JP2003534362A - アクチノマイセスナエスルンディイ関連疾患に対する外因性乳酸菌株の使用法 - Google Patents
アクチノマイセスナエスルンディイ関連疾患に対する外因性乳酸菌株の使用法Info
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Abstract
(57)【要約】
歯の外皮に付着して増殖抑制因子を産生する能力について選択された口内細菌叢外に存在する乳酸菌株の、歯垢軽減、及び哺乳動物におけるActinomyces naeslundiiに関連する歯根う蝕及び他の疾患の予防及び治療を意図した組成物の調製のための使用。
Description
【0001】
(技術分野)
この発明は、アクチノマイセス ナエスルンディイ(A.naeslundi
i)の定着を調節し、A.naeslundii−関連疾患の重症度を減じるこ
とができる外因性乳酸菌の口内細菌叢への取り込みに関する。
i)の定着を調節し、A.naeslundii−関連疾患の重症度を減じるこ
とができる外因性乳酸菌の口内細菌叢への取り込みに関する。
【0002】
(背景技術)
口の中(口腔)には、定住及び非定住細菌叢がある。前者は、口腔表面上の多
少永続的な定住を確立させることのできる微生物を含む。これらの細菌は、主に
、舌、頬粘膜、歯の上に局在するが、一方、歯肉、唇、頬、口蓋、口床はごくま
ばらな細菌叢を維持しているにすぎない。
少永続的な定住を確立させることのできる微生物を含む。これらの細菌は、主に
、舌、頬粘膜、歯の上に局在するが、一方、歯肉、唇、頬、口蓋、口床はごくま
ばらな細菌叢を維持しているにすぎない。
【0003】
歯垢(デンタルプラーク)は、細胞外ポリサッカライドと唾液生成物のマトリ
ックス中の細菌細胞から成る歯の表面に生じるフィルムである。歯は、萌出直後
、唾液の無定形層、即ち通常の歯口の刷掃では除去できない厚さ約1.3μmの
後天性エナメル外皮(AEP)に覆われる。AEPの形成直後に、歯に細菌沈着
が起こり、8−12時間で、プラークが多層構造として顕在化する。第1層は、
主に、特異的付着−レセプター認識を経て歯に接着する細菌(最早期定着因子)
から成る;それは、類似の特異的結合を経て、あるいは、単純な並列を経て次々
に付着する第2定着因子の下層を形成する。
ックス中の細菌細胞から成る歯の表面に生じるフィルムである。歯は、萌出直後
、唾液の無定形層、即ち通常の歯口の刷掃では除去できない厚さ約1.3μmの
後天性エナメル外皮(AEP)に覆われる。AEPの形成直後に、歯に細菌沈着
が起こり、8−12時間で、プラークが多層構造として顕在化する。第1層は、
主に、特異的付着−レセプター認識を経て歯に接着する細菌(最早期定着因子)
から成る;それは、類似の特異的結合を経て、あるいは、単純な並列を経て次々
に付着する第2定着因子の下層を形成する。
【0004】
舌や頬粘膜上で、自然の定住細菌叢には、連鎖球菌(Streptococc
us)、ベイヨネラ(Veillonella)、バクテロイデス(Bacte
roides)、及びヘモフィルス(Haemophilus)から選択される
細菌がある。歯の上には、様々なグラム陽性及び陰性球菌及び桿菌以外に連鎖球
菌とActinomyces predominateを認めることができる。
us)、ベイヨネラ(Veillonella)、バクテロイデス(Bacte
roides)、及びヘモフィルス(Haemophilus)から選択される
細菌がある。歯の上には、様々なグラム陽性及び陰性球菌及び桿菌以外に連鎖球
菌とActinomyces predominateを認めることができる。
【0005】
これらの細菌の多くは、無害な共生関係にあるが、その多数は、若干の疾病の
病原菌であると認識されている(Hill,M.J.and Marsh,P.
D.eds.Human Microbial Ecology,1990,C
RC Press,Boca Raton Florida,USA)。
病原菌であると認識されている(Hill,M.J.and Marsh,P.
D.eds.Human Microbial Ecology,1990,C
RC Press,Boca Raton Florida,USA)。
【0006】
特に、Actinomyces naeslundii遺伝種1(もとのA.
naesulundii)及び遺伝種2(もとのA.viscosus)は、人
の歯垢の共通成分である。それらは、歯に強固に付着し、多くの他の細菌種と共
凝集する能力があるため、最強プラーク形成口内菌株の中に入り、口内でのその
定着を促す。さらに、老人では、それらは歯根う蝕部位から多く単離され、この
疾患の主要な病原菌であると考えられる(Bowden,G.H.ら、1999
,歯のエナメルからの、並びに健康及びう蝕歯根表面からのサンプルにおけるA
ctinomyces naeslundii遺伝種1及び2の主要リボタイプ
の多様性と分布。J.Dent.Res.78,1800−1809)。
naesulundii)及び遺伝種2(もとのA.viscosus)は、人
の歯垢の共通成分である。それらは、歯に強固に付着し、多くの他の細菌種と共
凝集する能力があるため、最強プラーク形成口内菌株の中に入り、口内でのその
定着を促す。さらに、老人では、それらは歯根う蝕部位から多く単離され、この
疾患の主要な病原菌であると考えられる(Bowden,G.H.ら、1999
,歯のエナメルからの、並びに健康及びう蝕歯根表面からのサンプルにおけるA
ctinomyces naeslundii遺伝種1及び2の主要リボタイプ
の多様性と分布。J.Dent.Res.78,1800−1809)。
【0007】
一過性の細菌叢は、口内に時に検出できるが、(反復経口投与しても)永続的
には定住しない体外細菌から成る。食物細菌及び特に乳酸菌は、この一過性細菌
叢の一部であり得る。
には定住しない体外細菌から成る。食物細菌及び特に乳酸菌は、この一過性細菌
叢の一部であり得る。
【0008】
これらの体外乳酸菌には、歯の外皮への付着能のあることが認められているも
のもある。例えば、WO 00/09080 は、口内の定住細菌叢の一部ではなく、低酸性化性があり、歯の外皮への直接付
着能を有する乳酸菌株を開示している。これらの細菌は、特に、う蝕及びStr
eptococcus mutans及びStreptococcus sob
rinusなどのう蝕原性細菌によって引き起こされる歯周感染症の治療又は予
防に使用される。
のもある。例えば、WO 00/09080 は、口内の定住細菌叢の一部ではなく、低酸性化性があり、歯の外皮への直接付
着能を有する乳酸菌株を開示している。これらの細菌は、特に、う蝕及びStr
eptococcus mutans及びStreptococcus sob
rinusなどのう蝕原性細菌によって引き起こされる歯周感染症の治療又は予
防に使用される。
【0009】
体外細菌は、口内の定住細菌叢の増殖を抑制する因子を産生することもできる
。例えば、EP759469 は、口内病原菌S.sobrinus、S.sanguis、S.mutans
及びA.viscosusの発生を抑制するための、Micrococcus
variansが産生するバクテリオシンの使用を記述した。バクテリオシンの
応用は、う蝕を軽減することを考えた検討対象戦略の1つでもある。これらの分
子は、期待される抗う蝕剤として、また、口腔の細菌定着を調節する上で重要な
因子として関心を引いている。
。例えば、EP759469 は、口内病原菌S.sobrinus、S.sanguis、S.mutans
及びA.viscosusの発生を抑制するための、Micrococcus
variansが産生するバクテリオシンの使用を記述した。バクテリオシンの
応用は、う蝕を軽減することを考えた検討対象戦略の1つでもある。これらの分
子は、期待される抗う蝕剤として、また、口腔の細菌定着を調節する上で重要な
因子として関心を引いている。
【0010】
歯の外皮に直接付着することによって口腔内に定着し、A.naeslund
ii関連疾患の重症度を軽減するためにA.naeslundiiの定着を調節
できる増殖抑制因子のような因子も産生することができる菌株に関する情報を先
行技術から得られないのは、注目すべきことである。
ii関連疾患の重症度を軽減するためにA.naeslundiiの定着を調節
できる増殖抑制因子のような因子も産生することができる菌株に関する情報を先
行技術から得られないのは、注目すべきことである。
【0011】
(発明の開示)
その結果、本発明は、歯表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力のため、
歯垢を軽減することを意図した組成物の製造のため、及び、哺乳動物のActi
nomyces naeslundiiに関連する歯根う蝕又は他の疾患を治療
又は予防するために選択した、口内細菌叢にとっては外因性の乳酸菌の使用を提
供することを目的とする。
歯垢を軽減することを意図した組成物の製造のため、及び、哺乳動物のActi
nomyces naeslundiiに関連する歯根う蝕又は他の疾患を治療
又は予防するために選択した、口内細菌叢にとっては外因性の乳酸菌の使用を提
供することを目的とする。
【0012】
乳酸菌は、Streptococcus thermophilus、Lac
tococccus lactis亜種lactis及びLactococcu
s lactis亜種lactis biovar diacetylacti
sから成る群から、並びに、特に、CNCM I−1984株、CNCM I−
1985株、CNCM I−1986株、CNCM I−1987株から成る群
から選択するのがよい。
tococccus lactis亜種lactis及びLactococcu
s lactis亜種lactis biovar diacetylacti
sから成る群から、並びに、特に、CNCM I−1984株、CNCM I−
1985株、CNCM I−1986株、CNCM I−1987株から成る群
から選択するのがよい。
【0013】
従って、上記の乳酸菌は、歯の表面に定着し、増殖抑制因子を産生することに
よって、Actinomyces naeslundiiの範囲の有意な減少を
発揮し、それによって、歯垢、歯根う蝕及び他のActinomyces na
eslundii関連疾患を軽減することができる。
よって、Actinomyces naeslundiiの範囲の有意な減少を
発揮し、それによって、歯垢、歯根う蝕及び他のActinomyces na
eslundii関連疾患を軽減することができる。
【0014】
他の目的は、Actinomyces naeslundiiの定着を軽減す
ることによって口内の健康を維持するための組成物であって、歯の表面に付着し
、増殖抑制因子を産生する能力について選択した外因性乳酸菌を含む上記組成物
を提供することである。
ることによって口内の健康を維持するための組成物であって、歯の表面に付着し
、増殖抑制因子を産生する能力について選択した外因性乳酸菌を含む上記組成物
を提供することである。
【0015】
