DE60124255T2 - Verwendung von exogenen milchsäurebakterien zur behandlung von durch actinomyces naeslundii hervorgerufenen krankheiten - Google Patents

Verwendung von exogenen milchsäurebakterien zur behandlung von durch actinomyces naeslundii hervorgerufenen krankheiten Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Einführung von exogenen Milchsäurebakterien in die orale Mikroflora, die in der Lage sind, die Kolonisierung von A. naeslundii zu modulieren und die Schwere von Erkrankungen, die von A. naeslundii hervorgerufen werden, zu vermindern.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Mund (die Mundhöhle) enthält eine residente und eine nicht-residente Mikroflora. Erstere schließt Mikroorganismen ein, die in der Lage sind, eine mehr oder weniger permanente Besiedlung auf den oralen Oberflächen auszubilden. Diese Bakterien sind hauptsächlich auf der Zunge, der Wangenschleimhaut und den Zähnen lokalisiert, während das Zahnfleisch, die Lippen, die Wangen, der Gaumen und der Mundboden nur eine sehr spärliche Mikroflora tragen.
  • Der Zahnbelag ist ein Film, der sich auf der Oberfläche von Zähnen bildet und aus Bakterienzellen in einer Matrix von extrazellulären Polysacchariden und Speichelprodukten besteht. Sofort nach dem Durchbrechen werden die Zähne mit einer amorphen Schicht von Speichel bedeckt, dem erworbenen Zahnschmelzhäutchen (acquired enamel pellicle, (AEP)), das etwa 1,3 μm dick ist und durch normales Bürsten der Zähne nicht entfernt werden kann. Die Ablagerung von Bakterien auf den Zähnen folgt unmittelbar der Bildung des AEP, und ein Zahnbelag wird innerhalb von 8–12 Stunden als eine mehrschichtige Struktur erkennbar. Die erste Schicht besteht aus Bakterien (den frühesten Koloniebildnern), die an den Zähnen hauptsächlich über eine spezifische Adhesin-Rezeptorerkennung haften; sie bildet ein Substrat für die zweiten Koloniebildner, die an den anderen über eine analoge spezifische Bindung oder als einfache Überlagerung haften.
  • Auf der Zunge und der Backenschleimhaut schließt die natürliche residente Mikroflora Mikroorganismen ein, die ausgewählt sind aus Streptococcus, Veillonella, Bacteroides und Haemophilus. Auf den Zähnen überwiegen Streptococci und Actinomyces, aber es kann eine Vielzahl von Gram-positiven und -negativen Kokken und Stäbchen gefunden werden.
  • Viele dieser Mikroorganismen sind harmlose Mitesser, wobei jedoch eine ganze Anzahl davon als die ätiologischen Mittel für ziemlich viele Erkrankungen erkannt wurden (Hill, M.J. und Marsh, P.D. eds. Human Microbial Ecology, 1990, CRC Press, Boca Raton, Florida, US).
  • Insbesondere sind Actinomyces naeslundii Genospecies 1 (früher A. naeslundii) und 2 (früher A. viscosus) übliche Bestandteile in einem humanen Zahnbelag. Sie gehören zu den stärksten Plaque-bildenden oralen Stämmen, und zwar aufgrund ihrer Fähigkeit, fest an den Zähnen zu haften und mit vielen anderen bakteriellen Spezies Aggregate zu bilden, wodurch sie deren Festsetzung im Mund fördern. Darüber hinaus sind sie bei älteren Personen üblicherweise an Stellen einer Wurzelkaries isoliert, und es wird angenommen, dass sie das hauptsächliche ätiologische Mittel für diese Erkrankung darstellen (Bowden, G.H., et al. 1999, The diversity and distribution of the predominant ribotypes of Actinomyces naeslundii Genospecies 1 and 2 in samples from enamel and from healthy and carious root surfaces of teeth. J. Dent. Res,. 78, 1800–1809).
  • Die temporäre Mikroflora umfasst exogene Bakterien, die gelegentlich im Mund vorhanden sein können, die jedoch keine permanente Besiedlung entwickeln (selbst wenn wiederholte orale Verabreichungen dieser Bakterien erfolgen). Alle Lebensmittelbakterien, und insbesondere Milchsäurebakterien, können Teile dieser Mikroflora sein.
  • Es wurde gezeigt, dass einige dieser exogenen Milchsäurebakterien in der Lage sind, am Häutchen der Zähne zu haften. Beispielsweise offenbart WO 00/09080 (Societe des Produits Nestlé) Milchsäurebakterienstämme, die kein Teil der residenten Mikroflora des Mundes sind, die schwach säuernd wirken und die in der Lage sind, direkt am Zahnhäutchen anzuhaften. Diese Bakterien werden insbesondere zur Behandlung oder Prävention von Zahnkaries und einer periodontalen Infektion verwendet, die durch kariogene Mikroorganismen wie Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus hervorgerufen werden.
  • Exogene Bakterien können auch Faktoren erzeugen, die das Wachstum der residenten Mikroflora im Mund inhibieren. Beispielsweise beschrieb EP 759 469 (Societe des Produits Nestlé SA) die Verwendung eines Bacteriocins, das von Micrococcus varians erzeugt wird, zur Inhibierung der Entwicklung der oralen Pathogene S. sobrinus, S. sanguis, S. mutans und A. viscosus. Der Einsatz von Bacteriocinen ist auch eine der untersuchten Strategien, die zur Verminderung einer Zahnkaries entwickelt wurden. Diese Moleküle haben ein Interesse als vielversprechende Antikariesmittel und als Faktoren, die wichtig zur Modulierung der Kolonisation der Mundhöhle sind, auf sich gezogen.
  • Es ist festzustellen, dass der Stand der Technik keinerlei Information enthält, die Stämme betrifft, die sich in der Mundhöhle durch direktes Anhaften am Zahnhäutchen festsetzen können und auch Faktoren wie Wachstumsinhibierungsfaktoren produzieren, die die Kolonisation von A. naeslundii modulieren und auf diese Weise die Schwere von Erkrankungen, die mit A. naeslundii in Beziehung stehen, vermindern.
  • Kurzdarstellung der Erfindung
  • Folglich zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, die Verwendung von Milchsäurebakterien, die im Hinblick auf die orale Mikroflora exogen sind, die aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt wurden, an der Zahnoberfläche zu haften und die einen Wachstumsinhibierungsfaktor produzieren, zur Herstellung einer Zusammensetzung bereitzustellen, die für die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen bestimmt sind, die eine Beziehung zur Actinomyces naeslundii in Säugetieren aufweisen.
  • Die Milchsäurebakterien können aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis und Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis und insbesondere aus der Gruppe, die besteht aus den Stämmen CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM I-1986, CNCM I-1987.
