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Diese Erfindung betrifft eine Immun-Milchzubereitung
zum Verhindern von Mittelohrinfektionen (Otitis media) bei Kindern.
Die Zubereitung enthält Antikörper, die
gegen Bakterien hergestellt wurden, die Mittelohrinfektionen verursachen,
und, wenn erwünscht,
auch Zahnkaries hemmende Wirkstoffe.
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So genannte Immun-Milch kann hergestellt werden,
indem eine schwangere Kuh gegen bestimmte Pathogene geimpft wird,
wodurch der Organismus der Kuh Antikörper gegen diese Erkrankungen
erzeugt, die in das Kolostrum transferiert werden. Die heilenden
Wirkungen von Immun-Milch sind seit langer Zeit bekannt. Schon seit
Anfang des Jahrhunderts wurde Milch von immunisierten Ziegen und Kühen in der
Behandlung verschiedener bakterieller und viraler Erkrankungen getestet.
Die wichtigsten der neueren Studien konzentrieren sich auf Erkrankungen,
die von den Mikroorganismen des Magendarmtrakts abhängen, u.
a. Gelenkrheumatismus, Zahnkaries, Gingivitis, Diarrhöe, Ruhr,
Gastritis und Kryptosporidiosis. Es ist ein Zahnkaries hemmendes Produkt
aus Milch von immunisierten Kühen
bekannt, das spezifische Antikörper
gegen abgetötete
Streptococcus mutans-Zellen enthält
(
US-Patent 4,324,782 ). In den Vereinigten Staaten übliche Immun-Milch
wird hergestellt, indem der Antikörperspiegel mit Boostern aufrecht
erhalten wird. Die Menge an Antikörpern ist ziemlich gering und
die Wirkung beruht auf einer täglichen
Verabreichung. In Taiwan wird Immun-Milch als ein Gesundheitsgetränk verkauft.
In Australien wurde Pulver, das gegen Antikörper gegen Rotaviren enthält, u. a.
in Säuglings-Rezepturen
gemischt (Murtomaa-Niskala, 1994). Produkte aus gesamter Milch enthalten
auch unspezifische, antibakterielle Faktoren, die einen Einfluss
auf die mikrobielle Flora haben können (Takahashi et al., 1992).
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In Finnland wurde Immun-Milch u.
a. gegen Helicobacter pylori-Infektionen hergestellt (Oona et al.,
1994) und es wurden Antikörper
gegen Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus, die aus dem
Kolostrum eines immunisierten Rindes erhalten wurden (Loimaranta
et al., 1996), im Department für Zahnmedizin
der Universität
Turku untersucht (Prof. Jorma Tenovuo, persönliche Mitteilung). Diese Immun-Milch
wurde am Zentrum für
Landwirtschaftsforschung in Jokioinen hergestellt.
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Es wurde gezeigt, dass eine gegen
mutans-Streptococcen gerichtete Antikörperzubereitung, die aus einem
Immun-Kolostrum isoliert wurde, eine Infektion der Zahnoberfläche durch
mutans-Streptococcen hemmt und Zähne
vor Karies schützt,
wenn sie kariogener Nahrung für
gnotobiotische Ratten zugegeben wird (Michalek et al., 1987). Die
Verwendung eines lyophilisierten, auf der gleichen Technik beruhenden
Immun-Molkepulvers,
das in Wasser gelöst
wurde, um den Mund über
zwei Wochen hinweg morgens und abends eine Minute zu spülen, reduzierte
deutlich den Anteil an S. mutans im Zahnplaque junger Erwachsener
im Vergleich zu einer Kontrollgruppe (Filter et al., 1991). Ausspülen ist
jedoch keine geeignete Art und Weise der Verabreichung bei Kleinkindern,
denen jedoch ein erhöhter Immun-Schutz
wahrscheinlich am meisten zugute kommen würde (Aaltonen et al., 987).
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Suhonen hat den theoretischen Hintergrund des
Gebrauchs einer Schnuller-ähnlichen
Verabreichungsvorrichtung vorgestellt, die innerhalb eines prophylaktischen
Verfahrens zur Verhinderung von Zahnkaries langsam Fluoride, Xylit,
monoclonale Karies-Antikörper
oder Komponenten des Lactoperoxidase-Systems in den Mund freigibt.
Die Verwendbarkeit eines abgebenden Schnullers als Freigabevorrichtung
von Natriumfluorid, Xylit und Sorbit aus einer Tablette wurde in
vitro etabliert und die Verabreichung passiver Impfstoffe gegen
Mikroorganismen, die orale Erkrankungen hervorrufen, mittels eines Schnullers
wurde vorgeschlagen (Suhonen et al., 1994). Ein Prototyp eines Schnullers
zur Abgabe von Natriumfluorid, Xylit und Sorbit erwies sich in unserem
Feldversuch in dem Lohja-Distrikt-Gesundheitszentrum mit Kindern in einem
Alter von 16 Monaten als funktionierendes Instrument mit Potential
zur Entwicklung für
die Behandlung von Erkrankungen des Mundes und des Rachens bei Kindern
im Säuglingsalter.
In unserer Nachfolgestudie würde
offensichtlich, dass bei der Gruppe der Kinder, die den Testschnuller
gut annahm, deutlich weniger häufig
Mittelohrinfektionen vor dem Alter von 18 Monaten auftraten (48%
gegenüber
78%) als bei der vergleichbaren Gruppe, die aus irgendwelchen Gründen den
Testschnuller nicht verwendete (Suhonen J., Aaltonen A. S., Tenovuo
J., „Fall-asleep
pacifier in toddlers subject to cariologic risk factors", Poster, 15. Kongress der
internationalen Vereinigung der pediatrischen Zahnmedizin, Göteborg 1995).