上記の組成物は、少なくとも104−109cfu/gの乳酸菌を含有すること
ができる。
ができる。
【0016】
本発明は、歯の表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力について選択した
少なくとも1種類の乳酸菌株を含有する組成物であって、Actinomyce
s naeslundiiの定着を軽減する上記組成物を哺乳動物に与える段階
を含む、Actinomyces naeslundii関連感染症、特に哺乳
動物の歯垢範囲と歯根う蝕の予防又は治療のための方法も提供する。
少なくとも1種類の乳酸菌株を含有する組成物であって、Actinomyce
s naeslundiiの定着を軽減する上記組成物を哺乳動物に与える段階
を含む、Actinomyces naeslundii関連感染症、特に哺乳
動物の歯垢範囲と歯根う蝕の予防又は治療のための方法も提供する。
【0017】
(発明の詳細な説明)
以下の説明で、口は、口内粘膜(歯肉、唇、頬、口蓋及び口床)、舌及び歯(
人工的構造物を含む)から成る、人又はペットなどの動物の口腔と定義する。
人工的構造物を含む)から成る、人又はペットなどの動物の口腔と定義する。
【0018】
「増殖抑制因子」という用語は、A.naeslundiiの増殖を抑制する
ことを可能にする付着外因性乳酸菌によって産生される細胞外物質と定義される
。
ことを可能にする付着外因性乳酸菌によって産生される細胞外物質と定義される
。
【0019】
本発明の第1の目的は、歯の表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力につ
いて、歯垢軽減を意図した組成物の製造のために、及び、Actinomyce
s naeslundiiに関連する歯根う蝕及び他の疾患の治療又は予防のた
めに選択した外因性乳酸菌の使用に関する。
いて、歯垢軽減を意図した組成物の製造のために、及び、Actinomyce
s naeslundiiに関連する歯根う蝕及び他の疾患の治療又は予防のた
めに選択した外因性乳酸菌の使用に関する。
【0020】
乳酸菌は、Streptococcus thermophilus、Lac
tococccus lactis亜種lactis及びLactococcu
s lactis亜種lactis biovar diacetylacti
sから成る群から、並びに、特に、Streptococcus thermo
philus株(NCC 1529)(CNCM I−1984)、Strep
tococcus thermophilus株(NCC 1561)(CNC
M I−1985)、Lactococcus lactis亜種lactis
株(NCC 2211)(CNCM I−1986)、 Lactococcu
s lactis亜種lactis biovar diacetylacti
s株(NCC 2225)(CNCM I−1987)から成る群から選択する
ことができる。
tococccus lactis亜種lactis及びLactococcu
s lactis亜種lactis biovar diacetylacti
sから成る群から、並びに、特に、Streptococcus thermo
philus株(NCC 1529)(CNCM I−1984)、Strep
tococcus thermophilus株(NCC 1561)(CNC
M I−1985)、Lactococcus lactis亜種lactis
株(NCC 2211)(CNCM I−1986)、 Lactococcu
s lactis亜種lactis biovar diacetylacti
s株(NCC 2225)(CNCM I−1987)から成る群から選択する
ことができる。
【0021】
乳酸菌は、乳製品由来であるのが好ましい(即ち、例えばミルク又はチーズに
由来する)。 本発明に係る乳酸菌は「低酸性化性」であり、これは病原株より酸性化性が低
いことを意味する。従って、それは約5.5〜7の口腔内pHに貢献し得る。
由来する)。 本発明に係る乳酸菌は「低酸性化性」であり、これは病原株より酸性化性が低
いことを意味する。従って、それは約5.5〜7の口腔内pHに貢献し得る。
【0022】
これらの菌株は、歯の外皮への付着能について乳酸菌株間で選択されており、
その至適増殖温度は、口腔内温度の約37℃である。また、それらは、その付着
性と組み合わせて、A.naeslundii遺伝種1及び2の定着範囲を有意
に減少させることを可能にする増殖抑制因子を産生することもできる。
その至適増殖温度は、口腔内温度の約37℃である。また、それらは、その付着
性と組み合わせて、A.naeslundii遺伝種1及び2の定着範囲を有意
に減少させることを可能にする増殖抑制因子を産生することもできる。
【0023】
さらに、それらはグルコース及びスクロースを発酵させることができ、う蝕原
性菌株の病原性因子であるグルカンを合成しない。
性菌株の病原性因子であるグルカンを合成しない。
【0024】
例えば、少なくとも1種類の乳酸菌株をバクテリオシンと配合して使用するこ
ともできる。
ともできる。
【0025】
乳酸菌株は、例えば、食品、ペットフード、化粧品又は医薬組成物中に含ませ
ることができる。従って、これらの組成物は、例えば、歯磨きペースト、マウス
リンス、ガム、スプレー、飲料水、キャンディー、粉ミルク、アイスクリーム、
フローズンデザート、スイートサラダドレッシング、乳調製物、チーズ、クオー
ク、ヨーグルト、酸性乳、コーヒークリーム又はホイップクリームであることが
好ましい。
ることができる。従って、これらの組成物は、例えば、歯磨きペースト、マウス
リンス、ガム、スプレー、飲料水、キャンディー、粉ミルク、アイスクリーム、
フローズンデザート、スイートサラダドレッシング、乳調製物、チーズ、クオー
ク、ヨーグルト、酸性乳、コーヒークリーム又はホイップクリームであることが
好ましい。
【0026】
外因性乳酸菌は、少なくとも104−109cfu/gの乳酸菌量で使用するこ
とができる。
とができる。
【0027】
口内細菌叢中の上述の細菌を取り込む効果をラットモデルで検討した。CNC
M I−1985株及びCNCM−1986株は、口内細菌生態を調節し、総C
FU数を有意に減少させることができた。より具体的には、これらの菌株は、ラ
ットが感染していたA.naeslundii遺伝種2の定着範囲を有意に減少
させることができた(実施例参照)。
M I−1985株及びCNCM−1986株は、口内細菌生態を調節し、総C
FU数を有意に減少させることができた。より具体的には、これらの菌株は、ラ
ットが感染していたA.naeslundii遺伝種2の定着範囲を有意に減少
させることができた(実施例参照)。
【0028】
選択菌株の生化学的特徴付け
【0029】
発酵パターン:49種類の単糖をapi 50 CH bioMerieux
ストリップ試験 で検討し、結果を表1に示す。
ストリップ試験 で検討し、結果を表1に示す。
【0030】
表1.L.lactis CNCM I−1987(A)、L.Lactis
CNCM I−1986(B)、S.thermophilius CNCM
I−1984(C)、S.thermophilus CNCM I−1985
(D)の糖発酵。 +、++、+++、++++は、発酵が始まったのが3、6、24又は48時間
後であるのかを示す。
CNCM I−1986(B)、S.thermophilius CNCM
I−1984(C)、S.thermophilus CNCM I−1985
(D)の糖発酵。 +、++、+++、++++は、発酵が始まったのが3、6、24又は48時間
後であるのかを示す。
【0031】
Streptococcus thermophilus(NCC 1529
)株、Streptococcus thermophilus株(NCC 1
561)、Lactococccus lactis亜種lactis(NCC
2211)株及びLactococcus lactis亜種lactis
biovar dioacetylactis(NCC 2225)株は、ブダ
ペスト協定に従って、Collection Nationale de Cu
lture de Microorganismes (それぞれCNCM I
−1984,CNCM I−1985,CNCM I−1986及びCNCM
I−1987)、25 rue du docteur Roux,75724
Paris,Franceに1998年3月3日に寄託した。
)株、Streptococcus thermophilus株(NCC 1
561)、Lactococccus lactis亜種lactis(NCC
2211)株及びLactococcus lactis亜種lactis
biovar dioacetylactis(NCC 2225)株は、ブダ
ペスト協定に従って、Collection Nationale de Cu
lture de Microorganismes (それぞれCNCM I
−1984,CNCM I−1985,CNCM I−1986及びCNCM
I−1987)、25 rue du docteur Roux,75724
Paris,Franceに1998年3月3日に寄託した。
【0032】
本発明の第2の主目的は、哺乳動物におけるA.naeslundiiの定着
を軽減することによって口内の健康を維持するための組成物に関するもので、前
記組成物は、歯の表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力について選択した
外因性乳酸菌を含む。
を軽減することによって口内の健康を維持するための組成物に関するもので、前
記組成物は、歯の表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力について選択した
外因性乳酸菌を含む。
【0033】
これらの組成物は、特に、歯垢及びA.naeslundiiに関連する例え
ば歯根う蝕などの感染症の予防又は治療を意図する。
ば歯根う蝕などの感染症の予防又は治療を意図する。
【0034】
本発明に記載の乳酸菌株は、Streptococcus thermoph
ilus、Lactococccus lactis亜種lactis及びLa
ctococcus lactis亜種lactis biovar diac
etylactisから成る群から、好ましくはCNCM I−1984株、C
NCM I−1985株、CNCM I−1986株、CNCM I−1987
株から成る群から選択する。
ilus、Lactococccus lactis亜種lactis及びLa
ctococcus lactis亜種lactis biovar diac
etylactisから成る群から、好ましくはCNCM I−1984株、C
NCM I−1985株、CNCM I−1986株、CNCM I−1987
株から成る群から選択する。
【0035】
上記の組成物は、少なくとも104−109cfu/gの乳酸菌を含有すること
ができる。
ができる。
【0036】
相乗効果組成物は、グラム陽性口内細菌に作用する少なくとも1種類のバクテ
