ES2275697T3 - Utilizacion de una cepa de bacterias lacticas contra las enfermedades relacionadas con actinomyces naeslundii. - Google Patents
Utilizacion de una cepa de bacterias lacticas contra las enfermedades relacionadas con actinomyces naeslundii. Download PDFInfo
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Abstract
La utilización de una cepa de bacterias lácticas que es exógena a la microflora oral, que se ha seleccionado por su capacidad de adherirse a la película de los dientes y de producir un factor de inhibición de crecimiento, para la preparación de una composición con la que se pretende tratar o prevenir las enfermedades relacionadas con Actinomyces naeslundii en mamíferos.
Description
Utilización de una cepa de bacterias lácticas
exógenas contra las enfermedades relacionadas con Actinomyces
naeslundii.
La presente invención esta relacionada con la
incorporación en la microflora oral de bacterias lácticas exógenas
que son capaces de modular la colonización de A. naeslundii y
de reducir la gravedad de las enfermedades relacionadas con A.
naeslundii.
La boca (cavidad oral) contiene una microflora
residente y una no residente. La primera incluye los microorganismos
que son capaces de establecer una residencia más o menos permanente
en las superficies orales. Estas bacterias se localizan
principalmente en la lengua, la mucosa bucal y los dientes mientras
que en las encías, labios, carrillos, paladar y base de la boca
sólo se encuentra una microflora muy dispersa.
La placa dental es una película que se forma en
la superficie de los dientes que consiste en células bacterianas
incluidas en una matriz de polisacáridos extracelulares y productos
salivares. Inmediatamente tras su aparición, los dientes quedan
cubiertos con una capa amorfa de saliva, la película adquirida del
esmalte (PAE) que es de alrededor de 1,3 \mum de grueso y no
puede eliminarse mediante el cepillado dental normal.
La deposición de bacterias sobre los dientes se
da inmediatamente después de la formación de la PAE y la placa es
evidente en 8-12 horas como una estructura en
múltiples capas. La primera capa está formada por bacterias
(colonizadores tempranos) que atacan los dientes principalmente a
través del reconocimiento de receptores adhesina específicos; esto
forma un sustrato para los segundos colonizadores que se adhieren el
uno al otro a través de uniones específicas análogas o por simple
yuxtaposición.
En la lengua y la mucosa bucal, la microflora
residente natural incluye a microorganismos seleccionados de entre
Streptococcus, Veillonella, Bacteroides y
Haemophilus. En los dientes, predominan los estreptococos y
Actinomyces pero pueden encontrarse una serie de cocos y
bacilos Gram positivos y negativos.
Muchos de estos microorganismos son comensales
inocuos, pero muchos de ellos se han reconocido como agentes
etiológicos de numerosas enfermedades (Hill, M. J. y Marsh, P. D.,
Eds., Human Microbial Ecology, 1990, CRC Press, Boca Ratón,
Florida, USA).
En particular, los Actinomyces naeslundii
genoespecies 1 (previamente A. naeslundii) y 2 (previamente
A. viscosus) son miembros habituales de la placa dental
humana. Estos están entre las cepas orales que forman una placa más
fuerte, a causa de su capacidad de adherirse firmemente a los
dientes y de co-agregar con muchas otras especies
de bacterias, fomentando así su establecimiento en la boca. Además,
en ancianos se aíslan frecuentemente en los puntos de caries en las
raíces, y se cree que son el principal agente etiológico de esta
enfermedad (Bowden, G.H., et al. 1999, The diversity and
distribution of the predominant ribotypes of Actinomyces
naeslundii genospecies 1 and 2 in samples from enamel and from
healthy and carious root surfaces of teeth. J. Dent. Res.,
78, 1800-1809).
La microflora transitoria incluye a las
bacterias exógenas que pueden estar presentes ocasionalmente en la
boca, pero que no establecen una residencia permanente (incluso si
se realizan repetidas administraciones orales de estas bacterias).
Todas las bacterias de la comida, y en particular las bacterias del
ácido láctico, pueden formar parte de esta microflora
transitoria.
Se ha demostrado que algunas de estas bacterias
lácticas exógenas son capaces de adherirse a la película de los
dientes. Por ejemplo, la WO 00/09080 (Société des Produits Nestlé)
describe cepas de bacterias lácticas, que no son parte de la
microflora residente de la boca, que producen una acidificación
reducida y que son capaces de adherirse directamente a la película
de los dientes. Estas bacterias se utilizan concretamente para el
tratamiento o prevención de la caries dental y la infección
periodontal causadas por microorganismos cariogénicos como los
Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus.
Las bacterias exógenas también pueden producir
factores que inhiben el crecimiento de la microflora residente en
la boca. Por ejemplo, la PE 759469 (Société des Produits Nestlé)
describe la utilización de una bacteriocina producida por
Micrococcus varians para la inhibición del desarrollo de los
patógenos orales S. sobrinus, S. sanguis, S.
mutans y A. viscosus. La aplicación de bacteriocinas es
también una de las estrategias investigadas que se han optimizado
para la reducción de la caries dental. Estas moléculas son
interesantes al considerarse los próximos agentes
anti-caries y como factores importantes en la
modulación de la colonización de la cavidad oral.
Debe notarse que los conocimientos previos no
proporcionan ninguna información sobre las cepas que pueden
establecerse en la cavidad oral adhiriéndose directamente a la
película de los dientes y que también producen factores como los
factores de inhibición del crecimiento, que pueden modular la
colonización de A. naeslundii como para reducir la gravedad
de las enfermedades relacionadas con A. naeslundii.