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Theoretisch ist es möglich, dass
die Kinder, die den Testschnuller angenommen haben, so wenig Mittelohrinfektionen
hatten aufgrund der Tatsache, dass das Xylit, das langsam aus dem
Schnuller freigegeben wurde und zur Auswirkung für eine lange Zeit im Mund verblieb,
wenn die Kinder einschliefen, das Wachstum des Streptococcus pneumoniae-Bakteriums
(ein Pneumococcus) im Rachen der Kinder verhindert hat (Sipponen,
1995, Kontiokari et al., 1995). Über
die Hälfte
der Mittelohrinfektionen (Otitis media) bakteriellen Ursprungs bei
Kindern unter zwei Jahren sind auf Pneumococcen zurückzuführen. Ein zweites,
ziemlich häufiges
Pathogen bei Mittelohrinfektionen ist die nicht-typisierbare (nicht-Typ
b) Bakterienart Haemophilus influenzae und ein drittes, selteneres
ist Branhamella (Moraxella) catarrhalis. In einer Zweimonats-Studie
mit Kindern in Tagesobhut hat das Kauen von Xylit-Kaugummi für 5 Minuten
5 mal pro Tag das Auftreten von Mittelohrinfektionen um 50%o verringert
im Vergleich mit einer Kontrollgruppe, die den entsprechenden Kaugummi
mit Zucker gesüßt verwendete
(Uhari et al., 1996). Eine mögliche
Erklärung
für diesen
Effekt ist, dass das Xylit die Adhäsion von Pneumococcus und auch
von H. influenzae an die Schleimhautzellen erniedrigt und dadurch
das Aufsteigen dieser Pathogenen des Ohrs durch den Gehörgang in
das Mittelohr verhindert hat (Assistenz-Prof. Matti Uhari, persönliche Mitteilung 8.11.1996;
Andersson et al., 1986).
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In unserer Studie waren Mittelohrinfektionen bei
den Kindern signifikant häufiger,
die in einem Alter von 12-14 Monaten Milch oder Milchhaferschleim aus
einer Nachtflasche gesaugt hatten, als bei denen, die Saft oder
Wasser gesaugt hatten. Das und die vorhergehende, möglicherweise
mit Xylit verbundene Beobachtung deuten darauf hin, dass sich die Wirkungen
von Mitteln, die über
einen Schnuller verabreicht werden, auf die Flora des Nasenrachenraums
und von dort bis in das Mittelohr erstrecken. Einige unserer Ergebnisse
deuten darauf hin, dass Kinder die Mittelohrinfektionen verursachenden
Bakterien über
Speichelkontakte durch den Mund erhalten, obwohl der hauptsächliche
Aufenthaltsort dieser Bakterien der Nasenrachenraum zu sein scheint.
Die Mundhöhle
kann also eine erste Verteidigungslinie im Kampf gegen Bakterien
sein, die auf das Mittelohr abzielen. Wenn also das vorstehend beschriebene Suhonen-Verfahren
zur Kariesprophylaxe ausgeweitet wird, um sie auf die pathogene
Mikroorganismen-Flora des Rachenraumes anzuwenden, ist es möglich, dass
mit einer vom Verfahren bekannten oder davon modifizierten Verabreichungsvorrichtung auch
Wirkstoffe, die gegen Pathogene der Mittelohrinfektionen wirken, über einen
längeren
Zeitraum verabreicht werden können,
was auf das Verhindern von Mittelohrinfektionen bei Kindern abzielt.
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Zur Behandlung akuter Mittelohrinfektionen bei
Kindern werden heutzutage in erster Linie Antibiotika angewendet
und zur unmittelbaren Beseitigung der Schmerzen werden eine Punktur
des Trommelfells und Ohrtropfen eingesetzt. Es wird befürchtet, dass
die umfangreiche Anwendung von Antibiotika die Verbreitung von resistenten
Bakterienstämmen (Bacuero
und Loza, 1994) und die Selektion der oralen Mikroorganismen fördert, so
dass Arten, die Immunglobulin A (IgA) abbauende Proteasen produzieren,
auf Kosten anderer häufiger
vorkommen (Østergaard,
1983). Kinder, die wiederholt Infektionen der Atemwege ausgesetzt
wurden, enthalten in ihrem Speichel bedeutend weniger IgA als gesunde
Kontrollen (Lehtonen et al., 1987). Wegen der hohen Häufigkeit
der Krankheit und der Schwierigkeiten, die mit der Behandlung verbunden
sind, werden gegen die Krankheit parenterale, Serum-spezifische
Impfstoffe entwickelt, die die IgG-Immunantwort aktiv erhöhen. In
der Zukunft könnte
auch von aktiven, viralen Impfstoffen, die als Nasensprays verabreicht
werden, Gebrauch gemacht werden, die die sekretorische IgA-Antwort
auf der Schleimhautmembran stimulieren und dadurch die Gefahr einer
Mittelohrinfektion reduzieren. Die Idee, dass Mittelohrinfektionen
bei Kindern durch einen passiven Impfstoff verhindert werden können, der
außerhalb
des menschlichen Körpers
produziert wird und besonders mittels einer Saugvorrichtung über einen
längeren
Zeitraum verabreicht werden kann, ist bislang, so weit bekannt, noch
nicht veröffentlicht
worden. In der Nase verabreichte IgG-Antikörper gegen Kapsel-Polysaccharide von
Haemophilus influenzae vom Typ b haben die Besiedelung des Nasenrachenraums
durch dieses Pathogen bei jungen Ratten gehemmt (Kauppi et al., 1993).
