JPS6028937A - 非う蝕性抗体および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はストレプトコッカス・ミュウタンスによって誘
発されるヒトの虫歯を予防または抑制（以下抑制という
）するだめの非う触性抗体およ゛び本抗体を有効成分と
する非う触性組成物に関する。

虫歯（う蝕）は口腔内の細菌によって直接に誘発される
歯の疾患である。各種の虫歯原因菌のなかで、ストレプ
トコッカス・ミュウクンスが最も重要視されている。従
来、たとえばパーシース。

マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー、５０２頁（１９７４）は［ミュウタンスと虫歯と
関係があるとされている。ミュウタンスは、ストレプト
コッカス・サリバリウスに似た微生物であるが、詳しく
研究されたことも、サリバリウスと比較されたこともな
かった」と記載している。

しかし今日一般によく知れているように、ミュウタンス
はヒトおよび動物の歯の表面や裂溝内面に付着して、し
よ糖から水溶性および不溶性のデキストラン様多糖体（
以下ＤＰ８という）を産生する。

不溶性ＤＰ８は歯の表面に付着して、固い粘着性の歯垢
（プラーク）を形成する。口腔内のミュウタンスの多く
はプラーク内に居住して乳酸を産生じ、これが歯を破壊
するといわれている。ミュウタンス以外の虫歯原因菌も
乳酸を産生するけれども、プラーク内のミュウタンスに
よって産生された乳酸は解放されることなく、歯の表面
に濃厚に蓄積される。従って、現在ではミュウタンスは
各種の虫歯原因菌のなかでも最も重要視されている。

ミュウタンスによって誘発されるヒトの虫歯を予防し、
または少なくとも抑制（以下抑制という）するだめの免
疫学的手法は公知であるが、これを次の二つの型に分類
することができる。

（１）虫歯防発能をもつミュウタンスの細胞の全部また
は一部あるいはその抽出物を抗原とする虫歯抑制用ワク
チン。たとえば英国特許１，３７５，８６６号は、代表
的な虫歯原因菌として周知の、ミュウタンスＮＣ’Ｍ：
　ｌ　０４４ｇ号株と同一の性質を有する菌株の全菌体
または一部あるいは抽出物を抗原とする虫歯抑制用ワク
チンを開示しているが、実施例に記載された全部のワク
チンは、全菌体を抗原としている。しかし、全菌体ワク
チンを用いてヒトの虫歯を効果的に抑制できたことはま
だ報告されていない。しかも、ミュウタンスの全菌体ワ
クチンを動物に投与したところ、心筋抗原との交叉反応
やアレルギー性疾患のような不利な副作用が認められた
ことが報告されている。

（２）　ミュウタンスの全菌体または一部あるいはこれ
らの抽出物を抗原として哺乳動物を免疫することによっ
て、動物の体内に抗体をつくシ、産生された抗体を動物
から採取して、ヒトに投与する方法。本発明はこの種の
抗体に関する。この方法は、上記の不利な副作用をヒト
に及ぼすおそれがなく、しかも抗体の投与法を広い範囲
で選ぶことができる点からみて、虫歯用ワクチンよりも
有利であると思われる。しかし、この種の抗体を含有す
る公知の非う触性組成物（英国特許１，５０５．５１３
号）には、次に例示するような問題があるので、ミュウ
タンスによって誘発されるヒトの虫歯の抑制に実用化す
ることは困雛である。

英国特許に開示された非う触性抗体は次の方法で製造さ
れる。

ミュウタンスＡＲＴ　（血清学的群ａ）、ＢＩＴ　（同
ｂ）、１０４４’ｌ　（同Ｃ）および６７１５（同ａ）
の培養物を一つの透析されたトリプトース培地で培養し
、培養液から細胞を遠心分離し、０．１Ｍ燐酸塩緩衝食
塩水で洗浄し、同様の食塩水に細胞を浮遊し、０°Ｃで
加分加熱することによって不活化し、４種の細胞の最終
濃度５Ｘ１０８個／ｇ／！の抗原液をつくり、この液を
用いて常法により雌牛を免疫し、牛乳をｍ牛から採取し
、乾燥することによって、乾燥牛乳すなわち免疫グロブ
リンを得る。こうして得られた牛乳免疫グロブリンを飲
むと、口腔内のミュウタンス忙直接に抑制作用を及ばす
と共に、消化器から血液を経て唾液中に分泌される。次
にこの乾燥牛乳を、たとえば（イ）１−５倍の水にうす
めて、うがい剤とするか、（ロ）無糖のガム、キャンデ
ー、アイスクリームのような食品に２５チ以上添加する
か、または（ハ）通常の歯みがき剤に２５％以上添加す
ると、非う食性組成物が得られる。

ミュウタンスに対する牛乳免疫グロブリンの抑副活性を
調べるために、段階的に希釈（×２）された食塩水に一
定量の乾燥牛乳をそれぞれ加え、各抗体液にホルマリン
で殺したミュウタンス４種のいずれかを加え、凝集値を
測定し、次の結果が得られた。

使用抗原　血清学的群　力　価 ＡＨＴ　ａ　６４ ＢＨＴ　ｂ　１０２４ １０４４９　０　＜２ ６７１５　（１２５６ 次に試験動物としてラットを用い、ミュウタンスの感染
防禦試験も行ない、う食抑制効果を認めた。ただし１０
４４９は、前の測定において力価を検出しなかったので
動物試験から除かれた。

以上の英国特許１５０５５１３号の開示には、たとえば
次の問題があり、実用的な非う触性組成物を得ることは
できないと考えられる。

（１）　血清学的群の分類は、ブラツタール分類によっ
ている。すなわちプラツタール等は、ミュウタンスの菌
体抽出物を調べた結果、ミュウタンスをａからｇまでの
７つの血清型に分類できることを提案した［　Ｂｒａｔ
ｔｈａｌｌ、　ｏｄｏｎｔ、　Ｒｅｖｙ、　、　２０　
：　１４１　（１９７０）＆　ｉＭｄ、、２０　：Ｚ３
（１９７０）　ｉ　Ｐｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｃｔ
ａ、　Ｐａｔｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔｉｏｎ
　１３．　ｓ２　：　３５７　（１９７４）　］。

その他の分類も知られている。たとえば佐原誠は、ミュ
ウタンス菌株の抗原の特異性を血清学的に調べ、ミュウ
タンスをヒトＩ（Ｈ■）、ヒトｎ（ＨＩＩ）およびラッ
ト（Ｒ）型に分類できることを提案し、次のように報告
した。

（イ）　大部分（９６，３％）のヒト由来のミュウタン
スはヒトＩ型で、残りはヒ）ＩＩ型であった。

（ロ）　ラット由来のミュウタンスはすべてラット型で
あった。

（ハ）　マウスおよびモルモットからミュウタンスを検
出しなかった。

に）ハムスターおよびサル由来のミュウタンスはすべて
ヒト■型であった。

上記のヒ）Ｉ、ヒ）ＩＩおよびラット型は、それぞれブ
ラツタール分類による「Ｑ、＠１およびｆ」、「ｄおよ
びｇ」および「ａおよびｂ」血清型に対応する菌株であ
る〔口衛誌、四巻、２号、　１００−１２３頁（１９７
８）’）。

