JP2004506695A

JP2004506695A - う蝕の予防の免疫学的方法

Info

Publication number: JP2004506695A
Application number: JP2002520852A
Authority: JP
Inventors: シー，ウェニュアン; アンダーソン，マックスウェル，エイチ．
Original assignee: ワシントン　デンタル　サービス; リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2004-03-04
Also published as: WO2002015931A1; EP1313506A1; AU2000270698A1; WO2002015931A9

Abstract

ヒトのう蝕は、う蝕原性生物（例えば、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））の表面抗原に結合するヒトまたはヒト化マウスモノクローナルＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の経口摂取により、予防または治療される。これらがう蝕原性生物に結合すると、遺伝子的に免疫系はその破壊を引き起こす。好適な実施形態において、う蝕原性生物に対するモノクローナル抗体は、所望の抗体をコードするＤＮＡ配列により形質転換された食用植物（果実および野菜を含む）により産生される。抗体は、植物を食べることにより適用される。

Description

【０００１】
発明の背景
本出願は、う蝕の治療と予防のための免疫学的方法に関する。本発明は、幼児や決断力が無く充分に教育されていない集団のような、確立されたセルフケアの原理を応用する能力も動機も持たない患者に特に適用される。
【０００２】
う蝕（虫歯）と歯周病は、おそらく世界で最も一般的な慢性疾患である。歯の空洞の存在は、細菌感染の結果である。すなわちう蝕の存在は、正しくは歯の石灰化組織の局所的破壊を引き起こす感染性微生物疾患と見なされる。
【０００３】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）は、ヒトの虫歯の主要な原因である。エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）が歯垢中に多数存在し、複合糖を代謝すると、生じる有機酸が歯の表面の脱灰を引き起こす。その結果は、う蝕病変であり、これは一般的に窩洞として知られている。他の生物（例えば、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｉ）とアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ））は、窩洞病変の進行と形成に関与していると考えられている。虫歯を引き起こすこれらの生物は、本明細書において「う蝕原性生物」と呼ぶ。
【０００４】
歯の損傷部分を除去したり詰め物をして修復すると、う蝕原性生物による口腔感染による損傷を、少なくとも一時的には止めることができる。しかし「ｄｒｉｌｌａｎｄｆｉｌｌ」アプローチは、起因細菌を排除していない。正しい口腔の清潔さが歯垢（ここにう蝕原性生物が増殖し、歯の表面を攻撃する）の蓄積を抑える。しかし歯のセルフケアは、特に自分でケアすることができない集団、またはセルフケアの正しい方法についての知識が無い集団では、限界がある。フッ素イオンの投与は、う蝕の発生を減少させるが、根絶はしないことが証明されている。
【０００５】
う蝕の発症にう蝕原性生物が関与しているという圧倒的な証拠を考えると、古典的な抗菌療法により症状を緩和する多くの試みがなされていることは驚くべきことではない。抗微生物剤の欠点は、う蝕原性生物に対して選択的ではないことである。非特異的殺菌剤の投与は、口腔に通常棲息している微生物のバランスを乱し、これが予測できない結果を招くが、病原性微生物のための環境が作り出されることがある。さらに、抗微生物剤の長期投与は、これらに耐性の微生物を選択することになることが知られている。従って、虫歯を治療するために抗微生物剤を長期にかつ集団的に使用することは、現実的ではない。
【０００６】
エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または他のう蝕原性生物に対して能動免疫応答を誘発するためにヒトに予防接種することも、今は現実的ではない。このアプローチの１つの欠点は、予防接種が、主にＩｇＧとＩｇＭ抗体の産生を誘発することであるが、これらは唾液中に分泌されない。唾液中に存在するほとんどの抗体はＩｇＡイソタイプであり、これは、リンパ球や補体成分に結合できるが、これらを活性化して細菌を死滅させることは無い。従って予防接種は、免疫系を誘発して口の中のう蝕原性生物を死滅させることができる抗体を産生すると考えられない。予防接種により誘導された、口腔中のＩｇＧまたはＩｇＭイソタイプ抗体の力価を、選択的に上昇させる方法は知られていない。
【０００７】
動物やヒトの虫歯を予防するために、マウスで作成したモノクローナルＩｇＡ抗体を使用して、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対して患者を受動的に免疫する多くの試みが報告されている。ＩｇＡは多価抗体であるため、単一のＩｇＡ分子がいくつかの異なる抗原性部位に結合し、細菌の凝集を引き起こす。しかし細菌の表面抗原へのＩｇＡの結合は、細菌を死滅させない。むしろ、凝集は、細菌が歯の表面に結合することを阻害すると考えられている。このアプローチの別の欠点は、マウス（すなわち、異種）抗体をヒトに繰り返し投与すると、抗体に対する免疫応答を誘発する可能性があることである。
