JPH11504901A - 植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の免疫グロブリンは、Ｓ．mutansのような粘膜病原体に対する有用な治療的免疫グロブリンである。この免疫グロブリンは、粘膜環境で免疫グロブリンを防御する防御タンパク質を含む。本発明はまた同じ細胞中で防御タンパク質と免疫グロブリンの他の成分を製造させることによって植物細胞中で免疫グロブリンを製造する非常に改善された方法も含む。免疫グロブリンの成分は非常に改善された効率で集合する。本発明の方法は、このような複合体分子の集合および非常に能率的な製造を可能にする。本発明はまた、有用な付加特性により選択できる、植物細胞を含む種々の細胞中に防御タンパク質を含む免疫グロブリンを製造させることにも関する。粘膜および他の病原体に対する治療的抗体としての防御タンパク質を含む免疫グロブリンの使用にもまた関する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法およびその使用関連出願のクロスリファンレンス これは、本発明に参考として包含させる１９９４年１２月３０日出願の同時継 続出願番号第０８／３６７,３９５号の一部継続出願である。発明の分野 本発明は、植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの発現およびこ のような免疫グロブリンを発現するトランスジェニック植物に関する。これらの 免疫グロブリンの治療的使用にもまた関する。発明の背景 モノクローナル抗体は、多くの治療目的に非常に可能性を有する。モノクロー ナル抗体治療の慣用医薬を越える利点は、その著しい選択性、多重エフェクター 機能および分子操作、例えば放射性同位元素標識および他のタイプの結合の行い 易さを含む。広範な標的抗原が特異的モノクローナル抗体を製造するのに使用さ れている。例えば、Ｔherapeutic Ｍonoclonal Ａntibodies，Ｃ.Ａ.Ｋ．Ｂorre baeckおよびＪ.Ｗ．Ｌarrick編，Ｓtockton Ｐress，Ｎew Ｙork，1990およびＴ he Ｐharmacology of Ｍonoclonal Ａntibodies，Ｍ．ＲosenbergおよびＧ.Ｐ． Ｍoore編，Ｓpring-Ｖerlag，Ｂerlin．1994参照。 モノクローナル抗体の一つの治療的使用は、外因性に製造した免疫グロブリン を直接、処置する動物に注射または経口により投与する、受動免疫治療である。 成功するには、受動免疫治療は処置する動物の免疫応答に拠るものではないため 、受動免疫治療は適切な量の免疫グロブリンを動物に送達しなければならない。 投与する免疫グロブリンは処置を行うことが望ましい病原菌または分子に特異的 でなければならない。受動免疫治療の一つの利点は、正常免疫応答と比較した、 抗体が標的に接触し得る速度である。受動免疫治療は疾病または感染が発症する のを予防する予防剤としても使用できる。 受動免疫治療の主要な使用の可能性は、細菌感染を防除することである。近年 の抗生物質耐性細菌の出現は、受動免疫による細菌感染の処置を望ましくしてい る。一つの病原菌を標的にした抗生物質処置は、しばしば正常微生物の大集団の 絶滅を含み、これは望ましくない副作用をもたらし得る。別の試みは、非常に特 異的な微生物集団における特異的病原機能を阻止するための免疫グロブリンの固 有な特性の利用である。この概念において、適切な特異性の精製免疫グロブリン を病原菌侵入の受動障壁を提供する程度で投与する。 加えて、例えば、免疫グロブリンの経口投与のための受動免疫治療に使用する 免疫グロブリンは、ある要求を満たさなければならない。第１に、免疫グロブリ ンは胃腸管のような非常に厳しい環境で機能しなければならない。第２に、免疫 グロブリンは標的を不活性化する前に分解されないように、プロテアーゼの作用 に耐性でなければならない。 上皮細胞および肝細胞を含むあるタイプの細胞は、厳しい環境で機能するのに 特に適した免疫グロブリンの集合(assemble)をできる。これらの免疫グロブリン は、分泌型免疫グロブリン(ＳＩｇ)と呼ばれ、分泌型ＩｇＡ(ＳＩｇＡ)および分 泌型ＩｇＭ(ＳＩｇＭ)を含む。内因性分泌型免疫グロブリンにより提供される防 御は証明されている。分泌型免疫グロブリンによる細菌感染から防御するための 幾つかの機構が提案されており、直接の殺菌、凝集、外皮性結合および侵入の阻 害、酵素および毒素の不活性化、オプソニン作用および補体活性化を含むが、こ れらに限定されない。動物において、内因性ＳＩｇＡは、消化および細菌性酵素 のような多くのプロテアーゼが非常に活性で、胃酸のような変性剤も存在する非 常に苛酷な環境にさらされる。 分泌型免疫グロブリンの一つの成分である分泌成分は、免疫グロブリンをこれ らの不活性化剤に対して防御するのを助け、それにより分泌成分の生物学的効果 を増加させる。 ＳＩｇＡまたはＳＩｇＭのようなこれらの分泌型免疫グロブリンの合成および 集合の機構は非常に複雑である。動物細胞において、分泌型免疫グロブリンは異 なる細胞型を必要とする工程で集合する。各分泌型免疫グロブリンは、免疫グロ ブリン重および軽鎖、結合鎖(Ｊ鎖)および分泌成分からなる。免疫グロブリン製 造Ｂ細胞は免疫グロブリン重および軽鎖をＪ鎖と共に製造し、構築し、二量体ま たは多量体ＩｇＭまたはＩｇＡを製造する。分泌成分は、上皮細胞または肝細胞 の何れかである細胞の第２のタイプで製造され、分泌型免疫グロブリンがこれら の細胞中で集合し分泌される。これらの細胞が分泌型免疫グロブリンを集合させ 、分泌させる機構は非常に複雑であり、例えば、粘膜組織により提供される独特 な微細環境を必要とする。微細環境は、多量体免疫グロブリンを産生するＢ細胞 を、免疫グロブリンを集合させ、動物の粘膜表面に分泌させる細胞の近くに置く 。 外皮細胞は、多量体免疫グロブリン／Ｊ鎖含有を特異的に認識および結合し、 それを内部移行させ、外皮細胞を経由して輸送する受容体であるポリ免疫グロブ リン受容体(ｐＩｇＲ)を有する。側底細胞表面上へ発現して、ｐＩｇＲは１８ア ミノ酸のＮ−末端シグナルペプチド、６２９アミノ酸の細胞外ポリ免疫グロブリ ン結合部分、２３の疎水性残基の膜伸長セグメント、１０３アミノ酸の細胞質テ ールを有する。細胞外部分は、それぞれ１００−１１１アミノ酸の５つの免疫グ ロブリン様ドメインを含み、分子の分泌形を形成する。例えば、Ｍostov，Ａnn ．Ｒev．Ｉmmol.，12:63-84(1994)参照。ポリ免疫グロブリン受容体が成熟分泌 成分を産生するために開裂される部位は正確に決定されていない。 ポリ免疫グロブリン受容体は動物上皮細胞の側底表面(basolateral surface) に位置する。Ｂ細胞中で製造される多量体、Ｊ鎖含有免疫グロブリンは、受容体 と相互作用し、結合し、小胞化、外皮細胞を経由した輸送および最後に粘膜表面 への分泌をもたらす。外皮細胞経由輸送はまたタンパク質分解およびリン酸化も 関与し、分泌成分を含む成熟ＳＩｇを製造する。粘膜微細環境で見られる必要な 細胞、特にＢリンパ球と上皮細胞の緊密な関係は、分泌型免疫グロブリン集合に 必要である。 トランスジェニック生物、例えばマウスにおける免疫グロブリンの製造のター ゲンティングは非常に困難であり、真菌または植物から作られたトランスジェニ ック生物は、分泌型免疫グロブリンを製造するための適切な細胞型および粘膜微 細環境を含まない。トランスジェニック生物および細胞培養中の大量の分泌型免 疫グロブリンの製造は、本発明の前は不可能であった。細胞培養中またはトラン スジェニック生物中に分泌型免疫グロブリンを製造したいと望む者は、免疫グロ ブ リン重鎖、免疫グロブリン軽鎖およびＪ鎖をＢリンパ球中に発現しなければなら ない。機能的分泌型免疫グロブリンを集合させる試みですら、正しい粘膜微細環 境を模倣するために、その表面にｐＩｇＲ受容体を有する細胞もまた存在させ、 そのＢリンパ球と緊密に関係させなければならない。 天然分泌成分集合に必要なこの手の込んだ工程は、細胞培養中またはトランス ジェニック生物中で複製するのが非常に困難である。細胞培養中またはトランス ジェニック生物中でのＳＩｇの製造は、免疫グロブリンを産生する細胞の機能と 上皮細胞の機能を人工的(イン・ビトロ)システムで組み合わせることが必要であ る。更に、望ましいトランスジェニック生物が真菌、細菌または植物である場合 、受容体媒体細胞性内面化、トランスサイトシスおよび分泌の細胞型および経路 は単に存在しない。これらの生物は上皮細胞および必要な粘膜微小環境を欠く。 今日まで、同じ細胞内での軽、重およびＪ鎖を有する免疫グロブリンの集合の みが報告されている。Ｃarayannopolos et al.，Ｐroc．Ｎat Ａcad．Ｓci.，US A，91:8348-8352(1994)参照。しかしながら、付加タンパク質成分、分泌成分を 有する免疫グロブリンの一細胞内での集合は記載されていない。 本発明は、これらの複合分子の集合の新規な方法を記載する。膜結合ポリ免疫 グロブリン受容体と免疫グロブリンの相互作用による上皮細胞表面での四量体複 合体の集合よりむしろ、我々は、ｐＩｇＲ由来の防御タンパク質と会合したアル ファ、Ｊおよびカッパ免疫グロブリン鎖からなる分泌型免疫グロブリンを集合さ せた。本発明は、非常に効率的に分泌型免疫グロブリンを集合させるトランスジ ェニック植物を製造する。本発明は、受動免疫治療を経済的に実行可能にする。発明の要約 本発明は免疫グロブリン分子の新規タイプに関する。本発明の免疫グロブリン は少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と会合し た(in association)防御タンパク質を含む。他の態様において、本発明の免疫グ ロブリンは、更に、免疫グロブリン由来重鎖と結合した少なくとも抗原結合ドメ イン部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖を含む。 本発明の防御タンパク質は、これらのタンパク質を含む免疫グロブリンに化学 的および酵素的分解に対する耐性および変性に対する耐性を含む有用な特性を付 与する。これらの防御タンパク質は免疫グロブリンの環境条件への耐性を増加す る。 本発明のタンパク質の防御タンパク質は、任意の種の天然ポリ免疫グロブリン 受容体(ｐＩｇＲ)の少なくともアミノ酸残基１から６０６のセグメントを含む。 他の有用な防御タンパク質は、ｐＩｇＲ分子の一部を含む防御タンパク質を含む 。例えば、防御タンパク質は：アミノ酸１−１１８(ウサギｐＩｇＲのドメイン Ｉ)、アミノ酸１から２２３(ウサギｐＩｇＲのドメインＩおよびII)；アミノ酸 １から３３２(ウサギｐＩｇＲのドメインＩ、II、III)；アミノ酸１から４４１( ウサギｐＩｇＲのドメインＩ、II、IIIおよびIV)；アミノ酸１から５５２(ウサ ギｐＩｇＲのドメインＩ、II、III、IVおよびＶ)；およびｐＩｇＲのアミノ酸１ から６０６または１から６２７の全てまたは一部を含む。ｐＩｇＲ配列６５３− ７５５または他の源のいずれか由来の付加アミノ酸が、機能的膜通過伸長セグメ ントを形成しない限り、含まれ得る。 他の好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、ウサギポリ免疫グロ ブリン受容体のアミノ酸残基１から６０６または１から６２７に対応する第１ア ミノ酸配列および第１アミノ酸配列に隣接した第２アミノ酸残基配列(ここで、 第２アミノ酸残基配列はウサギポリ免疫グロブリン受容体の膜通過セグメントに 対応するアミノ酸残基配列を有しない)を有する防御タンパク質を有する。 更に好ましい態様において、第２アミノ酸残基配列は、少なくともポリ免疫グ ロブリン受容体のアミノ酸残基６５５から７５５に対応するアミノ酸配列の部分 を有する。他の好ましい態様において、第２アミノ酸残基は少なくとも以下のも のの一個またはそれ以上の部分である；ポリ免疫グロブリン分子の細胞内ドメイ ン、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーのドメイン、酵素、毒 素またはリンカー。 本発明は、ウサギポリ免疫グロブリンの膜通過セグメントに対応するアミノ酸 残基を有しないが、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞内ドメインに対応す るアミノ酸残基を有し得る防御タンパク質に関し、これは受容体の欠失変異体で ある。 本発明はまた、ウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基２８８から７５５ に類似の種由来のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基を含まないが、アミ ノ酸セグメント：ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基２０−４５に 対応するアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基１から１２ ０に対応するまたは類似のアミノ酸：ウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残 基数１２０から２３０に対応するまたは類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブ リン受容体のアミノ酸残基数２３０−３４０に対応するまたは類似のアミノ酸； ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基３４０−４５６に対応するまた は類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基数４５０− ５５０から５７０に対応するまたは類似のアミノ酸；ウサギポリ免疫グロブリン 受容体のアミノ酸残基５５０から５７０−６０６から６２７に対応するまたは類 似のアミノ酸の少なくとも１個またはそれ以上と類似の種のポリ免疫グロブリン 受容体由来のアミノ酸残基またはドメインの部分を有する防御タンパク質を含む 免疫グロブリンに関する。 本発明の防御タンパク質は、多くの種由来であり得、哺乳類、囓歯類、ヒト、 ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリまた は他の鳥類およびウサギ由来の防御タンパク質を含む。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、防御タンパク質に結合す る少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する２個または４個の免疫グロブリン 由来重鎖および免疫グロブリン由来重鎖のそれぞれに結合した少なくとも抗原結 合ドメインの部分を有する２個または４個の免疫グロブリン由来軽鎖を含む。 他の好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、少なくとも一つの免 疫グロブリン由来重鎖に結合した免疫グロブリンＪ鎖を更に含む。好ましい態様 においては、本発明の免疫グロブリンの成分パーツは、水素結合、ジスルフィド 結合、共有結合、イオン性相互作用またはこれらの結合の組み合わせにより互い に結合する。他の好ましい態様においては、本発明の免疫グロブリンは、Ｎ−結 合および／またはＯ−結合オリゴサッカライドを含まない、防御タンパク質およ び／または免疫グロブリン由来重、軽またはＪ鎖を含む。 本発明の免疫グロブリンは例えば、粘膜病原体抗原に対して、治療的免疫グロ ブリンとして使用し得る。好ましい態様においては、本発明の免疫グロブリンは Ｓ．mutans血清型ｃ、ｅおよびｆ；およびＳ．sobrinus血清型ｄおよびｇ、より 古い命名法ではＳ．mutans ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ由来の抗原に結合 することにより、虫歯を防止できる。 本発明はまた本発明の免疫グロブリンを含む、植物細胞を含む真核生物にも関 する。防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列および少なくとも抗原結合 ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするヌクレオチド配列 を含む植物細胞を含む真核細胞にもまた関する。少なくとも抗原結合ドメインの 部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードするヌクレオチド配列を更に含む 、植物細胞を含む真核細胞にも関する。好ましい態様において、抗原結合ドメイ ンを有する免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の植物細 胞を含む真核細胞は、Ｓ．mutans血清型ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇ、ｈ(新し い命名法ではＳ．mutans血清型ｃ、ｅおよびｆ；およびＳ．sobrinus血清型ｄお よびｇ)由来の抗原に結合できる。ＲＮＡおよび適当なＤＮＡ分子を含むヌクレ オチド配列を発現のために配列できる。 好ましい態様において、本発明の植物細胞は全植物のような植物の一部である 。本発明は、全てのタイプの植物、アルファルファおよびタバコを含む双子葉植 物および単子葉植物の両方の使用を含む。 本発明はまた本発明の免疫グロブリンおよび本発明の実施に有用な植物の一つ 由来の植物高分子物質を含む組成物にも関する。特に、リブロースビスホスフェ ートカルボキシラーゼ、集光性複合体、色素、二次代謝物またはクロロフィルお よび本発明の免疫グロブリンを含む組成物に関する。好ましい組成物は、水以外 の質量の０.００１％から９９.９％の間の免疫グロブリン濃度を有する。より好 ましい態様においては、組成物中に存在する免疫グロブリンの濃度は０.１から ９９％の間である。他の好ましい組成物は、水以外の質量の１％から９９％の間 の植物高分子物質を有する。 本発明はまた、植物細胞中への、転写プロモーターと操作可能に結合した、防 御タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターの挿入；およ び同じ植物細胞への、転写プロモーターと操作可能に結合した、少なくとも抗原 結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードする配列を含む発 現ベクターの挿入を含む、本発明の免疫グロブリンの製造法にも関する。他の方 法は、更に、同じ植物細胞への、転写プロモーターと操作可能に結合した、少な くとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードするヌ クレオチドを含む発現ベクターの挿入の段階を含む。他の好ましい方法は、また 、植物細胞への、転写プロモーターと操作可能に結合した免疫グロブリンＪ鎖を コードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの挿入も含む。 本発明は、発現のために操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの部 分を有する免疫グロブリン重鎖、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免 疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質のコードする ヌクレオチド配列の真核細胞への挿入による集合免疫グロブリン重、軽およびＪ 鎖および防御タンパク質を製造する方法にも関する。本方法は、更に、防御タン パク質を含む免疫グロブリンを形成させるための、免疫グロブリン由来重および 軽鎖と免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質の製造および集合を可能にする 条件下に真核細胞を維持することを含む。 本発明はまた、免疫グロブリン重鎖由来の少なくとも望ましい抗原結合ドメイ ンの部分をコードするヌクレオチドを、免疫グロブリンμまたはα(ＩｇＭまた はＩｇＡ)重鎖(または環境に増加した安定性を有する他の免疫グロブリン)由来 の少なくとも一つのドメインをコードするヌクレオチド配列と操作可能に結合さ せることによる種々の環境的条件および厳しい条件に耐性(より安定)な免疫グロ ブリンの製造法にも関し、キメラ免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド 配列を形成させ、そのヌクレオチド配列を真核生物中で発現させ、それはまた以 下に列記の少なくとも一つの分子も含む：防御タンパク質、少なくとも抗原結合 ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖。本 方法は、更に、キメラ免疫グロブリン重鎖を、同じ細胞中に存在する他の分子と 集合させ、環境的条件に耐性であり、より安定な免疫グロブリンを製造すること を含む。 本発明の免疫グロブリンの大規模製造は、本発明の植物を生育させ、免疫グロ ブリンをこれらの植物から抽出することにより考慮される。好ましい態様におい ては、植物高分子物質を含む治療的免疫グロブリン組成物の製造法は、圧力下で 、本発明の植物の一部を切り、治療的免疫グロブリンを含むパルプおよび植物高 分子を植物のアポプラストまたはシンプラスト由来の液体中に含み、固体植物由 来物質を含むパルプを産生する段階を含む。更に、処理段階は、固体植物由来材 料を液体から分離することを含み、葉、幹、塊茎、花、果実、種子を含む植物の 部分または全植物を使用することに関する。本発明は、植物のアポプラストまた はシンプラスト由来の液体を放出し、続いて、所望により、遠心、沈殿、フロキ ュレーションまたは濾過を使用して分離する機械または酵素的方法の使用を考慮 する。 本発明は、キメラであり、したがって異なる免疫グロブリン由来の免疫グロブ リンドメインを含む免疫グロブリンに関する。特に好ましくは、免疫グロブリン はＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡのドメインを含む。 本発明は、免疫グロブリン由来重鎖が二つの異なる免疫グロブリンのアイソト ープ由来の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンに関する。好ましい態 様において、使用する免疫グロブリンドメインは、少なくともマウスＩｇＧ、Ｉ ｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣ_H １、Ｃ_H２またはＣ_H３ドメインもしくはＣvarドメインを含む。他の好ましい態 様において、免疫グロブリン重鎖は、マウスＩｇＭのＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３ま たはＣμ４から成る。 本発明はまた、少なくともヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、Ｉｇ Ｇ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤのＣ_HＩ、Ｃ_H２またはＣ_H３ドメイン； または少なくともヒトＩｇＭのＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣμ４ドメイン； またはＣvarドメインを含む免疫グロブリンを構成する免疫グロブリン由来重鎖 に関する。ＩｇＧイソタイプ、ＩｇＡイソタイプ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ を含む、哺乳類、動物または囓歯類由来の免疫グロブリンドメインの使用が考慮 される。 本発明はまた、それぞれ異なるマルチペプチド分子のポリペプチド(ここで、 少なくともこれらの一つはマルチペプチド分子を形成するために互いに関連して いる)をコードする４つの異なるトランスジーンを含む細胞を含む、テトラトラ ンスジェニック生物にも関する。本発明により考慮されるトランスジェニック生 物は、存在する４つのトランスジーンの一つとして防御タンパク質をコードする トランスジーンを含むトランスジェニック生物に関する。トランスジェニック生 物細胞中に存在する防御タンパク質は、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを 形成するために、存在する場合、免疫グロブリン重鎖と集合できる。 好ましいトランスジェニック生物において、生物の細胞は、少なくとも抗原結 合ドメインの部分を有する重鎖由来免疫グロブリン、少なくとも抗原結合ドメイ ンの部分を含む免疫グロブリン由来軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパ ク質をコードする４つのトランスジーンを発現する。他の好ましいトランスジェ ニック生物において、細胞は、キメラ免疫グロブリン重鎖、ＩｇＡ重鎖由来免疫 グロブリン重鎖、ＩｇＭ重鎖由来免疫グロブリンまたは重鎖の他のアイソタイプ 由来の免疫グロブリンをコードするトランスジーンを含む。 最も好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物は植物である。 植物の種々のタイプおよび種が、本発明により考慮される。加えて、本発明はま た本発明の種々の分子を含むトランスジェニック生物である哺乳類も考慮する。 哺乳類トランスジェニック生物は本発明により考慮され、異なるポリペプチドを コードする４つのトランスジーンを含む哺乳類トランスジェニック生物を含む。図面の簡単な説明 図面を最初に簡単に説明する。 図１は、ハイブリッドＩｇＧ／Ａ重鎖の構築におけるＧuy's 13およびアルフ ァ鎖ドメインＤＮＡフラグメントの増幅に使用した合成オリゴヌクレオチドＪ１ −Ｊ５(制限酵素部位は下線を引いている)を説明する。各オリゴヌクレオチドに よりコードされる領域の相対的位置を図式的に示す。植物中に発現される種々の Ｄ ＮＡフラグメントを合わせることにより製造する得られる組換え重鎖も示す。