CH645025A5 - Verfahren zur herstellung eines hypotoxinogenen und genetisch bestaendigen abweichenden stammes von vibrio cholerae. - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines hypotoxinogenen und genetisch bestaendigen abweichenden stammes von vibrio cholerae. Download PDF

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vibrio cholerae
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hypotoxinogenic
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hypotoxinogenen und genetisch beständigen abweichenden Stammes von Vibrio cholerae sowie die zusätzliche Mutagenese des erhaltenen abweichenden Stammes. Die so erzeugten Stämme von Vibrio cholerae bilden ein schadhaftes Choleratoxin. Diese Stämme sind geeignet, um eine Lebendvaccine zur oralen Verabreichung herzustellen, die zur Immunisierung gegen Cholera geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung wurde im Zusammenhang mit Arbeiten entwickelt, die im Auftrag des Departementes für Gesundheit, Erziehung und Wohlfahrt durchgeführt wurden.
Es ist allgemein bekannt, dass der reichliche wässrige Durchfall, der bei Cholera auftritt, auf die Wirkung des Choleratoxins auf die Epithelzellenauskleidung des Dünndarmes zurückzuführen ist. Choleratoxin wird von den toxi-nogenen Stämmen der Vibrio cholerae erzeugt. Die toxino-genen Stämme der Vibrio cholerae können entweder der klassische Stamm oder der EI-Tor-Biotyp oder der Ogawa-Serotyp oder der Inaba-Serotyp sein. In allen Fällen jedoch dürfte, soweit dies überprüft wurde, das Toxin, das von allen diesen unterschiedlichen Gruppen gebildet wird, das gleiche sein.
In den letzten Jahrzehnten wurde eine Anzahl an unterschiedlichen Impfstoffen gegen Cholera, nämlich Cholera-vaccine, entwickelt, und sie wurden auch auf ihre Wirksamkeit durch Einsatz dieser Materialien getestet. Im allgemeinen bestanden diese Vaccine entweder aus abgetötete Gesamtzellen enthaltenden Präparaten oder aus Zellwandpräparaten oder in den zuletzt entwickelten Impfstoffen aus einem Toxoid, das durch Inaktivierung des gereinigten Toxins mit Formalin oder Glutaraldehyd erhalten wurde. Die bisher verwendeten Vaccine wurden durch Injektion, also parenteral, verabreicht, und die Ergebnisse, die beim Einsatz derartiger Impfstoffe erzielt wurden, waren dahingehend enttäuschend, dass der Schutz gegen die Krankheit kurzzeitig war, so dass nur ein gewisser Anteil der Bevölkerung immunisiert werden konnte. Es ist jedoch klar, dass Cholerapatienten sehr gut gegen eine erneute Infektion oder einen erneuten Angriff von toxinogener Vibrio cholerae für bis zu einem Jahr geschützt sind.
Die ersten Versuche bezüglich einer Entwicklung einer oral zu verabreichenden Lebendvaccine gegen Cholera, analog der Sabin-polio-Vaccine, mit der gewünschten Eigenschaft von selbstreplizierenden Antigenen, wurden von Mu-kerjee und Mitarbeitern unternommen (Mukerjee, 1963; Sanyal und Mukeq'ee, 1969), und diese Forscher verwendeten nichttoxinogene El-Tor-Vibrios, die aus der Umwelt isoliert wurden. Es zeigte sich, dass diese Stämme wirksam waren, um zirkulierende vibriocidale Antikörper sowie auch allgemeine intestinale Antikörper hervorzurufen. Der Schutz gegen die Krankheit war jedoch schwach, und zwar aufgrund des offensichtlichen Mangels dieser Organismen, in kleinen Höhlungen Kolonien zu bilden. Die Isolierung von genetisch beständigen nichttoxinogenen Mutanten von Vibrio cholerae war das angestrebte Ziel von Finkelstein und Mitarbeitern (s. Finkelstein et al. 1974; Vasil et al., 1974). Mutanten von toxinogener Vibrio