Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Zastosowanie szczepu bakterii kwasu mlekowego i zawierająca go kompozycja
PL202576B1
Poland
- Other languages
English - Inventor
Elena-Maria Comelli Bernhard Guggenheim Jean-Richard Neeser Francesca Stingele
Description
translated from
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu bakterii kwasu mlekowego i zawierająca go kompozycja.
Wynalazek dotyczy wprowadzenia do mikroflory jamy ustnej egzogennych bakterii kwasu mlekowego, które mają zdolność modulowania kolonizacji bakterii A. naeslundii oraz łagodzenia chorób wywoływanych przez A. naeslundii.
Usta (jama ustna) zawierają mikroflorę stale występującą i mikroflorę występującą tylko czasowo. Do pierwszej należą mikroorganizmy, które zdolne są do mniej lub bardziej stałej obecności na powierzchniach jamy ustnej. Bakterie te występują głównie na języku, na śluzówce policzka oraz zębach, podczas gdy dziąsła, wargi, policzki, podniebienie oraz dno jamy ustnej stanowią siedlisko jedynie nielicznej mikroflory.
Płytka nazębna stanowi błonę, która tworzy się na powierzchni zębów, składającą się z komórek bakterii, znajdujących się w matrycy pozakomórkowych polisacharydów i produktów śliny. Natychmiast po wyrżnięciu się, zęby pokrywają się amorficzną warstwą śliny, błonką nabytą (AEP - acquired enamel pellicle), która ma grubość około 1,3 μm i nie może być usunięta przez zwykłe szczotkowanie zębów. Osadzanie się bakterii na zębach zachodzi natychmiast po utworzeniu się warstwy AEP, a płytka staje się wyraźnie widoczna w ciągu 8-12 godzin jako wielowarstwowa struktura. Pierwsza warstwa składa się z bakterii (najwcześniejszych kolonizatorów), które przylegają do zębów głównie w wyniku rozpoznawania specyficznego receptora adhezynowego. Tworzy ona podkład dla kolejnych kolonizatorów, którzy przylegają jeden do drugiego za pośrednictwem analogicznego, specyficznego wiązania lub przez zwykłe umieszczenie się obok siebie.
Na języku oraz na śluzówce policzka, do naturalnej, stale występującej mikroflory należą mikroorganizmy wybrane spośród Streptococcus, Veillonella, Bacteroides oraz Haemophilus. Na zębach dominują bakterie Streptococcus i Actinomyces, ale znaleźć tam można rozmaite Gram-dodatnie
Gram-ujemne ziarniaki i pałeczki.
Wiele spośród tych mikroorganizmów jest nieszkodliwymi komensalami, ale też wiele spośród nich rozpoznano jako czynnik etiologiczny wielu chorób (Hill, M. J. and Marsh, P. D. eds. Human Microbal Ecology, 1990, CRC Press, Boca Raton Florida, USA).
W szczególności, gatunek genomowy 1 Actinomyces naeslundii (dawniej A. naeslundii) oraz (dawniej A. viscosus) są powszechnymi składnikami ludzkiej płytki nazębnej. Należą one do szczepów jamy ustnej najsilniej tworzących płytkę, ze względu na ich zdolność do mocnego przylegania do zębów oraz koagregacji z wieloma innymi gatunkami bakterii, co sprzyja ich trwałej obecności w ustach. Ponadto, u starszych osób, są powszechnie izolowane w miejscach próchnicy korzeni i uważa się, że są głównym czynnikiem etiologicznym tej choroby (Bowden, G. H. i wsp. 1999, The diversity and distribution of the predominant ribotypes of Actinomyces naeslundii genospecies 1 and 2 in samples from enamel and from healthy and carious root surfaces of teeth. J. Dent. Res 78, 1880-1809).
Mikroflora przejściowa obejmuje bakterie egzogenne, które mogą być okazjonalnie obecne w ustach, ale nie wykazują stałej obecności (nawet jeżeli przeprowadza się powtarzane podawanie doustne tych bakterii). Wszystkie bakterie spożywcze, a w szczególności bakterie kwasu mlekowego, mogą stanowić część takiej przejściowej mikroflory.
Wykazano, że niektóre z tych egzogennych bakterii kwasu mlekowego mają zdolność przylegania do błonki zębów. Przykładowo, w WO 00/09080 (Societe des Produits Nestle) ujawniono szczepy bakterii kwasu mlekowego, które nie są częścią stale obecnej mikroflory ust, mają niskie właściwości zakwaszające i są zdolne do przylegania bezpośrednio do błonki zębów. Bakterie te są stosowane szczególnie do leczenia i zapobiegania próchnicy zębów oraz infekcji przyzębia, które są spowodowane przez mikroorganizmy próchnicotwórcze, takie jak Streptococcus mutans oraz Streptococcus sobrinus.
Egzogenne bakterie mogą także wytwarzać czynniki, które hamują wzrost swoistej mikroflory stale występującej w jamie ustnej. W zgłoszeniu EP 759649 (Societe des Produits Nestle) opisano, na przykład, zastosowanie bakteriocyn wytwarzanych przez Micrococcus varians do hamowania rozwoju patogenów jamy ustnej S. sobrinus, S. sanguis, S. mutans i A. viscosus. Zastosowanie bakteriocyn jest także jedną z badanych strategii, które opracowano w celu zmniejszenia próchnicy zębów. Cząsteczki te zwróciły na siebie uwagę jako obiecujące czynniki przeciwpróchnicze oraz jako czynniki ważne dla modulowania kolonizacji jamy ustnej.
Należy zauważyć, że stan techniki nie dostarcza żadnej informacji dotyczącej szczepów, które mogą rozwijać się w jamie ustnej przez bezpośrednie przyleganie do błonki zębów, a także wytwarzać
PL 202 576 B1 takie czynniki, jak czynniki hamujące wzrost, które mogą modulować kolonizację A. naeslundii, aby zmniejszyć zagrożenie chorobami związanymi z występowaniem A. naeslundii.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu bakterii kwasu mlekowego wybranego z grupy Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subs. lactis i Lactococcus lactis subs. lactis biovar diacetylactis, który jest egzogenny wobec mikroflory jamy ustnej i zdolny do przylegania do błonki zębów i wytwarzania czynnika hamującego wzrost bakterii Actinomyces naeslundii, do wytwarzania kompozycji przeznaczonej do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z występowaniem Actinomyces naeslundii u ssaków.
Korzystnie szczep bakterii kwasu mlekowego pochodzi z produktu mlecznego, korzystniej jest szczepem wybranym z grupy składającej się ze szczepów CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986 i CNCM 1-1987.
Korzystnie kompozycja jest kompozycją jadalną.
Korzystnie kompozycja zawiera przynajmniej 104-109 cfu/g bakterii kwasu mlekowego.
Korzystnie szczep bakterii kwasu mlekowego jest w kombinacji z bakteriocyną.
Zatem przez kolonizację powierzchni zębów i wytwarzanie czynników hamujących wzrost takie bakterie kwasu mlekowego mogą powodować znaczące zmniejszenie namnożenia Actinomyces naeslundii, zmniejszając płytkę nazębną, próchnicę korzeni zębów oraz inne infekcje, związane z występowaniem Actinomyces naeslundii.
