DE3427477A1 - Antikoerper, verfahren zu deren herstellung und diese antikoerper enthaltende mittel zur inhibierung von durch streptococcus mutans induzierte zahnkaries - Google Patents
Antikoerper, verfahren zu deren herstellung und diese antikoerper enthaltende mittel zur inhibierung von durch streptococcus mutans induzierte zahnkariesInfo
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Description
PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR. WERNER KINZEBACH
DR. ING. WOLFRAM BUNTE (ιββ8-ΐ97β)
EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENTATTORNEYS
25. Juli 1984
OURREF: M/25
BETREFF:
RE
KITASATO KENKYUSHO
9-1, Shirakane 5-chome
Minato-ku
9-1, Shirakane 5-chome
Minato-ku
Tokyo-to
Japan
Japan
Antikörper, Verfahren zu deren Herstellung und diese Antikörper enthaltende Mittel zur Inhibierung von
durch Streptococcus mutans induzierte Zahnkaries
(θ
Die Erfindung betrifft Antikörper, diese enthaltende pharmazeutische Mittel zur Inhibierung von Zahnkaries
und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper.
Zahnkaries ist eine Krankheit, die sowohl bei Menschen als auch bei Tieren auftritt. Diese Krankheit
wird hauptsächlich auf der Zahnoberfläche durch
Karies erzeugende, orale Bazillen induziert. Diese Krankheit führt zu einer fortschreitenden Zerstörung
der Zahnstruktur. Von den verschiedenen Karies erzeugenden, oralen Bazillen scheint der Bazillus
Streptococcus mutans der wichtigste zu sein. So ist beispielsweise in dem Manual of Determinative
Bacteriology, Seite 502 (1974) von Bergy ausgeführt, daß eine Wechselwirkung zwischen Zahnkaries und
S.mutans besteht. Es wird die Vermutung ausgesprochen, daß S.mutans ein ähnlicher Organismus ist wie
S. salivarious. Obwohl S.mutans bis jetzt noch nicht
intensiv untersucht und mit S. salivarious verglichen
worden ist, so steht doch fest, daß S.mutans von S.salivarious dadurch klar unterschieden werden kann,
daß S.salivarious aus Rohrzucker Fruktose produziert,
während S.mutans aus diesem Disaccharid sowohl wasserlösliche und unlösliche dextranähnliche
Polysaccharide (im folgenden als DPS bezeichnet) produziert. Bekanntlich haften durch S.mutans produzierte
unlösliche DPS auf der Zahnoberfläche und führen zu
Zahnbelag (Zahnplaque). Der Hauptantail von S.mutans
in der oralen Flora befindet sich in dem Belag und produziert Milchsäure, von der angenommen wird, daß
sie.die Oberflächenstruktur der Zähne zerstört.
Auch andere Karies erzeugende, orale Bazillen produzieren Milchsäure. Jedoch wird die von S.mutans produzierte
Milchsäure nicht aus dem Belag freigesetzt, sondern
sammelt sich direkt auf der Zahnoberfläche an.
Die S. mutans-Stämme werden nach der von Bratthal 1 et al
vorgeschlagenen Klassifizierung in 7 serologische
Gruppen (Serotypen) aufgeteilt, die auf Basis der immunologischen Spezifizitäten ihrer ZeIlwandantigene
mit er bis £ bezeichnet werden [Bratthall , Odont.
Rev. 20:141, (1970) and ibid., 20: 23 (1970) and Perch et al, Acta. Path. Microbiol. Scand. Section
B, 82:357 (1974)]. Ein weiteres Klassifizierungsschema
für S. mutans-Stämme ist von Makoto Sato vorgeschlagen
worden. Nach diesem Klassifizierungsschema werden
S. mutans-Stämme als Human 1-(HI), Human II- (HII) oder Ratten-(R) Typ definiert. Folgendes wird von
Sato ausgeführt:
20
20
(a) Der Hauptanteil (96,3 %) des von menschlichen Wirten isolierten S. mutans ist vom Human I-Typ,
der Rest ist vom Human II-Typ,
(b) alle S. mutans-Stämme, die von Ratten abstammen, sind vom Ratten-Typ,
(c) von Mäusen und Meerschweinchen kann kein S. mutans
isoli ert werden,
(d) alle von Affen und Hamstern isolierten S. mutans-Stämme sind vom Human I-Typ,
(e) Human I, Human II und Ratten-Typen entsprechen jeweils dem £, e_ und f_, d^ und £, und a^ und b^-
Serotypen der Klassifizierung nach Bratthall
[J. of Dental Health, Vol. 28, No. 2, pages 100-123
(1978) in der japanischen Version], b
Es sind bereits immunologische Wege zur
Inhibierung der durch S. mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen beschrieben worden.
So beschreibt die GB-PS 1 375 866 beispielsweise
IO
eine Zahnvakzine, die als Antigen mindestens ein Teil der Zelle eines Karies erzeugenden Stammes von
S. mutans aufweist, wobei die Charakteristika dieses
Stammes dieselben sind, wie die Charakteristika von
Streptococcus mutans NCTC 10449, einem gut bekannten 15
repräsentativen Karies erzeugenden Stamm, der in der
Mundhöhle des Menschen vorhanden ist. Es ist jedoch noch nicht berichtet worden, da3 eine derartige
Vakzine zur wirksamen Inhibierung der durch S. mutans
induzierten Zahnkaries beim Menschen eingesetzt worden 20
wäre. Es ist zudem auch berichtet worden, daß die Verabreichung des ganzen , von S. mutans stammenden
Zellantigens an Tiere verschiedene ungewünschte Nebenwirkungen, bei spielsweise' eine Kreuzreaktion
mit dem Herzmuskel anti gen, allergische Reaktionen 25
und dergleichen, hervorruft.
Die GB-PS 1 505 513 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der die durch S. mutans
induzierte Zahnkaries bei Ratten inhibiert. Bei diesem 30
Verfahren wird eine Kuh mit hitze-inaktivierten
S. mutans-Zel1 en bestimmter Stämme immunisiert, um
die entsprechenden Antikörper in dem Körper der Kuh zu produzieren. Anschließend werden die erhaltenen
Antikörper aus der Kuhmilch gewonnen. Es wird vorge-35
schlagen, derartige Antikörper Menschen zu verabreichen, um Zahnkaries auf verschiedene Art und Weise zu
inhibieren, ohne dabei die zuvor genannten ungewünschten
Nebenwirkungen hervorzurufen. Die in dieser GB-PS 1 505 513 beschriebenen Mittel, die den
Antikörper enthalten, sind nicht geeignet, die durch S. mutans induzierte Zahnkaries beim
Menschen zu inhibieren, da sie einen hohen Anteil an Antikörper für Stämme vom Human-Typ enthalten.