cholerae, welche nicht den Beweis erbrachten, dass sie antigenetisch reaktives Toxin bilden, wurden durch immunologische Methoden isoliert. Ein derartiger Mutant wurde in jüngster Zeit an freiwilligen menschlichen Versuchspersonen erprobt. An diese wurden oral 3 bis 4 Dosierungen, und zwar in einer Menge von 1010 Bakterien pro Dosierung, an den nichtvirulenten Organismen verabreicht, und dann erfolgte 6 Wochen nach der Immunisierung eine orale Infektion mit 10® virulenten Cholerabazillen. Die freiwilligen Versuchspersonen, welche eine orale Immunisierung erhalten hatten, zeigten eine 55prozentige Schutzrate im Vergleich zu der Vergleichsgruppe. Von den 66 freiwilligen Versuchspersonen, welche die Vaccine erhalten hatten, zeigten 84% einen Anstieg der Titer an vibrioci-dalem Antikörper im Serum, und völlig unerwarteterweise zeigten 26% einen Anstieg an Antitoxin-Titern im Serum. Man weiss jetzt, dass dieser Mutantenstamm mit der Bezeichnung M-13 geringe Menge an biologisch aktivem Choleratoxin bildet. Ausserdem wurden hochtoxinogene Stämme von Vibrio cholerae aus Stühlen einiger freiwilliger Versuchspersonen isoliert, welche der Immunisierung unterworfen worden waren. Aus diesen Versuchsergebnissen kann man den naheliegenden Schluss ziehen, dass der oben beschriebene Mutantenstamm genetisch unbeständig war.
Viele Mutantenstämme der Vibrio cholerae 569B, welche geringe Mengen an biologisch aktivem Toxin bilden, wurden isoliert, jedoch fast alle Mutanten, die durch einstufige Methoden isoliert worden waren, haben entweder geringe Mengen oder erhöhte Mengen des Holocholeratoxines gebildet, wie dies von Mekalanos et al., 1978, und auch von Holmes, 1978, hervorgehoben wurde. Als Klasse wurden diese Mutantenstämme als Cholera toxregulierende__Mutanten betrachtet und nicht als Mutanten mit einer Änderung in der Genstruktur, weder bezüglich der Unterklasse A noch bezüglich der Unterklasse B des Toxins. Es zeigte sich, dass auch fast alle Mutanten, die beschrieben worden waren, sich mit messbarer Häufigkeit entweder in vitro oder in vivo in Stämmen mit der Toxinogenizität der «wilden Typen» zurückverwandelten.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren zur Herstellung eines hypotoxinogenen und genetisch beständigen abweichenden Stammes von Vibrio cholerae, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Elternstamm von Vibrio cholerae bei erhöhter Temperatur bebrütet und daraus einen abweichenden Stamm auswählt, der den Biotyp und die Antigene des Elternstammes beibehält und eine Toxizität besitzt, die um einen Faktor von mindestens 750 reduziert ist, verglichen mit dem Elternstamm, wobei die Toxizität in S49-Maus-Lymphosarcomzellen bestimmt wurde.
In einer besonderen Ausführungsform wird der erhaltene abweichende Stamm zusätzlich einer Mutagenese unterworfen, und man wählt einen Mutantenstamm aus, der eine Toxizität besitzt, die gegenüber der Toxizität des Elternstammes um einen Faktor von mindestens 7500 vermindert ist.
Es zeigte sich nun, dass genetisch beständige Mutantenstämme von Vibrio cholerae vorzugsweise durch ein zweistufiges Verfahren erhalten werden können, wobei die eine Stufe durch eine Bebrütung eines Stammes bei erhöhter Temperatur hervorgerufen ist, wodurch man eine Variante erhält, die sowohl Hypotoxinogenizität als auch genetische Beständigkeit aufweist, und der zweite zusätzliche Schritt eine Mutagenese und eine Auswahl der Stämme mit verminderter Toxizität darstellt. Die ausgewählten Mutanten sind ausserdem nicht krankheitserregend, also nicht pathogen.