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Die Zusammenfassung des japanischen
Patents JP-A-4211613 offenbart eine orale Zusammensetzung zur Behandlung
opportunistischer Infektionen, wobei die Zusammensetzung einen Antikörper gegen
bakterielle Antigene enthält,
vorzugsweise Milch als die aktive Komponente enthaltend, die von einer
Kuh entnommen wurde, die durch mindestens ein bakterielles Antigen,
ausgewählt
aus einer Vielzahl von Bakterienstämmen, sensibilisiert wurde.
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Die internationale Veröffentlichung
WO-A-91/04727 offenbart
eine Vorrichtung, die eine verlängerte
Freigabe von aktiven Substanzen gegen Zahnkaries verursacht, enthaltend
Xylit und monoclonale Antikörper,
die spezifisch für
Zahnkaries verursachende S. mutans sind.
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Das prophylaktisch verwendete Immun-Milchprodukt,
d. h. das anti-Otitis-Immunglobulinprodukt
von Rinderkolostrum, das Gegenstand der Erfindung ist, würde die
passive Immun-Abwehr ergänzen,
was in der Natur in erster Linie dem durch die Muttermilch erhaltenen
Immun-Schutz entsprechen würde,
jedoch mit dem Unterschied, dass die menschliche Milch hauptsächlich IgA-Antikörper, die Rindermilch
IgG-Antikörper
enthält.
In der europäischen
Patentanmeldung Nr.
0 479 597 wird offenbart, dass
Immunglobuline von menschlicher oder Rinder-Milch bei der Behandlung
von z. B. Mittelohrinfektionen eingesetzt werden können, aber
die Anmeldung befasst sich ausdrücklich
mit IgA. Charakteristisch für
die meisten Mittelohrinfektionen verursachenden Bakterien ist, dass
sie IgA-abbauende Proteasen produzieren, wodurch sie selbst einen ökologischen Überlebensvorteil
in der Mikroflora des Rachens erlangen. Die fraglichen Proteasen
bauen keine IgG-Antikörper
ab. Der Höhepunkt
des Auftretens von akuten Mittelohrinfektionen ist genau in dem
Alter, in dem ein Schnuller am eifrigsten benutzt wird, während der
zweiten Hälfte
des ersten Lebensjahres eines Kindes. Ein passiver IgG-Impfstoff,
der durch eine orale Verabreichungsvorrichtung oder auf andere Weise
oral abgegeben wird, könnte
eine wirksame Hilfe im Kampf gegen Pathogene des Ohrs sein, die über den
Mundweg infizieren und IgA enzymatisch abbauen.
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Die chemischen und biologischen Eigenschaften
von Antikörpern,
die zu den Molkeproteinen der Milch gehören, sind ziemlich gut bekannt.
Ein Liter Kolostrum enthält
40-100 Gramm Antikörper,
aber die gleiche Menge an Milch nur 0,5-1 Gramm. Mit der Hilfe moderner
Verfahren der Milchwirtschaftstechnologie können Antikörper konzentriert, in reinem
Zustand isoliert und auch getrocknet werden, ohne ihre Aktivität in einem
bedeutenden Ausmaß zu
verändern.
Antikörper
sind vollständig
wasserlösliche,
geruchlose und geschmacklose Proteine. Ein Konzentrat oder Pulver,
das Antikörper
enthält,
kann verschiedenen Milchprodukten, bestimmten Nahrungsmittelprodukten
oder klinischen Nahrungszubereitungen zugefügt werden (Korhonen, 1992).
Obwohl Kuhmilch, und damit auch die darin enthaltenen natürlichen
oder durch Immunisierung produzierten Antikörper, ein verbreitetes Nahrungsmittel
ist, ist seine Verwendung bei Kleinkindern mit bestimmten Nachteilen
verbunden, die in Rezepturen für
Kleinkinder verringert worden sind und deren weitere Verringerung
in einem Immun-Milchprodukt erreichbar ist, für die nur die Molkeprotein-Antikörper der
Milchbestandteile notwendigerweise gebraucht werden. Antikörper oder
in anderen Worten Immunglobuline der Milch verursachen relativ selten
eine Sensibilisierung der Kinder. Eine Allergie gegen Milch hat
sich bei etwa 2% der finnischen Kinder entwickelt, üblicherweise
während
des ersten Lebensjahres, und die bei weitem häufigste Ursache dafür sind die
Casein-Bestandteile der Milch, die aus dem Molkeprodukt entfernt
wurden.
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Das Ende oder die geringe Anzahl
des Stillens während
der ersten drei Monate und eine allergische Disposition scheinen
Kinder für
wiederkehrende Ohrinfektionen anfällig zu machen. Wenn die am stärksten sensibilisierenden
Faktoren aus dem Immun-Milchprodukt entfernt worden sind, kann es wahrscheinlich
einem Kind mit einem niedrigen Alter unmittelbar nach dem Ende des
Stillens gegeben werden oder wenn eine Rezeptur für Kleinkinder
als ergänzende
Nahrung verwendet wird. Ein prophylaktischer Schnuller, der das
Wachstum pathogener Bakterien im Ohr hemmt, wäre in Einschlaf-Situationen
besser als eine Milchflasche, die als solche für Ohrinfektionen anfällig machen
kann. In unserer Studie reduzierten diejenigen, die den Testschnuller
verwendeten, den Gebrauch einer Nachtflasche mehr als andere (Suhonen
et al., 1995).
