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Beschreibung zu der Patentanmeldung Mittel mit Antikarieswirkung,
dessen Herstellung und Verwendung Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß der Zahnzerfall
eine natürliche folge von Mundbakterienprozessen (Streptococcus mutans) ist0 Insbesondere
ist bekannt, daß die S. mutans an die Zahnschmelzoberfläche der Zähne anhaften und
daß unter entsprechenden Bedingungen von Temperatur, Acidität und Bakteriennährstoff-Verfügbarkeit
eine Kolonisation erfolgt, wobei die Bakterienkolonie dann ihrerseits die eigentliche
Kariesbildung erst im Zahnschmelz und dann in der Zahnstruktur verursacht.
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Es ist bekannt, Bakterien in Kontakt mit Antikörper zu bringen, die
das Wachstum der Bakterienkolonien hemmt. Wichtig ist dabei meist, dass der Antikörper
regelmässig, vorzugsweise täglich, angewendet werden sollte, um ein wirksames Mittel
gegen die Vermehrung von Streptococcus mutans darzustellen.
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Die Gewinnung von Streptococcus mutans stellt kein Problem dar, weil
diese Bakterienart im Mund der meisten Menschen vorhanden ist und lediglich Ausmass
oder Grad der natürlichen Widerstandsfähigkeit gegen die Bakterien unterscheiden
sich von Individuum zu Individuum. Unter geeigneten Umgebungsbedingungen läuft die
Kolonienbildung mit rascher Geschwindigkeit.
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Es ist bekannt, dass Antikörper gegen Streptococcus mutans in Serumform
aus den meisten Tieren gewonnen werden können.
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Zur Gewinnung eines Serum-Antikörpers wird häufig mit Kaninchen und
Pferden gearbeitet.
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Es ist auch bekannt, dass die Kühe wirksame Systeme zur Erzeugung
von Antikörpern auf Antigene darstellen, die diesen Tieren durch Injektion verabreicht
wurden. Speziell für Kühe gilt, dass nicht nur Serum-Antikörper, sondern auch Milch
erzeugt wird, welche die gleichen Antikörper wie das Serum enthält. Tierserum ist
kein normalerweise als Lebensmittel anzusehendes
Produkt, wohingegen
Kuhmilch ein Lebensmittel darstellt.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis der Tatsache,
dass die Kühe grosse Mengen spezifischer Antikörper gegen Streptococcus mutans in
Form einer gerne genommenen Nahrung bilden können, die ohne Schaden konsumiert werden
kann und die Kariesbildung inhibiert.
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Die Erfindung bietet ein Verfahren zur Erzeugung eines Milch produkts,
das Antikörper gegen Streptococcus mutans enthält und zur Inhibierung von Zahnkaries
auf die Zähne aufgebracht werden kann. Als Produkt kann ein völlig natürliches Nahrungsmittel
gewonnen werden, das Antikörper enthält, welche die Kariesbildung hemmen.
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Es wurde gefunden, dass durch Immunisieren von Kühen mit einem Streptococcus
mutans-Antigen, insbesondere zu bestimmten Zeiten des gestativen Zyklus der Kuh,
Kühe in ihrer Milch Antikörper gegen das Antigen erzeugen. Die Tatsache, dass der
Antikörper in dem natürlichen Nahrungsmittel enthalten ist, macht diese Form der
erfindungsgemäss erhältlichen Zubereitung zu einem besonders ansprechenden wirksamen
Produkt.
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Die genaue Technik der Immunisierung von Kühen zur Erzeugung spezifischer
Antikörper ist in der Veterinärkunde bekannt.
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Allgemein werden Kühe in zwei Stufen immunisiert. In der ersten Stufe
werden meist vier Injektionen intramuskulär in Wochenabständen verabreicht. In der
zweiten Immunisierungsstufe werden intramuskuläre Injektionen mit fünfzehntägigen
Zwischenräumen gegeben. Die Einzelheiten der Immunisierungstechnik sind bekannte
fachmännische Massnahmen. Für das erfindungsgemässe Verfahren können Stämme von
Streptococcus mutans verwendet werden, die nach üblichen Arbeitsmethoden kultiviert
worden sind. In der Praxis können Kulturen von S. mutans AHT (serologische Gruppe
a), BHT (Gruppe b), 10449 (Gruppe c) und 6715 (Gruppe d) in dialysiertem Tryptosemedium
zum Wachsen gebracht, die Zellen dann durch Zentrifugieren bei 4000 x g gesammelt
und fünfmal mit 0,1 m phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, gewaschen werden.