Die durch Wärmeeinwirkung erzeugte Variante wird zuerst gebildet, indem man einen Standardelternstamm der Vibrio cholerae, vorzugsweise den weitverbreiteten Stamm Vibrio cholerae 569B, bebrütet, wobei sich ein Stamm bildet, der Hypotoxinogenizität besitzt, wie dies bei einer Prüfung in Lymphosarcomzellen von S49-Mäusen festgestellt wurde. Die Toxizität wurde um einen Faktor von mehr als 750, vorzugsweise einen Faktor von etwa 1000, verglichen mit dem Elternstamm, vermindert, und die so erhaltenen Mutantenstämme waren genetisch stabil. Die Bebrütungstemperatur liegt insbesondere im Bereich von 40 bis 42 °C, und es zeigte sich, dass bei 43 °C kein Zellenwachstum mehr auftritt. Die Bebrütungszeit ist nicht kritisch, wobei üblicherweise mehrere Stunden benötigt werden, um ein entsprechendes Wachstum zu erzielen, vorzugsweise eine Zeit von 15 bis 20 Stunden. Ein so induzierter hypotoxinogenetischer Stamm wird dann vorzugsweise einer zweiten Mutation durch irgendeine übliche Mutagenese unterworden, und zwar entweder unter Verwendung eines chemischen Mutagens oder durch Bestrahlung, wobei das chemische Mutagen bevorzugt ist. Es zeigte sich, dass die so hergestellten Mutantenstämme den Biotyp und die Antigene sowohl des ursprünglichen Vibrio-cholerae-Stammes, beispielsweise des Stammes 569B, als auch der hitzeinduzierten Variante beibehalten, dass sie sich jedoch von diesen dadurch unterscheiden, dass ihre Toxizität weiter vermindert ist. Diese Mutantenstämme zeigen eine weitere Verminderung in der Toxizität, die um einen Faktor von mindestens 7500, üblicherweise einen Faktor im Bereich von 7500 bis 15 000, im Vergleich zu dem ursprünglichen Stamm oder Elternstamm vermindert ist, und sie zeigen eine genetische Beständigkeit sowohl in vitro als auch in vivo und besitzen ferner die Fähigkeit, im Magen-Darm-System Kolonien zu bilden. Eine weitere Auswahl von nichtpathogenen Mutanten kann getroffen werden entsprechend den Anforderungen von Tiermodellsystemen auf der Basis von Nagetieren und Schweinen, die zur Bestimmung der Cholerageni-zität herangezogen werden. Diese nichtpathogenen Mutanten sind dementsprechend als oral zu verabreichende Le-bendvaccinen zur Immunisierung gegen Cholera nützlich.
Die durch Wärmeeinwirkung variierten Stämme können leicht bezüglich ihrer verminderten Toxizität getestet werden, indem man den gleichen Test mit Lymphosarcomzellen der S49-Maus anwendet, der üblicherweise zur Testung von Mutanten der Vibrio cholerae herangezogen wird. Der übliche Test bezüglich des Durchlässigkeitsfaktors der Haut von Kaninchen und ebenso der Y-l-Nebennierenzellentest (Y-l-Adrenalzellentest) können angewandt werden, um die Toxizität sowohl der Varianten als auch der Mutanten zu prüfen, wobei dadurch weitere Mittel gegeben sind, um diejenigen Variantenkolonien und Mutantenkolonien auszuwählen, welche die erwünschten hypotoxinogenen Eigenschaften besitzen.
Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, welche spezielle Ausführungsarten des erfin-dungsgemässen Verfahrens beschreiben.
Beispiele
Kulturen des weitverbreiteten Vibrio-cholerae-Stammes 569B wurden in Erlenmeyer-Kolben in einem Syncaseme-dium gezüchtet, dabei nahm die Kulturbrühe 10% des Kol-benvolumes ein, und man züchtete bei 30 °C während 18 bis 20 Stunden unter heftigem Belüften. Grosse Volumina, in der Grösse von 5 bis 10 Litern, wurden in einem Gärbehälter, und zwar einem Microferm-Fermentor der Firma New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, N.J., USA, bei 30 °C gezüchtet, wobei ein Einblasen von Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Litern pro Minute pro Liter Kulturmedium durchgeführt wurde und wobei ferner mit 700 Umdrehungen pro Minute gerührt wurde. Man züchtete unter Anwendung der obigen Bedingungen während 18 bis 20 Stunden. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren, und zwar unter Anwendung von 10 000 x g, während 20 Minuten zum Absetzen gebracht, und die rohen überstehenden Flüssigkeiten des Kulturmediums wurden durch eine Membran mit Öffnungen von 0,45 |i, die bei der Millipore Corp., Bedford, Mass., USA, erhältlich ist, filtriert. Dieses filtrierte Kulturmedium wurde durch Druckultrafiltration auf das 40- bis IOOfache konzentriert, wobei die Druckultrafiltration unter Verwendung von PM-10-Membranen der Firma Amicon Corp., Lexington, Mass., USA, durchgeführt wurde.
