JP2009502205A - 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質 - Google Patents

炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質 Download PDF

Info

Publication number
JP2009502205A
JP2009502205A JP2008525193A JP2008525193A JP2009502205A JP 2009502205 A JP2009502205 A JP 2009502205A JP 2008525193 A JP2008525193 A JP 2008525193A JP 2008525193 A JP2008525193 A JP 2008525193A JP 2009502205 A JP2009502205 A JP 2009502205A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
toxin receptor
receptor protein
anthrax
chimeric
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2008525193A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009502205A5 (ja
Inventor
ロイド・エム・ユ
キース・エル・ワイコフ
ジェイムズ・ダブリュー・ラリック
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Planet Biotechnology Inc
Original Assignee
Planet Biotechnology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Planet Biotechnology Inc filed Critical Planet Biotechnology Inc
Publication of JP2009502205A publication Critical patent/JP2009502205A/ja
Publication of JP2009502205A5 publication Critical patent/JP2009502205A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • C07K14/095—Rhinovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

少なくとも免疫グロブリン重鎖の一部および少なくとも免疫グロブリン軽鎖の一部を有する免疫グロブリン複合体と会合した毒素受容体を持つキメラ毒素受容体タンパク質を記載するものである。かかるキメラ毒素受容体タンパク質は、該軽鎖を欠失している該キメラ毒素受容体タンパク質と比較して安定性が改良されている。高い安定性をもった炭疽菌およびボツリヌス菌のキメラ毒素受容体タンパク質を記載する。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２００５年８月２日に提出した米国仮特許出願No.60/704,829の利益を享受しており、この出願は出典明示により、全体およびすべての目的について本明細書の一部とする。
これらの各出願は全ての図、図面および配列表を包含するそのすべてにおいて出典明示により本明細書の一部とする。
連邦政府により出資された研究または開発に関する記述
連邦政府の研究調査支援は、連邦研究助成金1R43AI053005-01A1の形態で提供された。
本発明の分野
本発明は、キメラ毒素受容体タンパク質、イムノアドヘシン、植物からのその産物、および毒性および病原体介在疾患の処置および予防におけるそれらの使用に関する。
感染および発病を媒介する毒素および病原体成分についてのデコイ（decoy）として作用する可溶性受容体および結合タンパク質は、毒性および他の病原体媒介効果を処置および予防するための期待できる手段である。
受容体デコイにより処理できる症状のある例示は炭疽菌感染である。ＰＡ(保護抗原、炭疽菌毒素の成分)についての２つの細胞表面受容体が同定されている：腫瘍内皮マーカー8 (ＴＥＭ８)および毛細血管形態形成タンパク質2(ＣＭＧ２)(30, 31)。これらのタンパク質両方の細胞外ドメインの可溶性形態は、内生毒素受容体を発現する細胞の中毒を阻害することが示されている。ＴＥＭ８の可溶性形態は、８０nM (ＩＣ50=８０nM)で５０％まで致死毒作用を阻害した[Bradley, K. A., Mogridge, J., Mourez, M., Collier, R. J. & Young, J. A. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414, 225-9 (2001)]。