Das in der GB-PS 1 505 513 beschriebene Verfahren zur Herstellung der Antikörper ist nachstehend
näher erläutert:
Kulturen von S. mutans AHT, BHT, 10449 und 6715 der serologischen Gruppen (Serotypen) a_, Jd, £ und c[
wurden in dialysiertem Tryptose-Medium gezüchtet,
Die Zellen wurden von der Kulturbrühe getrennt. Die Zellen wurden fünfmal mit 0,1 M phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung gewaschen und in einer ähnlichen Pufferlösung suspendiert. Die Zellen wurden durch
Erhitzen auf 60° C für 30 Minuten inaktiviert und resuspendiert, wobei die Endkonzentration von
S. mutans AHT, BHT, 10449 und 6715 5 χ 108 Zellen/ml
25
betrug. Dieses Präparat wurde zum Immunisieren von Kühen verwendet. Die Milch von Kühen, die aufgrund
dieser Immunisierung Antikörper enthielt, wurde gesammelt und getrocknet.
Die Menge der Antikörper in der getrockneten Milch, die
S. mutans AHT, BHT, 10449 und 6715 binden können, wurde wie folgt bestimmt:
AO
50 mg getrocknete Milch w urden iη 1 ml destilliertem
Wasser gelöst. 4 Sätze von Serien 2-fach Verdünnungen wurden in Kochsalzlösung durchgeführt. Zu jedem Satz
von VerdUnnungsröhrchen wurden durch Formalin getötete S. mutans AHT, BHT, 10449 oder 6715 in einer Konzen-
tration von 2 χ 10 Zellen/ml gegeben. Durch Bestimmung der Titer für den Agglutinations-Endpunkt der Proben
wurden die folgenden Antikörper-Titer erhalten:
Verwendetes Antigen | Serotypen | Antikörper-Titer |
AHT | a | 64 |
BHT | b | 1024 |
10449 | C | < 2 |
6715 | d | 256 |
Die folgenden Mittel wurden unter Verwendung der oben beschriebenen, getrockneten Milch hergestellt:
(a) Eine Mundspülung, die die getrocknete Milch verdünnt
mit Wasser (x 1-5) enthielt,
25
25
(b) ein Konfekt ohne Zucker, beispielsweise ein Kaugummi,
ein Bonbon oder eine Eiscreme mit einem Gehalt von mehr als 25 % an getrockneter Milch, und
(c) Standardreinigungsprodukte, Pulver oder Zahnpasten,
die mehr als 25 % dieser getrockneten Milch enthielten
M/25 156 -JBr-
Die getrocknete Milch wurde unter Verwendung junger
Ratten getestet. An diese Ratten wurde eine ο
Karies fördernde Diät verfüttert. Die Ratten wurden ferner mit S. mutans AHT, BHT und 6715 oral infiziert.
Die Inhibierung der Zahnkaries wurde bestimmt. S. mutans 10449 wurde in diesem Test nicht verwendet,
da in der getrockneten Milch zuvor keine Antikörper für diesen Stamm beobachtet wurden.
Die in der GB-PS 1 505 513 beschriebenen, Antikörper
enthaltenden Mittel sind in der Lage. S. mutans 6715
deutlich zu inhibieren. Dieser Stamm gehört zu der Io
Gruppe der Typ Il-Stämme, die in der Mundhöhle des Menschen gefunden werden. Da diese Mittel jedoch keine
Antikörper enthalten, die S. mutans NCTC 10449 (Serotyp £, Human I-Typ), der - wie zuvor ausgeführt - ein gut
bekannter Karies erzeugender Stamm in der Mundhöhle des Menschen ist, oder irgendeinen anderen Human I -Typ-Stamm
inhibieren können, können sie auch nicht als geeignet angesehen werden, um in Antikaries-Mitteln für Menschen
eingesetzt zu werden.
Bekanntlich haften orale Streptococci, wie S. mutans,
auf der Zahnoberfläche oder der Schleimhaut aufgrund
der haar-artigen Strukturen (fimbriae) auf der Oberfläche der Zellwand [Gibbons et al, Ann. Rev.
Microbiol., 29:19-44 (1975)]. Erfindungsgemäß wurde
3U
nun gefunden, daß Antigene, die aus den haar-artigen (pili-like) Strukturen von Human-Typ-Stämmen von
S. mutans (im folgenden als PLS Antigene bezeichnet) zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden können,
welche Human-Typ S. mutans inhibieren können. Aufgrund
signifikanter Unterschiede der serologischen Spezifizität
wird zwischen zwei PLS Antigenen unterschieden, die im folgenden als PLS Antigen I und PLS Antigen II bezeichnet
sind. Das PLS Antigen II kann aus Stämmen vom Serotyp <d
isoliert werden, während das PLS Antigen I aus den Stämmen irgendeiner der Serotypen £, £, f_ und £ isoliert
werden kann.
Gegenstand der Erfindung sind somit Antikörper zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten
Zahnkaries beim Menschen, die dadurch erhältlich sind,
daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man aus den haar-ähnlichen Strukturen auf der Zelloberfläche
der Stämme S. mutans der Serotypen c, e, f und
*~
£ isoliert, oder mit einem Antigen, das man aus den haar-ähnlichen Strukturen auf der ZeI1 oberfläche
der Stämme S. mutans des Serotyps d^ isoliert, oder mit beiden genannten Antigenen immunisiert und die
erhaltenen Antikörper von diesen Säugetieren gewinnt".
20
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern zur Inhibierung der durch
Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim
Menschen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein
25
Säugetier mit einem Antigen, das man aus den haarähnlichen -Strukturen auf der ZeI 1 oberfl äche der Stämme
von S. mutans der Serotypen £, es _f und £ isoliert,
oder mit einem Antigen, das man von den haar-ähnl ichen
Strukturen auf der ZeI1 oberfläche von Stämmen von 30
S. mutans des Serotyps ά_ isoliert, oder mit beiden
oben genannten Antigenen immunisiert und die erhaltenen Antikörper von dem Säugetier gewinnt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel zur Inhibierung der durch S. mutans induzierten Zahnkaries
beim Menschen, das eine wirksame Menge von Antikörpern zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger
und/oder Exhibienten enthält. Diese Antikörper wurden mit Hilfe von mindestens einem PLS Antigen erhalten.