  • Indem sie somit die Oberfläche von Zähnen besiedeln und Wachstumsinhibierungsfaktoren produzieren, können derartige Milchsäurebakterien eine erhebliche Verminderung des Ausmaßes an Actinomyces naeslundii bewirken, wodurch sie Zahnbelag, Wurzelkaries und andere zu Actinomyces naeslundii in Beziehung stehende Infektionen vermindern.
  • Ein weiteres Ziel besteht darin, eine Zusammensetzung zur Aufrechterhaltung der Gesundheit des Mundes bereitzustellen, indem man die Besiedlung mit Actinomyces naeslundii vermindert, wobei die Zusammensetzung ein exogenes Milchsäurebakterium umfasst, das aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt wurde, an der Zahnoberfläche zu haften und einen Wachstumsinhibierungsfaktor zu produzieren.
  • Eine derartige Zusammensetzung kann wenigstens 104–109 KBE/g Milchsäurebakterien enthalten.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Innerhalb der nachfolgenden Beschreibung bezeichnet der Mund die Mundhöhle von Menschen oder Tieren wie Haustieren, die sich zusammensetzt aus der Mundschleimhaut (Zahnfleisch, Lippen, Wangen, Gaumen und Boden des Mundes), der Zunge und den Zähnen (einschließlich künstlicher Strukturen).
  • Die Begriffe "Wachstumsinhibierungsfaktor" definiert eine extrazelluläre Substanz, die durch die anhaftenden exogenen Milchsäurebakterien erzeugt wird, die es ermöglicht, das Wachstum von A. naeslundii zu inhibieren.
  • Im Hinblick auf das erste Ziel der vorliegenden Erfindung geht es um die Verwendung eines exogenen Milchsäurebakteriums, das im Hinblick auf seine Fähigkeit ausgewählt wurde, an der Zahnoberfläche zu haften und einen Wachstumsinhibierungsfaktor zu produzieren, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen bestimmt ist, die eine Beziehung zu Actinomyces naeslundii aufweisen.
  • Die Milchsäurebakterien können aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis und Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis und insbesondere aus der Gruppe, die besteht aus den Stämmen Streptococcus thermophilus (NCC 1529) (CNCM I-1984), Streptococcus thermophilus (NCC 1561) (CNCM I-1985), Lactococcus lactis subsp. lactis (NCC 2211) CNCM I-1986), Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (NCC 2225) (CNCM I-1987).
  • Die Milchsäurebakterien weisen vorzugsweise eine Herkunft aus Milchprodukten auf (d.h. sie stammen beispielsweise aus Milch oder Käse).
  • Die Milchsäurebakterien gemäß der Erfindung sind "schwach säuernd", was bedeutet, dass sie weniger säuernd sind als pathogene Stämme. Demgemäß können sie zu einem pH in der Mundhöhle von ungefähr 5,5–7 beitragen.
  • Diese Stämme wurden unter Milchsäurebakterienstämmen aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, am Häutchen der Zähne anzuhaften, ihre optimale Wachstumstemperatur beträgt etwa 37°C, was die Temperatur in der Mundhöhle ist. Sie sind ferner in der Lage, einen Wachstumsinhibierungsfaktor zu produzieren, der es gemeinsam mit ihren Hafteigenschaften ermöglicht, dass sie erheblich den Besiedlungsgrad durch A. naeslundii Genospecies 1 und 2 vermindern.
  • Darüber hinaus sind sie in der Lage, Glucose und Saccharose zu fermentieren, und sie synthetisieren keine Glucane, die Faktoren der Pathogenität von kariogenen Stämmen darstellen.
  • Es ist ferner möglich, wenigstens einen Milchsäurebakterienstamm in Kombination mit beispielsweise einem Bacteriocin zu verwenden.
  • Die Milchsäurebakterienstämme können beispielsweise einem Lebensmittel, einer Haustiernahrung, einer kosmetischen oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung beigegeben werden. Somit sind diese Zusammensetzungen vorzugsweise, zum Beispiel, Zahnpasta, eine Mundspülung, ein Gummi, ein Spray, ein Getränk, Karamellen, eine Kleinkinder-Formulanahrung, eine Eiscreme, ein gefrorenes Dessert, ein süßes Salatdressing, Milchzubereitungen, Käse, Quark, Joghurt, gesäuerte Milch, Kaffeesahne oder Schlagsahne.
  • Die exogenen Milchsäurebakterien können in einer Menge von wenigstens 104–109 KBE/g Milchsäurebakterien verwendet werden.
  • Die Wirkung der Einführung der oben erwähnten Bakterien in die orale Mikroflora wurde in einem Rattenmodell getestet. Die Stämme CNCM I-1985 und CNCM I-1986 waren in der Lage, die orale mikriobelle Ökologie zu modulieren, indem sie die Gesamtzahl an KBE erheblich verminderten. Genauer gesagt, waren die Stämme in der Lage, den Besiedlungsgrad durch A. naeslundii Genospecies 2 erheblich zu vermindern, womit die Ratten infiziert worden waren (vergleiche die Beispiele).
  • BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER AUSGEWÄHLTEN STÄMME
  • Fermentationsmuster: 49 einfache Zucker wurden mit dem api 50 CH bioMérieux Streifentest (bioMérieux SA, 69280 Marcy-l'Etoile, Frankreich) getestet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1. Zuckerfermentation von L. lactis CNCM I-1987 (A), L. lactis CNCM I-1986 (B), S. thermophilus CNCM I-1984 (C), S. thermophilus CNCM I-1985 (D).
    Figure 00070001
    • +, ++, +++, ++++ geben an, ob die Fermentation nach 3, 6, 24 oder 48 Stunden einsetzt.
  • Die Stämme Streptococcus thermophilus (NCC 1529), Streptococcus thermophilus (NCC 1561), Lactococcus lactis subsp. lactis (NCC 2211), Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (NCC 2225) wurden am 3. März 1998 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM I-1986 bzw. CNCM I-1987), 25 Rue due docteur Roux, 75724 Paris, Frankreich.
  • Das zweite Hauptziel der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Aufrechterhaltung der Gesundheit des Mundes durch Verminderung der Besiedlung mit A. naeslundii bei Säugetieren, wobei die Zusammensetzung exogene Milchsäurebakterien umfasst, die aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt wurden, an der Zahnoberfläche anzuhaften und einen Wachstumsinhibierungsfaktor zu erzeugen.
  • Diese Zusammensetzungen sind besonders für die Prophylaxe oder Behandlung von Zahnbelag und einer Infektionserkrankung, die eine Beziehung zur A. naeslundii aufweist, wie beispielsweise Wurzelkaries, bestimmt.
  • Der Milchsäurebakterienstamm gemäß der vorliegenden Erfindung wird ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis und Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, und zwar vorzugsweise aus der Gruppe, die aus den Stämmen CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM I-1986 und CNCM I-1987 besteht.