ＣＭＧ２由来タンパク質は、マクロファージ保護アッセイにおいてＰＡに対して170 pMの親和性および3.1 nM (67 ng/ml)のIC50を示し、炭疽菌毒作用の強力な阻害剤となる(Scobie, H. M., Rainey, G. J., Bradley, K. A. & Young, J. A.）。ヒト血管形態形成タンパク質２は炭疽菌毒素受容体として機能する[Proc Natl Acad Sci U S A 100, 5170-4 (2003); Wigelsworth, D. J., Krantz, B. A., Christensen, K. A., Lacy, D. B., Juris, S. J. & Collier, R. J. Binding stoichiometry and kinetics of the interaction of a human anthrax toxin receptor, CMG2, with protective antigen. J Biol Chem 279, 23349-56 (2004)]。細胞培養物アッセイにおいて、可溶性ＣＭＧ２細胞外ドメインは、ＰＡと３：１のモル比で致死毒活性の50%を中和した(Scobie et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 5170-4 (2003))。しかし、能動感染の期間中の血中の該細菌の高濃度から、ＰＡの濃度が非常に高く、保護を提供するためには抗毒素の高用量を要することが示唆される。
受容体デコイにより処理可能な条件の別の例は通常の風邪である。通常の風邪は、一般的に比較的緩和な疾患である。しかし、風邪からくるかなりの合併症、例えば中耳炎、副鼻腔炎、喘息悪化が一般的である。ヒト・ライノウイルス(ＨＲＶ)は、全成人の風邪の５０％および小児風邪の２５％の原因である(Bella and Rossmann, J Struct Biol. 128:69-74, 1999, and Sperber and Hayden, Antimicrob Agents Chemother. 32:409-19, 1988)。社会に対する出費は年間１０億ドルにもなる。これらの小さい非包膜ＲＮＡウイルスはピコルナウイルスのサブグループを表す(Rueckert, Virology, pp. 507-548, eds. Fields, et al., Raven Press, Ltd. New York, 1990)。ライノウイルスのＸ線結晶学的検査により、直径３００Å（１Å＝０.１nm)で正２０面体対称を持つカブシドが同定され、ウイルス・コート・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３の各々６０コピーから構築された(Rossmann, Nature 317:145-153, 1985)。ＨＲＶ上の表面陥没部すなわち「カニヨン（canyon）」は、受容体結合部位と考えられた(Colonno, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 85:5449-5453, 1985; Rossmann, et al. Nature 317:145-153, 1985)。１０２の特徴解明されたＨＲＶ血清型のうち、９１(メジャーグループと知られる）がその受容体として、細胞間接着分子-１（ＩＣＡＭ−１）として知られる細胞表面糖タンパク質を共有する(Greve, et al., Cell 56:839-847, 1989; Staunton, et al., Cell 56:849-853, 1989); 結合部位はＮ末端ドメイン１に位置する(Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Staunton, et al., Cell 61:243-254, 1990)。
ＩＣＡＭ−１は、５つの細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、短い細胞質ドメインを有する膜タンパク質である。ＩＣＡＭ−１は免疫および炎症の応答において重要な多くの細胞で発現され、他の細胞で誘発的である（Casasnovas et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 4134-9, 1998)。ＩＣＡＭ−１は白血球インテグリンＬＦＡ-１およびＭａｃ-１についてのリガンドとして機能する（Springer, Cell. 76: 301-14, 1994; Staunton et al., Cell 61: 243-254, 1990)。細胞表面で、ＩＣＡＭ−１は膜貫通ドメインの会合により主に二量体である（Miller et al., J Exp Med. 182: 1231-41, 1995; Reilly et al., J Immunol. 155: 529-32, 1995)。