Das PLS Antigen wurde von Streptococcus mutans NCTC 10449 isoliert. Diesen Stamm findet man bekanntlich
in der Mundhöhle des Menschen (Serotyp £, Human I-Typ).
,,- Der Proteingehalt des Antigens (nach dem Verfahren von
Hartree, unter Verwendung von Rinderserumalbumin als
Standard) und die Kohlenhydrate(nach dem Phenol/Schwefel säureverfahren
unter Verwendung von D-Glukose als Standard), wurden quantitativ bestimmt. Auch das
nr. Molekulargewicht wurde durch Gelfiltration unter Ver-Wendung
von Sephadex G-10 0 (Pharmacia Fine Chemicals AB., Schweden), wobei Phosphorylase Jb, Rinderserumalbumin,
Eialbumin, Chymotrypsinogen und dergleichen mit bekannten
Molekulargewichte als Standard verwendet wurden. Ähnliche Untersuchungen wurden auch unter Verwendung bestimmter
Stämme von S. mutans durchgeführt, die gut bekannte Vergleichsstämme darstellen, beispielsweise S. mutans
Ingbritt (Serotyp £) , 0MZ176 (Serotyp ά) , P4 (Serotyp ej,
0MZ175 (Serotyp f) und K1R (Serotyp c[). Es wurden folgende
3q Ergebnisse erzielt:
(1) Ein PLS Antigen ist ein saures Glycoprotein, das
etwa 15-25 % Protein (beispielsweise etwa 20 %) und
etwa 75-85 % Kohlenhydrate (beispielsweise etwa 80 %)
4 g5 enthält und ein Molekulargewicht von etwa 6 bis 9 χ
(beispielsweise etwa 75 000) besitzt.
A1»
(2) Polyacrylamid-Scheiben-Elektrophorese der PLS
Antigene führt zu einer charakteristischen breiten Bande
zur Kathode.
(3) Führt man mit einem PLS Antigen eine Ultrazentrifugation
mit einem Sukrosedichte-Gradienten durch, dann findet man das Antigen in den Fraktionen, die
eine Sukrosedichte von etwa 10-13 % und eine spezifische Schwere von eta 1,3-1,4 besitzen.
(4) Führt man eine Gelfiltration einer rohen PLS Antigen·
lösung unter Verwendung von Sepharcyl S-300 oder Sephadex G-100 (Pharmacia Fine Chemicals AB., Schweden) durch,
dann eluiert man zwei Peaks (überwacht durch Absorption
nn bei 280 nm). Das PLS Antigen gewinnt man aus dem ersten
Peak,
(5) Nach der Methode der isoelektrischen Focussierung
gemäß Versterberg et al unter Verwendung von 1 % des Carrier-Ampholyten (pH 3.5-10,0; Handelsprodukt von
LKB Produkter AB., Schweden) erhält man einen pl-Wert
für ein PLS Antigen von nicht größer als 3,5.
Zwischen den Fraktionierungsmustern der PLS Antigene*
g0 die von allen Human-Typ-Stämmen von S. mutans abstammen,
besteht kein signifikanter Unterschied.
5 Obwohl es gewünschtenfal 1s möglich ist, Antikörper zur
Inhibierung der Human Typ I- und -Il-Stämme zu verwenden,
welche mit Hilfe des PLS Antigens I oder des PLS Antigens II erhalten wurden, verwendet man vorzugsweise
Antikörper, die mit einer Kombination dieser Antigene gezüchtet wurden. Die gemeinsame Verwendung beinträchtigt
weder die Lagerfähigkeit noch die Wirksamkeit der PLS
Antigen I-Antikörper und der PLS Antigen II-Antikörper.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Antikörper können, wenn sie oral am Menschen verabreicht
werden, das Haften (Infektion) der Human-Typ-Stämme von S. mutans an den Zahnoberflächen inhibieren. Die
Inhibierung des .Haftens von S. mutans an den Zähnen führt zu einer Koagulation der Zellen der wilden Stämme
von S. mutans beispielsweise im Speichel. Die Zellen
sterben innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeit ab.
Es ist möglich, die koagulierten Zellen von S. mutans ohne Schwierigkeiten aus der Mundhöhle zu entfernen,
beispielsweise durch die Verwendung üblicher Zahnpasten,
Gurgelmittel, Putzmittel und dergleichen.
Es wurde gefunden, daß die orale Verabreichung einer wirksamen Menge von Antikörpern, die mit Hilfe
mindestens eines PLS Antigens kontinuierlich gezüchtet
on wurden, beispielsweise während mehreren Wochen, zu einem
völligen Verschwinden wilder Stämme von S. mutans aus der Mundhöhle führt.
Das Verfahren zur Herstellung der Antikörper kann man wie folgt durchführen.
Für die erfindungsgemäßen Zwecke können sowohl wilde
Stämme als auch Mutanten-Stämme vom Human-Typ S. mutans verwendet werden. Vorteilhafterweise verwendet man einen
Stamm, der über ein großes Haftvermögen verfügt. Den gewünschten Stamm kann man beispielsweise dadurch
leicht auswählen, daß man untersucht, wie stark der Stamm an einer Röhrchenwand in vitro haftet. In den
nachstehend beschriebenen Beispielen und Experimenten wurden zwei Mutanten-Stämme von S. mutans verwendet,
d.h. Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp (FERM-BP Nr. 317) und S. mutens KH2 (FERM-BP Nr. 366). Die
Charakteristika dieser Mutanten-Stämme sind im wesentlichen
dieselben, wie diejenigen der entsprechenden wilden Stämme, jedoch haften sie besser. Kulturen dieser Mutanten-Stämme
wurden bei der Hinterlegungsstelle Bikoken hinterlegt (The Fermentation Research Institute of Industrial Science
and Technology), und zwar am 5. März 1982 bzw. 23. Juli 1983.
Das Kultivieren kann man auf übliche Weise, vorzugsweise unter anaeroben Bedingungen durchführen. Gewünschenfal1s
ist es jedoch auch möglich, aerobe Kulturen einzusetzen. Es können sowohl synthetische als auch organische Medien
_ verwendet werden. Für die Massenvermehrung verwendet man vorzugsweise flüssige Medien. Somit kultiviert man
gewöhnlich bei einer Temperatur von 23-39° C (beispielsweise etwa 37° C) und bei einem pH von etwa 5,6-9,0
(beispielsweise etwa 7) während 24-72 Stunden. Nach 3_ Beendigung der Kultivierung trennt man die Zellen von
der Kulturbrühe ab, beispielsweise durch »'Zentrifugieren
(8 000 upm/5-20 Min.).