発明の詳細な説明 Ａ．定義 双子葉植物(双子葉)：胚芽が二つの半分の種子または子葉を有する顕花植物。 双子葉の例は：タバコ；トマト；アルファルファを含むマメ科植物；オーク；カ エデ；バラ；ハッカ；カボチャ；ヒナギク；クルミ；サボテン；スミレ；および キンポウゲである。 単子葉植物(単子葉)：胚芽が一つの子葉または種子葉を有する顕花植物。単子 葉の例は：ユリ；芝生；トウモロコシ；オート麦、小麦および大麦を含む穀類； ラン；アイリス；タマネギおよびヤシである。 下等植物：シダ、裸子植物、球果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、ゼニゴケ、 ツノゴケ、コケ、紅藻類、褐藻類、配偶体、シダ植物の胞子体および緑藻類を含 む非顕花植物。 真核ハイブリッドベクター：その手段により、ポリペプチドをコードするＤＮ Ａ(挿入体)を真核細胞に挿入できるＤＮＡ。 染色体外リボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)：リボソームＲＮＡをコードする１個ま たはそれ以上の遺伝子を有し、自主的に複製する(染色体の複製と無関係)、単細 胞真核細胞内で染色体の外に見られるＤＮＡ。 回帰性ＤＮＡ：１個またはそれ以上の対称性中心を有するＤＮＡ。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。 Ｔ−ＤＮＡ：移入ＤＮＡのセグメント。 ｒＤＮＡ：リボソームＤＮＡ。 ＲＮＡ：リボ核酸。 ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ。 Ｔｉ−プラスミド：癌誘発プラスミド。 Ｔｉ−ＤＮＡ：Ｔｉ−プラスミド由来のＤＮＡのセグメント。 挿入体：構造遺伝子および所望により付加ＤＮＡ配列を含む、ｒＤＮＡに無関 係のＤＮＡ配列。 構造遺伝子：ポリペプチドをコードする遺伝子であり、適当なプロモーター、 停止配列および所望により他の調節ＤＮＡ配列を伴い、正しいリーディングフレ ームを有する。 シグナル配列：ポリペプチドを内質性細網に結合させ、ポリペプチドに結合し たアミノ酸配列をコードする、タンパク質分泌に必須である、ＤＮＡ配列。 ( 選択)遺伝子マーカー：その手段により形質転換細胞が非形質転換細胞から選 択できる、表現型形質をコードするＤＮＡ配列。 プロモーター：遺伝子の発現制御要素を発現し、それにＲＮＡポリメーラゼが 特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成(転写)を開始させる、ＤＮＡ配列また はＤＮＡ配列のグループの認識部位。 誘導性プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度を外的刺激に より調節する所のプロモーター。このような刺激は光、熱、無酸素ストレス、栄 養条件の置換、代謝物の存在または非存在、リガンドの存在、微生物攻撃、傷等 を含む。 ウイルスプロモーター：ウイルス遺伝子の５'末端に見られるプロモーターと 実質的に同一のＤＮＡ配列を有するプロモーター。典型的ウイルスプロモーター は、Ｈuang et al.，Ｃell，27:245(1981)記載のＭＭＴＶのｐ２１タンパク質を コードする遺伝子の５'末端に見られる。他の例は、Ｂenfey et al.，Ｓcience ，250:959(1990)記載のようなカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ転写物に 見られるプロモーターを含む。 合成プロモーター：生物由来よりむしろ化学的合成したプロモーター。通常合 成プロモーターはＲＮＡポリメラーゼ開始の能率を最適化するための配列変化を 含む。 構造的プロモーター：ＲＮＡポリメーラゼ結合および開始がほぼ一定あり、外 的刺激に相対的に無関係な所のプロモーター。構成プロモーターの例は、Ｐoszk owski et al.，ＥＭＢＯ Ｊ.，3:2719(1989)およびＯdell et al.，Ｎature，31 3:810(1985)により記載されたカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９ Ｓプロモーターを含む。 制御プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度が発育の特定の 時期、または生物の特定の構造またはこれらのタイプの調節の両方で制御される 所のプロモーター。制御プロモーターの例は、Ｃhua et al.，Ｓcience，244:17 4-181(1989)に記載されている。 一本鎖抗原結合タンパク質：Ｖ_L配列のカルボキシル末端をＶ_H配列のアミノ末 端に結合させるペプチドにより、免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列(Ｖ_H )につながれた免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列(Ｖ_L)ポリペプチドを有 するポリペプチド。一般に、重鎖および軽鎖抗原結合ドメインの同じポリペプチ ドへの、リンカーポリペプチドを使用した任意の組み合わせは、有用な構造を確 実にするための結合ドメインを可能にするリンカーを使用する。このような組み 合わせはＶ_H-リンカー−Ｖ_L、Ｖ_H-直接−軽鎖、またはＶ_L-直線−Ｆｄを含む。 一本鎖抗原結合タンパク質コード遺伝子：一本鎖抗原結合タンパク質をコード する組換え遺伝子。 ポリペプチドおよびペプチド：隣接残基のアルファ−アミノおよびカルボキシ 基の間のペプチド結合により他のものに結合したアミノ酸残基の連続直線。 タンパク質：ポリペプチドでのように他のものに結合した約５０アミノ酸残基 より大きい連続直線。 免疫グロブリン生産物：免疫グロブリン重鎖の少なくとも免疫活性部位を含む ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質であり、従って抗原と特異的に結合 できる。免疫グロブリン生産物の例は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分 子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子、当分野でＦａｂフラグメント、Ｆａｂ 'フラグメント、Ｆ(ａｂ')フラグメントおよびＦｖフラグメントとして知られて いる部分を含む、パラトープを含む免疫の部分である。 免疫グロブリン分子：互いに共有結合した免疫グロブリン重鎖および免疫グロ ブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含むタンパク質であり、抗原と特異的に結合で きる。 免疫グロブリン由来重鎖：免疫グロブリンの少なくとも抗原結合ドメインの部 分および免疫グロブリン重鎖の少なくとも可変領域の部分または免疫グロブリン 重鎖の少なくとも定常領域の部分を含むポリペプチド。従って、免疫グロブリン 由来重鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとアミノ酸配 列相同性の明白な領域を有する。例えば、Ｆａｂフラグメントの重鎖は、免疫グ ロブリン由来重鎖である。 免疫グロブリン由来軽鎖：免疫グロブリンの少なくとも抗原結合ドメインの部 分および少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変領域または定常領域の部分を含む ポリペプチド。従って、免疫グロブリン由来軽鎖は、免疫グロブリン遺伝子スー パーファミリーのメンバーとアミノ酸配列相同性の明白な領域を有する。 抗原結合ドメイン：抗原と特異的に結合する免疫グロブリンポリペプチドの部 分。この抗原は、典型的に、免疫グロブリン重および軽鎖の抗原結合ドメイン結 合される。しかしながら、抗原結合ドメインは単一ポリペプチド上に提示され得 る。 Ｊ鎖：免疫グロブリンの重合化および重合化免疫グロブリンの上皮細胞への輸 送に関与するポリペプチド。Ｔhe Ｉmmunoglobulin Ｈelper：Ｔhe Ｊ Ｃhain i n Ｉmmunogloburin Ｇenes，345頁，Ａcademic Ｐress(1989)参照。Ｊ鎖は、五 量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＡにみられ、典型的にジスルフィド結合により結合 している。Ｊ鎖はマウスおよびヒトの両方で研究されている。 Ｆａｂフラグメント：互いに共有結合し、抗原と特異的に結合できる免疫グロ ブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む免疫グロブリン分子の部分からなる タンパク質。Ｆａｂフラグメントは典型的に、実質的に無傷な免疫グロブリン分 子の、当分野で既知の方法を使用したパパインによるタンパク質分解的消化によ り製造される。しかしながら、Ｆａｂフラグメントは、当分野で既知の方法を使 用して、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の望ましい部分を好適な 宿主細胞中で発現させることにより製造し得る。 Ｆ_vフラグメント：互いに共有結合し、抗原と特異的に結合できる免疫グロブ リン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的活性部分を含む タンパク質。Ｆ_vフラグメントは典型的に、当分野で既知の方法を使用して、免 疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の望ましい部分を 好適な宿主細胞中で発現させることにより製造し得る。 無性繁殖：切った葉、切った幹、切った根、一個の植物細胞(原形質体)または カルスから全植物を再生することにより子孫を産生すること。 自家授粉：同植物上での雄花部分から雌花部分への花粉の移動。この工程は典 型的に種子を産生する。 交差授粉：別植物上での雄花部分から雌花部分への花粉の移動。この工程は典 型的に種子を産生し、そこから種々の子孫が成育できる。 エピトープ：免疫グロブリン生産物により特異的に認識される分子の部分。こ れはまた決定基または抗原決定基とも呼ばれる。 キメラ免疫グロブリン重鎖：異なるイソタイプまたはサブタイプまたはある別 のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の免疫グロブリン重鎖由来のアミノ 酸配列残基の一部を有する免疫グロブリン由来重鎖。典型的に、キメラ免疫グロ ブリン重鎖は、免疫グロブリン重鎖の少なくとも二つの異なるイソタイプまたは サブタイプ由来のアミノ酸残基配列を有する。 トランスジーン：動物の生殖細胞系に挿入された遺伝子。遺伝子は初期発育段 階で動物内に挿入し得る。しかしながら、遺伝子は、動物細胞に、例えば、レト ロウイルスベクターにより、遅い段階で挿入できる。 多重分子：互いに化学結合を含む手段で結合した１ペプチド以上またはポリペ プチドからなる分子。 Ｂ．防御タンパク質含有免疫グロブリン 本発明は、防御タンパク質含有免疫グロブリン分子の新規な製造法を提供する 。免疫グロブリンは、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリ ン由来重鎖と結合した防御タンパク質を含む。 本発明の防御タンパク質は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の少なくともア ミノ酸残基配列の残基１から６２７の部分に実質的に対応するまたは類似のアミ ノ酸配列を有し、アミノ酸残基６２７より大きいアミノ酸残基配列を含まないか 、ウサギ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６２７と類似のアミノ酸は含まな い前駆体タンパク質由来である。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のヌクレオチ ド 配列およびアミノ酸配列は、現在、Ｍostov et al.，Ｎature，308:37(1984)お よびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank K01291により記載されている。ポリ免疫グロブリン 受容体のヌクレオチド配列は配列番号１および対応するアミノ酸配列は配列番号 ２である。 任意の種由来のポリ免疫グロブリン受容体は、防御タンパク質として使用し得 、これらの防御タンパク質はウサギ免疫グロブリン配列のアミノ酸１−６２７と 類似のアミノ酸数より大きい数を有するアミノ酸を含まない前駆体タンパク質を 含まず、それに由来する。好ましい態様において、防御タンパク質は、任意の種 および少なくともウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸１−６０６の部分 と類似のアミノ酸を含み、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の残基６０７−７５ ５と類似のアミノ酸残基を含まない前駆体タンパク質由来である。 ヒトポリ免疫グロブリン受容体配列は、Ｋrajci et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol .，22:2309-2315(1992)およびＫrajci et al.，Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃo mm.，158-783-789(1989)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo．X73079 により決定および報告されている。ヒトポリ免疫グロブリンのヌクレオチド配列 は配列番号３および対応するアミノ酸残基配列は配列番号４である。ヒトポリ免 疫グロブリン受容体は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のものと非常な配列相 同性を有し、類似のドメイン構造を有する。Ｋraehenbuhl et al.，Ｔrends in Ｃell Ｂiol．2:170(1992)参照。ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインお よび／またはアミノ酸残基配列と類似のヒトポリ免疫グロブリン受容体の部分を 表１に示す。 ラットポリ免疫グロブリン受容体配列は、Ｂanting et al.，ＦＥＢＳ Ｌett. ，254:177-183(1989)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo．X15741によ り決定および報告されている。ラットポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配 列のヌクレオチドは配列番号９および対応するアミノ酸残基配列は配列番号１０ である。ラットポリ免疫グロブリン受容体は、ウサギおよびヒトポリ免疫グロブ リン受容体のものと非常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。Ｋ raehenbuhl et al.，Ｔ．Ｃell Ｂiol．2:170(1992)参照。ウサギポリ免疫グロ ブリン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のラットポリ免 疫グロブリン受容体の部分を表１に示す。 ウシポリ免疫グロブリン受容体配列は、ＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎ o．X81371により決定および報告されている。ウシポリ免疫グロブリン受容体ヌ クレオチド配列は配列番号５および対応するアミノ酸残基配列は配列番号６であ る。ウシポリ免疫グロブリン受容体は、ウサギおよびヒトポリ免疫グロブリン受 容体のものと非常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。ウサギポ リ免疫グロブリン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のウ シポリ免疫グロブリン受容体の部分を表１に示す。 マウスポリ免疫グロブリン受容体配列は、Ｐiskurich et al.，Ｊ．Ｉmmunol. ，150:38(1993)およびＥＭＢＬ/Ｇene Ｂank Ａccession Ｎo．U06431により決 定および報告されている。マウスポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配列は 配列番号７および対応するアミノ酸残基配列は配列番号８である。マウスポリ免 疫グロブリン受容体は、ウサギおよびヒトポリ免疫グロブリン受容体のものと非 常な配列相同性を有し、類似のドメイン構造を有する。ウサギポリ免疫グロブリ ン受容体のドメインおよび／またはアミノ酸残基配列と類似のマウスポリ免疫グ ロブリン受容体の部分を表１に示す。 広範な種由来のポリ免疫グロブリンの上記の核酸および対応するアミノ酸残基 配列に加えて、本発明は任意の種由来のポリ免疫グロブリン受容体の使用に関す る。種間のポリ免疫グロブリン受容体の保存的ドメイン構造は異なる種由来のそ れぞれのポリ免疫グロブリン受容体中の類似アミノ酸残基配列の選択を可能にす る。本発明は、ポリ免疫グロブリン由来のこのような類似アミノ酸残基配列の使 用に関する。幾つかのポリ免疫グロブリンアミノ酸配列由来の類似配列は、表１ に示す通りである。 本発明の防御タンパク質は、実質的にポリ免疫グロブリン受容体の全アミノ酸 配列より少なく含み得る。好ましい態様において、防御タンパク質はウサギの天 然ポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミノ酸残基１から６０６の部分を含 み得る。天然ポリ免疫グロブリンと異なり、本発明の防御タンパク質は天然ポリ 免疫グロブリン由来のアミノ酸残基６２７より大きい全アミノ酸残基配列を含ま ない前駆体タンパク質由来であり、従って、分泌成分より多いアミノ酸または少 ないアミノ酸を含み得る。好ましい態様において、本発明の防御タンパク質はウ サギの天然免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６０６より大きい全アミノ酸残 基配列を含まない。本発明は、防御タンパク質として、天然ポリ免疫グロブリン の部分のみを使用することを考慮する。他の態様において、防御タンパク質が、 ６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、 ６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、 ６２５、６２６のような６０６から６２７の間の全アミノ酸部分を含むアミノ酸 残基６０６から６２７の間の任意のアミノ酸で終わり得ることを考慮する。 好ましい態様において、本発明の防御タンパク質は、以下のアミノ酸セグメン トの１個またはそれ以上に対応するアミノ酸配列を有する： １）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)２１−４ ３に対応するＡＡ； ２）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)１−１１ ８に対応するＡＡ； ３）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸(ＡＡ)１１９− ２２３に対応するＡＡ； ４）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸(ＡＡ)２２４ −３３２に対応するＡＡ； ５）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸(ＡＡ)３３３− ４４１に対応するＡＡ； ６）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸(ＡＡ)４４２− ５５２に対応するＡＡ； ７）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸(ＡＡ)５５３か ら６０６または５５３から６２７に対応するＡＡ；およびウサギポリ免疫グロブ リン受容体のＡＡ残基６０７から７５５または６２８から７５５に対応するアミ ノ酸残基は含まない。 ドメインの正確な境界は約２０アミノ酸内で変化し得る。しかしながら、ドメ イン構造および境界は当業者に理解できる。 加えて、本発明は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の以下のアミノ酸残基で または以下の残基に対応するが、他の種のポリ免疫グロブリン受容体中であるア ミノ酸残基で終わる防御タンパク質に関する：５８０−６０５。 他の好ましい態様において、防御タンパク質は特定の種のポリ免疫グロブリン 受容体のアミノ酸配列に対応し、以下のアミノ酸セグメントと類似であるアミノ 酸を有する： １）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)２１−４ ３に対応するＡＡ； ２）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)１−１１ ８に対応するＡＡ； ３）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸(ＡＡ)１１９− ２２３に対応するＡＡ； ４）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸(ＡＡ)２２４ −３３２に対応するＡＡ； ５）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸(ＡＡ)３３３− ４４１に対応するＡＡ； ６）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸(ＡＡ)４４２− ５５２に対応するＡＡ； ７）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸(ＡＡ)５５３か ら６０６または５５３から６２７に対応するＡＡ；およびウサギポリ免疫グロブ リン受容体のＡＡ残基６０７から７５５または６２８から７５５に対応するアミ ノ酸残基は含まない。 他の好ましい態様において、防御タンパク質は、ウサギポリ免疫グロブリン受 容体のドメインＩ、IV、ＶおよびドメインVIのＡＡ５５０−６０６または５５０ −６２７または類似ドメイン由来のアミノ酸配列および異なる種のポリ免疫グロ ブリン受容体の領域を含む。 他の態様において、本発明の防御タンパク質は、少なくともウサギ免疫グロブ リン受容体のアミノ酸残基１−６２７と類似の種のポリ免疫グロブリン受容体由 来のアミノ酸残基の部分と実質的に対応するアミノ酸残基を有する。このアミノ 酸配列の部分は、この種の少なくとも細胞外ドメインの部分と対応する。 好ましい態様において、本発明の防御タンパク質は、少なくともウサギポリ免 疫グロブリン受容体のアミノ酸残基１−６０６のアミノ酸と類似の種のポリ免疫 グロブリン受容体由来のアミノ酸残基の部分と実質的に対応するアミノ酸配列を 有する。 他の好ましい態様において、本発明の防御タンパク質は、少なくとも以下のア ミノ酸残基配列の部分に対応するまたは類似(ウサギ以外の種由来であれば)のア ミノ酸残基配列を有する： １）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)２１−４ ３に対応するＡＡ； ２）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸(ＡＡ)１−１１ ８に対応するＡＡ； ３）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸(ＡＡ)１１９− ２２３に対応するＡＡ； ４）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸(ＡＡ)２２４ −３３２に対応するＡＡ； ５）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸(ＡＡ)３３３− ４４１に対応するＡＡ； ６）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸(ＡＡ)４４２− ５５２に対応するＡＡ； ７）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸(ＡＡ)５５３か ら６０６または５５３から６２７に対応するＡＡ；およびウサギポリ免疫グロブ リン受容体のＡＡ残基６２８から７５５に対応するアミノ酸残基は含まない。 他の好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、ウサギポリ免疫グロ ブリン受容体の少なくともアミノ酸残基１から６０６または１から６２７の部分 と実質的に対応する第１のアミノ酸を有し、該第１アミノ酸に続いて第２アミノ 酸残基配列を有し、第２アミノ酸残基配列は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体 の膜通過セグメントに対応するアミノ酸残基配列を有しない。 より好ましい態様において、第２アミノ酸残基配列は、少なくともポリ免疫グ ロブリン受容体のアミノ酸残基６５５から７５５に対応するアミノ酸配列の部分 を有する。他の好ましい態様において、第２アミノ酸残基は、少なくとも１個ま たはそれ以上の以下の部分を有する：ポリ免疫グロブリン分子の細胞内ドメイン 、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーのドメイン、酵素、毒素 またはリンカー。 本発明は、ウサギポリ免疫グロブリンの膜通過セグメントに対応するアミノ酸 残基を含まないが、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞内ドメインに対応す るアミノ酸を有し得る防御タンパク質に関し、これは受容体の欠損変異体である 。 