DE2128626C3

DE2128626C3 -

Info

Publication number: DE2128626C3
Application number: DE2128626A
Authority: DE
Inventors: Rene Dr.Phil.Nat. Muri Bern Germanier (Schweiz)
Original assignee: Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 1971-04-29
Filing date: 1971-06-09
Publication date: 1978-03-16
Also published as: IT1101491B; DK129244B; IT7830643A0; CA939608A; AT304763B; FR2134325A1; SE397632B; DE2128626B2; BE770453A; GB1291214A; JPS5522448B1; AU3283071A; NL146385B; NL7109739A; ES392830A1; ZA714798B; FR2134325B1; AU445536B2; SU492094A3; DE2128626A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff mit lebenden Keimen zur oralen Applikation.

Eine überstandene Typhus-Infektion hinterläßt eine '5 hochgradige Immunität. Reinfektionen sind selten. Trotzdem sind die heute bestehenden Impfmöglichkeiten, im besonderen die orale Impfung, hinsichtlich ihrer Wirksamkeit noch unbefriedigend. Die parenteral Schutzimpfung mit abgetöteten Keimen verursacht zudem allgemeine und lokale Reaktionen.

Bereits 1896 hat A. E. Wright die ersten Versuche mit abgetöteten Salmonella-Keimen durchgeführt (Lancet II. S. 807-809 [1896]).

Durch Vakzination mit abgetöteten Keimen kann zwar die Konzentration der sogenannten O-, H- und Vi-Antikörper stark gesteigert werden, es besteht jedoch offenbar kein direkter Zusammenhang zwischen diesen Antikörpern und der Resistenz gegen Infektion und Rückfall. (R. B. Horn ick et al, New English Journal of Medizine 285.739-746 [1970]).

Kürzlich durchgeführte Feldversuche und klinische Versuche an Freiwilligen ergaben ernsthafte Zweifel an der Wirksamkeit einer oralen, inaktiven Typhus-Vakzine, R. B. H ο r η i c k et al, loc. zit.

Experten der World Health Organization gelangten 1971 aufgrund von Feldversuchen zum Ergebnis, daß abgetötete Typhus-Vakzine bei oraler Anwendung wirkungslos sind: C. S. C u 11 a η i et al, Bulletin World Health Organization 1971,45,445-450.

Es gibt demnach bis heute keinen oralen Typhus-Impstoff auf Basis abgetöteter Keime, der eine befriedigende Schutzwirkung zu erzeugen vermag.

In der kanadischen Patentschrift 7 65 378 (B u ζ ζ u bo ν et al) wird die Herstellung von oralen Typhus-Impfstoff-Drag6es beschrieben. Angaben über die Natur und Zusammensetzung des Impfstoffes selbst fehlen

E. S. Anderson et al, The Lancet, Dec. 5, 1964, 1196—1200, haben vorgeschlagen, bei der Herstellung von Typhus-Impfstoffen den klassischen Salmonella typhi-Vakzinestamm T2 durch einen flagellenfreien (Η-freien) Stamm zu ersetzen. Durch diese Maßnahme wäre es leicht möglich am Patienten festzustellen, ob er entsprechend geimpft wurde oder ob er eine Typhus-Infektion durchmacht Infolge erwiesener Unwirksamkeit entsprechend hergestellter Impfstoffe ist dieser Vorschlag inzwischen gegenstandslos geworden. Vergleiche dazu: M. H. Wahdan et al, Bulletin Worlds Health Organization 1975,52, Seiten 69-73. <>°

Zahlreiche Modellversuche mit Salmonella typhimurium oder Salmonella enteritidis an Mäusen lassen vermuten, daß mit einem Lebend-Impfstoff bessere Resultate erzielt werden könnten. Diese Annahme wurde durch Versuche an Schimpansen (B. Cvjeta- ^(>5 novic, D. M. MeI und O. Felsenfeld, Bulletin World Health Organization !970, 42, 499—507^ up.d an Freiw lligen (Hornick, loc. zit.) bestätigt. Die genannten Forscher benützten für ihre Versuche eine streptomycin-abhängige Mutante von Salmonella typhi (M. Reitman, Journal of Infection Diseases 117, 101-107 [1967]).