５つの細胞外ドメインからなる組換え可溶性ＩＣＡＭ−１（sＩＣＡＭ−１)は、イン・ビトロでヒト細胞のライノウイルス感染を阻止するのに有効であることが示されている(Greve et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991；Marlin et al., Nature 344: 70-2, 1990)。実験室株および野外単離体の範囲に対する sＩＣＡＭ−１活性についての評価によると、ＨＲＶのすべてのメジャー株がsＩＣＡＭ−１に感受性である。受容体としてＩＣＡＭを使用しないマイナー株は、sＩＣＡＭ−１により影響を受けない（Crump et al., Antiviral Chem Chemother. 4: 323-327, 1993; Ohlin et al., Antimicrob Agents Chemother. 38: 1413-5, 1994)。
可溶性ＩＣＡＭ−１のイン・ビトロでの抗ウイルス活性は、複数のメカニズムにより仲介されるようである。それらのメカニズムには、結合部位についての細胞表面ＩＣＡＭ−１との競合、ウイルスの侵入または脱コートの妨害、ウイルスＲＮＡの未熟放出および空のカプシドの形成による直接的不活化がある（Arruda et al., Antimicrob Agents Chemother. 36: 1186-1191, 1992; Greve et al., J Virol. 65: 6015-6023, 1991；Marlin et al., Nature 344: 70-2, 1990; Marlin et al., J Virol. 67: 3561-8,1993)。
ＨＲＶの宿主の範囲は霊長類に限定される。最近の研究によると、可溶性ＩＣＡＭ−１がチンパンジーのライノウイルス感染を予防するのに有効であった（Huguenel et al., Am J Respir Crit Care Med. 155: 1206-10, 1997)。チンパンジーは臨床徴候を示さないが、血清変換およびウイルス脱皮を測定することにより感染が示された。鼻腔内噴霧として、単回量１０mgの可溶性ＩＣＡＭ−１は、ＨＲＶと共投与されたとき、またはウイルスが１０分後に投与されたときに、ＨＲＶ−１６による感染を予防するのに有効であった。
可溶性ＩＣＡＭ−１を用いたヒト臨床試験から、それは試験的ＨＲＶ風邪の重篤度を低下することがわかった(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)。この試験で全１９６人の対象者が種々の製剤形態で可溶性ＩＣＡＭ−１かプラセボのいずれかを摂取した。ある対象者は、ＨＲＶ３９の接種７時間前から始まり可溶性ＩＣＡＭ−１またはプラセボが与えられ、他の対象者は、ウイルス接種１２時間後に開始した。その投与は、経鼻溶液または粉末として投与され、７日間で６日投与（合計１日につき４.４ mg)である。この試験において、ウイルス単離または血清変換のいずれかで測定した場合、可溶性ＩＣＡＭ−１は感染を防止しなかった（感染率、プラセボ処置で９２％、可溶性ＩＣＡＭ−１処置で８５％)。しかし、可溶性ＩＣＡＭ−１は疾患のすべての指標に効果があった。全症候スコアが４５％まで減少し、臨床的な風邪に罹患した対象者の率が２３％低下し、鼻粘膜の重量が５６％減少した。粉末製剤と溶液製剤との間、あるいは接種前と後との間には有意差がなかった。可溶性ＩＣＡＭ−１による処置で有害な副作用または鼻粘膜による吸収が認められなかった。また、抗ＨＲＶ型特異的抗体の発生に関する阻止もなかった。
すでに述べたように、ＩＣＡＭ−１は細胞表面で二量体である。最初に提言された Marlin et al., J Virol. 67: 3561-8,1993 によると、多量体可溶性ＩＣＡＭによるＨＲＶとの多価結合が、効果的な高い親和性、いわゆる結合活性（avidity）をもたらし、もってウイルスの脱コートを容易にするようである。かれらは、多価ＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子を構築し、それが１価可溶性ＩＣＡＭ−１より、ＨＲＶの中和に効果的であり、従って治療上の有用性を増加すると考えた。これらのＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ１(ＩＣ１−２Ｄ／ＩｇＡ)、ＩｇＭ(ＩＣ１-２Ｄ／ＩｇＭ)、ＩｇＧ１(ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＧ) の重鎖のヒンジおよび定常ドメインに融合しているＩＣＡＭ−１アミノ末端ドメイン１および２を含む。さらに、５つの細胞外ドメインはＩｇＡ１(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)に融合された。これらのＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子は、ＨＲＶ結合、感染能、配座に関するアッセイにおいて、２つの(ｓＩＣ１-２Ｄ)および５つの(ｓＩＣ１-５Ｄ)ドメインを有する可溶性形態のＩＣＡＭ−１と比較された。ＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ 免疫グロブリン(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)は２００倍、ＩＣＡＭ−１/ＩｇＭ免疫グロブリン(ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＭ)は２５倍、ＩＣＡＭ−１/ＩｇＧ免疫グロブリン(ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＧ)は１０倍、可溶性ＩＣＡＭ−１よりも効果的であった。これらの分子は、ライノウイルスの細胞への結合を阻止するのに、およびウイルス・カプシドの配座を破壊するのに、非常に有効であった。ＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ免疫グロブリン分子は、ナノモル濃度範囲で有効であった。ＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＡとＩＣ１-２Ｄ/ＩｇＧとの比較によると、使用したＩｇ定常領域のクラスが効力に大きな影響を与えた。
次の試験で、可溶性ＩＣＡＭ−１に対する中程度の耐性について選択された９つのメジャー ＨＲＶ血清型およびＨＲＶ−３９の変種に対する可溶性ＩＣＡＭ−１およびＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡの阻害活性が比較された（Crump et al., Antimicrob Agents chemother. 38: 1425-7, 1993)。ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡは、単量体の可溶性ＩＣＡＭ−１よりも重量ベースで５０から１４３倍、モルベースで６０から１７０倍、標準の血清型に対して効力が強い。ＨＲＶ−３９変種は、可溶性ＩＣＡＭ−１に対する耐性が野生型よりも３８倍であり、ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡに対する耐性が５倍にすぎなかった。このことは、多価分子による阻害からのウイルス逃走が単量体の可溶性受容体による阻害からのウイルス逃走よりも低い頻度でおきるのではないかとの仮説（Martin et al., J. Virol. 67: 3561-8, 1993)に一致する。ウイルスの不活性化を測定するように設計されたアッセイによると、ＨＲＶ−３９およびＨＲＶ−１３は、可溶性ＩＣＡＭ−１により有意に（感染能の低下、＜０.５ｌｏｇ10）直接不活性化されなかった。しかし、ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡとインキュベートすると、これらの同じウイルスの感染能が約１.０ ｌｏｇ10 低下した(Crump et al., Antimicrob Agents chemother. 38: 1425-7, 1994)。Martin et al.（J. Virol. 67: 3561-8, 1993)によると、価数が大きくなるほど、分子の効果が大きくなる。ＩＣ１-２/ＩｇＭの二量体および十量体がスクロース傾斜沈降により分離可能であった。十量体は二量体より、ＨＲＶのＨｅＬａ細胞との結合を阻止するのに、５倍有効であった。
有効性を確実にするために必要な受容体デコイ・タンパク質の量を最小にするためには、さらに受容体デコイの特異的活性または効力を増加することが望まれる。従って、より高い活性および改善された薬物動態を有する強力なデコイについての必要性が残っている。
記載されてきた受容体デコイは、労力の多い生産技術やその産生方法に関連する高いコストを含むいくつかの欠点をこうむる。さらに、これらの受容体デコイは、厳しい環境ではこの分子が病原体を不活性化するために必要であり得る多量体としての安定性が限られている。従って、収量を増加させるために安定性が高く、妥当な費用で商業的に実現可能な容量にて産生できるデコイ技術が必要である。
本発の要約
本発明は、毒素受容体が免疫グロブリン重鎖の最小の一部および免疫グロブリン軽鎖の少なくとも一部を有する免疫グロブリン複合体と会合されているキメラ毒素受容体タンパク質を意図する。毒素受容体は、病原性効果をもらすかまたは発揮する毒素またはタンパク質を結合するあらゆるポリペプチドであり得る。かかるキメラ毒素受容体タンパク質は、該軽鎖を欠いたキメラ毒素受容体タンパク質と比べて安定性が改良された。毒素受容体および免疫グロブリン複合体との会合は、毒素受容体および重鎖との間の共有結合、または毒素受容体と該軽鎖との共有結合を介し得る。共有結合は、典型的にリンカー、例えば柔軟なポリペプチド配列(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３である。好ましい実施形態において、キメラ毒素受容体タンパク質は、第一の毒素受容体と重鎖共有結合、さらに第二毒素受容体と軽鎖との共有結合を包含する。いくつかの実施形態において、第一および第二毒素受容体は、同じアミノ酸配列を有するが、別の実施形態では、該受容体は異なる配列を有する。