この公知の抗体は、ヒ）Ｉ型、血清型Ｃのミュウタンス
ＮＣＴＣ１０４４９に対して抑制活性を有していないが
、この菌株はヒトの口腔内のり触性ミュウタンスの代表
的菌株であることは周知である。従って、たとえ公知の
抗体がヒトのミュウタンスのわずかな部分を占める６７
１５　（ヒ）ＩＩ型、血清型ｄ）に対して多少の抑制効
果をもつとしても、ヒトのミュウタンスの代表的菌株に
対して活性がない以上、ヒトの虫歯の抑制に実用化する
ことはできない。

（２）ミュウタンスの細胞浮遊液を６０°Ｃ，３０分間
加熱することによって不活化している。その結果、菌体
表層の線毛層抗原が実質的に破壊され、菌体抗原のみが
残存する。この点については後記する。

（３）佐原の報告かられかるように、ミュウタンスは顕
著な動物種特異性を有する細菌である。しかし英国特許
は４つの血清型の菌株を混合して無差別に処理している
。各型菌株の最終比率も不明である。ヒト型ミュウタン
スの抑制活性をラットで試験している。血中抗体の力価
とくらべて、牛乳中の抗体の力価は著しく低い。

他方において、ミュウタンスのようなストレプトコツカ
ス属口腔細菌が菌体の細胞壁表層の線毛によって宿主の
歯や口腔粘膜に付着することは公知である（　Ｇｉｂｂ
ｏｎｓ　ａｔ　ａｌ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、。

２９　：　１９−４４　（１９７５）　）。しかし虫歯
抑制の観点において、上記線毛層抗原と細胞壁内（菌体
内）抗原との抗原活性の差は、これまでほとんど解明さ
れなかった。

本発明は、ミュウタンスの線毛層抗原で哺乳動物を免疫
することによって動物の体内に産生される抗体を動物か
ら回収すると、従来の菌体抗原を用いる場合にくらべて
、著しく高い付着抑制活性を持つ抗体が得られること、
および血清型Ｃ１θ、ｆ、およびｇ型のミュウタンスの
線毛層抗原と血清型ｄ型のミュウタンスの線毛層抗原と
は、これから得られる抗体の付着抑制能に関して特異性
を異にしていることの知見に基づいている。

本発明の目的は、ストレプトコッカス・ミュウタンスに
よって誘発されるヒトの虫歯を予防または抑制するため
の非う触性抗体および本抗体を有効成分とする非う触性
組成物を提供することにある。

本発明により、ヒト型ストレプトコッカス・ミュウタン
スの菌体の細胞壁表層の線毛層から採取された抗原で哺
乳動物を免疫することによって、動物の体内に、対応す
る抗体を産生じ、これを回収する工程からなる、ストレ
プトコッカス・ミュウタンスによって誘発されるヒトの
虫歯を予防または抑制するための非う触性抗体の製法が
提供される。

本発明による抗体を容易に効果的にヒトに投与するため
に、本発明による抗体を有効成分とし、薬理学的に許容
し得る担体壕だは賦形剤と共存させてなる、非う触性組
成物が提供される。

本発明による抗体は工ｇＧを主とする免疫グロブリンで
あって、これをヒトの口腔に投与すると、口腔内のミュ
ウタンスに直接に作用し、また消化器から血液を経て唾
液に分泌される。本抗体は対応するり蝕誘発性ミュウタ
ンス野外株の、歯の表面や裂溝内面への付着を抑制する
作用を有するが、凝集素は産生せず、また野外法自体の
増殖やＤＰＳ産生能を抑制しない。従って、これらの野
外法は、歯面に付着（感染）する代りに、唾液中などで
凝集する。これを、たとえば通常の歯みがき剤やうがい
剤等によって口腔から除去することは容易である。ヒト
およびハムスターを用いた試験の結果、本抗体の有効量
を、たとえば数週間連続投与すると、口腔内からミュウ
タンスが消滅することが認められた。

本発明における腺毛層から採取された抗原（以下線毛層
抗原という）とは、ミュウタンスのようなストレプトコ
ツカス属口腔内細菌の細胞壁表層の、線毛状の型特異多
糖体抗原および表層蛋白質または抽出物をいう。本抗原
自体は公知であるが、たとえば上記英Ｉ３！Ｉ特許１，
５０５，５１３号のように、菌体を６（１”Ｃで加分間
加熱して不活化すると、線毛層抗原は実質的に破壊され
、菌体抗原しか残らない。

得られる抗体の付着抑制活性は抗原物質の付着活性に依
存する。実用的には、う蝕誘発能の高い菌株の線毛層抗
原を採取して、これを用いて哺乳動物を免疫することに
よって、付着抑制活性の高い抗体を得ることができる。

所望の菌株を、たとえば試験管壁付着能の高い菌株を選
別することによって得ることができる。

後記実施例記載の突然変異株ストレプトコッカス・ミュ
ウタンス変異株に−Ｄｐ株（血清型Ｃ）と四ＫＨ２株（
血清型ｄ）とは、通常の野外法（親株）と同様の性状を
有するが、著しく高い伺着能をもつ点が異なっている。

これらはそれぞれ１９８２年３月５日と１９８３年７月
ｎ日にＦＦｉＲＭ−ＢＰ３１７号およびＦＨＲＮ　−Ｐ
　７１６６号として微工研に寄託されている菌株である
。

本発明の方法によって得られる抗体を、線毛層抗原の出
所となる菌株の血清型によって、抗体Ｉおよび■に分け
ることができる。抗体Ｉは血清型ｃ、ｅ、ｆおよびｇの
菌株由来抗原から得られたもので、抗体■は血清型ｄの
菌株由来の抗原から得られたものであって、それぞれ対
応する血清型の野外法の付着能を特異的に抑制する活性
を有していることがわかった。異なった血清型の菌株か
らの抗原を用いることによって、４種類の抗体Ｉを得る
ことができる。これらを単独または混合して、血清型ｃ
、ｅ、ｆおよびｇ型野外株の虫歯誘発の抑制に用いるこ
とができる。前述の佐原誠氏の報告によると、ヒトの大
部分はＣ１θ、ｆ−ｊたはｇ型ミュウタンスの宿主であ
って、ｄ型ミュウタンスの宿主であるヒトはわずかであ
る。従って、抗体Ｉのみによって、はとんど大部分のヒ
トの宿主のミュウタンスを抑制することができる。しか
し、ヒトの口腔内のミュクタンスの血清型を調べるには
複雑な操作が必要である。しかも抗体Ｉ、■を併用して
も各抗体の効果に変りはない。従って、実用的には抗体
ｌ、■を混合して投与するのが有利である。

本発明による抗体はプラスマの形でもよいし、または精
製して抗血清の形としてもよい。これを凍結乾燥して、
低温で長期間保存することも周知である。

本抗体の製法を次に例示する。

本発明に用いられる菌株は野外法でも突然変異株でもよ
い。培養は常法によることができる。すなわち培養は好
気条件下でもよいが好気条件下の培養が適している。使
用培地は天然培地でも合成培地でもよいが、大量生産に
は液体培地が適している。培地のｐＨは５．６−９．０
、たとえば約７．０で、培養温度は２３−４０°Ｃ１た
とえば３７°Ｃが適している。