Der Nachteil dieses Stammes liegt darin, daß Virulenz und Immunogenität durch tägliche Streptomycingaben geregelt werden müssen. Auch ist die Reversionsrate viel zu hoch als daß er jemals als Impfstoff-Stamm Verwendung finden könnte.

Zweck und Aufgabe der Erfindung war, für einen oral verabreichbaren Lebend-Impfstoff einen stabilen Salmonella typhi-Stamm zu finden, der völlig avirulent und dennoch immunogen ist Dieses Vorhaben stößt auf einige Schwierigkeiten, weil sowohl Immunogenität als auch Virulenz stark an die äußere Zellwandstruktur des Bakteriums gebunden sind.

Eine weitere Schwierigkeit für die experimentelle Bearbeitung besteht darin, daß Salmonella typhi, der Erreger des menschlichen Typhus, außer bei Schimpansen, in keinem der üblichen Versuchstiere eine echte Infektion bewirkt Die ersten Entwicklungsarbeiten mußten daher zunächst an einem Modell durchgeführt werden. Ais Modell wurde der durch Salmonella enteritidis und Salmonella typhimurium hervorgerufene Mäuse-Typhus gewählt. Die Ergebnisse dieser Mäuse-Versuche ließen sich glücklicherweise gut auf die menschenpathogenen Salmonella typhi übertragen, was keineswegs vorauszusehen war.

Bei der Prüfung verschiedenster Salmonella-Mutanten wurde gefunden, daß unter allen geprüften Mutanten nur solche, die durch einen Defekt im Enzym Uridindiphosphat-Galactose-4-Epimerase gekennzeichnet sind, einen Infektionsschutz hervorrufen, wie ihn eine überstandene Infektion hinterläßt. Solche epimerase-negative Mutanten — sogenannte »epimeraseless«- Mutanten — können wegen ihres Defektes im Enzym Uridindiphosphat-(UDP)-Galactose-4-Epimerase auf dem normalen Weg keine UDP-Galactose bilden. Da nun UDP-Galactose als Vorstufe für den Einbau von Galactose in die Zellwand-Lipopolysaccharide dient, werden nur unvollständige Zellwände synthetisiert. Solche Bakterien erwiesen sich als weitgehend avirulent. Es wurde weiter gefunden, daß die außergewöhnlich gute Immunisierungsfähigkeit dieser Mutanter darauf beruht, daß in Anwesenheit von Galactose, wie dies in vivo der Fall ist, die Lipopolysaccharide wieder teilweise aufgebaut werden können. Ein zu starkei Anstieg der Virulenz durch diese phänotypische Reversion wird dadurch verhindert, daß bei zu hoherr Galactoseangebot die aufgenommene Galactose ir Form von Galactose-1-Phosphat und UDP-Galactoss angereichert wird, was zu einer starken Bacteriolyse führt. Die Stabilität dieser Mutanten wird dadurch erreicht, daß nur Mutanten mit einer Deletion irr Epimerase-Gen verwendet werden. Diese Mutanter zeigen weder spontan noch nach Behandlung mii mutagenen Agentien die geringste Reversion. Fernei werden unter diesen Mutanten nur solche ausgewählt deren Deletion im Epimerase-Gen einen schwacher polaren Effekt auf die distal gelegenen Uridyl-Transfe rase- und Galactokinase-Gene ausüben. Auch diessi polare Effekt übt einen stabilisierenden Einfluß auf dit Mutante aus (Schutz gegen Mutation zu starkei Galactoseresistenz).