Die abgetrennten Zellen suspendiert man in einer geeigneten Lösung, beispielweise 0,1-1 M Essigsäure
und 0,1-1 M phosphatgepufferter 0,1-1 M Natriumchloridlösung
(pH 6-8), zu der man gewünschtenfal1s ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel gibt, beispielsweise
Triton X-100 (0,01 %-0,00Γ/Ο. Handelsprodukt
von^Rohm & Haas Co., USA). Die Zellensuspension behandelt man dann mit Ultraschallwellen (beispielsweise
10-20 KHz/5-20 Min.) um das gewünschte Antigen zu extrahieren. Elektronenmikroskopische Beobachtungen
haben gezeigt, daß es möglich ist, daß PLS Antigen 15
alleine durch den Einsatz einer hypertonischen Lösung zu extrahieren.
Statt der Behandlung mit Ultraschallwellen kann man auch
Ammoniumsulfat zu der ZeI1 suspension bis zu einer Sättigung von etwa 20-70 % (beispielsweise 60 %) geben.
Anschließend rührt man, um das Ammoniumsulfat zu lösen.
Die Mischung läßt man bei niedriger Temperatur (beispielsweise 4° C) 24-48 Stunden stehen, wobei sich ein
„._ Präzipitat bildet, daß das gewünschte Antigen enthält.
25
Nach Entfernen der überstehenden Flüssigkeit sammelt man die ausgefallene Fraktion und suspendiert dicht in einer
ähnlichen Pufferlösung (pH 6-8) und dialysiert gegen eine ähnliche Pufferlösung bei niedriger Temperatur (beispielsweise
4° C), um Ammoniumsulfat und dialysierbare Verun-3Ü
reinigungen zu entfernen. Die restliche Lösung sammelt man und zentrifugiert (beispielsweise bei 8 000 upm/20 Min.)
und erhält so eine extrahierte Lösung, die das PLS Antigen enthält.
Die erhaltene extrahierte Lösung, die das gewünschte
c PLS Antigen enthält, kann man fraktionieren und auf übliche
b
Weise reinigen, beispielsweise durch Säulenchromatographie,
nach der Ausfällungsmethode mit isoelektrischer Focussierung,
durch fraktionierte Präzipitation unter Verwendung
eines kalten Lösungsmittels, beispielsweise
Äthanol, durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und dergleichen. Diese Verfahren können alleine
oder in Kombination eingesetzt werden. Besonders gute Ergebnisse erzielt man mit der Zentrifugationsmethode
mit einem Dichtegradient.
Um eine Denaturierung des PLS Antigens zu vermeiden, führt man die Extraktion, Fraktionierung und Reinigung
vorteilhafterweise bei niedriger Temperatur, beispielsweise
unterhalb 10° C durch.
Die gereinigte PLS Antigen-Lösung kann man gewünschtenfalls
mit einem geeigneten Inaktivierungsmittel, beispielsweise
Formalin (0,2-0,02 %) behandeln. Anschließend
dialysiert man, um das Inaktivierungsmittel auf übliche
o_ Weise zu entfernen.
2b
2b
Die gereinigte PLS Antigen-Lösung verdünnt man dann, beispielsweise mit einer 0,5-1 M phosphat-gepufferten
0,5-1 M Natriumchloridlösung (pH 6-8) bis zu einer
Protein-N-Konzentration von 10-50 Mg/ml. Anschließend 30
gibt man Aluminiumhydroxid bis zu einer Endkonzentration
von Aluminium von etwa 100-500 Mg/ml zu, um das Antigen zu adsorbieren. Ein antiseptisches Mittel, beispielsweise
Thimerosal (0,05-0,1 % Gewicht/Volumen) kann man zu der
o_ Antigenlösung geben. Auf diese Weise erhält man eine
PLS Anti gen!ösung, die zur Immunisierung eines Säugetieres
geeignet ist.
M/25 156 -IA- °^Δ l H l l
Statt des Aluminiumhydroxids kann man zu der Antigenlösung
auch eine gleiche Menge des
Freund's complete adjuvant
geben. Man immunisiert in üblicher Weise, beispielsweise
indem man kleinere Säugetiere, z.B. Mäuse, Ratten und Meerschweinchen, oder größere Säugetiere, z.B. Kaninchen,
Ziegen, Schafe, Pferde und Rinder einsetzt. Die PLS Antigen-Dosis kann in Abhängigkeit von verschiedenen
Faktoren, beispielsweise dem verwendeten Säugetier,
variieren. Jedoch ist es im allgemeinen möglich, die
,,_ Anti gen-Lösung an kleinere Tiere in einer Dosis von
b
10-500 pg und an größere Säugetiere in einer Dosis von
100-200 yg (einmal täglich, berechnet als Protein N) durch Injektion, beispielsweise unter die Haut des
Tierrückens, verabreichen. Die Immunisierung kann man beispielsweise 2-5 Mal in einem Abstand von 2-5 Wochen
durchführen. Gewünschtenfal 1s kann man die Immunisierung
durch orale Verabreichung, beispielsweise einer 5-10fachen
Dosis, durchführen. Die Immunisierung kann man beispielsweise
3-12 Tage fortsetzen. So mischt man beispielsweise
für Kaninchen eine PLS Antigen-Lösung, die 100-200 pg
Protein N enthält, beispielsweise mit einer gleichen
Menge'des Freund's complete Adjuvant und injiziert auf einmal unter die Rückenhaut des Tieres an 2^5 Tagen
in einem Abstand von 2-5 Wochen.
Beispielsweise 10-14 Tage nach der letzten Immunisierung
sammelt man das Blut der Säugetiere auf übliche Weise, beispielsweise durdh Herzpunktion. Das Blut verwendet man
zur Herstellung von Plasma, das man gewünschtenfall s „_ weiter reinigen 'kann, um ein Antiserum zu erhalten. Das
erhaltene Pl.asma oder Antiserum kann man bei niedriger Temperatur für einen längeren 2eitraum aufbewahren und
kann man an Menschen ohne weitere Bearbeitung verabreichen
so
Gewünschtenfal 1s kann man ein Säugetier mit einer
Kombination der PLS Antigene I und II immunisieren,
5
obwohl man das Säugetier vorzugsweise entweder mit dem PLS Antigen II oder III alleine immunisiert. Das
Antigen I kann man von mehr als einem Stamm von S. mutans erhalten, wobei die Stämme dem gleichen
Serotyp oder unterschiedlichen Serotypen, ausgewählt
aus c_, £, f_ und £, angehören.