Die Zellen können dann durch Erhitzen während 30 min auf 600C inaktiviert und für
eine Endkonzentration an S. mutans AHT, BIIT, 10449 und 6715 von 5 x 10 Zellen pro
ml erneut suspendiert werden. Diese Zubereitung wird beispielsweise zum Immunisieren
von zwei Kühen wie folgt verwendet. Jede Kuh wurde in zwei gesonderten Behandlungen
mit frischem Antigen aus allen vier Gruppen von S. mutans (Gruppen a, b, c und d)
immunisiert. Dann wurde eine Kuh nach den üblichen Methoden zur Erzeugung von Milchprodukt
immunisiert. Nach der Immunisierung wurden Blutproben der Kuh genommen,
bis
der Serum-Antikörper-Titer seinen Höchstwert erreicht hatte, und darauf die Milch
gesammelt. Die Milch wurde nach üblichen Methoden zur Herstellung von Milchpulver
getrocknet und pulverisiert, das in diesem Fall Antikörper gegen Streptococcus mutans
enthält. Tatsächlich wurde ein Kuhmilch-Immunoglobulin erzeugt. Dieses Produkt kann
dann beispielsweise als Basiskomponente für eines der folgenden Konsumentenprodukte
verwendet werden: (a) Die Trockenmilch selbst kann mit 1-5 gleichen Teilen Wasser
zur Bildung eines Mundspülmittels verdünnt werden.
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Das undspülittel wirkt einfach dadurch, dass man den Mund täglich
damit spült und dadurch die Bildung von Streptococcus mutans-Kolonien auf der Zahnschmelzoberfläche
inhibiert.
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(b) Das Produkt kann einer zuckerfreien Süssware, z. B. in Form eines
Kaugummis, Bonbons oder einer Eiscreme oder einer anderen Nahrungsmittelform, einverleibt
werden, indem man erhebliche prozentuale Anteile Immunoglobulin in das Produkt einarbeitet,
beispielsweise 25 % oder mehr.
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(c) Das Immunoglobulin kann in übliche Zahnreinigungsmittel, z. B.
Pulver oder Zahnpasten, eingearbeitet werden, wie sie von Zahnärzten verwendet oder
im Handel verkauft werden. Empfehlenswert ist ein prozentualer Anteil von mindestens
25
% Milch-Immunoglobulin als Zusatz zu bekannten Handelsprodukten, was deren Wirksamkeit
erheblich verbessert.
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(d) Tatsächlich ist die rekonstituierte Milch in und von sich zur
Inhibierung der Bildung von Kolonien von Streptococcus mutans wirksam, d. h. durch
einfaches Trinken der Milch kommt es zu einem für eine wirksame Behandlung ausreichenden
Kontakt zwischen den Zähnen und dem Immunoglobulin.
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Die Erfindung ist primär auf die Erzeugung des Milch-Immunoglobulins
und die Anwendung des Milch-Immunoglobulins auf die Zahnoberfläche gerichtet. Das
Milch-Immunoglobulin kann aber auch über den Verdauungstrakt vom Blut aufgenommen
und dann über den Blutstrom an die Mundhöhle abgegeben werden. Auch dies ist eine
Möglichkeit, um die Antikörper der eingenommenen Milch wirksam gegen Kariesbildung
auszunützen.
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Zusammenfassend lasse sich aufgrund der bisher ermittelten Daten sagen,
dass das erfindungsgemäss erzeugte Milch-Immunoglobulin Antikörper gegen Streptococcus
mutans enthält und dass diese Antikörper, wenn sie in Kontakt mit den Zähnen gebracht
werden, das Wachstum von Streptococcus mutans und damit auch den Zahnzerfall inhibieren.