W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja przeznaczona do utrzymania zdrowia jamy ustnej przez zmniejszenie kolonizacji Actinomyces naeslundii u ssaków, która zawiera co najmniej jeden szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy, składającej się ze szczepów Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis oraz Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, egzogenny względem mikroflory jamy ustnej i zdolny do przylegania do błonki zębów i do wytwarzania czynnika hamującego wzrost bakterii Actinomyces naeslundii.
Korzystnie kompozycja ponadto zawiera bakteriocynę.
Korzystnie kompozycja zawiera co najmniej jeden szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy, składającej się ze szczepów CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987.
Korzystnie kompozycja taka zawiera przynajmniej 104-109 cfu/g (colony forming units - liczba jednostek formujących kolonie) bakterii kwasu mlekowego.
W niniejszym opisie, określenie „usta” oznacza jamę ustną ludzi lub zwierząt, takich jak zwierzęta domowe, złożoną ze śluzówki (dziąsła, wargi, policzki, podniebienie i dno jamy ustnej), języka oraz zębów (włącznie ze strukturami sztucznymi).
Określenie „czynnik hamujący wzrost” określa każdą pozakomórkową substancję, wytwarzaną przez przylegające egzogenne bakterie kwasu mlekowego, która umożliwia hamowanie wzrostu A. naeslundii.
Bakterie kwasu mlekowego są wybrane z grupy składającej się ze szczepów Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, a także Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, a szczególnie z grupy składającej się ze szczepów Streptococcus thermophilus (NCC 1529) (CNCM 1-1984), Streptococcus thermophilus (NCC1561) (CNCM 1-1985), Lactococcus lactis subsp. lactis (NCC2211) (CNCM 1-1986), Lactococcus lactis subsp. lactis biovar dioacetylactis (NCC 2225) (CNCM 1-1987).
Bakterie kwasu mlekowego korzystnie pochodzą z produktów mlecznych to znaczy, na przykład z mleka lub sera. Bakterie kwasu mlekowego zastosowane według wynalazku są „nisko zakwaszające”, co oznacza, że są one w mniejszym stopniu zakwaszające niż szczepy patogenne. Zgodnie z tym, mogą one przyczyniać się do utrzymania w jamie ustnej pH około 5,5-7.
Szczepy te wybrane zostały spośród szczepów bakterii kwasu mlekowego, ze względu na ich zdolność do przylegania do błonki zębów i ich optymalną temperaturę wzrostu, wynoszącą około 37°C, która jest temperaturą, jaka panuje w jamie ustnej. Mają one również zdolność wytwarzania czynnika hamującego wzrost bakterii Actinomyces naeslundii, co w połączeniu z ich właściwościami przylegania umożliwia im znacząco zmniejszyć stopień kolonizacji przez gatunki genomowe 1 i 2 A. naeslundii. Są one ponadto zdolne do fermentowania glukozy i sacharozy i nie syntetyzują glukanów, które są czynnikami patogeniczności szczepów próchnicotwórczych.
Możliwe jest także zastosowanie przynajmniej jednego szczepu bakterii kwasu mlekowego, na przykład w połączeniu z bakteriocyną.
Szczepy bakterii kwasu mlekowego mogą być wprowadzone, na przykład, do żywności, karmy dla zwierząt, kompozycji kosmetycznej lub farmaceutycznej. Zgodnie z tym, kompozycjami tymi są
PL 202 576 B1 korzystnie, na przykład, pasty do zębów, płyny do płukania ust, gumy do żucia, spray, napoje, słodycze, mieszanki dla niemowląt, lody, desery mrożone, słodkie dresingi sałatkowe, przetwory mleczne, ser, twaróg, jogurt, kwaśne mleko, śmietanka do kawy lub bita śmietana.
Egzogenne bakterie kwasu mlekowego mogą być stosowane w ilości przynajmniej 104-109 cfu/g bakterii kwasu mlekowego.
Efekt wprowadzenia wymienionych wyżej bakterii do mikroflory jamy ustnej przebadano na modelu szczurzym. Szczepy CNCM 1-1985 oraz CNCM-1986 były zdolne do modulowania mikrobiologicznego ekosystemu jamy ustnej, znacząco zmniejszając całkowitą wartość CFU. Bardziej konkretnie, szczepy te były zdolne do znaczącego zmniejszenia stopnia kolonizacji gatunków genomowych A. naeslundii 2, którymi zainfekowane zostały szczury (patrz przykłady).
Charakterystyka biochemiczna wybranych szczepów
Wzory fermentacji: przebadano 49 cukrów prostych przy zastosowaniu testu paskowego api
CH bioMerieux (bioMerieux SA, 69280 Marcy-l'Etoile, France), a wyniki zestawiono w tabeli 1.
T a b e l a 1
Fermentacja cukrów przez bakterie L. lactis CNCM 1-1987 (A),
L. lactis CNCM 1-1986 (B), S. thermophilus CNCM 1-1984 (C), S. thermophilus CNCM 1-1985 (D)
| Cukier | A | B | C | D | Cukier | A | B | C | D |
| adonitol | +++ | inulina | |||||||
| eskulina | ++ | ++++ | laktoza | + | ++++ | +++ | ++++ | ||
| amigdalina | ++++ | D-liksoza | |||||||
| D-arabinoza | maltoza | ++ | |||||||
| L-arabinoza | mannitol | +++ | ++ | ||||||
| D-arabitol | D-mannoza | + | ++++ | ||||||
| L-arabitol | +++ | melezytoza | |||||||
| arbutyna | +++ | +++ | melibioza | ||||||
| celobioza | +++ | ++++ | α-mety l o-D-g l u kozy d | ||||||
| dulcytol | α-metylo-D-mannozyd | ||||||||
| e ryt ryto l | D-rafinoza | ||||||||
| D-fruktoza | + | ++++ | ramnoza | ||||||
| D-fukoza | ryboza | ++ | ++ | ||||||
| L-fukoza | salicyna | +++ | +++ | ||||||
| galaktoza | ++ | ++++ | sorbitol | ||||||
| β-gentobioza | +++ | L-sorboza | |||||||
| glukonian | skrobia | ||||||||
| 2-ketoglukonian | sacharoza | +++ | ++++ | ||||||
| 5-keto-glukonian | D-tagatoza | ||||||||
| GlcNAc(N-acetylogalakto- zoamina) | + | ++++ | trehaloza | ++ | |||||
| D-glukoza | + | ++++ | + | ++ | D-turanoza | ++ | |||
| glicerol | ksylitol | +++ | |||||||
| glikogen | D-ksyloza | ||||||||
| inozytol | L-ksyloza | ||||||||
| β-metyloksylozyd |
+, ++, +++, ++++ pokazują, czy fermentacja rozpoczęła się po 3, 6, 24 czy 48 godzinach
PL 202 576 B1
Szczepy Streptococcus thermophilus (NCC 1529), Streptococcus thermophilus (NCC 1561),
Lactococcus. lactis subsp lactis (NCC 2211), Lactococcus. lactis subsp. lactis biovar dioacetylactis (NCC 2225) zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Collection Nationale de Culture de Microorganismes (odpowiednio CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986 i CNCM 1-1987), 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris, France, dnia 3 marca 1998.