Isolierung von durch Wärmebehandlung hypotoxinogenen Varianten
Vibrio cholerae 569B wurden in der Syncasebrühe während 18 Stunden bei 42 °C gezüchtet. Platten aus Nähr-agar-agar wurden beimpft, indem man Verdünnungen der Kultur aufstrich und über Nacht bei 30 °C bebrütete. Einzelne Kolonien wurden verwendet, um getrennte Proben oder Quellen von Mikrotiterplatten der Firma Linbro, 76-003-05, Ham-den, Conn., USA, zu beimpfen, welche 250 |il Syncasebrühe enthielten. Die Mikrotiterplatten wurden bei 30 °C während 24 Stunden bebrütet, anschliessend wurden die Bakterien durch Zentrifugieren zum Absetzen gebracht, und Volumina von 10 (il der darüberstehenden Zuchtflüssigkeit wurden auf ihre Choleratoxinaktivität durch den Test mit Hilfe der Lymphosarcomzellen der Mäuse S49 geprüft. Durch dieses Verfahren wurden die hypotoxinogenen Varianten isoliert, und zwar in einer Häufigkeit von 0,3%. Es zeigte sich, dass drei dieser Varianten etwa 0,010 bis 0,020 (ig der Cholerato-xinäquivalente pro ml des filtrierten Kulturmediums besas-sen, wenn sie unter optimalen Bedingungen zur Bildung von Toxin gezüchtet wurden und wenn sie in zweifachen seriellen Verdünnungen der konzentrierten darüberstehenden Kulturflüssigkeit getestet wurden. Im Gegensatz dazu hatte der Elternstamm der Vibrio cholerae 569B unter den gleichen Bedingungen eine Choleratoxinaktivität von 15 (ig pro ml.
Die in vitro genetische Stabilität des durch Wärmeeinwirkung variierten Stammes wurde bestimmt, indem man die Toxizität in den Lymphosarcomzellen der Mäuse S49 testete, nachdem eine serielle tägliche Passage in Syncasebrühe
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durchgeführt wurde (1: 50-Verdünnung einer 24-Stunden-Kultur in frischem Medium). Während einer 2 Wochen dauernden seriellen Passage wurde kein Anstieg bezüglich der Höhe der Toxinproduktion festgestellt.
Der isolierte variierte Stamm wurde dann in der Syncasebrühe gezüchtet, und Zellen der logarithmischen Vermehrungsphase wurden unter Verwendung von N-Methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin in einer Menge von 60 ng pro ml während 10 bis 30 Minuten mutagenisiert. Die überlebenden Bakterien wurden durch Zentrifugieren zum Absetzen gebracht, man wusch sie, und sie wurden dann in frischem Medium erneut suspendiert und bei 30 °C während 1 Stunde bebrütet. Platten aus Nähr-agar-agar wurden beimpft und bei 30 °C bebrütet, und die einzelnen Kolonien wurden dann auf getrennte Proben oder Quellen von Mikrotiterplatten aufgebracht. Nachdem man über Nacht bebrütet hatte, wurden die überstehenden Flüssigkeiten der Kultur bezüglich ihrer Choleratoxinaktivität so beschrieben, wie dies weiter vorne erläutert ist. Die potentiellen Mutantenstämme wurden auf Nähr-agar-agar-Platten aufgestrichen, und 12 Einzelkolonien der 600 geprüften wurden erneut auf ihre Toxizität getestet, und zwar in dem Test mit den Lymphosarcomzellen der Mäuse S49.25fach konzentrierte darüberstehende Flüssigkeiten der Kultur dieser potentiellen Mutantenstämme erwiesen sich als nichttoxisch sowohl in den Lymphosarcomzellen der Mäuse S49 als auch nach dem Y-l-Nebennieren-zellentest gegenüber Choleratoxin. Jedoch waren die 50- bis lOOfachen Konzentrate der Kulturen bei den Y-l-Nebennie-renzellentests, bei den Tests mit den Lymphosarcomzellen der Mäuse S49 und auch bei den.Tests bezüglich des Durchlässigkeitsfaktors der Kaninchenhaut toxisch. Es zeigte sich, dass alle durch Mutation mit Nitrosoguanidin erzeugten Mutantenstämme zwischen 1 bis 15 ng an Choleratoxinäqui-valenten pro ml der darüberstehenden Zuchtflüssigkeit bildeten. Die Mutantenstämme wurden serienweise in der Reihenfolge ihrer Isolierung bezeichnet, und zwar als Vibrio cholerae 569B (tox TI-101N1) bis 569B (tox TI-101N12).