Die erfindungsgemäßen Mittel zur Inhibierung der Zahnkaries
bei Menschen enthalten als aktiven Bestandteil PLS
Antigen I-Antikörper oder PLS Antigen II-Antikörper
15
oder eine Kombination dieser Antikörper. Die Träger oder Excipienten, die in den erfindungsgemäßen Mitteln
verwenden werden können, können fest , halbfest oder flüssig sein. Die Mittel sind im allgemeinen feste,
halb-feste oder flüssige Mittel, die oral verabreicht werden können. Die Mittel können somit in Form von
Pulver, Kapseln, Granulaten, Tabletten, Tropfen, Sirupen, Suspensionen, Emulsionen und dergleichen vorliegen.
Beispiele geeigneter fester Träger sind Laktose, Kartoffel- oder lösliche Stärke, Magnesiumstearat, Ton und
25
Kieseiguhr. Geeignete flüssige Träger sind beispielsweise
Wasser, Kochsalzlösung, Glyzerin, Mandelöl, Getränke,
die Milchsäure produzierende Bazillen enthalten, und Säfte. Die Mittel können ferner gewünschtenfal 1s Bindemittel,
stabilisierende Mittel, Emulgatoren, Dispergier-30
mittel, anti septische Mittel, Konservierungsmittel,
Essenzen und verschiedene andere, üblicherweise verwendete
Additive enthalten. Bevorzugte Beispiele der erfindungsgemäßen Mittel sind Zahnreinigungsmittel, Gurgelmittel,
Bonbons, Kaugummi, Eiscremes und dergleichen. 35
Um eine gegebene Menge der erfindungsgemäßen Antikörper
ρ- an Menschen zu verabreichen, formuliert man die erfindungsgemäßen
Mittel einfach derart, daß sie beispielsweise
in Form von Tabletten, Kapseln, Ampullen, Pastillen oder dergleichen vorliegen. Die Menge der in einer derartigen
Dosiseinheit vorhandenen Antikörper kann in Abhängigkeit n von der Dosierungseinheitsform und der Verabreichungsart
variieren. Gemäß einer Ausführungsform enthält eine derartige Dosierungseinheit die erfindungsgemäßen
Antikörper in einer solchen Menge, daß damit 1-10 der nachstehend definierten Einheiten der Antikörper einmal
täglich verabreicht werden. Verschiedene Tests an Menschen und Hamstern haben gezeigt, daß Stämme von
S. mutans aus der Mundhöhle durch beispielsweise
kontinuierliche orale Verabreichung über mehrere Wochen der mit Hilfe mindestens eines PLS Antigens erhaltenen
Antikörper in einer täglichen Dose von 1-4 Einheiten
(wie nachstehend definiert) entfernt werden können.
über einen längeren Zeitraum, beispielsweise 6-12 Monate,
können die erfindungsgemäßen Antikörper kontinuierlich
in die Mundhöhle von Hamstern in großen Mengen verabreicht werden. Danach wurden alle Tiere auf Krankheitserreger
untersucht und für normal befunden.
In der vorliegenden Beschreibung wird die Einheit des n Antikörpertiters ausgedrückt durch den Präzipitationswert,
der nach der Doppeldiffusionsmethode unter Bezug auf
Goldman et al erhalten wurde [Isolation and Characterization of Glial Filaments from Human Brain,
J. Cell. Biol. , 78:426 (1978)].
In den folgenden Beispielen und Experimenten, die die Erfindung nicht begrenzen sollen, wurde die
Kultivierung bei 37° C unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, wobei man im Handel erhältliche Medien
bei ihren spezifischen pH's verwendete, soweit nichts Anderes angegeben ist.
Herstellung des Streptococcus mutans Mutanten-Stammes
K-Dp (FERM-BP Nr. 317):
Frische, wilde Stämme von S. mutans (Serotyp c_) wurden
aus der Mundhöhle eines Menschen isoliert und 24 Stunden unter Verwendung von Dott Heuwitt-Brühe kultiviert
(20 ml; Handelsprodukt von Baltimore Laboratories Inc.,
U.S.A., im folgenden als BBL bezeichnet). Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen von der
Kulterbrühe abzentrifugiert (8 000 u.p.m./20 Min.) und
dann 3 Mal mit 100 ml einer 0,75 M phosphat-gepufferten 1 M Natriumchloridlösung (pH 6,8) durch Zentrifugieren
(8 000 u.p.m./20 Min.) gewaschen. Die Zellen wurden in einer ähnlichen Pufferlösung (20 ml) suspendiert, die
20 % Stickstofflost in einer Konzentration von etwa
10 Lebendzelle pro ml enthielt. Die Lösung wurde bei 37° C gehalten, bis mehr als 90 % der Zellen getötet
worden waren (während etwa 60-90 Minuten). Die nicht getöteten Zellen wurden gesammelt und auf ähnliche Weise
wie oben beschrieben unter Verwendung von Dott Heuwitt-Brühe kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung überführt
man die Kulturbrühe mit einer Plat inöse zu einem
TYC Agarplattenmedium [Stoppelaar et al, Archs, Oral
Biol., 12:1190-1201 (1976)] und kultiviert 24 Stunden. Die Kulturbrühe läßt man bei Raumtemperatur 24 Stunden
stehen, um Kolonien auszuwählen, die große Mengen unlösliche DPS produzieren können. Gewünschtenf all s kann man das oben
erwähnte Verfahren wiederholen, bis man einen Stamm erhält, der eine besonders hohe Herstellkapazität von
unlöslichen DPS besitzt. Der erhaltene Stamm wurde als
Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp bezeichneten. IO
Dieser Mutanten-Stamm wurde oral über einen längeren Zeitraum an Hamster verabreicht und unter Verwendung
verschiedener bekannter Medien weiterkultiviert, um zu
bestätigen, daß dieser Stamm ein außerordentlich hohes
Haftvermögen besitzt und daß seine Charakteristika
15
genetisch stabil sind.
Herstellung von Streptococcus mutans Stamm KH2 (FERM-BP Nr. 366).