Der erfindungsgemäße oral verabreichbare Impfstof gegen Typhus ist dadurch gekennzeichnet, daß ei lebende. Stabil? UridinHiphosphat-Galactose-4-F.mni merase negative Deletions-Mutanten von virulentei

Salmonella typhi Stämmen mit abgeschwächter Galactokinase- und Galacto-l-Phosphat-Uridyl-Transferase-Aktivität enthalt

Epimerase-negative Mutanten sind schon seit 40 Jahren bekannt: W. Murase, Japanese Journal of Bacteriology 440,975—999 (1932). H. N i k a i d ο und M. J. O s b ο r η haben 1966 die Isolierung von entsprechenden Mutanten von Salmonella typhimurium beschrieben: Methods in Enzymology VoL 8, Seiten 149—161 (1966). Diese Mutanten wurden seit ihrer Entdeckung ι ο vor mehr als 40 Jahren nie mit irgendwelchen immunologischen Aspekten in Zusammenhang gebracht und auch nie als Impfstoffe geprüft. Eine Schutzwirkung konnte nicht vorausgesagt werden. Sie war im Falle der vorliegenden Erfindung selbst für den Erfinder unerwartet Die von N i k a i d ο und O s b ο r η in einer rein wissenschaftlichen Zielen dienenden Veröffentlichung beschriebenen Mutanten von Salmonella typhimurium stehen in keinem Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Sie sind als Lebend-Impfstoffe ganz ungeeignet, da sie nicht Deletions-Mutanten sind, folglich nicht stabil sind und spontan in die virulente Wildform mutieren können. Abgesehen von ihrer Instabilität sind sie als Vertreter der Art Salmonella typhimurium zum Schutz gegen Infektionen durch Salmonella typhi erfahrungsgemäß ohnehin ungeeignet.

Der neue Typhus-Impfstoff wird derart hergestellt, daß man spontan auftretende oder durch mutagene Ägentien induzierte stabile Mutanten von virulenten Salmonella typhi Stämmen, die sich durch einen Defekt im Enzym Uridindiphosphat-Galactose-4-Epimerase auszeichnen, selektioniert, isoliert, kultiviert und anschließend zum Lebend-Impfstoff verarbeitet

Die Selektion der gewünschten epimerase-negativen Mutanten wird dadurch erleichtert, daß man die Kultur von Salmonella typhi vorzugsweise nach mutagener Behandlung mit smooth-spezifischen Phagen infiziert. Für diese Phagen weisen die epimerase-negativen Mutanten von Salmonella typhi mit ihrer Rauh-(rough)-Struktur keine Rezeptoren auf, sind diesen gegenüber also resistent, während die normalen (smooth), virulenten Bakterien von diesen Phagen lysiert werden. Man erzielt damit eine Vorselektion der epimerase-negativen Rauh-Mutanten, was deren Isolierung wesentlich erleichtert. Als smooth-spezifische Ph ^ η werden vorzugsweise solche vom Typ FO-I verwendet.

Die Herstellung des Impfstoffs erfolgt durch Kultivierung der selektionierten Bakterien und deren Verarbeitung zum Impfstoff, die gewöhnlich in der Abtrennung der Bakterien vom Nährmedium und der Lyophilisation der Bakteriensuspension in einem Schutzmedium besteht.

Eine maximale Stabilität muß von einem Lebendimpfstoff unbedingt gefordert werden. Es muß ausgeschlossen werden können, daß sich die Virulenz zurückbildet und die Impfung zu echtem Typhus Anlaß geben kann. Dies erreicht man auf folgende Weise: Durch die Benutzung von Deletions-Mutanten kann eine Reversion in die ursprüngliche Wildform definitiv verhindert werden. Ein weiteres kritisches Moment besteht aber darin, daß durch eine Sekundärmutation galactose-resistente Mutanten — den Sicherheitsmechanismus einer — Galactose-Lyse nicht mehr besitzen. Um die Gefahr der Sekundärmutation zum vollständig galactose-resistenten Stamm zu vermindern, verwendet man gemäß vorliegender Erfindung solche Mutanten, die zusätzlich teilweise galactose-resistent sind.

Der neue oral verabreichbare Typhus-Impfstoff mit lebenden Bakterien weist die erhoffte hohe immunisierende Aktivität und die notwendige geringe Virulenz und eine sichere Stabilität gegenüber Reversionen in die Wildform auf.