Feststellung der Menge an Choleratoxin, Untergruppe B und Untergruppe A
Choleratoxin
Das Choleratoxin wurde quantitativ und qualitativ durch den Test mit den Lymphosarcomzellen der Mäuse S49 und durch den Test mit den Y-l-Nebennierenzellen bestimmt, und zwar im wesentlichen, wie dies weiter oben beschrieben ist. Ausserdem wurde eine quantitative Bestimmung des Choleratoxins gemacht, indem man den Test auf der Basis des Durchlässigkeitsfaktors der Kaninchenhaut durchführte.
Untergruppe B
Die Untergruppe B des Choleratoxins wurde geprüft, indem man eine Gegenimmunoelektrophorese von zweifachen seriellen Verdünnungen von konzentrierten, darüberstehenden Zuchtflüssigkeiten gegen gereinigtes Anti-Untergruppen B durchführte. Das Anti-Untergruppen B wurde in gereinigter Form aus dem Anticholeragenoid durch eine Affinitäts-chromatographie auf einer Untergruppe B-Sepharose-4B-Säule gewonnen.
Untergruppe A
Die enzymatische Aktivität der Untergruppe A des Choleratoxins wurde auch bestimmt, und zwar im wesentlichen nach den bisher bekannten Arbeitsverfahren. Frisch entnommene rote Blutkörperchen (Erythrocyten) der Taube wurden gewaschen und durch eine Säule von absorbierender Baumwolle geleitet, um die als Verunreinigung vorliegenden weissen Blutkörperchen, also die Leukocyten, zu entfernen. Die Erythrocyten wurden zu einem Plättchen vereinigt, und zwar durch Zentrifugieren mit 1200 x g während 5 Minuten, und sie wurden dann erneut suspendiert, und zwar in einem gleichen Volumen des Mediums A, und man lysierte sie durch rasches Gefrieren und Auftauen. Das Medium A hatte die folgende Zusammensetzung:
130 mMol NaCl 5 mMol KCl 2 mMol MgCl2 und 20 mMol Hepes.
Der pH-Wert beträgt 7,3.
50 ^1 Aliquote des Erythrocytenlysates wurden mit na-triumdodecylsulfataktivierten Proben während 30 Minuten bei 37 °C bebrütet. Das Natriumdodecylsulfat wird in der Folge als SDS abgekürzt. Die aktivierten Erythrocytenspu-ren wurden dann durch Zentrifugieren mit 1200 x g während 10 Minuten zum Sedimentieren gebracht, und man bebrütete während weiterer 30 Minuten bei 37 °C in einem cyclischen Adenosin-monophosphat-Accumulationsmedium, welches 0,2 mM Theophyllin enthielt, und die Gehalte an dem cyclischen Adenosin-monophosphat wurden nach in der Literatur beschriebenen Verfahren bestimmt. Das cyclische Adenosin-monophosphat wird in der Folge als cAMP abgekürzt. Die Untergruppe A des Choleratoxins wurde auch durch eine umgekehrte passive Haemagglutinatioh unter Verwendung von Anti-SA wie vorhin beschrieben bestimmt."
Die Aktivität an Choleratoxin, an Untergruppen-B- und Untergruppen-A-Choleratoxin wurde in der gleichen Weise getestet, wie dies weiter oben für die Vibrio cholerae 569B sowie die durch Hitzeeinwirkung gebildeten Varianten und eine Anzahl von ausgewählten Mutanten beschrieben ist. Die Mutantenstämme, welche charakterisiert wurden, können in drei Gruppen klassifiziert werden, und zwar basierend auf der Art ihrer Cholera-tox-gen-Produkte.