他の態様において、本発明の防御タンパク質は、特定の種のポリ免疫グロブリ ンの細胞外ドメインの少なくとも一つに実質的に対応するアミノ酸配列を有する 。防御タンパク質は、そのアミノ酸配列のセグメントが一つの種のポリ免疫グロ ブリン受容体の細胞外ドメインに実質的に対応し、そのアミノ酸配列の異なるセ グメントは第２の種由来であり、異なる種の細胞外ドメインに実質的に対応する ものである、アミノ酸配列を有し得る。本発明は、防御タンパク質が、一つの種 のポリ免疫グロブリン受容体の細胞外ドメインに実質的に対応するアミノ酸配列 セグメントを有し、および同ドメイン中に異なる種のポリ免疫グロブリン受容体 のアミノ酸および配列に対応する第２アミノ酸配列を有する、態様に関する。従 って、防御タンパク質は異なる種由来のポリ免疫グロブリン受容体に対応するア ミノ酸配列から成る個々のドメインまたは特定ドメインの一部を有し得る。 他の態様は、そのアミノ酸配列が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバ ーの分子由来のアミノ酸配列の部分を有する防御タンパク質に関する。Ｉmmunog lobulin Ｇenes，361頁，Ａcademic Ｐress(Ｈonjo ＡltおよびＲabbits編，198 9)中のＷilliamsおよびＢarclay，“Ｔhe Ｉmmunoglobulin Ｓuperfamily”参照 。これら由来の部分は、免疫グロブリンスーパーファミリー分子由来のペプチド 、ドメインまたは多重ドメインをコードするアミノ酸配列を含み得る。 本発明はまた、少なくともウサギポリ免疫グロブリン受容体ヌクレオチド配列 のアミノ酸１−６０６または１−６２７の部分をコードする第１ヌクレオチド配 列を有し、第１ヌクレオチド配列の機能的膜通過セグメント３'をコードするヌ クレオチドを有しない防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。 更に好ましい態様は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体配列のアミノ酸１−６０ ６または１−６２７をコードする、第１ヌクレオチド配列の３'位に位置する第 ２ヌクレオチド配列を含む。この第２ヌクレオチド配列は、ウサギポリ免疫グロ ブリン受容体または他のポリ免疫グロブリン受容体の細胞内ドメインの部分また は免疫グロブリンスーパーファミリー分子の部分を含む種々の分子をコードし得 る。加えて、第２ヌクレオチド配列が種々のエフェクター分子、酵素、毒素等を コードする態様に関する。好ましい態様は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体ま たは他の種由来のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６５５から７５５に 対応するアミノ酸残基をコードする第２ヌクレオチド配列を含む。 本発明は、また、発現のために操作可能に結合した防御タンパク質をコードす るヌクレオチ配列を含む発現ベクターに関する。これらの発現ベクターは、ヌク レオチド配列を特定細胞中で発現させるために、ヌクレオチドを転写および発現 させるプロモーター配列の３'に置く。発現ベクターは、またこの転写の効率を 改善する種々のエンハンサー配列も含み得る。加えて、ターミネーター、ポリア デニル化(ポリＡ)部位および他の３'末端処理シグナルのような配列が特定細胞 中で転写されるヌクレオチド配列の量を促進するために含まれ得る。 好ましい態様において、この防御タンパク質は、少なくとも抗原結合ドメイン の部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と関係している免疫グロブリンの部分で ある。少なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブリン由来重鎖は当分 野で既知であり、例えば、Ｈuse et al.，Ｓcience，246:1275(1989)、Ｌerner およびＳorge，ＰＣＴ出願ＷＯ／１４４３０、１９９０年１１月２９日公開に記 載されている。これらの刊行物の記載は、本明細書に参考として包含させる。 他の態様において、本発明の免疫グロブリンは、防御タンパク質および免疫グ ロブリン由来重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、免疫グロブリン由来重鎖に 関しては、少なくとも抗原結合部位を含む。少なくとも抗原結合ドメインの部分 を有する免疫グロブリン軽鎖は当分野で既知であり、種々のものに記載されてい る。例えば、ＥarlyおよびＨood，Ｇenetic Ｅngineering，Ｓetlow＆Ｈollaend er(編)，Ｖol．3，Ｐlenum Ｐublishing Ｃorp.，Ｎew Ｙork(1981)157-188；お よびＫabat et al.，Ｓequences of Ｉmmunologic Ｉnterest，Ｎational Ｉnst itutes of Health，Ｂethesda，Ｍaryland(1987)参照。本明細書に記載のすべて の参考文献の記載は、本明細書に参考として包含する。 複合体の免疫グロブリン成分(アルファ、Ｊ、カッパまたはラムダ)は、ポリペ プチドの完全な長さの全てまたは一部を含むことができる。これらの鎖の一部は 全鎖に代わって使用し得る。例えば、完全免疫グロブリンアルファ重鎖は、可変 領域に置換し得、アルファ定常領域のみが他の成分との集合を可能にするのに充 分である。同様に、定量領域の小さい部分しか含まない切断カッパまたはラムダ 鎖を完全な長さのカッパまたはラムダ鎖と置き換えることができる。複合体の必 須条件は、防御タンパク質を結合する能力である。 切断成分に加えて、本発明は異なるタイプの免疫グロブリンの組み合わせに関 する。例えば、ＩｇＧのＣ_H１およびＣ_H２領域、続いてＩｇＡ由来のＣ_H２およ びＣ_H３領域を含む重鎖定常領域は防御タンパク質を含む安定な複合体を形成す る。これは、例として特記する。 本発明の防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、好ましくは、免疫グロブリ ン重鎖が免疫グロブリンＪ鎖と結合するのを可能にし、それにより防御タンパク 質と結合するのを可能にする、少なくともＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖の部分を含む 。本発明の免疫グロブリン重鎖がＩｇＡ重鎖またはＩｇＭ重鎖または他の重鎖の イソタイプの個々ドメインから成り得ることが考慮される。ＩｇＡまたはＩｇＭ 以 外の免疫グロブリン重鎖由来の免疫グロブリンドメインが免疫グロブリンＪ鎖と 結合するのに分子操作し得、即ち、本発明の免疫グロブリンを製造するのに使用 し得ることも考慮される。 当業者は、免疫グロブリンが約１００から１１０アミノ酸残基であるドメイン から成ることを理解できる。これらの種々のドメインは当分野で既知であり、既 知の境界を有する。単一ドメインの除去および他の抗体分子のドメインとの置換 は現在の分子生物学で容易に達成される。ドメインは鎖間ジスルフィド結合で安 定化している球状構造である。これは、別々の形を付与し、ドメインを他の同様 な形のドメインとの置換または交換できる内蔵ユニットにする。免疫グロブリン の重鎖定常領域は、そのドメインを含む特定の分子に抗体エフェクター機能とし て知られている種々の特性を付与する。エフェクター機能の例は、補体固定、胎 盤移動、ブドウ球菌タンパク質への結合、連鎖球菌タンパク質Ｇへの結合、単核 細胞、好中球または肥満細胞および好塩基球への結合を含む。特定のドメインお よび特定の免疫グロブリンとこれらのエフェクター機能の関係は既知であり、例 えば、Ｉmmunology，Ｒoitt et al.，Ｍosby Ｓt．Ｌouis，Ｍissouri(1993第３ 版)に記載されている。 本発明の免疫グロブリンは、防御タンパク質に加えて、免疫グロブリン由来重 鎖に結合した免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリンＪ 鎖を含み得る。好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、免疫グロブ リン由来重鎖の少なくとも一つに結合した、２個または４個の免疫グロブリン由 来軽鎖およびＪ鎖と共に２個または４個の免疫グロブリン由来重鎖を有する。免 疫グロブリンＪ鎖は記載され、当分野で既知である。例えば、Ｍ．Ｋoshland， Ｔhe Ｉmmunoglobulin Ｈelper：Ｔhe Ｊ Ｃhain，Ｉmmunoglobulin Ｇenes，Ａ cademic Ｐress，Ｌondon，345頁，(1989)およびＭatsuuchi et al.，Ｐroc．Ｎ atl．Ａcad．Ｓci．USA，83:456-460(1986)参照。免疫グロブリンＪ鎖の配列は 、米国に拠点を置く種々のデータから入手可能である。 本発明の免疫グロブリンは、少なくとも免疫グロブリン由来重鎖と会合した防 御タンパク質を有する。この会合は、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、 イオン性相互作用またはこれらの種々の結合の組み合わせであり得る。典型的に 、免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の間のジス ルフィド結合により互いに結合している。防御タンパク質と免疫グロブリンの相 互作用は、非共有またはジスルフィド結合である。 防御タンパク質、免疫グロブリン由来重鎖および所望により免疫グロブリン由 来軽鎖およびＪ鎖を含む本発明の免疫グロブリンは、典型的に以下のものの一つ で互いに結合する：水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン性相互作用 またはこれらの種々の結合の組み合わせ。本発明は、必要な免疫グロブリン重、 軽および／またはＪ鎖部分が単一ポリペプチド中にあり、抗原および防御タンパ ク質を結合させるのに機能する分子に関する。このようなタンパク質の例は、一 本鎖抗原結合タンパク質である。 本発明は、免疫グロブリンＪ鎖の全てまたは一部をコードするＤＮＡセグメン トおよび免疫グロブリンアルファ鎖の全てまたは一部をコードするＤＮＡセグメ ントおよび免疫グロブリンカッパ鎖または免疫グロブリンラムダ鎖の何れかの全 てまたは一部をコードするＤＮＡセグメントの生物への挿入；および防御タンパ ク質の同生物への挿入(ここで、防御タンパク質は、セグメントが機能的膜伸長 領域を含むアミノ酸残基を含まない前駆体タンパク質由来であり、アミノ酸配列 が膜伸長領域の開始(ウサギポリ免疫グロブリン受容体の約残基６３０)からタン パク質のカルボキル末端(ウサギポリ免疫グロブリン受容体の約残基７５５)が完 全に無傷である前駆体タンパク質由来のセグメントであるように、少なくともウ サギポリ免疫グロブリン受容体(ｐＩｇＲ)アミノ酸残基配列のアミノ酸残基１か ら残基６０６のセグメントまたは他の種由来の類似アミノ酸残基を含む)：の工 程を含む、多量体免疫グロブリンを集合させる方法に関する。好ましい態様にお いて、前駆体タンパク質はウサギポリ免疫グロブリンまたは他の種由来の類似ア ミノ酸残基の６０６以上のアミノ酸残基を含まない。 当業者に理解されるように、膜伸長領域または機能的膜通過セグメントは、全 ての残基が荷電しておらず、事実上、全ての残基が疎水性または非極性である、 約２０から約３０アミノ酸からなるアミノ酸残基の隣接領域から成り、セグメン トはアルファ螺旋を形成している。機能的膜通過セグメントは、生体膜の伸長を できる。膜伸長領域は荷電残基により固定できる。ｐＩｇＲの膜伸長領域の例は 、ウサギのポリ免疫グロブリン受容体アミノ酸残基配列の残基６３０から６５３ である。 防御タンパク質を含む免疫グロブリンを形成する鎖は、タンパク質のアミノ末 端にシグナル配列を含む前駆体由来であり得る。各成分は、従って、膜内システ ムに統合され、そこで集合が起こる。シグナル配列に加えて、複合体の種々の生 物が、Ｎ末端糖付加または複合体の構造に影響を与えることができる種々の他の 修飾のための付加シグナルを含み得、または含み得ない。本発明の一つの態様に おいて、糖付加のためのシグナル(即ち、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはスレ オニンまたはＯ−結合糖付加のシグナル)は存在しないか、ヌクレオチド配列内 の多少の場所に存在する。従って、得られる抗体は炭水化物を含まず、炭水化物 が免疫応答を誘発する投与において、有利であり得る。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは免疫グロブリン由来重鎖と 会合した防御タンパク質を含み、防御タンパク質はＮ−結合および／またはＯ− 結合オリゴサッカライドを含まない。当業者は、そのアミノ酸残基配列内にＮ− 結合糖付加シグナルアスパラギン−Ｘ−セリン(ここで、Ｘは恐らくプロリンお よびアスパラギン酸以外のアミノ酸残基)を有するポリペプチドをコードする遺 伝子が、植物細胞に挿入したとき、配列のアスパラギン残基(Ｎ−結合)と結合し たオリゴサッカライドにより糖付加されることを理解する。糖付加シグナルとし て機能するポリペプチド配列の一般的レビューのために、Ｍarshall，Ａnn．Ｒe v．Ｂiochem.，41:673(1972)およびＭarshall，Ｂiochem．Ｓoc．Ｓymp．40:17( 1974)参照。これらのシグナルは、哺乳類および植物細胞の両方で認識される。 当業者は、Ｎ−結合糖付加シグナルが本発明の防御タンパク質をコードするＤＮ Ａ配列を変化させるための通常の変異誘発法を使用して容易に除去し得ることを 理解する。この変異誘発は、典型的に、Ｎ−結合糖付加シグナル欠損を有するオ リゴヌクレオチドの合成および、次いで、その中に挿入される該オリゴヌクレオ チド配列とのＤＮＡ鎖の製造を含む。このような変異誘発法および試薬はＳtrat ag ene(Ｌa Ｊolla，ＣＡ)のような多くの源から商品として入手可能である。 マルチペプチド分子(例えば、免疫グロブリン)を形成する個々のポリペプチド の集合は、単一細胞中に、直接全ての個々のポリペプチドをコードするトランス ジーンをその細胞に連続して、または全て一度に挿入して発現させることにより 得られ得る。ポリペプチドをコードするトランスジーンは、個々の構築物または ＤＮＡセグメントに存在し得るか、またはＤＮＡセグメントまたは構築物中に、 １個またはそれ以上のトランスジーンと共に含まれ得る。 これらの成分の集合は、Ｍendelにより最初に述べられたような交差授粉によ りでき、全ての鎖を発現する分離体の集団を製造する。先の記載は、これが多量 体糖付加体の集合および共分離に適した方法であることを証明する。米国特許第 ５,２０２,４２２号の記載は本明細書に参考として包含し、これらの方法を記載 する。本発明の好ましい態様において、グリカンの減少した数を含む抗体分子お よびグリカンの無い抗体分子が考慮される。 防御タンパク質、免疫グロブリン由来重鎖および所望により免疫グロブリン由 来軽鎖、およびＪ鎖を含む本発明の免疫グロブリンは、Ｎ−結合オリゴサッカラ イドの無い防御タンパク質を含み得る。 防御タンパク質を含む本発明の免疫グロブリンは、好ましくは動物における疾 病を予防するのに有用な治療的免疫グロブリンである。好ましい態様において、 本発明の免疫グロブリンは、粘膜病原体抗原と結合できる。他の好ましい態様に おいて、本発明の治療的免疫グロブリンは、虫歯を防止できる。最も好ましい態 様において、防御タンパク質を含む本発明の免疫グロブリンは、Ｓ．mutans血清 型ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ(新しい命名法ではＳ．mutans血清型ｃ、ｅ およびｆ；およびＳ．sobrinus血清型ｄおよびｇ)由来の抗原に結合できる抗原 結合ドメインを含む。このような抗原結合ドメインは当分野で既知であり、例え ば、米国特許第５,３５２,４４６号、Ｊ．Ｋ-Ｃ．Ｍa et al.，Ｃlin．Ｅxp．Ｉ mmunol．77:331(1989)；およびＪ．Ｋ-Ｃ Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．24 ：131-138(1994)；米国特許第５,３５２,４４６号；米国特許第４,５９１,２４ ４号；および欧州特許公開第３７１０１７Ｂ１号に記載の結合ドメインを含む。 これらの刊行物の記載は、本発明に参考として包含する。好ましい態様において 、本発明の免疫グロブリンは、動物またはヒトのいずれかに治療活性を有する組 成物の一部である。治療的免疫グロブリンの例は多いが、我々は、最も適切な治 療効果を、食用植物由来の組成物の直接経口投与による粘膜および腸病原体の予 防と意図する。 治療的組成物の投与は、植物または他のトランスジェニック生物からの抽出前 または後にできる。一度抽出すれば、免疫グロブリンはまたサイズ排除、イオン 交換または親和性クロマトグラフィーにより更に精製もし得る。好ましい態様に おいて、トランスジェニック生物は食用植物であり、複合体の投与は、部分的精 製後の摂取による。植物分子は複合体と共投与し得る。 本発明はまた植物由来分子および動物由来分子が変化できることも考慮する。 ＲuＢisＣoまたはクロロフィルのような特定植物タンパク質は、水を除く抽出物 の質量の最小１％または最大９９.９％であり得る。 本発明はまた防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む治療的植物抽出物 の、特異的治療成分、例えば、抗体の更なる精製無しの直接の使用を含む。投与 は、局所、経口摂取または抗体を粘膜標的病原体に送達させるのに適切な他の方 法により得る。この投与形態は、直接注射または血流内への治療的植物抽出物の カミングリング(comingling)を含む非経口投与と区別する。 本発明はまた抽出物の味または風味を操作した後の、防御タンパク質を有する 免疫グロブリンを含む治療的植物抽出物の使用にも関する。ゲル化物質または香 味剤の適当な量は例えば、直接経口投与による抗体の標的病原体への接触を促進 するために添加できる。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、動物の粘膜表面と予め選 択したリガンドを結合できる、本発明の防御タンパク質を含む免疫グロブリンを 含む組成物を接触させることにより、予め選択したリガンドに対して動物を受動 的に免疫化するのに使用する。受動免疫は大量の抗体を必要とし、広範な使用の ために、この抗体は安価でなければならない。 予め選択した抗原と結合できる防御タンパク質を含む免疫グロブリン分子は植 物細胞中で効率的におよび経済的に製造できる。好ましい態様において、免疫グ ロブリン分子は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、分泌型ＩｇＭまたは分泌型ＩｇＡまたはキメ ラ免疫グロブリン重または軽鎖を有する免疫グロブリンである。 防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、タンパク質分解および変性に耐性で あり、したがって、厳しい環境での使用に望ましい。考慮される厳しい環境は、 酸性環境、プロテアーゼ含有環境、高温環境および他の厳しい環境を含む。例え ば、動物の胃腸管は、プロテアーゼおよび酸の両方が存在し、厳しい環境である 。Ｋobayashi et al.，Ｉmmunochemistry，10:73(1973)参照。 これらのより耐性な本発明の免疫グロブリンを使用した動物の受動免疫は、防 御タンパク質を含む免疫グロブリンと動物の粘膜表面を接触させることにより作 る。動物は、肺、消化管、鼻咽頭腔、尿生成システム等を含む種々の粘膜表面を 有する。典型的にこれらの粘膜表面は、唾液、涙液、鼻水、気管気管支液、腸液 、胆汁、子宮頸液等のような種々の分泌物を製造する細胞を含む。 好ましい態様において、防御タンパク質を含む免疫グロブリンは、予め選択し た抗原に免疫特異的である。典型的に、この抗原は壊死性全腸炎、下痢疾患、潰 瘍および腸への癌源物質吸収による癌のような粘膜表面に関連する疾病をもたら す病原体に存在する。例えば、ＭcＮabbおよびＴomasi，Ａnn．Ｒevl．Ｍicrobi ol.，35:477(1981)およびＬawence et al.，Ｓcience，243:1462(1989)参照。粘 膜表面と関連した疾病をもたらす典型的病原体は、Ｅ．coli、Ｓ．typhimurium 、Ｖ．cholera、Ｈ．pyloriおよびＳ.mutansのような細菌性およびウイルス性病 原体の両方を含む。本発明に参考として包含する、欧州特許出願第４８４１４８ Ａ１号、５／６／９２公開もまた参照。本発明の免疫グロブリンはこれらの病原 体と結合でき、粘膜関連疾患をもたらすのを予防する。 Ｓ．mutansと結合でき、虫歯の予防をする免疫グロブリンは、本明細書に参考 として包含する欧州特許明細書第３７１,０１７号に記載されている。米国特許 第５,３５２,４４０号の記載もまた本明細書に参考として包含する。 細菌感染または癌腫に対して有効である防御タンパク質を含む本発明の治療的 免疫グロブリンが考慮される。治療的活性を有するモノクローナル抗体は、本明 細書に参考として包含する米国特許第４,６５２,４４８号、第４,４４３,５４９ 号および第５,１８３,７５６号に記載されている。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは、植物材料および予め選択 したリガンドと結合できる本発明の免疫グロブリンを含む、動物粘膜表面と接触 する組成物の一部である。植物材料は植物細胞壁、植物細胞小器官、植物細胞質 、無傷植物細胞、生存植物等であり得る。この植物細胞材料は、約１０,０００ グラムの植物材料対約１００ナノグラムの免疫グロブリンから存在する１０グラ ムの免疫グロブリンについて約１００ナノグラムの植物材料の範囲で存在する。 より好ましい態様において、植物材料は約１０,０００グラムの植物材料対存在 する免疫グロブリンの各１グラムから存在する１グラムの免疫グロブリンについ て約１００ナノグラムの植物材料の範囲で存在する。他の好ましい態様において 、植物材料は、存在する免疫グロブリン１ミリグラムについて約１０,０００グ ラムの植物材料から存在する５００ミリグラムの免疫グロブリンについて約１ミ リグラムの植物材料の範囲で存在する。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンを含む組成物は治療的組成物 である。活性成分としてポリペプチドまたはタンパク質を含む治療的組成物の製 造は当分野で周知である。治療的組成物は液体または懸濁液であり得、摂取前に 溶液にするまたは液体中に懸濁させるのに適当な固体形も製造し得る。活性治療 的成分は典型的に薬学的に許容され、活性成分と適合する無機および／または有 機担体と混合する。担体は典型的に、治療的組成物に添加したとき１個またはそ れ以上の不活性物質を含む薬学的に許容される賦形剤であり、組成物に適当な濃 度および形を付与する。適当な担体は、例えば、水、食塩水、デキストロース、 グリセロール等およびこれらの混合物である。加えて、望ましい場合、組成物は 活性成分の効果を促進する湿潤剤または乳濁剤およびｐＨ緩衝剤のような補助物 質を少量含むことができる。栄養価値を有する担体を含む治療的組成物もまた考 慮される。 本発明の防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む組成物を哺乳類の歯ま たは口に適用する態様において、慣用法を使用し得る。このような組成物を歯に 適用する方法は既知であり、種々の目的のために種々の物質で適用されている。 例えば、組成物は、歯の表面に本組成物を塗ることにより直接適用し得る。ある いは、本発明の組成物を、最後に歯に適用される、練り歯磨き、うがい薬、チュ ーインガム、甘味錠剤またはジェルに含ませ得る。ある製剤において、組成物、 したがって防御タンパク質を含む免疫グロブリンの歯への接触を延長する製剤の 提供が望ましいことがある。この目的の製剤は既知であり、歯を覆うのに使用さ れている種々の歯科用トレイ(dental tray)および種々の条件に併せて歯に使用 される他の歯科用道具に置き得る。 特定適用中の歯に適用すべき組成物の正確な量は、このような処置が一定間隔 で容易に繰り返し得るため、厳密ではない。例えば、練り歯磨きに存在する組成 物は歯に練り歯磨きを使用した全ての場合、典型的に一日２回適用される。例え ば、防御タンパク質を有する免疫グロブリンの１０から１００マイクログラムの 程度を各歯に、組成物が歯に適用される各場合に適用できる。しかしながら、有 害作用なしに使用し得る、本発明の免疫グロブリンを多かれ少なかれ有する組成 物の適用として、特定適用期間中に適用し得る範囲の限定と取るべきではない。 本発明の免疫グロブリンのより低い濃度での使用は、ある点で、このような製剤 により提供される防御の減少をもたらす。 本発明の組成物の正確な製剤は使用する適用法および適用頻度に依存して変化 し得る。一般に、適切なｐＨを有し、本発明の防御タンパク質を有する免疫グロ ブリンを不活性にする物質を有しない製剤であり得る。例えば、本発明の組成物 は、本発明の組成物は、溶液１００マイクロリットル当たり組成物が免疫グロブ リンで０.１から１０ミリグラムで全体に分散している単純水性溶液として適用 し得る。一般に、このような溶液は、歯当たり約１から１０マイクロリットルの 溶液で歯科手術中に適用される。 自己投与用に設計された本発明の組成物の製剤は、変化し得、それを使用する 生産物の適用頻度を考慮に入れて製剤する。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンを含む組成物は、病原体抗原 に免疫特異的な免疫グロブリン分子を含む。