Frische wilde Stämme von S. mutans (Serotyp d^) werden
aus der Mundhöhle eines Menschen isoliert und auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt,
um einen Mutanten-Stamm mit einem sehr großen Haftvermögen und genetisch stabilen Charakteristika zu
erhalten. Der erhaltene Mutanten-Stamm wurde mit Streptococcus mutans Stamm KH2 bezeichnet.
Herstellung von Antikörpern unter Verwendung des PLS Antigens I, das aus dem S. mutans Mutanten-Stamm
K-Dp isoliert wurde.
Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp (FERM-BP Nr. 317) 3g kultiviert man unter Verwendung eines Impfmediums (500 ml),
das Polypepton (1,7 %, Wako, Japan), Polypepton S (0,3 %;
Wako, Oapan), Hefeextrakt (0,5 %; Difco., USA), Kaliumphosphat,
dibasisches (0,25 %) Natriumchlorid (0,25 %)
und Glukose (0,25 %) enthält und einen pH von 7,0-7,8 besitzt. Nach Beendigung der Kultivierung wird die
Kultur in ein Hauptmedium (15 000 ml) überführt, das dieselbe Zusammensetzung besitzt, wie das Impfmedium.
Man kultiviert 24 Stunden bei denselben Bedingungen. Nach Beendigung der Kultivierung gibt man Ammoniumsulfat
zu der Kulturbrühe bis zu einer Sättigung von 33 % und löst durch Rühren. Die Mischung läßt man bei Raumtemperatur
24 Stunden stehen, entfernt die überstehende Lösung von der Mischung und zentrifugiert die präzipitierte
Fraktion 8000 U.p.M./30 Min.) ab und suspendiert in einer 1 M phosphat-gepufferten 0,1 M Natriumchloridlösung
(750 ml; pH 8,0). Die Zeil suspension läßt man 72 Stunden bei 4° C stehen, wobei man langsam mit 1-5
U.p.M. rührt. Die Suspension zentrifugiert man dann (8 000 U.p.M./30 Min.), um die Zellen zu entfernen,
und gibt Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit
bis zu einer Sättigung von 60 %. Das Ammoniumsulfat löst man unter Rühren, läßt die Mischung 48 Stunden bei 4° C
stehen, wobei sich das gewünschte Antigen enthaltende Präzipitat bildet, entfernt die überstehende Flüssigkeit
von der Mischung und zentrifugiert die präzipitierte
Fraktion (8 000 U.p.M./30 Min.). Das gewonnene Material suspendiert man in einer phosphat-gepufferten Natriumchloridlösung
(100 ml) die der oben beschriebenen ähnelt, gibt die erhaltene Suspension in ein Cellophanröhrchen
dialysiert mehr als 48 Stunden bei 4° C gegen eine·ähnliche
Pufferlösung (mehr als 5 000 ml), um Ammoniumsulfat und
dialysierbare Verunreinigungen zu entfernen. Die restliche
Lösung zentrifugiert man (8 000 U.p.M./30 Min.) und
sammelt die überstehende Flüssigkeit. 35
M/25 156 -21Γ-
Die überstehende Flüssigkeit (300 ml) verdünnt man mit
einer ähnlichen phosphat-gepufferten Natriumchloridlösung
mit einer Protein N-Konzentration von 100 pg/ml . Die
verdünnte Lösung (200 ml) unterwirft man einer Ultrazentrifugation
mit einem Sukrose-Dichte-Gradienten (Sukrose-Dichte 5-30 %·, 35 000 U.p.M./18 Stunden) unter
Verwendung einer 65P Ultrazentrifuge mit einem Zonenrotor
235T (im Handel erhältlich von Hitachi Limited, Tokyo). Das gewünschte Antigen findet man in den Fraktionen mit
einer Sukrose-Dichte von etwa 10-13 % und einer spezifischen Schwere von 1,31-1,35. Die Menge an Protein N
des gewünschten PLS Antigens beträgt dabei etwa
_,_ 33-37 Mg/ml. Die erhaltene, extrahierte, das gewünschte
Ib
Antigen enthaltende Lösung gibt man in ein Cellophanröhrchen
und konzentriert, um die Menge auf 1/10 durch die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon zu reduzieren.
Die konzentrierte Lösung verdünnt man dann mit einer 0,75 M phosphat-gepufferten 1 M Natriumchloridlösung
(pH 6,2-6,5) bis zu einer Konzentration von Protein N von 50-100 yg/ml. Zu der verdünnten Lösung gibt man dann
eine gleiche Menge von Freund's complete adjuvant, um
eine Antigen-Lösung zu erhalten, die zum Immunisieren eines Säugetieres verwendet werden kann.
Die erhaltene, aus Haarbestandteilen gewonnene Antigen-Lösung
(1,0 ml) injiziert man auf übliche Weise unter die Rückenhaut von Kaninchen mit einer Körpergewicht
von etwa 3 kg. Eine ähnliche Immunisierung führt man insgesamt 3 Mal in einem Abstand von 4 Wochen durch.
4 Wochen nach der letzten Immunisierung tötet man die
Tiere durch Herzpunktion und entnimmt den Tieren das Blut, zu dem man Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung
O1_ von 33 % gibt. Zum Lösen des Ammoniumsulfats rührt man
ob
das Blut und läßt dann 48 Stunden bei 4° C stehen.
Das Präzipitat zentrifugiert man ab (8 000 U.p.M./20 Min.),
gibt es in ein Cellophanröhrchen und dialysiert bei
3477477
M/25 156 -€-[- ΟΗΔ I ^ I ι
4° C gegen gereinigtes Wasser, um das Ammoniumsulfat
_ vollständig zu entfernen. Die verbleibende Lösung 5
sammelt man, konzentriert und gefriergetrocknet, um
eine Antikörper enthaltende Lösung (etwa 85 ml) zu erhalten.
_ Beispiel 4 10 Herstellung von Antikörpern unter Verwendung des von
S. mutans KH2 isolierten PLS Antigens
Man kultiviert Streptococcus mutans KH2 (FERM-P Nr. 366, Serotyp dj wie im Beispiel 3 beschrieben und behandelt
1^ in ähnlicher Weise, wobei man eine Antikörper enthaltende
Lösung (etwa 85 ml) erhält.
Man stellt einen "baccal" in üblicher Weise unter Verwendung von Glukose (1 g), einer Antikörper enthaltenden
Lösung (0,05 ml; PLS Antigen I-Antikörper oder PLS Antigen II-Antikörper oder eine Kombination derartiger
Antikörper) und löslicher Stärke (0,05 g) her.