Drugim przedmiotem wynalazku jest kompozycja służąca do utrzymania zdrowia jamy ustnej w wyniku zmniejszenia kolonizacji A. naeslundii u ssaków, przy czym kompozycja ta zawiera egzogenne szczepy bakterii kwasu mlekowego, które wybrane zostały pod względem zdolności przylegania do powierzchni zęba i wytwarzania czynnika hamującego wzrost.
Kompozycje te są szczególnie przeznaczone do profilaktyki lub leczenia płytki nazębnej oraz infekcji, związanej z chorobą wywołaną A. naeslundii, taką jak próchnica korzeni zębów.
Szczep bakterii kwasu mlekowego w kompozycji według niniejszego wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z bakterii Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis i Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis i korzystnie z grupy, składającej się ze szczepów CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986 oraz CNCM 1-1987.
Kompozycja taka może zawierać przynajmniej 104-109 cfu/g bakterii kwasu mlekowego.
Można także sporządzić kompozycję synergistyczną, dodając przynajmniej jedną bakteriocynę, która jest aktywna wobec Gram-dodatnich bakterii jamy ustnej. W tym przypadku, kompozycje do higieny jamy ustnej mogą zawierać od 0,00001 do 50%, a korzystnie od 0,00001 do 15% wagowych oczyszczonej bakteriocyny. Bakteriocyną może korzystnie być variacyna (EP 0759 469).
W celu ochrony kompozycji przed degradacją , można również dodać rozpuszczalnego w oleju antyutleniacza. Do odpowiednich antyutleniaczy należą „tokoferole”, butylo-hydroksyanizol (BHA), butylo-hydroksytoluen (BHT) oraz palmitynian askorbylu. Rozpuszczalny w oleju antyutleniacz obecny jest w ilości od 0,005% do 0,5%, korzystnie 0,005% do 0,01% wagowych w odniesieniu do ciężaru kompozycji. Odpowiednie materiały ścierne, do zastosowania w kompozycjach według niniejszego wynalazku do czyszczenia zębów obejmują węglan wapnia, glinokrzemian wapnia, tlenek glinowy, hydraty tlenku glinowego, ortofosforan cynku, cząstki tworzywa sztucznego oraz krzemionkę, spośród których krzemionka jest korzystnym materiałem ściernym.
Kompozycje według wynalazku będą miały pH, które jest dopuszczalne w jamie ustnej i w zakresie którego aktywność bakterii kwasu mlekowego nie jest ograniczona. pH może być w zakresie 3,0-9,5, korzystnie w zakresie od 3,5 do 6,5. Kompozycje te mogą być wytwarzane konwencjonalnymi sposobami obejmującymi mieszanie składników razem we właściwych proporcjach, a ostatecznie, o ile jest to konieczne, doprowadzenie pH do żądanej wartości.
Gatunki genomowe Actinomyces naeslundii 1 (dawniej A. naeslundii) oraz 2 (dawniej A. viscosus) należą do szczepów jamy ustnej najsilniej tworzących płytki. Izolowane są powszechnie w miejscach próchnicy korzeni zębów, szczególnie u osób powyżej 40 roku życia i są uważane za główny czynnik etiologiczny tej choroby.
Podawana ilość może wynosić przynajmniej około 104-109 cfu/g bakterii kwasu mlekowego.
P r z y k ł a d 1. Próby in vitro
Do biofilmu imitującego płytkę nazębną in vitro wprowadzono szczepy S. thermophilus NCC1561 (CNCM 1-1985) oraz L. lactis subsp. lactis NCC 2211 (CNCM 1-1986) (tutaj 1. lactis NCC2211).
Szczep jamy ustnej A. naeslundii gatunek genomowy 1 (dawniej A. naeslundii) OMZ745 oraz
A. naeslundii gatunek genomowy 2 (dawniej A. viscosus) OMZ105 otrzymano z Institute far Orale Mikrobiologie und Allgemeine Immunologie, Uniwersytet w Zurychu i hodowano w pożywce FUM (Fluid Universal Medium) w warunkach beztlenowych (GasPackSystem, BBL) w temperaturze 37°C.
Wszystkie szczepy przechowywano w glicerolu w temperaturze -20°C i przed użyciem wstępnie hodowano przez 14 godzin w optymalnej dla nich temperaturze.
Obydwoma wybranymi szczepami, L. lactis NCC 2211 oraz S. thermophilus NCC 1561, zaszczepiono układ in vitro, w którym biofilm, złożony z bakterii powszechnie występujących w jamie ustnej osoby po 40 roku życia, rozwinął się na pokrytych śliną krążkach z hydroksyapatytu. Stosowana pożywka wzrostowa, Fluid Universal Medium (FUM) była specjalnie formułowana do buforowania kwasowości wytwarzanej przez szczepy testowe i dawania ciągłego wzrostu (rozwoju płytki), podobnie jak ma to miejsce w ustach (Gmur and Guggenheim, 1983). Oznaczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a mieszaniny z zawartością i bez zawartości szczepów mlecznych badano równolegle. Wykorzystywano szczepy wyszczególnione w tabeli 2.
PL 202 576 B1
T a b e l a 2
Stosowane szczepy bakteryjne oraz warunki hodowli w eksperymentach dotyczących płytki nazębnej in vitro
| Szczep | Istotne właściwości | Warunki wzrostu |
| S. thermophilus NCC1561 | przylega do syntetycznego hydroksyapatytu S-HA | FUM, Belliker; 37°C |
| L. lactis subsp. lactis NCC2211 | przylega do S-HA | FUM, M17-laktoza; 37°C |
| S. sobrinus OMZ176 | próchnicotwórczy | FUM; 37°C |
| S. oralis OMZ607 | tworzy płytkę nazębną | FUM; 37°C |
| A. naeslundii OMZ74 5 | tworzy płytkę nazębną; czynnik przyczynowy próchnicy korzeni zębów | FUM; 37°C |
| V. dispar OMZ493 | tworzy płytkę nazębną | FUM; 37°C |
| F. nucleatum OMZ596 | tworzy płytkę nazębną | FUM; 37°C |
Procedura
- Wytwarzanie błonki śliny: pokrycie krążków syntetycznego hydroksyapatytu (S-HA) o średnicy 10 mm (Hy-APATITE®, Euro-Crystals, Landgraaf, Holandia) 800 μl ludzkiej śliny oraz inkubacja przez 4 godziny w temperaturze pokojowej przy potrząsaniu (1 krążek/studzienkę (w jałowej płytce Nunclon z 24 otworami).
- Wytwarzanie konsorcjum bakteryjnego: wzrost S. thermophilus NCC1561, L. lactis subsp. lactis NCC2211, S. sobrinus OMZ176, S. oralis OMZ607, A. naeslundii OMZ745, V. dispar OMZ493 i także F. nucleatum OMZ596 przez noc w temperaturze 37°C, w pożywce beztlenowej FUM-glukoza (S. thermophilus NCC1561 w pożywce FUM-laktoza), doprowadzenie OD550 do 1 z FUM oraz spulowanie 2 ml każdej zawiesiny bakterii z jamy ustnej z 2 ml albo S. thermophilus NCC1561, albo L. lactis subsp. lactis NCC2211. Mieszanina kontrolna zawiera jedynie pięć szczepów z jamy ustnej.
- Tworzenie biofilmu i odzysk bakterii: procedura jak opisano w pracy Guggenheim i in., 1998, Validation of a new biofilm model. J. Dent. Res. 77, (Spec Iss A): 110 (Abstrakt #38).