病原体は、他の生物の疾病の原因と なる生物である。特に好ましくは、免疫グロブリンが粘膜病原体抗原に免疫特異 的である。粘膜病原体抗原は、粘膜組織を経由して生物に侵入するかまたは粘膜 関連疾病をもたらす病原体に提示される。粘膜病原体は肺病原体、鼻病原体、胃 腸病原体、口病原体等を含む。病原体の一般的記載として、含まれる粘膜病原体 は、Ｄavis et al.，Ｍicrobiology，第３版，ＨaperおよびＲaw，Ｈagerstown ，ＭＤ(1980)参照。 病原体に免疫特異的な抗体は標準モノクローナル抗体製造法により製造し得る 。Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｈarlow et al.編，Ｃold Ｓpring Ｈabor，ＮＹ(1988)参照。軽鎖および重鎖可変領域をコードする遺伝子は、次い で、ポリメラーゼ連鎖反応および適切な選択プライマーの使用により単離できる 。Ｏrlandi et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ，86:3833(1989)およ びＨuse et al.，Ｓcience，246:1275(1989)参照。次いで、可変領域を植物発現 ベクターに、Ｈiatt et al.，Ｎature，342:76-78(1989)記載の発現ベクターの ように挿入する。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは胃腸病原体抗原に免疫特異 的である。特に好ましくは、免疫グロブリンが胃腸管の疾病をもたらす細菌、ウ イルスおよび寄生虫、例えば、Ｅ．coli、Ｓalmonellae、Ｖibrio cholerae、Ｓ almonellae typhimurium、ＳhigellaおよびＨ．pyloriのような胃腸病原体に免 疫特異的である。 他の好ましい態様において、組成物に存在する防御タンパク質に含まれる免疫 グロブリンは、Ｓtreptococcus mutans等のような歯科病原体に免疫特異的な免 疫グロブリン分子である。特に好ましくは、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ 15B2(ＡＴＣＣ番号 HB8510)；ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・ セルズ受託番号86031901で寄託のハイブリドーマ；およびＭa et al.，Ｅur．Ｊ ．Ｉmmunol.，24:131(1994)およびＳmithおよびＬehner，Ｏral Ｍicro．Ｉmmun ol．4:153(1989)に記載のＧuy's１３モノクローナル抗体により製造される免疫 グロブリンのようにＳtreptococcus mutansに免疫特異的である。 本発明は、脊椎動物のような動物における受動免疫を製造することに関する。 好ましい態様において、受動免疫は魚、鳥、爬虫類、両性類または昆虫で製造さ れる。他の好ましい態様において、受動は、ヒト、家畜、例えば反芻動物、ウシ 、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等の哺乳類で製造される。特に好ましい態様において 、受動免疫は成熟または幼少哺乳類で製造される。 好ましい態様において、受動免疫は、離乳し、したがってもはや母親から乳を 哺乳しない哺乳類のような動物において製造する。受動免疫は、このような動物 において、動物に予め選択したリガンドに免疫特異的な防御タンパク質を含む免 疫グロブリンを含む組成物を、動物に免疫グロブリンの予防的濃度を作るのに充 分な量を動物に投与することにより製造する。免疫グロブリンの予防的濃度は、 存在する病原体に結合し、その病原体が動物中で検出可能な疾病をもたらすのを 予防するのに充分な量である。予防的濃度を作るのに必要な本発明の免疫グロブ リンを含む組成物の量は、動物の大きさ、存在する病原体の量、特定免疫グロブ リンの病原体への親和性、特定免疫グロブリンが動物内でその活性部位に送達さ れる効率等により、当分野で既知のように変化する。 Ｃ．防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む真核細胞 本発明は、本発明の免疫グロブリンを含む植物細胞を含む真核細胞に関する。 本発明はまた本発明の免疫グロブリンの種々の成分をコードするヌクレオチド配 列を含む植物細胞にも関する。当業者は、防御タンパク質および種々の免疫グロ ブリン重鎖および軽鎖およびＪ鎖をコードするヌクレオチド配列が、典型的には プロモーターに操作可能に結合し、発現ベクターまたはカセットの一部として存 在することを理解する。 免疫グロブリン重および軽鎖遺伝子、およびＪ鎖遺伝子を単離した後、それら は典型的に発現ベクター中の転写プロモーターと操作可能に結合させる。 選択した生物中での成分の発現は、プラスミドの非依存的複写または染色体の 永久成分または成分をコードする転写物を一時的に発生し得るＤＮＡ断片に由来 する。形質転換に好適な生物は原核または真核のいずれでもよい。複合体の成分 の挿入は、直接ＤＮＡ形質転換、生物への弾道送達によるかまたは例えば、植物 細胞上の組換えＡgrobacteriaの活性化のように、他の生物により媒介されるこ とができる。トランスジェニック生物におけるタンパク質の発現は、通常、適当 なプロモーター要素およびポリアデニル化シグナルの共挿入を必要とする。本発 明の一つの態様において、プロモーター要素は植物の細胞の全てにおける成分の 構造的発現をもたらす可能性がある。多くのまたは全ての細胞で起こる構造的発 現は、前駆体が、集合が起きるために必要な同じ細胞性膜内システムを占領する ことができることを確認する。 宿主細胞と適合する発現ベクター、好ましくは植物細胞と適合するものを、本 発明の遺伝子の発現に使用する。植物中での遺伝子の発現に有用な典型的発現ベ クターは当分野で既知であり、Ｒogers et al.，Ｍeth．in Ｅnzymol.，153:253 -277(1987)記載のようなＡgrobacterium tumefaciensの癌誘発(Ｔｉ)プラスミド である。しかしながら、幾つかの他の発現ベクターシステムが植物中で機能する ことが知られている。例えば、Ｖerma et al.，ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／００５ ５１；およびＣockingおよびＤavey，Ｓcience，236:1259-1262(1987)参照。 上記の発現ベクターはプロモーターを含む発現制御要素を含む。発現すべき遺 伝子は発現ベクターに操作可能に結合し、プロモーター配列がＲＮＡポリメラー ゼ結合および所望のポリペプチドコード遺伝子の合成を指示できる。遺伝子の発 現において有用なのは、誘導可能、ウイルス性、合成、構造的および制御プロモ ーターである。発現ベクターおよび結局どのプロモーターに、本発明の免疫グロ ブリンをコードするヌクレオチド配列が操作可能に結合するかの選択は、当分野 で既知のように、直接、望ましい機能的特性、例えば、タンパク質発現の位置お よび時期および形質転換すべき宿主細胞に依存し、これらは構築組換えＤＮＡ分 子の分野で本来制限される。しかしながら、本発明の実施に好ましい発現ベクタ ーは、それが操作可能に結合しているＤＮＡセグメントに含まれるポリペプチド コード遺伝子の、少なくとも複製および好ましくはまた発現の指示ができる。 好ましい態様において、遺伝子の発現に使用する発現ベクターは、植物細胞で 有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい医薬耐 性マーカーは、その発現がカナマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわち、Ｒog ers et al，Ｍethods Ｆor Ｐlant Ｍolecular Ｂiology，Ａ．Ｗeissbachおよ びＨ．Ｗeisscach編，Ａcademic Ｐress Ｉnc.，Ｓan Ｄieco，ＣＡ(1988)記載 のようなノパリン合成プロモーター、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼIIおよびノパリンシンターゼ３'非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。 植物中の異種遺伝子を発現するための発現ベクターおよびプロモーターは、本 明細書に参考として包含させる米国特許第５,１８８,６４２号；第５,３４９,１ ２４号；第５,３５２,６０５号および第５,０３４,３２２号に記載されている。 種々の方法が、ＤＮＡをベクターに、相補的粘着性末端により操作可能に結合 させるために開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラックを挿入する ＤＮＡセグメントに付加でき、次いで、相補的ホモポリマー尾の間の水素結合に より結合させ、組換えＤＮＡ分子を形成できる。 あるいは、１個またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リン カーをＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合させるのに使用できる。合成リン カーを平滑末端ＤＮＡセグメントを大過剰の合成リンカー分子と、バクテリオフ ァージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端のライゲーションを触媒できる酵素 の存在下でインキュベートすることにより結合できる。従って、反応生産物は、 その末端に合成リンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡ セグメントを、次いで、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させ、これらの合 成リンカーと適合する末端を作った酵素で開裂した発現ベクターにライゲートす る。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｎew Ｅngland Ｂio Ｌabs，Ｂerverly，ＭＡを含む多くの源から商品として入手可能である。 本発明の防御タンパク質および他の免疫グロブリンをコードするヌクレオチド 配列を、同じ植物細胞中に、直接またはそれぞれの成分を植物細胞に挿入し、植 物を再生し、種々の生物を交差ハイブリダイズし、全ての必要な成分を含む最終 植物細胞を作ることにより挿入する。 本発明の免疫グロブリンの成分をコードするヌクレオチド配列を真核細胞に挿 入するのに任意の方法が使用し得る。例えば、遺伝子を植物に挿入する方法は、 Ａgrobacterium媒体植物形質転換、原形質形質転換、花粉への遺伝子移入、生殖 器官への注入および非成熟胚への注入を含む。これらの方法のそれぞれは、明白 な利点および欠点がある。従って、遺伝子を特定の真核細胞または植物腫に挿入 する一つの特定の方法が、必ずしも他の真核細胞または植物細胞で最も有効では ない。 Ａgrobacterium tumefaciens媒体移入は、ＤＮＡを全植物組織に挿入でき、原 形質から無傷細胞を再生する必要を迂回できるため、遺伝子を植物へ挿入するの に広範に適用可能なシステムである。Ａgrobacterium媒体発現ベクターの、ＤＮ Ａを植物細胞へ挿入するための使用は当分野で既知である。例えば、Ｆraley et al.，Ｂiotechnology 3:629(1985)およびＲogers et al.，Ｍethods in Ｅnzym ology，153:253-277(1987)記載の方法参照。更に、Ｔｉ−ＤＮＡの統合は僅かな 再配列をもたらす相対的に精密な方法である。形質転換すべきＤＮＡの領域は広 い配列により定義され、介在ＤＮＡを、通常、Ｓpielmann et al.，Mol．Ｇen． Ｇenet.，205:34(1986)およびＪorgensen et al.，Ｍol．Ｇen．Ｇenet.，207:4 71(1987)記載のように植物ゲノム中に挿入する。現在のＡgrobacterium形質転換 ベクターは、Ｅscherichia coliおよびＡgrobacteriumu中で複製でき、Ｋlee et al.，Ｐlant ＤＮＡ Ｉnfectious Ａgent，Ｔ．ＨohnおよびＪ．Ｓchell編，Ｓ pringer-Ｖerlag，Ｎew Ｙork(1985)179-203頁記載のように簡便な操作を可能に する。更にＡgrobacterium媒体遺伝子移入の最近の技術的利点は、種々のポリペ プチドコード遺伝子の発現を可能にするベクターの構築を容易にする、ベクター の遺伝子および制限部位の改善された配列を有する。Ｒogers et al.，Ｍethods in Ｅnzymology，153:253(1987)に記載のベクターは、挿入ポリペプチドコード 遺伝子の発現を指示するためのプロモーターおよびポリアデニル化部位にフラン キングである、簡便なマルチリンカー領域を有し、本発明の目的に適する。 葉ディスクおよび他の組織のＡgrobacterium媒介形質転換はＡgrobacterium t umefaciensが本来感染する植物種に限定されるように思える。従って、Ａgrobac terium媒介形質転換は、双子葉植物で最も有効である。しかしながら、Ａgrobac teriumを使用したアスパラガスの形質転換も達成できている。例えば、Ｂytebie r，et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．84:5345(1987)参照。 Ａgrobacterium媒体形質転換が有効なこれらの植物種において、遺伝子移入の 容易さおよび限定された性質のため、これが最良の方法である。しかしながら、 ほとんどの単子葉がＡgrobacteriumの天然宿主ではないように思えるが、アスパ ラガスのトランスジェニック植物が、Ｂytebier et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad ．Ｓci．U.S.A.，84:5345(1987)に記載のように、Ａgrobacteriumベクターを使 用して製造されている。従って、米、トウモロコシおよび小麦のような商業的に 重要な穀類を別法を使用して形質転換しなければならない。植物原形質の形質転 換 は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気泳動およびこれ らの処理の組み合わせを基本にした方法を使用して達成できる。例えば、Ｐotry kus et al.，Ｍol．Ｇen．Ｇenet.，199:183(1985)；Ｌorz et al.，Ｍol．Ｇen Ｇenet.，199:178(1985)；Ｆromm et al.，Ｎature，319:791(1986)；Ｕchimiy a et al.，Ｍol．Ｇen．Ｇenet.，204:204(1986)；Ｃallis et al.，Ｇenes and Ｄevelopment，1:1183(1987)；およびＭacrotte et al.，Ｎature．335:454(19 88)参照。 これらのシステムの異なる植物種への使用は、原形質からその特定植物種を再 生できる能力に依存する。原形質からの穀類の再生の実例方法は、Ｆujimura et al.，Ｐlant Ｔissue Ｃulture Ｌetters，2:74(1985)；Ｔoriyama et al.，Ｔ heor Ａppl．Ｇenet.，73:16(1986);Ｙamada et al.，Ｐlant Ｃell Ｒep.，4:8 5(1986);Ａbdullah et al.，Ｂiotechnology，4:1087(1986)に記載されている。 原形質から充分に再生できない植物種を形質転換するために、ＤＮＡを無傷細 胞または組織に挿入する他の方法が使用できる。例えば、未成熟胚または外植物 からの穀類の再生は、Ｖasil，Ｂiotechnology，6:397(1988)に記載のように行 うことができる。加えて、“粒子銃”または高速微小投射物技術が同様に使用で きる。このような技術を使用して、ＤＮＡを細胞壁を通して、Ｋlein et al.， Ｎature，327:70(1987)；Ｋlein et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．U.S.A. ，85:;8502(1988)；およびＭcＣabe et al.，Ｂiotechnology，6:923(1988)に記 載のように、１から数百メートル／秒の速度に加速する小さい(０.５２５μm)金 属粒子の表面の細胞質に運ぶ。金属粒子は、細胞の数層を通って浸透し、従って 組織外植物の細胞の形質転換を可能にする。金属粒子は、トウモロコシ細胞の充 分な形質転換におよび稔性、安定形質転換タバコおよび大豆植物の製造に使用さ れる。組織外植物の形質転換は、原形質段階を通る必要性を除き、トランスジェ ニック植物の製造を速くする。 ＤＮＡは、Ｚhou et al.，Ｍethods in Ｅnzymology，101:433(1983)；Ｄ．Ｈ ess，Ｉntern Ｒev．Ｃytol.，107:367(1987)；Ｌuo et al.，Ｐlant．Ｍol．Ｂ iol．Ｒeporter，6:165(1988)記載のように、直接ＤＮＡを花粉に移入すること によりまた挿入できる。ポリペプチドコード遺伝子の発現は、Ｐena et al.，Ｎ ature，325:374(1987)記載のように、ＤＮＡの植物の生殖器官への注入により得 ることができる。ＤＮＡはまた、Ｎeuhaus et al.，Ｔheor．Ａpl．Ｇenet.，75 :30(1987)；およびＢenbrook et al.，Ｐroceedings Ｂio Ｅxpo 1986，Ｂutter worth，Ｓtoneham，ＭＡ，27-54頁(1986)に記載のように、直接未成熟胚細胞へ も注入でき、乾燥胚を再水和する。 単一細胞原形質または種々の外植物からの植物の再生は当分野で既知である。 例えば、Ｍethods for Ｐlant Ｍolecular Ｂiology，Ａ．ＷeisbachおよびＨ． Ｗeissbach編，Ａcademic Ｐress，Ｉnc.，Ｓan Ｄiego，ＣＡ(1988)参照。この 再生および成育法は、形質転換細胞および新芽、根および形質転換新芽の選択お よび土壌での小植物の生育の段階を含む。 Ａgrobacterium tumefaciensにより葉外植物から挿入された異種遺伝子を含む 植物の再生は、Ｈorsch et al.，Ｓcience，227:1229-1231(1985)記載のように 達成できる。この方法において、形質転換体を選択試薬の存在下成育させ、新芽 の形質転換された植物種への再生を誘発する媒体は、Ｆraley et al.，Ｐroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．U.S.A.，80:4803(1983)に記載の通りである。この方法は 、典型的に、２から４週間内に新芽を製造し、これらの形質転換新芽を次いで、 選択試薬および細菌成育を防止するための抗生物質を含む適当な根誘発媒体に移 す。選択試薬存在下で発根し、小植物を形成する形質転換新芽を、次いで、土壌 に移植し、根を作らせる。これらの方法は、用いる特性植物種に依存して変化し 、このような変化は当分野で既知である。 本発明の免疫グロブリンは、双子葉植物または単子葉植物、ナス科植物、アル ファルファ、マメ科植物またはタバコである植物由来の植物細胞を含む植物細胞 中に製造し得る。 本発明のトランスジェニック植物は、当業者に既知の方法を使用して形質転換 できる性的交差可能植物から製造できる。有用な植物種は、タバコ、トマト、マ メ科植物、アルファルファ、オークおよびカエデを含む双子葉植物；芝生、トウ モロコシ、穀類、オート麦、小麦および大麦を含む単子葉植物；および裸子植物 、 球果植物、トクサ、ヒゲノカズラ、ゼニゴケ、ツノゴケ、コケ、藻、配偶体およ びシダ植物の胞子体を含む下等植物である。 本発明の植物細胞は、防御タンパク質および免疫グロブリン由来重鎖に加えて 、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコード するヌクレオチド配列も含み得る。 本発明の植物細胞は、免疫グロブリン由来重および軽鎖でＳ．mutans血清型ａ 、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ(新しい命名法ではＳ．mutans血清型ｃ、ｅおよ びｆ；およびＳ．sobrinus血清型ｄおよびｇ)由来の抗原に結合できる抗原結合 ドメインを有し得る。これらの植物細胞上に提示される抗原結合ドメインはまた 原因の粘膜病原体と結合でき、虫歯を予防できる。 本発明の植物細胞は、植物の一部であり得、以下のタイプの植物を作る：双子 葉植物、単子葉植物、ナス科植物、アルファルファ、タバコまたは他のタイプの 植物。 Ｄ．防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む組成物 本発明は、本発明の免疫グロブリンおよび植物高分子物質を含む組成物に関す る。典型的に、これらの植物高分子物質は本発明で有用な植物由来である。植物 高分子物質は、本発明の免疫グロブリンと共に、例えば、植物細胞中、植物細胞 の抽出物中または植物中に存在する。組成物中で本発明の免疫グロブリンと結合 した典型的植物高分子物質は、リボースビホスフェートカルボキシラーゼ、集光 複合体、(ＬＨ６)色素、二次代謝物またはクロロフィルである。本発明の組成物 は、本発明の免疫グロブリンを、水以外の質量の１％から９９％の間の濃度で有 する。他の好ましい組成物は、水以外の質量の１％から５０％の間の濃度で存在 する本発明の免疫グロブリンを有する組成物を含む。他の好ましい組成物は、水 以外の質量の１％から２５％の間の濃度の免疫グロブリンを含む。 本発明の組成物は、植物高分子物質を、水以外の質量の１％から９９％の間の 濃度で含む。典型的に組成物中に存在する質量は、植物高分子物質および本発明 の免疫グロブリンから成る。本発明のグロブリンが、より高いまたは低い濃度で 存在するとき、組成物中に存在する植物高分子物質の濃度は、逆比例して変化す る。好ましい態様において、植物高分子の組成物は、水以外の質量の５０％から ９０％の間の濃度で存在する。最も好ましい組成物において、植物高分子物質は 、水以外の質量の７５％から９９％の間の濃度で存在する。 本発明は、以下の全てまたは一部を含む組成物に関する：ＩｇＡ重鎖、カッパ またはラムダ鎖、Ｊ鎖。これらの成分は複合体を形成し、先に定義のように防御 タンパク質に結合する。組成物はまた植物由来の分子も含む。この組成物は、機 能的抗体および植物由来分子を製造する抽出工程の後に得られ得る。 抽出法は、複合体を含む植物に力を掛け、それにより植物植物のアポプラスト 成分が裂けて、複合体が遊離する工程を含む。力は、dyn／cm²としての剪断を、 アポプラスト液体を遊離する最初の方法として含む。 全植物または植物抽出物は、抗体および他の植物の高分子物質の混合物を含む 。混合物中に含まる高分子物質の中の一つはリブロースビホスフェートカルボキ ラーゼ(ＲuＢisＣo)またはＲuＢisＣoのフラグメントである。他の高分子物質は ＬＨＣＰである。他の分子はクロロフィルである。 剪断力は、アポプラスト領域の断絶のために植物に掛ける全ての力の有用な成 分である。他のタイプの力は、また剪断の効果を最適にするために含み得る。例 えば、lbs／in²で測定する直接の圧力は剪断を掛けるのに使用する装置の効果を 促進し得る。抗体抽出に適当ではない一般に使用される均質化技術は、全ての植 物構造を爆発的に破壊する高速刀またはシリンダーの使用を含む。 本発明の組成物は、本発明の免疫グロブリンおよび双子葉植物、単子葉植物、 ナス科植物、アルファルファ、タバコまたは他の植物由来の植物分子を含み得る 。本発明の組成物に存在する植物分子は、リブロースビホスフェートカルボキシ ラーゼ、集光性複合体、色素、二次代謝物、クロロフィルおよび他の植物分子を 含む。 防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む組成物の製造のための他の有用 な方法は、植物材料の種々の溶媒での抽出および真空適用を含む。本発明の組成 物は、本発明の免疫グロブリンを水以外の質量の１％から９９％の間の濃度で含 み得る。本発明の組成物は、植物高分子物質を水以外の質量の１％から９９％の 間の濃度で含み得る。 本発明の免疫グロブリンおよび植物高分子物質を含む治療的組成物は、本発明 の植物を、圧力下にその植物の一部を剪断し、治療的免疫グロブリンおよび植物 高分子物質を、植物のアポプラストまたはシンプラスト由来の液体中に含み、固 体植物由来材料もまた含むパルプを製造させることにより処理することにより製 造し得る。固体植物由来材料を本発明の免疫グロブリンを含む液体から分離する ことにより、更なる処理を行い得る。このような過程の出発物質は、植物葉、幹 、根、塊根、種子、果実または全植物を含み得る。典型的に、この処理は、植物 のアポプラストまたはシンプラストから液体を放出させる機械的装置により達成 される。更なる処理段階は、遠心沈殿フロキュレーションまたは濾過を使用した 液体からの固体植物由来材料の分離を含み得る。当業者は、これらの分離法が本 発明の免疫グロブリンを含む液体からの固体植物由来材料の分離をもたらすこと を理解する。本発明の方法は、防御タンパク質および免疫グロブリンアルファ鎖 または免疫グロブリンガンマ鎖のドメインまたは部分を含む免疫グロブリン由来 重鎖を含む免疫グロブリンを製造し得る。本発明の方法は、防御タンパク質およ び免疫グロブリンカッパまたはラムダ鎖のドメインまたは部分を含む免疫グロブ リン由来軽鎖を含む免疫グロブリンを製造し得る。 本発明の方法は、植物細胞または植物の部分で操作可能である。本発明の方法 は、更にまた植物の成育を含む方法も含み得る。