酸産生は速やかで、通常は４８時間以内に培地のｐＨは
約４．２に低下し、その彼、菌は増殖しない。本菌株の
培養にストレプトコツカス属細菌用の各種培地を使用す
ることができる。

培養終了稜、遠心処理のような常法により、培養液から
菌体を分離する。この菌体を適当な方法、たとえば０．
１−　Ｉ　Ｍ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，（
１＝　７．８　）、１Ｍ塩化ナトリウム・リン酸塩緩衝
液（０，０１−０，７５Ｍ　）その他の緩衝液、またこ
れらの緩衝液に非イオン系界面活性剤（トリ）ｙ−Ｘ１
００、米国ロームアンドハース社製）のようが適当な界
面活性剤を加えた緩衝液に浮遊させて超音波処理（１，
０２０ｋＨｚ、５−２０分間程度）をして線毛層を抽出
する。得られた抽出物をたとえば公知のカラム分画法、
等電点沈降法、冷溶媒分画沈降法、膜濃縮法、硫酸アン
モニウム塩析法およびしよ精密度勾配超遠心法などの単
独またけ適宜組合わせによって分画精製する。精製され
た材料を１／７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ約６．
２）で含有ゾロティｙ　１４０．０５−０．５　ｍ９／
ｌｔｌになるように希釈調製し、アジュバントとして水
酸化アルミニウムゲルを最終アルミニウム用量０．２ｍ
ｇ／ｌｄになるように加えて抗原を吸着し、所望により
チメロザール０．０１％　（ｗ／ｖ　）のような防腐剤
を加えると免疫用抗原液が得られる。

超音波処理の代りに、純毛層抽出液に６０％飽和になる
ように硫安を加えて、かく拌溶解させ、低温たとえば４
°Ｃで静置すると純毛層が沈降する。

上清を除いた液に０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ８，ｏ；
１Ｍ塩化ナトリウムを含む）に濃厚に浮遊させ、低温で
同様の緩衝液で透析して、透析性不純物および硫安を除
き、透析内液を遠心処理して得られた抽出液を、たとえ
ば上記のしよ精密度勾配超遠心法で精製することもでき
る。

抗原液の最終処理において、水酸化アルミニウムの代シ
に等量の７０インド完全アジユバントを用いることもで
きる。

免疫動物として、たとえばマウス、ラット、モルモット
、ウサギ、ヤギ、牛、馬等を用いることができる。用量
は動物によって異なるが、通常、小動物では抗原１−５
００μｆ（蛋白質として）、大動物では０．１−１■を
１回量として、２−５週問おきに３−５回常法によって
免疫する。たとえばウサギの場合、抗原液（蛋白質とし
て１００−２００μｆ　／　ｍｅ　）を等量のフロイン
ト完全アジュバントと混合したものを２−５週問おきに
３−５回投与し、最終免疫後１０−１４日口重動物から
常法により採血し、免疫グロブリンを含有するプラズマ
を得る。

これをこのままヒトに投与することもできるし、精製し
て抗血清とすることもできる。

本発明による非う触性組成物の担体は、経口投与に適す
る固体、早固体まだは液体であってもよく、たとえば粉
末、シロップ、カプセル、粒状物、乳液、懸濁液、ドロ
ップ、の類であってもよい。

適当な賦形剤の例は、ラクトース、ポテトでん粉、可溶
性でん粉、ステアリン酸マグネシウム等であり、適当な
液状担体の例は、食塩水、グリセリン、アーモンド油、
乳酸菌飲料、ジュース等である。

本発明による組成物は、結合剤、安定剤、乳化剤、懸濁
剤、潤滑剤、防腐剤のような常用の添加物を含んでもよ
い。組成物は、歯みがき剤、うがい剤、キャンデー、ア
イスクリーム、等の形状でもよい。

本発明による抗体の一定量を供給するために、非う触性
組成物を錠剤、アンプル、バッカル、トローチのような
投与単位として成形することができる。各投与単位に含
有される抗体ＩｔたはＲの量は、たとえば、各抗体日量
１〜１０ゲル内沈降価を投与できるように選ぶことがで
きる。ヒトに投与した試験の結果、たとえば各抗体日量
２−４ゲル内沈降価を数週間連続投与することによって
、口腔内からミュウタンスの消滅が認められた。ハムス
ターに対して本抗体を長期間（６−１２ケ月間）大量連
続投与しても、格別の異常のないことが病理学的試験に
よって認められた。

本明細書において抗体の力価は、ゲル内沈降反応による
２ゲル内沈降価によって示した［：　Ｇｏｌｄｍａｎ。

Ｊ、Ｃ，ａｔ　ａｌ、工５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｇｌｉａｌ　ｆ
ｉｌａｍｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ
、　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ、　、　７８　：　４２６　
（１９７８）　：］。

下記実施例および試験例において、培養は特記しない限
り３７°Ｃで嫌気培養した。市販品培地は指定ｐＨで用
いた。

実施例１ ストレプトコッカス・ミュウタンス変異株に−Ｄｐ株（
ＦＥＲＭ−ＢＰ　３１７　）の作出。

ヒトの歯垢から分離した新鮮なミュウタンス野外株（血
清型Ｃ）をドツトヒユーイツトブロス（米国、ＢＢＬ社
製）　２０　ｔｕｌを用いて３７°Ｃで２４時間培養し
、培養液を遠心処理（８００Ｑ　ｒ、ｐｏｍｏ、加分間
）して菌体を分離し、これをｌ／’ｉ’５ＭＩＪン酸塩
緩衝食塩水（ｐＨ６，８、各１００ｍＡ’）で３回遠心
処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、、２０分間）して洗浄する
。ナイトロジエン・マスタード０．１　％を含有する１
／フ５Ｍリン酸塩緩衝食塩水（１）Ｈ６，８）に生菌数
約１００万／鹸になるように菌体を浮遊させ、生菌数０
９０チ以上が死滅するまで３７°Ｃ１ｌ′Ｉ：保つ。残
シの生菌をドツトヒユーイツトプロスで上記と同様に培
養し、培養液の１白金耳をＴＹＣ寒天平板培地（ｆ３Ｔ
ＯＰＰＥｉＬＡＡＲｅｔ　ａｍ　：Ａｒｃｈｓ、０ｒａ
ｌ　ｐｉｏｌ、、　１２．１１９９−１２０１　（１９
６７）　］を用いて４８時間培養した後、培養物を調時
間室温に静置して、不溶性デキストラン多糖体の産生能
の高いコロニーを分離する。所望により、上記の方法を
くり返して、デキストラン様多糖体産生能の筒い菌株を
純化培養する。

この方法で得られた菌株の付着能の極めて高いことが、
ハムスターへの口腔内投与によって認められた。本菌株
をストレプトコッカス変異株に−Ｄｐ株と命名した。

実施例２ 実施例１記載の方法に準じて、ヒトの口腔から分離した
血清型ｄの野外味から、付着能の高いストレプトコッカ
ス・ミュウタンスＫＨ２株（ＦＩＭ−Ｐ７１６６　）を
人工的に誘導した。

実施例３ 抗体の製造 ストレプトコッカス・ミュウタンス変異株Ｋ　−Ｄｐ株
（ＦＩＲＭ−ＢＰ３１７　）を下記組成の種培地５００
１および本培地１５０００　ｄを用いて、調時間培養し
た。