En consecuencia, la presente invención pretende
proporcionar la utilización de bacterias lácticas que son exógenas
a la microflora oral, seleccionadas por su capacidad de adherirse a
la superficie de los dientes y producir un factor de inhibición del
crecimiento, para la preparación de una composición con la que se
pretende tratar o prevenir las enfermedades relacionadas con
Actinomyces naeslundii en mamíferos.
Las bacterias lácticas pueden seleccionarse de
entre el grupo que consiste en Streptococcus thermophilus,
Lactococcus lactis subsp. lactis, y Lactococcus
lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, y en
particular de entre el grupo que consiste en las cepas CNCM
I-1984, CNCM I-1985, CNCM
I-1986 y CNCM I-1987.
Así, mediante la colonización de la superficie
de los dientes y la producción de factores de inhibición del
crecimiento, tales bacterias lácticas pueden conseguir una reducción
significativa de la expansión de Actinomyces naeslundii,
reduciendo así la placa dental, la caries en las raíces y otras
infecciones relacionadas con Actinomyces naeslundii.
Otro objeto es el proporcionar una composición
para mantener la salud bucal mediante la reducción de la
colonización de Actinomyces naeslundi, composición que
comprende bacterias lácticas exógenas que se han seleccionado por
su capacidad de adherirse a la superficie de los dientes y de
producir un factor de inhibición del crecimiento.
Tal composición puede contener al menos
10^{4}-10^{9} UFC/g de bacterias lácticas.
En la siguiente descripción, la boca se define
como la cavidad oral de humanos, o animales como las mascotas, que
se compone de la mucosa oral (encías, labios, carrillos, paladar y
base de la boca), la lengua y los dientes (lo que incluye las
estructuras artificiales).
El término "factor de inhibición del
crecimiento" define cualquier sustancia extracelular producida
por las bacterias lácticas exógenas adherentes que les permite
inhibir el crecimiento de A. naeslundii.
Respecto al primer objeto de la presente
invención, éste está relacionado con la utilización de bacterias
lácticas exógenas que se han seleccionado por su capacidad de
adherirse a la superficie de los dientes y de producir un factor de
inhibición del crecimiento, para la preparación de una composición
con la que se pretende tratar o prevenir las enfermedades
relacionadas con Actinomyces naeslundii en mamíferos.
Las bacterias lácticas pueden seleccionarse de
entre el grupo que consiste en Streptococcus thermophilus,
Lactococcus lactis subsp. lactis, y Lactococcus
lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, y en
particular de entre el grupo que consiste en las cepas
Streptococcus thermophilus (NCC 1529) (CNCM
I-1984); Streptococcus thermophilus (NCC
1561) (CNCM I-1985), Lactococcus lactis
subsp. lactis (NCC 2211) (CNCM I-1986),
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
dioacetylactis (NCC 2225) (CNCM I-1987).
Las bacterias lácticas son preferiblemente de
origen lácteo (es decir, las que se obtienen de la leche o el
queso, por ejemplo).
Las bacterias lácticas de acuerdo con la
invención resultan en una "acidificación reducida", lo que
significa que son menos acidificantes que las cepas patogénicas.
Por lo tanto, pueden contribuir a un pH en la cavidad oral de
alrededor de 5,5-7.
Estas cepas se han seleccionado de entre las
cepas de bacterias lácticas por su capacidad de adherirse a la
película de los dientes y su temperatura de crecimiento óptima de
alrededor de 37°C, que es la temperatura de en la cavidad oral.
También son capaces de producir un factor de inhibición de
crecimiento, lo que combinado con sus propiedades de adhesión les
permiten disminuir significativamente la extensión de la
colonización de A. naeslundii genoespecies 1 y 2.
Además, son capaces de fermentar glucosa y
sacarosa, y no sintetizan glucanos, que son factores de
patogenicidad de las cepas cariogénicas.
También es posible utilizar al menos una cepa de
bacterias lácticas en combinación con una bacteriocina, por
ejemplo.
Las cepas de bacterias lácticas pueden incluirse
en un alimento, alimento para mascotas, composición cosmética o
farmacéutica, por ejemplo. De acuerdo con esto, estas composiciones
son preferiblemente dentífricos, enjuagues bucales, gomas de
mascar, pulverizadores, bebidas, caramelos, formulaciones
infantiles, helados, postres helados, aliños dulces para ensaladas,
preparados lácteos, quesos, quark, yogur, leches acidificadas, nata
para café o nata montada, por ejemplo.
Las bacterias lácticas exógenas pueden
utilizarse en una cantidad de al menos
10^{4}-10^{9} UFC/g de bacterias lácticas.
El efecto de incorporar las bacterias
anteriormente mencionadas en la microflora oral se probó en un
modelo de rata. Las cepas CNCM I-1985 y
CNCM-1986 fueron capaces de modular la ecología
microbiana oral, reduciendo significativamente el número de UFC
totales. Más específicamente, las cepas fueron capaces de reducir
significativamente la extensión de la colonización de A.
naeslundii genoespecie 2, con la que las ratas se habían
infectado (véanse los ejemplos).