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Die Gesundheit der Immun-Milch produzierenden
Kühe muss überprüft werden
und sie müssen mit
ganz besonderer Sorgfalt bedacht werden. Getrocknetes Immun-Milchpulver
besitzt auch eine Bedeutung für
die Ernährung,
da es Molkeproteine enthält
und darüber
hinaus üblicherweise
eine gewisse Menge an Lactose zur Stabilisierung der Proteine und
zur Geschmackszugabe. Durch Hydrolyse kann Lactose weiter in Galactose
und Glucose gespalten werden, Zucker, die vom Darm einfacher absorbiert werden
können
und die Süße des Produkts
erhöhen. Lactose
fördert
die Gesundheit des Darms des Babys, indem eine acidophile Bifidobacterium-F1ora aufrechterhalten
wird (Korpela, 1992). Jedoch verursachen Milchzucker bei einer langfristigen
Anwendung Zahnkaries.
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Die Neigung von Kindern zu Zahnkaries hängt davon
ab, ob die Unterseiten der kleinen Poren auf den glatten Oberflächen oder
auf den verschlossenen Spalten der durchstoßenden Zähne mit einer kariogenen oder
einer nicht-kariogenen mikrobiellen Flora bedeckt sind (Svanberg
und Loesche, 1977). Es bildet sich ein kariogenes Plaque, wenn sich
mutans-Streptococcen (MS), die aus Zucker Säuren und langkettige Polysaccharide
produzieren, in der Flora befinden. Die Entwicklung von Karies-Läsionen in MS-positiven
Kindern ist ein multikausaler Prozess, aber sie wird in erster Linie
angesehen, als sei sie mit der langanhaltenden Aussetzung gegenüber Saccharose
in der Mundhöhle
verbunden (Gustafsson et al., 1953, Aaltonen, 1991, Grindefjord
et al., 1995a, b). Auch andere Zucker wie Lactose erhöhen das
Karies-Risiko bei längerem
Stillen, wenn die Menge an Calcium und puffernden Phosphaten in
der Milch schon abgenommen haben (Matee et al., 1992). Da die Wirtsresistenz
und die Virulenz des Pathogen abhängig oder unabhängig von
Umweltfaktoren variieren können
(Aaltonen, 1989, 1991, 1992, Aaltonen und Tenovuo, 1994), kann man
auf individueller Ebene nicht von vornherein wissen, ob ein kleines
Baby ein MS-Träger
sein wird und daher ein wahrscheinlicher Kariespatient, wenn die
Milchzähne
herauskommen, oder nicht. Daher müssen kariogene Zucker unserer
Endung entsprechend aus dem Immun-Milchprodukt entfernt werden. Eine weitere,
prozesstechnisch gute Alternative ist es, dem Produkt genügend schützende Wirkstoffe
zuzugeben, um das Anheften (Adhäsion)
von mutans-Streptococcen, die Anreicherung (Aggregation) von Plaques
und die Produktion von Säuren
oder anderen Virulenzfaktoren zu hemmen. Eine dritte Alternative
ist es, sich den remineralisierenden Mitteln zuzuwenden, die das
zerstörerische
Symptom der Karies-Erkrankung,
die Demineralisierung der Zähne,
hemmen, von welchen die Wirkung der Fluoride seit über einem
halben Jahrhundert bekannt ist.
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In unserer parallelen Patentanmeldung (
PCT/FI96/00609 )
schlagen wir ein neues Modell für eine
Verabreichungsvorrichtung vor, das für die Abgabe des Immun-Milchproduktes verwendet
werden soll, unserer Erfindung entsprechend in einem prophylaktischen
Verfahren zur Hemmung von Mittelohrinfektionen bei Kindern. Das
Produkt kann jedoch auch dieser Erfindung entsprechend in verschiedenen
Formen verschiedenen Nahrungsmittelprodukten für Kleinkindern zugegeben werden,
wodurch bioaktive Produkte erhalten werden, die Kindern oral auch
mit Hilfe anderer Mittel verabreicht werden können als durch die vorstehend
erwähnte
Verabreichungsvorrichtung. Mit bioaktiven Produkten sind in diesem
Zusammenhang solche Produkte gemeint, die biologisch wirksame, aktive
Wirkstoffe enthalten, die für
den menschlichen Körper
von Vorteil sind.
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Die Wahl des Antigens
für die
Produktion eines Antikörpers
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Durch eine Verabreichungsvorrichtung,
die langsam wirksame Antikörper
in den Mund freigibt, wird mit kleinen Dosen eine relativ anhaltende
Wirkung auf die Mikroflora des Mundes und des Rachens erhalten.
Es ist daher von Wichtigkeit, dass die verwendeten Antikörper die
Entwicklung der normalen Flora nicht stören, was für die Gesundheit des Mundes
wichtig ist. Im Bereich des Mundes konkurrieren zum Beispiel der
nicht-kariogene Streptococcus sanguis und der kariogene S. mutans
um die Besiedelung der Zahnoberflächen und es steht nicht außer Frage,
ist jedoch auch nicht bekannt, dass eine antigene Struktur eines
verwandten S. pneumoniae (Pneumococcus) einem der beiden ähnlich wäre, wodurch
ein kreuzreagierender Antikörper,
der auf die Hemmung eines im Ohr pathogenen Pneumococcus abzielt,
auch die vorstehend erwähnte
Konkurrenzsituation im Zusammenhang mit Zahnkaries beeinflussen
würde.
Kreuzreaktionen müssen
in vitro untersucht werden, bevor das Produkt in Gebrauch genommen
wird, und obwohl durch verschiedene Antigene erhaltene Kombinationsprodukte
in Gedanken verführerisch
sind, sollte für
die klinische Anwendung ein Antikörperprodukt ausgewählt werden,
das nur gegen eine pathogene Spezies auf einmal gerichtet ist (es
kann verschiedene Stämme
geben), um die Nachfolgestudien zu vereinfachen. Nur wenn die Wirkung
dieses Produktes untersucht worden ist, kann die Mischung ausgeweitet
werden.