ポリペプトン１．７％、ポリペプトン５Ｏ０３％１酵母
エキス０．５　％　、リン酸二カリウム０．２５％。

塩化ナトリウム０．５チ、ブドー糖０．２５係（ｐＨ７
やＯ−７，８） 培養終了後、培養液［３３％飽になるように硫酸アンモ
ニウムを加え、かく拌溶解させ、４°ＣＫ　２４時間静
置した。この液の上清を除去し、沈降物を遠心処理（８
０００ｒ、　ｐ、　Ｉｌｌ、　、７３０分間）によって
回収し、これをＩＭりん酸塩緩衝食塩水（７５０ｍ　；
　０．１Ｍ　ｉ　ｐＨ＝　ｓ、ｏ　）に浮遊し、４°Ｃ
で毎分１−５回転で７２時間かく拌した。緩衝液を遠心
処理（８０００ｒ、　ｐ、　ｍ、　／　３０分間）して
菌体を除去し、上清に６ｔ）％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、かく拌溶解させた後、４°Ｃに４８
時間静置することによって、線毛層を沈降させた。上清
を除き、沈降部分を遠心分離（８０００ｒ、　ｐ、　ｍ
、／　３０分間）して回収した材料を同様のりん酸塩緩
衝食塩水１００　ｄに浮遊させた。浮遊液を透析用セロ
ファンチューブに入れ、４°Ｃで４８時間同様のりん酸
塩緩衝食塩水５０００１以上を用いて、硫酸アンモニウ
ムが除去されるまで透析した。透析内液を遠心処理（８
０００ｒ、　ｐ、　ｍ。

７３０分間）して透析性不純物を除去し、上清を回収し
た。

上清（３００ｄ　）を蛋白Ｎ含量１００ｔｔｆ／ｄにな
るように、同様のシん酸塩緩衝食塩水で希釈し、希釈液
２００ｉＪをしよ糖密度勾配超遠心分離装置〔日立６５
Ｆ超遠心機、ゾーナルローターＲＰ　２３５　Ｔ使用；
しよ糖濃度５−３ｏチｉ　３５０００　ｒ、ｐ、ｍ、／
１Ｂ時間〕で′処理したところ、しよ糖密度１０−１２
％付近の分画く比重約１．３１−１．３５　”）に所望
の抗原が見出された。その蛋白Ｎ量は約３３−３７μｔ
／継であった。こうして得られた抽出液を、セロファン
チューブに入れ、ポリビニールピロリドンを用いて１１
１０量になるまで４°Ｃで濃縮した。濃縮液を０．７５
　Ｍりん酸塩緩衝食塩水（ＰＨ６，２〜６．５）で、蛋
白Ｎ含量間−１００μｆ／ｒｄになるように希釈し、希
釈液に等量のフロイント完全アジュバントを加え、免疫
用抗原液とした。こうして得られた液を体重的３ｋｇの
ウサギの背部皮下に常法により１．０−投与して免疫し
、４週問おきに計３回行ない、最終免疫の４週間後に常
法により全採血し、硫酸アンモニウムを３３％飽和にな
るように加え、かく拌溶解させ、４°Ｃに４８時間静置
し、沈降した部分を遠心処理（８０００ｒ、　Ｉ）、　
Ｉｎ、　／２０分間）によって回収し、セロファンチュ
ーブに入れ、４°Ｃで精製水中で硫酸アンモニウムがな
くなるまで透析し、透析内液を常法により濃縮、凍結乾
燥し、抗体Ｉ（約８５−）を製造した。

実施例４ 実施例２の方法で得られたミュウタンス突然変（ＦＥＲ
Ｎ−Ｐ　７１６６　；血清型ｄ）を実施例３記載の方法
に準じて、培養と処理とを行ない抗体■（約８５ｍ１　
）を得た。

実施例５以下記載の組成物に含有される抗体として、実
施例３（抗体ｌ）および４（抗体２）記載の抗体の１種
以上を用いることができるが、便宜上１種の抗体の債を
示す。

実施例５ ブドー糖１１、抗体０．０５耐、可溶性でん粉０．０５
２を用いて常法によりバッカルを作った。

実施例６ ＣＭＣナトリウム０．２１．２０チ果糖液２０ゴ、エチ
ルパラフィン０．０４ｆ、抗体０．１　ｍＪを用いて、
常法によりシロップを作った〇 実施例７ 歯みがき剤を次の方法で作った。

リン酸水素カルシウム微粉末６０％、グリセリン３０％
、ＣＭＣナトリウム１０％およびパラベン（防腐剤）　
０．２５％を混合し、抗体を加え、抗体の力価が前記測
定法で２ゲル内沈降価１５Ｏｆになるように調整した。

実施例８ 非う触性乳酸菌飲料を次の方法で作った。

固形分１０チのスキムミルク液２０００　耐を１１０’
（：’で１５分間滅菌後、ラクトバチルス・カセイを常
法により移植し、３５−３７°Ｃであ時間培養し、培養
物をかくはんしながら、１０チ果糖液を加え、生菌数約
１０８個／−になるように調製した。混合液に各抗体（
Ｉ、■または併用）の力価がゲル内沈降反応による４ゲ
ル内沈降価１５０ｄになるように加えた。

ることによシ、非う触性乳酸菌飲料を得た。

試験例 下記試験において、抗体１．ＩＦを併用した組成物を用
いて、ストレプトコッカス・ミュウタンス野外株の付着
抑制能を試験した。試験動物（ゴールデン、ハムスター
）の数は特記しない限シ、各群雌または雄５匹であった
。

試験例１ 生後２１１００ハムスターを用いて試験した。

第１群と第２群は試験群で、第３群と第４群とは対照群
である。実施例１および２記載のストレプトコッカス・
ミュウタンス変異株Ｋ　−Ｄｐ　（ＦＥＲＭ−ＢＰ３１
７　）およびストレプトコッカス・ミュウタンスＫＨ２
（ＦＢＲＭ−Ｐ　（，１７７）株をそれぞれトリプトケ
ースソイブロス（米国ＢＢＬ社製、指定ｐＨ）を用いて
３７°Ｃで冴時間培養した。得られた各培養液（生菌数
約１０８個／１）日量０，１ｄを用いて、第１群および
第３群の動物にはに−Ｄｐ株（血清型Ｃ）、第２群およ
び第４群の動物にはＫ１２株（血清型ｄ）を５日間連続
して口腔内に投与し、定着させた。

その後、第１群および第２群の動物の臼歯面を、実施例
７記載の歯みがき剤（抗体Ｉ、■含有）、各個体当り０
．１ｆを用いて、小ブラシで強くみがき、これを１日１
回、１４日間続けた。なお試験期間の飼料は、う蝕誘発
飼料ダイエツ）　２０００　（船橋農場製）を用い、脱
イオン水と共に自由に摂取させた。ω日間の試験期間中
、各個体の臼歯面から適宜に試料を採取し、ＴＹＣ寒天
平板培地［５ｔｏｐｐｅ−１ａａｒ　ｅｔ　ａｌ　］　
（１５＋＋＋Ａ！　；　Ｉ）Ｈ７，２）およびミテス・
サリバリウス寒天平板培地（１５ｄ　；　ＰＨ７，４；
　バシトラシン１００μｔ／ｍｌ含有）を用いて３７°
Ｃで７２時間培養することにより、歯面への菌の定着を
調べた。