記載したキメラ毒素受容体タンパク質における免疫グロブリン重鎖は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはキメラ免疫グロブリン重鎖などの重鎖のあらゆる型であり得る。該重鎖がＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ重鎖である場合、重鎖の一部は定常領域２および３であり得る。あるいは、重鎖がＩｇＭまたはＩｇＥ重鎖である場合、重鎖の一部は、定常領域２、３および４であり得る。
免疫グロブリン軽鎖は、好ましくは軽鎖定常ドメインを包含し、κまたはλ鎖のいずれかであり得る。
好ましい実施形態において、キメラ毒素受容体タンパク質は、植物ゲノムの一部として単子葉植物および双子葉植物を包含する植物において発現される。タバコは、発現のための植物として好ましい。植物での発現により、培養した哺乳動物細胞での発現とは異なって、キメラ毒素受容体タンパク質を産生する有意な費用削減が可能となる。
好ましい実施形態において、本発明のキメラ毒素受容体タンパク質を作成するために使用した全てのタンパク質は、ヒトタンパク質である。植物または植物細胞における産生に加えて、本発明は、植物、脊椎動物または無脊椎動物から得た異種細胞、例えば哺乳動物細胞、毛根細胞または植物組織培養細胞において発現したキメラ毒素受容体タンパク質を意図する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載したキメラ毒素受容体を包含するイムノアドヘシンを提供する。いくつかの実施形態において、イムノアドヘシンは、少なくとも２つのキメラ毒素受容体タンパク質を包含する多量体である。別の実施形態において、該イムノアドヘシンは、J鎖と会合したキメラ毒素受容体タンパク質を包含する。別の実施形態において、J鎖と会合したイムノアドヘシンを含む組成物は、さらに分泌成分と共に会合される。
ある実施態様において、本発明は、植物特異的グリコシル化を有するキメラ毒素受容体タンパク質を意図する。アミノ酸配列中にグリコシル化シグナル・アスパラギン-Ｘ-セリン／トレオニン（Ｘはいかなるアミノ酸残基でもよい）を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、植物細胞中で発現した時に、配列のアスパラギン残基に結合したオリゴ糖によりグリコシル化される。グリコシル化シグナルとして機能するポリペプチド配列についての総説は、Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41: 673 (1972)および Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40: 17 (1974)を参照されたい。これらのシグナルは哺乳動物でも植物細胞でも認められる。その成熟の終了時において、植物体または植物細胞で発現されたタンパク質は、哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む他の型の細胞で発現されるタンパク質と異なるパターンのグリコシル化を有する。植物特異的グリコシル化の特徴および他の細胞型でのグリコシル化との比較についての詳細な研究は、例えば、下記の文献に記載されている：Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4): 365-372 (1999) および Altmann, Glycoconjugate J. 14: 643-646 (1997)。これらの文献などによると、植物特異的グリコシル化はマンノースにβ(１,２) 結合したキシロースを有するグリカンをつくるが、哺乳動物および昆虫の細胞においてはグリコシル化の結果としてキシロースはマンノースにβ (１,２) 結合していない。植物特異的グリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃに結合α(１,３)したフコースをもたらすが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃにα(１,６) 結合したフコースをもたらす。さらに、植物特異的グリコシル化は、シアル酸をタンパク質グリカンの末端に付加しないが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化ではシアル酸が付加される。