【０００８】
ＩｇＡ抗体と異なり、ＩｇＧとＩｇＭクラスの抗体は殺菌作用を有する。う蝕原性生物の表面上に存在する抗原に対するＩｇＧまたはＩｇＭ抗体の結合は、２つの異なる機構（補体介在細胞溶解と抗体依存性細胞障害）により細菌細胞の破壊を引き起こし得る。いずれの場合も、ある微生物に選択的に結合する抗体は、免疫系による破壊について、そのような細胞を標的とする。補体介在細胞溶解と抗体依存性細胞障害の両方とも、ＩｇＧとＩｇＭクラスの抗体により仲介されるヒト免疫応答の一部である。
【０００９】
抗体結合の所望の細胞障害作用を誘発するために、う蝕原性生物に対するモノクローナル抗体は、ヒトの免疫系により認識されなければならない。異種の哺乳動物免疫系から応答を引き起こす抗体が産生される、多くの異なる技術がある。１つの例は、異種生物の抗原特異的結合ドメインをコードする配列を取り込むように修飾された、ヒト抗体をコードする核酸構築体である。
【００１０】
ヒトのう蝕を治療するためのそのような遺伝子操作したモノクローナル抗体の産生と投与は、特に革新的な解決を受けやすい問題を提起する。モノクローナル抗体の産生についての先行技術の方法は、培養培地中でハイブリドーマを増殖させ、次に所望の抗体を抽出および精製する。これらの工程は、本発明の好適な実施形態では、食用植物または動物（真核生物）中で抗体を発現することにより、大幅に単純化される。抗体は、植物または動物の生成物（例えば、その中で抗体が変性していない果実、野菜またはミルク）の経口摂取により投与される。この投与法は、改善している虫歯でコンプライアンスが不要になる可能性がある。
【００１１】
好適な実施形態の要約
う蝕は、う蝕原性生物（例えば、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））の表面抗原に結合する、ヒトまたはヒト化マウスモノクローナルＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の経口摂取により予防または治療し得る。遺伝子操作したモノクローナル抗体は、う蝕原性生物に結合する時、ヒトの免疫系のエフェクター機構に参加して、微生物を破壊させる。好適な実施形態において、う蝕原性生物に対するモノクローナル抗体は、所望の抗体をコードするＤＮＡ配列により形質転換された食用植物（果実および野菜を含む）により産生される。抗体は、植物を食べることにより適用される。
【００１２】
好適な実施形態の詳細な説明
１．　モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体技術は、すばらしい特異性を持った抗体供給源の調製を可能にする。特異的分子構造に結合するモノクローナル抗体は、今日標準的方法と考えられている技術を使用して産生することができる。
【００１３】
本発明で使用されるモノクローナル抗体は、う蝕原性生物の表面抗原に対して作成されるものである。表面抗原は、細胞の表面に表示される物質である。そのような抗原は、体液中に存在する抗体がアクセスできる。本発明においてう蝕原性生物の表面抗原は、う蝕を引き起こす微生物の表面に存在する。う蝕病変の発症における細菌活性の役割は、充分解明されているが、特定の微生物とう蝕の発症との間の因果関係は、完全には確立されていない。今日までエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のみがう蝕と関係するとされている。しかしラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｉ）とアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）の種もまた、特にう蝕病変の活動的な進行に関与していると考えられている。う蝕病変を発症する微生物は、本発明に従って調製され使用されるモノクローナル抗体の潜在的な標的である。
【００１４】
本発明の実施で使用されるモノクローナル抗体のさらなる要件は、う蝕原性生物に対して選択的であることである。う蝕原性生物ならびに非う蝕原性生物上に存在する抗原に対するモノクローナル抗体は、口腔内の菌叢の構成の非特異的変化を引き起こすことがある。そのような変化の結末はあまり理解されていない。
【００１５】
従って好適なモノクローナル抗体は、う蝕原性生物の表面抗原に対するものである。すなわち好適なモノクローナル抗体は、う蝕を引き起こす微生物に特異的に結合する。
【００１６】
本発明の範囲は、ヒトの虫歯の予防に限定されないことは明瞭に理解される。本発明のモノクローナル抗体は、他の哺乳動物（例えば、ペットとして家畜化されているもの）の免疫系のエフェクター応答を行うように遺伝子操作することができる。
【００１７】
モノクローナル抗体は、マウスまたは他の哺乳動物宿主を、う蝕原性生物から単離した細胞壁物質で免疫することにより調製される。好適な実施形態において、う蝕原性生物は、ｃ型エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ２５１７５）である。細胞壁中に存在する分子の免疫原性は、当該分野で公知の種々の方法により増強することができる。好適な実施形態において、そのような分子の免疫原性は、単離した細胞物質をホルマリンで変性することにより増強される。細胞壁タンパク質を修飾して免疫原性を増強する他の方法は、本発明の範囲内である。典型的には宿主は、単離した細菌細胞断片を一回またはそれ以上注射されて、抗体の力価を増加させた後、屠殺およびクローニングされる。