第１群および第２群（試験群）では、本発明による抗体
投与後、菌株の濃度が漸減し、一部の動物では約２−４
週間以内に、残シの動物では約４−７週間以内に口腔内
から菌が消滅した。対照群（第３．４群）では口腔内の
菌濃度の減少は認められなかった。各試験動物を、試験
期間終了後ペンタバルビタールで麻酔孔させ、アゴを摘
出し、オートクレーブ（１２０−１２５°Ｃ１１−２分
間）で処理した後、軟組織を除去し、よく水洗して乾燥
し、歯の標本とした。各試験群の総臼歯のうち、う蝕が
銹発された臼歯数から罹患率およびう触車をめ、第１表
に示す。

第　１　表 群　投与抗体　菌血清型 Ｉ　Ｉ、ＩＩ　ｃ ２　同　ｄ ３　無処置　Ｃ ４同　ｄ Ａ　：体重増加（平均チ）（試験開始前＝　１００％）
Ｂ　：罹患率％（全ハムスター数＝ｉｏｏ％）Ｃ：う触
車チ（全臼歯数＝１００係） 群　１　２　３　４ Ａ　７７．２　７４．２　７７．３　７４．０Ｂ　２０
　０　９０　７０ Ｃ７，５０６５３４，２ 血清型Ｃ型以外のヒトＩ型ミュウタンスすなわち周知の
標準菌株Ｐ−４（ｅ型）、ＯＭＺ　１７５　（ｆ型）お
よびＫＩＲ（ｇ型）を別々に用いて、上記と同様の試験
を行なったところ、本抗体■は、これらの菌株の付着能
をＣ型菌株の場合と同様に抑制することが認められた。

試験例２ 実施例７記載の抗体Ｉ、■含有歯みがき剤の投与による
成人口腔フローラ中のストレプトコッカス・ミュウタン
ス菌株濃度の変動を次の方法で調べた。

成人１０名（男５、女５名）から各３回、口腔から歯垢
を採取し、試験例１記載の方法で培養した他、厚生省弗
化物歯面塗布実施要領の規定に準じて歯垢および歯石沈
着度を調べた結果、１０名の口腔内にストレプトコッカ
ス・ミュウタンス（血清型Ｃ）の存在を認めた。１０名
全員が毎日朝食後と夕食後に上記歯みがき剤を用いて任
意の仕方で歯みがきを実施した。週１回以上、各人の歯
垢を採取して、前記方法と同様にして培養して、ミュウ
タンス菌数の変動を調べた結果、口腔内のミュウタンス
は、３名については約２−３週後、残りの７名について
は約４−７週後、はとんどまたは全く検出されなかった
。エリスロシンで染め出したＯＨ１価は、全員ともに投
与開始前よりも著しく低下した１゜ 試験例２ 実施例５記載の抗体Ｉ、■を含有するバッカルの投与に
よる成人口腔内のミュウタンス濃度の変動を試験例２記
載の方法に準じて調べた。被検者は成人女子題名であっ
た。そのうち１９名はミュウタンス血清型Ｃ型、残りの
１名は血清型ｄ型の宿主であった。各人の就寝時にバッ
カル１個を毎日投与し、できる限り長時間口腔内に保有
させた。

約２週間後５名の口腔からミュウタンスを検出しなかっ
た。残りの被験者の口腔内ミュウタンスの濃度は漸減し
、投与開始後約４週間で口腔かられずかのミュウタンス
が検出された。試験開始前のＯＨ１価はバッカルの投与
によｔ著しく低下した。

バッカルを用いた場合、口腔内における抗体の滞留時間
は歯みがき剤の場合よりも長いので、歯みがき剤の投与
と同等以上の抑制効果が得られるものと認められた。

（自発的）手　続　補　正　書（方式）昭和５８年　特
許　願第１３５４５１号２、発−の名称　非う触性抗体
および組成物３、　補正をする者 事件よ。関係　特許出願人 住　所　東京都港区白金五丁目９番１号氏　名銘称）北
　里　研　究　所　（社団法人）代表者　吉　岡　勇　
雄 ４・　代　理　人　電話　３５３−５５２□（自発的）
手続補正書 昭和５８年　特許　願第１３５４５１号２　発明の名称
　非う触性抗体および組成物３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ８、補正の内容　明細書を次の通シ傾圧する。

（リ　第１頁５行目以下の特許請求の範囲の記載を別紙
の通り補正する。

（２）第６頁１９行、「非う食性組成物」を「非う触性
組成物」に補正する。

（３）第７頁１２行、「う食抑制効果」を「う蝕抑制効
果」に補正する。

（４）　第８頁６行、「抗原」の前に「菌体」を加入す
る。

（５）　次の個所に記載された「線毛層」を「線毛成分
」に補正する。

第９頁１５行、第１０頁９行、同１２行、同１７行、同
１８行、　′−第１２頁 ’　”１９行、第１３頁３行、 同１６行、第１６頁３行　−− および第２２頁３行。

（６）　第１５頁１１行、「約４．２」を「約４．２位
」に補正する。

（７）　第１６頁８行、「１／７５　Ｍ　Ｊを［０，７
５ＭＪに補正する。

（８）同９行、「０．０５−０．５１Ｒ９／ｍｌＪを「
ｌ〇−５０μＩ／ＩＩＬＩ」に補正する。

（９）同１１行、ｒ　Ｏ，２＋ｎｇ／ゴ」を「２００μ
ｍ／―」に補正する。

（１０）第１７頁１１行、「ｏ４−　ｓ■」を「１ｏｏ
　−１０００μＩ」に補正する。

（１１）　第１９頁２０行、［１／７５ＭＪをｊ−０，
７５ＭＪに補正する。

（１２）第２０頁３行、「１７７５ＭＪを「０．７５Ｍ
Ｊに補正する。

（１４）同１３行、「３３％飽」を「３３チ飽和」に補
正する。

（１５）　同１７行、「ＩＭりん酸塩緩衝食塩水」を［
１Ｍ塩化す）　ＩＪウム加Ｏ０ＩＭりん酸塩緩衝液」に
補正する。

（１６）　同１７−１８行、「０．１Ｍ；」を削除する
。

（１７）第２２頁５行、７行および１３行、「りん酸塩
緩衝食塩水」を「ＩＭ塩化ナトリウム加０．１Ｍりん酸
塩緩衝液」に補正する。

（１８）第２３頁１８行、「ミュウタンス突然変」を［
突然変異株ストレプトコッカス・ミュウタンスＫＨ２Ｊ
に補正する。

（１９）第２５頁８行、「加えた。」セ「加え」に補正
する。

（２０）第３０頁１行、「試験例２」を「試験例３」に
補正する。

（２１）第１１頁７−８行、「表層の線毛層から採取さ
れた抗原」を「表層から採取された線毛成分抗原」に補
正する□ （２２）第１２頁１３−１７行、［本発明に・・・・・
・・・・・・、・・抽出物をいう。］を次の通シに補正
する。