Patrones de fermentación: Se probaron 49
azúcares sencillos con la prueba en tira API 50 CH de bioMérieux
(bioMérieux SA, 69280 Marcy-l'Etoile, France) y los
resultados se muestran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de Streptococcus thermophilus
(NCC 1529), Streptococcus thermophilus (NCC 1561),
Lactococcus lactis subsp. lactis (NCC 2211),
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
dioacetylactis (NCC 2225) se depositaron el 3 de marzo de
1998, bajo el Tratado de Budapest, en la Colección Nacional de
Cultivos de Microorganismos (CNCM I-1984, CNCM
I-1985, CNCM I-1986 y CNCM
I-1987, respectivamente), 25 rue du docteur Roux,
75724 Paris, France.
El segundo objeto principal de la presente
invención está relacionado con una composición para el mantenimiento
de la salud bucal mediante la reducción de la colonización de A.
naeslundii en mamíferos, y dicha composición comprende
bacterias lácticas exógenas, que se han seleccionado por su
capacidad de adherirse a la película de los dientes y de producir
un factor de inhibición de crecimiento.
Estas composiciones están particularmente
indicadas en la profilaxis o el tratamiento de la placa dental y
las enfermedades relacionadas con la infección por A.
naeslundii, como la caries en las raíces, por ejemplo.
La cepa de bacterias lácticas de acuerdo con la
presente invención se selecciona de entre el grupo que consiste en
Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp.
lactis, y Lactococcus lactis subsp. lactis
biovar diacetylactis, y preferiblemente de entre el grupo que
consiste en las cepas CNCM I-1984, CNCM
I-1985, CNCM I-1986 y CNCM
I-1987.
Tal composición puede contener al menos
10^{4}-10^{9} UFC/g de bacterias lácticas.
También pueden prepararse composiciones
sinergísticas, añadiendo al menos una bacteriocina, que es activa
frente a las bacterias Gram positivas orales. En ese caso, las
composiciones de higiene bucal pueden comprender del 0,00001 al
50%, y preferiblemente del 0,00001 al 15% de bacteriocina
purificada, en peso de la composición. La bacteriocina es
preferiblemente variacina (PE 0 759 469).
Para proteger la composición de la degradación,
también puede incluirse un antioxidante soluble en aceite. Los
antioxidantes adecuados incluyen los "tocoferoles",
butil-hidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT)
y ascorbil palmitato.
El antioxidante soluble en aceite está presente
en cantidades de entre el 0,005% y el 0,5%, preferiblemente del
0,005% al 0,01% en peso de la composición.
Los abrasivos adecuados para su utilización en
las composiciones de dentífrico de la presente invención incluyen
el carbonato cálcico, aluminosilicato cálcico, alumina, alumina
hidratada, ortofosfato de zinc, partículas de plástico y sílice, de
los que el sílice es el abrasivo preferido.
Las composiciones de acuerdo con la invención
tendrán un pH que es aceptable a nivel oral y en el que la actividad
de dichas bacterias lácticas no está comprometida. El pH puede
estar en el rango de 3,0-9,5, preferiblemente en el
rango de 3,5 a 6,5.
Estas composiciones pueden prepararse mediante
los procesos convencionales, lo que comprende la mezcla de los
ingredientes en las cantidades relativas adecuadas y finalmente, y
si es necesario, el ajuste del pH hasta el valor deseado.
Los Actinomyces naeslundii genoespecies 1
(previamente A. naeslundii) y 2 (previamente A.
viscosus) están entre las cepas orales que forman una placa más
fuerte. Estas se aíslan comúnmente en los puntos de caries en las
raíces, en particular en los humanos con más de 40 años, y se cree
que son el agente etiológico principal de esta enfer-
medad.
medad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las cepas de S. thermophilus NCC1561
(CNCM I-1985) y L. lactis subsp.
lactis NCC2211 (CNCM I-1986) (de aquí en
adelante L. lactis NCC2211) se incorporaron in vitro
en una biopelícula que mimetiza la placa dental in
vitro.
Las cepas orales A. naeslundii
genoespecie 1 (previamente A. naeslundii) OMZ745 y A.
naeslundii genoespecie 2 (previamente A. viscosus)
OMZ105 se obtuvieron del Institute für Orale Mikrobiologie und
Allgemeine Immunologie, Universidad de Zürich, y se cultivaron en
medio FUM en anaerobiosis (GasPackSystem, BBL) a
37°C.
37°C.
Todas las cepas se almacenaron en glicerol a
-20°C y se precultivaron durante 14 horas antes de su uso a su
temperatura óptima específica.
Las dos cepas seleccionadas L. lactis
NCC2211 y S. thermophilus NCC1561 se inocularon en un sistema
in vitro en el que se genera una biopelícula, compuesta por
bacterias que se encuentran comúnmente en la boca humana tras 40
años, sobre discos de hidroxiapatita recubiertos de saliva. El medio
fluido universal (FUM), el medio de crecimiento utilizado, se
formuló especialmente para tamponar la acidez producida por las
cepas de prueba y así conseguir un crecimiento continuado
(desarrollo de placa), como si estuvieran en la boca (Gmur y
Guggenheim, 1983). Los ensayos se realizaron por triplicado y las
mezclas, con y sin las cepas lácteas, se probaron en paralelo. Se
utilizaron las cepas listadas en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Formación de la película de saliva:
cubrir los discos de hidroxiapatita sintética de 10 mm de diámetro
(HY-APATITE®, Euro-Crystals,
Landgraaf, The Netherlands) con 800 \mul de saliva humana e
incubar durante 4 h a temperatura ambiente en agitación (1
disco/pocillo en una placa estéril Nunclon de 24 pocillos).