リオシンを添加して製造することができる。その場合、口内衛生組成物は、組成
物の重量で0.00001−50%、好ましくは0.00001−15%の精製
バクテリオシンを含むことができる。バクテリオシンは、バリアシン(vari
acin)であるのが好ましい(EP 0 759 469)。
リオシンを添加して製造することができる。その場合、口内衛生組成物は、組成
物の重量で0.00001−50%、好ましくは0.00001−15%の精製
バクテリオシンを含むことができる。バクテリオシンは、バリアシン(vari
acin)であるのが好ましい(EP 0 759 469)。
【0037】
組成物を分解から保護するため、油溶性抗酸化剤も添加することができる。適
した抗酸化剤としては、「トコフェロール類」、ブチル−ヒドロキシアニソール
(BHA)、ブチル−ヒドロキシトルエン(BHT)及びアスコルビルパルミテ
ートが挙げられる。油溶性抗酸化剤は、組成物の重量で0.005%−0.5%
、好ましくは0.005%−0.01%の量で存在する。
した抗酸化剤としては、「トコフェロール類」、ブチル−ヒドロキシアニソール
(BHA)、ブチル−ヒドロキシトルエン(BHT)及びアスコルビルパルミテ
ートが挙げられる。油溶性抗酸化剤は、組成物の重量で0.005%−0.5%
、好ましくは0.005%−0.01%の量で存在する。
【0038】
本発明の歯磨剤組成物での使用に適した研磨剤としては、炭酸カルシウム、カ
ルシウムアルミノシリケート、アルミナ、アルミナ水和物、オルトリン酸亜鉛、
プラスチック粒子及びシリカが挙げられ、中でもシリカは、好ましい研磨剤であ
る。
ルシウムアルミノシリケート、アルミナ、アルミナ水和物、オルトリン酸亜鉛、
プラスチック粒子及びシリカが挙げられ、中でもシリカは、好ましい研磨剤であ
る。
【0039】
本発明の組成物は、口内で許容可能であり、かつ、前記乳酸菌の活性が損なわ
れない範囲のpHを有することになる。pHは、3.0−9.5の範囲であるこ
とができ、好ましくは3.5−6.5の範囲である。
れない範囲のpHを有することになる。pHは、3.0−9.5の範囲であるこ
とができ、好ましくは3.5−6.5の範囲である。
【0040】
これらの組成物は、適当な相対量で成分を混合し、最後に、必要に応じて、p
Hを望みの数値に調整することから成る従来の工程によって製造することができ
る。
Hを望みの数値に調整することから成る従来の工程によって製造することができ
る。
【0041】
Actinomyces naeslundii遺伝種1(もとのA.nae
slundii)及び遺伝種2(もとのA.viscosus)は、最強のプラ
ーク形成口内菌株の中に入る。特に40才を超えた人の歯根う蝕部位から共通し
て単離され、この疾患の主要病原菌であると考えられる。
slundii)及び遺伝種2(もとのA.viscosus)は、最強のプラ
ーク形成口内菌株の中に入る。特に40才を超えた人の歯根う蝕部位から共通し
て単離され、この疾患の主要病原菌であると考えられる。
【0042】
従って、本発明は、歯表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力について選
択した少なくとも1種類の乳酸菌株を含有する組成物を哺乳動物に与える過程か
ら成る、哺乳動物のActinomyces neaslundii関連感染症
、特に歯垢範囲と歯根う蝕の予防又は治療の方法も提供する。
択した少なくとも1種類の乳酸菌株を含有する組成物を哺乳動物に与える過程か
ら成る、哺乳動物のActinomyces neaslundii関連感染症
、特に歯垢範囲と歯根う蝕の予防又は治療の方法も提供する。
【0043】
投与量は、少なくとも約104−109cfu/gの乳酸菌であることができる
。
。
【0044】
本発明は、ここに述べる特定の実施態様によって範囲が限定されるべきもので
はない。事実、本発明の各種変更態様が、ここで述べるものに加えて、前述の記
述から当業者に明らかになるであろう。上記の変更は、特許請求の範囲内に入る
ことを意図している。ここでは、各種刊行物を引用しているが、その開示は、本
発明の理解のために必要な範囲にまで、参照することによりそのまま取り込まれ
るものとする。
はない。事実、本発明の各種変更態様が、ここで述べるものに加えて、前述の記
述から当業者に明らかになるであろう。上記の変更は、特許請求の範囲内に入る
ことを意図している。ここでは、各種刊行物を引用しているが、その開示は、本
発明の理解のために必要な範囲にまで、参照することによりそのまま取り込まれ
るものとする。
【0045】
実施例1:in vitro試験
S.thermophilus NCC 1561(CNCM I−1985
)及びL.lactis亜種lactis NCC2211(CNCM I−1
986)(以下、L.lactis NCC2211)各株を、in vitr
oで歯垢を模したバイオフィルムにin vitroで組み入れた。
)及びL.lactis亜種lactis NCC2211(CNCM I−1
986)(以下、L.lactis NCC2211)各株を、in vitr
oで歯垢を模したバイオフィルムにin vitroで組み入れた。
【0046】
A.naeslundii遺伝種1(もとのA.naeslundii)OM
Z745及びA.naeslundii遺伝種2(もとのA.viscosus
)OMZ105の各口内菌株を から入手し、それらを、37℃、嫌気性様式(Gas Pack System
,BBL)においてFUM培地で培養した。
Z745及びA.naeslundii遺伝種2(もとのA.viscosus
)OMZ105の各口内菌株を から入手し、それらを、37℃、嫌気性様式(Gas Pack System
,BBL)においてFUM培地で培養した。
【0047】
全菌株をグリセロール中、−20℃で保存し、特定の至適温度で使用する前に
14時間前培養した;
14時間前培養した;
【0048】
40才以上の人の口内に共通して認められる細菌から成るバイオフィルムを唾
液被覆ヒドロキシアパタイトディスク上に作成したin vitro系に、2種
類の選択した菌株L.lactis NCC2211及びS.thermoph
ilus NCC1561を接種した。使用した成長培地であるフルイド ユニ
バーサルメジウム(FUM)を、ちょうど口内と同様に、被験株により生じる酸
性度を緩衝し、それ故継続的な成長(プラーク発生)をもたらすように特別に処
方した(Gmur及びGuggenheim,1983)。アッセイは3回行い
、日常株を用いた混合物と用いない混合物を並行して調べた。表2にリストした
株を用いた。
液被覆ヒドロキシアパタイトディスク上に作成したin vitro系に、2種
類の選択した菌株L.lactis NCC2211及びS.thermoph
ilus NCC1561を接種した。使用した成長培地であるフルイド ユニ
バーサルメジウム(FUM)を、ちょうど口内と同様に、被験株により生じる酸
性度を緩衝し、それ故継続的な成長(プラーク発生)をもたらすように特別に処
方した(Gmur及びGuggenheim,1983)。アッセイは3回行い
、日常株を用いた混合物と用いない混合物を並行して調べた。表2にリストした
株を用いた。
【0049】
表2 in vitro歯垢実験に使用した細菌株と適用した培養条件
【0050】
手順
【0051】
−唾液外皮形成:直径10mmの合成ヒドロキシアパタイトディスク(HY−A
PATITE(登録商標),Euro−Crystals,Landgraaf
,オランダ)を人の唾液800μlで覆い、震盪させながら、室温で4時間イン
キュベートする(24穴滅菌Nunclonプレート中、1枚のディスク/ウェ
ル)。
PATITE(登録商標),Euro−Crystals,Landgraaf
,オランダ)を人の唾液800μlで覆い、震盪させながら、室温で4時間イン
キュベートする(24穴滅菌Nunclonプレート中、1枚のディスク/ウェ
ル)。
【0052】
−細菌集合体の調製:S.thermophilus NCC1561、L.l
actis亜種lactis NCC2211、S.sobrinus OMZ
176、S.oralis OMZ607、A.naeslundii OMZ
745、V.dispar OMZ493及びF.nucleatum OMZ
596をFUM−グルコース、嫌気生活中、37℃で、一晩増殖させ(S.th
ermophilus NCC1561はFUM−ラクトース中で)、OD550
をFUMで1に調整し、S.thermophilus NCC1561又はL
.lactis亜種lactis NCC2211各2mlを含む各口内細菌浮
遊液2mlをプールする。対照混合液は、5種類の口内菌株のみを含有する。
actis亜種lactis NCC2211、S.sobrinus OMZ
176、S.oralis OMZ607、A.naeslundii OMZ
745、V.dispar OMZ493及びF.nucleatum OMZ
596をFUM−グルコース、嫌気生活中、37℃で、一晩増殖させ(S.th
ermophilus NCC1561はFUM−ラクトース中で)、OD550
をFUMで1に調整し、S.thermophilus NCC1561又はL
.lactis亜種lactis NCC2211各2mlを含む各口内細菌浮
遊液2mlをプールする。対照混合液は、5種類の口内菌株のみを含有する。
【0053】
−バイオフィルム形成と回収:手順は、Gggenheimら、1998、新し
いバイオフィルムモデルの有効性確認(Validation of a ne
w biofilm model.)J.Dent.Res.77,(Spec
Iss A):110(Abstract#38)で述べられている通りであ
る。
いバイオフィルムモデルの有効性確認(Validation of a ne
w biofilm model.)J.Dent.Res.77,(Spec
Iss A):110(Abstract#38)で述べられている通りであ
る。
【0054】
−バイオフィルムの培養分析:総菌数カウントとA.naeslundii識別
のため、Columbia血液寒天培地(5%ヒツジ血液、Becton Di
ckinson,Meylan Cedex、フランス)の平板上に浮遊液をら
せん状に流す。平板を嫌気生活中、37℃で48時間培養する。
のため、Columbia血液寒天培地(5%ヒツジ血液、Becton Di
ckinson,Meylan Cedex、フランス)の平板上に浮遊液をら
せん状に流す。平板を嫌気生活中、37℃で48時間培養する。
【0055】
被験口内株と乳製品菌株間の増殖拮抗作用
【0056】
使用した菌株と培養条件を表3に挙げる。
【0057】
表3 使用した細菌株と増殖拮抗作用実験に適用した培養条件
【0058】
A.naeslundii OMZ745及びA.viscosus OMZ
105(標的菌株)に対する増殖拮抗作用について、S.thermophil
us NC1561、S.thermophilus NCC1536及びL.