Die erste Gruppe wird durch Vibrio cholerae 569B (tox TI-101N4) veranschaulicht, bei der es sich herausstellte, dass sie die gleichen Gehalte an Untergruppen-A-Aktivität pro ml der darüberstehenden Zuchtflüssigkeit lieferte wie der durch Hitzeeinwirkung variierte Eltemstamm, dass sie jedoch keine feststellbaren Gehalte an Untergruppe B in lOOfachen Konzentraten des Zuchtmediums lieferte (s. die Ergebnisse der Tabelle 2).
Vibrio cholerae 569B (tox TI-101N9) ist ein typisches Beispiel für die zweite Gruppe. Es zeigte sich, dass dieser Stamm eine um das lOfache geringere Menge an Untergrup-pen-A-Aktivität pro ml filtriertem Zuchtmedium lieferte als der Elternstamm.
Ein typisches Beispiel für die dritte Gruppe ist Vibrio cholerae 569(tox TI-101N3) und 569B(tox TI-101N5). Es zeigte sich, dass diese beiden Stämme etwas geringere Mengen an Untergruppen-A-Aktivität pro ml lieferten als der durch Hitzebehandlung variierte Elternstamm. y
Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
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Tabelle
Choleratoxin-Untergruppen-A-Aktivität und -Untergruppen-B-Aktivität in darüberstehenden Zuchtflüssigkeiten von Vibrio cholerae 569B, einer durch Hitzeeinwirkung gebildeten Variante und
Mutantenstämmen
Art des Vibrio-cholerae-Stammes
Choleratoxin-Aktivität in ng/ml Untergruppe B Untergruppe A
Test mit den Test bezüglich des |ig/ml an ng/mlan
Lymphosarcom- Durchlässigkeits- Choleratoxin- Choleratoxin-
zellen der S49-Maus faktors der Kanin- äquivalenten äquivalenten chenhaut
569B
15
15
15
15
Durch Wärmeeinwir
kung erzeugte Variante
0,010-0,015
0,015-0,025
0,001
3
569B(tox TI-101N3)
0,006-0,010
0,015-0,020
<0,02
1
569B(tox TI-101N4)
0,001-0,005
0,004
<0,0005
3
569B(tox TI-101N5)
0,002-0,010
0,006
<0,02
1
569B(tox TI-101N9)
0,001-0,005
0,015-0,029
<0,02
0,3
Der Mutantenstamm Vibrio cholerae 569B(tox TI-101N4) zeichnet sich durch die folgenden Eigenschaften aus: Gram negative bewegliche Hebe Klassischer Biotyp
Inaba Serotype + 25
Group Serotype +
Entwicklungszeit: etwa 48 Minuten in Syncasebrühe Biochemische Reaktionen:
ß-Galactosidase —
Arginin-dihydrolyase —
Lysin-decarboxylase +
Ornithin-decarboxylase 4-
Zitratverbrauch —
Bildung von Schwefelwasserstoff —
Urease —
Tryptophan-desaminase —
Indolbildung +
Acetoinbildung —
Verflüssigung von Gelatine +
Mannitverbrauch +
Inositverbrauch —
Sorbitverbrauch —
Rhamnoseverbrauch —
Saccharoseverbrauch +
Melibioseverbrauch —
Amygdalinverbrauch —
( 1 + ) Arabinoseverbrauch —
Glucoseverbrauch +
Katalasebildung —
Wächst auf TCBS Agar-agar.
Die genetische Beständigkeit der Mutante Vibrio cholerae 569B(tox TI-101N4) wurde in vivo getestet, indem man den Mutantenstamm in keimfreien Rattenkolonien bilden Hess. Vibrio cholerae wurde aus dem Stuhl der Ratten jeden zweiten Tag isoliert. 200 willkürlich ausgewählte Kolonien wurden auf ihre Toxinogenetizität aus jeder Probe getestet.
Nach 5 Wochen Testzeit konnten keine revertierten Stämme festgestellt werden, und das ist ein deutlicher Hinweis dafür,
dass revertierte Stämme, also sogenannte Revertanten, keine selektiven Vorteile bei der Kolonienbildung im Magen-Darm-System der Ratte aufweisen. Wenn ausserdem irgendeine Reversion in dem «wilden Typ» vorkam, dann war die Reversionsrate unterhalb des Niveaus, das feststellbar war.