他の実施態様において、前記組成物は植物材とさらに会合される。本植物材は、植物細胞壁、植物細胞小器官、植物細胞質、無傷の植物細胞、植物種子、生存植物などであり得る。存在し得る特定の植物材または植物高分子は、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼ、集光複合体、色素、二次代謝物または葉緑素およびそのフラグメントを含む。本発明の組成物は、キメラ毒素受容体タンパク質の濃度が水分を除き０.００１％から９９.９％であり得る。別の実施態様において、キメラ毒素受容体タンパク質は水分を除き０.０１％から９９％の濃度で存在する。別の実施態様において、本発明の組成物は、水分を除き０.０１％から９９％の濃度で存在する植物材または植物高分子を有する。
別の態様において、本発明は、病原体抗原とキメラ毒素受容体タンパク質とを接触することにより、宿主細胞への病原体抗原の結合を低下させるための方法を提供する、ここで、該病原体は病原体分子、病原体ウイルスまたは病原体細胞生物であり得る。他の態様は、病原体の罹患率および死亡率、および病原性分子、例えば毒素による罹患率および死亡率を低下させるための方法である。該用語が本明細書で使用される場合、該病原体抗原は、抗体の形成を刺激出来ても、出来なくてもよい。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のキメラ毒素受容体タンパク質および医薬的に許容し得る担体を包含する医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン重鎖の一部をコードする第一のヌクレオチド配列；免疫グロブリン軽鎖の一部をコードする第二のヌクレオチド配列；および第一の毒素受容体タンパク質をコードする第三のヌクレオチド配列を包含する発現ベクター系を提供するものであって、細胞性宿主における発現では、該免疫グロブリン重鎖、該免疫グロブリン軽鎖および第一の毒素受容体タンパク質がキメラ毒素受容体タンパク質を形成する。
さらなる別の態様において、本発明は、キメラ毒素受容体タンパク質を産生する方法を提供するものであって、免疫グロブリン軽鎖の一部と会合した免疫グロブリン重鎖の一部を有する免疫グロブリン複合体;および免疫グロブリン複合体と会合されている第一の毒素受容体タンパク質を共に発現する、１以上の発現ベクターを提供すること;１以上の該発現ベクターを細胞性宿主に導入すること；そして該免疫グロブリン複合体および該第一の毒素受容体タンパク質を発現させて、キメラ毒素受容体タンパク質を形成すること、を包含する。
本発明は、炭疽菌毒素受容体が免疫グロブリン重鎖の最小の一部を有する免疫グロブリン複合体と会合されている炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質も意図する。
好ましい実施形態において、該炭疽菌毒素受容体は、フォンビルブランド因子タイプＡ/インテグリン挿入(ＶＷ／Ｉ)ドメインを有する。典型的に、炭疽菌毒素受容体は、受容体分子の細胞外ドメインを持つ。該炭疽菌毒素受容体は保護抗原を結合するあらゆるポリペプチドであって、既知の受容体の腫瘍内皮マーカー８(ＴＥＭ８)および毛細血管形態形成タンパク質２(ＣＭＧ２)を包含し得る。
好ましい実施形態において、炭疽菌毒素受容体は、プロテアーゼ感受性アミノ酸配列を欠失する。例えば、炭疽菌毒素受容体がＣＭＧ２タンパク質であるなら、炭疽菌毒素受容体がアミノ酸配列ＴＥＩＬＥＬＱＰＳＳＶＣＶＧ(配列番号：１０２)を欠失するのが好ましい。
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重鎖が、全ての重鎖定常領域１、２および３を有するＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ重鎖である。別の実施形態において、該重鎖は重鎖定常領域２および３を有するのみである。
炭疽菌毒素受容体タンパク質および免疫グロブリン重鎖の一部の共有結合は、be an 免疫グロブリンヒンジまたはあらゆる型のリンカー、好ましくは(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３のアミノ酸配列を有するもの。
炭疽菌キメラ毒素受容体の好ましい実施形態は、下記のものを包含する：１）ＣＭＧ２受容体のＶＷＡ／Ｉドメインおよびリンカーによって共有結合された重鎖定常領域１、２および３を有する免疫グロブリン重鎖の一部を有する炭疽菌毒素受容体タンパク質；２）ＣＭＧ２受容体のＶＷＡ／Ｉドメインおよびリンカーおよび免疫グロブリンヒンジによって共有結合された重鎖定常領域２および３を持つ免疫グロブリン重鎖の一部を有する炭疽菌毒素受容体タンパク質；３）ＣＭＧ２受容体のＶＷＡ／Ｉドメインおよび免疫グロブリンヒンジによって共有結合された重鎖定常領域２および３を有する免疫グロブリン重鎖の一部を有する炭疽菌毒素受容体タンパク質；４）ＣＭＧ２受容体のＶＷＡ／Ｉドメインおよびリンカーによって共有結合した重鎖定常領域１、２および３を有する免疫グロブリン重鎖の一部を有する炭疽菌毒素受容体タンパク質；５）ＣＭＧ２受容体のＶＷＡ／Ｉドメインおよび免疫グロブリンヒンジおよびリンカーによって共有結合した重鎖定常領域２および３を有する免疫グロブリン重鎖の一部を有する炭疽菌毒素受容体タンパク質；および６）該炭疽菌毒素受容体タンパク質の細胞外ドメインのいずれか一部およびＩｇＡ２重鎖の少なくとも一部を有する免疫グロブリン重鎖。