lactis NCC2211(キラー株)を検討した。
105(標的菌株)に対する増殖拮抗作用について、S.thermophil
us NC1561、S.thermophilus NCC1536及びL.
lactis NCC2211(キラー株)を検討した。
【0059】
手順
−キラー株を嫌気生活中、寒天平板上で、また、標的菌株をBHI中で、定常中
期まで一晩増殖させる。 −標的菌株懸濁液20μlを、グルコース及びラクトースを含有するBHI軟寒
天(寒天7g/l)3mlで希釈し、攪拌後直ちにBHI寒天平板に流す。 −室温で1時間固化し、次に、M17平板からキラー株を十字に画線する。対照
として、キラー株及び標的菌株を単独で平行して画線する。 −嫌気生活中、37℃で24時間培養する。 増殖拮抗作用は、十字の周りの阻止円によって明らかになる。
期まで一晩増殖させる。 −標的菌株懸濁液20μlを、グルコース及びラクトースを含有するBHI軟寒
天(寒天7g/l)3mlで希釈し、攪拌後直ちにBHI寒天平板に流す。 −室温で1時間固化し、次に、M17平板からキラー株を十字に画線する。対照
として、キラー株及び標的菌株を単独で平行して画線する。 −嫌気生活中、37℃で24時間培養する。 増殖拮抗作用は、十字の周りの阻止円によって明らかになる。
【0060】
統計分析
対照と被験集合体の差は、Studentのt−検定で決定した。
【0061】
結果及び考察
【0062】
S.thermophilus NCC1561及びL.lactis NC
C2211は、S−HAディスク上のプラーク様バイオフィルムに取り込み、増
殖させることができ、40.5時間後の総CFU/ディスクを表4に示す。
C2211は、S−HAディスク上のプラーク様バイオフィルムに取り込み、増
殖させることができ、40.5時間後の総CFU/ディスクを表4に示す。
【0063】
表4 バイオフィルム中の乳製品菌株2種類の取り込みレベル(CFU/ディス
ク)。数値は、標準偏差を伴う3回の実験の平均値である。
ク)。数値は、標準偏差を伴う3回の実験の平均値である。
【0064】
口内細菌種に対するバイオフィルム中の乳製品菌株取り込みの作用を表5及び
6に表す。S.thermophilus NCC1561を使用した時(表5
)、Columbia血液寒天平板(CBA)上の菌数で表す総細菌叢と口内細
菌種中4種の全体的な減少が認められた。
6に表す。S.thermophilus NCC1561を使用した時(表5
)、Columbia血液寒天平板(CBA)上の菌数で表す総細菌叢と口内細
菌種中4種の全体的な減少が認められた。
【0065】
L.lactis NCC2211を口内菌株集合体に導入すると(表6)、
総細菌叢数は顕著に減少した(CBAについてのCFU)。減少は、有意に減少
したA.naeslundii OMZ745の場合、有意であった(p=0.
021)。菌株を口内細菌以前のディスクに接種すれば、減少は、はるかに顕著
であった。
総細菌叢数は顕著に減少した(CBAについてのCFU)。減少は、有意に減少
したA.naeslundii OMZ745の場合、有意であった(p=0.
021)。菌株を口内細菌以前のディスクに接種すれば、減少は、はるかに顕著
であった。
【0066】
表5 S.thermophilus NCC1561による口内細菌集合体の
調節(CFU/ディスク) N=3*:p値は、対照に関して算出(*:p<0.05、**:p<0.01
);°:p値は、「+NCC1561」処理に関して算出(°:p<0.05;
°°:p<0.01)。
調節(CFU/ディスク) N=3*:p値は、対照に関して算出(*:p<0.05、**:p<0.01
);°:p値は、「+NCC1561」処理に関して算出(°:p<0.05;
°°:p<0.01)。
【0067】
表6 L.lactis NCC2211による口内細菌集合体の調節(CFU
/ディスク) N=3*:p値は、対照に関して算出(*:p<0.05、**:p<0.01
);°:p値は、「+NCC2211」処理に関して算出(°:p<0.05;
°°:p<0.01)
/ディスク) N=3*:p値は、対照に関して算出(*:p<0.05、**:p<0.01
);°:p値は、「+NCC2211」処理に関して算出(°:p<0.05;
°°:p<0.01)
【0068】
口内菌株の減少が乳製品菌株のそれらに対する増殖拮抗作用によるものである
か否かを立証するため、数件のアッセイを実施した(表7)。A. visco
sus OMZ105株とS.thermophilus NCC1536株も
、in vivoモデルの一部であるので、試験対象とした(実施例2)。
か否かを立証するため、数件のアッセイを実施した(表7)。A. visco
sus OMZ105株とS.thermophilus NCC1536株も
、in vivoモデルの一部であるので、試験対象とした(実施例2)。
【0069】
4種類の乳製品菌株は、すべてグラム陰性菌株A.viscosus OMZ
105の増殖を抑制した。この抑制は、乳酸の産生に起因するとは考えられない
。A.viscosusは、好気的条件下でのみ、乳酸塩を代謝でき(van
der Hoevenら(1990)Oral Microbiol.Immu
nol.5,223−225)、非常に耐酸性がある。これらの所見は、1%乳
酸の存在下でのA.viscosusの平板培養で確認されている:抑制は認め
られなかった。
105の増殖を抑制した。この抑制は、乳酸の産生に起因するとは考えられない
。A.viscosusは、好気的条件下でのみ、乳酸塩を代謝でき(van
der Hoevenら(1990)Oral Microbiol.Immu
nol.5,223−225)、非常に耐酸性がある。これらの所見は、1%乳
酸の存在下でのA.viscosusの平板培養で確認されている:抑制は認め
られなかった。
【0070】
表7 S.thermophilus NCC1561、S.thermoph
ilus NCC1536及びL.lactis NCC211による口内細菌
増殖の抑制
ilus NCC1536及びL.lactis NCC211による口内細菌
増殖の抑制
【0071】
結論
【0072】
S.thermophilus NCC1561及びL.lactis NC
C2211を歯垢を模したバイオフィルムに取り込むことができ、口内細菌叢を
調節し、総cfu数を有意に減少させることができ、より具体的には、これらの
菌株は、A.naeslundii遺伝種2の定着範囲を有意に減少させること
ができた。さらに、これらの菌株は、共培養液中でのA.naeslundii
遺伝種1及び2の増殖を抑制することができた。
C2211を歯垢を模したバイオフィルムに取り込むことができ、口内細菌叢を
調節し、総cfu数を有意に減少させることができ、より具体的には、これらの
菌株は、A.naeslundii遺伝種2の定着範囲を有意に減少させること
ができた。さらに、これらの菌株は、共培養液中でのA.naeslundii
遺伝種1及び2の増殖を抑制することができた。
【0073】
実施例2:in vivo試験
【0074】
ラットモデルについてin vivo試験を実施した。この試験では、チルド
乳製品を与える方法で、1日単位の全実験期間中、選択した菌株の吸着を続けた
。
乳製品を与える方法で、1日単位の全実験期間中、選択した菌株の吸着を続けた
。
【0075】
試験は、58日間実施した。その日のうちに実験を実施するため、動物の活動
時間を合計して7時間以内にしなければならなかった;これは更に詳述する通り
、16日、17日、18日の3段階で実施した。う蝕原性菌株は、21日目と2
2日目に吸着させたが、乳製品菌株の吸着は、23日目に開始し、57日目まで
続けた。本節で説明するように、普通食に加えたヨーグルトベース中補助添加物
として乳製品菌株をラットに与えた。ラットの歯を試験終了時、58日目に綿棒
で拭いた。
時間を合計して7時間以内にしなければならなかった;これは更に詳述する通り
、16日、17日、18日の3段階で実施した。う蝕原性菌株は、21日目と2
2日目に吸着させたが、乳製品菌株の吸着は、23日目に開始し、57日目まで
続けた。本節で説明するように、普通食に加えたヨーグルトベース中補助添加物
として乳製品菌株をラットに与えた。ラットの歯を試験終了時、58日目に綿棒
で拭いた。
【0076】
動物及び飼料
【0077】
Osborne−Mendel幼若ラット各4匹から成る同産児10群
の動物生産課、
チューリッヒ、スイス)を実験に使用した。実験期間の開始時と終了時に全ラッ