- Analiza kultur biofilmu: wysiewanie wężykiem zawiesiny na pożywkę Columbia Blood Agar (5% krwi owczej, Becton Dickinson, Meylan Cedex, Francja) w celu określenia całkowitej ilości i dla różnicowania A. naeslundii. Inkubacja płytek w temperaturze 37°C w warunkach beztlenowych przez 48 godzin.
Antagonizm wzrostu między szczepami z jamy ustnej a badanymi szczepami mlecznymi
Szczepy i warunki hodowli wyszczególniono w tabeli 3.
T a b e l a 3
Wykorzystywane szczepy bakteryjne i warunki hodowli stosowane w badaniach antagonizmu wzrostu
| Szczep | Istotne właściwości | Warunki wzrostu |
| S. thermophilus NCC1561 | przylega do S-HA | Belliker; 42°C |
| L. lactis subsp. lactis NCC2211 | przylega do S-HA | M17-laktoza; 37°C |
| S. thermophilus NCC 1536 | nie przylega | Belliker; 42°C |
| A. naeslundii OMZ745 | tworzy płytkę nazębną | BHI; 37°C; warunki beztlenowe |
| A. viscosus OMZ105 | tworzy płytkę nazębną | BHI; 37°C |
S. thermophilus NCC 1561, S. thermophilus NCC 1536 oraz L. lactis NCC 2211 (szczepy „zabójcy”) przebadano pod kątem antagonizmu wzrostu w stosunku do A. naeslundii OMZ745 oraz A. viscosus OMZ105 (szczepy „docelowe”).
Procedura
- Wzrost szczepów „zabójców” przez noc na płytkach agarowych w warunkach beztlenowych oraz szczepów „docelowych” w BHI aż do średniej fazy stacjonarnej.
PL 202 576 B1
- Rozcień czenie 20 μ l zawiesiny szczepów „docelowych” w 3 ml mię kkiego agaru BHI (agar 7 g/l), zawierają cego glukozę oraz laktozę , mieszanie na mieszalniku typu „Hortex” i natychmiastowe wylanie na agarową płytkę BHI.
- Zestalanie przez 1 godzin ę w temperaturze pokojowej, nast ę pnie rozprowadzenie szczepów „zabójców” i z płytki M17 w postaci krzyża. Rozprowadzenie równoległe oddzielnie szczepów zabójców” i „docelowych” w charakterze kontroli.
- Inkubacja w temperaturze 37°C w warunkach beztlenowych przez 24 godziny.
Antagonizm wzrostu jest ujawniony przez halo zahamowania wokół krzyża.
Statystyka
Różnice pomiędzy wspólnotą kontrolną a testową wyznaczone zostały przy zastosowaniu testu t-Studenta.
Wyniki i dyskusja
Szczepy S. thermophilus NCC1561 oraz L. lactis NCC 2211 można wprowadzić i hodować na podobnym do płytki nazębnej biofilmie na krążkach S-HA, zaś ich całkowite wartości CFU/krążek po 40,5 godzinach podano w tabeli 4.
T a b e l a 4
Poziom wprowadzenia dwóch szczepów mlecznych do biofilmu (CFU/krążek). Wartości są wartościami średnimi z trzech eksperymentów z odchyleniami standardowymi
| Sposób inokulacji | S. thermophilus NCC561 (x 106) | L. lactis NCC2211 (x 106) |
| razem ze szczepami jamy ustnej | 4,08 ± 1,78 | 5,76 ± 3,64 |
| przed szczepami jamy ustnej | 5,03 ± 2,21 | 3,87 ± 4,01 |
Wpływ wprowadzenia szczepów mlecznych do biofilmu na gatunki z jamy ustnej wskazany został w tabelach 5 i 6. Gdy włączono S. thermophilus NCC1561 (tabela 5), zanotowano ogólny spadek całkowitej flory, którą reprezentowały zliczenia z płytek Columbia Blood Agar (CBA) oraz 4 gatunków z jamy ustnej.
Gdy szczep L. lactis NCC2211 wprowadzony został do konsorcjum szczepów z jamy ustnej (tabela 6) całkowite zliczenia flory zmniejszyły się zauważalnie (CFU na CBA). Spadek ten był znaczący w przypadku A . naeslundii OMZ745, które uległ y istotnemu zmniejszeniu (p = 0,021). Spadek był nawet większy, gdy szczep zaszczepiono na krążkach przed bakteriami z jamy ustnej.
T a b e l a 5
Modulacja konsorcjum szczepów z jamy ustnej przez S. thermophilus NCC1561 (CFU/krążek)
| Traktowanie | CBA (x · 108) | A. naeslundii OMZ745 (x · 106) | MS (x · 108) |
| Kontrola | 2,86 ± 2,14 | 5,29 ± 2,58 | 2,02 ± 1,68 |
| + NCC1561 | 1,63 ± 0,55 | 4,75 ± 1,45 | 1,21 ± 0,81 |
| Inkubacja wstępna z NCC1561 | 2,32 ± 10,38°° | 4,78 ± 2,29 | 1,48 ± 0,29 |
N = 3. *: wartości p obliczane są względem kontroli (*: p < 0,05; **: p < 0,01); °: wartości p obliczane są względem próby „+NCC1561” (°: p < 0,05; °°: p < 0,01)
T a b e l a 6
Modulacja konsorcjum szczepów z jamy ustnej przez L. lactis NCC2211 (CFU/krążek)
| Traktowanie | CBA (· 108) | A. naeslundii OMZ745 (· 106) | MS (· 108) |
| Kontrola | 2,77 ± 2,16 | 6,07 ± 2,70 | 3,04 ± 2,88 |
| + NCC2211 | 0,65 ± 0,33 | 4,59 ± 2,81 | 0,65 ± 10,33 * |
| Inkubacja wstępna z NCC2211 | 0,27 ± 10,11 **° | 3,91 ± 13,29 *° | 0,27 ± 10,11 **°° |
N = 3. *: wartości p obliczane są względem próby kontrolnej (*: p < 0,05; **: p < 0,01); °: wartości p obliczane są względem próby „+NCC2211” (°: p < 0,05; °°: p < 0,01)
PL 202 576 B1
Przeprowadzono pewne próby w celu stwierdzenia, czy zmniejszenie szczepów z jamy ustnej wynikało z antagonizmu wzrostu szczepów mlecznych wobec nich (tabela 7). Szczepy A. viscosus OMZ105 oraz S. thermophilus NCC 1536 również zostały włączone do testu, gdyż stanowią one część modelu in vivo (przykład 2).
Wszystkie cztery szczepy mleczne hamowały wzrost Gram-ujemnego szczepu A. viscosus OMZ105. Hamowanie to nie może być przypisane wytwarzaniu kwasu mlekowego. A. viscosus mają zdolność metabolizowania mleczanów tylko w warunkach tlenowych (van der Hoeven i in. (1990) Oral Microbiol. Immunol. 5, 223-225) i rosną w środowisku kwaśnym. Stwierdzenia te potwierdzone zostały przez wysianie na płytce A. viscosus w obecności 1% roztworu kwasu mlekowego: nie zaobserwowano zahamowania.