【００１８】
宿主の脾臓細胞を採取し、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの先駆的な仕事以来標準法となった技術を使用して、限界希釈法によりクローニングする。好適な実施形態において、生存しているハイブリドーマは、う蝕原性生物に対する抗体について、ホルマリン化細菌細胞物質でコートしたマイクロタイタープレートに対して、ＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングされる。陽性の上清を、さらにスクリーニングして、う蝕原性生物に対する親和性が最も大きい抗体を分泌するクローンを同定する。好適な実施形態において、バックグランドより少なくとも３倍高い力価を有するクローンが、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からの変性細胞壁物質に対して、免疫沈降法を使用して再度スクリーニングされる。好適な実施形態において、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）株ＡＴＣＣ２５１７５、ＬＭ７、ＯＭＺ１７５およびＡＴＣＣ３１３７７にのみ検出できる形で結合する３つのクローンが同定された。これらのクローンは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託して、寄託番号ＨＢ−１２５６０、１２５９９および１２５５８を受けた。
【００１９】
２．　ヒト免疫系からエフェクター応答を誘発することができるモノクローナル抗体の調製
う蝕の予防のための免疫学的方法を開発する従来の試みは、異種抗体を使用した。例えば、Ｌｅｈｎｅｒ、ＵＳＰａｔｅｎｔＮｏ．５，３５２，４４６は、マウスで作製したエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）表面抗原に対するモノクローナル抗体の、サルにおけるこれらの細菌の増殖を阻害するための使用に関する。さらに最近は、Ｍａら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，４５（５）６０１−６（１９９８）は、タバコ植物で発現した、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する遺伝子操作した分泌性モノクローナル抗体を使用して、ヒトで同様の結果を報告した。このアプローチの欠点は、１）異種抗体の投与は、有害な微生物を凝集させるが、そのような抗体は免疫応答を誘発しないため、これらを死滅させることはない；および２）抗体の繰り返し投与は、患者に抗体に対する免疫応答を誘発することがある。好適なアプローチは、組換え法を使用して、う蝕原性生物の表面抗原に対して特異的に作成されるキメラ抗体分子を調製することであり、これはまた、標的微生物に結合することによりヒトの免疫系（ヒトで使用する場合）にエフェクター応答を誘発するであろう。これは、う蝕原性生物に特異的なマウスモノクローナル抗体からの種々の領域または相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を、治療される哺乳動物からのＩｇＧおよび／またはＩｇＭクラスの抗体に挿入することにより行われる。治療される哺乳動物がヒトである時、抗体は「ヒト化」されたと言う。
【００２０】
う蝕原性生物の表面抗原に対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体をコードする核酸配列を得るには、種々の方法がある：１）う蝕原性生物に対するモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを単離し、これらの抗体をコードするマウス遺伝子をクローニングする；２）精製したう蝕原性生物を使用して、ヒトＢリンパ球から作製したファージディスプレイランダムライブラリーをスクリーニングし、う蝕原性生物に特異的な抗体をコードする遺伝子を得る；３）重度感染患者から回収したＢリンパ球を使用して、う蝕原性生物に対するモノクローナル抗体を産生するヒトハイブリドーマを単離し、これらの抗体をコードするヒト遺伝子をクローニングする；または４）精製したう蝕原性生物を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏでヒトＢリンパ球と脾臓細胞を免疫し、次に融合させて、ハイブリドーマを形成させ、不死化細胞株を作製する。必要な技術は、当業者に公知である。
【００２１】
本発明の好適な実施形態において、マウスモノクローナル抗体は「ヒト化」される。ＰＣＲまたはサザンブロット技術を使用して、う蝕原性生物の細胞表面抗原に特異的な抗体を分泌するマウスハイブリドーマの可変ドメインをコードするＤＮＡ断片を単離する。遺伝子クローニング技術を使用して、ヒトＩｇＧとＩｇＭ免疫グロブリンの可変領域を、対応するマウス可変領域またはＣＤＲで置換する。この遺伝子操作の結果は、う蝕原性生物の表面抗原に選択的に結合するが、その定常領域を介してヒト免疫系と相互作用して、体液性免疫応答を誘発する可変ドメインを有するキメラ抗体分子である。
【００２２】
３．　モノクローナル抗体の投与