Man stellt einen Sirup in üblicher Weise unter Verwendung von Carboxymethylzel1ulose (CMC-Na; 0,2 g), einer 20 %igen
Fruktoselösung (20 ml), Ethyl paraffin (0,04 g) und einer
Antikörper enthaltenden Lösung (0,1 ml; PLS Antigen I-Antikörper oder PLS Antigen II-Antikörper oder eine
Kombination derartiger Antikörper) her.
M/25 156 -22- OH
Man stellt eine Zahnpasta her, indem man Kaiziumhydrogenphosphat
(feines Pulver; 60 %), Glyzerin (30 %), CMC-Na (10 %) und Parabens (antiseptisches Mittel;
0,25 g) gut mischt und Antikörper zu der Mischung gibt (PLS Antigen I- oder PLS Antigen I I-Antikörper oder eine
Kombination derartiger Antikörper), so daß der Antikörper-Titer 2 Einheiten (wie zuvor definiert) pro 50 ml Produkt
beträgt.
Man stellt einen nicht-karieserzeugenden Trank, der Milchsäure produzierende Bazillen enthält, auf folgende Weise
her. Magermilch (2 000 ml), die 10 % Feststoffe enthält, sterilisiert man 15 Minuten bei 110° C, gibt dann
Lactobacillus casei zu und kultiviert 36 Stunden bei 35-37° C. Zu der Kulturbrühe gibt man eine 10 %ige
Fruktoselösung, um die Konzentration von L. casei auf
10 Lebendzellen/ml einzustellen. Die gegen..PLS Antigen I
und II gezogenen Antikörper gibt man zu dieser Lösung und stellt die beiden Titer der PLS Antigen I-Antikörper
und PLS Antigen II-Antikörper auf 4 Einheiten (wie hier
definiert) pro 50 ml des erhaltenen Produkts ein.
In den folgenden Experimenten wurden Mittel eingesetzt, die gleiche Titer an Antikörpern enthielten, welche mit
den PLS Antigenen I und II erhalten und nach den in den
° oben aufgeführten Beispielen beschriebenen Verfahren
hergestellt worden waren. Diese Mittel wurden verwendet, um die Inhibierung des Anhaftens Karies erzeugender
S. mutans zu untersuchen. Als Testtiere dienten, soweit
nichts anderes angegeben ist, weibliche und männliche Hamster. Jede Gruppe bestand aus 5 Tieren.
M/25 156 -£3-
r Experiment 1
ο
21 Tage alte Hamster wurden als Testtiere verwendet. Es wurden 4 Gruppen gebildet, wovon die erste und die
zweite Gruppe als Testgruppen und die dritte und vierte Gruppe als Kontrol1 gruppen dienten. Streptococcus mutans
Mutanten-Stamm K-Dp (FERM-BP Nr. 317) und Streptococcus mutans KH2 (FERM-P Nr. 366) wurden 24 Stunden bei einem
pH von 7,5-7,8 getrennt unter Verwendung von Tryptocase Soja Brühe (Handelsprodukt von BBL., USA) kultiviert.
Die Kulturbrühe, die etwa 10 Lebendzellen des K-Dp-Stammes
pro ml enthielt, wurde an jedes Tier der ersten und dritten Gruppe oral in einer Dosis von 0,1 ml 5 Tage
einmal täglich verabreicht. In ähnlicher Weise wurde der KH2-Stamm an jedes Tier der dritten und vierten Gruppe
verabreicht. Es wurde festgestellt, daß die Stämme von
S. mutans an den Zähnen sämtlicher Tier hafteten. Dann wurde eine nach dem Verfahren des Beispiels 7
hergestellte Zahnpasta (0,1 g pro Tier; enthielt gleiche Titer der PLS Antigen I-und PLS Antigen II-Antikörper)
auf die Oberfläche der Backenzähne jedes Tiers der ersten und zweiten Gruppe mit einer kleinen Bürste kräftig
verrieben. Diese Behandlung wurde 14 Tage einmal täglich durchgeführt.
Während des 60tägigen Testzeitraums wurden alle Tiere
mit einer Karies erzeugenden Diät (Diet 2000, Handelsprodukt von Funabashi Nojo, Japan) und deionisiertem Wasser
ad libitum gefüttert. Nach unterschiedlichen Zeiträumen
wurden Proben von den Oberflächen der Backenzähne jedes Tieres entnommen. Jede Probe wurde 72 Stunden unter Ver-Wendung
eines TYC Agarplatten-Mediums (15 ml, pH 7,4;
Stoppelaar et al) und eines Mitis-Salivarius Agarplatten-Mediums
(15 ml, pH 7,4; Handelsprodukt von Difco.; USA) kultiviert, um das Haften von S. mutans zu untersuchen.
M/25 156 -24-
Es wurde gefunden, daß die S. mutans-Konzentration in
der Mundhöhle jedes Tieres der ersten und dritten Gruppe b
nach Verabreichen der Antikörper graduell abnahm. Die S. mutans-Stämme verschwanden von einem Teil der
Tiere nach 2-4 Wochen und von den übrigen Tieren nach 4-7 Wochen. In der oralen Flora jedes Tiers der Kontrollgruppen
wurde keine Konzentrationsabnahme von S. mutans beobachtet. Nach Testende wurden alle Tiere durch
Injektion von Pentabarbitol anästhisiert. Den Tieren
wurde die Maxilla entnommen. Der weiche Teil der Maxilla wurde durch ein 1-2minütiges Behandeln in einem Autoklaven
bei 120-125° C entfernt. Die Maxilla wurde mit Wasser 15
gewaschen und getrocknet, um eine Zahnprobe herzustellen.
Alle Backenzähne sämtlicher Tiere wurden untersucht, um den Grad der Infektion ('Haften ) mit S. mutans und
das Ausmaß der Induktion von Zahnkaries verglichen mit der Zahl kariöser Zähne zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt,
Gruppe Verwendete Serotyp des Anti körper S. mutans
1 I und II c
2 I und II d
3 unbehandelt c
4 unbehandelt d 30
Gruppe
1
1
2
3
3
77,2 | 20 | 7 | ,5 |
74,2 | 0 | 0 | |
77,4 | 90 | 65 | |
74,0 | 70 | 34 | .2 |
Es bedeuten: A ... Gewichtszunahme (durchschnittlicher
Prozentsatz; das Körpergewicht vor Beginn der Verabreichung betrug 100 %)
B ... Infektionsgrad (alle Backenzähne = 100 %)
C ... Ausmaß der Karies (alle Backenzähne
= 100 %).