Der Mutantenstamm hält den Biotyp und die Antigene des Elternstammes aufrecht und ferner auch seine Fähigkeit, im Dünndarm von Kaninchen Kolonien zu bilden.
Eine weitere Analyse von Vibrio cholerae tox TI-101N4 wurde durchgeführt, indem man eine orale Infektion bei 2 Wochen alten Schweinchen hervorrief, die kein Kolostrum ' erhielten aufgrund einer Entfernung der Gebärmutter (Hy-sterectoma). Der Elternstamm an Vibrio cholerae 569B wurde zur Durchführung der positiven Kontrollversuche herangezogen.
Innerhalb von 6 Stunden nach der Verabreichung von 4 x 10® lebenden Organismen des Vibrio cholerae 569B wurde der Stuhl weich. Der Durchfall begann innerhalb von 15 Stunden, und der reichliche wässrige Durchfall, der für schwere Cholera typisch ist, begann innerhalb von 24 Stunden. Die klinische Krankheit dauerte bis 5 Tage.
Im Gegensatz dazu führte eine orale Infektion der Schweinchen mit 4x10® lebenden Organismen an Vibrio cholerae tox TI-101N4 nicht zu irgendwelchen Symptomen einer Darmkrankheit. Die lebenden Organismen konnten, aus dem Stuhl der gesunden Schweinchen bis zum 7. Tag isoliert werden, und dann wurden die Tiere getötet. Bei der Autopsie zeigte es sich, dass die Schweinchen, die mit der Vibrio cholerae tox TI-101N4 infiziert worden waren, normal waren.
Die Isolierung von genetisch beständigen Mutanten der durch Wärmebehandlung und anschliessende Mutagenese hervorgerufenen Variante ermöglicht den Vorteil einer zweistufigen genetischen Änderung. Die Häufigkeit der Reversion, d.h. des Zurückschlagens in die nichtmutierten Stämme, liegt in der Grössenordnung von 10"8 für den durch Hitzeveränderung hervorgerufenen Schritt und in der Grösse von 10"8 für den durch Mutation hervorgerufenen Schritt. Dementsprechend sollte die Rate der Reversion der Mutanten in dem «wilden Typ» in der Grösse von 10"16 liegen. Aus diesem Grund besteht ein sehr hohes Ausmass des Vertrauens bezüglich der Sicherheit eines derartigen Lebendimpfstoffstammes, der oral zu verabreichen ist. Die Wichtigkeit der genetischen Beständigkeit eines derartigen Stammes kann nicht überbetont werden, und zwar aus wissenschaftlichen Gründen, aus ethischen Gründen und auch aus politischen Gründen.
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Claims (8)

645 025
1. Verfahren zur Herstellung eines hypotoxinogenen und genetisch beständigen abweichenden Stammes von Vibrio cholerae, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Elternstamm von Vibrio cholerae bei erhöhter Temperatur bebrütet und daraus einen abweichenden Stamm auswählt, der den Biotyp und die Antigene des Elternstammes beibehält und eine Toxizität besitzt, die um einen Faktor von mindestens 750 reduziert ist, verglichen mit dem Elternstamm, wobei die Toxizität in S49-Maus-Lymphosarcomzellen bestimmt wurde.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Vibrio cholerae 569B ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bebrütung bei einer Temperatur von 40 bis 42 °C während einer Zeit von 15 bis 20 Stunden stattfindet.
4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der erhaltene abweichende Stamm zusätzlich einer Mutagenese unterworfen wird und dass man einen Mutantenstamm auswählt, der eine Toxizität besitzt, die gegenüber der Toxizität des Elternstammes um einen Faktor von mindestens 7500 vermindert ist.
5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutagenese eine chemische Mutagenese ist.
6. Hypotoxinogener, genetisch beständiger variierter Stamm von Vibrio cholerae, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
7. Stamm von Vibrio cholerae gemäss Anspruch 6, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 2.
8. Stamm von Vibrio cholerae gemäss Patentanspruch 6, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 4.
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