臨床的使用に充分な量のモノクローナル抗体を調製するためには、ＩｇＧまたはＩｇＭをコードする配列でトランスフェクションした所望の細胞株を増殖させなければならない。既存の技術が、組織培養でのモノクローナル抗体の大規模増殖を可能にする。トランスフェクションした細胞株は、モノクローナル抗体を組織培養培地中に分泌するであろう。分泌されたモノクローナル抗体は回収され、ゲル濾過およびタンパク質化学の関連技術で精製される。
【００２３】
実験的研究で、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するモノクローナル抗体は、歯の表面に直接適用されている。うがい薬の摂取、またはチューインガムによる適用もまた提唱されている。現在好適な代替法は、食用植物（例えば、バナナまたはブロッコリー）中で本発明のモノクローナル抗体を発現することである。本発明により形質転換された植物を食べることにより、歯の表面および口の別のところに存在するう蝕原性生物に抗体が適用される。また、植物性および動物性の他の微生物を形質転換して、本明細書に記載のモノクローナル抗体を発現し、その結果そのような抗体が例えばミルクを飲むことにより摂取されることも企図される。
【００２４】
実施例
１．　エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するマウスモノクローナル抗体の産生
ｃ型エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）株ＡＴＣＣ２５１７５を、ＢＨＩ培地中で対数期まで増殖させ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）を用いて３０００×ｇで５分遠心分離して２回洗浄する。ペレットを１％ホルマリン／０．９％ＮａＣｌに再懸濁し、室温で３０分混合し、０．９％ＮａＣｌで２回洗浄する。Ｂａｌｂ／ｃマウス（８〜１０週齢）を、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）で乳化したホルマリン化した完全なエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）細菌の約１０^８個の全細胞を含有する１００　ＦＩの抗原を腹腔内投与して免疫する。３〜５週後、マウスに抗原（ＦＩＡ中１０^８個の全細胞の細菌）の第２回投与を行う。融合の３日前に、マウスに、食塩水中１０^８個の全細胞を静脈内投与して追加免疫する。
【００２５】
標準的組織培養培地は、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭヘペスを補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地であり、さらに１００μｇ／ｍｌペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを１０％牛胎児血清とともに含有する。ＨＡＴ（１００μｇヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）を含有する培地中で、ハイブリッドを選択する。アミノプテリンを除去した後、ＨＴ（１００μｇヒポキサンチン、１６μＭチミジン）を培養培地中で２週間維持する。ハイブリドーマのクローニング中に、組織培養物に追加の増殖因子として、ＯＰＩ（１ｍＭオキザロ酢酸、０．４５ｍＭピルビン酸および０．２Ｕ／ｍｌウシインスリン）を加える。ＬｉｄｄｅｌｌとＣｒｙｅｒ（ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ジョンワイリーアンドサンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ）、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９１）が報告した方法に従って、ハイブリドーマを作成する。ＮＳＩ／Ａ９４．１マウスミエローマ細胞株を、融合のパートナーとして使用し、５％ＣＯ_２で３７℃で撹拌培養で増殖させ、対数増殖期で維持した後、融合する。
【００２６】
エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する種特異的モノクローナル抗体のスクリーニングのために、以下のアプローチがとられる。最初のスクリーニングをＥＬＩＳＡアッセイを使用して行い、これは、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に結合する抗体を含有する培養上清について選択する。ホルマリン化細菌をＰＢＳでＯＤ_６００＝０．５に希釈し、あらかじめ０．０２ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン１００μｌで４時間インキュベートした９６ウェルＰＶＣＥＬＩＳＡプレートのウェル中に二重測定で加える（１００μｌ）。これらの抗原被覆プレートを、湿潤箱中で４℃で一晩インキュベートし、次にＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％胎児牛血清でブロックし、４℃に保存する。１００μｌの成熟ハイブリドーマ上清を抗原プレートの適当なウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０で３回洗浄し、結合した抗体を、ＰＢＳ−１％胎児牛血清で１：１０００希釈したアルカリホスファターゼと結合した多価ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加して、検出する。炭酸バッファー（１５ｍＭ　Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ　ＮａＨ_２ＣＯ_３、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６）中の基質である１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を加えた後、１５分後の発色を、ＥＩＡリーダーで４０５ｎｍで測定する。次に、陽性の上清（対照の３倍より高い）を免疫沈降アッセイ（１００μｌの細菌と１００μｌの上清を混合する）を行って、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）と強い陽性の反応性を有するものを選択する。寄託したクローンはこの方法で調製された。