トの体重を計測した。13日令で、母獣と幼獣を敷き藁なしのスクリーンボトム
ステンレススチールケージに移し、亀裂埋伏が起こらないように低フッ素粉末(
0.2μm)Nafag食で栄養補給し(Rat Checkers No.1
84,NAFAG,Gossau SG,スイス)、水道水を適宜与えた。ラッ
トが飼料を食べる活動時間は、夜間、即ち18:00−06:00である。
トの体重を計測した。13日令で、母獣と幼獣を敷き藁なしのスクリーンボトム
ステンレススチールケージに移し、亀裂埋伏が起こらないように低フッ素粉末(
0.2μm)Nafag食で栄養補給し(Rat Checkers No.1
84,NAFAG,Gossau SG,スイス)、水道水を適宜与えた。ラッ
トが飼料を食べる活動時間は、夜間、即ち18:00−06:00である。
【0078】
通常の勤務時間にフードカップに飼料を入れることができるように、16日目
と18日目の間に、自動ライトを調節しながら毎日3回ラットの活動時間を早め
ることによって、概日バイオリズムを段階的に逆転させた。
と18日目の間に、自動ライトを調節しながら毎日3回ラットの活動時間を早め
ることによって、概日バイオリズムを段階的に逆転させた。
【0079】
16/17日目に、活動時間の開始を、18:00から15:00に進めた。
即ち、夜間15:00−03:00となり、それ以後昼間であった。17/18
日目には、活動時間の開始を、15:00から12:00に早めた。即ち、夜間
12:00−0:00、昼間00:00以降であった。
即ち、夜間15:00−03:00となり、それ以後昼間であった。17/18
日目には、活動時間の開始を、15:00から12:00に早めた。即ち、夜間
12:00−0:00、昼間00:00以降であった。
【0080】
最終的に18/19日目に、活動時間の開始を12:00から10:00に早
めた。即ち、夜間10:00から22:00まで、昼間22:00以降であった
。
めた。即ち、夜間10:00から22:00まで、昼間22:00以降であった
。
【0081】
そのため、19日目までに、暗闇の時間から通常の勤務時間(10:00−2
2:00)へのラットの活動時間のシフトが完了した。
2:00)へのラットの活動時間のシフトが完了した。
【0082】
20日目、母獣を離し、ラットに、40%スクロース、28%スキムミルク代
用品(大豆蛋白エキスSVPRO−PP 1611 39.4%、ラクトース4
9.3%、0.6%、L−メチオニン0.3%、L−リジンHCl 0.1%)
、24%小麦粉、5%ビール酵母、2%Gevral(登録商標)インスタント
プロテイン(Whitehall−Robins SA,6301 Zug,ス
イス)及びNaCl 1%を含有する調製ダイエット2000aの適宜給餌を開
始した。
用品(大豆蛋白エキスSVPRO−PP 1611 39.4%、ラクトース4
9.3%、0.6%、L−メチオニン0.3%、L−リジンHCl 0.1%)
、24%小麦粉、5%ビール酵母、2%Gevral(登録商標)インスタント
プロテイン(Whitehall−Robins SA,6301 Zug,ス
イス)及びNaCl 1%を含有する調製ダイエット2000aの適宜給餌を開
始した。
【0083】
吸着期間(21日目、22日目)中、飲料水に2%グルコースと2%スクロー
スを補給し、吸着する細菌の移植を促した。23日目に、同産児群を1匹/ケー
ジで、プログラム給餌機による3種類の処理に分配し、表10に示す試験食を与
え始めた。試験食は、18回分の被験菌株含有ヨーグルトミールから成り、前述
の調製ダイエット2000a18回分と交互に与えた。
スを補給し、吸着する細菌の移植を促した。23日目に、同産児群を1匹/ケー
ジで、プログラム給餌機による3種類の処理に分配し、表10に示す試験食を与
え始めた。試験食は、18回分の被験菌株含有ヨーグルトミールから成り、前述
の調製ダイエット2000a18回分と交互に与えた。
【0084】
飲料水は、適宜与えた。58日目の綿棒拭き取り処置後、ラットにチオペンタ
ールナトリウム(100mg/kg体重)を腹腔内注入で過剰投与し、昏睡時、
断頭した。
ールナトリウム(100mg/kg体重)を腹腔内注入で過剰投与し、昏睡時、
断頭した。
【0085】
細菌株:表8に挙げる菌株を使用した。
【0086】
表8 本試験で使用した細菌株
【0087】
吸着のための被験LAB菌株の調製
【0088】
増殖パラメーター、特に詳述の特定条件における定常期に達するのに要する時
間を評価するため、予備試験を実施した。それにより、S.thermophi
lus株が7時間で、また、L.lactis株が6時間で増殖することが確定
した。また、乳製品菌株の冷凍後の生育能の検討も、冷凍前後の同一細胞懸濁液
の平板培養によって実施した。乳製品菌株は、ラットに吸着させるため、以下の
手順に従って処理した。
間を評価するため、予備試験を実施した。それにより、S.thermophi
lus株が7時間で、また、L.lactis株が6時間で増殖することが確定
した。また、乳製品菌株の冷凍後の生育能の検討も、冷凍前後の同一細胞懸濁液
の平板培養によって実施した。乳製品菌株は、ラットに吸着させるため、以下の
手順に従って処理した。
【0089】
手順
−グリセロール原液から得た適当な培地に菌株1%を一晩培養する。
−この培養液からの菌株5%を、至適増殖温度に予め加温した適当な培地各4
Lのバッチ10種類に接種し、対数期終了時/定常期開始時まで増殖させる。 −4種類の菌株のそれぞれについて、無作為に選択した2バッチをM17−ラ
クトース寒天培地上で平板培養して、最終CFU/mlを測定する。平板を嫌気
生活中で一晩培養する。 −各バッチの培養物を6000rpmで10分間遠心分離し、ペレットを新鮮
培地150mlに再度浮遊させる;4℃で一晩保存する。 −再度遠心分離し、凍結培地(Belliker又はM17中15%グリセロ
ール)に再浮遊させる。 −冷凍による生育能の損失を考慮して、2x1011生育細胞/バイアルを含む
ように小分けし、使用時まで−20℃で保存する。
Lのバッチ10種類に接種し、対数期終了時/定常期開始時まで増殖させる。 −4種類の菌株のそれぞれについて、無作為に選択した2バッチをM17−ラ
クトース寒天培地上で平板培養して、最終CFU/mlを測定する。平板を嫌気
生活中で一晩培養する。 −各バッチの培養物を6000rpmで10分間遠心分離し、ペレットを新鮮
培地150mlに再度浮遊させる;4℃で一晩保存する。 −再度遠心分離し、凍結培地(Belliker又はM17中15%グリセロ
ール)に再浮遊させる。 −冷凍による生育能の損失を考慮して、2x1011生育細胞/バイアルを含む
ように小分けし、使用時まで−20℃で保存する。
【0090】
細菌株のラットへの吸着
【0091】
ラットを3種類の処理に割り付けた(表9)。各処理群は、1匹/ケージに分
配した幼獣10匹から成った。
配した幼獣10匹から成った。
【0092】
表9 処理群の割り付け
【0093】
最初に、21日目と22日目に全ラットをA.viscosus OMZ10
5に感染させた。
5に感染させた。
【0094】
被験LAB株を毎日吸着させ(ヨーグルトベースのミールに含ませたので)、
23日目に開始した。それぞれ生育細胞2x1011ヶの被験菌株を含有するバイ
アル2本を、少なくとも109CFU/mlとなるように、ヨーグルト200m
lに混合した。非S−HA付着菌株のS.thermophilus NCC1
536を陰性対照として使用した。
23日目に開始した。それぞれ生育細胞2x1011ヶの被験菌株を含有するバイ
アル2本を、少なくとも109CFU/mlとなるように、ヨーグルト200m
lに混合した。非S−HA付着菌株のS.thermophilus NCC1
536を陰性対照として使用した。
【0095】
それぞれ1mlと400mgのヨーグルト及びダイエット2000aミールを
20分間隔で交互に1日18回与えた(表10)。そのため、各ラットは、合計
18mlのヨーグルトと7.2gの粉末食を与えられたことになる。
20分間隔で交互に1日18回与えた(表10)。そのため、各ラットは、合計
18mlのヨーグルトと7.2gの粉末食を与えられたことになる。
【0096】
正確な時間に正確なミール量をラットに自動的に与えるプログラム給餌機のフ
ードカップにミールを入れた。
ードカップにミールを入れた。
【0097】
表10 摂食時間
【0098】
細菌学的評価
【0099】
58日目に、1種類の処理当たり5匹のラットから綿棒で拭き取った。拭き取
り懸濁液をCFU(コロニー形成単位)数測定のためにペトリ皿に流すか、又は