本発明の方法は、双子葉植物、 単子葉植物、ナス科植物、マメ科植物、アルファルファまたはタバコ植物を含む 植物に使用し得る。本発明の方法は、葉、幹、根、塊根、種子、果実または全植 物のような植物の部分から免疫グロブリンを抽出するのに使用し得る。本発明の 方法は、植物のアポプラストまたはシンプラストから液体を放出させる機械的を 使用し得る。本発明の植物パルプは、固体植物材料を除去するために、以下の方 法のいずれか一つを使用して分離し得る：遠心、沈殿、フロキュレーションまた は濾過。 Ｅ．防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法 本発明は： (ａ)転写プロモーターに操作可能に結合した防御タンパク質をコードするヌクレ オチドを含む発現ベクターの植物細胞への挿入；および (ｂ)転写プロモーターに操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの部分 を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするヌクレオチドを含む発現ベクター の同じ植物細胞への挿入： の段階を含む、防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法に関する。 本発明の方法は、所望により、防御タンパク質および転写プロモーターに操作 可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来 軽鎖のヌクレオチド配列の、発現ベクターを含む植物細胞への挿入を含む。方法 は、また、既にヌクレオチド配列ならびに防御タンパク質および免疫グロブリン 重鎖および免疫グロブリン軽鎖、Ｊ鎖をコードするヌクレオチド配列に操作可能 に結合したプロモーターを既に含む細胞への挿入も考慮する。これは、免疫グロ ブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖、Ｊ鎖および防御タンパク質のプロモータ ーに操作可能に結合したヌクレオチド配列を含む細胞をもたらす。 本発明の植物細胞は、成育できる植物の一部として存在し得る。本発明で特に 有用な植物は、双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、マメ科植物、アルファル ファ、トマトおよびタバコ植物を含む。 本発明の方法は、真核細胞中で集合した、重、軽およびＪ鎖を有する免疫グロ ブリンおよび防御タンパク質を含む。この真核細胞は、少なくとも抗原結合ドメ インの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖、少なくとも抗原結合ドメインの部 分を有する免疫グロブリン由来軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質 をコードする発現のために操作可能に結合したヌクレオチド配列をその細胞に挿 入することにより製造する。これらのヌクレオチド配列は、各個々のヌクレオチ ド配列にまたは１個以上のヌクレオチド配列に適当なプロモーターを付け、それ により、種々の分子をコードする二つのヌクレオチド配列をタンデムに置くこと により、発現のために操作可能に結合している。 本方法により製造される、免疫グロブリン重、軽およびＪ鎖および防護タンパ ク質をコードするこれらのヌクレオチド配列を含む真核細胞は、これらの分子を 再生し、本発明の防御タンパク質を含む免疫グロブリンに集合できるようにする 条件下に維持する。 本発明は、特定免疫グロブリンまたは環境条件に耐性でより安定な免疫グロブ リンの抗原結合ドメインまたはドメイン群を、免疫グロブリン重鎖由来の少なく とも抗原結合ドメインの部分をコードするヌクレオチド配列を免疫グロブリンα またはμ重鎖由来の少なくとも一つのドメインに操作可能に結合させ、キメラ免 疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を形成させることにより製造す る方法にも関する。キメラ免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列は 、防御タンパク質、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン 由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖のような他の分子をまた少なくとも一つ含む 真核細胞中で発現する。好ましい態様において、細胞は、免疫グロブリン由来重 鎖に存在する抗原結合ドメインと相補的な抗原結合ドメインを有する免疫グロブ リン由来軽鎖を含むすべての分子を含む。この方法は、キメラ免疫グロブリン重 鎖を他の分子、例えば、相補的抗原結合ドメインを有する免疫グロブリン由来軽 鎖および免疫グロブリンＪ鎖および防御タンパク質Ｊ鎖の少なくとも一つと結合 させ、環境条件に耐性な防御タンパク質を含む免疫グロブリンを形成させる。 これらの免疫グロブリンは環境条件に耐性であり、従って、高いまたは低い温 度、高いまたは低いｐＨ、高いイオンまたは低いイオン濃度タンパク質分解酵素 および他の厳しい条件に付されたときにより安定である。このような厳しい条件 は、典型的に、人体内、例えば、腸内の天然水源および粘膜表面上および哺乳類 のような動物の表面上に見られる。 Ｆ．防御タンパク質を含むキメラ免疫グロブリン 本発明は、重および軽鎖を含む免疫グロブリンドメインが、重または軽鎖免疫 グロブリンのいずれかの異なるイソトープ由来である、防御タンパク質を含む免 疫グロブリンに関する。当業者は、分子技術を使用して、これらのドメインが同 じドメインに置換でき、従って、二つの異なる免疫グロブリンの間のハイブリッ ドである免疫グロブリンを製造することを理解する。これらのキメラ免疫グロブ リンは、異なる免疫グロブリンから付与された種々の望ましい特性を含む、構築 すべき防御タンパク質を含む免疫グロブリンを可能にする。 本発明はまた、異なる分子由来の完全より少ないドメイン含む重、軽およびＪ 鎖を含むキメラ免疫グロブリンにも関する。同分子技術は、このようなキメラ免 疫グロブリンの製造に使用し得る。 好ましい態様において、本発明の免疫グロブリンは少なくともＣ_H１、Ｃ_H２、 Ｃ_H３、マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ 、ＩｇＥまたはＩｇＤのドメインを含む。本発明の好ましい他の態様は、少なく ともマウスＩｇＭのＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣまたは４ドメインを含む免 疫グロブリンドメインを含む。好ましい免疫グロブリンは、マウス免疫グロブリ ンＩｇＥのＣε２、Ｃε３およびＣε４ドメインを含む免疫グロブリンを含む。 本発明はまたヒト免疫グロブリン由来のキメラ免疫グロブリンにも関する。こ れらのキメラ免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンの異なる二つのイソトープ 由来のドメインを含む。好ましい免疫グロブリンは、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、Ｉ ｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣ_H１、Ｃ_H２ またはＣ_H３を含む免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンを含む。他の 好ましい免疫グロブリンは、少なくともヒトＩｇＭまたはＩｇＥのＣ_H１、Ｃ_H２ 、Ｃ_H３またはＣ_H４ドメイン由来のドメインを含む免疫グロブリンを含む。本発 明はまた哺乳類免疫グロブリンの少なくとも二つの異なるイソトープ由来の免疫 グロブリンドメインを含む免疫グロブリンにも関する。一般に、哺乳類免疫グロ ブリンは、以下のイソトープのような好ましい態様で使用できる：ＩｇＧのイソ タイプ、ＩｇＡのイソタイプ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ。本発明の免疫グロ ブリンは、哺乳類免疫グロブリンの二つの異なるイソトープ由来の少なくとも一 つの定常領域を含む。 本発明はまた囓歯類免疫グロブリンの二つの異なるイソトープ由来の免疫グロ ブリンドメインを含む免疫グロブリンにも関する。囓歯類免疫グロブリンのイソ トープは当分野で既知である。本発明の免疫グロブリンは、以下の免疫グロブリ ンの少なくとも一つを含む免疫グロブリン由来重鎖を含み得る：マウスＩｇＧ、 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤの Ｃ_H１、Ｃ_H２またはＣ_H３ドメイン；マウスＩｇＥまたはＩｇＭのＣ_H１、Ｃ_H２ 、Ｃ_H３、Ｃ_H４ドメイン；ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤのＣ_H１、Ｃ_H２またはＣ_H３ドメイン；ヒ トＩｇＥまたはＩｇＭのＣ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３、Ｃ_H４ドメイン；哺乳類ＩｇＧの イソタイプ、ＩｇＡのイソタイプ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣ_H１、Ｃ_H２またはＣ_H ３ドメイン；囓歯類ＩｇＧのイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣ_H１ 、Ｃ_H２またはＣ_H３ドメイン；囓歯類ＩｇＥまたはＩｇＭのＣ_H１、Ｃ_H２または Ｃ_H３ドメイン；動物ＩｇＧのイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣ_H１ 、Ｃ_H２またはＣ_H３ドメイン；動物ＩｇＥまたはＩｇＭのＣ_H１、Ｃ_H２またはＣ_H ３ドメイン。本発明はまた免疫グロブリンスーパーファミリーのメンマーであ る分子由来のタンパク質ドメインの置換または付加にも関する。免疫グロブリン スーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンと相同なアミノ酸残基配列 および核酸配列を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーの一部である分子 はアミノ酸または核酸配列相同性により同定できる。例えば、Ｉmmunoglobulin Ｇenes，Ａcademic Ｐress(1989)の361頁参照。テトラトランスジェニック生物 ： 本発明はまた、その細胞または植物内に、細胞内にそれそれ異なるポリペプチ ドをコードする４つのトランスジーン核酸に挿入された核酸を有する細胞を含む トランスジェニック生物に関する。これらのトランスジーンは、そのトランスジ ーンから製造されるメッセンジャーＲＮＡが４つのトランスジーンの他のものか ら製造されるメッセンジャーＲＮＡおよびポリペプチドと異なることとにより異 なる。従って、本発明で記載されているトランスジーンの数は、通常トランスジ ェニック生物で見られるような同じトランスジーンの多重コピーは含まない。本 発明は、他のトランスジーンの同一コピーではない４つのトランスジーンを有す るトランスジェニック生物を指向する。本発明は、それぞれのトランスジーンが 多重コピーで存在し得る可能性を除外しない。しかしながら、少なくとも４つの 別の異なるトランスジーンがトランスジェニック生物の細胞中に存在する。 加えて、本発明は、４つのトランスジーンが、多重ポリペプチド分子の一部で あるポリペプチドをコードするトランスジーンという点で関連していることを考 慮する。従って、本発明は、多重ペプチド分子の各個々のポリペプチド鎖がトラ ンスジェニック生物の細胞内のトランスジーンに存在することを考慮する。多重 ペプチド分子の各個々の異なるポリペプチドの発現は、トランスジェニック動物 細胞内で、異なるポリペプチドが、互いに集合し、多重ペプチド分子を形成する ことを可能にする。従って、本発明は、個々のそれぞれの細胞中の４つの異なる トランスジーンに、多重ペプチド分子を行うために集合しないポリペプチドをコ ードするトランスジーンを含まない。互いに結合しない分子をコードするこのよ うなトランスジーンの例は、カナマイシンまたはネオマイシンまたはチミジンキ ナーゼのような抗生物質耐性のポリペプチドである。 好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物に存在するトランス ジーンは、以下の４つの異なるポリペプチドをコードする：防御タンパク質；少 なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖；少なくとも 抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖；および免疫グロブリ ンＪ鎖。他の好ましい態様において、トランスジェニック生物に存在するトラン スジーンの一つは、キメラ免疫グロブリン重、軽またはＪ鎖をコードする。他の 好ましい態様において、本発明のトランスジェニック生物のトランスジーンは、 ＩｇＡまたはＩｇＭの少なくとも一部由来の免疫グロブリン重鎖をコードする。 他の好ましい態様は、少なくともＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリン重鎖由来の 免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列の部分をコードするトランスジーンを含 むトランスジェニック生物を含む。 本発明は、哺乳類、植物、囓歯類、爬虫類、昆虫、両生類、魚または他の生物 由来のトランスジェニック生物に関する。好ましい態様において、本発明のトラ ンスジェニック生物は植物または哺乳類である。このような生物を製造する方法 は既知である。本明細書に参考として包含する、即ち、米国特許第４,７３６,８ ６６号；第４,６０７,３８８号；第４,８７０,００９号および第４,８７３,１９ １号参照。 本発明はまた、特定の種においてこれらのドメインを余り免疫原性でないよう に工作した免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリン由来重鎖または免疫グ ロブリン由来軽鎖を含む免疫グロブリンにも関する。典型的に、免疫グロブリン 分子は、他の種由来のものであっても、ヒト免疫グロブリンのようにする“ヒト 化”として工作する。実施例 以下の実施例は本発明の記載を説明する。これらの実施例はいかなる意味でも 本発明の請求の範囲を限定しない。 実施例１．抗生物質を植物で発現させるＤＮＡベクターの構築 ａ．Ｇuy'13免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列の単離 Ｇuy's13抗Ｓ．mutans抗体のガンマおよびカッパ鎖の分子クローニングは、Ｍ a et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131(1994)記載の方法で行った。簡単には 、Ｇuy's13ハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを抽出し、標準工程によりｃＤＮ Ａに変換した。次いで、ｃＤＮＡをガンマまたはカッパｃＤＮＡのいずれかに特 異的に相補的なオリゴヌクレオチドのペアを使用して増幅した。増幅は、記載の ように熱サイクラー(thermal cycler)を使用してＴaq １ポリメラーゼで触媒し た。増幅ｃＤＮＡを次いで適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、標準植物発 現ベクターの対応する制限部位にライゲートした。このようなベクターの多くの 例が文献で報告されており、一般に入手可能である。使用し得る一つのベクター の例はpBIN19である。 実験の関連するシリーズにおいて、ｃＤＮＡを細菌ベクターbluescriptにクロ ーンした。この構築物を使用して、ガンマおよびカッパｃＤＮＡを、Ｍaxamおよ びＧilbert法を使用して決定した。 ＰＣＲ技術を含み、または得られたｃＤＮＡの適当なベクター中へのライゲー ションに続くｃＤＮＡライブラリーの構築による抗体ｃＤＮＡをクローニングす る方法は、当業者に慣用の平凡な技術である。 ｂ）Ｇuy's13重鎖可変領域、ガンマ鎖定常領域の一部およびアルファ鎖定常領 域の一部をコードするハイブリッド これらの構築物は、Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131(1994)記載の 方法で行い、上記のように適当な植物発現ベクターにライゲートした。最終構築 物は構造：ＩｇＧ２Ａ重鎖と呼ぶＧuy's13可変領域−(ＩｇＧ１ Ｃ_H１)−(Ｉｇ Ｇ１ Ｃ_H２)−(ＩｇＡ Ｃ_H２)−(ＩｇＡ Ｃ_H３)およびＧuy's13可変領域−( ＩｇＧ１ Ｃ_H１)−(ＩｇＡ Ｃ_H２)−(ＩｇＡ Ｃ_H３)を有した。 ｃ）防御タンパク質およびＪ鎖 クローンウサギポリ免疫グロブリン受容体(ｐＩｇＲ)ｃＤＮＡは、Ｍostov， Ｎature，308:37(1984)に記載され、図８に示した。防御タンパク質部分は(ｐＩ ｇＲ)をコードするヌクレオチド配列の部分のＰＣＲ増幅により得、上記のよう に適当な植物発現ベクター中にライゲートした。これらの構築に使用するｐＩｇ Ｒの防御タンパク質部分は、アミノ酸数１のコドンからアミノ酸数６０６のコド ンを含む。この構築を達成する方法は当分野で既知であり、オリゴヌクレオチド がｐＩｇＲ核酸配列を使用して選択できる。 ｄ）重鎖定常領域の非糖付加誘導体をコードするｃＤＮＡ 変異誘発方法は、Ｓtratageneプロトコールに従って行った。いずれの場合(即 ち、アルファ定常領域または防御タンパク質)も、炭水化物の結合部位として使 用したアスパラギンのコドンは、ヒスチジンのコドンに変えた。 実施例２．治療的抗体を発現するトランスジェニック植物の製造 防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む植物および植物細胞は、以下の 方法で製造した。 ａ）ベクターのＡgrobacterium tumefaciensへの移入 植物形質転換は、Ａgrobacterium tumefaciensを使用して行った。組換えpMON 530植物発現ベクターを有するＥ．coli ＤＨ５αは、移入機能を提供するのに 、ヘルパー株(pRK2013)の存在下でＡgrobacteriumと組み合わせた。あるいは、p MON530プラスミドＤＮＡを直接形質転換によりＡgrobacteriumに挿入した。この 方法において、Ａgrobacterium株を最初にＹＥＰ培地中で一晩２８℃で成育させ た。一晩培養物の２mlを、ＹＥＰ ５０mlに接種するのに使用し、ＯＤ₆₀₀が１. ０になるまで成育させた。次いで、細胞を４℃で冷却し、遠心してペレットにし 、氷冷２０mＭ ＣａＣｌ₂ １mlに再懸濁した。約１μｇのＤＮＡを、氷冷細胞 の０. １mlのアリコートに添加した。次いで、細胞を、液体窒素に浸すかまたはドライ アイスエタノール浴で急速に凍結させた。細胞を、３７℃で５分のインキュベー ション、続くＹＥＰ培地１mlの添加により融解した。細胞を、穏やかに振盪しな がら２−４時間インキュベートした。組換えベクターを有する個々のベクターを 、適当な抗生物質を含むＹＥＰ寒天プレート上でインキュベートすることにより 単離した。 pMON530を含むＡgrobacteriaをカナマイシン、スペクチノマイシンおよびクロ ラムフェニコールを含む培地で成育させた。次いで、タバコ葉の小断片をＡgrob acteriumと２日間共インキュベートし、その後葉切片をＡgrobacteriumを殺すた めのカルベニシリン含有プレートに移した。形質転換葉細胞の全植物への再生は 、植物が土壌での成育ができるまでカナマイシン選択の存在下で行わせた。 ｂ）形質転換タバコおよびペチュニア植物の再生 温室で育てたタバコまたはペチュニア植物由来の葉を２０％(容量)Ｃhlorox漂 白剤、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムで、室温で８分滅菌した。次いで、葉を ７０％エタノールで簡単に濯ぎ、滅菌ペトリ皿で乾燥させた。 約０.５cm直径の葉ディスクを滅菌穴開け器で除き、ＭＳ１０培地(ＭＳ１０培 地リットル当たり：最小有機物含有４.４ｇ ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Si gma #M68991]、３０ｇシュークロース、０.２mg酢酸ナフタレン、２mgベンジル アミノプリン、０.１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン、０.１mgチアミン、 １０ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)含有寒天培地に置いた。 次いで、ＬＢ中のＡgrobacterium(約１×１０⁸Ａgrobacterium／ml)の２mlの アリコートを葉片に加えた。葉ディスクの全ての表面をＡgrobacteriumと接触さ せ、過剰な液体をプレートから注ぎ出し、ディクスを細菌と２日間室温で共培養 した。次いで、このディスクをＭＳ１０培地、５０μg／mlカナマイシンおよび ２５０μg／mlカルベニシリン含有(ＭＳ１０−ＫＣ)寒天プレートに移した。再 生は、ディスクを、再生新芽が見えるまで週毎に新鮮ＭＳ−１０−ＫＣプレート に移すことにより行った。次いで、新芽をＭＳＯ−ＫＣ培地(ＭＳＯ−ＫＣリッ トル当たり：最小有機物含有４.４ｇ ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M 68991]、３０ｇシュークロース、１mgニコチン酸、１mgピリドキシン、０.１mg チアミン、５０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン、１０ ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)を含む寒天プレートに移した。 根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。 ｃ）形質転換アルファルファの再生 ３つ葉のアルファルファを温室植物から切り、２０％(容量)Ｃhlorox漂白剤、 ０.１％ドデシル硫酸ナトリウムで、室温で８分滅菌した。次いで、３つ葉を７ ０％エタノールで簡単に濯ぎ、滅菌ペトリ皿で乾燥させた。 約１cm×４mmの葉片を滅菌外科用メスで切り取り、Ｂ５Ｈ培地(Ｂ５Ｈ培地リ ットル当たり：３.１ｇガンボルグ粉末培地(Ｓigma#G8593)、５００mg ＫＮＯ₃ 、２５０mg ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３０ｇシュークロース、５００mgプロリン、 １mg ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸、１００μgカイネチン、１００mgイノシ トール、１mgニコチン酸、１mgピリドキシン、１０mgチアミン、１０ｇ寒天、３ ０ml貯蔵アミノ酸、ＫＯＨでｐＨ５.７；貯蔵アミノ酸はリットル当たり２６.６ ｇ Ｌ−グルタミン、３.３２ｇセリン、１６.８mgアデニン、３３３mgグルタチ オンから成り、オートクレーブ後、培地が約５０℃になった時に添加する)を含 む寒天プレートに置いた。 次いで、葉片にＬＢ中のＡgrobacteriumの懸濁液(約１×１０⁸Ａgrobacterium ／ml)２mlを加えた。葉の全ての表面をＡgrobacteraと接触させ、過剰な液体を プレートから注ぎ出し、葉を細菌と２日間室温で共培養した。次いで、葉片をＢ ５Ｈ培地、２５μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン(Ｂ５ Ｈ−ＫＣ)含有寒天プレートに移した。再生は、葉片を、体細胞胚が見えるまで 週毎に新鮮Ｂ５Ｈ−ＫＣプレートに移すことにより行った。次いで、胚をＢＩＯ ２Ｙ−ＫＣ培地(ＢＩＯ２Ｙ−ＫＣリットル当たり：２５ml多量栄養素、１０ml 微量栄養素、２５ml鉄、１mlビタミン、１mlアミノ、２ｇ酵母抽出物、１００mg ミオイノシトール、３０ｇシュークロース、１０ｇ寒天、２５ｇカナマイシン、 ２５０mgカルベニシリン、ＫＯＨでｐＨ５.９；多量栄養素はリットル当たり４ ０ｇ ＫＮＯ₃、４０ｇ ＮＨ₄ＮＯ₃、１３.８８ｇ Ｃａ(ＮＯ₃)₂−４ＦＵＯ、 １.４ｇ ＭｇＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ、２.６ｇ ＫＣｌ、１２ｇ ＫＨ₄ＰＯ₄から成る ４０×貯蔵を作る；ビタミンはリットル当たり１００mgチアミンＨＣｌ、５００ mgニコチン酸、１００mgピリドキシンＨＣｌから成る１０００×貯蔵を作る；ア ミノはリットル当たり２ｇグリシンから成る１０００×貯蔵を作る；微量栄養素 はリットル当たり５８０mgＭｎＳＯ₄−４Ｈ₂Ｏ、１５５０mg ＺｎＳＯ₄−７Ｈ₂ Ｏ、１６０mg Ｈ₃ＢＯ₃、８０mg ＫＩを含む１００×貯蔵を作る；鉄はリット ル当たり１.２８ｇ ＮａＦｅＥＤＴＡを含む４０×貯蔵を作る)を含む寒天プレ ートに移した。 根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。 ｄ）形質転換トマト植物の再生 ７日令苗木由来の子葉を２０％(容量)Ｃhlorox漂白剤、０.１％ドデシル硫酸 ナトリウムで、室温で８分滅菌した。次いで、葉を７０％エタノールで簡単に濯 ぎ、滅菌ペトリ皿で乾燥させた。 約０.５cm直径の子葉片を滅菌外科用メスで切り、ＭＳ４培地(ＭＳ４培地リッ トル当たり：最小有機物含有４.４ｇ ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M 68991]、３０ｇシュークロース、２mgゼアチンリボシド、５mgニコチン酸、０. ５mgピリドキシン、０.５mgチアミン、１mＭアセトシリンゴン、１０ｇ寒天、Ｋ ＯＨでｐＨ５.