  • Eine derartige Zusammensetzung kann wenigstens 104–109 KBE/g Milchsäurebakterien enthalten.
  • Es können auch synergistische Zusammensetzungen hergestellt werden, indem man wenigstens ein Bacteriocin zusetzt, das gegen Gram-positive Mundbakterien wirksam ist. In diesem Falle kann die orale Hygienezusammensetzung 0,00001 bis 50%, und vorzugsweise von 0,00001 bis 15% gereinigtes Bacteriocin umfassen, und zwar bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung. Das Bacteriocin ist vorzugsweise Variacin ( EP 0 759 469 ).
  • Um die Zusammensetzung gegen einen Abbau zu schützen, kann auch ein öllösliches Antioxidans zugegeben werden. Geeignete Antioxidantien schließen ein die "Tocopherole", Butylhydroxyanisol (BHA), Butylhydroxytoluol (BHT) und Ascorbylpalmitat. Das öllösliche Antioxidans liegt in Mengen von 0,005% bis 0,5%, vorzugsweise von 0,005% bis 0,01%, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, vor.
  • Geeignete Scheuermittel zur Verwendung in Zahnreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen ein Calciumcarbonat, Calciumaluminosilicat, Aluminiumoxid, Aluminiumoxidhydrate, Zinkorthophosphat, Kunststoffteilchen und Kieselsäure, wovon Kieselsäure das bevorzugte Scheuermittel ist.
  • Erfindungsgemäße Zusammensetzungen weisen einen pH auf, der oral annehmbar ist und innerhalb dessen die Aktivität der Milchsäurebakterien nicht beeinträchtigt werden. Der pH kann im Bereich von 3,0 bis 9,5 liegen, vorzugsweise im Bereich von 3,5 bis 6,5.
  • Diese Zusammensetzungen können nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, die die Vermischung der Bestandteile in geeigneten Relativmengen und schließlich, soweit erforderlich, die Einstellung des pH auf den gewünschten Wert umfassen.
  • Actinomyces naeslundii Genospecies 1 (früher A. naeslundii) und 2 (früher A. viscosus) gehören zu den stärksten belagbildenden oralen Stämmen. Sie werden üblicherweise an Wurzelkariesstellen isoliert, insbesondere bei Menschen von über 40 Jahren und es wird angenommen, dass sie das hauptsächliche ätiologische Mittel für diese Erkrankung darstellen.
  • Beispiel 1: in vitro-Versuche
  • Die Stämme S. thermophilus NCC 1561 (CNCM I-1985) und Lactococcus lactis subsp. lactis NCC2211 (CNCM I-1986) (nachfolgend L. lactis NCC2211) wurden in vitro einem Biofilm beigemischt, der einen in vitro Zahnbelag verkörpert.
  • Der orale Stamm A. naeslundii Genospecies 1 (früher A. naeslundii) OMZ745 und A. naeslundii Genospecies 2 (früher A. viscosus) OMZ105 wurden erhalten vom Institut für Orale Mikrobiologie und Allgemeine Immunologie, Universität von Zürich, und sie wurden unter Anaerobiose (GasPackSystem, BBL) in FUM-Medium bei 37°C kultiviert.
  • Alle Stämme wurden in Glycerin bei –20°C gelagert und vor der Verwendung bei ihrer spezifischen Optimaltemperatur 14 Stunden vorkultiviert.
  • Die beiden ausgewählten Stämme L. lactis NCC2211 und S. thermophilus NCC1561 wurden als Beimpfung in ein vitro-System zugesetzt, in dem sich ein Biofilm, der sich zusammensetzte aus Bakterien, die üblicherweise nach 40 Jahren im menschlichen Mund gefunden werden, auf Speichel beschichteten Hydroxyapatitscheiben entwickelte. The Fluid Universal Medium (FUM), das verwendete Wachstumsmedium, war speziell formuliert, um die Acidität abzupuffern, die von den Teststämmen erzeugt wurde, so dass sie deshalb ein kontinuierliches Wachstum zeigten (eine Belagentwicklung), wie es im Mund der Fall ist (Gmur und Guggenheim), 1983). Die Tests wurden dreifach durchgeführt, und die Mischungen mit und ohne die Stämme auf Milchbasis wurden parallel getestet. Es wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Stämme verwendet.
  • Tabelle 2. Verwendete Bakterienstämme sowie bei den in vitro-Zahnbelagexperimenten angewandten Kultivierungsbedingungen
    Figure 00110001
  • Vorgehensweise
    • – Speichelhäutchenbildung: Bedecke synthetische Hydroxyapetit-Scheiben von 10 mm Durchmesser (HY-APATITE®, Euro-Crystals, Landgraaf, Niederlande) mit 800 μl menschlichem Speichel und inkubiere 4 h bei Raumtemperatur unter Schütteln (1 Scheibe/Vertiefung in einer sterilen 24-Loch Nunclon-Platte).
    • – Herstellung eines bakteriellen Konsortiums: Züchte S. thermophilus NCC1561, L. lactis subsp. lactis NCC2211, S. sobrinus OMZ176, S. oralis OMZ607, A. naeslundii OMZ745, V. dispar OMZ493 und F. nucleatum OMZ596 über Nacht bei 37°C unter Anaerobiose in FUM-Glucose (S. thermophils NCC1561 in FUM-Lactose), stelle die OD550 mit FUM auf 1 ein und gebe 2 ml einer jeden Suspension von oralen Bakterien mit 2 ml von entweder S. thermophilus NCC1561 oder L. lactis subsp. lactis NCC2211 zusammen. Die Kontrollmischung enthält nur die fünf oralen Stämme.
    • – Biofilmbildung und Gewinnung: Die Arbeitsweise ist wie beschrieben wird in Guggenheim et al., 1998, Validation of a new biofilm model, J. Dent. Res. 77, (Spec Iss A): 110 (Abstract #38).
    • – Kulturanalyse des Biofilms: Streiche die Suspension auf Columbia Blood Agar (5 % Schafblut, Becton Dickinson, Meylan Cedex, Frankreich) spiralförmig für die Gesamtzählung aus sowie für die Differenzierung von A. naeslundii. Inkubiere die Platten bei 37°C unter Anaerobiose für 48 h.
  • Wachtstumsantagonismus zwischen den untersuchten oralen Stämmen und den Milchstämmen
  • Die Stämme und die Kulturbedingungen sind in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Tabelle 3. Verwendete Bakterienstämme und Kulturbedingungen, die bei den Wachstumsantagonismusexperimenten angewandt wurden.
    Figure 00120001
  • S. thermophilus NCC1561, S. thermophilus NCC1536 und L. lactis NCC2211 (Killerstämme) wurden auf einen Wachstumsantagonismus gegenüber A. naeslundii OMZ745 und A. viscosus OMZ105 (Zielstämme) getestet.