- Preparación del asociación bacteriana:
cultivar S. thermophilus NCC1561, L. lactis subsp.
lactis NCC2211, S. sobrinus OMZ176, S. oralis
OMZ607, A. naeslundii OMZ745, V. dispar OMZ493 y F.
nucleatum OMZ596 durante toda la noche a 37°C en anaerobiosis
en FUM-glucosa (S. thermophilus NCC1561 en
FUM-lactosa), ajustar la DO_{550} hasta 1 con FUM
y agrupar 2 ml de cada una de las suspensiones de bacterias orales
con 2 ml de S. thermophilus NCC1561 o de L. lactis
subsp. lactis NCC2211. La mezcla control sólo contiene las
cinco cepas orales.
- Formación y recuperación de la
biopelícula: el procedimiento es como se describe en Guggenheim
et al., 1998, Validation of a new biofilm model. J. Dent.
Res., 77, (Spec Iss A): 110 (Resumen nº 38).
- Análisis de cultivo de la biopelícula:
Sembrar en espiral la suspensión en agar sangre Columbia (sangre de
oveja al 5%, Becton Dickinson, Meylan Cedex, France) para el contaje
total y para la diferenciación de A. naeslundii. Incubar las
placas a 37°C en anaerobiosis durante 48 h.
Las cepas y las condiciones de cultivo
utilizadas están listadas en la Tabla 3.
Se probó el antagonismo de crecimiento entre
S. thermophilus NCC1561, S. thermophilus NCC1536 y
L. lactis NCC2211 (cepas asesinas) y A. naeslundii
OMZ745 y A. viscosus OMZ105 (cepas diana).
- Cultivar las cepas asesinas durante toda la
noche en placas de agar en anaerobiosis y las cepas diana en BHI
hasta llegar a la fase estacionaria
- Diluir 20 \mul de la suspensión de las cepas
diana en 3 ml de agar blando BHI (agar 7 g/l) que contiene glucosa
y lactosa, vortear y vertir inmediatamente sobre una placa de agar
BHI
- Solidicar durante 1 h a temperatura ambiente,
entonces sembrar la cepa asesina de la placa M17 en forma de cruz.
Sembrar en paralelo sólo la cepa asesina y diana como control
- Incubar a 37°C en anaerobiosis durante 24
horas.
El antagonismo de crecimiento se detecta por un
halo de inhibición alrededor de la cruz.
Las diferencias entre los controles y las
asociaciones de prueba se determinaron mediante la prueba t de
Student.
S. thermophilus NCC1561 y L.
lactis NCC2211 pueden incorporarse y crecer en la biopelícula
tipo placa de los discos de S-HA, y sus UFC
totales/disco tras 40,5 h se proporcionan en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de la incorporación de las cepas
lácteas en la biopelícula sobre las especies orales se indica en
las Tablas 5 y 6. Cuando se incluye S. thermophilus NCC1561
(Tabla 5), se observa una reducción general de la flora total, que
está representada por el contaje en placas de agar sangre Columbia
(ASC), y de 4 de las especies orales.
Al introducir L. lactis NCC2211 en la
asociación de cepas orales (Tabla 6), el contaje de la flora total
disminuyó notablemente (UFC en ASC). La reducción fue significativa
en el caso de A. naeslundii OMZ745 que disminuyó
significativamente (p = 0,021). La reducción fue aún mayor si la
cepa se inoculaba en los discos antes que las bacterias orales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron algunos ensayos para verificar si
la reducción de las cepas orales era debida a un antagonismo de
crecimiento de las cepas lácteas hacia ellas (Tabla 7). Las cepas
A. viscosus OMZ105 y S. thermophilus NCC1536 también
se incluyeron en la prueba ya que forman parte del modelo in
vivo (ejemplo 2).
Las cuatro cepas lácteas inhibieron el
crecimiento de la cepa Gram negativa A. viscosus OMZ105. Esta
inhibición no puede atribuirse a la producción de ácido láctico.
A. viscosus es capaz de metabolizar lactato sólo bajo
condiciones aeróbicas (van der Hoeven et al., (1990) Oral
Microbiol. Immunol., 5, 223-225) y es muy
acidúrico. Estos descubrimientos se han confirmado sembrando A.
viscosus en presencia de ácido láctico al 1%, y no se observó
inhibición alguna.
S. thermophilus NCC1561 y L.
lactis NCC2211 pudieron incorporarse en una biopelícula que
imita la placa dental y fueron capaces de modular la microflora
oral, reduciendo significativamente el número total de UFC, y más
específicamente, estas cepas fueron capaces de reducir
significativamente la extensión de la colonización de A.
naeslundii genoespecie 2. Además, las cepas pudieron inhibir el
crecimiento de A. naeslundii genoespecies 1 y 2 en
cocultivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se realizó un estudio in vivo en un
modelo de rata. En este estudio, la asociación de las cepas
seleccionadas continuó de forma diaria durante el periodo
experimental completo, mediante el suministro de un producto lácteo
frío.
El estudio se llevó a cabo en 58 días. Para
realizar el experimento durante el día, el periodo activo de los
animales tuvo que adelantarse 7 horas en total; esto se realizó en
tres pasos en el día 16, 17 y 18 como se describe en más detalle.