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Wegen der bekannten chemischen Sicherheit
und der einfachen Produktion von Immun-Milch kann das Immunogen-Repertoire
nötigenfalls
erweitert und sogar schnell zum Beispiel an bakterielle Stämme angepasst
werden, die gegen Antibiotika resistent geworden sind. In diesen
medizinischen Fällen
sollte die Behandlung auf einer Diagnose basieren und die zu verwendenden
Antikörper
sollten so spezifisch wie möglich
sein, vorzugsweise monoclonal hergestellt.
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Bei der Auswahl eines Antigens zur
prophylaktischen Anwendung in großem Maßstab muss dem Vorteil Aufmerksamkeit
geschenkt werden, der wahrscheinlich durch das neue Behandlungsverfahren
im Vergleich zu anderen Behandlungsverfahren erreichbar ist. Was
für das
Ohr pathogene Pneumococcen betrifft, ist es zu erwarten, dass ein
Octavalent, ein auf einem Proteinträger konjugierter, Polysaccharid-antigener
Wirkstoff, der in Finnland bereits in der Erprobung ist, in hohem
Maße das
Problem der auf Pneumococcen beruhenden Mittelohrinfektionen beseitigen
wird (Giebink, 1994). Es verbleiben Haemophilus influenzae (nicht-Typ
b) und Branhamella (Moraxella) catarrhalis, die schwieriger zu behandeln sind
und gegen die es keinen bekannten Impfstoff gibt. Von diesen ist
der Erstgenannte hinsichtlich seiner Lebensgewohnheiten besser bekannt.
Es ist schon vor einer langen Zeit gezeigt worden, dass er ebenfalls
in dem Mundbereich lebt und eine ziemlich verbreitete Ursache für wiederkehrende
Mittelohrinfektionen bei Kindern in einem Alter unter fünf Jahren ist.
Im Rachen dieser Kinder, die zu wiederkehrenden Mittelohrinfektionen
neigen, wird H. influenzae auch während gesunder Perioden bedeutend
häufiger
gefunden als in dem Rachen anderer (Faden et al., 1991). Da die
Verbindung von dem Vorhandensein von H. influenzae im Pharynx und
Antikörpern
in der Muttermilch ebenfalls am besten bei Pathogenen des Ohrs dokumentiert
zu sein scheint (Harabuchi et al., 1994), erscheint es sinnvoll,
sie als den ersten Angriffspunkt der Prophylaxe durch Immun-Milch
zu nehmen. Da die immunogenen Strukturen von H. influenzae nicht
so genau bekannt sind, ist das verlässlichste Ergebnis zu erwarten,
indem eine abgetötete ganze
Zelle als Impfstoff verwendet wird. Wegen der erheblichen Variation
der nicht-typisierbaren, üblicherweise
kapselfreien Form (nicht b), die mit Mittelohrinfektionen verbunden
ist, würde
es sich lohnen, verschiedene der erhältlichen Stämme gleichzeitig bei der Immunisierung
der Kühe
zu verwenden. Rein gezüchtete
Stämme,
die momentan in Finnland vorrherschen, sind vom nationalen, öffentlichen
Gesundheitsinstitut von Oulu erhältlich,
wo Probenmaterial während
einer Gruppenstudie, die in der Region von Tampere durchgeführt wird,
gesammelt wird, um zu untersuchen, ob Babys Pathogene für das Ohr
in ihrem Rachen tragen (Dozent Aino K. Takala, persönliche Mitteilung).
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Zusätzlich zu der Immunisierung
gegen H. influenzae lohnt es sich, auch eine Immunisierung der Kühe mit einem
entsprechenden Impfstoff gegen B. catarrhalis zu versuchen. Natürlich kommen
auch die S. pneumoniae-Stämme
mit der größten Pathogenität für das Ohr
(u.a. 6, 14, 19, 23) in Frage, zumindest im Sinne einer vergleichenden
Studie, obwohl ein wirksamer parenteraler Wirkstoff gegen diese
zu erwarten ist. Dieser und auch die anderen bekannten, auf einem
Proteinträger
konjugierten Impfstoffe multipler Valenz wären wahrscheinlich auch bei der
Produktion von Immun-Milch in Kühen
sehr wirksam. Die langkettige Alkyl-Verbindung in dem Polysaccharid-Protein-Konjugat
ist ein Immun-Adjuvans. Ein
prophylaktisch verwendeter Antikörper,
der mit Hilfe einer Verabreichungsvorrichtung verabreicht wird,
könnte überraschend
wirksam sein, da er sich bereits auf das Plankton-Stadium von bakteriellen Zellen
in einem frühen
Biofilm an der äußersten Oberfläche der
Schleimhaut-Membran auswirken würde,
wohin die Wirkung von parenteral produzierten Serum-Antikörpern nicht
in einem bedeutenden Ausmaß reicht.
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Herstellung und Gebrauch
des Impfstoffes
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Die reinen Bakterienstämme, die
für die
Herstellung des Impfstoffes (vgl. vorstehend) ausgewählt wurden,
werden durch die Verwendung bekannter, mikrobiologischer Verfahren
zu ausreichend großen Kulturen
herangezogen. Die Kultur wird abgetötet, indem zum Beispiel die
Kultur bei einer geeigneten Temperatur inkubiert wird bis die Kultur
steril ist. Die Sterilität
wird durch die Entnahme von Proben nach mehreren Stunden bestätigt. Die
abgetöteten
bakteriellen Zellen werden gewaschen, zentrifugiert und für die Lagerung
lyophilisiert.