  • Vorgehensweise
    • – Züchte die Killerstämme über Nacht auf Agarplatten unter Anaerobiose und die Zielstämme in BHI bis zur mittleren stationären Phase,
    • – Verdünne 20 μl der Zielstämme-Suspension in 3 ml BHI-Weichagar (Agar 7 g/l), der Glucose und Lactose enthält, verrühre und gieße sofort auf eine BHI-Agarplatte,
    • – Verfestige 1 h bei Raumtemperatur, streiche dann den Killerstamm von der M17-Platte in Form eines Kreuzes aus. Streiche parallel den Killerstamm und den Zielstamm allein als Kontrolle aus.
    • – Inkubiere bei 37°C unter Anaerobiose für 24 Stunden.
  • Ein Wachstumsantagonismus wird erkennbar anhand eines Inhibierungshofs um das Kreuz.
  • Statistiken
  • Unterschiede zwischen dem Kontrollkonsortium und dem Testkonsortium wurden nach dem Students t-Test bestimmt.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • S. thermophilus NCC1561 und L. lactis NCC2211 konnten in den belagartigen Biofilm auf den S-HA-Scheiben inkorporiert und gezüchtet werden, und ihre gesamten KBE/Scheibe nach 40,5 h sind in Tabelle 4 angegeben.
  • Tabelle 4. Grad der Inkorporierung der zwei Milchstämme in den Biofilm (KBE/Scheibe). Die Werte sind das Mittel von drei Versuchen mit ihren Standardabweichungen.
    Figure 00140001
  • Die Wirkung der Inkorporierung der Milchstämme in den Biofilm bei den oralen Spezies wird in den Tabellen 5 und 6 gezeigt. Wenn S. thermophilus NCC1561 eingeführt wurde (Tabelle 5), wurde eine allgemeine Verminderung der gesamten Flora, die durch die Zählungen auf Columbia-Blutagar-Platten (CBA) repräsentiert wird, sowie von 4 der oralen Spezies festgestellt.
  • Wenn L. lactis NCC2211 in das Konsortium der oralen Stämme eingeführt wurde (Tabelle 6) verminderten sich die Zählungen für die Gesamtflora nennenswert (KBE auf CBA). Die Verminderung war signifikant im Falle von A. naeslundii OMZ745, der signifikant abnahm (p = 0,021). Die Abnahme war sogar noch stärker, wenn man die Scheiben vor den oralen Bakterien mit dem Stamm beimpfte.
  • Tabelle 5. Modulation des Konsortiums der oralen Stämme durch S. thermophilus NCC1561 (KBE/Scheibe).
    Figure 00140002
    • N = 3 *: p-Werte werden im Hinblick auf die Kontrolle errechnet (*: p < 0,05; **: p < 0,01); °: p-Werte wurden errechnet im Hinblick auf die "+NCC1561"-Behandlung (°: p < 0,05; °°: p < 0, 01).
  • Tabelle 6. Modulation des Konsortiums der oralen Stämme durch L. lactis NCC2211 (KBE/Scheibe).
    Figure 00150001
    • N = 3 *: p-Werte werden im Hinblick auf die Kontrolle errechnet (*: p < 0,05; **: p < 0,01); °: p-Werte wurden errechnet im Hinblick auf die "+NCC1561"-Behandlung (°: p < 0,05; °°: p < 0,01).
  • Es wurden einige Tests durchgeführt, um festzustellen, ob die Reduktion der oralen Stämme auf einem Wachstumsantagonismus der Milchstämme diesen gegenüber beruhte (Tabelle 7). Die Stämme A. viscosus OMZ105 und S. thermophilus NCC1536 wurden ebenfalls in den Test aufgenommen, da sie Teil des in vivo-Modells (Beispiel 2) sind.
  • Alle vier Milchstämme inhibierten das Wachstum des Gram-negativen Stammes A. viscosus OMZ105. Diese Inhibierung kann nicht auf eine Milchsäure-Produktion zurückgeführt werden. A. viscosus ist in der Lage, Lactat nur unter aeroben Bedingungen zu metabolisieren (van der Hoeven et al. (1990) Oral Microbiol. Immunol. 5, 223–225) und ist sehr säurefest. Diese Befunde wurden durch Ausstreichen von A. viscosus in Gegenwart von 1% Milchsäure bestätigt: Es wurde keine Inhibierung beobachtet.
  • Tabelle 7. Wachstumsinhibierung der oralen Stämme durch S. thermophilus NCC1561, S. thermophilus NCC1536 und L. lactis NCC211.
    Figure 00160001
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • S. thermophilus NCC1561 und L. lactis NCC2211 konnten in einen Biofilm eingeführt werden, der einen Zahnbelag verkörperte, und sie waren in der Lage, die orale Mikroflora zu modulieren, wobei die Gesamtzahl an KBE erheblich vermindert wurde, und genauer gesagt waren diese Stämme in der Lage, den Besiedlungsgrad durch A. naeslundii Genospecies 2 signifikant zu vermindern. Zusätzlich konnten die Stämme das Wachstum von A. naeslundii Genospecies 1 und 2 in Co-Kulturen inhibieren.
  • Beispiel 2: in vivo-Versuche
  • Es wurde eine in vivo-Untersuchung an einem Rattenmodel durchgeführt. Bei dieser Untersuchung wurde die Assoziation der ausgewählten Stämme während der gesamten Versuchsdauer auf einer täglichen Basis aufrechterhalten, und zwar aufgrund einer Fütterung eines gekühlten Molkereiprodukts.
  • Die Studie wurde in 58 Tagen durchgeführt. Um das Experiment während des Tags durchzuführen, mußte die aktive Periode der Tiere insgesamt 7 Stunden verschoben werden; das erfolgte in drei Stufen am Tag 16, 17 und 18, wie noch genauer beschrieben wird. Die kariogenen Stämme wurden an den Tagen 21 und 22 assoziiert, während die Assoziation der Milchstämme am Tag 23 begann und wenigstens bis Tag 57 anhielt. Den Tieren wurden die Milchstämme als Ergänzung in einer Joghurtbasis verfüttert, die Teil der normalen Diät war, wie in dem Abschnitt erläutert wird. Ein Abstrich von den Rattenzähnen wurde am Ende der Untersuchung, am Tag 58, abgenommen.
  • Tiere und Diät
  • 10 Würfe, die jeweils aus 4 Osborne-Mendel Rattenjungen bestanden (Tierzuchtabteilung des Instituts für Orale Mikrobiologie und Allgemeine Mikrobiologie, Universität von Zürich, Zürich, Schweiz) wurden in dem Experiment verwendet. Alle Tiere wurden zu Beginn und am Ende des Versuchzeitraums gewogen. Wenn sie 13 Tage alt waren, wurden die Muttertiere und die Jungen in Käfige aus nicht-rostendem Stahl mit einem Siebboden ohne Bett überführt und mit einer fluoridarmen pulverisierten (0,2 μm) Nafag-Diät ernährt, um eine Fissurenimpaktion zu vermeiden (Rat Checkers Nr. 184, NAFAG, Gossau SG, Schweiz) sowie mit Leitungswasser ad libitum. Die aktive Phase, während der die Ratten fressen, ist während der Nacht, d.h. 18:00–06:00.