「本発明による線毛成分抗原とは、ミュウタンス細胞壁
の表層から突出する線毛状の型特異多糖体抗原および表
層蛋白質から得られた抗原成分のことである。

代表的なヒト型ミュウタンスＮＣＴＧ　１０４４９株（
血清型Ｃ）から単離した本抗原について、フェノール硫
酸法による炭水化物の定量、Ｈａｒｔｒａｅ法による蛋
白質の定量、およびフォスフォリラーゼｂ１子牛血清ア
ルブミン、鶏卵アルブミンおよびキモトリプシノーゲン
Ａを参考としてセファデックスＧ−１００（スエーデン
国、ファルマシア・ファイン・ケミカルス社製）による
分子量の測定を行なった結果、本抗原は蛋白質約２０チ
と炭水化物約８０チとを含む酸性の糖蛋白質の１種であ
って、分子量は約７５０００と推定された。

次にポリアクリルアミドゲル・ディスク電気泳動法では
陰極側に特徴的な太いバンドが認められた。ｐＨ３，５
−１０，０のキャリヤー・アムフオライト（スエーデン
国、エルケービー・グロダクター社製）による静電点分
画試験では、ｐＩ値は３゜５以下であった。

しよ稠密度勾配超遠心法では、ミュウタンスの線毛成分
抗原はしよ糖密度約１０−１３％付近の分画から回収さ
れる。ゲル濾過では、２つのピークが現われるが、血清
との反応が陽性である最初のピークから回収される。血
清型の差による分画パターンの差は認められなかった。

しかし、線毛成分抗原の血清型的性状は、各菌株の血清
型によシ相違し、ａ、ｂ型、Ｃｓｅｓｆｚｇ型およびｄ
型に分けられる。

口腔内細菌は、菌種ごとに歯の表面や口腔粘膜等への付
着性を異にしていることは公知であるが、ミュウタンス
の歯面への付着においても、菌体表層の構造が重要であ
る。」 （２３）第１６頁１５行、「線毛層」を「抗原」に補正
する。

（２４）同１７行、「線毛層」をＦ線毛成分抗原」に補
正する。

（２５）第１６頁７行、「精製する。」の後に「所望に
より、抗原液に０．０２−０．２　％ホルマリンを加え
て・常法により抗原を不活化してもよい。」を特徴する 特許請求の範囲 （１）　ヒト型ストレプトコッカス・ミュウタンス菌株
の細胞壁表層の線毛ａ＋抗原をすし・これで禰乳動物を
免疫することにより、＋４乳動物の体内に対応する抗体
を産生じ、これを回収する工程からなる、ストレプトコ
ッカス・ミュウタンスによシ誘発されるヒトの虫歯を抑
制するための非う触性抗体の製造方法。

（２）　ヒト型菌株の血清型がＣ，＠Ｓｆまたはｇ型で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。

（３）　ヒト型菌株の血清型がｄ型である特許請求の範
囲第１項記載の方法。

（４）　菌株が突然変異株である特許請求の範囲第１項
記載の方法。

（５）突然変異株がストレプトコッカス・ミュウタンス
変異株に−Ｄｐ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１７＞である特
許請求の範囲第４項記載の方法。

（６）突然変異株がストレプトコッカス・ミュウタンス
ＫＨ２株（ＦＥＢＭ　Ｐ−７１６６）である特許請求の
範囲第４項記載の方法。

（７）　ヒト型ストレプトコッカス・ミュクタンス菌株
の細胞壁表層の線毛Ｓ＋抗原をすし、これで哺乳動物を
免疫することにより咄乳動物の体内に対応する抗体を産
生じ、これを回収し、薬理学的に許容し得る担体オたは
賦形剤と共存させてなる、ストレプトコッカス・ミュウ
タンスにより朽発されるヒトの虫歯を抑制するための非
う触性組成物。

（８）　特許請求の範囲第７項記載の可食性組成物。

（９）　特許請求の範囲第８項記載の乳酸菌飲料。

（］０）特許請求の範囲第８項記載のチューインガム、
キャｙデー、アイスクリームまたはシロップ。

（１１）　特許請求の範囲第７項記載の歯みがき剤また
はうがい剤。

（１２）バッカルまたはトローチとして形成された特許
＃ｉ！１水の範囲第７項記載の組成物。

（自発的）手続補正書 昭和５９年１０月１７日 昭和５８年　特許　願第１３５４５１、発明の名称　非
う触性抗体および組成物３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都港区白金五丁目９番１号氏　名銘弥）北
里研究所　（社団法人）代表者水之江公　英 ４、　代　理　人　− 〒１６０　電話　３５３−５５２１ 住　所　東京都新宿区信濃町１１番地 （２）　別紙の通り受託証（写）を提出する。

補正の内容 （１）特許請求の範囲の記載を別紙の通り補正する。

（２）第２１頁２〜３行、「ＦＥＲＭ−Ｐ　７１６６　
Ｊをｒ　ＦＥＲＭ　ＢＰ−３６６Ｊに補正する。

（３）第２３頁１９行、ｌ’−Ｆ’ＥＲ，Ｍ−Ｐ　７１
６６　ＪをｒＦＥＲ，ＭＢＰ−３６６ＪＫ補正する、 （４）第２５頁１０行、「試験例」の前に次の通り加入
する。

［実施例９ 下記の成分のチューインガムを製造した。

成分　重１ ガムベース　２゜ フルクトース　５５ レシチン　０．２ コーンシロップ　２５ ガムペースを溶解（９５℃）し、これにコーンシロップ
、レシチンを加え、５分間８０℃で混合して、フルクト
ースとクエン酸を加え充分に練り、６０℃に冷却した後
抗体を混合した。これから公知の技術を用いてチューイ
ンガムを形成した。」 （５）第２６負２行、ｒｐＥａＭ−ｐ　６］７７　Ｊを
「ＦＥ几ＭＢＰ−３６６Ｊに補正する。

（５）　同１ｏ行、「抗体」の前に「等力価の」を加入
する、 （７）第２９頁２行、「抗体」の前に１等力価の」を加
入する。

（３）第３０頁２行、「抗体」の前に「等力価の」を加
入する。

（９）　同１７行、「認められた。」の後に次の通り試
験例４を加入する。

「試験例４ 実施例９の方法で得られた抗体■、■を含有するチュー
インガムの投与による成人女子口腔内のミュウタンス濃
度の変動を試験例２記載の方法に遵じて調べた。

ミュウタンス血清型Ｃの宿主成人女子１ｏ名の各人につ
き毎日夕食後チューインガム５Ｉを投与し、噛みながら
、できる限り長時間（２０分間以上う口腔内に保有させ
た。４名の口腔内のミュウタンスは約２週間抜検出され
なくなり、残りの６名ではミュウタンスの濃度は漸減し
、試験例３における。１ツカルの投与とほぼ同様の結果
であった。」 （］０）第１３頁１４行、「ＦＦＲＭ−１）　７　］　
６６　ｊを「ＦＥＲＭＢＰ−３６６ｊに補正する。

特許請求の範囲 （１）　ヒト型ストレフトコツカス・ミュウタンス菌株
の細胞壁表層の線毛成分抗原を単離し、これで痛乳動物
を免疫することにより、晴゛乳動物の体内に対応する抗
体を産生じ、これを回収する工程からなる１、ストレプ
トコッカス・ミュウタンスにより誘発されるヒトの虫歯
を抑制するための非う触性抗体の装造方法。