Las cepas cariogénicas se asociaron los días 21 y 22, mientras que
la asociación de las cepas lácteas se inició el día 23 y se mantuvo
hasta el día 57. Los animales se alimentaron con las cepas lácteas
como suplemento en una base de yogur que estaba incluida en su dieta
normal, como se explica en la sección. Los dientes de las ratas se
frotaron con un bastoncillo de algodón al final del estudio, en el
día 58.
En el experimento se utilizaron 10 camadas que
consisten en 4 crías de rata Osborne-Mendel cada una
(sección de producción animal del Institute für Orale Mikrobiologie
und Allgemeine Mikrobiologie, Universidad de Zurich, Zurich,
Suiza). Todos los animales se pesaron al inicio y al final del
periodo experimental. Cuando tuvieron 13 días, las madres y las
crías se transfirieron a jaulas de acero inoxidable con fondo de
rejilla sin sustrato y se alimentaron con dieta Nafag en polvo (0,2
\mum) baja en fluoruro para evitar los impactos en las fisuras
(Rat Checkers nº 184, NAFAG, Gossau SG, Suiza), y agua corriente a
voluntad. La fase activa durante la que las ratas comen es durante
la noche, es decir, de 18:00 - 06:00.
Para poder rellenar los recipientes de alimento
durante el horario normal de trabajo, el biorritmo circadiano se
modificó secuencialmente entre los días 16 y 18 mediante el avance
de la fase activa de las ratas cada día en tres ocasiones mediante
un ajuste automático del control de la luz.
En el día 16/17, el inicio del periodo activo se
adelantó de las 18:00 h a las 15:00, es decir, era de noche de
15:00 - 03:00 y era de día de ahí en adelante. En el día 17/18, el
inicio del periodo activo se adelantó de las 15:00 a las 12:00 h,
es decir, era de noche de 12:00 h - 00:00 h y de día de las 00:00 h
en adelante.
Finalmente en el día 18/19, el inicio del
periodo activo se adelantó de las 12:00 a las 10:00, es decir, era
de noche de 10:00 h a 22:00 h y de día de 22:00 h en adelante.
Por lo tanto en el día 19 se había completado el
cambio de la fase activa de las ratas de las horas de oscuridad al
horario normal de trabajo (10:00 - 22:00 h).
En el día 20 se retiraron las madres, y se
inició la alimentación de las ratas a voluntad con la dieta
modificada 2000a que contiene el 40% de sacarosa, 28% de sustituto
de leche descremada (extracto de proteína de soja
SVPRO-PP 1611 al 39,4%, lactosa al 49,3%,
L-metionina al 0,6%, L-lisina al
0,3%, HCl al 0,1%), harina de trigo al 24%, levadura de cerveza al
5%, proteína instantánea Gevral® al 2%
(Whitehall-Robins SA, 6301 Zug, Suiza) y NaCl al
1%.
Durante el periodo de asociación (días 21 y 22)
el agua de beber se suplementó con glucosa al 2% y sacarosa al 2%
para apoyar la implantación de las bacterias asociadas. En el día 23
las camadas se distribuyeron en los 3 tratamientos, 1 animal por
jaula, en un equipo de alimentación programado y empezaron a recibir
la dieta de prueba como se indica en la tabla 10. La dieta de
prueba consistió en 18 comidas de yogur que contenían las cepas de
prueba, alternando con 18 comidas de dieta modificada 2000a
previamente descrita.
El agua para beber se suministró a voluntad.
Tras el procedimiento de frotado con el bastoncillo de algodón en
el día 58, se administró a los animales una sobredosis de tiopental
sódico (100 mg/Kg de peso corporal) mediante una inyección
intraperitoneal y se decapitaron cuando estuvieron comatosos.
Cepas bacterianas: Se utilizaron las
cepas que se listan en la Tabla 8.
Se realizó un estudio preliminar para valorar
los parámetros de crecimiento, especialmente las horas necesarias
para alcanzar la fase estacionaria en las condiciones específicas
descritas. Así se estableció el cultivar las cepas de S.
thermophilus durante 7 h y la de L. lactis durante 6 h.
También se realizó un estudio de la viabilidad tras la congelación
de las cepas lácteas mediante la siembra de la misma suspensión
celular antes y después de una congelación. Para asociarlas a los
animales, las cepas lácteas se trataron de acuerdo con el siguiente
procedimiento.
- Inocular las cepas al 1% durante toda la noche
en un medio apropiado a partir de una reserva en glicerol
- Inocularlas al 5% a partir de ese cultivo en
10 recipientes de cultivo de 4 litros de medio apropiado
pre-calentado a la temperatura óptima de
crecimiento, y cultivarlas hasta el final de la fase
logarítmica/principio de la fase estacionaria.
- Determinar las UFC/ml finales sembrándolas en
agar M17-lactosa a partir de dos recipientes
elegidos al azar para cada una de las 4 cepas. Incubar las placas
durante toda la noche en anaerobiosis.
- Centrifugar los cultivos de cada recipiente a
6000 rpm durante 10 min. y resuspender los botones en 150 ml de
medio fresco; mantener durante toda la noche a 4°C.
- Centrifugar de nuevo y resuspender en el medio
de congelación (glicerol al 15% en Belliker o M17).
- Distribuir en alícuotas de forma que haya 2 x
10^{11} células viables/vial, teniendo en cuenta la pérdida de
viabilidad debida a la congelación, y almacenar a -20°C hasta que
sea necesario.