  • Um eine Wiederbefüllung der Futterschalen während der normalen Arbeitsstunden zu ermöglichen, wurde der zirkadiane Biorhythmus stufenweise zwischen den Tagen 16 und 18 umgedreht, indem man die aktive Phase der Ratten jeden Tag zu drei Gelegenheiten vorverschob, indem man die automatische Lichtsteuerung einstellte.
  • Am Tag 16/17 wurde der Beginn der aktiven Periode von 18:00 auf 15:00 Uhr nach vorn verschoben, d.h. es war Nacht von 15:00–03:00 Uhr, und es war von da ab Tag. Am Tag 17/18 wurde der Beginn der aktiven Periode von 15:00 auf 12:00 Uhr verschoben, d.h. es war Nacht von 12:00 bis 00:00 Uhr, und Tag von 00.00 Uhr an.
  • Schließlich wurde am Tag 18/19 der Beginn der aktiven Periode von 12:00 auf 10:00 Uhr vorverlegt, d.h. es war Nacht von 10:00 bis 22:00 Uhr und Tag von 22:00 Uhr an.
  • Bis zum Tag 19 war die Verschiebung der aktiven Phase der Ratten von den Stunden der Dunkelheit auf die normalen Arbeitsstunden (10:00–22:00 Uhr) abgeschlossen.
  • Am Tag 20 wurden die Muttertiere entfernt, und man begann damit, die Ratten ad libitum mit der modifizierten Diät 2000a zu füttern, die 40% Saccharose, 28% Magermilchersatz (Sojaproteinextrakt SVPRO-PP 1611 39,4%, Lactose 49,3%, 0,6%, L-Methionin 0,3%, L-Lysin HCl 0,1%), 24% Weizenmehl, 5% Brauereihefe, 2% Gevral® Instantprotein (Whitehall-Robins SA, 6301 Zug, Schweiz) und 1% NaCl enthielt.
  • Während des Assoziationszeitraums (Tage 21 und 22) wurde das Trinkwasser mit 2% Glucose und 2% Saccharose ergänzt, um die Einpflanzung der assoziierten Bakterien zu unterstützen. Am Tag 23 wurden die Würfe auf die 3 Behandlungen verteilt, ein Tier pro Käfig, in einer programmierten Füttermaschine, und sie begannen, die Testdiät zu erhalten, wie in Tabelle 10 angegeben ist. Die Testdiät bestand aus 18 Jogurtmahlzeiten, die die Teststämme enthielten, die mit 18 Mahlzeiten der modifizierten Diät 2000a alternierten, die vorher beschrieben wurde.
  • Trinkwasser wurde ad libitum gegeben. Im Anschluss an die Abstrichprozedur am Tag 58 erhielten die Tiere eine Überdosis Thiopental Natrium (100 mg/kg Körpergewicht), die durch intra-peritoneale Injektion verabreicht wurde, und sie wurden enthauptet, wenn sie im Koma lagen.
  • Bakterienstämme: Die in Tabelle 8 aufgeführten Stämme wurden verwendet.
  • Tabelle 8. Die in dieser Untersuchung verwendeten Bakterienstämme
    Figure 00180001
  • Herstellung der untersuchten LAB-Stämme für die Assoziie rung.
  • Es wurde eine Vorstudie durchgeführt, um die Wachstumsparameter zu bestimmen, insbesondere die Stunden, die benötigt wurden, dass die stationäre Phase bei den genauer beschriebenen spezifischen Bedingungen erreicht wird. Es wurde daher festgesetzt, die S. thermophilus-Stämme 7 h und den L. lactis-Stamm 6 h wachsen zu lassen. Es wurde ferner eine Untersuchung der Lebensfähigkeit nach dem Einfrieren der Milchstämme durchgeführt, indem man die gleiche Zellsuspension vor und nach dem Einfrieren ausstrich. Um sie mit den Tieren zu assoziieren, wurden die Milchstämme nach der folgenden Vorgehensweise behandelt.
  • Vorgehensweise
    • – Beimpfe die Stämme 1% über Nacht aus einem Glycerinvorrat in ein geeignetes Medium.
    • – Beimpfe sie zu 5% aus dieser Kultur in 10 Ansätze von 4 Litern ihres auf die optimale Wachstumstemperatur erwärmten Mediums, und lasse sie wachsen, bis zum Ende der log-Phase, dem Beginn der stationären Phase.
    • – Bestimme die Endwerte KBE/ml durch Ausstreichen auf M17-Lactose-Agar aus zwei zufällig ausgewählten Ansätzen für jeden der 4 Stämme. Inkubiere die Platten über Nacht unter Anaerobiose.
    • – Zentrifugiere die Kulturen eines jeden Ansatzes bei 6000 U/min für 10 min und resuspendiere die Pellets in 150 ml frischem Medium; halte sie über Nacht bei 4°C.
    • – Zentrifugiere wieder und re-suspendiere im Gefriermedium (15% Glycerin in Belliker oder M17).
    • – Teile in Teilmengen auf, um 2 × 1011 lebensfähige Zellen/Ampullen zu erhalten, wobei der Verlust an Lebensfähigkeit aufgrund des Einfrierens in Rechnung gestellt wird, und lagere bei –20°C, bis sie benötigt werden.
  • Assoziation der Tiere mit den Bakterienstämmen
  • Die Tiere wurden in 3 Behandlungen aufgeteilt (Tabelle 9). Jede Behandlung bestand aus 10 Jungen, die zu ein Tier pro Käfig verteilt wurden.
  • Tabelle 9. Anordnung der Behandlungen
    Figure 00200001
  • Alle Ratten wurden das erste Mal an den Tagen 21 und 22 mit A. viscosus OMZ105 infiziert.
  • Die getesteten LAB-Stämme wurden täglich assoziiert (da sie in der Joghurt-Grundmahlzeit enthalten waren), beginnend am Tag 23. 2 gefrorene Ampullen, die jeweils 2 × 1011 lebensfähige Zellen des Teststamms enthielten, wurden in 200 ml Joghurt eingemischt, um wenigstens 109 KBE/ml zu erhalten. S. thermophilus NCC1536, ein nicht an S-HA haftender Stamm, wurde als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Joghurt- und Diät 2000a-Mahlzeiten, von 1 ml bzw. 400 mg, wurden alternativ 18 mal pro Tag in 20 min-Intervallen angeboten (Tabelle 10). Jedes Tier erhielt daher insgesamt 18 ml Joghurt und 7,2 g pulverförmige Diät.