【００２７】
２．　エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するヒト化モノクローナル抗体をコードするマウス／ヒトキメラ遺伝子の作成
マウスモノクローナル抗体をヒト化する方法の１つをここに説明する。マウスハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐシステム（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して単離する。種々の制限酵素で消化した後、ＤＮＡ断片を電気泳動により０．８％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロース膜に移す。サザンブロッティングを行い、免疫グロブリン遺伝子を同定する。重鎖遺伝子を、Ｊ３とＪ４セグメントおよびエンハンサー領域を含むマウスＩｇＧ重鎖遺伝子からのＤＮＡ断片とプローブ結合させる。軽鎖遺伝子は、Ｊ１−５セグメントを含有するマウスＩｇＧ軽鎖遺伝子からのＤＮＡ断片とプローブ結合させる。
【００２８】
サザンブロット解析で同定した選択したサイズのＤＮＡ制限断片を、アガロースゲルから、ＱｉａｇｅｎＤＮＡクリーンアップおよびゲル抽出システムを使用して精製する。ＤＮＡを、ラムダ−Ｚａｐ１１ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に連結して、ラムダファージ中のこれらのマウスハイブリドーマの重鎖および軽鎖ライブラリーを構築する。前述のようにライブラリーを重鎖および軽鎖Ｊ領域プローブを用いてスクリーニングする。陽性クローンのＤＮＡを単離し、サブクローニングし、配列決定する。最良の正確度を達成するために、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を配列決定する。ＢＬＡＳＴ検索を行って、ヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳し、それを既存の抗体遺伝子と比較する。重鎖の可変領域を同定し、サブクローニングし、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片およびミコフェノール酸に対する耐性を与えるＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含有する発現ベクターに挿入する。軽鎖の可変領域も同定し、サブクローニングし、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片およびＧ４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子を含有する別の発現ベクターに挿入する。
【００２９】
３．　形質転換した生物中のエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するモノクローナル抗体の発現
ａ）　動物細胞でヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を産生する
ヒトＩｇＧ遺伝子の重鎖および軽鎖を、リポフェクション試薬（ＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、動物細胞株（例えばＳＰ２／０）中に、別々に導入または同時トランスフェクションする。トランスフェクションした細胞を、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で、１×亜鉛選択培地中で２４時間インキュベートし、次に１０％胎児牛血清含有培地中でインキュベートする。４８時間インキュベーション後、細胞をマイクロタイタープレートに移し、Ｇ４１８とミコフェノール酸を含有する選択培地中で増殖させる。薬剤耐性細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡまたは上記の沈降アッセイを使用して、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する免疫反応性についてスクリーニングする。
【００３０】
ｂ）　食用植物中でヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を産生する
トランスジェニック植物は、大量の外来タンパク質を非常に低コストで製造するための非常に有用なシステムであることが認識されている。エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を食用植物（野菜または果実）中で発現することは、存在するう蝕を治療し、将来の細菌感染を予防するために、口に植物または植物抽出物を直接適用することを可能にする。トランスジェニックな食用植物の選択には、特に限定されないが、ジャガイモ、トマト、ボロッコリーおよびバナナがある。