Experiment 2
Die Konzentrationsveränderung der Stämme von S. mutans in der Mundhöhle von Menschen aufgrund der Verwendung
der in Beispiel 7 beschriebenen Zahnpasta (enthielt gleiche Titer der PLS Antigen I- und PLS Antigen II-Antikörper)
wurde untersucht. Als Testpersonen wurde zehn Erwachsene (5 Männer und 5 Frauen) bestimmt..
Aus der Mundhöhle jeder Versuchsperson wurde dreimal Zahnbelag (Zahnplaque) entnommen. Die Proben wurden in
ähnlicher Weise wie im Experiment 1 beschrieben kultiviert.
Zudem wurde die Bildung von Zahnbelag und Zahncysten in der Mundhöhle untersucht. Es wurde dabei so vorgegangen
wie beschrieben in: "The guide line of the procedure of smearing fluoride" (herausgegeben von The Japanese
Ministry of Welfare and Health). Die Ergebnisse bestätigen,
daß bei allen Versuchspersonen Stämme von S. mutans vorhanden waren. Täglich nach dem Frühstück und dem Abendessen
wurde die Zahnpasta von allen Testpersonen zum Reinigen ihrer Zähne verwendet. Die Anwendungart wurde nicht
spezifiziert. Mindestens einmal wöchentlich wurde Zahn-
belag aus der Mundhöhle jeder Versuchsperson entnommen und in ähnlicher Weise wie oben beschrieben kultiviert,
um die Konzentrationsveränderung der Stämme von Streptococcus mutans in der oralen Flora zu bestimmen.
Fast alle Stämme von S. mutans waren bei 3 Testpersonen nach etwa 2-3 Wochen und bei den übrigen Versuchspersonen
nach etwa 4-6 Wochen verschwunden. Die OHI-Werte aller Versuchspersonen, die unter Verwendung von Erythrosin
bestimmt wurden,nahmen während des Testzeitraums
signifikant ab.
Ein nach dem Verfahren des Beispiels 5 hergestellter
"baccal", der sowohl PLS Antigen I- als auch PLS Antigen II Antikörper enthielt,wurde an jede Versuchsperson einer
Testgruppe von 20 erwachsenen Frauen verabreicht. Die Konzentrationsänderung von Strepctococcus mutans in
deren Mundhöhlen wurde bestimmt. 19 Frauen waren Wirte von S. mutans vom Serotyp £, während nur 1 Frau als Wirt
von S. mutans vom Serotyp <d diente.
Jeden Tag wurde kurz vor dem Schlafengehen ein Mundwasser
(baccal) oral an jede Versuchsperson der Testgruppe verabreicht. Das Mundwasser wurde solange wie möglich
in der Mundhöhle gehalten. Zwei Wochen nach Beginn der Verabreichung konnten bei 5 Versuchspersonen der Testgruppe
kein S. mutans isoliert werden. Die Konzentration von S. mutans in der oralen Flora der übrigen Versuchspersonen
nahm graduell so ab, daß die S. mutans-Konzen- -,-tration in deren Mundhöhlen etwa 4 Wochen nach Verabreichungsbeginn
sehr niedrig war. Die OHI-Werte aller Versuchspersonen nahmen während des Testzeitraums
sehr stark ab.
Es wurde gefunden, daß die inhibierende Wirkung, die
durch Verabreichung von Mundwassern erzielt wurde, zumindest gleich groß oder stärker war als die Wirkung
einer Zahnpasta, da das Mundwasser in der Mundhöhle länger verweilte als die üblichen Zahnputzmittel.
Claims (16)
1. Antikörper zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen,
dadurch erhältlich, daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man
aus den haar-ähnlichen Strukturen auf der Zelloberfläche
der Stämme S. mutans der Serotypen £, £, Jf und
£ isoliert, oder mit einem Antigen, das man aus den haar-ähnlichen Strukturen auf der ZeI1oberflache
der Stämme S. mutans des Serotyps d_ isoliert, oder
mit beiden genannten Antigenen immunisiert und die erhaltenen Antikörper von diesen Säugetieren gewinnt.
2. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten
Zahnkaries beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man aus
den haar-ähnlichen Strukturen auf der Zelloberfläche
der Stämme von S. mutans der Serotypen £, e_, f_ und £
isoliert, oder mit einem Antigen, das man von den haar-ähnlichen Strukturen auf der ZeI1oberf1äche
von Stämmen von S. mutans des Serotyps _d isoliert, oder mit beiden oben genannten Antigenen immunisiert
und die erhaltenen Antikörper von dem Säugetier gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die beiden Antigene saure Glyko-Proteine sind, die etwa 15-25 % Proteine und etwa 75-85 % Kohlenhydrate
enthalten und ein Molekulargewicht von etwa
60 000 bis 90 000 und einerspezifisehen Schwere von
etwa 1,3 bis 1,4 besitzen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutanten-Stamm von
S. mutans verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem Mutanten-Stamm um den Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp
(FERM-BP Nr. 317) handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem genannten Mutanten-Stamm um den Streptococcus mutans Stamm KH2 (FERM-BP Nr.366)
handelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch
gekennzeichnet, daß man das gewünschte Antigen oder die gewünschten Antigene durch Extraktion mit
hypertonischer Kochsalz- oder Pufferlösung und an-A schließender Zentrifugierung unter Einhaltung eines
Dichtegradienten isoliert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung bei einer Temperatur von
nicht höher als 10° C durchführt.
9. Mittel zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens einen der.Anti körper
gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten enthält.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es oral verabreicht werden kann.
11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Form von Kaugummis, Bonbons, Eiscreme, 20
Sirupen, Säften und Drinks vorliegt, die Milchsäure produzierende, lebende Bazillen enthalten.
12. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Form von Zahnputzmitteln, Gurgelmitteln
25
oder Pasten vorliegt.
13. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Form von Tabletten oder Pastillen vorliegt,
14. Streptococcus mutans-Mutanten-Stamm K-Dp (FERM-BP
Nr. 317) unddie Mutanten davon.
M/25 156 -4- 3427477
15. Streptococcus mutans-Mutanten-Stamm KH2 (FERM-BP Nr. 366) und Mutanten davon.
16. Verwendung der Antikörper gemäß Anspruch 1 zur Inhibierung der Zahnkaries beim Menschen.
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