T a b e l a 7
Zahamowanie wzrostu szczepów z jamy ustnej wywołane przez S. thermophilus NCC 1561, S. thermophilus NCC 1536 oraz L. lactis NCC2211
| Docelowy | Szczepy zabójców NCC1561 NCC1536 NCC2211 | Kwas mlekowy 1% | ||
| NCC1561 | NCC1536 | NCC2211 | ||
| A. naeslundii OMZ745 | + | + | + | - |
| A. viscosus OMZ105 | + | + | + | - |
Wnioski
S. thermophilus NCC1561 i L. lactis NCC2211 mogły być wprowadzone do biofilmu naśladującego płytkę nazębną i były zdolne do modulowania mikroflory jamy ustnej, znacząco zmniejszając całkowitą wartość cfu, a bardziej konkretnie szczepy te były zdolne do znaczącego zmniejszenia stopnia kolonizacji gatunku genomowego A. naeslundii 2. Ponadto, szczepy mogły hamować wzrost gatunków genomowych A. naeslundii 1 i 2 we wspólnych hodowlach.
P r z y k ł a d 2. Próby in vivo
Badania przeprowadzono in vivo na modelu szczurzym. W badaniu tym kontynuowano kojarzenie wybranych szczepów przez cały okres badawczy, w cyklu dobowym, drogą karmienia chłodzonym produktem mleczarskim.
Badanie to prowadzono w ciągu 58 dni. W celu wykonania eksperymentu podczas dnia, okres aktywności zwierząt musiał być przesunięty w sumie o 7 godzin. Dokonano tego w trzech etapach w dniu 16, 17 i 18, jak to dalej opisano szczegółowo. Szczepy próchnicotwórcze zostały skojarzone 21 i 22 dnia, podczas gdy kojarzenie szczepów mlecznych rozpoczęło się dnia 23 i trwało aż do dnia 57. Zwierzętom podawano szczepy mleczne jako dodatek w jogurcie, który włączono do normalnej diety, jak wyjaśniono to dalej. Na zakończenie eksperymentu, 58 dnia, pobrano wymaz z zębów szczurów.
Zwierzęta i dieta
W eksperymencie wykorzystano 10 miotów, składają cych się z 4 młodych szczurów Osborne-Mendel (dział produkcji zwierząt Institute far Orale Mikrobiologie und Allgemeine Mikrobiologie, Uniwersytet w Zurychu, Szwajcaria). Wszystkie zwierzęta zważono na początku i na zakończenie okresu badawczego. Po 13 dniach, matki z młodymi przeniesiono do klatek ze stali nierdzewnej z przezroczystym dnem bez wyściółki i karmiono bez ograniczeń sproszkowaną (0,2 μm) karmą Nafag o niskiej zawartości fluorku, w celu uniknięcia wpływu zarysowania (Rat Checkers No. 184, NAFAG, Gossau SG, Szwajcaria) oraz wodą wodociągową bez ograniczeń. Fazą aktywności, podczas której szczury jedzą jest noc, tj. 18:00- 06:00.
W celu umożliwienia uzupełniania miseczek na karmę w czasie zwykłych godzin pracy, okołodobowy rytm aktywności szczurów był stopniowo odwracany między dniem 16 a 18, przez przesuwanie okresu aktywności szczurów każdego dnia w trzech momentach, przez dostosowanie regulacji automatycznego oświetlenia.
W dniu 16/17 początek okresu aktywności przesunięto z 18:00 na godzinę 15:00, to znaczy noc uległa przesunięciu z 15:00-3:00, po czym następował dzień. W dniu 17/18 początek okresu aktywności przesunięto z godziny 15:00 na 12:00, to znaczy, że noc trwała od 12:00 godz. do 00:00, a dzień od godziny 00:00.
Ostatecznie, dnia 18/19 początek okresu aktywności przyspieszono z godziny 12:00 na 10:00, to znaczy, noc trwała od 10:00 do 22:00, zaś dzień od 22:00.
PL 202 576 B1
Z tego wzgl ę du, do dnia 19 zakoń czono przesuwanie okresu aktywności szczurów z godzin ciemności do normalnych godzin pracy (10:00-22:00).
dnia usunięto matki, zaś szczury zaczęto karmić bez ograniczeń modyfikowaną karmą 2000a, zawierającą 40% sacharozy, 28% substytutu mleka odtłuszczonego (ekstrakt białka sojowego SVPRO-PP 1611 39,4%, laktoza - 49,3%, 0,6%, L-metionina - 0,3%, L-lizyna HCl 0,1%), 24% mąki pszennej, 5% drożdży piwnych, 2% preparatu Gevral® Instant Protein (Whitehall-Robins SA, 6301 Zug, Szwajcaria) oraz 1% NaCl.
W okresie kojarzenia (dni 21 i 22) wodę do picia uzupełniano 2% glukozą oraz 2% sacharozą w celu podtrzymania implantacji skojarzonych bakterii. Dnia 23 mioty podzielone został y na 3 grupy traktowania, po jednym zwierzęciu w klatce, w programowanej maszynie karmiącej i zaczęły dostawać dietę testową, jak wskazano w tabeli 10.
Dieta testowa składała się z 18 posiłków jogurtowych, zawierających szczepy testowe na przemian z 18 posiłkami modyfikowanej diety 2000a, opisanej uprzednio.
Wodę do picia podawano bez ograniczeń. Po pobraniu wymazu 58 dnia, zwierzętom przedawkowywano tiopental sodu (100 mg/kg masy ciała) podawany w zastrzyku do otrzewnej, po czym dekapitowano w czasie śpiączki.
Szczepy bakteryjne: wykorzystano szczepy wyszczególnione w tabeli 8.
T a b e l a 8
Szczepy bakteryjne wykorzystane w badaniu
| Szczep | Istotne właściwości | Warunki wzrostu |
| S. thermophilus NCC1561 | przylega do S-HA | Belliker; 42°C |
| S. thermophilus NCC1536 | nie przylegająca kontrola | Belliker; 42°C |
| L. lactis NCC2211 | przylega do S-HA | M17-laktoza; 37°C |
| A. viscosus OMZ105 | tworzy płytkę nazębną; przylega do S-HA | BHI; 37°C |
Wytworzenie badanych szczepów LAB do kojarzenia
Wykonano wstępne badanie w celu oceny parametrów wzrostu, zwłaszcza godzin wymaganych do osiągnięcia fazy stacjonarnej w specyficznych, opisanych w dalszej części, warunkach. Dlatego też ustalono czas wzrostu dla szczepów S. thermophilus na 7 godzin, a dla szczepu L. lactis - 6 godzin. Przeprowadzono również badanie żywotności po zamrożeniu szczepów mlecznych, przez wysianie na płytce tej samej zawiesiny komórek przed i po zamrożeniu. W celu skojarzenia ze zwierzętami, szczepy mleczne traktowano zgodnie z następującą procedurą.
Procedura
- Inokulacja szczepów 1% przez noc w ich właściwym medium szczepem muzealnym z glicerolu.
- Inokulacja szczepów 5% tej kultury do 10 porcji po 4 litry właściwego medium podgrzanego do optymalnej temperatury wzrostu, a następnie wzrost aż do końca fazy logarytmicznej/początku fazy stacjonarnej.