TCN(総細胞数)測定のための免疫蛍光検査用にガラススライドに固定した。
り懸濁液をCFU(コロニー形成単位)数測定のためにペトリ皿に流すか、又は
TCN(総細胞数)測定のための免疫蛍光検査用にガラススライドに固定した。
【0100】
CFU測定手順
−ラットの歯を滅菌綿棒で拭き取り、それを直ちに5mlの滅菌NaCl0.9
%に入れる。 −1分間攪拌し、50Wで5秒間超音波にかける。 −CBA、MS及びHJL寒天培地上に適切に希釈した懸濁液をらせん状に流す
。 −CBA及びMS平板を37℃、HJL平板を45℃でインキュベートする。
%に入れる。 −1分間攪拌し、50Wで5秒間超音波にかける。 −CBA、MS及びHJL寒天培地上に適切に希釈した懸濁液をらせん状に流す
。 −CBA及びMS平板を37℃、HJL平板を45℃でインキュベートする。
【0101】
TCN測定手順
−ウェルあたりCFU測定用に調製した非希釈綿棒懸濁液10μlを24ウェル
ガラススライド(Dynatech Produkte AG,Embrach
Embraport、スイス)上に置き、風乾する。 −2分間メタノール中に浸漬して固定し、風乾する。 −ELISA緩衝液で希釈した適切な抗体又は血清10μlと共にインキュベー
トし(4.2.2.5節)、37℃で30分間インキュベートする。 −ウェルの片側から出る各滴下物を吸引し、スライドを、最初にELISA緩衝
液に、次に蒸留水に浸漬して洗浄する。風乾する。 −1:400に希釈したヤギ−抗ウサギIgG(H+L)−FITC(Sigm
a)10μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。 −前述と同様に洗浄し、風乾する。 −封入液49μl (4.2.2.5節)を加え、ガラススリップで覆い、蛍光
顕微鏡で蛍光を発する細胞数を数える。
ガラススライド(Dynatech Produkte AG,Embrach
Embraport、スイス)上に置き、風乾する。 −2分間メタノール中に浸漬して固定し、風乾する。 −ELISA緩衝液で希釈した適切な抗体又は血清10μlと共にインキュベー
トし(4.2.2.5節)、37℃で30分間インキュベートする。 −ウェルの片側から出る各滴下物を吸引し、スライドを、最初にELISA緩衝
液に、次に蒸留水に浸漬して洗浄する。風乾する。 −1:400に希釈したヤギ−抗ウサギIgG(H+L)−FITC(Sigm
a)10μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。 −前述と同様に洗浄し、風乾する。 −封入液49μl (4.2.2.5節)を加え、ガラススリップで覆い、蛍光
顕微鏡で蛍光を発する細胞数を数える。
【0102】
統計分析
データは、両側ANOVAで処理した(SnedecorとCochram
1980)。
1980)。
【0103】
チルド乳製品給餌法による乳製品菌株の連続吸着の結果
【0104】
細菌学的評価(表11)
【0105】
−菌株の定着。乳製品に非付着S.thermophilus対照(NCC15
36)を添加すると、プラーク形成A.viscosus OMZ105につい
てカウントすると、1.7(+/−1.1)x107CFUであった。乳製品菌
株は、微生物学的方法ではカウントできなかった。しかし、免疫蛍光法によって
、定性的評価を行った。処理群2及び3のプラークサンプルに3種類の付着乳製
品菌株を認識できた。それらは、他の口内細菌及び口内残渣と共凝集し、大型の
クラスターを生成したため、正確な定量が不可能であった。
36)を添加すると、プラーク形成A.viscosus OMZ105につい
てカウントすると、1.7(+/−1.1)x107CFUであった。乳製品菌
株は、微生物学的方法ではカウントできなかった。しかし、免疫蛍光法によって
、定性的評価を行った。処理群2及び3のプラークサンプルに3種類の付着乳製
品菌株を認識できた。それらは、他の口内細菌及び口内残渣と共凝集し、大型の
クラスターを生成したため、正確な定量が不可能であった。
【0106】
−総細菌叢(TF)の変動。付着性被験株S.thermophilus NC
C1561及びL.lactis NCC2211を含む3種類の処理群は、非
付着性株S.thermophilus NCC1536を含む対照群に比較し
て、CBA上のコロニー形成単位数の有意な減少を示した(表11)。処理群2
は、PF<0.01の有意な係数を伴って、また、処理3は、さらにはるかに有
意に(PF<0.001)、CFU数を減少した。
C1561及びL.lactis NCC2211を含む3種類の処理群は、非
付着性株S.thermophilus NCC1536を含む対照群に比較し
て、CBA上のコロニー形成単位数の有意な減少を示した(表11)。処理群2
は、PF<0.01の有意な係数を伴って、また、処理3は、さらにはるかに有
意に(PF<0.001)、CFU数を減少した。
【0107】
−A.viscosus OMZ105歯牙定着の被験菌株による調節。
プラーク形成細菌A.viscosus OMZ105の場合、処理群1に関
して、被験付着菌株を含む3種類の処理群に、一見それほど顕著ではないが、よ
り有意なコロニー形成単位数の減少が認められた(PF<0.01)(表11)
。対照的に、総CFU数に対するA.viscosusの割合は、有意差がなか
った。4処理群すべてについての総CFUの約50%は、A.viscosus
コロニーと同定された。
して、被験付着菌株を含む3種類の処理群に、一見それほど顕著ではないが、よ
り有意なコロニー形成単位数の減少が認められた(PF<0.01)(表11)
。対照的に、総CFU数に対するA.viscosusの割合は、有意差がなか
った。4処理群すべてについての総CFUの約50%は、A.viscosus
コロニーと同定された。
【0108】
表11 総細菌叢(TF)及びA.viscosus OMZ105についての
ラット1匹当たりの平均コロニー形成単位数、並びに、それぞれの割合(N=5
) 処理群2−3を処理群1と比較した。SEM=平均値の標準誤差;n.s.=有
意でない。CBA=Columbia血液寒天培地;MS=ミティス−サリバリ
ウス寒天培地。OMZ105:A.naeslundii遺伝種2
ラット1匹当たりの平均コロニー形成単位数、並びに、それぞれの割合(N=5
) 処理群2−3を処理群1と比較した。SEM=平均値の標準誤差;n.s.=有
意でない。CBA=Columbia血液寒天培地;MS=ミティス−サリバリ
ウス寒天培地。OMZ105:A.naeslundii遺伝種2
【0109】
このin vivoアッセイでは、毎日与えた菌株は、総細菌叢に明らかな抑
制効果を示し、そのCFUが有意に減少した。この減少は、口内細菌種に対する
乳製品菌株の増殖拮抗作用によって説明できる。例えば、in vitroで、
非S−HA付着S.thermophilus NCC1536を含めた乳製品
菌株のすべてが、A.viscosus OMZ 105の増殖を抑制できる。
しかし、in vivoでは、このような作用は、処理1群に比較して、処理群
2−4で検出されたことから、S−HA付着菌株が示すことができるだけである
。
制効果を示し、そのCFUが有意に減少した。この減少は、口内細菌種に対する
乳製品菌株の増殖拮抗作用によって説明できる。例えば、in vitroで、
非S−HA付着S.thermophilus NCC1536を含めた乳製品
菌株のすべてが、A.viscosus OMZ 105の増殖を抑制できる。
しかし、in vivoでは、このような作用は、処理1群に比較して、処理群
2−4で検出されたことから、S−HA付着菌株が示すことができるだけである
。
【0110】
特に、ラットは、A.viscosus OMZ 105に感染していたため
、このプラーク形成菌の定量は実験期間終了時に可能で、CFUの減少を入念に
モニターできた。
、このプラーク形成菌の定量は実験期間終了時に可能で、CFUの減少を入念に
モニターできた。
【0111】
総CFUに対するA.viscosus OMZ 105の割合は、平行して
減少しなかったため、他の細菌種、即ちベイヨネラに対しても増殖拮抗作用を示
しており、その結果、観察されているのは総合的作用であると推測できる。
減少しなかったため、他の細菌種、即ちベイヨネラに対しても増殖拮抗作用を示
しており、その結果、観察されているのは総合的作用であると推測できる。
【0112】
従って、CNCM I−1985株及びCNCM I−1986株は、口内微