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Für
die Inaktivierung kann auch Formalin verwendet werden. In dem Verfahren
wird die Dünnheit
der Zellwände
der fraglichen Bakterien berücksichtigt
und bekannte Labortechniken werden angewendet, um Fimbrien und andere
möglicherweise
antigene Strukturen so unversehrt wie möglich zu erhalten. Trockenzellpulver,
das von den am häufigsten
im Nasenrachenraum gefundenen H. influenzae-Stämmen (oder B. catarrhalis-Stämmen) erhalten
wurde, wird in gleichen Mengen abgewogen und kombiniert, um ein polyvalentes
Antigen zu erhalten. Die Trockenzellen werden anschließend in
eine physiologische Kochsalzlösung
gemischt, um eine konzentrierte Stammsuspension zu erzeugen. Von
dieser werden Verdünnungen
angelegt bis eine bestimmte optische Dichte erhalten wird, die der
für den
Impfstoff geeigneten Zellmenge entspricht. Die Stammsuspensionen
werden in verschiedene Chargen eingefroren gelagert. Die letzte
Verdünnung
wird einem vorher festgelegten Verdünnungskoeffizienten entsprechend
angelegt und zur gleichen Zeit wird ihre Sterilität überprüft. Irgendein
anerkanntes Adjuvans (z. B. Aluminiumhydroxid und -phosphat, Liposomen) wird
verwendet, um bei der Immunisierung zu helfen. Die Immunisierungstechnik
ist in der Tiermedizin bekannt. Kühe werden verschiedene Male
während
der Trockenperiode vor der Entbindung geimpft, indem eine geeignete
Menge an Antigensuspension intramuskulär injiziert wird. Der Immunisierung
folgt die Entnahme von Serumproben. Die Immunisierung einer Kuh
gegen das verwendete Antigen kann festgestellt werden, indem spezifische
Antikörper
aus dem Serum zum Beispiel durch ELISA-Verfahren bestimmt und die
Ergebnisse mit einer mit einem Placebo geimpften Kuh verglichen
werden. Antikörper hauptsächlich vom
IgG-Typ werden in großen
Mengen vom Serum in das Kolostrum befördert.
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Sammlung und
Verarbeitung von Immun-Milch
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Kolostrums von den ersten 3 bis 5
Melkvorgängen
während
der zwei oder drei Tage nach der Entbindung werden gesammelt. Von
einer Kuh können
im besten Fall 50 Liter Kolostrum erhalten werden. Ein Kalb trinkt
etwa drei Liter auf einmal, aber es kann anderes, gefrorenes Kolostrum
bekommen. Ein Molke-basieries Konzentrat, das die Immunglobuline enthält, wird
von dem Kolostrum mittels einer bereits gebräuchlichen Molkereitechnologie
abgetrennt. Immun-Milch kann pasteurisiert werden, aber dann geht etwa
30% der Aktivität
der Antikörper
verloren. Die Antikörper
werden aufbewahrt und ein ausreichend hohes hygienisches Niveau
wird erhalten, indem Immun-Molke mit Hilfe von Membranfiltern (0,2 μm) gereinigt
wird und durch mikrobiologische Tests bestätigt wird, dass die Kühe gesund
sind. Das Molkeprodukt kann in ein Pulver lyophilisiert werden.
Als andere Möglichkeit
kann Sprühtrocknung
verwendet werden, wobei die Aktivität der Antikörper ebenfalls erhalten bleibt,
wenn niedrige Temperaturen verwendet werden. Antikörper gegen
das in dem Impfstoff verwendete Antigen, die in dem Molkepulver
enthalten sind, können
auf die gleiche Art und Weise bestimmt werden wie aus dem Serum.
In dem Immun-Molkeprodukt, das der Erfindung entsprechend funktioniert, können signifikant
erhöhte
Mengen an IgG-Antikörpern
gegen ein H. influenzae (nicht-Typ b)-spezifisches Strukturantigen
und/oder Gesamtzellenantigen, beziehungsweise gegen ein B. catarrhalis-Gesamtzellenantigen,
wenn dieses als Impfstoff in der Kuh verwendet worden ist, gezeigt
werden, im Vergleich zu demjenigen, das durch einen Placebo-Impfstoff
hergestellt wurde. Bekannte Strukturantigene von H. influenzae sind
u. a. Protein „e" (FI Patentanmeldung
914241) und Protein P6 (Harabuchi et al., 1994). Die Kapsel-Polysaccharidantigene
von S. pneumoniae sind bekannt, aber zum Beispiel kann auch Pneumolysin,
ein für
Pneumococcus spezifisches Proteinenzym, als Erkennungsantigen verwendet
werden. Immun-Molkepulver enthält
Lactose, das Proteine stabilisiert und die Verdichtung des Pulvers
in Tablettenform vereinfacht. Es ist möglich, die Lactose wegzulassen
und sie zumindest teilweise durch Xylit zu ersetzen.
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Schutz gegen Zahnkaries
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Zum Beispiel können die folgenden Wirkstoffe
oder Wirkstoffgruppen, die im folgenden genau untersucht werden,
in unserem Produkt gegen Karies verwendet werden:
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- 1. Xylit (C5H12O6). In der Natur
wird Xylit in kleinen Mengen in nahezu allen Früchten gefunden und ist ein
normales Zwischenprodukt des menschlichen Stoffwechsels (Touster,
1960, Mäkinen, 1978).