Prüfung des Impfstoffes

Prinzip:

Da Salmoneila typhi in Schimpansen in keinem der üblichen Versuchstiere eine echte Infektion hervorruft, ist es umständlich, einen Typhus-Impfstoff zu prüfen. Wird Salmonella typhi Mäusen intraperitoneal injiziert, vermehren sich diese Keime zwar nur schwach, werden aber äußerst langsam eliminiert. Da die Fähigkeit, Salmonellen mehr oder weniger rasch inaktivieren zu können, der wichtigste Faktor in der Immunität gegen Typhus darstellt, wurde die Eliminationsgeschwindigkeit als Maß für die erreichte Immunität bei den Mäusen verwendet.

Ausfuhrung:

Mäusen wurden subcutan je 10⁷ lebende Keime des neuen gemäß dem Ausführungsbeispiel erhaltenen Impfstoff-Stammes, der die Bezeichnung Ty SB trägt verabreicht. Zu Vergleichszwecken erhielten andere Mäuse 10⁶ lebende Keime des virulenten Stammes Ty 2, respektive 10⁷ durch lstündiges Erhitzen auf 58°C inaktivierte Keime des gleichen Stammes mit einer gleichen Dosib 10 Tage später, als Booster-Injektion. Keimzahlbestimmungen in Leber und Milz dieser Tiere zeigten, daß die attenuierten Keime des Impfstammes bereits nach 20 Tagen vollständig eliminiert waren, während die Keime des virulenten Stammes trotz schwächerer Dosierung noch nach 4 Wochen in Konzentrationen von 10² — 10³ in den Mäusen nachweisbar waren.

6 Wochen nach der Impfung wurden die Mäuse intraperitoneal mit 10⁶ lebenden Keimen des virulenten Stammes Ty 2 belastet. In diesem Zeitpunkt waren alle Tiere frei von Impfbakterien. Durch Keimzahlbestimmungen in Leber und Milz der Mäuse wurde das Schicksal der Challenge-(Belastungs)-Bakterien Ty 2 verfolgt (Tab. 1).

Tabelle 1

Anzahl Tage nach Challenge

Anzahl Challenge-Bakterien/Leber und Milz

Mäuse mit 10⁷ Keimen des
neuen Vakzinestammes Ty SB
geimpft

4 · 102
1 · 102
60

Mäuse mit 1O^b lebenden Ty Keimen geimpft

1 · 103
1 · 103

Mäuse mit 10'
hitzeinaktivierten Ty 2
Keimen geimpft

6,5 · 103
3 · 104
2,5 · 10"

Unbehandelte
Kontrollmäuse

8 · 103
5 · 10⁴
1,5 · 10

Fortsetzung	Anzahl Challenge-Bakterien/Leber und	Mäuse mit ΙΟ⁶	MiU	Unbehanddtc
Anzahl Tage nach Challenge	Mäuse mit 10⁷	lebenden Ty 2	Mäuse mit 10'	Kontrollmäuse
	Keimen Jes	Keimen geimpft	hit/.einaktivierien Ty 2
	neuen Vakzine		Keimen geimpft
	stammes Ty SB geimpft	<10		1,5
6	40	<10	6 - 103	5 ■
7	20	<10	5 · KP	4 ■
8	30	<10	3 · 103	4 -
10	10	<10	! - 102	9 ■
11	10	<10	1,5 - 102	1 ■
12	10		5 ■ 102

	i ■ 10⁵
	ICH
	103
103
103
10*

Schutzwirkung Schutzwirkung Kein wirksamer Schutz

Die Konzentration der virulenten Challenge-Bakterien steigt in Leber und Milz unbehandelter Tiere während der ersten 6 Tage nach dem Challenge leicht bis auf ca. 10⁵ Keime an. Nach 12 Tagen sind immer noch Bakterien/Maus nachweisbar.

In den mit dem erfindungsgemäßen neuen Impfstoff Ty SB immunisierten Tieren wurden die Cha lenge-Bakterien ähnlich rasch eliminiert wie in Tieren, die mit dem für Menschen pathogenen virulenten Stamm Ty 2 vorbehandelt — und damit immunisiert — waren.

Dagegen verhalten sich Mäuse, die mit inaktivierten Bakterien des virulenten Stammes Ty 2, wie sie in heute üblichen Impfstoffen enthalten sind, geimpft wurden, nicht wesentlich anders als die Kontrolltiere.