生物生態を調節することができ、ラットが感染していたA.naeslundi
i遺伝種2の定着範囲を有意に減少させる。
生物生態を調節することができ、ラットが感染していたA.naeslundi
i遺伝種2の定着範囲を有意に減少させる。
【0113】
実施例3:S.thermophilus NCC1561及びS.therm
ophilus NCC1536からの界面活性物質の産生と初期分析
ophilus NCC1536からの界面活性物質の産生と初期分析
【0114】
S.thermophilus NCC1561及びS.thermophi
lus NCC1536を1lのBelliker中、42℃で一晩増殖させた
。バイオサーファクタント産生に対して、Busscherら(1997)Ap
pl.Environ.Microbiol.63,3810−3817(Bu
sscherら、1997)に述べる手順を使用した。
lus NCC1536を1lのBelliker中、42℃で一晩増殖させた
。バイオサーファクタント産生に対して、Busscherら(1997)Ap
pl.Environ.Microbiol.63,3810−3817(Bu
sscherら、1997)に述べる手順を使用した。
【0115】
界面活性物質の産生
【0116】
手順
−細胞をPBSで3回洗浄する。
−蒸留水又はPBS200mlに再度懸濁させる。
−その懸濁液を室温で2又は4時間ゆっくりと攪拌しながら、バイオサーファク
タントを産生させる。 −10000rpmで10分間遠心分離して細菌を分離する。 −上分離液を10000rpmで10分間、2回遠心分離する。 −ペレットと界面活性物質溶液の両方を凍結乾燥し、重量を計る。
タントを産生させる。 −10000rpmで10分間遠心分離して細菌を分離する。 −上分離液を10000rpmで10分間、2回遠心分離する。 −ペレットと界面活性物質溶液の両方を凍結乾燥し、重量を計る。
【0117】
粗バイオサーファクタント懸濁液を、最初にSDS−PAGEで分析し、次に
表面張力の測定に供した。
表面張力の測定に供した。
【0118】
SDS−PAGE手順
プレキャスト12.5%ExcelGel(Amersham Pharma
cia Biotech)でSDS−PAGEを実施した。プルソン銀染色キッ
ト(Amersham Pharmacia Biotech)で銀染色を実施
した。
cia Biotech)でSDS−PAGEを実施した。プルソン銀染色キッ
ト(Amersham Pharmacia Biotech)で銀染色を実施
した。
【0119】
表面張力測定手順
【0120】
バイオサーファクタント懸濁液の表面張力を液滴体積原理に基づいたTVT1
液滴体積張力計(Lauda,Lauda−Konigshofen,ドイツ)
で測定した。手短に言うと、この方法は、毛細管から剥離する懸濁液滴の体積の
正確な測定から成る。この体積(臨界体積)は、以下の関係式で数値を計算する
表面張力(σ)に比例する: σ=VgΔpF/2πrcap ここで、 −σは界面張力 −Vは液滴体積 −Gは加速度定数 −Δpは両隣接相の密度差 −Fは補正係数 −rcapは毛細管の半径である。
液滴体積張力計(Lauda,Lauda−Konigshofen,ドイツ)
で測定した。手短に言うと、この方法は、毛細管から剥離する懸濁液滴の体積の
正確な測定から成る。この体積(臨界体積)は、以下の関係式で数値を計算する
表面張力(σ)に比例する: σ=VgΔpF/2πrcap ここで、 −σは界面張力 −Vは液滴体積 −Gは加速度定数 −Δpは両隣接相の密度差 −Fは補正係数 −rcapは毛細管の半径である。
【0121】
測定は、大気中37℃、2回繰り返しで実施した。各測定は、10サイクルか
ら成った。放出された粗生成物6mg/mlの溶液は、水の表面張力を70mN
/mから51mN/mに減少させた(表13)。細菌放出生成物のSDS−PA
GEプロファイルは、溶液に蛋白質の性質を持つ多数の様々な物質が存在するこ
とを示した。
ら成った。放出された粗生成物6mg/mlの溶液は、水の表面張力を70mN
/mから51mN/mに減少させた(表13)。細菌放出生成物のSDS−PA
GEプロファイルは、溶液に蛋白質の性質を持つ多数の様々な物質が存在するこ
とを示した。
【0122】
表13 水及びPBSと比較したバイオサーファクタント懸濁液の表面張力値。
数値は、それぞれ10回の測定から成る2回の実験の平均値である。
数値は、それぞれ10回の測定から成る2回の実験の平均値である。
【0123】
結果
【0124】
S.thermophilus NCC1561及びS.thermophi
lus NCC1536細胞は、界面活性能を有する物質を放出することができ
る。そのため、S.thermophilus NCC 1561が産生するバ
イオサーファクタントは、それに密着する細菌自体と他の口内細菌株を歯の表面
から剥離させる、と考えられる。対照的に、この作用は、S.thermoph
ilus NCC1536が歯に付着しないことから、この菌株によっては認め
られないであろう。
lus NCC1536細胞は、界面活性能を有する物質を放出することができ
る。そのため、S.thermophilus NCC 1561が産生するバ
イオサーファクタントは、それに密着する細菌自体と他の口内細菌株を歯の表面
から剥離させる、と考えられる。対照的に、この作用は、S.thermoph
ilus NCC1536が歯に付着しないことから、この菌株によっては認め
られないであろう。
【0125】
実施例4:歯磨きペースト
【0126】
歯磨きペーストは、凍結乾燥形態の乳酸菌株CNCM I−1984、CNC
M I−1985、CNCM I−1986、CNCM I−1987の少なく
とも1種類の105cfu/mlを次の物質を含有する混合物に添加して調製す
る:1.65%セチルピリジニウムクロリド、33.0%ソルビトール(70%
溶液)、25.0%グリセリン、2.0%カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、0.25%フッ化ナトリウム、26.3%シリカ(RP93)、8.1%増
粘シリカ(Sident22)、0.5%サッカリンナトリウム、3.2%ポロ
キサマー(Pluronic F108)。
M I−1985、CNCM I−1986、CNCM I−1987の少なく
とも1種類の105cfu/mlを次の物質を含有する混合物に添加して調製す
る:1.65%セチルピリジニウムクロリド、33.0%ソルビトール(70%
溶液)、25.0%グリセリン、2.0%カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、0.25%フッ化ナトリウム、26.3%シリカ(RP93)、8.1%増
粘シリカ(Sident22)、0.5%サッカリンナトリウム、3.2%ポロ
キサマー(Pluronic F108)。
【0127】
この歯磨きペーストは、A.naeslundii種に誘発される歯根う蝕、
歯垢及び感染症の予防又は治療を意図している。
歯垢及び感染症の予防又は治療を意図している。
【0128】
実施例5:ヨーグルト
【0129】
MRS培養培地5lを121℃で15分間滅菌した後、約109cfu/ml
を含有するS.thermophilus株 CNCM I−1984、CNC
M I−1985のうちの少なくとも1種類の5体積%の活性培養物で接種する
。41℃、8時間のインキュベーション後、4.5.108cfu/mlを含有
するスターターが得られる。
を含有するS.thermophilus株 CNCM I−1984、CNC
M I−1985のうちの少なくとも1種類の5体積%の活性培養物で接種する
。41℃、8時間のインキュベーション後、4.5.108cfu/mlを含有
するスターターが得られる。
【0130】
0.1%酵母エキスを予め添加した10%の乾燥物含量を有する溶解スキムミ
ルク5 lを121℃で15分間滅菌し、細胞約109ヶ/mlを含有する市販
増粘S.treptococcus thermophilus活性培養物2%
で接種する。41℃で4時間インキュベーションした後、細胞4.5.108ヶ
/mlを含有するスターターが得られる。
ルク5 lを121℃で15分間滅菌し、細胞約109ヶ/mlを含有する市販
増粘S.treptococcus thermophilus活性培養物2%
で接種する。41℃で4時間インキュベーションした後、細胞4.5.108ヶ
/mlを含有するスターターが得られる。
【0131】
2.5%スキムミルク粉末で強化し、次に90℃で30分間低温殺菌した3.