  • Die Mahlzeiten wurden in Futterschalen einer programmierten Fütterungsmaschine ausgegeben, die den Tieren die richtige Mahlzeit zum exakten Zeitpunkt anbot.
  • Tabelle 10. Esszeiten
    Figure 00210001
  • Bakteriologische Bewertung
  • Von fünf Ratten pro Behandlung wurden am Tag 58 Abstriche genommen. Die Abstrichsuspensionen wurden entweder zur Zählung der KBE (koloniebildenden Einheiten) auf Petri-Schalen ausgestrichen oder zur Immunofluoreszenz für die TCN (total cells number)-Zählungen auf Glasträgern immobilisiert.
  • Vorgehensweise für KBE-Bestimmung
    • – Gewinne Abstriche von den Rattenzähnen mit einem Stäbchen mit einer sterilen Baumwollspitze und gebe dieses sofort in 5 ml einer 0,9%igen NaCl.
    • – Rühre 1 min und beschalle 5 s bei 50 W.
    • – Streiche ordnungsgemäß verdünnte Suspensionen auf CBA, MS und HJL-Agar spiralförmig aus.
    • – Inkubiere CBA und MS-Platten bei 37°C und HHJL-Platten bei 45°C.
  • Vorgehensweise für TCN-Bestimmung
    • – Gebe 10 μl der unverdünnten Abstrichsuspension, die für die KBE-Bestimmung hergestellt worden war, pro Vertiefung auf einen Glasträger mit 24 Vertiefungen (Dynatech Produkte AG, Embrach Embraport, Schweiz), und lufttrockne.
    • – Fixiere durch Einweichen in Methanol für 2 min und lufttrockne.
    • – Inkubiere mit 10 μl des richtigen Antikörpers oder Serums, verdünnt in ELISA-Puffer (Abschnitt 4.2.2.5) und inkubiere bei 37°C für 30 min.
    • – Sauge jeden Tropfen von der Seite der Vertiefung an und Wasche dadurch, dass man den Träger zuerst in ELISA-Pulver einweicht und dann in destilliertem Wasser. Lufttrockene.
    • – Bringe 10 μl eines Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (H+L) – FITC (Sigma), verdünnt 1:400, zur Anwendung und inkubiere bei 37°C 30 min.
    • – Wasche wie zuvor und lufttrockne
    • – Bringe 49 μl eines Montagefluids (Abschnitt 4.2.2.5) zur Anwendung, bedecke mit einem Glasträger und zähle die fluoreszierenden Zellen mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.
  • Statistik
  • Daten wurden mit einem Zweiwege-ANOVA (Snedecor und Cochran, 1980) behandelt.
  • ERGEBNISSE aus der kontinuierlichen Assoziation der Milchstämme durch Füttern eines gekühlten Produkts auf Milchbasis.
  • Bakteriologische Bewertung (Tabelle 11)
    • – Kolonisation des Stammes. 1,7 (± 1,1) × 107 KBE wurden für den Belag-bildenden A. viscosus OMZ105 gezählt, wenn das Milchprodukt mit der nicht-haftenden S. thermophilus-Kontrolle (NCC1536) ergänzt wurde. Die Milchstämme konnten nach mikrobiologischen Verfahren nicht gezählt werden. Es wurde jedoch eine qualitative Bewertung mittels Immunofluoreszenz versucht. Die drei anhaftenden Milchstämme konnten in den Plaque-Proben aus den Behandlungen 2 und 3 erkannt werden. Da sie mit anderen oralen Bakterien und Mundtrümmern koaggregiert waren, wodurch große Cluster gebildet wurden, war eine präzise Quantifizierung unmöglich.
    • – Variationen der Gesamtflora (TF). Die drei Behandlungen, die die haftenden getesteten Stämme S. thermophilus NCC1561 und L. lactis NCC2211 enthielten, zeigten signifikant vermindernde Zahlen von Kolonie-bildenden Einheiten auf CBA, verglichen mit der Kontrollgruppe, die den nicht-haftenden Stamm S. thermophilus NCC1536 enthielt (Tabelle 11). Die Behandlung 2 verminderte die KBE-Zählungen mit einem signifikanten Faktor von PF < 0,01, und die Behandlung 3 sogar noch signifikanter (PF < 0,001).
    • – Modulation einer Zahnbesiedlung durch A. viscosus OMZ105 durch die getesteten Stämme
  • Im Falle des Plaque-bildenden Bakteriums A. viscosus OMZ105 wurde eine scheinbar weniger ausgeprägte, jedoch signifikantere Verminderung der Zahl von Kolonie-bildenden Einheiten für die drei Behandlungen beobachtet, die die getesteten haftenden Stämme enthielten, bezogen auf Behandlung 1 (PF < 0,01) (Tabelle 11). Im Gegensatz dazu waren die prozentualen Werte von A. viscosus bei den Gesamt-KBE/Zählungen nicht signifikant verschieden. Etwa 50% der Gesamt-KBE für alle vier Behandlungen wurden als A. viscosus-Kolonien identifiziert.
  • Tabelle 11. Mittelwerte pro Ratte von Kolonie-bildenden Einheiten für die Gesamtflora (TF) und A. viscosus OMZ105 und ihre entsprechenden prozentualen Werte (N = 5).
    Figure 00240001
    • Behandlungen 2–3 wurden mit Behandlung 1 verglichen.
    • SEM = Standardfehler des Mittelwerts,
    • n.s. = nicht signifikant.
    • CBA = Columbia Blood Agar, MS = Mitis-salivarius Agar. OMZ105: A. naeslundii Genospecies 2.
  • Bei diesem in vivo-Test zeigten die Stämme, die täglich zugeführt wurden, einen klaren inhibitorischen Effekt auf die Gesamtmikroflora, deren KBE signifikant abnahm. Diese Abnahme kann erklärt werden durch den Wachstumsantagonismus der Milchstämme gegenüber den oralen Spezies. Beispielsweise können in vitro alle von ihnen, einschließlich des nicht an S-HA haftenden S. thermophilus NCC1536, das Wachstum von A. viscosus OMZ105 inhibieren. In vivo kann ein derartiger Effekt nur für die S-HA anhaftenden Stämme gezeigt werden, da er in den Behandlungen 2–4, bezogen auf die erste, festgestellt wurde.
  • Insbesondere, weil die Tiere mit A. viscosus OMZ105 infiziert worden waren, war die Quantifizierung dieses belagbildenden Organismus am Ende des Versuchszeitraums möglich, und die Abnahme seiner KBE konnte genau überwacht werden.
  • Die Prozentzahlen von A. viscosus OMZ105, bezogen auf die Gesamt KBE nahmen nicht parallel dazu ab, weshalb man folgern kann, dass der Wachstumsantagonismuseffekt auch gegenüber anderen Spezies in Erscheinung trat, d.h., Veillonellae, und dass es folglich ein globaler Effekt ist, der beobachtet wird.