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Zur Durchführung entsprechender Tierversuche wurde wie folgt gearbeitet:
Trächtige Rattenmuttertiere (COBS/CD-Stamm) wurden von den Charles River Laboratories
(Wilmington, Nass.) beschafft. Jedes Muttertier wurde in einem sterilen Käfig gehalten
und mit sterilem Wasser versorgt. Zur Unterdrückung der Bakterienflora wurde eine
genau definierte Diät verwendet, die ausgewählte Antibiotika enthielt. Nach der
Geburt wurde jeder Wurf auf neun Jungtiere pro lluttertier reduziert. Entsprechend
der Arbeitsvorschrift wurden alle Würfe in drei Gruppen (A, B und C) geteilt. Jede
Gruppe enthielt fünf Würde mit neun Jungtieren pro Wurf oder insgesamt fünfundvierzig
Jungtiere pro Gruppe. Nach der Entwöhnung (neunzehn Tage nach der Geburt) wurden
die Jungtiere mit einer völlig definierten kariesfördernden Nahrung (siehe Tabelle
I) gefüttert. Die Ratten der Gruppe A erhielten die Nahrung mit Immunmilch, während
die Gruppen B und C die entsprechende Nahrung mit "Carnation"-Trockenmilch erhielten.
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Milch-Antikörpergehalt: Der Gehalt an Anti-S. mutans Antikörper in
entfetteter getrockneter Milch aus Kuh (1222) wurde jeweils wie folgt bewertet:
50 mg Trockenmilch wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und zu vier Sätzen
von zweifachen Reihenverdünnungen mit Salzlösung angesetzt. Jedem Satz Verdünnungsrohre
wurde mit Formalin getötetes S. mutans AHT, BHT,
10449 oder 6715
in einer Konzentration von 2 x 108 Zellen pro ml zugesetzt. Die Rohre wurden zur
Durchmischung geschüttelt und 4 Std. bei 370C inkubiert. Die Endpunkt-Agglutinations-Titerwerte
wurden aufgezeichnet und die Rohre während 24 Std.
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bei 4 0C nochmals inkubiert, wonach die Titerwerte erneut aufgezeichnet
wurden.
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Kariesbewertung: Am Ende des Experiments (nach zweiundvierzig Tagen)
wurden die Ratten gewogen und mit Hilfe einer Guillotine durch Köpfen getötet. Die
Köpfe wurden zur Lockerung der weichen Gewebe 5 min im Autoklav behandelt. Die Kinnbacken
wurden herauspräpariert, gereinigt und mit 0,4 9O Murexid in 70 % Alkohol angefleckt.
Nach dem Anflecken wurden die Molaren mit einem Zahnbohrer in zwei Hälften zerschnitten
und die kariösen Befallsstellen nach der Arbeitsweise von Keyes (9) bewertet. Bisher
wurden nach diesem Versuch insgesamt fünfzehn Ratten pro Gruppe analysiert. Die
Bewertungsergebnisse jeder Rattengruppe wurde statistisch durch Berechnen, Standardabweichungen
und Standardfehler reduziert. Die Unterschiede der Mittelwerte wurden durch Varianz
analyse und Vergleich des Mehrfachen der Titerwerte nach dem Duncan-Test bewertet.