Los animales se distribuyeron en los 3
tratamientos (Tabla 9). Cada tratamiento se realizó en 10 crías que
se distribuyeron 1 por jaula.
Todas las ratas se infectaron inicialmente en
los días 21 y 22 con A. viscosus OMZ105.
Las cepas de laboratorio probadas se asociaron
de forma diaria (ya que estaban incluidas en la comida de base de
yogur), a partir del día 23. Se mezclaron 2 viales congelados, cada
uno con 2 x 10^{11} células viables de la cepa de prueba, en 200
ml de yogur para obtener al menos 10^{9} UFC/ml. Se utilizó como
controlnegativo a S. thermophilus NCC1536, una cepa que no
se adhiere a la S-HA.
Las comidas de yogur y dieta 2000a, de 1 ml y
400 mg respectivamente, se ofrecieron de forma alternativa 18 veces
al día en intervalos de 20 min. (Tabla 10). Por lo tanto, cada
animal recibió en total 18 ml de yogur y 7,2 g de dieta en
polvo.
Las comidas se dispensaron en los recipientes
para alimentación de un equipo de alimentación programado que
automáticamente ofrecía a los animales la comida correcta en el
momento exacto.
\vskip1.000000\baselineskip
En el día 58, se frotaron con un bastoncillo de
algodón cinco ratas por tratamiento. Las suspensiones del frotis se
sembraron en placas de Petri para el contaje de UFC (unidades
formadoras de colonias) o se inmovilizaron en portaobjetos para
inmunofluorescencia para el contaje de NCT (número de células
totales).
- Frotar los dientes de las ratas con un
bastoncillo de algodón estéril y colocarlo inmediatamente en 5 ml
de NaCl al 0,9% estéril
- Vortear durante 1 min. y sonicar durante 5 s a
50 W.
- Semblar en espiral las suspensiones diluidas
adecuadamente en agar ASC, MS y HJL.
- Incubar las placas de ASC y MS a 37°C y las
placas HJL a 45°C.
- Colocar 10 \mul de la suspensión del frotis
sin diluir preparada para la determinación de UFC en cada pocillo
de un portaobjetos de vidrio de 24 pocillos (Dynatech Produkte AG,
Embrach Embraport, Suiza), y dejar secar al aire.
- Fijar mediante inmersión en metanol durante 2
min. y dejar secar al aire.
- Incubar con 10 \mul del anticuerpo adecuado
o suero diluido en tampón de ELISA (sección 4.2.2.5) e incubar a
37°C durante 30 min.
- Aspirar cada gota desde la pared del pocillo y
lavar mediante inmersión del portaobjetos, primero en tampón de
ELISA y después en agua destilada. Secar al aire.
- Aplicar 10 \mul de
IgG(H+L)-FITC de cabra
anti-conejo (Sigma) diluido 1:400 e incubar a 37°C
durante 30 min.
- Lavar como antes y secar al aire.
- Aplicar 49 ml de solución de montaje (sección
4.2.2.5), cubrir con un cubreobjetos y contar las células
fluorescentes con un microscopio de fluorescencia.
Los datos se trataron con un ANOVA bidireccional
(Snedecor y Cochran, 1980).
Resultados de la asociación continua de
las cepas lácteas mediante la alimentación con un producto lácteo
frío.
- Colonización de la cepa. Cuando el
producto lácteo se suplementó con el control no adherente S.
thermophilus (NCC1536), se contaron 1,7 (+/- 1,1) x 10^{7}
UFC de A. viscosus OMZ105 formador de placa. Las cepas
lácteas no se pudieron contar mediante métodos microbiológicos. No
obstante, se intentó una evaluación cualitativa mediante
inmunofluorescencia. Las tres cepas lácteas adherentes pudieron
reconocerse en las muestras de placa de los tratamientos 2 y 3. Fue
imposible hacer una cuantificación precisa, debido a que estaban
co-agregadas con otras bacterias orales y residuos
bucales, generando de esta manera grandes agregados.
- Variaciones en la flora total (FT). Los
tres tratamientos, que contienen las cepas adherentes probadas
S. thermophilus NCC1561 y L. lactis NCC2211,
mostraron una reducción significativa del número de unidades
formadoras de colonias sobre ASC en comparación con el grupo
control que contiene la cepa no-adherente S.
thermophilus NCC1536 (Tabla 11). El tratamiento 2 redujo el
contaje de UFC en un factor significativo P_{F}<0,01 y el
tratamiento 3 aún más significativamente (P_{F}<0,001).
- Modulación de la colonización dental por
A. viscosus OMZ105 por las cepas probadas.
En el caso de la bacteria formadora de placa
A. viscosus OMZ105, se observó una disminución aparentemente
menos pronunciada pero más significativa del número de unidades
formadoras de colonias con los tres tratamientos que contienen las
cepas adherentes probadas respecto al tratamiento 1
(P_{F}<0,01) (Tabla 11). Por el contrario, los porcentajes de
A. viscosus sobre el contaje de UFC totales no fueron
significativamente diferentes. Aproximadamente el 50% de las UFC
totales en los cuatro tratamientos se identificaron como colonias
de A. viscosus.