Der große Fortschritt des neuen Impfstoffes gegenüber den herkömmlichen inaktivierten Impfstoffen ist offensichtlich.

Lebende virulente Salmonella typhi Stämme, wie etwa Ty 2, sind in Impfstoffen für den Menschen natürlich unzulässig, da sie im Gegensatz zu der neuen, völlig gefahrlosen, epimerase-negativen stabilen Mutante Ty SB, beim Menschen echten Typhus auslösen würden.

Die Schutzwirkung des neuen Impfstoffes Ty SB ist streng spezifisch: Sie ist weder wirksam gegen virulente Bakterien anderer Salmonella Spezies noch kann sie durch epimerase-negative Mutanten anderer Salmonella Spezies erreicht werden (Tab. 2a) und (2b).

Tabelle 2

a) Belastung mit Salmonella (S.) typhi Ty 2 (pathogen für den Menschen)

Anzahl
Tage nach
Challenge

Anzahl Challenge-Bakterien/Leber und Milz

Mäuse mit 2 ■ 10* lebenden Keimen des neuen Vakzinestammes Ty SB geimpft

Mäuse mit 5 · 10⁵ lebenden Kontrollmäuse
Keimen der S. typhimuriumepimerase-negativen Mutante
G 30 geimpft

13

17

103

40

10

Schutzwirkung

9 · ICH 5 ■ 2 · 8 · 7 · Kein Schutz

3 · 10'
7 ■ 10⁴

5 103

6 · 10²
1 ■ 103

b) Belastung mit Salmonella (3.) typhimurium LT 2 (pathogen für Mäuse)

Anzahl
Tage nach
Challenge

Anzahl Challenge-Bakterien/Leber und Milz

Mäuse mit 2 · 10⁶ lebenden Keimen des neuen Vakzinestammes Ty SB geimpft

Mäuse mit 5 · ins lebenden	Kontrollmäuse
Keimen der S. typhimurium-
epimerase-negativen Mutante
G 30 geimpft
103	4 ■ 10«
2 · 103	2 · ΙΟ"
2 · 102	*)
50
50
Schutzwirkung

13

17

2 · 108
1,5 · 10"
^#)

Kein Schutz
') Keine überlebenden Mäuse.

Mäuse, die mit dem neuen Salmonella typhi Impfstoff Ty SB geimpft wurden, sind nicht gegen eine Infektion mit dem für Mäuse virulenten Salmonella typhimurium Stamm geschützt (2b). Ebenso verhalten sich Mäuse, die mit einer epimerase-negativen Mutante von Salmonella ^s typhimurium geimpft wurden, gegen eine Infektion mit Salmonella typhi Ty 2 nicht anders als die Kontrollmäuse (2a).

Die Vorteile eines Lebend-Impfstoffes mit epimerasenegativen Mutanten von Salmonella typhi bestehen darin, daß durch eine einzige orale Gabe eine sichere, hochgradige, spezifische Immunität gegen die menschcnpathogcnen Salmonella typhi crzieli werden kann.

Der nach dem nachfolgenden Beispiel hergestellte Lebendimpfstoff gegen Typhusinfektionen wurde kli- "5 nisch an Freiwilligen hinsichtlich seiner Gefahrlosigkeit und Wirksamkeit eingehend untersucht.

Vergleiche dazu beispielsweise R. B. H ο r η i c k, H. L. D e P ο η t et al, Develop. biol. Standard., Vol. 33,89—92 (S. Karger, Basel 1976) (14th Congress of the *° International Association of Biological Standardization, Douglas, Isle of Man 1975).

Die Gefahrlosigkeit wurde durch Verabreichung an 137 Erwachsenen und 370 Kindern geprüft. Stuhluntersuchungen haben gezeigt, daß etwa 10% der geimpften ²J Personen den Impfstamm während 2 bis 3 Tagen nach der Impfung ausschieden. Biochemische und bakteriologische Analysen an den ausgeschiedenen und isolierten Keimen zeigten, daß sich die Keime während der Darmpassage in keiner ihrer wichtigsten Eigenschaften verändert haben. In keinem einzigen Fall konnte ein Revertant (in die Wildform zurückmutiertes Bakterium) gefunden werden.