Versuchsablauf
| Tag |
| -21 0 19 25 45 |
| Geburt entwöhnt Provokation Tötung |
| Mutter- |
| tiere Trächtigkeit Säugezeit |
| Futter: gereinigte Nahrung Nr. 425 |
| Jungtier- S. mutans AHT, |
| gruppen BHT, 6715 |
| A ernährt mit gereinigter Nahrung Nr. 305 |
| mit Immunmilch |
| S. mutans AHT, |
| BHT, 6715 |
| B ernährt mit gereinigter Nahrung Nr. 305 |
| mite "Carnation"-Milch |
| keine |
| C ernährt mit gereinigter Nahrung Nr. 305 |
| mit "Carnation"-Milch |
rgebnisse: Milch-Antikörper-Titerwerte. Als Ergebnis verschiedener
Doppeltitrationen wurden die folgenden Resultate erhalten: Immunmilch-Titer Verwendetes
Antigen (Kuh 1222) 5. mutans AHT 64 5. mutans BHT 1024 5. mutans 10449 42 5. mutans
6715 256 S. sanguis 0 Wie zu erkennen, zeigten drei der vier Stämme signifikante
Agglutinintiter, doch konnten keine Antikörper gegen S. mutans 10449 (Gruppe c)
gefunden werden. Aus diesem Grunde wurden die Jungratten durch Infektion mit virulentem
S. mutans AHT, BHT und 6715 (siehe Versuchsablauf) provoziert. Gegenüber einem zu
Vergleichszwecken verwendeten blundbakterienstamm, Streptococcus sanguis, konnten
keine erkennbaren Antikörper festgestellt werden.
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Zusammensetzung der Nahrung der Jungratten: Wie in Tabelle I gezeigt,
war die verwendete Nahrung abgesehen von der Milch, die anstelle von Protein verwendet
wurde, vollständig definiert. Die Analyse von Immunmilch als auch von "Carnat.ion"-Trockenmilch
zeigte, dass sie jeweils ungefähr 29 Protein
enthielten und wurden
daher in die karies fördernde Nahrung Nr. 305 in diesem Anteil für Lactalbumin eingesetzt.
Die Jungratten wurden neunzehn Tage nach der Geburt entwöhnt und in sterile Käfige
gebracht, wo sie mit der entsprechenden Nahrung bis zum fünfundvierzigsten Tag (Tötung)
gefüttert wurden.
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TABELLE I Zusammensetzung von gereinigter karies fördernder Nahrung
Nr. 305 und Nahrung Nr. 305 mit Milchsubstitut Komponenten gereinigte Nahrung milch-substituier-Nr.
305 (%) te Nahrung Nr. 305 (%) Saccharose (6 x pulverisiert) 5,0 5,0 Lactalbumin
(Milchprotein) 20,0 20,0 (69,0)* Salzmischung ("MIT") 3,0 3,0 Vitaminmischung 1,0
1,0 Baumwollsamenöl 3,0 3,0 Cellulose 6,0 6,0 ,Maisstärke 62,0 62,0 * Immunmilch
und "Carnation"-Trockenmilch enthalten etwa 29 % Protein, was 690 g/kg erfordert,
um 200 g/kg Protein zu ergeben.
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Provokation mit karioqenem S. mutans: 18 Std.-Kulturen von S. mutans
AHT, BHT und 6715 wurden wie im Versuchsablauf dargestellt verwendet. In die Mundhöhle
jeder Ratte der Gruppen A und B wurden am fünfundzwanigsten Tag Abstriche jeder
Kultur eingeführt. Die Gruppe C diente als ungeimpfte Vergleichsgruppe. An den Tagen
26 und 27 wurden Oralabstriche von drei bis vier Ratten pro Wurf in den Gruppen
A und B genommen und zur Bestätigung der Kolonienbildung auf Nährplatten mit Blut
und litis-salivarius agar gezüchtet. In jedem Fall konnten S. mutans AHT, BHT und
6715 wieder isoliert werden. Zusätzliche Abstriche, die an bestimmten getöteten
Tieren (Tag 45) genommen wurden, zeigten ebenfalls positive Kulturen dieser drei
Stämme, was auf eine andauernde Kolonienbildung von S. mutans hindeutet.
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Tiergewichte und Kariesbewertung: Die Ergebnisse der Kariesbewertungen
von fünfzehn Ratten jeder Gruppe sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.