\newpage
En este ensayo in vivo, las cepas que se
suministraron diariamente, mostraron un claro efecto inhibitorio
sobre la microflora total, cuyas UFC disminuyeron de forma
significativa. Esta disminución puede explicarse mediante el
antagonismo de crecimiento de las cepas lácteas frente a las
especies orales. Por ejemplo, todas ellas, incluyendo el S.
thermophilus NCC1536 no adherente a la S-HA,
pueden inhibir el crecimiento de A. viscosus OMZ105 in
vitro. No obstante, in vivo tal efecto sólo se presenta
en las cepas adherentes a la S-HA, tal como se
detectó en los tratamientos 2-4 comparados con el
primero.
Concretamente, como los animales fueron
infectados con A. viscosus OMZ105, la cuantificación de estos
organismos formadores de placa fue posible al final del periodo
experimental, y la disminución de sus UFC pudo monitorizarse
cuidadosamente.
Los porcentajes de A. viscosus OMZ105
sobre las UFC total no disminuye en paralelo, por lo que se puede
deducir que el efecto de antagonismo del crecimiento también se
presenta frente a otras especies, es decir, Veillonellae, y
consecuentemente lo que se observa es un efecto global.
Así, las cepas CNCM I-1985 y
CNCM-1986 son capaces de modular la ecología oral
microbiana, disminuyendo de forma significativa la colonización de
la genoespecie 2 de A. naeslundii, con la que se habían
infectado las ratas.
Ejemplo
3
Se cultivaron S. thermophilus NCC1561 y
S. thermophilus NCC1536 durante la noche en 1 l de Belliker
a 42°C. Para la producción de biosurfactante, se utilizó el
procedimiento descrito en Busscher et al., (1997) Appl.
Environ. Microbiol., 63, 3810-3817, (Busscher
et al., 1997).
- Lavar las células tres veces con PBS.
- Resuspender en 200 ml de agua destilada o
PBS.
- Producir el biosurfactante mediante agitación
suave de la suspensión durante 2 o 4 h a temperatura ambiente.
- Separar las bacterias mediante centrifugación
a 10000 rpm durante 10 min.
- Centrifugar el sobrenadante dos veces a 10000
rpm durante 10 min.
- Liofilizar y pesar tanto el botón como las
soluciones de sustancias surfactantes.
La suspensión de biosurfactante bruto se analizó
primero mediante SDS-PAGE y después se sometió a
mediciones de tensión superficial.
El SDS-PAGE se llevó a cabo con
un ExcelGel al 12,5% listo para su uso (Amersham Pharmacia Biotech).
Se realizó una tinción de plata con el equipo de tinción de plata
Plusone (Amersham Pharmacia Biotech).
La tensión superficial de las suspensiones de
biosurfactantes se midió con un tensiómetro de volumen de gota TVT1
(Lauda, Lauda-Königshofen, Alemania), que está
basado en el principio del volumen de una gota. En resumen, el
método consiste en la determinación exacta del volumen de una gota
de una suspensión que se separa desde un capilar. Este volumen
(volumen crítico) es proporcional a la tensión superficial (s), cuyo
valor se calcula con la relación:
\sigma = V \ g
\ \Delta \rho \ F/2 \ \pi
r_{cap}
en la
que:
- \sigma es la tensión interfacial
- V es el volumen de la gota
- G es la constante de aceleración
- \Delta\rho es la diferencia de las
densidades de ambas fases adyacentes
- F es el factor de corrección
- r_{cap} es el radio del capilar.
Las mediciones se realizaron por duplicado a
37°C al aire. Cada medición consistió en 10 ciclos. Una solución de
6 mg/ml de producto bruto liberado, hizo disminuir la tensión
superficial del agua de 70 a 51 mN/m (Tabla 13). El perfil de
SDS-PAGE de los productos bacterianos liberados,
mostró que había muchas sustancias diferentes de naturaleza
proteica en la solución.
Las células de S. thermophilus NCC1561 y
S. thermophilus NCC1536 son capaces de liberar sustancias
con actividad surfactante. Por lo tanto es posible que el
biosurfactante producido por S. thermophilus NCC1561 haga
que la propia bacteria y las demás cepas orales cercanas se separen
de la superficie del diente. Por el contrario, esta acción no se
observa en S. thermophilus NCC1536, ya que esta cepa no se
adhiere a los dientes.
Ejemplo
4
La pasta de dientes se prepara añadiendo
10^{5} ufc/ml de al menos una de las cepas de bacterias lácticas
CNCM I-1984, CNCM I-1985, CNCM
I-1986 o CNCM I-1987 en forma
liofilizada, a la siguiente mezcla que contiene: 1,65% de cloruro
de cetil piridinio, 33,0% de sorbitol (sol. al 70%), 25,0% de
glicerina, 2,0% de carboximetilcelulosa sódica, 0,25% de fluoruro
sódico, 26,3% de silicio (RP 93), 8,1% de silicio espesante (Sident
22), 0,5% de sacarina sódica, 3,2% de poloxámero (Pluronic
F108).
Esta pasta de dientes se pretende utilizar para
la profilaxis o tratamiento de la caries en las raíces, placa
dental y otras infecciones inducidas por especies de A.
naeslundii.
Ejemplo
5
5 l de medio de cultivo MRS se esterilizaron
durante 15 min. a 121°C y después se inocularon con un 5% en
volumen de un cultivo activo de al menos una de las cepas de S.
thermophilus CNCM I-1984 o CNCM
I-1985 que contienen aproximadamente 10^{9}
ufc/ml. Tras la incubación durante 8 h a 41°C, se obtuvo un cultivo
de inicio de 4,5 x 10^{8} ufc/ml.