（２）　ヒト型菌株の血清型がｃ、ｅ、ｆｌたはｇ型で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。

（３）　ヒト型菌株の血清型がｄ型である特許請求の範
囲第１項記載の方法。

（４）　菌株が突然変異株である特許請求の範囲第１項
記載の方法。

（５）突然変異株がストレプトコッカス・ミュウタンス
変異株Ｋ　−Ｄ　ｐ株（ＰＥＲＭ　ＢＰ−３１７）であ
る特許請求の範囲第４項記載の方法。

（６）突然変異株がストレプトコッカス・ミュウタンス
ＫＨ２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３６６）である特許請求の
範囲第４項記載の方法。

（７１ヒト型ストレプトコッカス・εユウタンス菌株の
細胞壁表層の線毛成分抗原を単離し、これで傭乳動物を
免疫することにより情゛乳動物の体内に対応する抗体を
産生じ、これを回収し、薬理学的に許容し得る担体また
は賦形剤と共存させてなる、ストレプトコッカス・ミュ
ウタンスにより誘発されるヒトの虫歯を抑制するための
非う触性組成物。

（８）＠許請求の範囲第７項記載の可食性組成物。

（９）特許請求の範囲第８項記載の乳酸菌飲料。

（１０）特許請求の範囲第８項記載のチューインガム、
キャンデー、アイスクリームまたはシロップ。

（１１）特許請求の範囲第７項記載の歯与がき剤せたは
うがい剤。

（１２）　バッカルまたはトローチとして形成された特
許請求の範囲第７項記載の組成物。

（自発的）手続補正書 昭和５９年１０月２４日 昭和５８年　特許　願第１３５４５１、発明の名称　非
う触性抗体および組成物３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都港区白金五丁目９番１号氏　名（名称）
北里研究所　（社団法人）代表者水之江公　英 ４・　代　理　人　電話　３５３−５５□１５、　補正
命令の日付 第１１−１８−３頁の通り補正しさしかえる。

本発明の目的は、ストレプトコッカス・ミュウタンスに
よって誘発されるヒトの虫歯を予防捷たは抑制するため
の非う触性抗体および本抗体を有効成分とする非う触性
組成物を提供することにある。

本発明により、ヒト型ストレプトコッカス・ミュウタン
ス菌株の細胞壁表層の線毛成分抗原を単離し、これで凶
′乳動物を免疫することによって、動物の体内に対応す
る抗体を産生じ、これを回収する工程からなる、ストレ
プトコッカス・ミュウタンスにより誘発されるヒトの虫
歯を抑制するための非う触性抗体の製造方法が提供され
る。

本発明による抗体を容易に効果的にヒトに投与するため
に、本発明による抗体を有効成分とし、薬理学的に許容
し得る担体捷たは賦形剤と共存させてなる、非う触性組
成物が提供される。

本発明による抗体はＩｇＧを主とする免疫グロブ、−゛
・本 抗体はミュウタンス野外株の、歯の表面や裂溝内面への
付着を抑制する作用を有するが、凝集素は産生ぜず、ま
た野外様自体の増殖やＤＰＳ産生能を抑制しない。従っ
て、これらの野外株は、歯面に伺着（感染）する代わり
に、唾液中などで凝集する。抑制された野外株は、もは
やプラーク内に居住しないので、比較的短期間に死滅す
る。これを、たとえば通常の歯みがき剤やうがい剤等に
よって口腔から除去することは容易である。ヒトおよび
ハムスターを用いた試験の結果、本抗体の有効量を、た
とえば数週間連続投力すると、口腔内からミュウタンス
が消滅することが認められた。

本発明による線毛成分抗原とは、ミュウタンス細胞壁の
表層から突出する線毛状構造から単離された抗原成分の
ことである。

代表的なヒト型ミュウタンスＮＣＴＧ　１０４４９　株
（血清型Ｃ）から単離した本抗原について、Ｄ−グルコ
ースを基進としたフェノール硫酸性ニヨル炭水化物の定
量、牛血清アルブミンを基漁としたＨａｒｔｒｅｅ法に
よる蛋白質の定量、およびフォスフォリラーゼｂ、子牛
血清アルブミン、鶏卵アルブミンおよび中モトリプシノ
ーゲンＡを＃考としてセファテックス０−１００　（ス
エーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミカルス社芽
、’！　）による分子量の測定を行なった結果、本抗原
は蛋白質的１５−２５％（例、約２０係）と炭水化物的
７５−８５％’（例、約５ｏｂ）とを含む酸性の糖蛋白
質の１種であって、分子量は約６−９Ｘ］０’ｆ例、約
７５０００　）と推定された。

次にポリアクリルアミＰゲル・ディスク電気泳動法では
陰極側に％徴的な太いパンＰが認められた。ＰＨ３，５
−１０，０のキャリヤー・アムフォライト（スエーデン
国、エルヶービー・プロダクター社製）による尋電点分
画試鹸では、ｐＩ値は３．５以下であった。

しよ糖密度勾配超遠心法では、ミュウタンスの線毛成分
抗原は、しょ糖密度約１ｏ−１３％およびしよ糖比重約
１．３−１．４付近の分画がら回収される。

粗抗原液のゲル濾過では、２つのピークが現われるが、
ヒトまたはウザギ血清との反応が陽性である最初のピー
クから回収される。血清型の差による分画／Ｒターンの
差は認められなかった。

ミュウタンスの基迎株として認められたイングプリット
（血清型ｃ　）　、ＯＭＺ１７６　（同ｄ）、Ｐ４（同
ｅ　）　、ＯＭＺ　１７５　（同ｆ）およびＫＩＲ（同
ｇ）を用いて同様の試験を行なったが、実質的に同じ結
果が得られた。

本発明により得られる抗体の付着抑制活性は抗原物質の
付着活性に依存する。実用的には、う蝕誘発能の高い菌
株の線毛成分抗原を採取して、これを用いて頭孔動物を
免疫することによって、付着抑制活性の高い抗体を得る
ことができる。所望の菌株を、たとえば試験管壁付着能
の高い菌株を選別することによって得ることができる。

後記実施例記載の突然変異株すなわちストレプトコッカ
ス・ミュウタンス変異株に−Ｄｐ株（血清型Ｃ）と同Ｋ
Ｈ２株（血清型ｄ）とは、通常の野外株（親株）と同様
の性状を有するが、著しく高い付着能をもつ点が異なっ
ている。これらはそれぞれ１９８２年３月５日と１９８
３年７月２３日にＦＥＲＭ−ＢＰ　３１７およびＦＥＲ
Ｍ−ＢＰ　３６６として微工研に寄託されている菌株で
ある。

る 本発明の方法によって得られｔ抗体を、線毛成分抗原の
出所となる菌株の血清型によって、抗体■および■に分
けることができる。抗体■は血清型ｅＳｅ、ｆおよびｇ
の菌株由来抗原（以下、抗原Ｉという）から得られたも
ので、抗体■は血清型ｄの菌株由来の抗原（以下、抗原
■という）から得られたものであって、それぞれ対応す
る血清型の野外株の付着能を特異的に抑制する活性を有
していることがわかった。異なった血清型の菌株からの
抗原Ｉを用いることによって、４種類の抗体■を得るこ
とができる。これらを単独または混合して本発明の目的
に用いることができる。前述の佐原城代の報告によると
、ヒトの大部分はＣ１ｅ、ｆまたはｇ型ミュウタンスの
宿主であるが、抗体【はｄ型ミュウタンスも抑制する。