７)含有寒天培地に置いた。 次いで、ＬＢ中のＡgrobacterium(約１×１０⁸Ａgrobacterium／ml)の２mlの 懸濁液を葉片に加えた。葉ディスクの全ての表面をＡgrobacteriumと接触させ、 過剰な液体をプレートから注ぎ出し、ディクスを細菌と２日間室温で共培養した 。次いで、このディスクをＭＳ４培地、５０μg／mlカナマイシンおよび２５０ μg／mlカルベニシリン含有(ＭＳ４−ＫＣ)寒天プレートに移した。再生は、デ ィスクを、再生新芽が見えるまで週毎に新鮮ＭＳ−４−ＫＣプレートに移すこと により行った。次いで、新芽をＭＳＯ−ＫＣ培地(ＭＳＯ−ＫＣリットル当たり ：最小有機物含有４.４ｇ ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M68991]、３ ０ｇシュークロース、１mgニコチン酸、１mgピリドキシン、１０mgチアミン、５ ０μg／mlカナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン、１０ｇ寒天、ＫＯ Ｈで ｐＨ５.７)を含む寒天プレートに移した。 根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。 ｅ）形質転換シロイヌナズナ属の再生 無菌培養で成育したシロイヌナズナ(Ａrabidopsis thalliana)植物由来の無傷 根を、最初、暗所で３日間、２８℃でカルス誘発培地(ＣＩＭ)で前処理した(Ｃ ＩＭ培地リットル当たり：３.１ｇガンボルグ粉末培地(Ｓigma#G8593)、３０ｇ シュークロース、１mg ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸、１００μgカイネチン 、１mgイノシトール、０.１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン、０.１mgチア ミン、８ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)。 次いで、無傷根にＬＢ中のＡgrobacteriumの懸濁液(約１×１０⁸Ａgrobacteri um／ml)２mlを加えた。根の全ての表面をＡgrobacteraと接触させ、過剰な液体 をプレートから注ぎ出した。次いで、無傷根を５mmセグメントに切断し、細菌と ２日間、２８℃でＣＩＭプレート上で共培養した。次いで、根片を５０μg／ml カナマイシンおよび２５０μg／mlカルベニシリン含有新芽誘発培地(ＳＩＭ)(Ｓ ＩＭ培地リットル当たり：３.１ｇガンボルグ粉末培地(Ｓigma#G8593)、３０ｇ シュークロース、５mg Ｎ⁶−(２−イソペンテニル)アデニン、１５０μgインド ール−３−酢酸、１mgイノシトール、０.１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシン 、０.１mgチアミン、８ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ５.７)に移した。 再生は、根片を、緑色新芽が見えるまで週毎に新鮮ＳＩＭプレートに移すこと により行った。次いで、新芽をＥＭ培地(ＭＳＯ−ＫＣリットル当たり：最小有 機物含有４.４ｇ ＭurashigeおよびＳkoog基本塩[Sigma #M6899]、１０ｇシュ ークロース、１mgインドール−３−酪酸、１mgニコチン酸、０.１mgピリドキシ ン、０.１mgチアミン、２５０μg／mlカルベニシリン、８ｇ寒天、ＫＯＨでｐＨ ５.７)を含む寒天プレートに移した。 根形成後、小植物を土壌に移し、成熟するまで成育させた。 実施例３．トランスジェニック植物の同定 個々の免疫グロブリン鎖を発現するカナマイシン耐性形質転換体を記載のよう にELISAで同定した。形質転換体の更なる分析は、ノーザンブロッティングによ るＲＮＡの評価およびウエスタンブロッティングによる免疫グロブリンポリペプ チドの評価を含み、両方ともＭaniatis et al.に記載されていた。 各免疫グロブリン鎖については、抗原性物質、ＲＮＡまたはタンパク質を各検 定で検出した。最も高いレベルの免疫グロブリンを有すると同定された形質転換 体を、交差授粉プロトコールに使用した。 実施例４．形質転換体の交差授粉による抗体の集合 交差授粉を、記載の抗体の種々の成分を共発現する植物を得るために行った。 これらの交配は、以下の集合成分を含むアルファルファ、トマト、タバコおよび シロイヌナズナ植物を産生し、全てＧuy's13抗原結合ドメインもまた含んだ。抗体のタイプ 免疫グロブリン成分 １ Ｇ１重鎖、カッパ軽鎖 ２ Ｇ２／Ａ重鎖、カッパ軽鎖 ３ Ｇ２／Ａ重鎖、カッパ軽鎖、Ｊ鎖 ４ Ｇ１／Ａ重鎖、カッパ軽、Ｊ鎖、防御タンパク質 ５ Ｇ１／Ａ重鎖、カッパ軽鎖 実施例５．トランスジェニック植物由来のＧuy'sタイプ１、２および３＆４抗体 の抽出および評価 ａ）葉に含まれる抗体の抽出および富化 葉片を約１cm²片に切った。次いで、これらの切片を、両方約４℃の冷却磁気 乳鉢に含まれる、１０μg／mlロイペプチン含有ＴＢＳの冷却溶液に添加した(１ mlＴＢＳ／グラム葉)。植物液体を、回転動および手で押して、切片を冷却乳棒 で粉砕することにより抽出した。粉砕は、切片がほとんど均質なパルプになるま で続けた(約３分の粉砕)。パルプを４℃で約５０,０００×ｇで遠心し、固体植 物片がない上清を作った。あるいは、パルプを、孔サイズ約１００ミクロンのプ ラスティックメッシュを通して濾過した。 特定植物に含まれる抗体の力価に依存して、上清は抗原に直接さらすのに適当 であるかまたは適当な濃度までの富化が必要であった。粗抽出物中のＩｇＧ１ま たはＩｇＧ／Ａは、決まりきって、１０μg／ml以下であり、平均約５μg／mlで あった。Ｇuy's13抗体の粘膜表面への適用のため、１から４mg／mlの濃度までの 富化が必要であり得る。１、２または３構築物のタイプについて、Ｇuy's13抗体 は、１０から１４倍の富化が、所望の濃度を作るのに必要であった。これは、親 和性吸着(プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかを使用して)、または水を 除去するための凍結乾燥により達成された。サイズ排除クロマトグラフィーもま た富化に使用したが、必要な濃度の抗体を産生するために、粗抽出物の完全フラ クションが必要であった。ELISA検定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動に より、共発現鎖は、複合体中に、タイプ１＆２については約１８０−２００ｋダ ルトンおよびタイプ３については約４００ｋダルトンが集合した。粗抽出物は、 決まり切って、約５−１０μg／mlを含んで得られた。 抗体蓄積の劇的増加は、防御タンパク質が、タイプ４抗体を含む植物を産生す るタイプ３抗体を含む植物に交配されたときに見られた。ELISAおよびポリアク リルアミドゲル電気泳動により、共発現鎖は、複合体中に約４７０,０００ダル トンで集合された。粗抽出物は、決まり切って、２００μg／ml以上を含み、平 均約２５０μg／mlを含んで得られた。従って、Ｇuy's13抗体のＳＩｇＡ構築物 は標的濃度を達成するために、最小富化を必要とした。この富化は、上記技術で 達成された。あるいは、抗体が分子排除２００,０００ｄの膜を使用した限外濾 過により、植物分子の多くから容易に分離されることが分かった。 ｂ．Ｇuy's13タイプ４抗体の機能 機能的抗体研究をELISAにより行った。抗体軽および重鎖を発現する全ての植 物は、連鎖球菌抗原(ＳＡ Ｉ／II)を特異的に認識する機能的抗体を集合させた 。結合のレベルおよび力価曲線は、マウスハイブリドーマ細胞上清のものと類似 していた。ＳＡ Ｉ／II結合は、Ｊ鎖のみまたは防御タンパク質のみを発現する 植物では検出されなかった。同様に、免疫グロブリンを発現しない野生型植物も 、結合の検出可能レベルは示さなかった。 同様な一連の実験で、抗体の固定化精製連鎖球菌抗原または細菌細胞表面上の 天然抗原への結合が、抗分泌成分抗血清を使用して検出された。これらの検定に おいて、タイプ４抗体結合のみが検出された。機能的タイプ１、２または３抗体 は抗分泌成分抗血清に結合しなかった。これらの結果は、防御タンパク質がタイ プ４構築物を発現する植物中の抗体と、抗原結合を妨げない方法で、集合するこ とを確認する。 実施例６．キメラ免疫グロブリンの発現 マウスモノクローナル抗体(mＡb Ｇuy's13)の重および軽鎖をコードする遺伝 子を、タバコ(Ｎicotiana tabacum)にクローンし、発現させた。トランスジェニ ック植物は、完全長Ｇuy's13抗体を分泌するものに再生した。重鎖遺伝子配列の 操作により、免疫グロブリンアルファ重鎖由来の定常領域が挿入され、Ｇuy's13 mＡbと共にキメラガンマ／アルファ重鎖も分泌する植物がまた製造される。各植 物抗体について、軽および重鎖はウエスタンブロットにより分析し、集合の忠実 度を、抗原結合研究により、抗体が完全に機能することを証明することにより確 認する。更に、植物抗体は、連鎖球菌を凝集する能力を残し、これは完全長抗体 の２価抗原結合能力が無傷であることを証明する。 ａ．重および軽鎖のクローニング メッセンジャーＲＮＡをＧｕy's13およびマウスＩｇＡ(ＭＯＰＣ３１５)ハイ ブリドーマ細胞系から、酸グアニジニウムチオシアナート−フェノール−クロロ ホルム抽出を使用して精製した。相補的ＤＮＡを、Ｍoloneyマウス白血病ウイル ス逆転写酵素(Ｐromega，ＧＢ)を使用して作った。Ｇuy'13のガンマおよびカッ パ鎖をコードするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅した。変性 ＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドは、増幅ＤＮＡフラグメントの５'末端Ｘh oＩおよび３'末端ＥcoＲＩ制限部位を含むように設計された。制限酵素消化に続 き、免疫グロブリン鎖コードＤＮＡを、クローニング部位の上流にマウス免疫グ ロブリンリーダー配列を含む構築植物発現ベクター(pMON 530)にライゲートした 。組換えベクターをＥ．coli(ＤＨ５−α，Ｇibco ＢＲＬ)形質転換に使用し、 サザンブロッティングでスクリーニングし、本来のＰＣＲ生産物由来の放射標識 Ｄ ＮＡプローブを使用した。プラスミドＤＮＡを陽性形質転換体から精製し、Ａgr obacterium tumefaciensに挿入した。 同様な研究を、ハイブリッドＧuy's13重鎖の二つの形を構築するのに使用した 。図１に示す合成オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲで：(ａ)Ｃγ１ドメイン(Ｊ１ −Ｊ５)の３'末端にＧuy's13シグナル配列、(ｂ)Ｃγ２ドメイン(Ｊ１−Ｊ２)の ３'末端にＧuy's13シグナル配列および(ｃ)MOPC315ハイブリドーマ(Ｊ３−Ｊ４) 由来のＤＮＡの３'末端にＣα２ドメインの５'末端領域を増幅するために使用し た。フラグメントを精製し(Ｇeneclean II，Ｂio101，ＬaＪolla，ＣＡ)、１時 間、３７℃でＨindIIIで消化させた。Ｇuy's13フラグメントをMOPC315フラグメ ントにＴ４ＤＮＡリガーゼ(Ｇibco，ＢＲＬ)で、１６℃で１６時間ライゲートし 、反応混合物のアリコートを、Ｇuy's13(Ｊ１)の５'末端オリゴヌクレオチドお よびMOPC315(J4)の３'末端オリゴヌクレオチドを使用した、更なるＰＣＲの鋳型 ＤＮＡとして使用した。増幅ＤＮＡフラグメントを精製し、上記のようにpMON53 0ベクターにライゲートした。この方法で使用したベクターは、予め挿入された マウスリーダー配列を有せず、この場合は、天然Ｇuy's13リーダー配列をコード するＤＮＡをＰＣＲ増幅に含んだ。 ｂ．植物形質転換および再生 約６mm直径の葉ディスクを表面滅菌タバコ葉(Ｎicotiana tabacum，var．xant hii)から切り、一晩、２８℃で、免疫グロブリンｃＤＮＡ挿入体含有組換えＡ． tumefaciensの培養と共にインキュベートした。このディスクを新芽の再生を誘 発する、カナマイシン(２００mg／ｌ)およびカルベニシリン(５００mg／ｌ)添加 培地を含む培養プレートに移した。この段階後の新芽発育を切除し、カナマイシ ン(２００mg／ｌ)を添加した根誘発培地に移植した。発根小植物を、根の出現の できるだけ直後に土壌に移植した。植物を、下記のように、免疫グロブリン鎖発 現についてスクリーニングした。重鎖を発現したものは、軽鎖を発現したものと 、交差授粉により交配させた。得られた種子を土壌に蒔き、発芽させた。２２ト ランスジェニック植物が、ELISAで測定して、軽または重鎖構築物を伴って形質 転換体から再生した。軽および重鎖分泌植物の交差は、カッパおよびガンマ鎖を 共 に発現するＦ１植物３／１０、カッパおよび植物Ｇ１／Ａ重鎖を両方発現する植 物４／１７およびカッパおよび植物Ｇ２／Ａ重鎖を両方とも発現する植物３／８ をもたらした。 植物中でのＧuy's13モノクローナル抗体発現の３つの異なる形は、従って、全 て、同一な軽(カッパ)鎖であるが、異なる重鎖を含む。これらは、この報告を通 して、以下(図１)のように略する：本来のガンマ重鎖のＧuy's13ＩｇＧ、植物Ｇ １３、var−γ１−γ２−α２−α２ドメインを含むＩｇＧ／ＩｇＡハイブリッ ド重鎖のＧuy's13、植物Ｇ２／Ａ。陽性対照として使用するＧuy's13ハイブリド ーマ細胞培養上清をマウスＧ１３と略す。陰性対照植物は、無関係マウスタンパ ク質をコードする挿入体を含むpMON530ベクターで形質転換したものである。 ｃ．抗体鎖検出 ガンマ、カッパまたはガンマ／アルファ鎖ハイブリッドの製造をELISAで検出 した。マイクロタイターウェルを、１５０mＭ ＮａＣｌ、２０mＭ Ｔris−Ｈ Ｃｌ(ｐＨ８)(ＴＢＳ)中のヤギ抗マウス重または軽鎖特異的ＩｇＧ(Ｆisher，Ｕ ＳＡ；Ｓigma，ＧＢ；Ｎordic Ｐharmaceuticals，ＧＢ)で覆った。ブロッキン グは、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳で４℃で一晩行った。植物葉をＴＢＳ中で、ロイ ペプチン(１０μg／ml)(Ｃalbiochem，ＵＳＡ)と共に均質化した。上清を連続２ 倍希釈でマイクロタイタープレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。 ０.０５％トゥイン２０含有ＴＢＳで洗浄後、結合免疫グロブリン鎖を適当な西 洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス重または軽鎖特異的抗体(Ｆisher； Ｓigma；Ｎordic Ｐharmaceuticals)で、２時間、３７℃で検出した。検出は、 ２,２'−アジノ−ジ(３−エチル−ベンズチアゾリン−スルホネート)(Ｂoehring er，ＦＲＧ)で行った。 同様な検定を使用して、マウスおよび植物Ｇuy's13抗体の濃度の測定を行った 。これらを、既知の濃度で使用したマウスＩｇＧ１(MOPC21)およびマウスＩｇＡ mＡb(TEPC21)(Ｓigma)と比較した。ELISAプレートを抗マウスカッパ抗血清で覆 った。ブロッキング後、結合抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスガ ンマまたはアルファ抗血清で検出した。抗体濃度を、各抗体の結合曲線を比較し て 測定した。 ELISAをまた集合抗体の結合機能測定の検出に使用した。ＳＡ Ｉ／IIへの結 合を、２μg／mlの最適濃度の精製ＳＡ Ｉ／IIで覆ったマイクロタイタープレ ートを使用して検出した。ELISA法は上記の通りである。Ｓ．mutansまたはＥ． ｃoli細胞を結合する能力は、静止期まで１８時間、３７℃で成育させ、固定し た無傷細胞(株Ｇuy's ｃ、Ｓ．mutansおよびＤＨ５−α、Ｅ．coli)を使用して 検出した。全ての抗体溶液を１.５μg／mlの最初の濃度に調節し、連続２倍希釈 で使用した。Ｇuy's13重または軽鎖を単独に発現する植物の抽出物でまたこの検 定を行い、単一免疫グロブリン鎖が抗原結合活性を示すか否か測定した。細胞ま たは精製ＳＡ Ｉ／IIに結合する抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ 抗マウス軽または重鎖抗血清(Ｎordic Ｐharmaceuticals)を使用して検出した。 この結果は、３つの別の検定の二つの結果の平均±標準分散として示す。 競合ELISAは、精製ＳＡ Ｉ／IIで覆ったマイクロタイタープレートで、上記 のように行った。プレートを、１.５μg／mlのＧuy's13ハイブリドーマ上清の植 物抽出物および連続二倍希釈で、３７℃で１時間および４℃で一晩行った。洗浄 後、¹²⁵Ｉ−標識マウスＧuy's13を添加し、２時間３７℃でインキュベートを続 けた。プレートを再び洗浄し、結合放射活性をガンマカウンター(Ｈydragamma16 ，Ｉnnotec，ＧＢ)で計数した。結果を標識マウスＧuy's13の阻害％として示し 、１００％はブロッキング溶液を添加していないウェルからの放射活性計数であ る。 ｄ．ウエスタンブロット分析 葉均質物の１０μlのアリコートを、還元および非還元条件下で、７５mＭ ト リス−ＨＣｌ(pＨ６.８)、２％ＳＤＳと共に沸騰させた。１０％アクリルアミド のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをニトロセルロースにブロットした。ブロット を１６時間、０.０５％トゥイン２０および１％脱脂粉乳含有ＴＢＳ中でインキ ュベートし、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ１、カッパ(Ｎordic Ｐharmaceuticals) またはアルファ鎖特異的抗血清(Ｓigma)と２時間、３７℃でインキュベートした 。洗浄後、２層抗体、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ(Ｓigma) を２時間、３７℃で適用した。抗体結合を、３００μg／mlニトロブルーテト ラゾリウムおよび１５ｐ μg／ml ５−ブロモ−５−クロロ−３−インドリル ホスフェート(Ｐromega)とのインキュベーションにより検出した。 ｅ．ＤＮＡ配列決定 各クローン免疫グロブリン遺伝子挿入体のＤＮＡ配列は、ＰＣＲ増幅またはク ローニング工程中に変異が起こっていないことを確認する。λ／γハイブリッド 重鎖のＨindIII部位の挿入は、植物Ｇ２／ＡのＣγ２およびＣα２ドメインの間 のロイシン残基および植物Ｇ１／ＡのＣγ１およびＣα２ドメインの間のロイシ ン−リジン残基の予定された挿入をもたらす。植物Ｇ２／Ａ構築物の付加Ｃγ２ ドメインは、重鎖の長さを１４１アミノ酸残基(約１２０００Ｄa)まで増加させ る。予定の植物Ｇ１／Ａ重鎖は、天然Ｇuy's13重鎖より、３３アミノ酸まで、約 ３０００Ｄa大きい。 Ｅ．coliの陽性形質転換体から精製されたプラスミドＤＮＡを配列決定した。 免疫グロブリン遺伝子挿入体を切除し、Ｂluescript(Ｓtratagene，USA)にサブ クローンした。ＤＮＡ配列を、ジデオキシ末端法(Ｓequenase，USA，USA)で測定 した。 ｆ．集合抗体の発現 これらの代表的Ｆ１子孫植物由来の抽出物のウエスタンブロット分析は行われ 、Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131-138(1994)の図２に報告されてい る。還元条件で流したサンプルは、マウスＧuy'13ならびに３つのトランスジェ ニック植物での約２５Ｋｄの所の軽鎖の存在を証明するが、対照植物にはなかっ た。Ｇuy's13重(ガンマ)鎖はまた植物Ｇ１３の約５７Ｋｄの所で検出されるが、 対照植物抽出物ではなかった。単一タンパク質種は検出され、Ｇuy's13抗体細胞 培養上清を製造するハイブリドーマと異なり、２つのタンパク質種が矛盾しない 発見であった。マウス重鎖の分子サイズの差異は恐らく糖付加差異によるもので あり、この結果は、植物中で二つの重鎖が同じ方法で糖付加され得ることを示す 。 植物Ｇ１／ＡおよびＧ２／Ａの重鎖を、抗アルファ鎖抗血清で検出する。マウ スＧuy's13重鎖(約５７Ｋｄ)と比較して、植物Ｇ１／Ａの重鎖は僅かに大きい相 対的分子質量(約６０Ｋｄ)を有し、植物ＧＡ／２重鎖はより大きい(約７０Ｋｄ) 。 これは配列分析で予期される分子量と一致する。幾つかの他のタンパク質種はト ランスジェニック植物抽出物質で検出された。これらは、対照トランスジェニッ ク植物からの抽出物で結合が検出されかったため、軽／重鎖複合体または重鎖の タンパク質分解フラグメントであるようである。抗アルファ鎖抗血清は、ガンマ 鎖ドメインのみを含むマウスＧuy's13と交差反応しなかった。 サンプルをまた非還元条件でも流し、免疫グロブリン分子中への重および軽鎖 の集合を確認し、Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131-138(1994)に報告 されている。検出は、標識抗カッパ抗血清と重内、全ての３つのトランスジェニ ック植物は、完全長抗体の上記１５０Ｋｄの正しいＭ_rで集合免疫グロブリンを 有した。植物Ｇ１３抗体は、マウスＧ１３と同じＭ_rを有するが、植物Ｇ２／Ａ および植物Ｇ１／Ａ抗体は予測したように、高いＭ_rを有した。多くの小さいタ ンパク質分解フラグメントもまた検出され、それは先の発見および多くのプロテ アーゼが抗体抽出工程中に遊離される事実と一致する。これらの抗体フラグメン トは、対照植物抽出物における検出可能バンドの欠失により確認される。 ｇ．抗原結合 免疫グロブリンを製造する１０個の植物を全部で製造し、植物抽出物中の免疫 グロブリンの濃度は１から１０μg／ml(平均４.５μg／ml)の間で変化した。こ の研究で使用したマウス抗体および代表植物について、ELISAで測定した濃度は ：マウスＩｇＧ−１５.４μg／ml、植物ＩｇＧ−７.７μg／ml、植物Ｇ１／Ａ− １.５μg／mlおよび植物Ｇ２／Ａ−２.１μg／ml。ハイブリッド重鎖を含む植物 抗体について測定した濃度は、使用した標準ｍＡｂ ＩｇＡと比較して、定常領 域決定基の全ては有しないため、恐らく少なく見積もられる。 ＳＡ Ｉ／IIと結合する３つの代表トランスジェニック植物の抽出物の力価曲 線は製造され、Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131-138(1994)に報告さ れている。特異的抗体は全ての３つのトランスジェニック植物から検出可能であ り、力価曲線はマウスは、同じ濃度で使用したマウスハイブリドーマ細胞培養上 清と同一であった。力価曲線は同じパターンに従うが、植物Ｇ１／Ａ抗体の結合 は他の抗体より僅かに低いように見える。ＳＡ Ｉ／II結合活性は、陰性対照植 物で検出されず、また精製ＳＡ Ｉ／IIに対して結合活性を有する軽または重鎖 を個々に発現する植物からも抽出されなかった。これらの発見は、軽および重鎖 の両方を発現するトランスジェニック植物が、抗体分子を正確に集合させ、機能 的抗原結合部位を形成し、一つの軽または重鎖は抗原を結合できないことを証明 する。 植物抗体はまたＭa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131-1387(1994)(Ｓ．m utans血清型ｃ)の図５に示されるように、連鎖球菌細胞表面の天然抗原も認識し 、更に植物抗体の抗原結合部位の無傷さを確認する。異なる抗体の結合部位で明 白な差はなかった。対照からのまたは重または軽鎖のみを発現する植物からの抽 出物は、Ｓ．mutans細胞への結合を示さなかった。１.０および０.５μg／mlの 濃度で、植物抽出物のＥ．coli細胞への結合はなかった。 植物抗体は、ＳＡ Ｉ／IIへの結合について、本来のマウスＧuy's13 mＡbと 競合する。¹²⁵Ｉ−標識マウスＧuy's13 mＡbのＳＡ Ｉ／IIへの結合の８５％ までの阻害が、Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131-138(1994)の図６に 示されるように、植物抗体を使用して証明された。前記のように、植物抗体の阻 害力価曲線は互いに類似であり、マウスＧuy's13のものと同等であるが、対照植 物抽出物は阻害しなかった。 ｈ．Ｓ．mutansの凝集 細菌のＧuy's13抗原結合領域を有する植物で製造された免疫グロブリンの活性 は、Ｍa et al.，Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol.，24:131-138(1994)の図７で測定および 報告されている。植物抽出物は、０.２２μm孔サイズフィルターを通した濾過に より滅菌し、Ｔodd Ｈewittブロスで１０倍希釈した。サンプルにＳ．mutans一 晩培養物の０.０５容量を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。サンプル をグラム染色し、油浸顕微鏡観察下に試験した。マウスＧuy's13、植物Ｇuy's13 、植物Ｇ１／Ａまたは植物Ｇ２／Ａ存在下で成育したＳ．mutansは凝集し、細胞 クランピングが明らかであった。しかしながら、対照植物抽出物は、Ｓ．mutans 成育に何ら影響を与えなかった。８、１２および１６時間での生存生物の培養に より測定し、植物ｍＡｂはＳ．mutansの成長速度に影響は与えなかった。この結 果 は、植物抗体が、抗原結合領域を正確に集合させているだけでなく、抗体分子が 抗原に二価的に結合することも証明する。 実施例７．防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造 ４種のトランスジェニックタバコ植物を生育させ、(１)Ｇuy's13軽鎖の抗原結 合部位を有するマウスモノクローナル免疫グロブリンカッパ鎖、(２)Ｇuy's13重 鎖のＧγおよびＣα鎖ドメイン並びに抗原結合部位を含むハイブリッドＩｇＡ／ Ｇマウス免疫グロブリン重鎖、(３)マウスＪ鎖および(４)ウサギポリ免疫グロブ リン受容体のアミノ酸１−６０６を含み、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のア ミノ酸６２７−６７５を含まない防御タンパク質を発現させた。