Die gegen Typhusinfektion schützende Wirkung des Impfstoffes wurde an erwachsenen Männern erprobt. 3-^s Diese erhielten den Impfstoff in 6 bis 8 oralen Dosen von 3 bis 5 · 10¹⁰ Keimen. 6 Wochen nach Erhalt der letzten Dosis wurden sie durch Verabreichung von 10⁵ lebenden virulenten Salmonella Typhi T2 Bakterien belastet. Diese Belastung mit virulenten Keimen führte bei 53% der nicht geimpften Männer aus der Kontrollgruppe zu fiebrigem Typhus während von den geimpften Männern nur 7% erkrankten. Daraus ergibt sich bereits in diesem ersten Versuch ein Impferfolg von 87%. Ein auch nur annähernd vergleichbarer Impferfolg konnte bis heute nicht einmal mit einem parenteralen Typhusimpfstoff erreicht werden. Mit dem erfindungsgemäßen neuen Lebend-Impfstoff ist erstmals eine breit anwendbare wirksame orale Typhusprophylaxe möglich. Die empfohlene Impf-Dosis liegt bei ca. 10* bis etwa 10'° Keimen.

Beispiel
a) Gewinnung des Impfstammes

Der virulente Salmonella typhi Stamm Ty 2 wird in 30 ml einer Nährlösung, bekannt als »Brain Heart Infusion« (BHI) (Difco Manual 9th Ed, 1953 Michigan, Seite 77) in 100 ml Schüttejkolben bei 37° C angezüchtet Nach 4 Stunden werden die Bakterienzellen abzentrifugiert und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, so daß die Suspension 10⁸ Organismen/ml enthält Diese Suspension wird so lange mit UV-Licht bestrahlt, bis eine 80%ige Abtötung der Bakterien erreicht ist Die Bakterienzellen werden dann auf frische Nährlösung f>s überimpft und bei 37°C auf einer Schüttelmaschine inkubiert Nach 2 Stunden wird die Kultur mit smooth-spezifischen Bacteriophagen des Typs FO-I infiziert (1 .Bacteriophag/10 Bakterienzellen) und weitere 3 Stunden inkubiert. Durch diese Behandlung werden alle smooth Bakterien lysiert und es bleiben nur Rauh-Bakterien zurück. Diese werden auf Nähr-Agar gebracht und bei 37°C während 14 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien werden nun auf Endo-Agar, der an Stelle der Lactose 0,2% Galactose enthält, repliziert. Auf diesem Nährboden sind epimerase-negative Mutanten aufgrund der Kolonien-Wuchsform leicht zu erkennen: Epimerase-negative Mutanten vergären, im Gegensatz zum Wild-Typ, die Galactose nicht, und sie wachsen in typischen farblosen, flachen Kolonien mit schmälern äußerem Wall und konkavem Zentrum, das zum größten Teil aus lysierten Zellen besteht. 30 solcher Kolonien werden isoliert und von diesen diejenigen Deletions-Mutanten isoliert, die auch nach mutagener Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (NG) keine Reversion zeigen. Zu diesem Zwecke werden die isolierten Mutanten auf BHI angezüchtet und nach 6 Stunden mit NG behandelt, um eine 99%ige Abtötung zu erhalten (E. A. A d e 1 b e r g et al, Biochem. Biophy. Res. Com. 18, 788 [1965]). Die überlebenden Zellen werden nach 2maligem Abzentrifugieren und Waschen in BHI suspendiei t, auf einer Schüttelmaschine bei 37^CC inkubiert und nach 2 Stunden in frische BHI, der 0,1% Galactose zugegeben wurde, überimpft. Wegen des Defektes im Enzym UDP-Galactose-4-Epimerase sind epimerase-negative Mutanten nicht in der Lage, die aufgenommenen Galactose zu metabolisieren. Es kommt zu einer Anreicherung von Galactose-1-Phosphat und von UDP-Galactose, was innerhalb 3—4 Stunden eine vollständige Lyse der epimerase-negativen Bakterien zur Folge hat. Die Kultur wird dann noch für weitere 3 Stunden inkubiert. Dadurch wird das Aufkommen auch seltener Revertanten stark gefördert. Die überlebenden Bakterien werden dann auf galactosehaltige Endo-Agar ausgeplattet und 14 Stunden bei 37°C bebrütet. Eventuelle Revertanten sind auf diesem Nährboden leicht als galactose-vergärende dunkelrote Kolonien zu erkennen. Sämtliche Mutanten, die bei diesem äußerst sensiblen Test auch nur die geringste Reversion zeigen, werden verworfen. Für die folgenden Enzymtests werden nur diejenigen Mutanten selektioniert, die keine Reversion gezeigt haben.