  • Somit sind die Stämme CNCM I-1985 und CNCM I-1986 in der Lage, die orale mikrobielle Ökologie zu modulieren, den Besiedlungsgrad durch A. naeslundii Genospecies 2 signifikant zu vermindern, mit der die Ratten infiziert worden waren.
  • Beispiel 3: Produktion und erste Analyse von Tensidsubstanzen aus S. thermophilus NCC1561 und S. thermophilus NCC1536.
  • S. thermophilus NCC1561 und S. thermophilus NCC1536 wurden über Nacht in 1 l Belliker bei 42°C gezüchtet. Zur Biotensidproduktion wurde die von Busscher et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 3810–3817, (Busscher et al., 1997) beschriebene Vorgehensweise angewandt.
  • Herstellung der Tensidsubstanzen
  • Vorgehensweise
    • – Wasche Zellen dreimal in PBS
    • – Resuspendiere in 200 ml destilliertem Wasser oder PBS
    • – Erzeuge das Biotensid durch leichtes Rühren der Suspension für 2 oder 4 Stunden bei Raumtemperatur
    • – Trenne Bakterien durch Zentrifugation bei 10000 U/min für 10 min ab
    • – Zentrifugiere den Überstand zweimal bei 10000 U/min für 10 min
    • – Gefriertrockne und Wiege sowohl das Pellet als auch die Lösung der Tensidsubstanzen.
  • Die rohe Biotensidsuspension wurde zuerst durch SDS-PAGE analysiert und dann Messungen der Oberflächenspannung unterzogen.
  • Vorgehensweise für SDS-PAGE
  • SDS-PAGE wurde ausgeführt mit einem vorgegossenen 12,5% ExcelGel (Amersham Pharmacia Biotech). Eine Silberanfärbung wurde durchgeführt mit dem Plusone Silver Staining Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
  • Vorgehensweise für die Messung der Oberflächenspannung
  • Die Oberflächenspannung der Biotensidsuspensionen wurde mit einem TVT1-Tropfenvolumen-Tensiometer (Lauda, Lauda-Königshofen, Deutschland) gemessen, das auf dem Prinzip des Tropfenvolumens beruht. Kurz gesagt, besteht das Verfahren in der genauen Bestimmung des Volumens eines Suspensionstropfens, der sich von einer Kapillare ablöst. Dieses Volumen (das kritische Volumen) ist der Oberflächenspannung (σ) proportional, deren Wert mit der Beziehung errechnet wird: σ = V g ΔρF/2πrcap,worin:
    • σ
    die Grenzflächenspannung ist
    V
    das Tropfenvolumen ist
    G
    die Beschleunigungskonstante ist
    Δρ
    der Unterschied der Dichten der beiden aneinandergrenzenden Phasen ist
    F
    der Korrekturfaktor ist
    rcap
    der Radius der Kapillare ist
  • Die Messungen wurden zweifach bei 37°C gegen Luft durchgeführt. Jede Messung bestand aus 10 Zyklen. Die Lösung von 6 mg/ml des freigesetzten rohen Produkts führte zu einer Abnahme der Wasser-Oberflächenspannung von 70 auf 51 mN/m (Tabelle 13). Das SDS-PAGE-Profil der von den Bakterien freigesetzten Produkte zeigte, dass in der Lösung viele unterschiedliche Substanzen proteinischer Natur vorhanden waren.
  • Tabelle 13. Werte für die Oberflächenspannung der Biotensidsuspensionen, verglichen mit Wasser und PBS. Die Werte sind das Mittel aus zwei Versuchen, von denen jeder aus zehn Messungen bestand.
    Figure 00270001
  • ERGEBNIS
  • S. thermophilus NCC1561 und S. thermophilus NCC1536 sind in der Lage Substanzen mit einer oberflächenaktiven Wirkung freizusetzen. Es ist daher möglich, dass das Biotensid, das von S. thermophilus NCC1561 produziert wird, dazu führt, dass sich das Bakterium selbst und die anderen oralen Stämme, die sich in seiner Nähe etabliert haben, von der Zahnoberfläche lösen. Im Gegensatz dazu wurde eine solche Wirkung nicht für S. thermophilus NCC1536 gezeigt, da dieser Stamm nicht an den Zähnen haftet.
  • BEISPIEL 4: ZAHNPASTA
  • Eine Zahnpasta wird hergestellt, indem man 105 KBE/ml von wenigstens einem der Milchsäurebakterienstämme CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM I-1986, CNCM I-1987 in lyophilisierter Form zu der folgenden Mischung zusetzte, die enthielt: 1,65% Cetylpyridiniumchlorid, 33,0% Sorbit (70%ige Lösung), 25,0% Glycerin, 2,0% Natriumcarboxymethylcellulose, 0,25% Natriumfluorid, 26,3% Kieselsäure (RP 93), 8,1% Kieselsäure-Verdickungsmittel (Sident 22), 0,5% Natriumsaccharin, 3,2% Poloxamer (Pluronic F108).
  • Diese Zahnpasta ist für die Prophylaxye oder Behandlung von Wurzelkaries, Zahnbelag und anderen Infektionen bestimmt, die durch A. naeslundii Species ausgelöst werden.
  • BEISPIEL 5: JOGHURT
  • 5 l MRS-Kulturmedium werden 15 min bei 121°C sterilisiert und dann mit 5 Vol.-% einer aktiven Kultur von wenigstens einem der Stämme S. thermophilus CNCM I-1984, CNCM I-1985 beimpft, die etwa 109 KHE/ml enthielt. Bei einer Inkubation für 8 h bei 41°C wird eine Startkultur erhalten, die 4,5·108 KBE/ml enthält.
  • 5 l rekonstituierte Magermilch mit einem Trockenmassegehalt von 10%, zu der 0,1% Hefeextrakt zugesetzt wurde, werden 15 min bei 121°C sterilisiert und mit 2% einer aktiven Kultur eines kommerziellen eindickenden Streptococcus thermophilus beimpft, die etwa 109 Zellen/ml enthielt. Nach der Inkubation für 4 h bei 41°C wird eine Startkultur erhalten, die 4,5·108 Zellen/ml enthält.
  • Ein Ansatz Vollmilch, die 3,7% Fette enthielt und mit 2,5% Magermilchpulver angereichert und dann für 30 min bei 90°C pasteurisiert wurde, wird dann mit 2 Vol.-% der Startkultur von wenigstens einem der Stämme CNCM I-1984, CNCM I-1985 und 3 Vol.-% der Startkultur des eindickenden Streptococcus thermophilus beimpft. Die beimpfte Milch wird gerührt, in Töpfe gegossen und 4 h bei 41°C inkubiert.