実施例１参照。 これらの植物間の連続的交配は、子孫植物における全ての４つのタンパク質鎖の 同時発現をもたらした。ある場合、戻り交配を、ホモ接合植物を製造するために 使用した。４つの組換えポリペプチドは、約４７０,０００Ｋｄの防御タンパク 質を含む機能的、高分子量免疫グロブリンに結合した。防御タンパク質の免疫グ ロブリンへの集合は、抗体単独を発現する植物を防御タンパク質を発現するもの と交配した場合に、防御タンパク質の結合が検出されていないため、Ｊ鎖の存在 に依存する。防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する植物の顕微鏡評価 は、単一細胞中の防御タンパク質および免疫グロブリン重鎖の同時発現を証明し た。単一細胞は、トランスジェニック植物中で防御タンパク質を有する免疫グロ ブリンを製造できるが、２つの細胞は、哺乳類で分泌型免疫グロブリンの天然の 製造に必要である。結果は、組換えサブユニットを発現するトランスジェニック 植物の交配が、受動免疫治療用防御タンパク質の大規模製造にならびに他の複合 体タンパク質分子の発現に適していることを証明する。防御タンパク質を含む免 疫グロブリンは、Ｓmith，Ｒ.＆Ｌehner，Ｔ．Ｏral Ｍicrobiol．Ｉmmunol．4 ，153-158(1989)に示される用に、経口連鎖球菌の細胞表面粘着分子ＳＡ Ｉ／I Iを特異的に認識するＧuy's13モノクローナル抗体由来の重および軽鎖抗原結合 ドメインを有する。重および軽鎖のみを含むこのタイプのトランスジェニック免 疫グロブリンは、実施例６に記載のように、Ｎicotiana tabacum植物で製造され ている。コード長ｃＤＮＡを含むマウスＪ鎖構築物を、Ｍatsuuchi，Ｌ.，Ｃann ， Ｇ．Ｍ.＆Ｋoshland，Ｍ.Ｅ．ＰＮＡＳ 83，456-460(1986)に記載のように、マ ウスＪ鎖のＮ末端ＭＫＴＨＬＬおよびＣ末端ＳＣＹＰＤに対応する合成オリゴヌ クレオチドプライマーを使用して増幅した。この増幅ヌクレオチド配列を、カリ フラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓプロモーターを含み、Ｒogers，Ｓ．Ｇ. ，Ｋlee，Ｈ．Ｊ．Ｈorsch，Ｒ．Ｂ.＆Ｆraley，Ｒ.Ｔ．Ｍeth．Ｅnzymol．153 ，253-2796(1987)に記載されている構造的植物発現ベクター、pMON530にライゲ ートした。タバコ葉組織を、前実施例に記載のように組換えプラスミドを含むア グロバクテリウムを使用して形質転換した。再生植物を、Ｊ鎖をコードするメッ センジャーＲＮＡの製造についてスクリーニングし、陽性形質転換体を、ホモ接 合子孫を製造するために自家授粉した。Ｊ鎖発現植物を最初に、キメラ免疫グロ ブリン重鎖およびカッパ鎖を発現するものと交配した。キメラ免疫グロブリン重 鎖を発現する植物由来の植物抽出物の、抗カッパ抗血清による、非還元条件下で のウエスタンブロット分析は、本来のＩｇＧ１抗体と比較して、キメラ免疫グロ ブリン重鎖に存在する余分な定常領域の存在と一致する、約２１０Ｋｄのタンパ ク質種を明らかにした。免疫グロブリンを発現する植物とＪ鎖植物の間の交配は 、相対的分子量約４００Ｋｄの約２倍の主要免疫グロブリンバンドの存在をもた らし、３ポリペプチドの集合が２量体免疫グロブリン(ｄＩｇＡ／Ｇ)を発生させ ることを証明した。 コード長ｃＤＮＡを含む防御タンパク質構築物を、ウサギポリ免疫グロブリン 受容体のアミノ酸６０１−６０６のＮ末端ＭＡＬＦＬＬおよびＣ末端ＡＶＱＳＡ Ｅに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。ウサギポリ免 疫グロブリン受容体のヌクレオチド配列は、Ｍostov，Ｋ．Ｅ.，Ｆriedlander， Ｍ.＆Ｂlobel，Ｇ．Ｎature 308，37-43(1984)に報告されている。防御タンパク 質を上記のようにトランスジェニック植物中で産生させ、防御タンパク質を発現 する陽性形質転換体をウエスタンブロット分析により同定した。 ２量体を形成するために、ＩｇＡ／Ｇ重鎖を有する免疫グロブリンと会合させ たＪ鎖を発現する植物を、次いで、防御タンパク質を発現するホモ接合植物と交 配した。防御タンパク質を有する免疫グロブリンを発現する子孫植物は、非還元 条件下でウエスタンブロット分析で測定して、約４７０Ｋｄの高分子量タンパク 質種を含んだ。この分子サイズは、防御タンパク質を含む免疫グロブリンで予期 されるものと一致した。この高分子量タンパク質は、防御タンパク質を特異的に 認識する抗血清を使用したウエスタンブロットで確認して、防御タンパク質を含 んだ。植物抽出物は、また、ＩｇＡ／Ｇの２量体に対応する約４００Ｋｄのタン パク質種およびキメラ重鎖の免疫グロブリンに対応する約２１０Ｋｄのタンパク 質種も含んだが、これらは抗カッパ抗血清でのみ検出され、抗防御タンパク質抗 血清では検出されなかった。防御タンパク質のみを製造するトランスジェニック 植物において、高分子量タンパク質が非還元条件のウエスタンブロットで検出さ れたため、防御タンパク質が内因性植物タンパク質と会合しているまたは多量体 を形成している証拠はなかった。ウエスタンブロット分析は、防御タンパク質ま たはＪ鎖のみを含む植物または野生型植物由来ではなく、免疫グロブリン重鎖( ＩｇＡ／Ｇ、２量体ＩｇＡ／Ｇおよび防御タンパク質を含む免疫グロブリン)由 来の抽出物が同一の免疫グロブリン由来重および軽鎖を含むことを証明した。更 に、防御タンパク質を含む植物および防御タンパク質を有するＩｇＧ／Ａ免疫グ ロブリンを含む植物のみが、防御タンパク質を特異的に認識する抗血清により認 識されるタンパク質を発現した。野生型対照植物からの抽出物で、交差反応タン パク質は検出されなかった。 哺乳類において、免疫グロブリンを有する分泌成分の集合は、Ｂrandtzaeg， Ｐ.＆Ｐrydz，Ｈ．Ｎature 311，71-73(1984)に記載のように、Ｊ鎖の存在を必 要とする。キメラ重鎖(ＩｇＡ／Ｇ)を含む免疫グロブリンを発現する植物を、防 御タンパク質を発現する植物と交配させた。免疫グロブリンおよび防御タンパク 質をＪ鎖無しで発現する子孫は１０のうち一つも集合複合体を製造しなかったが 、比較して、Ｊ鎖２量体免疫グロブリンおよびＪ鎖無しの防御タンパク質を共発 現する植物の１０／１０が防御タンパク質を含むＭ_r４７０Ｋｄ免疫グロブリン を集合させた。これは、哺乳類で見られるように、Ｊ鎖が防御タンパク質の免疫 グロブリンへの会合に必要であることを確認する。抗カッパ抗血清で、約２１０ Ｋｄ一量体形の免疫グロブリンのみが認識され、防御タンパク質と特異的に結合 す る抗血清は、遊離防御タンパク質を認識したが、免疫グロブリン重または軽鎖タ ンパク質は認識しなかった。 機能的研究を、ELISAを使用して、５つの植物構築体で製造された免疫グロブ リンを使用して行った。免疫グロブリン軽および重鎖を発現する全ての植物は、 連鎖球菌抗原(ＳＡ Ｉ／II)を特異的に認識する機能的免疫グロブリンを集合さ せた。結合のレベルおよび力価曲線は、天然マウスハイブリドーマ細胞上清と類 似であった。Ｊ鎖のみまたは防御タンパク質のみを発現する植物または野生型植 物でＳＡ Ｉ／II結合は検出されなかった。免疫グロブリンの固定化精製連鎖球 菌抗原または細菌細胞表面の天然抗原への結合もまた、防御タンパク質に特異的 に結合する抗血清を使用して検出した。これらの検定において、防御タンパク質 を含む免疫グロブリンの連鎖球菌抗原への結合が特異的に検出された。これらの 結果は、防御タンパク質が免疫グロブリンと会合し、抗原結合を妨害しない方法 で、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを製造することを確認した。 植物中での重および軽鎖の機能的免疫グロブリン分子への集合は、Ｈiatt，Ａ .Ｃ.，Ｃafferkey，Ｒ.＆Ｂowdish，Ｋ．Ｎature 342，76-78(1989)で示される ように非常に効率的である。シグナルペプチドは重および軽鎖構築物の両方に存 在すべきであり、組換えタンパク質に、Ｈiatt，Ａ.Ｃ.，Ｃafferkey，Ｒ.＆Ｂo wdish，Ｋ．Ｎature 342，76-78(1989)に先に示されているように、小胞体抗体 の集合が植物内で起こるように、指示をする。この研究は、トランスジェニック 植物中での一量体抗体のＪ鎖による２量体化を含む、免疫グロブリン集合の忠実 性を証明している。これらの研究は、植物中で、免疫グロブリン集団が全抗体の 主要集団(約５７％)を意味することを証明する。これらの結果はまた、防御タン パク質が取り込まれたとき、全抗体の主要集団(約４５％)を形成する、対応する 抗原ならびに親マウスモノクローナル抗体と結合する防御タンパク質を含む集合 免疫グロブリンの製造も証明する。 植物内の防御タンパク質を有する２量体免疫グロブリンの共発現は、防御タン パク質を含む機能的免疫グロブリンの集合を導く。この複合体タンパク質の全４ つのトランスジーンを、同一のpMON530カセットおよび天然リーダー配列と共に 植物内に挿入した。このベクターは、Ｂenfey，Ｐ.Ｎ.＆Ｃhua，Ｎ-Ｈ．Ｓcienc e 250，959-966(1990)；およびＢarnes，Ｗ.Ｍ．ＰＮＶＡＳ 87，9183-9187(199 0)により記載されているように、ほとんどの植物器官の種々の細胞型でトランス ジーンの発現を指示するカリフラワー・モザイクウイルスの３５Ｓ転写物由来の プロモーター配列を含む。同じプロモーターでの全４トラスジーンの発現の指示 は、共通植物細胞中の同時発現の可能性を最大にする。防御タンパク質を含む免 疫グロブリンを発現する植物の顕微鏡観察は、葉の多くの細胞型が免疫グロブリ ンを形成する個々のタンパク質成分を含むことを明らかにした。これらのタンパ ク質は、維管束鞘細胞中に最も高い濃度で蓄積され、これらおよび他の細胞の細 胞壁に限定されるが、細胞内領域には見られなかった。最大免疫グロブリン成分 、防御タンパク質およびキメラ免疫グロブリン重鎖の、個々の細胞のプロトプラ ストまたはアポプラスト区画領域内の制限は、全ての成分分子が合成されるこれ らの細胞への分泌型免疫グロブリンの集合をさせる。細胞下部位および集合の機 構は、決定すべきままであり、植物のＩｇＧヘテロ４量体の集合は、Ｈiatt，Ａ .Ｃ.，Ｃafferkey，Ｒ.＆Ｂowdish，Ｋ．Ｎature 342，76-78(1989)；およびＨe in，Ｍ.Ｂ.，Ｔang，Ｙ.，ＭcＬeod，Ｄ.Ａ.，Ｊanda，Ｋ.Ｄ.＆Ｍatt，Ａ.Ｃ． Ｂiotechnol Ｐrog．7，455-461(1991)により先に示されているように、両方の タンパク質が膜内システムを標的とすることを必要とする。 加えて、我々は、膜統合、トランスサイトーシスまたは続くタンパク質分解の シグナルを欠く成熟分泌成分由来の防御タンパク質が、免疫グロブリンガンマお よびアルファタンパク質ドメインを含むキメラ免疫グロブリン重鎖と会合できる ことを証明する。これらの結果は、ＩｇＧ定常領域の本来の機能(タンパク質Ａ 結合、補体固定、Ｆｃ受容体活性)が２量体免疫グロブリンでも維持され得、防 御タンパク質と結合できることを証明する。これらの付加的能力は、受動免疫治 療に使用する免疫グロブリンの機能の促進に使用し得、防御タンパク質を含む機 能的免疫グロブリンを製造できる植物の開発は、受動免疫治療において著しく密 接である。防御タンパク質を含む免疫グロブリンの発現レベルは高く、製造は、 モノクローナル抗体の経済的製造を可能にするために、農業的比率まで拡大でき る。方法 以下の方法は、本実施例の免疫グロブリンの製造および分析に使用した。 ｉ）トランスジェニックＮicotiana tabacum中の抗体集合 葉切片を、ロイペプチン(１０μg／ml)含有１５０mＭ ＮａＣｌ、２０mＭト リス−ＨＣｌ(ｐＨ８)(ＴＢＳ)中で均質化した。抽出物を、非還元条件下で、７ ５mＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ６.８)、２％ＳＤＳ中で３分沸騰させ、４％アクリル アミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをニトロセルロースにブロットした。 ブロットを２時間、ＴＢＳ中で、０.０５％トゥイン２０および１％脱脂粉乳と 共に２時間インキュベートし、続いて、適当な抗血清と共に、２時間、３７℃で インキュベートした。洗浄後、第２層アルカリホスファターゼ結合抗体を２時間 ３７℃で適用した。抗体結合を、３００mg／mlニトロブリーテトラゾリウムおよ び１５０mg／ml５−ブロモ−４−クロロ３−インドリルホスフェートとのインキ ュベーションにより検出した。 これらの抽出物を、ウエスタン分析を使用して分析し、免疫グロブリンが免疫 グロブリン分子に集合しているか否かを測定し、ウエスタンブロット分析は、非 還元条件下で製造した植物抽出物で、抗カッパ抗血清(Ｂradsure，ＵＫ)および 防御タンパク質を特異的に認識する抗血清で行った。植物中で作られる免疫グロ ブリンを、Ｓmith，Ｒ.＆Ｌehner，Ｔ．Ｏral Ｍicrobiol．Ｉmmunol．4，154-1 58(1989)記載のモノクローナルＩgＧ１ Ｇuy's13免疫グロブリンと比較した。 ii）ウエスタン分析 ウエスタン分析を、還元条件下で製造した各植物抽出物について行い、免疫グ ロブリンの個々のタンパク質成分を同定した。種々の植物抽出物のサンプルを、 前記の様に、だたし５％β−メルカプトエタノールを添加して、製造した。１０ ％アクリルアミド中のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルのタンパク質をニトロセル ロースに移した。個々のタンパク質を、抗マウスγ１重鎖(Ｓigma，ＵＫ)；抗マ ウスカッパ鎖(Ｂradsure，ＵＫ)；または防御タンパク質を特異的に認識する抗 血清、続いて適当なアルカリホスファターゼ結合抗体を使用して検出した。 iii）防御タンパク質を有する免疫グロブリンの製造を示すためのウエスタン 分析 トランスジェニック植物抽出物のウエスタン分析を上記ii）に記載のように行 った。防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する植物由来の植物抽出物を 非還元条件下および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質をニトロ セルロースに移した。免疫グロブリン成分を、抗カッパ抗血清または防御タンパ ク質を特異的に認識するヒツジ抗血清、続いて、適当なアルカリホスファターゼ 標識２°抗体で検出した。 iv）トランスジェニックＮicotiana tabacumにおける防御タンパク質を含む抗 原特異的免疫グロブリンの発現 植物が抗原特異的免疫グロブリンを製造することを証明するために、精製連鎖 球菌抗原(ＳＡ)Ｉ／IIに結合する植物抽出物を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標 識抗カッパ鎖抗血清で検出して、測定した。抗原特異的免疫グロブリンにおける 防御タンパク質の存在を、防御タンパク質に免疫特異的なヒツジ抗血清、続いて アルカリホスファターゼ標識ロバ抗ヒツジ抗血清で検出して、精製連鎖球菌抗原 Ｉ／IIおよび連鎖球菌細胞に結合する植物抽出物により証明した。抗原特異的免 疫グロブリンのこれらの試験を、ＴＢＳ中の精製ＳＡ Ｉ／II(２μg／ml)また は炭酸水素緩衝液(ｐＨ９.８)中の対数増殖期Ｓtrep，mutans(NCTC 10449)で覆 ったマイクロタイタープレートで行った。ブロッキングを、ＴＢＳ中の５％脱脂 粉乳で、室温で２時間行った。植物葉を１０μg／ml中のロイペプチン(Ｃalbioc hem，ＵＳＡ)と、ＴＢＳ中で均質化した。マウスＧuy's13ハイブリドーマ細胞培 養上清(ＩｇＧ)を陽性対象として使用した。上清を連続二倍希釈でマイクロタイ タープレートに添加し、室温で２時間インキュベーションした。０.０５％トゥ イン２０含有ＴＢＳで洗浄後、結合免疫グロブリン鎖を、西洋ワサビペルオキシ ダーゼ結合ヤギ抗マウス軽鎖特異的抗体(Ｎordic Ｐharmaceuticals，ＵＫ)また はヒツジ抗ＳＣ抗血清、続いてアルカリホスファターゼ標識ロバ抗ヒツジ抗体で 、２時間、室温で検出した。２,２'−アジノ−ジ−[３−エチル−ベンズチアゾ リン−スルフォネート](Ｂoehringer，Ｗ．Ｇermany)でＨＲＰＯ結合抗体または ジ ナトリウムｐ−ニトロフェニルホスフェート(Ｓigma，ＵＫ)でアルカリホスファ ターゼ抗体を検出した。 ｖ）免疫グロブリン成分の植物中での局在化 防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現するトランスジェニック植物およ び対照Ｎicotiana tabacumの光顕微鏡写真を、マウスα鎖の免疫金(immunogold) を使用して製造した。簡単に、葉片を２mm×１０mm切片に切断し、１００mＭリ ン酸ナトリウム(ｐＨ７.４)中の３％(ｗ／ｖ)パラホルムアルデヒド、０.５％( ｗ／ｖ)グルタールアルデヒド、５％(ｗ／ｖ)シュークロースに固定した。無水 エタノールで脱水後、葉切片をキシレンで浸透させ、パラフィンに埋め、３mm切 片に切り、スライドガラス上に、免疫化学染色のためにのせた。葉切片を一次抗 体、親和性精製ウサギ抗マウスアルファ鎖(Ａ／Ｇハイブリッド重鎖と反応する) またはヒツジ抗ウサギＳＣと、次いで二次抗体；ヤギ抗ウサギ１０mn金またはウ サギ抗ヒツジ１０mn金とインキュベートした。免疫金シグナルを銀促進により強 めた。植物を、位相差および明視野顕微鏡の両方を使用して、同じ葉横断切片を 見た。防御タンパク質の連続領域中の免疫局在化を、免疫グロブリンとして重鎖 の細胞性局在化を示すために使用した。分析を以下の細胞および細胞区画で行っ た：海綿状葉肉組織細胞、表皮細胞、細胞間隙、さく状柔組織細胞および維束管 。 免疫グロブリン成分の正確な局在化の更なる分析を、Ｎicotiana tabacum維束 管の連続部分および対照Ｎicotiana tabacum維束管で、免疫グロブリンの各成分 について、免疫金検出で行った。分泌型免疫グロブリンを発現する植物由来のト ランスジェニック植物葉の連続部分を、防御タンパク質を特異的に認識する抗体 または抗ＩｇＡ抗体、続いて適当な金標識二次抗体とインキュベートした。免疫 グロブリンコード配列を含まないトランスジェニック植物由来の対照葉部分もま た抗ＩｇＡ抗体、続いて金標識ヤギ抗ウサギ抗血清または金標識二次抗体単独と インキュベートし、染色の特性を確認した。植物を、位相差および明視野蛍光の 両方を、防御タンパク質の局在化を示すのに使用した。維束管の連続葉横断切片 の明視野蛍光は、防御タンパク質で示されたのと同じ、免疫グロブリン重鎖の局 在化を証明する。 実施例８．防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む有用な植物抽出物の製 造 防御タンパク質を含む免疫グロブリンを製造する植物の植物片(葉、幹、花、 根または組み合わせ)を均質緩衝液(緩衝液２ml／植物材料ｇ；均質緩衝液：１５ ０mＭ ＮａＣｌ、２０mＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７.５)と混合し、Ｗaring混合機 を使用してパルプまで均質化し、１０,０００×ｇで遠心し、破片を除いた。次 いで、上清を等量のＨＰＬＣグレード酢酸エチルで室温で振ることにより抽出し 、続いて１０,０００×ｇで遠心した。水相を他の容器に移し、残っている酢酸 エチル水相から、溶液を真空下に置くことにより除去した。得られた粗抽出物は 、決まりきって防御タンパク質を有する免疫グロブリン１００μg／mlを含んだ 。この方法は、防御タンパク質を含む植物で有用である。 乳鉢および乳棒またはＰolytronを含む均質化のための多くの方法が使用され 、冷してまたは室温で行うことができる。 抽出物は、ヘキサンまたは他の有機溶媒での抽出による脱脂により更に精製し 得る。脱脂は植物抽出物から有用な生産物を得るのに必須ではないが、最終生産 物が防御タンパク質を有する精製免疫グロブリンである場合は有利である。多く の場合、粗抽出物が、更なる精製または富化なしに、使用するのに充分な高い量 (即ち、１００μg／mＬ)の防御タンパク質を有する免疫グロブリンを含む。経口 投与のために、抽出物は通常、香味剤および安定化剤と混合して使用する。歯へ の使用のために、抽出物は、加えて、ゲル化試薬と混合して、抽出物の歯への接 触を持続する。胃投与において、香味抽出物を直接飲む。 実施例９．防御タンパク質を含む免疫グロブリンの安定性 粗植物抽出物の２つのセットを上記のように製造した。第１の抽出物はＩｇＧ １抗体を発現する植物由来および第２の抽出物は防御タンパク質を発現する植物 由来であった。植物由来のこのタイプの粗植物抽出物は種々のタンパク質分解酵 素を含むことが知られている。抽出物の室温または３７℃での長時間のインキュ ベーションは、従って、タンパク質分解的消化を起こす。 ELISAを使用して、二つの抽出物中のガンマ−カッパ複合体の量を、室温およ び３７℃で時間の関数として測定した。これらの検定において、抗カッパ鎖抗体 をプレートをコードするのに使用し、続いて、３７℃で１時間、植物抽出物とイ ンキュベーションした。ＨＲＰＯに結合した抗ガンマ鎖抗体を植物由来の免疫グ ロブリンの検出に使用した。抽出直後の抽出物に含まれる防御タンパク質を有す る免疫グロブリンの量を１００％として取った。室温で３時間後、ＩｇＧ１を４ ０％含み、防御タンパク質を含む免疫グロブリンを＞９５％含んだ。６時間後、 残っているＩｇＧ１抗体は２０％および豊富な防御タンパク質を含む免疫グロブ リンはまだ＞９５％であった。１２時間後、検出可能なＩｇＧ１は存在しなかっ たが、〜９０％の防御タンパク質を有する免疫グロブリンが残っていた。豊富な 防御タンパク質の有意(〜７０％まで)の減少は、抽出物を製造して４８時間後ま で観察されなかった。 実施例１０．防御タンパク質を含む免疫グロブリンを発現する真核テトラトラン スジェニック細胞 防御タンパク質を含む免疫グロブリンを構成する４つの鎖はまたインビトロ( 細胞培養)またはインビボ(トランスジェニック動物)の他の細胞タイプでも発現 できる。Ｍanipulating the Ｍouse Ｅmbryo；Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｂ．Ｈ ogan et al.，Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaboratory(1986)参照。トランスジェニ ック動物の場合、適当なベクターＤＮＡの精製製造物を、１０mＭトリス、０.２ mＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４中で２ng／μlの最終濃度に調整する。前核注入を、 近交系動物から製造した接合体を使用して行う。次いで、注入卵を標準技術を使 用して疑似妊娠雌に移入する。次いで、生存して生まれてきた動物をＰＣＲおよ び ELISAのような通常使用されている多くの方法を使用して、トランスジーンの存 在についてスクリーニングする。次いで、防御タンパク質を含む免疫グロブリン の異なる成分を発現する血統の仲間を多トランスジーン動物を製造するために交 尾させる。次いで、これらの交配の子孫を、全４つの鎖を発現するものを同定す るためにスクリーニングする。接合体注入に使用したベクタータイプに依存して 、種々の細胞タイプが、防御タンパク質を含む完全免疫グロブリンを集合させる トランスジェニック動物で同定できる。これらのベクターＤＮＡは、特定細胞タ イプまたは組織中でトランスジーンの転写を可能にする特異的プロモーター要素 を含むことができる。各ベクターは、防御抗体(ＩｇＧ／Ａ、Ｊ鎖、防御タンパ ク質またはカッパ鎖)の単一成分を発現するかまたは一つ以上の成分を発現し得 るこの場合、ベクターは、各トランスジーンの転写をさせるための適当な数のプ ロモーター領域および制限部位を含む。 細胞培養系中の全４つの鎖の発現は、各成分を個々に促進できるＤＮＡベクタ ーを使用して達成でき、そこから各成分を個々に促進できる。これは、同じベク ターＤＮＡ上の発現カセット(プロモーター、多重クローニング部位およびポリ アデニル化領域)を必要とする。あるいは、個々の細胞系を、各ベクターが細胞 場で選択的耐性を付与する限り、一本鎖を発現する別の個々のベクターに連続移 入できる。 pMAMneo(Ｃlontech)のような通常入手可能なベクターが、多重発現または別の 選択可能マーカーを発現するベクターのシリーズのいずれにも適することができ る。 線維芽細胞のような真核細胞の形質導入は慣用法で行う。簡単に、細胞を形質 導入の前日に１：２０に分割し、１２５mＭ ＣａＣｌ₂、１４０mＭ ＮａＣｌ 、２５mＭ Ｈepes、０.７５mＭ ＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７.０５および５μgＤＮＡ ／１０cm皿を使用して、約３０％コンフルエントで形質導入する。ＤＮＡインキ ュベーションの１６時間後、細胞を１０％ジメチルスルフオキシドで３分間衝撃 を与える。形質導入４８時間後、細胞を抗生物質または他の細胞毒性試薬を含む 適当な培地での成育による選択に付す。 得られる細胞は、防御タンパク質を含む免疫グロブリンのためのすべての成分 を製造する。これらの成分は、防御タンパク質を含む機能的免疫グロブリンを製 造するために適切に集合する。 実施例１１．ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞質ドメインの部分に融合す る防御タンパク質の操作 ウサギポリ免疫グロブリン受容体の細胞質ドメインのセグメントをコードする セグメントに融合した防御タンパク質の構築物を下記のように製造する。