- Okreś lenie końcowej wartoś ci CFU/ml przez wysianie na pł ytkę agarową z M17 - laktozą z dwóch, przypadkowo wybranych partii dla każ dych z 4 szczepów. Inkubacja płytek przez noc w warunkach beztlenowych.
- Odwirowanie hodowli z każ dej partii przy szybkoś ci 6000 obr./min. przez 10 minut i zawieszenie osadów w 150 ml świeżego podłoża, przetrzymanie przez noc w temperaturze 4°C.
- Ponowne odwirowanie i ponowne zawieszenie w podł o ż u mrożącym (15% glicerolu w Belliker lub M17).
- Podział na próbki w celu uzyskania 2-1011 żywych komórek/fiolkę, biorąc pod uwagę utratę żywotności w wyniku zamrażania i przechowywania w temperaturze -20°C do czasu wykorzystania.
Kojarzenie zwierząt ze szczepami bakterii
Zwierzęta podzielono na trzy grupy traktowań (tabela 9). Każde grupa składała się 10 młodych, które rozdzielono po jednym w klatce.
PL 202 576 B1
T a b e l a 9 Ustawienie traktowań
| Traktowanie | Bakterie kojarzone |
| 1 | A. viscosus OMZ105; S. thermophilus NCC1536 |
| 2 | A. viscosus OMZ105; S. thermophilus NCC1561 |
| 3 | A. viscosus OMZ105; L. lactis NCC2211 |
Wszystkie szczury zainfekowano najpierw w dniach 21 i 22 szczepem A. viscosus OMZ105.
Badane szczepy LAB kojarzono codziennie (gdyż znajdowały się w podstawowym posiłku jogurtowym), poczynając od dnia 23. Dwie zamrożone fiolki, każda zawierająca 2 · 1011 żywotnych komórek badanego szczepu, zmieszano w 200 ml jogurtu w celu otrzymania przynajmniej 109 CFU/ml.
S. thermophilus NCC 1536, szczep nieprzylegający do S-HA wykorzystano jako kontrolę ujemną.
Jogurt oraz karmę 2000a, w ilości 1 ml oraz 400 mg odpowiednio, podawano naprzemiennie 18 razy dziennie w 20-minutowych odstępach (tabela 10). Zatem każde zwierzę otrzymywało w sumie 18 ml jogurtu i 7,2 g sproszkowanej karmy.
Posiłki dozowane były w miseczkach do pokarmu z zaprogramowanego dozownika karmy, który automatycznie podawał zwierzętom właściwy posiłek w wyznaczonym czasie.
T a b e l a 10 Godziny karmienia
| Nr posiłku | Posiłki wysoko próchnicotwórcze | Posiłki jogurtowe | Nr posiłku |
| 1 | 10:00 | 10:20 | 2 |
| 3 | 10:40 | 11:00 | 4 |
| 5 | 11:20 | 11:40 | 6 |
| 7 | 12:00 | 12:20 | 8 |
| 9 | 12:40 | 13:00 | 10 |
| 11 | 13:20 | 13:40 | 12 |
| 13 | 14:00 | 14:20 | 14 |
| 15 | 14:40 | 15:00 | 16 |
| 17 | 15:20 | 15:40 | 18 |
| 19 | 16:00 | 16:20 | 20 |
| 21 | 16:40 | 17:00 | 22 |
| 23 | 17:20 | 17:40 | 24 |
| 25 | 18:00 | 18:20 | 26 |
| 27 | 18:40 | 19:00 | 28 |
| 29 | 19:20 | 19:40 | 30 |
| 31 | 20:00 | 20:20 | 32 |
| 33 | 20:40 | 21:00 | 34 |
Ocena bakteriologiczna
W 58 dniu pię ciu szczurom z każ dej grupy pobrano wymaz. Zawiesiny z wymazu wysiewano albo na szalkach Petriego do oceny CFU (jednostek tworzących kolonie) lub unieruchamiano na szkiełkach do immunofluoroscencji w celu zliczenia TCN (całkowitej liczby komórek).
Procedura określania wartości CFU
- Pobranie wymazu z uzębienia szczurów przy użyciu sterylnych patyczków z bawełnianą końcówką i natychmiastowe ich umieszczenie w 5 ml sterylnego 0,9% roztworu NaCl.
PL 202 576 B1
- Mieszanie na mieszalniku typu „Hortex” przez 1 minutę i sonikacja przez 5 s przy 50 W.
- Wysianie wężykiem właściwie rozcieńczonych zawiesin na podłoża agarowe CBA, MS i HJL.
- Inkubacja płytek CBA i MS w temperaturze 37°C, a płytek HJL w temperaturze 45°C.
Procedura określania TCN
- Umieszczenie 10 μl nie rozcieńczonej zawiesiny z wymazu, przygotowanej w celu określenia wartości CFU na studzienkę na 24 studzienkowej płytce szklanej (Dynatech Produkte AG, Embrach Embraport, Szwajcaria) i suszenie w powietrzu.
- Utrwalenie przez moczenie w metanolu przez 2 minuty i suszenie w powietrzu.
- Inkubacja z 10 μl odpowiedniego przeciwciała lub surowicy rozcieńczonej w buforze ELISA (sekcja 4.2.2.5) oraz inkubacja w temperaturze 37°C przez 30 minut.
- Zasysanie każdej kropli z boku studzienki i przemycie przez moczenie szkiełka najpierw w buforze ELISA, a następnie w wodzie destylowanej.
Suszenie w powietrzu
- Zastosowanie 10 μl króliczej przeciw koziej IgG (H + L) - FITC (Sigma) rozcieńczonej w stosunku 1:400 oraz inkubacja w temperaturze 37°C przez 30 minut.
- Przemycie jak poprzednio oraz suszenie w powietrzu.
- Zastosowanie 49 μl płynu do osadzania (sekcja 4.2.2.5), przykrycie szkiełkiem nakrywkowym i zliczenie fluoroscencyjnych komórek przy użyciu mikroskopu fluoroscencyjnego.
Statystyka
Dane poddano dwukierunkowej analizie wariancji ANOVA (Snedecor and Cochran, 1980).
Wyniki ciągłego kojarzenia szczepów mlecznych w rezultacie podawania chłodzonych produktów mlecznych.
Ocena bakteriologiczna (tabela 11)
- Kolonizacja szczepu. Gdy produkt mleczny uzupełniany był nie przylegającym szczepem kontrolnym S. thermophilus (NCC1536), zliczono 1,7 (± 1,1) · 107 CFU dla tworzącego płytkę szczepu A. viscosus OMZ105. Szczepów mlecznych nie można było zliczyć metodami mikrobiologicznymi. Usiłowano dokonać jednak jakościowej oceny metodą immunofluorescencji. W próbkach płytki nazębnej dla grup traktowań 2 i 3 można było rozpoznać trzy przylegające szczepy mleczne. Ponieważ były one zagregowane z innymi bakteriami jamy ustnej oraz resztkami w jamie ustnej, tworząc duże klastery, precyzyjne określenie ilości było niemożliwe.
- Zmienność w całkowitej florze (TF). Trzy grupy traktowań, zawierające przylegające, badane szczepy S. thermophilus NCC1561 i L. lactis NCC 2211, wykazały istotne zmniejszenie liczby jednostek tworzących kolonie na podłożu CBA w porównaniu z grupą kontrolną zawierającą nie przylegający szczep S. thermophilus NCC 1536 (tabela 11). W grupie traktowania 2 wartości CFU zmniejszały się współczynnikiem istotności PF < 0,01, zaś w grupie 3 nawet bardziej znacznie (PF < 0,001).
