäroide Element der Variante (Ό und den Faden (5).

Auf Fig. 16 erkennt man die spliHroidalen Formen (7) und (7')t ^<Iie durch einen Faden (9) verbunden sind; in der Zelle des Kerns (8) zeigt die Form (7) zwei weitere Fäden (1O) und (11).

Fig. 17 bezieht sich auf einen Fall von amikrobieller Uretheritii, Urr Kern (12) wird umgeben von Einschlüssen (13).

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Fig. 18 zeigt eine zweite Beobachtung des gleichen Falles von amikrobieller Uretheritis. Man unterscheidet hier diei

1) Infektionen durch Chlamydozoen ^Gruppe ^der Trachome, Psittacose, Lymphogranuloiaatose ( 17)J » und

2) Infektionen «it Mycoplasraa fspheriode (i4) mit Fäden (15) und (i6)"7.

entsprechenden charakteristischen Einschlüsse·

Ein Vergleich der infizierten Zellen von Fig. 16 und 18 macht die tiefgreifende Analogie zwischen den stabilen Varianten und dem Mycoplasraa deutlich} die Einschlüsse (17) würden nach Ausbrechen der L3A-Form die Einschlüsse (13) ergeben.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   /i« Verfahren asur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten ausgehend von pathogenen oder nicht pathogenen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß am auf dieee Bakterien in eines seilfreien Milieu ie Zeitpunkt der Zellteilung ein chemisches, biochemisches oder physikalische* induzierendes Mittel einwirken list, das in definitiver Weise die Bakterienwand beseitigt, und daß «an die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 37 °C auf eines durch zellpermeatloneregulierende Mittel osmotisch abgeglichenen meilfreien Nahrmilieu kultiviert und übertrifft, wobei der esmotisohe Druck der Gesasitheit dieser regulierend wirkenden MIttel zwischen 20 und 30 Atmosphären liegt.

   2. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das physikalische induzierend wirkende Mittel durch eine Plasmolyse durch osmotisehen Sohock gebildet wird.

   3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daJB die Plasmolyse im zellfreien Milieu unter einem osmotisehen Druck von grBfier oder gleich 60 Atmosphäxen und voraugsweise_t gleich 80 AtnospMUfen durchgeführt wird.

   k» Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß die der Plasmolyse unterworfenen Bakterien keine Kapsel besitzen sowie keine starken Zellwände und keine CytoplasmaflUssigkeit in Form von Gel·

   5· Verfahren nach Anspruch h_t dadurch gekennzeichnet,

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   daß die der Plasmolyse unterworfenen Bakterien auegewählt · werden unter den Enterobakterien, Mikrokokken, Pseudomonaden, Parvobakterien, Aktinomyceen und Vibrionen·

   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Ton den Enterobakterien der Proteus Rettgeri der Plasmolyse unterworfen^wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 3, daduroh gekennzeichnet, daß dasKellfreie Milieu der Plasmolyse Saccharose und Mineralsalze enthält. .

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zellfreie Kultur- und Ubertragungsmilieu Saccharose und Mineralsalze enthält.

   9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 2k Stunden alte Proteus-Rettgeri-Keime, die in eine wäßrige Kultur eingeiapft wurden, die - in g pro 1000 g Kultur gerechnet -2Og pankreatisches Pepton, 0,10 g Nukleinsäuren, 0,01 g Adenosinphosphat und 2 g Glucose enthält, in einer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml einer wäßrigen hypertonischen Lösung mit einem p_H-Ver€ zwischen 7,5 und 8,4 eingebracht werden, die - in g pro 1000 g Lösung ,gerechnet - 102 g Saccharose (0,3 M), k g CaCl₂, UO g NaCl, 1 g NaHCO₃, ii| g MgCIg, 6H₂O, 18 g Na₂SO^ und 0,6 g KCl enthält, um unter einem osmotischen Druck von 80 at während 12 bis 2k Stunden eine Plasmolyse zu erleiden, und daß die erhaltenen alle k bis 6 Wochen übertragenen Varianten bei 37 °C auf einem wäßrigen hypertonischen Nfthrailieu kultiviert werden, das . in § pro 1000 g Milieu gerechnet - 20 g pankreatischee

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   Pepton, 0,10 g Nucleinsäuren« O₄Ol g Adenosindiphosphat, 2 g Clucose, 102 g Saccharose (0,5 M), 18 g NaCl, 2 g NaHCO,, 0,10 g MgCIg, 6H₃O, 0,40 g MgSo^, 7H_g0 und 0,40 g KCl enthält.

   10. Verfahren naoh Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die übertragung der erhaltenen Varianten während der sphärdüalen Phase des Entwicklungszyklus der Varianten erfolgt.

   11. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhaltenen stabilen Bakterienvarianten zur Herstellung von Ιηφfstoffen und Reagenzien für Serodiagnostik und Identifizierung infektiöser Agentien atypischer Krankheiten.

   NöCw (G)/27.7.7O

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