シグナ ル配列(ＭＥＴ_-18)からＧＬＵ₆₀₆の第１アミノ酸をコードする防御タンパク質ｃ ＤＮＡを、Ｂgl II−Ｘho ＩフラグメントとしてpMOBN530ベクター(Ｂgl IIおよ びＸho Ｉで消化した)のような植物発現ベクターにライゲートする。この防御タ ンパク質誘導体を、それぞれウサギポリ免疫グロブリン受容体の残基−１８から −１３およぼ残基６０１から６０６をコードするＤＮＡに相捕的でもあるＢgl I IまたはＸho Ｉ認識配列を含む適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した ＰＣＲ増幅によりＬ。ＭＥＴ_-18からＡＬＡ₆₂₈をコードする防御タンパク質ｃＤ ＮＡを得るために、Ｘho部位を含むオリゴヌクレオチドがまた残基６２３から６ ２８をコードする防御タンパク質ｃＤＮＡに相補的でもある以外、同じ方法を行 う。 ウサギポリ免疫グロブリン受容体細胞質ドメインフラグメントをコードするｃ ＤＮＡは、またＸho ＩフラグメントとしてＰＣＲ増幅により得られる。用いる オリゴヌクレオチドは、両方ともＸho Ｉ認識配列を含むＡＲＧ₆₅₃からＡＬＡ_{75 5} をコードするＤＮＡに相補的である。次いで、このフラグメントを上記の防御 タンパク質ｃＤＮＡのいずれかを含むpMON530ベクターにライゲートする。細胞 質ドメインｃＤＮＡの適当な方向を、制限消化および形質転換細菌コロニーから 得たプラスミドの配列分析により決定する。 ＰＣＲ増幅に使用するオリゴヌクレオチドは、得られるｃＤＮＡが枠内であり 、防御タンパク質および細胞質ドメインの両方を含む連続的融合タンパク質とし て翻訳されることができることを確実にするために、適当な数のヌクレオチドを 含む。 適当な方向の得られる構築物は、植物細胞中での発現を可能にするＤＮＡセグ メント(プロモーター)に操作可能に結合した、機能的膜通過セグメント無しに直 接ポリ免疫グロブリン受容体細胞質ドメインに融合した防御タンパク質をコード する。構築物は、Ｘho Ｉ制限部位の挿入に由来し、防御タンパク質と細胞質ド メインのリンカーとして作用する２つの付加アミノ酸(ＳＥＲ−ＴＲＰ)を高度す る。 次いで、これらのベクターは、前記のようにＡｇrobacteriumの形質転換に使 用し、次に植物細胞の形質転換に使用する。上記実施例の記載と同じ技術が、免 疫グロブリンの一部として本タンパク質を発現する植物の製造に使用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＵ，ＳＧ (72)発明者 ハイアット，アンドリュー・シー アメリカ合衆国92103カリフォルニア州 サンディエゴ、トランス・ストリート660 番 (72)発明者 マ，ジュリアン・ケイ−シー イギリス、エスイー11・５ピーエヌ、ロン ドン、オーセット・ストリート、トレボー ス・ハウス13番 (72)発明者 レーナー，トーマス イギリス、イーエヌ４・０エルエル、ハー トフォードシャー、バーネット、ハドリ ー・ウッド、ウッド・ライド２番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖と会 合した防御タンパク質を含む、免疫グロブリン。 ２．該免疫グロブリン由来重鎖と会合した少なくとも抗原結合ドメイン部分を 有する免疫グロブリン由来軽鎖を更に含む、請求項１記載の免疫グロブリン。 ３．該防御タンパク質と結合した少なくとも抗原結合ドメイン部分を有する第 ２免疫グロブリン由来重鎖を更に含む、請求項１または２のいずれかに記載の免 疫グロブリン。 ４．該第２免疫グロブリン由来重鎖と結合した少なくとも抗原結合ドメイン部 分を有する第２免疫グロブリン由来軽鎖を更に含む、請求項３記載の免疫グロブ リン。 ５．該免疫グロブリン由来重鎖の少なくとも一つに結合した免疫グロブリンＪ 鎖を更に含む、請求項１から４のいずれかに記載の免疫グロブリン。 ６．治療的免疫グロブリンである、請求項１から５のいずれかに記載の免疫グ ロブリン。 ７．治療的免疫グロブリンが粘膜病原体抗原に結合する、請求項７記載の免疫 グロブリン。 ８．虫歯の予防ができる、請求項７記載の免疫グロブリン。 ９．その抗原結合ドメインがＳ．mutans血清型ｃ、ｅおよびｆまたはＳ．sobr inus血清型ｄおよびｇに由来の抗原に結合できる、請求項１から８のいずれかに 記載の免疫グロブリン。 １０．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミ ノ酸残基配列の残基１から６２７の部分に実質的に対応するアミノ酸配列を有し 、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６２８−７５５に対応するア ミノ酸配列を含まないものである、請求項１記載の免疫グロブリン。 １１．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミ ノ酸残基配列の残基１から６０６の部分に実質的に対応するアミノ酸配列を有し 、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６２８−７５５に対応するア ミ ノ酸配列を含まないものである、請求項１記載の免疫グロブリン。 １２．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６ ２８から７５５に対応するアミノ酸残基を含まず、 ａ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸２１−４３に対 応するアミノ酸； ｂ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸１−１１８に対 応するアミノ酸； ｃ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸１１９−２２３ に対応するアミノ酸； ｄ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸２２４−３３ ２に対応するアミノ酸； ｅ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸３３３−４４１ に対応するアミノ酸； ｆ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸４４２−５５２ に対応するアミノ酸； ｇ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸５５３から６０ ６または５５３から６２７に対応するアミノ酸 の１個またはそれ以上のアミノ酸セグメントに対応するアミノ酸残基を含むアミ ノ酸配列を有する、請求項１０または１１記載の免疫グロブリン。 １３．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６ ２８から７５５に類似の種のポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基を含まず 、 ａ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸２１−４３に対 応するアミノ酸； ｂ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩのアミノ酸１−１１８に対 応するアミノ酸； ｃ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIのアミノ酸１１９−２２３ に対応するアミノ酸； ｄ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIIIのアミノ酸２２４−３３ ２に対応するアミノ酸； ｅ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインIVのアミノ酸３３３−４４１ に対応するアミノ酸； ｆ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＶのアミノ酸４４２−５５２ に対応するアミノ酸； ｇ）ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインVIのアミノ酸５５３から６０ ６または５５３から６２７に対応するアミノ酸 の１個またはそれ以上のアミノ酸セグメントに類似の種のポリ免疫グロブリン受 容体由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１記載の免疫グロ ブリン。 １４．種がヒトである、請求項１３記載の免疫グロブリン。 １５．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のドメインＩ、ド メインII、ドメインIII、ドメインIV、ドメインＶおよびドメインVIのアミノ酸 残基５５３−６２７の部分からなる群から選択されたドメインの少なくとも一つ を有し、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６２８−７５５に対応 するアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列を含む、請求項１記載の防御タンパク 質。 １６．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６ ２８−７５５に対応するまたは類似のアミノ酸配列を含まず、 ａ）第１動物のポリ免疫グロブリン受容体由来であり、ウサギのポリ免疫グロ ブリン受容体の以下のアミノ酸セグメントの少なくとも一つに対応するかまたは 類似の少なくとも一つのドメイン：ドメインＩ、ドメインII、ドメインIII、ド メインIV、ドメインＶおよびドメインVIのアミノ酸残基５５３−６２７； ｂ）第２動物のポリ免疫グロブリン受容体由来であり、ウサギのポリ免疫グロ ブリン受容体以下のアミノ酸セグメントの少なくとも一つに対応するかまたは類 似の少なくとも一つのドメイン：ドメインＩ、ドメインII、ドメインIII、ドメ インIV、ドメインＶおよびドメインVIのアミノ酸残基５５３−６２７； を含むアミノ酸配列を含む、請求項１記載の防御タンパク質。 １７．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６ ２８−７５５に対応するまたは類似のアミノ酸配列を含まず、 ａ）第１動物のポリ免疫グロブリン受容体由来であり、ウサギのポリ免疫グロ ブリン受容体の以下のアミノ酸セグメントの少なくとも一つに対応するかまたは 類似の少なくとも一つのアミノ酸セグメント：ドメインＩ、ドメインII、ドメイ ンIII、ドメインIV、ドメインＶおよびドメインVIのアミノ酸残基５５３−６２ ７； ｂ）第２動物のポリ免疫グロブリン受容体由来であり、ウサギのポリ免疫グロ ブリン受容体以下のアミノ酸セグメントの少なくとも一つに対応するかまたは類 似の少なくとも一つアミノ酸セグメント：ドメインＩ、ドメインII、ドメインII I、ドメインIV、ドメインＶおよびドメインVIのアミノ酸残基５５３−６２７； を含むアミノ酸配列を含む、請求項１記載の防御タンパク質。 １８．第１動物が哺乳類であり、第２動物がウサギである、請求項１６記載の 免疫グロブリン。 １９．第１動物がヒトであり、第２動物がウサギである、請求項１６記載の免 疫グロブリン。 ２０．免疫グロブリン由来重鎖が、少なくともＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖または 任意のサブタイプの部分を含む、請求項１記載の免疫グロブリン。 ２１．免疫グロブリン由来重鎖が、二つの異なる免疫グロブリンのイソトープ 由来である、請求項１記載の免疫グロブリン。 ２２．ａ）マウスＩｇＧのＣ_H１およびマウスＩｇＡのＣ_H２およびＣ_H３領域 ； ｂ）マウスＩｇＧのＣ_H１およびＣ_H２およびマウスＩｇＡのＣ_H２およびＣ_H３ 領域； からなる群から選択される、免疫グロブリンドメインである、請求項２１記載の 免疫グロブリン。 ２３．抗原結合ドメインがＧuy's13重鎖可変領域に実質的に対応する、請求項 １記載の免疫グロブリン。 ２４．抗原結合ドメインがＧuy's13軽鎖可変領域に実質的に対応する、請求項 １記載の免疫グロブリン。 ２５．防御タンパク質が、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の少なくともアミ ノ酸残基１から６０６または１から６２７の部分と実質的に対応する第１のアミ ノ酸を有し、該第１アミノ酸に続いて第２アミノ酸残基配列を有し、第２アミノ 酸残基配列は、ウサギポリ免疫グロブリン受容体の膜通過セグメントに対応する アミノ酸残基配列を有しないもものである、請求項１記載の免疫グロブリン。 ２６．該第２アミノ酸残基がポリ免疫グロブリン受容体のアミノ酸残基６５５ から７５５に対応するアミノ酸配列を有する、請求項２５記載の免疫グロブリン 。 ２７．第２アミノ酸残基は、ポリ免疫グロブリン分子の細胞内ドメイン、免疫 グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーのドメイン、酵素、毒素または リンカーの部分の少なくとも１個またはそれ以上を有する、請求項２５記載の免 疫グロブリン。 ２８．請求項１から２４のいずれかに記載の免疫グロブリンを含む真核細胞。 ２９．真核細胞が植物細胞である、請求項２８記載の真核細胞。 ３０．植物細胞が植物の一部である、請求項２９記載の植物細胞。 ３１．防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、真核細胞。 ３２．少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖、 少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖または免疫 グロブリンＪ鎖からなる群から選択される少なくとも一つの部分をコードする第 ２ヌクレオチド配列も更に含む、真核細胞。 ３３．第２ヌクレオチド配列が、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する 免疫グロブリン由来重鎖をコードするものである；および更に少なくとも抗原結 合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードする第３ヌクレオチ ドも含む、請求項３２記載の真核生物。 ３４．免疫グロブリンＪ鎖をコードする第４ヌクレオチド配列も含む、請求項 ３３記載の真核細胞。 ３５．真核細胞が植物細胞である、請求項３１から３４のいずれかに記載の真 核細胞。 ３６．防御タンパク質をコードするヌクレオチド配列および少なくとも抗原結 合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするヌクレオチド配 列を含む、植物細胞。 ３７．防御タンパク質を含む真核細胞。 ３８．少なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブリン由来重鎖、少 なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブリン由来軽鎖または免疫グロ ブリンＪ鎖からなる群から選択される少なくとも一つの分子も含む、請求項３７ 記載の真核細胞。 ３９．該分子が少なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブリン由来 重鎖であり、そしてさらに少なくとも抗原結合ドメインの部分を含む免疫グロブ リン由来軽鎖を含む、請求項３８記載の真核細胞。 ４０．免疫グロブリンＪ鎖をさらに含む、請求項３７記載の真核細胞。 ４１．真核細胞が植物細胞である、請求項３７から４０のいずれかに記載の真 核細胞。 ４２．植物細胞が双子葉植物または単子葉植物由来である、請求項２９、３５ 、３６および４１のいずれかに記載の植物細胞。 ４３．植物細胞がナス科植物由来である、請求項２９、３５、３６および４１ のいずれかに記載の植物細胞。 ４４．植物細胞がアルファルファ細胞である、請求項２９、３５、３６および ４１のいずれかに記載の植物細胞。 ４５．植物細胞がタバコ植物由来である、請求項２９、３５、３６および４１ のいずれかに記載の植物細胞。 ４６．植物細胞が植物の一部である、請求項２９、３５、３６および４１のい ずれかに記載の植物細胞。 ４７．請求項１から２４のいずれかに記載の免疫グロブリンおよび植物高分子 物質を含む、組成物。 ４８．植物分子が、双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、アルファルファま たはタバコ植物由来である、請求項４７記載の組成物。 ４９．植物分子が、リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ、集光性複合 体、色素、二次代謝物またはクロロフィルである、請求項４７記載の組成物。 ５０．免疫グロブリンが、水以外の質量の０.００１から９９％の間の濃度で 存在する、請求項４７記載の組成物。 ５１．免疫グロブリンが、水以外の質量の１から９９％の間の濃度で存在する 、請求項４７記載の組成物。 ５２．（ａ）転写プロモーターに操作可能に結合した防御タンパク質をコード するヌクレオチドを含む発現ベクターの植物細胞への挿入；および （ｂ）転写プロモーターに操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメインの 部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするヌクレオチドを含む発現ベク ターの同じ植物細胞への挿入： の段階を含む、防御タンパク質を含む請求項１から２４の何れかに記載の免疫グ ロブリンの製造法。 ５３．（ｃ）転写プロモーターに操作可能に結合した少なくとも抗原結合ドメ インの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖のヌクレオチド配列を含む発現ベク ターの同じ植物細胞への挿入： の段階を更に含む、請求項５２記載の方法。 ５４．転写プロモーターに操作可能に結合した免疫グロブリン由来Ｊ鎖のヌク レオチド配列を含む発現ベクターの同じ植物細胞への挿入の段階を更にを含む、 請求項５２または５３のいずれかに記載の方法。 ５５．免疫グロブリン由来重鎖が免疫グロブリンアルファ鎖であり、免疫グロ ブリン由来軽鎖が免疫グロブリンカッパまたはラムダ鎖である、請求項５２から ５４のいずれかに記載の方法。 ５７．植物細胞が植物の一部である、請求項５２から５４のいずれかに記載の 方法。 ５８．更に植物を生育させることを含む、請求項５６記載の方法。 ５９．植物分子が、双子葉植物、単子葉植物、ナス科植物、アルファルファま たはタバコ植物由来である、請求項５２から５９のいずれかに記載の組成物。 ６０．免疫グロブリン由来重鎖がキメラ免疫グロブリン重鎖である、請求項５ ２から５９のいずれかに記載の方法。 ６１．請求項３０または４６記載の植物を植物を、圧力下にその植物の一部を 剪断し、治療的免疫グロブリンおよび植物高分子物質を植物のアポプラストまた はシンプラスト由来の液体中に含み、固体植物由来材料を含むパルプを製造する 段階を含む、植物高分子物質を含む治療的免疫グロブリン組成物の製造法。 ６２．液体から固体植物由来材料を分離する段階を更に含む、請求項６１記載 の方法。 ６３．植物の一部が葉、幹、根、塊根、種子、果実または全植物である、請求 項６１または６２のいずれかに記載の方法。 ６４．剪断が、植物のアポプラストまたはシンプラストから液体を放出させる 機械的装置により達成される、請求項６１記載の方法。 ６５．分離が遠心、沈殿、フロキュレーションまたは濾過によるものである、 請求項６２記載の方法。 ６６．ａ）真核細胞への操作可能に結合した ｉ）少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来 重鎖、 ii）少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来 軽鎖、 iii）免疫グロブリンＪ鎖 iv）防御タンパク質： をコードするヌクレオチド配列の挿入；および ｂ）該細胞の、該免疫グロブリン由来重および軽鎖、該免疫グロブリンＪ鎖お よび該防御タンパク質の免疫グロブリン分子の製造および集合を可能にする条件 下での維持： の段階を含む、重、軽およびＪ鎖および防護タンパク質を有する集合免疫グロブ リンの製造法。 ６７．操作可能に結合した ｉ）少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来 重鎖、 ii）少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来 軽鎖、 iii）免疫グロブリンＪ鎖 iv）防御タンパク質： をコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞を、タンパク質製造および免疫グ ロブリン分子集合を可能にする条件下で維持することによる、重、軽およびＪ鎖 および防護タンパク質を有する集合免疫グロブリンの製造法。 ６８．真核細胞が植物細胞である、請求項６６から６７のいずれかに記載の方 法。 ６９．ａ）免疫グロブリン重鎖由来の少なくとも抗原結合ドメインの部分をコ ードするヌクレオチド配列の免疫グロブリンアルファ重鎖由来の少なくとも一つ のドメインをコードするヌクレオチド配列へ操作可能に結合させ、キメラ免疫グ ロブリン重鎖をコードするヌクレオチドを形成させる； ｂ）防御タンパク質、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブ リン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖からなる群から選択される少なくとも一 つの他の分子もまた含む真核細胞中で該キメラ免疫グロブリン重鎖をコードする ヌクレオチド配列を発現させ、キメラ免疫グロブリン重鎖を製造させる；および それによりキメラ免疫グロブリン重鎖を少なくとも一つの分子と集合させ、環境 条件に耐性な免疫グロブリンを形成させる 段階を含む、環境条件に耐性な免疫グロブリンの製造法。 ７０．他の分子が防御タンパク質であり、真核細胞がまた少なくとも抗原結合 ドメインの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖も含 む、請求項６９記載の方法。 ７１．ａ）鎖由来の少なくとも抗原結合ドメインの部分をコードするヌクレオ チド配列が、免疫グロブリンアルファ重鎖由来の少なくともひとつのドメインを コードするヌクレオチド配列に操作可能に結合している、キメラ免疫グロブリン 重鎖をコードするヌクレオチド配列； ｂ）防御タンパク質、少なくとも抗原結合ドメインの部分を有する免疫グロブ リン由来軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖からなる群から選択される少なくとも一 つの他の分子； を含む細胞をタンパク質製造および免疫グロブリンを可能にする条件下に維持し 、それによりキメラ免疫グロブリン重鎖を少なくとも一つの分子と集合させ、環 境条件に耐性な免疫グロブリンを形成させる ことによる、環境条件に耐性な免疫グロブリンの製造法。 ７２．真核細胞が植物細胞である、請求項５０から５２のいずれかに記載の免 疫グロブリン。 ７３．それぞれ多量体ペプチド分子の異なるポリペプチドをコードする４つの 異なるトランスジーンを含み、それぞれのその異なるポリペプチオドの一つが多 量体ペプチド分子中で互いに結合している、トランスジェニック生物。 ７４．４つのトランスジーンの少なくとも一つが防御タンパク質をコードする トランスジーンである、請求項７３記載の生物。 ７５．４つのトランスジーンの少なくとも一つが、少なくとも抗原結合ドメイ ンの部分を有する免疫グロブリン由来重鎖をコードするトランスジーンである、 請求項７３記載の生物。 ７６．４つのトランスジーンの少なくとも一つが、少なくとも抗原結合ドメイ ンの部分を有する免疫グロブリン由来軽鎖をコードするトランスジーンである、 請求項７３記載の生物。 ７７．４つのトランスジーンの少なくとも一つが、免疫グロブリンＪ鎖をコー ドするトランスジーンである、請求項７３記載の生物。 ７８．４つのトランスジーンの少なくとも一つが、キメラ免疫グロブリン重鎖 をコードするトランスジーンである、請求項７３記載の生物。 ７９．トランスジェニック生物が植物である、請求項７３記載のトランスジェ ニック生物。 ８０．トランスジェニック生物が哺乳類である、請求項７３記載のトランスジ ェニック生物。 ８１．キメラ免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉｇ Ｄである免疫グロブリン由来の少なくとも一つの免疫グロブリンドメインを含み 、ＩｇＡまたはＩｇＭ由来の防御タンパク質結合ドメインもまた含む、請求項１ 記載の免疫グロブリン。 ８２．免疫グロブリン重鎖が、ヒト、囓歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、 家禽、イヌ、ネコまたは霊長類免疫グロブリン由来重鎖である、請求項８１記載 の免疫グロブリン。 ８３．防御タンパク質結合ドメインがヒト、囓歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、 イヌ、ネコまたは霊長類免疫グロブリン由来重鎖である、請求項８１記載の免疫 グロブリン。 ８４．キメラ免疫グロブリン重鎖がマウスＩｇＧ１の免疫グロブリン鎖を含み 、防御タンパク質結合ドメインがマウスＩｇＡまたはＩｇＭ由来である、請求項 ８１記載の免疫グロブリン。 ８５．キメラ免疫グロブリン重鎖がヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ の免疫グロブリンドメインを含み、防御タンパク質結合ドメインがヒトＩｇＡま たはＩｇＭ由来である、請求項８１記載の免疫グロブリン。