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TABELLE II Mittlere Karieswerte und Körpergewichte junger Ratten,
die mit virulentem S. mutans AHT, BHT und 6715 infiziert und mit gereinigter kariesfördernder
Nahrung Nr. 305 gefüttert wurden, die entweder Immunmilch oder "Carnation"-Trokkenmilch
enthält Mittlere Karieswerte(a) Mittleres Körper-Gruppe Schmelz Dentin gewicht (g)
A 1,8 + 0,5 0,5 + 0,2 116 (Immun-Trockenmilch, infiziert) (17 %) (8 %) B 10,8 +
0,7 6,2 + 0,8 110 ("Carnation"-Trockenmilch, infiziert) (100 %) (100 %) C 0,9 +
0,5 0,1 + 0,1 114 ("Carnation"-Trockenmilch, keine Infektion) (8 %) (2 t) (a) bewertet
nach der Keyes-Methode (9). Werte + Standardfehler.
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Gruppen A und C sind signifikant von Gruppe B (p< 0,001) verschieden.
Gruppen A und C sind nicht signifikant versqhieden.
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(b) Karieswerte der Gruppen A und C, ausgedrückt in Prozent der Karieswerte
von Gruppe B.
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Aus diesen Daten ist klar zu erkennen, dass der Immunschutz bei Ratten
auftritt, die Nahrung erhalten hatten, welche Milch aus immunisierten
Kühen
enthielt. Dabei sind noch zwei andere Punkte wesentlich: (1) Zunächst traten bei
diesem Versuch die meisten Laesionen in den Sulci, den Zahnrillen, auf, einem Gebiet,
von dem man annimmt, dass dort durch Kompaktnahrung zusammen mit Kariogenen die
Karieslaesionen ausgelöst werden.
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(2) Die zur Kontrolle verwendeten und nicht provozierten Ratten entwickeln
praktisch keine Karies, was eine Basislinie darstellt, die normalerweise nur bei
nicht geimpften keimfreien Ratten erhalten wird. Bereits aufgrund der hier berichteten
Ergebnisse kann gesagt werden, dass die mit Immunmilch ernährten Tiere signifikant
weniger Karieslaesionen aufwiesen, als die Ratten, deren Nahrung als Milchanteil
in der Nahrung nur "Carnation" enthielt und die mit S. mutans provoziert worden
waren. Die Ernährung ist im übrigen an diesem Resultat nicht beteiligt, da sich
das mittlere Gewicht der Ratten aus den drei Gruppen nicht signifikant unterschied.
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Zusammenfassend zeiqen die Tierversuche: 1. Trockenmilchpulver kann
anstelle von Protein in der sonst vollständig definierten kariesfördernden Nahrung
Nr. 305 verwendet werden. In Gegenwart von virulentem S. mutans entwickeln sich
Karieslaesionen, insbesondere in den Furchen.
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2. Nach Injizieren von Kühen mit S. mutans-Antigen können signifikante
Anteile an agglutinierenden Antikörpern in der Kuhmilch festgestellt werden.
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3. enn Milch von immunisierten Kühen in im übrigen definierte, kariesfördernde
Nahrung eingeführt wird, führt dies zum Schutz gegen Karies, insbesondere in den
Furchenregionen der Zähne.
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Allgemein bietet die Erfindung unter anderem Kuhmilch-Immunoglobulin,
das Antikörper enthält, die gegen Streptococcus mutans-Antigen bzw. -Antigene spezifisch
sind, und in einem entsprechenden, beispielsweise pharmazeutisch annehmbaren Träger
zur Kariesbekämpfung verwendet werden kann, z. B. als Zahnpaste, die als Zusatz
das obige Kuhmilch-Immunoglobulin enthält, oder als entsprechend zusammengesetztes
Mundspülmittel. Zuckerfreie Süsswaren werden vorzugsweise mit mindestens 25 % der
oben beschriebenen Antikörper versehen, wobei die Süssware als pharmazeutisch annehmbarer
Träger dient.
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Ferner können zuckerfreie natürliche Lebensmittelprodukte mit mindestens
25 % des oben beschriebenen Immunoglobulins versehen werden, wobei das Lebensmittelprodukt
der pharmazeutisch annehmbare Träger ist. Man kann ferner auch handelsübliche Zahnpulver
mit mindestens 25 % des oben beschriebenen Immunoglobulins versehen, wobei der restliche
Teil des Zahnpulvers als pharmazeutisch annehmbarer Träger dient.
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Patentansrrüche