【００３１】
本明細書にトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を製造する方法が記載され、これは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種に密接に関連する食用植物である、一般的な野菜（例えば、キャベツ、カリフラワーおよびブロッコリー）を含む。これは、この植物について多くの遺伝的および生化学的手段が開発されているため、選択される。この植物でＩｇＧを発現するのにいくつかの方策がある。１つの方策は、まず重鎖と軽鎖をコードするヒトＩｇＧ遺伝子を２つの別個のトランスジェニック株に導入することである。２つの遺伝子は、遺伝子交配および選択により一緒にされる。他の方法は連続的形質転換であり、ここでは、１つのＩｇＧ遺伝子で形質転換されたトランスジェニック株が、第２の遺伝子で再形質転換される。あるいは、重鎖と軽鎖とをコードする遺伝子が、同じＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター中の２つの異なるクローニング部位に、２つのプロモーターの制御下でクローン化され、両方の遺伝子の発現は、単一の構築体を植物に形質転換することにより行われる。技術的には、別々の形質転換法は、最も簡単な方法であり、これは通常、より高い抗体収率を与える。従って我々はここに、この方策を提示する。同様の技術を使用して、他の植物を形質転換することが可能である。
【００３２】
ヒトＩｇＧ遺伝子の重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡ断片は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミド中に別々にクローン化される。このプラスミドは、アラビドプシス・タリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）中のＩｇＧのヒト重鎖と軽鎖、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中の抗生物質マーカー、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中の形質転換選択のための除草剤耐性遺伝子とを発現するプロモーターを含有する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株は、これらのプラスミドで形質転換され、抗生物質選択下で後期対数期まで増殖され、Ｂｅｔｈｔｏｌｄら（Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＰａｒｉｓＬｉｆｅＳｃｉ．３１６：１１９４−１１９９，１９９３）が記載した浸透培地中に再懸濁する。
【００３３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含有するＴｉプラスミドによるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の形質転換は、真空浸透により行われる。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の植物全体を細菌懸濁液中に浸漬する。この方法は、真空チャンバー中で行われる。５分の真空（約４０ｃｍ水銀）が４サイクル行われる。各適用後、真空を解除し直ちに繰り返す。浸透後、植物を増殖チャンバー中で２４時間水平に維持する。次に植物を成熟するまで増殖させ、その種子を採取する。採取した種子を、最初の一対の真の葉が出るまで、非選択培地中で発芽させる。この段階で、植物に除草剤Ｂａｓｔａを１５０ｍｇ／ｌ水の濃度で噴霧する。形質転換したＴｉプラスミドを含有するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、除草剤に耐性であり、非形質転換植物は脱色され死滅する。そのような選択は、植物の第２世代まで続く。耐性植物について、総ゲノムＤＮＡを単離し、ＩｇＧ遺伝子の重鎖と軽鎖とをコードするＤＮＡ断片とプローブ結合させる。陽性形質転換体の植物抽出物を調製し、ヒトＩｇＧタンパク質の発現について、ウェスタンブロットにより、ヒトＩｇＧの定常領域の重鎖と軽鎖に対する抗体を使用してスクリーニングする。
【００３４】
ヒトＩｇＧ重鎖を発現する植物を、ヒトＩｇＧ軽鎖を発現する植物と有性交配させて、両方の鎖を発現する子孫を作り出す。ウェスタンブロッティング法を使用して、重鎖と軽鎖の両方をスクリーニングする。陽性の形質転換体からの抽出物を採取し、上記のＥＬＩＳＡまたは沈降アッセイを使用してエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する免疫反応性についてスクリーニングする。
【００３５】
４．　ヒトう蝕を治療または予防するためのエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の使用
上記試験がうまく完了すると、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するヒト化モノクローナル抗体が得られる。この植物組織の効力を試験する。
【００３６】
エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するモノクローナル抗体を含有する植物組織抽出物を、精製したヒト補体成分または精製したヒト多形核好中球の存在下および非存在下で、種々の濃度のエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）と混合する。２時間インキュベーション後、混合物をＢＨＩプレートに蒔いて、細菌活性を調べる。
【００３７】
Ｗｏｌｉｎｓｋｙら（Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７５：８１６−８２２，１９９６）が開発した人工的プラーク形成システムを使用して、モノクローナル抗体を含有する植物組織抽出物を使用して、発現されたモノクローナル抗体が、唾液または人工的歯科エナメル上の歯垢中のエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を死滅させる能力を調べる。同様の方法を使用して、歯垢の形成を防ぐ能力を調べる。
【００３８】
動物細胞または植物により産生したこれらのモノクローナル抗体を使用して、ヒトの臨床試験が行われている。ヒトボランティアを、エス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対するこれらのヒトモノクローナル抗体有りでまたは無しで処置した。次に唾液と歯垢中のエス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のレベルを調べる。モノクローナル抗体の処理との関係における、現在と将来のう蝕の間の相関も調べる。
【００３９】
前記実施例は例示のみが目的であり、請求項に示す本発明の範囲を決して限定するものではない。

Claims

う蝕原性生物に特異的に結合し、哺乳動物に体液性免疫応答を誘発するモノクローナル抗体の経口投与を含んでなる、哺乳動物のう蝕の治療および予防方法であって、モノクローナル抗体は、治療される哺乳動物以外の種から得られる、方法。
う蝕の治療および予防方法であって、モノクローナル抗体が：
ａ）　少なくとも１つのう蝕原性生物を哺乳動物宿主に接種する工程；
ｂ）　少なくとも１つのう蝕原性生物の表面抗原に特異的な抗体を分泌する哺乳動物宿主から、ハイブリドーマを同定する工程；および
ｃ）　上記工程ｂ）のモノクローナル抗体からの相補性決定領域と、治療される哺乳動物からの定常ドメインとを含むキメラモノクローナル抗体を調製する工程、により産生される、方法。
請求項２のう蝕の治療および予防法であって、調製工程は：
ａ）　上記請求項２の哺乳動物宿主から得られるハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を発現に関してコードする核酸配列；および
ｂ）　治療される哺乳動物のＩｇＧクラスとＩｇＭクラスよりなる群から選択される抗体の定常領域を発現に関してコードする核酸配列、
とを含む核酸構築体の合成をさらに含む、方法。
キメラモノクローナル抗体は、上記請求項３の核酸構築体で形質転換された真核生物宿主により発現される、請求項３のう蝕の治療および予防方法。
モノクローナル抗体は、上記請求項４の核酸構築体で形質転換された真核生物宿主からの組織の経口摂取により投与される、請求項４の哺乳動物のう蝕の治療および予防方法。
治療される哺乳動物はヒトであり、他の種はマウスである、請求項１のう蝕の治療および予防方法。
う蝕原性生物に特異的に結合し、哺乳動物から体液性免疫応答を誘発するモノクローナル抗体の投与を含んでなる、哺乳動物のう蝕の治療および予防方法。
請求項７のう蝕の治療および予防方法であって、モノクローナル抗体は：
ａ）　少なくとも１つのう蝕原性生物を哺乳動物宿主に接種する工程；
ｂ）　少なくとも１つのう蝕原性生物の表面抗原に特異的な抗体を分泌する哺乳動物宿主からハイブリドーマを同定する工程；および
ｃ）　上記工程ｂ）のモノクローナル抗体からの相補性決定領域と、治療される哺乳動物からの定常ドメインとを含むキメラモノクローナル抗体を調製する工程、により産生される、方法。
請求項８のう蝕の治療および予防方法であって、調製工程は：
ａ）　上記請求項２の哺乳動物宿主から得られるハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を発現に関してコードする核酸配列；および
ｂ）　治療される哺乳動物のＩｇＧクラスとＩｇＭクラスよりなる群から選択される抗体の定常領域を発現に関してコードする核酸配列、
とを含む少なくとも１つの核酸構築体の調製をさらに含む、方法。
キメラモノクローナル抗体は、上記請求項９の核酸構築体で形質転換された真核生物宿主により発現される、請求項９のう蝕の治療および予防方法。
モノクローナル抗体は、上記請求項９の核酸構築体で形質転換された真核生物宿主からの組織の経口摂取により投与される、請求項９の哺乳動物のう蝕の治療および予防方法。
哺乳動物宿主はマウスであり、治療される哺乳動物はヒトである、請求項８のう蝕の治療および予防方法。
真核生物は植物である、請求項５のう蝕の治療および予防方法。
真核生物はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種の植物である、請求項５のう蝕の治療および予防方法。
真核生物は植物である、請求項１１のう蝕の治療および予防方法。
真核生物はアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種の植物である、請求項１１のう蝕の治療および予防方法。
治療される哺乳動物がイヌまたはネコである、請求項８のう蝕の治療および予防方法。