Als letzter Test wird von diesen vorselektionierten Mutanten die Aktivität der Enzyme des Leloir-Galactosestoffwechsels bestimmt (H. N i k a i d ο : Biochem. Biophys. Acta 48, 460—469 [1%1]) und nur Mutanten selektioniert, die keine Aktvität der UDP-Galactose-4-Epimerase mehr aufweisen und deren Galactokinase- und Galactose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase Aktivität noch ca. 10% der Aktivitäten des Wildstammes besitzt (Tab. 3).

55 Tabelle

Salmonella Aktivitäten der Leloir-Enzyme in

typhi Stamm μπΐοΐ/mg Protein/Std.

Epi- Galacto- Galactose-1-merase lcinase Phosphat-Uridyl-

Transferase Wildstamm Ty 2 24 3,4 18 Selektionierter 0 0,4 2,5

Impfstamm

Die auf diese Weise definitiv selektionierte Mutante wird in BHI auf einer Schüttelmaschine bei 37°C

angezüchtet. Nach 6 Stunden werden die Bakterien in einer Kühlzentrifuge bei 6000 g abzentrifugiert, ohne Waschen in einem Schutzmedium, enthaltend 8% Saccharose, 1,5% Gelatine und 5% Magermilchpulver, suspendiert und je 1 ml dieser Bakteriensuspension in 5 ml Ampullen lyophilisiert.

b) Herstellung des Impfstoffes

Eine Lyoampulle des nach a) erhaltenen neuen Impfstammes wird geöffnet und der Stamm auf Nähr-Schrägagar bei 37°C angezüchtet. Die Bakterien werden von der Oberfläche der Schrägagarkultur gewonnen und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Mit dieser Zellsuspension wird der Inhalt eines 1-Liter-Erlenmeyerkolbens beimpft. Dieser enthält 600 ml Nährlösung, hergestellt durch Auflösen von 28 g Casein-Hydrolysat, 10 g Hefeextrakt und 2 g Glucose in 1 Liter detilliertem Wasser und Einstellen des pH mit In NaOH-Lösung auf 7,2. Der Erlenmeyerkolben wird 6 Stunden bei 37°C geschüttelt.

Die erhaltene Bakterienkultur wird auf 25 Liter, wie oben hergestellte Nährlösung, überimpft. Die Kultur wird unter Belüftung (5 Liter Luft/Min.) bei 37"C während 12 Stunden bebrütet. Das Wachstum der Vor- und der Hauptkultur wird nephelometrisch verfolgt. Durch periodische Kulturproben wird die Reinheit geprüft. Am Ende der Kulturperiode werden die Bakterienzellen in einer Kühlzentrifuge bei 6000 g abzentrifugiert, ohne Waschen in ~600 ml des unter a) beschriebenen Schutzmediums suspendiert und in 1-ml-Portionen in 5-ml-Ampullen oder Stechflaschen

Jvonhihcipri.

c) Anwendung des Impfstoffes

Die Ampullen oder Stechflaschen werden geöffnet, der Inhalt wird in 3—5 ml kaltem oder lauwarmem Wasser oder Milch suspendiert und oral verabreicht.

Claims

Patentanspruch:

Oral verabreichbarer Lebend-Impfstoff gegen Typhus, dadurch gekennzeichnet, daß er lebende, stabile Uridindiphosphat-Galactose-4-Epimerase negative Deletions-Mutanten von virulenten Salmonella typhi Stämmen mit abgeschwächter Galactokinase- und Galacto-1-Phosphat-LJ ridy 1-Transferase-Aktivität enthält.