5 l de leche descremada reconstituida con un
contenido de materia seca del 10%, a los que se le ha añadido
extracto de levadura al 0,1%, se esterilizaron durante 15 min. a
121°C y se inocularon con un 2% de un cultivo activo de
Streptococcus thermophilus espesante comercial que contiene
aproximadamente 10^{9} células/ml. Tras la incubación durante 4 h
a 41°C, se obtuvo un cultivo de inicio que contenía 4,5 x 10^{8}
células/ml.
Un lote de leche entera que contiene un 3,7% de
grasas reforzado con un 2,5% de leche descremada en polvo y luego
pasteurizada durante 30 min. a 90°C, se inoculó con un 2% en volumen
del cultivo de inicio de al menos una de las cepas CNCM
I-1984 o CNCM I-1985, y un 3% en
volumen del cultivo de inicio del Streptococcus thermophilus
espesante. Se agitó la leche inoculada, se vertió en recipientes y
se incubó durante 4 h a 41°C.
El yogur obtenido posee una buena firmeza y una
textura suave y está destinado a la higiene bucal.
Ejemplo
6
Se puede preparar una goma de mascar para
prevenir o tratar la caries en las raíces, placa dental u otras
enfermedades relacionadas con A. naeslundii, añadiendo un
cultivo activo de al menos una de las cepas de S.
thermophilus CNCM I-1984 o CNCM
I-1985, que contienen aproximadamente de 10^{4} a
10^{9} ufc/g, a los siguientes ingredientes típicos: 67,5% de
xilitol, 20% de goma base, 5% de carbonato cálcico, 3% de glicerina,
2% de Pluronic F127, 1% de goma de celulosa, 0,5% de compuestos de
Balast y 1% de aromatizante.
Ejemplo
7
Se obtuvo una comida para la higiene bucal de
los animales domésticos preparando una mezcla de alimentos hecha de
maíz, comida a base de gluten de maíz, de pollo y de pescado, sales,
vitaminas y minerales. La mezcla de alimentos se coloca en un
preacondicionador y se humedece. El alimento humedecido que sale del
preacondicionador se coloca entonces en una
olla-extrusora y se gelatiniza. La matriz
gelatinizada que sale del extrusor se fuerza a través de un troquel
y se extruye. El extrusado se corta en pedazos adecuados para comida
para perros, se seca a alrededor de 110°C durante alrededor de 20
minutos y se enfría para formar botones que poseen una actividad
acuosa de alrededor del 0,6.
Los botones se pulverizan con 3 mezclas de
recubrimiento. Cada mezcla de recubrimiento contiene cultivo activo
de al menos una de las cepas de S. thermophilus CNCM
I-1984 o CNCM I-1985, pero una de
las mezclas de recubrimiento utiliza grasa de soja hidrogenada como
sustrato de recubrimiento, otra mezcla de recubrimiento utiliza
agua como sustrato de recubrimiento, y la otra mezcla de
recubrimiento utiliza proteína digerida como sustrato de
recubrimiento. Los botones contienen aproximadamente de 10^{4} a
10^{9} ufc/g de dichas cepas.
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(Formulario pasa a página
siguiente)
Claims (12)
1. La utilización de una cepa de bacterias
lácticas que es exógena a la microflora oral, que se ha seleccionado
por su capacidad de adherirse a la película de los dientes y de
producir un factor de inhibición de crecimiento, para la
preparación de una composición con la que se pretende tratar o
prevenir las enfermedades relacionadas con Actinomyces
naeslundii en mamíferos.
2. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la cepa de bacterias lácticas es de
origen lácteo.
3. La utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 1 o 2, en la que la cepa de bacterias lácticas se
selecciona de entre el grupo que consiste en Streptococcus
thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, y
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis.
4. La utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la cepa de bacterias lácticas se
selecciona de entre el grupo que consiste en las cepas CNCM
I-1984, CNCM I-1985, CNCM
I-1986 y CNCM I-1987.
5. La utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición es una composición
comestible.
6. La utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición contiene al menos
10^{4}-10^{9} UFC/g de la cepa de bacterias
lácticas.
7. La utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que la cepa de bacterias lácticas se
combina con una bacteriocina.
8. Una composición para el mantenimiento de la
salud bucal reduciendo la colonización de Actinomyces
naeslundii en mamíferos, en la que dicha composición contiene
al menos una cepa de bacterias lácticas que es exógena a la
microflora oral, que se ha seleccionado por su capacidad de
adherirse a la película de los dientes y de producir un factor de
inhibición de crecimiento.
9. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 8, que además comprende una bacteriocina.
10. Una composición de acuerdo con las
reivindicaciones 8 o 9, que comprende al menos una cepa de bacterias
lácticas seleccionadas de entre el grupo que consiste en
Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp.
lactis, y Lactococcus lactis subsp. lactis
biovar diacetylactis.
11. Una composición de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 8 a 10, que comprende al menos una cepa de
bacterias lácticas seleccionadas de entre el grupo que consiste en
las cepas CNCM I-1984, CNCM I-1985,
CNCM I-1986 y CNCM I-1987.
12. Una composición de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 8 a 11, que comprende al menos
10^{4}-10^{9} UFC/g de la cepa de bacterias
lácticas.
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