- Modulacja kolonizacji A. viscosus OMZ105 na zębach przez badane szczepy. W przypadku tworzących płytkę bakterii A. viscosus OMZ105 zaobserwowano wyraźnie mniej widoczny, ale bardziej istotny spadek liczby jednostek tworzących kolonie dla trzech traktowań zawierających testowane przylegające szczepy względem traktowania 1 (PF < 0,01) (tabela 11). Dla kontrastu, procentowe wartości A. viscosus w odniesieniu do całkowitej wartości CFU nie różniły się istotnie. W przybliżeniu 50% całkowitej wartości CFU dla wszystkich czterech traktowań zidentyfikowano jako kolonie A. viscosus.
T a b e l a 11
Średnie wartości na jednego szczura jednostek tworzących kolonie dla całkowitej flory (TF) oraz szczepu A. viscosus OMZ105 oraz ich odpowiednie wartości procentowe (N = 5)
| Traktowanie | TF na CBA x 106 | OMZ105 na CBA x 106 | % OMZ105 na CBA | TF na MS x 104 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1 (NCC1536) | 32,5 ± 13,87 | 17,3 ± 11,01 | 52,8 ± 23,09 | 41,9 ± 41 n. s. |
| 2 (NCC1561) | 17,6 ± 6,57 ** | 8,01 ± 1,96 ** | 47,2 ± 9,37 n. s. | 5,6 ± 3,8 n. s. |
| 3 (NCC2211) | 13,9 ± 4,85 *** | 5,81 ± 2,07 | 43,4 ± 18,16 n. s. | 1,7 ± 1,11 n. s. |
| SEM | 2,99 | 2,17 | 5,65 | 10,33 |
PL 202 576 B1 cd. tabeli 11
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Pf | 0, 001 | 0,01 | n. s . | n. s. |
| LSD 0,05 * | 9,21 | 6,69 | — | — |
| LSD 0,01 ** | 12,92 | 9,37 | — | — |
| LSD 0,001 *** | 18,25 | — | — | — |
Traktowania 2-3 porównywano z traktowaniem 1. SEM = błąd standardowy średniej; n.s. = nieznaczne; CBA = Columbia Blond Agar; MS = agar Mitis-salivarius. OMZ105: A. naeslundii gatunek genomowy 2
W tej próbie in vivo, szczepy, które dostarczane były codziennie, wykazywały wyraźny wpływ hamujący na całą mikroflorę, której wartość CFU istotnie spadła. Ten spadek można wyjaśnić antagonizmem wzrostu szczepów mlecznych w stosunku do szczepów z jamy ustnej. W warunkach in vitro, na przykład wszystkie one, włączając nie przylegający do podłoża S-HA szczep S. thermophilus NCC1536, mogą hamować rozwój A. viscosus OMZ105. Jednakże in vivo, działanie takie można przedstawić tylko dla szczepów przylegających do podłoża S-HA, gdyż wykryte zostało w traktowaniach 2-4, w przeciwieństwie do pierwszego.
W szczególności, ponieważ zwierzęta zainfekowane zostały bakteriami A. viscous OMZ105, możliwe było, na koniec eksperymentu, oszacowanie ilościowe tego tworzącego płytkę organizmu, a spadek jego wartości CFU mógł być ściśle monitorowany.
Wartości procentowe dla szczepu A. viscous OMZ105 w stosunku do całej wartości CFU nie spadały równolegle, dlatego można wnioskować, że efekt antagonizmu wzrostu przejawiany był także wobec innych gatunków, to jest Veillonellae, a w konsekwencji obserwowany jest efekt o zasięgu globalnym.
Szczepy CNCM 1-1985 oraz CNCM 1-1986 są zatem zdolne do modulowania mikrobiologicznego ekosystemu jamy ustnej, znacząco zmniejszając stopień kolonizacji przez A. naeslundii gatunku genomowego 2, którym zainfekowane zostały szczury.
P r z y k ł a d 3. Wytworzenie i wstępna analiza substancji surfaktantowych pochodzących od bakterii S. thermophilus NCC1561 oraz S. thermophilus NCC 1536
Szczepy S. thermophilus NCC1561 oraz S. thermophilus NCC1536 hodowano przez noc w 1 litrze pożywki Belliker w temperaturze 42°C. W celu wytworzenia biosurfaktanta zastosowano procedurę opisaną w pracy Busscher i in. (1997), Appl. Environ. Microbiol. 63, 3810-3817, (Busscher i in., 1997).
Wytwarzanie substancji surfaktantowych
Procedura
- Trzykrotne przemycie komórek w PBS.
- Zawieszenie w 200 ml wody destylowanej lub PBS.
- Wytworzenie biosurfaktanta przez delikatne mieszanie zawiesiny przez 2 lub 4 godziny w temperaturze pokojowej.
- Oddzielenie bakterii przez odwirowanie z prędkością 10000 obr./min. przez 10 minut.
- Dwukrotne odwirowanie supernatantu z prędkością 10000 obr./min. przez 10 minut.
- Suszenie sublimacyjne i ważenie zarówno osadu jak i roztworów substancji surfaktantowych.
Surowa zawiesina surfaktanu została najpierw przeanalizowana metodą SDS-PAGE, a następnie poddana pomiarom napięcia powierzchniowego.
Procedura SDS-PAGE
Badanie SDS-PAGE przeprowadzono przy użyciu gotowego do użycia 12,5% ExcelGel (Amersham Pharmacia Biotech). Barwienie srebrem wykonano przy użyciu preparatu Plusone Silver Staining Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
Procedura pomiaru napięcia powierzchniowego
Napięcie powierzchniowe zawiesin biosurfaktanta zmierzone zostało przy zastosowaniu urządzenia TVT1 Drop Volume Tensiometer (Lauda, Lauda-Konigdshofen, Niemcy), które oparte jest na zasadzie objętości kropli. W skrócie, sposób ten polega na dokładnym wyznaczeniu objętości kropli zawiesiny, która odrywa się od kapilary. Objętość ta (objętość krytyczna) jest proporcjonalna do napięcia powierzchniowego (σ), którego wartość obliczana jest z zależności:
σ = Vg Δρ F / 2π rkap
PL 202 576 B1 gdzie:
- σ - napięcie międzypowierzchniowe
- V - objętość kropli
- g - stała grawitacji
- Δμ - różnica gęstości obydwu sąsiadujących faz
- F - czynnik korekcyjny
- rkap - promień kapilary
Pomiary wykonano dwukrotnie w temperaturze 37°C na powietrzu. Każdy pomiar składał się z 10 cykli. Roztwór 6 mg/ml uwolnionego surowego produktu wytwarzał spadek napięcia powierzchniowego wody z 70 do 51 mN/m (tabela 13). Profil SDS-PAGE uwolnionych przez bakterie produktów wykazał, że w roztworze obecnych było wiele różnych substancji o naturze białkopodobnej.