従って、抗体■のみによって全部のヒト型ミュウタンス
を抑制することができる。しかし、ヒトの口腔内ミュウ
タンスの血清型を調べるには複雑な操作が必要である。

しかも抗体■、■を併用しても各抗体の保存性や効果に
変わりはない。従って、実用的には抗体■、■を混合し
て投与するのが有利である。

本発明による抗体はプラズマの形でもよいし、または精
製して抗血清の形としてもよい。これを凍結乾燥して、
低温で長期間保存することも周知である。

本抗体の製法を次に例示する。

本発明に用いられる菌株は野外株でも突然変異株でもよ
い。培養は常法によることができる。すなわち培養は好
気条件下でもよいが嫌気条件下の培養が適している。使
用培地は天然培地でも合成培地でもよいが、大量生産に
は液体培地が適している。培地のｐＨは５．６−９．０
　、たとえば約７．０で、培養温度は２３−３９℃、た
とえば３７℃が適している。酸産生は速やかで、通常は
２４−７２時間以内に培地のｐＨは約４．２位に低下し
、その後、菌は増殖しない。本菌株の培養にストレプト
コツカス属細菌用の各鍾培地を使用することができる。

培養終了稜、遠心処理のような常法により、培養液から
菌体を分離する。この菌体を適当な高張液、たとえば０
．１−１　Ｍ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０
−８，０）、１Ｍ塩化ナトリウム・リン酸塩緩衝液（０
，０１−０，７５Ｍ　）その他の緩衝液、またこれらの
緩衝液に非イオン系界面活性剤（たとえばトリトン−Ｘ
　１００　；　ｏ、ｏｏｔ　−ｏ、Ｃ１チ；米国ローム
・アンド・ハース社製）のような適当な界面活性剤を加
えた緩衝液に浮遊させて超音波処理（１Ｏ−２０ｋＨｚ
　、　５−２０分間程度）をして線毛成分を抽出する。

得られた抽出物をたとえば公知のカラム分画法、等電点
沈降法、冷溶媒分画沈降法、膜濃縮法、硫酸アンモニウ
ム塩析法およびしよ糖密度勾配超遠心法などの単独せた
は適宜組合わせによって分画精製する。精製された材料
を０．５−　Ｉ　Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ約６−８
）で含有プロティンＮ　１０−５０７１９　／　ｒｎｌ
になるように希釈調製し、アジュバントとして水酸化ア
ルミニウムデルを最終アルミニウム用Ｊｊｌ　１００−
５００μＩ／ｍｌになるように加えて抗原を吸着し、所
望によりチメロサールｏ、ｏｓ　−０，１（ｗ／ｖ　）
のような防腐剤を加えると免疫用抗原液が得られる。

超音波処理の代わりに、抗原抽出液に２０−７０　％（
例６０チ）飽和になるように硫安を加えて、攪拌溶解さ
せ、低温たとえば４℃で静置すると線毛層が沈降する。

上清を除いた液を０．１−　Ｉ　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８，０；　０．１−　Ｉ　Ｍ塩化ナトリウムを含む）
に濃厚に浮遊させ、低温で同様の緩衝液で透析して、透
析性不純物および硫安を除き、透析内液を遠心処理して
得られた抽出液を、たとえば上記のしよ糖密度勾配超遠
心法で精製することもできる。

抗原液の最終処理において、水酸化アルミニウムの代わ
りに静置の７０インド完全アジユバントを用いることも
できる。所望により、抗原液を、たとえばホルマリン（
０，２−０，０１％　）のような適当な不活化剤で処理
し、次に同様の緩衝液を用いて透析することにより、抗
原を不活化することもできる。

免疫動物として、たとえばマウス、ラット、モルモット
、クサイ、ヤギ、牛、馬等を用いることができる。用−
鎗は動物によって異なるが、通常、小動物では抗原ＴＯ
−５００μｌ（蛋白質として）、犬Ｕ１物では１００−
２０００μｙを１回量として、２−５週問おきに２−５
回常法によって免疫する。たとえばウザギの場合、抗原
液（蛋白質として１００−２００Ｐ１１／ｒｒｔ１．　
）　ヲ等量の７０インド完全アジユノセントと混合した
ものを２−５週問おきに２−５回投与し、最終免疫後１
０−１４日目に動口外ら常法により採血し、免疫グロブ
リンを含有するプラスマを得る。これをこのままヒトに
投与することもできるし、精製して抗血清とすることも
できる。所望により、５−１０倍量の抗原液を３−１２
日間連続的に経口投与して免疫することもできる。

本発明による非う触性組成物の担体は、経口投与に適す
る固体、半固体または液体であってもよく、たとえば粉
末、シロップ、カプセル、粒状物、乳液、懸濁液、ドロ
ップの類であってもよい。適当な賦形剤の例は、ラクト
ース、ポテトでん粉、可溶性でん粉、ステアリン酸マグ
ネシウム等であり、適洛な液状担体の例は、食塩水、グ
リセリン、アーセノげ油、乳酸菌飲料、ジュース等であ
る。

本発明による組成物は、結合剤、安定剤、乳化剤、懸濁
剤、潤滑剤、防腐剤のような常用の添加物を含んでもよ
い。組成物は、歯みがき剤、うがい剤、キャンデー、チ
ューインガム、アイスクリーム等の形状でもよい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒト型ストレプトコッカス・ミュウタンス菌株
   の細胞壁表層の線毛層抗原を採取し、これで哺乳動物を
   免疫することにより、哺乳動物の体内に対応する抗体を
   産生じ、これを回収する工程からなる、ストレプトコッ
   カス・ミュウタンスにより誘発されるヒトの虫歯を抑制
   するための非う触性抗体の製造方法。 （２）　ヒト型菌株の血清型がＣ１θ、ｆまたはｇ型で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）　ヒト型菌株の血清型がｄ型である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 （４）菌株が突然変異株である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）突然変異株がストレプトコッカス・ミュウタンス
   変異株に−Ｄｐ株（ＦＥＲＭ　−ＢＰ　３１７　）であ
   る特許請求の範囲第４項記載の方法。 （６）突然変異株がストレプトコッカス・ミュウタンス
   ＫＨ２株（ＦｌｎＲＭ　−Ｐ　７１６６　）である特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 （７）　ヒト型ストレプトコッカス・ミュウタンス菌株
   の細胞壁表層の線毛層抗原を採取し、これで哺乳動物を
   免疫することにより唱乳動物の体内忙対応する抗体を産
   生じ、これを回収し、薬理学的に許容し得る担体または
   賦形剤と共存させてなる、ストレプトコッカス・εニラ
   タンスにょジ誘発されるヒトの虫歯を抑制するための非
   う蝕性組放物。 （８）特許請求の範囲第７項記載の可食性組成物。 （９）特許請求の範囲第８項記載の乳酸菌飲料。 ａα　特許請求の範囲第８項記載のチューインガム、キ
   ャンデー、アイスクリームまたはシロップ。 （１１）特許請求の範囲第７項記載の歯みがき剤またけ
   うがい剤。 鰺　バッカルまたはトローチとして形成された特許請求
   の範囲第７項記載の組成物。