Xylit kann keine bakterielle Säureproduktion
hervorrufen, weshalb es ein kariostatisches Mittel ist (Mühlemann
et al., 1970, Scheinin und Mäkinen,
1975). Zusätzlich
zu der erwähnten
kariostatischen Wirkung besitzt Xylit ziemlich offensichtliche Karies-hemmende
Eigenschaften bei langfristiger und häufiger Verabreichung (Isokangas,
1994). Es wurde gefunden, dass Xylit die Menge an basischen Aminosäuren, Arginin
und Lysin, im Zahnplaque erhöht.
Dies erschwert das Gedeihen von Karies verursachenden säureausscheidenden
und säurebildenden
mutans-Streptococcen im Mund (Mäkinen
und Isokangas, 1988, Söderling
und Scheinin, 1991). Xylit hemmt das Wachstum des kariogenen S.
mutans, verringert auch die Fähigkeit
anderer oraler Mikroorganismen zur Produktion von Säuren und
verhindert die Biosynthese von extrazellulären Polysacchariden und Lipoteichonsäuren, deren
Erzeugung zu den Eigenschaften von kariogenischem Zahnplaque gehört.
Durch
die Verwendung einer Verabreichungsvorrichtung, die langsam einen
aktiven Wirkstoff freigibt, ist es möglich, in dem Mund eines schlafenden
Kindes um die durchstoßenden
Zähne herum für Stunden
eine orale, flüssige
Umgebung zu schaffen, die unserer Studie entsprechend offensichtlich
Karies-verhindernde Eigenschaften aufweist. Wenn es auf diese Art
und Weise verwendet wird, wird erwartet, dass die vorteilhaften
Eigenschaften von Xylit in ziemlich kleinen Dosen ohne abführende Nebenwirkungen
maximiert werden. Ein Nachteil von Xylit und anderen Polyolen ist
besonders bei kleinen Kindern ihre langsame Absorption aus dem Darm,
wodurch große Dosen
zu einem osmotischen Durchfall führen.
- 2. Fluoride. Im Allgemeinen wird nicht geglaubt, dass ein F--Ion die Besiedelung von mutans-Streptococcen
(MS) unter normalen Umständen
beeinflussen kann (Kilian et al., 1979, van Houte et al., 1978,
Zicken und Emilson, 1982). Jedoch verhindern Fluoride einer Theorie entsprechend
zumindest in hohen Konzentrationen durch die Reduktion der haftenden,
elektrostatischen Kräfte
die Anheftung der Bakterien an die Zahnoberfläche (Rölla, 1977a). Üblicherweise wird
die Karies-verhindernde Wirkung von Fluoriden auf die Zähne mit
der Fähigkeit
der Fluoridionen verbunden, die Zahnoberfläche zu härten und die Remineralisierung
zu fördern.
Darüber
hinaus stören
Fluoridionen den Kohlenwasserstoff-Stoffwechsel der mutans-Streptococcen
und verringern daher die Säureproduktion
in dem Plaque (Hamilton, 1977, Harper und Loesche, 1986). Die Verwendung
von Fluoriden als vor Karies schützende
Wirkstoffe in einem Immun-Milchprodukt ist durch die Gefahr ihrer Überdosierung
eingeschränkt.
Sie werden Kindern mit einem Alter von unter 6 Monaten überhaupt
nicht empfohlen und die maximale Dosis für Kinder in einem Alter von 6
bis 24 Monaten ist 1 Tablette oder in anderen Worten 0,25 mg F pro
Tag, für
Kinder in einem Alter von 2 bis 7 Jahren 2 Tabletten. Heutzutage,
da die Verwendung von Fluor-Zahnpasten schon bei Kleinkindern, die
beträchtliche
Mengen davon verschlucken können,
verbreitet ist, kann die Verabreichung von zusätzlichem Fluor in der Form
eines anderen Produktes Nebenwirkungen haben. Wenn sie von einer
während
der Nacht gehaltenen Verabreichungsvorrichtung verabreicht wird, kann
sogar ein Bruchteil der Fluormenge der vorliegenden Fluortabletten
wirksam sein, da durch die Vorrichtung eine langfristige, lokale
Wirkung auf der Oberfläche
der durchstoßenden
Zähne erreicht
wird, der Oberfläche,
die in einem unreifen Zustand für
eine Besiedelung durch MS und eine Demineralisierung anfällig ist.
- 3. Monoclonale Karies-Antikörper.
Mit Hilfe bekannter Hybridoma- und Genmanipulationstechniken ist
es prinzipiell möglich,
extrem spezifische Antikörper
gegen jeden Virulenzfaktor von MS herzustellen, nachdem er identifiziert
wurde. Die bislang vielleicht am vielversprechendste anti-kariotische
Antikörperzubereitung
ist ein monoclonaler IgGI-Antikörper
gegen ein adhäsives
Protein-Antigen
SA I/II der Zellwand von MS (Ma et al., 1990). Durch die Behandlung
der Zähne
mit diesem Antikörper
war das Verhindern der Rückkehr von
MS in den Zahnplaque eines erwachsenen Menschen erfolgreich (Ma
und Lehner, 1990). In den Serumproben von Kleinkindern im Südwesten
Finnlands, deren Zähne
noch frei von mutans-Streptococcen waren, wurden bedeutende Mengen
von IgG-Antikörpern
gegen das SA I/II-Antigen gefunden (Aaltonen, 1989, Tenovuo et al.,
1990). Es ist offensichtlich, dass diese natürlichen Antikörper MS-Infektionen
von geimpften Kindern durch den Einfluss von Serumflüssigkeit einschränken können, das
aus dem Zahnfleisch auf die Oberfläche eines durchstoßenden Zahnes quillt.