  • Der erhaltene Joghurt wies eine gute feste und glatte Textur auf und ist für die Gesundheit des Mundes bestimmt.
  • Beispiel 6: KAUGUMMI
  • Ein Kaugummi zur Prävention oder Behandlung von Wurzelkaries, Zahnbelag oder anderen von A. naeslundii ausgelösten Erkrankungen kann hergestellt werden, indem man eine aktive Kultur von wenigstens einem der S. thermophilus-Stämme CNCM I-1984, CNCM I-1985 zusetzte, so dass er etwa 104 bis 109 KBE/g enthält, und zwar zusätzlich zu den folgenden typischen Bestandteilen: 67,5% Xylit, 20% Gummibasis, 5% Calciumcarbonat, 3% Glycerin, 2% Pluronic F127, 1% Cellulosegummi, 0,5% Ballastverbindungen und 1% Aroma.
  • Beispiel 7: HAUSTIERFUTTERZUSAMMENSETZUNG
  • Haustierfutter für die Mundgesundheit wird dadurch erhalten, dass man eine Futtermischung herstellt, die aus Weizen, Weizengluten, Hühnchen und Fischmehl, Salzen, Vitaminen und Mineralstoffen erzeugt wurde. Die Ausgangsmischung wird in einen Vorkonditionierer eingespeist und befeuchtet. Die befeuchtete eingespeiste Mischung, die den Vorkonditionierer verläßt, wird dann in einen Kochextruder eingegeben und verkleistert. Die verkleisterte Matrix, die den Extruder verläßt, wird durch eine Formdüse gedrückt und extrudiert. Das Extrudat wird in Stücke geschnitten, die für die Fütterung von Hunden geeignet sind, für etwa 20 min bei etwa 110°C getrocknet und unter Bildung von Pellets abgekühlt, die eine Wasseraktivität von etwa 0,6 aufweisen.
  • Die Pellets werden mit 3 Überzugsmischungen besprüht. Jede Überzugsmischung enthält eine aktive Kultur von wenigstens einem der S. thermophilus-Stämme CNCM I-1984, CNCM I-1985, wobei eine Überzugsmischung hydriertes Sojafett als Überzugssubstrat verwendet, eine Überzugsmischung Wasser als Überzugssubstrat verwendet und eine Überzugsmischung einen Proteinverdau als Überzugssubstrat verwendet. Die Pellets enthalten etwa 104 bis 109 KBE/g der genannten Stämme.
    Figure 00300001
    • 1 En cas d'appication de la règle 6.4.d), cette date est la date à laquelle la statut d'autoritè de dèpõt internationale a ètè acquis.
    • Formule BP/4 (page unique)
    Figure 00310001
    • 1 En cas d'appication de la règle 6.4.d), cette date est la date à laquelle la statut d'autoritè de dèpõt internationale a ètè acquis.
    • Formule BP/4 (page unique)
    Figure 00320001
    • 1 En cas d'appication de la règle 6.4.d), cette date est la date à laquelle la statut d'autoritè de dèpõt internationale a ètè acquis.
    • Formule BP/4 (page unique)
    Figure 00330001
    • 1 En cas d'appication de la règle 6.4.d), cette date est la date à laquelle la statut d'autoritè de dèpõt internationale a ètè acquis.
    • Formule BP/4 (page unique)
    Figure 00340001
    • 1 Indiquer la date du dèpõt initial ou, si un nouvean dèpõt ou un transfert ont ètè effectuès, la plus rècente des dates pertinentes (date du nouveau dèpõt ou date du transfert).
    • 2 Dans les cas visès à la règle 10.2.a)ii) et iii), mentionner le contrõle de viabilitè le plus rècent.
    • 3 Cocher la case qui convient.
    • Formule BP/9 (pramière page)
    Figure 00350001
    • 1 Indiquer la date du dèpõt initial ou, si un nouvean dèpõt ou un transfert ont ètè effectuès, la plus rècente des dates pertinentes (date du nouveau dèpõt ou date du transfert).
    • 2 Dans les cas visès à la règle 10.2.a)ii) et iii), mentionner le contrõle de viabilitè le plus rècent.
    • 3 Cocher la case qui convient.
    • Formule BP/9 (pramière page)
    Figure 00360001
    • 1 Indiquer la date du dèpõt initial ou, si un nouvean dèpõt ou un transfert ont ètè effectuès, la plus rècente des dates pertinentes (date du nouveau dèpõt ou date du transfert).
    • 2 Dans les cas visès à la règle 10.2.a)ii) et iii), mentionner le contrõle de viabilitè le plus rècent.
    • 3 Cocher la case qui convient.
    • Formule BP/9 (pramière page)
    Figure 00370001
    • 1 Indiquer la date du dèpõt initial ou, si un nouvean dèpõt ou un transfert ont ètè effectuès, la plus rècente des dates pertinentes (date du nouveau dèpõt ou date du transfert).
    • 2 Dans les cas visès à la règle 10.2.a)ii) et iii), mentionner le contrõle de viabilitè le plus rècent.
    • 3 Cocher la case qui convient.
    • Formule BP/9 (pramière page)

Claims (12)

  1. Verwendung eines Milchsäurebakterienstammes, der bezüglich der oralen Mikroflora exogen ist, der aufgrund seiner Fähigkeit, am Belaghäutchen der Zähne zu haften und einen Wachstumsinhibierungsfaktor zu erzeugen, ausgewählt wurde, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen bei Säugetieren bestimmt ist, die eine Beziehung zu Actinomyces naeslundii aufweisen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Herkunft des Milchsäurebakterienstamms aus Milch ist.
  3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei der Milchsäurebakterienstamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis und Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Milchsäurebakterienstamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Stämmen CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM I-1986, CNCM I-1987 besteht.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zusammensetzung eine essbare Zusammensetzung ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zusammensetzung wenigstens 104–109 KBE/g des Milchsäurebakterienstamms enthält.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Milchsäurebakterienstamm mit einem Bacteriocin kombiniert ist.
  8. Zusammensetzung zur Aufrechterhaltung der Gesundheit des Mundes durch Verminderung der Kolonisation von Actinomyces naeslundii bei Säugetieren, wobei die Zusammensetzung wenigstens einen Milchsäurebakterienstamm enthält, der bezüglich der oralen Mikroflora exogen ist, der aufgrund seiner Fähigkeit, am Belaghäutchen der Zähne zu haften und einen Wachstumsinhibierungsfaktor zu erzeugen, ausgewählt wurde.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, die außerdem ein Bacteriocin umfasst.
  10. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 8 oder 9, die wenigstens einen Milchsäurebakterienstamm umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis und Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis.
  11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, die wenigstens einen Milchsäurebakterienstamm umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Stämmen CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM I-1986, CNCM I-1987 besteht.
  12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, die wenigstens 104–109 KBE/g des Milchsäurebakterienstammes umfasst.
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