T a b e l a 13
Wartości napięcia powierzchniowego zawiesin biopsurfaktantów w porównaniu z wodą i PBS Wartości te są średnimi z dwóch eksperymentów, z których każdy obejmował 10 pomiarów
| Stężenie surowego ekstraktu | Napięcie powierzchniowe (mN/m) | |
| Woda | — | 69,07 ± 0,001 |
| PBS | — | 68,13 ± 0,300 |
| S. thermophilus NCC1561 | 6 mg/ml | 51,47 ± 0,170 |
| S. thermophilus NCC1536 | 6 mg/ml | 51,67 ± 1,320 |
Wynik
Komórki szczepów S. thermophilus NCC1561 oraz S. thermophilus NCC 1536 są zdolne do uwalniania substancji o aktywności surfaktantu. Dlatego możliwe jest, że biosurfaktant wytwarzany przez S. thermophilus NCC1561 powoduje łatwe oddzielenie się tej bakterii lub innego szczepu jamy ustnej od powierzchni zęba. Natomiast działania takiego nie wykazuje S. thermophilus NCC1536, gdyż szczep ten nie przylega do zębów.
P r z y k ł a d 4. Pasta do zębów 5
Pastę do zębów przyrządza się przez dodanie 105 cfu/ml przynajmniej jednego szczepu bakterii kwasu mlekowego CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 w postaci liofilizowanej, do następującej mieszaniny zawierającej: 1,65% chlorku cetylopirydynium, 33,0% sorbitolu (roztwór 70%), 25,0% gliceryny, 2,0% karboksymetylocelulozy sodowej, 0,25% fluorku sodu, 26,3% krzemionki (RP 93), 8,1% krzemionki zagęszczającej (Sident 22), 0,5% soli sodowej sacharyny, 3,2% Poloksameru (Pluronic F108).
Ta pasta do zębów przeznaczona jest do profilaktyki lub leczenia próchnicy zębów, płytki nazębnej oraz innych infekcji, wywoływanych przez gatunki A. naeslundii.
P r z y k ł a d 5. Jogurt l pożywki MRS sterylizuje się przez 15 minut w temperaturze 121°C, a następnie zaszczepia się 5% objętościowymi aktywnej kultury przynajmniej jednego szczepu S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, zawierającej w przybliżeniu 109 cfu/ml. Po inkubacji przez 8 godzin w temperaturze 41°C otrzymano starter, zawierający 4,5-108 cfu/ml.
litrów odtworzonego mleka odtłuszczonego o zawartości suchej masy wynoszącej 10%, do którego dodano 0,1% ekstraktu drożdżowego, sterylizowano przez 15 minut w temperaturze 121°C i zaszczepiono 2% aktywnej kultury handlowego, zagęszczającego szczepu Streptococcus thermophilus, zawierającej w przybliżeniu 109 komórek na 1 ml. Po inkubacji przez 4 godziny w temperaturze 41°C, otrzymano starter, zawierający 4,5-108 komórek/ml.
Jedną porcję pełnotłustego mleka, zawierającą 3,7% tłuszczów, wzmocniono 2,5% odtłuszczonego mleka w proszku, a następnie pasteryzowano przez 30 minut w temperaturze 90°C, następnie zaszczepiano 2% objętościowych startera z przynajmniej jednego szczepu CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 oraz 3% objętościowymi startera zagęszczającego szczepu Streptococcus thermophilus. Zaszczepione mleko jest mieszane, rozlewane do naczyń i poddane inkubacji przez 4 godziny w 41°C.
Otrzymany jogurt ma dobrą, zwartą i gładką teksturę i przeznaczony jest do profilaktyki zdrowotnej jamy ustnej.
PL 202 576 B1
P r z y k ł a d 6. Guma do żucia
Gumę do żucia przeznaczoną do profilaktyki lub leczenia próchnicy zębów, płytki nazębnej lub innych chorób, związanych z aktywnością A. naeslundii, można wytworzyć przez dodanie aktywnej kultury przynajmniej jednego szczepu S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 w przybliżeniu w ilości od 104 do 109 cfu/g, do następujących, typowych składników: 67,5% ksylitolu, 20% bazy gumy, 5% węglanu wapnia, 3% gliceryny, 2% Pluronicu F127, 1% gumy celulozowej, 0,5% związków balastowych oraz 1% środka smakowego.
P r z y k ł a d 7. Kompozycja do karmienia zwierząt
Karmę dla zwierząt, przeznaczoną do profilaktyki jamy ustnej, otrzymuje się przez przygotowanie mieszanki, składającej się z ziarna, glutenu z kukurydzy, mączki drobiowej i rybnej, soli, witamin i minerałów. Mieszankę karmy wprowadza się do mieszalnika wstępnego i nawilża. Nawilżoną karmę opuszczającą mieszalnik wstępny następnie doprowadza się do wytłaczarki z gotowaniem i żelatynizuje. Żelatynizowaną matrycę opuszczającą wytłaczarkę przepuszcza się przez dyszę i wytłacza się. Wytłoczkę tnie się na kawałki, odpowiednie do karmienia psów, suszy w temperaturze około 110°C przez około 20 minut i chłodzi w celu utworzenia granulek o aktywności wodnej wynoszącej około 0,6.
Granulki spryskiwane są 3 warstwami mieszanek powłokowych. Każda mieszanka powłokowa zawiera aktywną kulturę przynajmniej jednego ze szczepów S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, ale w jednej mieszance powłokowej wykorzystano uwodniony tłuszcz sojowy jako substrat powlekający, w jednej mieszance powłokowej wykorzystano wodę w charakterze substratu powlekającego, a w jednej mieszance powłokowej wykorzystano jako substrat powlekający ekstrakt białkowy. Granulki zawierają w przybliżeniu 104 do 109 cfu/g wspomnianych szczepów.
Claims (10)
Hide Dependent
translated from
Claims (10)
Hide Dependent
translated from
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie szczepu bakterii kwasu mlekowego wybranego z grupy Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subs. lactis i Lactococcus lactis subs. lactis biovar diacetylactis, który jest egzogenny wobec mikroflory jamy ustnej i zdolny do przylegania do błonki zębów i do wytwarzania czynnika lamującego wzrost bakterii Actinomyces naeslundii, do wytwarzania kompozycji do leczenia lub zapobiegania chorobom owiązanym z występowaniem Actinomyces naeslundii u ssaków.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego pochodzi z produktu mlecznego.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany jest z grupy składającej się ze szczepów CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986 i CNCM 1-1987.
- 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że kompozycja jest kompozycją jadalną.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 1-4, znamienne tym, że kompozycja zawiera przynajmniej 104-109 cfu/g bakterii kwasu mlekowego.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 1-5, znamienne tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego jest w kombinacji z bakteriocyną.
- 7. Kompozycja przeznaczona do utrzymania zdrowia jamy ustnej przez zmniejszenie kolonizacji Actinomyces naeslundii u saków, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy składającej się ze szczepów Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis oraz Lactococcus lactis subsp. lactis biovar iacetylactis, egzogenny względem mikroflory jamy ustnej i zdolny do przylegania do błonki zębów i do wytwarzania czynnika hamującego wzrost bakterii Actinomyces naeslundii.
- 8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że ponadto zawiera bakteriocynę.
- 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy władającej się ze szczepów CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-386, CNCM 1-1987.
- 10. Kompozycja według zastrz. 7-9, znamienna tym, że zawiera przynajmniej 104-109 cfu/g bakterii kwasu mlekowego.