Dass jedoch eine natürliche
Immunisierung ausreichend wirksam ist, ist die Ausnahme. Wenn die
fraglichen, spezifischen Antikörper
mittels der vorstehend erwähnten
Verabreichungsvorrichtung entsprechend unserer Erfindung in einem Produkt
in den Mund eines Kindes gebracht werden würden, wenn die Milchzähne in einem
Alter von ½ bis
2½ Jahren
durchstoßen,
könnte
dieser passive Impfstoff theoretisch auch in einem höheren Alter
Zahnkaries hemmen, da die Milchzähne mit
einer mutansfreien nicht-kariogenen Mikroflora bedeckt werden würden, die
wahrscheinlich auf die bleibenden Zähne übertragen werden würde, und
mit ihrem Konkurrenzvorteil sogar später die Ausbreitung von MS
hemmen würde.
Bioaktive spezifische und unspezifische Proteine, die mittels einer
Verabreichungsvorrichtung verabreicht werden, können zu strukturellen Bestandteilen der
Glycoproteinhaut werden, die auf der Oberfläche von durchstoßenden Zähnen gebildet
wird und deren Zusammensetzung für
die Besiedelung der Pathogene wichtig ist (Gibbons, 1984).
- 4. Anti-Kariesantikörper
der Immun-Milch. Immun-Milch (Kolostrum) ist auf unsere Initiative
hin am Landwirtschaftlichen Forschungszentrum in Jokioinen gegen
die kariogenen MS-Spezies S. mutans und S. sobrinus produziert worden
(Loimaranta et al., 1996). Die anti-MS-Wirkung des Immun-Molkeproduktes
ist in vitro am Department für
Zahnmedizin der Universität
Turku untersucht worden (J. Tenovuo, persönliche Mitteilung). Die Wirksamkeit
eines entsprechenden anti-S. mutans-Molkeproduktes ist früher in Tests
mit Tieren und erwachsenen Menschen gezeigt worden (Michalek et
al., 1987, Filler et al., 1991). Wenn die Studien in Turku die früher im Ausland
erhaltenen Ergebnisse bestätigen,
wären Antikörper, die mit
dem gleichen, finnischen Verfahren erhalten wurden, hervorragend
als Karies-hemmende Wirkstoffe für
die der Erfindung entsprechenden anti-Pneumococcen-, anti-Haemophilus-
und anti-Branhamella- Produkte
geeignet oder für
ihre Kombinationen. Es wäre
jedoch angemessen, unserem Kombinationsprodukt Xylit wegen einer
zusätzlichen
anti-Karies- und anti-Otitis-Wirkung
zuzugeben, die zu erwarten ist, als auch wegen der für Proteine
stabilisierenden Wirkung. Azyklisches Xylit stabilisiert Proteinstrukturen,
indem es mit Wassermolekülen
um die erste Hydrathülle der
Proteine konkurriert und dadurch Denaturierung verhindert.
-
Verabreichungsvorrichtung
-
Wir haben eine Verabreichungsvorrichtung eines
neuen Typs entwickelt, zur optimalen Verabreichung des anti-Otitis-Immun-Milchproduktes
entsprechend unserer Erfindung. Diese Vorrichtung ist in größerem Detail
in unserer parallelen Patentanmeldung
PCT/FI96/00609 beschrieben.
-
Kurze Beschreibung der
Figuren
-
1 zeigt
die Antikörper-Titer
(ELISA) vom Kolostrum von Kühen,
die gegen Haemophilus influenzae (nicht-Typ b)-Bakterien geimpft
wurden.
-
2 zeigt
die Antikörper-Titer
(ELISA) vom Kolostrum von Kühen,
die gegen Streptococcus pneumoniae-Bakterien geimpft wurden.
-
Produktion von Rinder-Immun-Kolostrum
-
Am Landwirtschaftlichen Forschungszentrum
in Jokioinen wurden schwangere Kühe
mit Gesamtzellen-Antigenen von Kapsel-tragendem Streptococcus pneumoniae
und Kapselfreiem (nicht b) Haemophilus influenzae, die mit Formalin
abgetötet wurden,
geimpft. Der Impfstoff wurde am nationalen, öffentlichen Gesundheitsinstitut
(Helena Käyhty)
hergestellt. Die Kühe
wurden ziemlich gut immunisiert (Antikörper wurden aus Serumproben
bestimmt) und im Kolostrum wurden Antikörper produziert, was durch
die angestiegenen Antikörpertiter
gezeigt ist. 1 zeigt
also die Antikörpertiter
vom Kolostrum von Kühen
(Hapern, Astma, Hunnari), die mit Haemophilus influenzae (nicht
typisierbar: IH 57501, IH 57522, IH 57596, IH 57602, IH 57608) gegen
Gesamtzellen-Antigen, das mit einem ELISA-Test bestimmt wurde, immunisiert wurden,
und 2 zeigt die Antikörpertiter
vom Kolostrum von Kühen
(Esitys, Hannikki), die mit Streptococcus pneumoniae (Serotyp 4,
Stämme
IH 31890, IH 32026) gegen ein Serotyp-spezifisches Polysaccharid-Antigen
(ELISA) immunisiert wurden. Die als Kontrolle verwendete Kuh (Iretta)
erhielt nur Aluminiumhydroxid als Adjuvans.
-
Antikörper können aus dem erhaltenen Kolostrum
zum Beispiel durch das in Loimaranta et al. (1996) beschriebene
Verfahren isoliert werden. Das resultierende Antikörperpulver
kann als ein aktiver Bestandteil in dem der Erfindung entsprechenden Produkt
verwendet werden.
-
Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass
die erfindungsgemäßen Ausführungsformen nicht
auf die vorstehend gezeigten Beispiele beschränkt sind, sondern innerhalb
des Umfangs der angehängten
Ansprüche
variieren können.
-
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