7%脂肪含有全乳1バッチに、CNCM I−1984及びCNCM I−19
85株のうちの少なくとも1種類のスターター2体積%と、増粘Strepto
coccus thermophilusのスターター3体積%を接種する。接
種したミルクを攪拌し、ポットに流し、41℃で4時間インキュベートする。
7%脂肪含有全乳1バッチに、CNCM I−1984及びCNCM I−19
85株のうちの少なくとも1種類のスターター2体積%と、増粘Strepto
coccus thermophilusのスターター3体積%を接種する。接
種したミルクを攪拌し、ポットに流し、41℃で4時間インキュベートする。
【0132】
得られるヨーグルトは、良好な固さで、滑らかなきめを有し、口内の健康を意
図する。
図する。
【0133】
実施例6:チューインガム
【0134】
歯根う蝕、歯垢又は他のA.naeslundii関連疾患の予防又は治療の
ためのチューインガムは、S.thermophilus株CNCM I−19
84及びCNCM I−1985株のうちの少なくとも1種類の活性培養物を、
約104−109cfu/mlを含有するように、次の典型的成分に添加すること
により調製することができる:67.5%キシリトール、20%ガムベース、5
%炭酸カルシウム、3%グリセリン、2%Pluronic F127、1%セ
ルロースガム、0.5%Balast化合物及び1%香料。
ためのチューインガムは、S.thermophilus株CNCM I−19
84及びCNCM I−1985株のうちの少なくとも1種類の活性培養物を、
約104−109cfu/mlを含有するように、次の典型的成分に添加すること
により調製することができる:67.5%キシリトール、20%ガムベース、5
%炭酸カルシウム、3%グリセリン、2%Pluronic F127、1%セ
ルロースガム、0.5%Balast化合物及び1%香料。
【0135】
実施例7:ペットフード組成物
【0136】
口腔衛生用ペットフードは、コーン、コーングルテン、トリ肉、魚肉、塩類、
ビタミン及びミネラルから成る混合飼料を調製することによって得られる。混合
飼料をプレコンディショナーに送り、水分を補給する。次に、プレコンディショ
ナーから出る吸湿給飼料をエクストルーダー−クッカーに送り、ゼラチン化する
。エクストルーダーから出るゼラチン化マトリックスをダイに押付け、押出す。
押出し物を犬に与えるのに適した小片に切断し、約110℃で約20分間乾燥し
、冷却後、水分活性約0.6のペレットにする。
ビタミン及びミネラルから成る混合飼料を調製することによって得られる。混合
飼料をプレコンディショナーに送り、水分を補給する。次に、プレコンディショ
ナーから出る吸湿給飼料をエクストルーダー−クッカーに送り、ゼラチン化する
。エクストルーダーから出るゼラチン化マトリックスをダイに押付け、押出す。
押出し物を犬に与えるのに適した小片に切断し、約110℃で約20分間乾燥し
、冷却後、水分活性約0.6のペレットにする。
【0137】
ペレットに3種類の混合コーティング剤を噴霧する。各混合コーティング剤は
、S.thermophilus株CNCM I−1984、CNCM I−1
985のうちの少なくとも1種類の活性培養物を含有するが、1種類目の混合コ
ーティング剤は、コーティング基質として水和大豆脂肪を使用し、2種類目の混
合コーティング剤は、コーティング基質として水を使用し、3種類目の混合コー
ティング剤は、コーティング基質として蛋白消化物を使用する。ペレットは、約
104−109cfu/gの前記菌株を含有する。
、S.thermophilus株CNCM I−1984、CNCM I−1
985のうちの少なくとも1種類の活性培養物を含有するが、1種類目の混合コ
ーティング剤は、コーティング基質として水和大豆脂肪を使用し、2種類目の混
合コーティング剤は、コーティング基質として水を使用し、3種類目の混合コー
ティング剤は、コーティング基質として蛋白消化物を使用する。ペレットは、約
104−109cfu/gの前記菌株を含有する。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 1/20 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KZ,MD,
RU,TJ,TM),AE,AU,BR,CA,CN,
CO,CR,DM,HU,ID,IL,IN,JP,K
R,MA,MX,NO,NZ,PL,SG,TR,US
,ZA
(72)発明者 グッゲンハイム、ベルンハルト
スイス国 エルレンバッハ、ラオブホルツ
シュトラーセ 65
(72)発明者 ネーゼ、ジャン − リシャール
スイス国 サヴィニー、サンティエ デ
コータライエ、6
(72)発明者 シュティンゲレ、フランチェスカ
スイス国 ローザンヌ、ルート デュ シ
ニャル 10
Fターム(参考) 4B018 MD86 ME09
4B065 AA01X AA49X AC12 BA22
CA44
4C084 AA01 AA02 BA03 BA44 CA04
DA41 MA02 NA05 ZA67 ZB35
4C087 AA01 AA02 BC55 BC61 MA02
NA05 ZA67 ZB35
Claims (14)
- 【請求項1】 口内細菌叢外に存在する乳酸菌株であって、歯の外皮に付着
して増殖抑制因子を産生する能力について選択した上記乳酸菌株の、歯垢軽減を
意図した組成物の製造、及び哺乳動物におけるアクチノマイセス ナエスルンデ
ィイ(Actinomyces Naeslundii)に関連する歯根う蝕及
び他の疾患の治療又は予防のための使用。 - 【請求項2】 乳酸菌株が乳製品に由来する特許請求の範囲第1項記載の使
用。 - 【請求項3】 乳酸菌株をストレプトコッカス テルモフィルス(Stre
ptococcus thermophilus)、ラクトコッカス ラクチス
(Lactococcus Lactis)亜種ラクチス(lactis)、及
びラクトコッカス ラクティス亜種ラクチスビオバージアセチラクチス(lac
tis biovar diacetylactis)から成る群から選択する
特許請求の範囲第1項又は2項記載の使用。 - 【請求項4】 乳酸菌株をCNCM I−1984株、CNCM I−19
85株、CNCM I−1986株、CNCM I−1987株から成る群から
選択する特許請求の範囲第1項から3項までの1項に記載の使用。 - 【請求項5】 組成物が、哺乳類における歯垢軽減のための、及び/又は歯
根う蝕及びアクチノマイセス ナエスルンディイ(Actynomyces n
aeslundii)に関連する他の疾患の治療又は予防のための有効量の乳酸
菌を含む食用組成物である特許請求の範囲第1項から4項までの1項に記載の使
用。 - 【請求項6】 組成物が少なくとも104−109cfu/gの乳酸菌株を含
有する特許請求の範囲第1項から5項までの1項に記載の使用。 - 【請求項7】 乳酸菌株がバクテリオシンと混合されている特許請求の範囲
第1項から6項までの1項に記載の使用。 - 【請求項8】 哺乳類におけるアクチノマイセス ナエスルンディイ(Ac
tinomyces naeslundii)の定着を減じることによって口腔
の健康を維持するための組成物であって、歯の外皮に付着して増殖抑制因子を産
生する能力について選択した、口内細菌叢外に存在する少なくとも1種類の乳酸
菌株を含有する上記組成物。 - 【請求項9】 哺乳類におけるアクチノマイセス ナエスルンディイ(Ac
tinomyces naeslundii)の定着を減少させることによって
口腔の健康を維持するための組成物であって、 −歯の外皮に付着して増殖抑制因子を産生する能力について選択した乳酸菌株と
−バクテリオシン を含む上記組成物。 - 【請求項10】 ストレプトコッカス テルモフィルス(Streptoc
occus thermophilus)、ラクトコッカス ラクチス(Lac
tococcus Lactis)亜種ラクチス(lactis)及びラクトコ
ッカス ラクチス(Lactococcus lactis)亜種ラクチス ビ
オバー ジアセチラクチス(lactis biovar diacetyla
ctis)から成る群から選択した少なくとも1種類の乳酸菌株を含む特許請求
の範囲第8項又は9項記載の組成物。 - 【請求項11】 CNCM I−1984株、CNCM I−1985株、
CNCM I−1986株、CNCM I−1987株から成る群から選択した
少なくとも1種類の乳酸菌株を含む特許請求の範囲第8項から10項までの1項
に記載の組成物。 - 【請求項12】 少なくとも104−109cfu/gの乳酸菌株を含む特許
請求の範囲第8項から11項までの1項に記載の組成物。 - 【請求項13】 歯の表面に付着し、増殖抑制因子を産生する能力について
選択した少なくとも1種類の乳酸菌株を含有する組成物を哺乳類に与える段階を
含む、哺乳類におけるアクチノマイセス ナエスルンディイ(Actinomy
ces naeslundii)関連疾患の予防又は治療のための方法。 - 【請求項14】 哺乳類における歯垢を減少させ、歯根う蝕を治療又は予防
するための特許請求の範囲第13項に記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00201948.7 | 2000-06-02 | ||
EP00201948A EP1159951A1 (en) | 2000-06-02 | 2000-06-02 | Use of exogenous lactic bacteria strain against Actinomyces naeslundii-related diseases |
PCT/EP2001/006268 WO2001091711A1 (en) | 2000-06-02 | 2001-05-30 | Use of exogenous lactic bacteria strain against actinomyces naeslundii related diseases |
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---|---|
JP2003534362A true JP2003534362A (ja) | 2003-11-18 |
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---|---|---|---|
JP2001587727A Withdrawn JP2003534362A (ja) | 2000-06-02 | 2001-05-30 | アクチノマイセスナエスルンディイ関連疾患に対する外因性乳酸菌株の使用法 |
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Country | Link |
---|---|
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EP (2) | EP1159951A1 (ja) |
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MY (1) | MY142363A (ja) |
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UY (1) | UY26748A1 (ja) |
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ZA (1) | ZA200210308B (ja) |
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CN110129352A (zh) * | 2013-09-24 | 2019-08-16 | 密歇根大学董事会 | 用于破坏生物膜稳定性、改变生物膜和分散生物膜的组合物和方法 |
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US20180228179A1 (en) | 2015-06-08 | 2018-08-16 | Chr. Hansen A/S | Glycerin-based gummy candy and foam candy products with probiotic bacteria |
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