該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質は、免疫グロブリン複合体における免疫グロブリン重鎖と会合して免疫グロブリン軽鎖も包含する。上記したとおりに、毒素受容体と免疫グロブリン複合体との会合は、毒素受容体および重鎖との共有結合または毒素受容体と軽鎖との共有結合を介し得る。特定の実施形態において、該キメラ毒素受容体タンパク質は、第一の毒素受容体および重鎖の共有結合、ならびに第二の毒素受容体および軽鎖の共有結合を包含する。いくつかの実施形態において、第一および第二の毒素受容体は、同一アミノ酸配列を持つが、別の実施形態において、該受容体は異なる配列を持つ。
かかる修飾は、毒素、毒性物質、病原体または病原体成分を結合する受容体の能力を損なわない条件で、受容体タンパク質またはその一部に対する変更および修飾も考えられる。
キメラ毒素受容体タンパク質の全ての型について上記したとおり、炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質は、植物および多様な異種細胞中で発現され得る。好ましい実施形態において、本発明のキメラ毒素受容体タンパク質を作成するために使用した全てのタンパク質は、ヒトタンパク質である。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載した炭疽菌キメラ毒素受容体を包含するイムノアドヘシン、例えば少なくとも２つの炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を有する多量体、J鎖と会合した炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質、およびJ鎖および分泌成分と会合した炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を提供する。
別の実施形態において、本発明は、明細書に記載した植物特異的グリコシル化を有する炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質、および植物材料とさらに会合した前記組成物を意図する。
別の態様において、本発明は、Bacillus anthracisの保護抗原(ＰＡ)と宿主細胞との結合を、ＰＡを明細書に記載した炭疽菌キメラ毒素受容体と接触させることにより、低下または予防するための方法を特徴とする。別の態様は、炭疽菌の罹患率および死亡率ならびに保護抗原を原因とする罹患率および死亡率を低下させるための方法を特徴とする。
別の態様において、本発明は、炭疽菌キメラ毒素受容体を包含する医薬組成物、かかる受容体のための発現ベクターおよびかかる受容体を作成するための方法を提供する。
別の異なる態様において、本発明は、免疫グロブリン複合体がボツリヌス菌毒素受容体タンパク質と会合した免疫グロブリン重鎖の少なくとも一部を有するキメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質を提供する。
（図面の簡単な説明）
図１は、ベクターｐＳＳＰＨｕＡ２を示しており、このベクターにおいて、ヒトＩＣＡＭ−１の最初の５つのドメインを含有するキメラＩＣＡＭ−１分子をコードするＤＮＡとヒトＩｇＡ２ｍ(２)のＦｃ領域が融合している[配列番号；９、４８]。このベクターは、シグナル・ペプチドの発現を駆動するためのＳｕｐｅｒＭａｓプロモーターおよびヒトＩｇＡ２ｍ(２)重鎖の定常領域を含有する。ＩＣＡＭドメイン１−５をコードする配列をＰＣＲで増幅させ、シグナル・ペプチドとＣα１ドメインの間への挿入のために都合の良い制限部位（５'ＳｐｅＩおよび３'ＳｐｅＩ）を含有させる。ＥＲ保持シグナル(ＲＳＥＫＤＥＬ)[配列番号：５]をコードするＤＮＡを、構築体の発現レベルを増強するために重鎖の３'末端に付けた。
図２は、キメラＩＣＡＭ分子を示す。２Ａは、キメラＩＣＡＭ−１分子がつくられるＤＮＡ発現カセットを示す。２Ｂは、融合タンパク質の成熟形についての、シグナル・ペプチド開裂後のアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。クローニング法により導入されたアミノ酸に下線を引き、これはＩＣＡＭ−１の５細胞外ドメインとＩｇＡ２ｍ(２)重鎖のＣα１-Ｃα３ドメインとの接合部を印す。太字のＮは、１５個の潜在的なグリコシル化部位を示す。
図３は、独立的に形質転換されたタバコ・カルス（tabacco calli）におけるイムノアドヘシンの発現を示す。３Ａは、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの免疫ブロットを示す。形質転換された異なるタバコ・カルス（Ｃ)および水性抽出物（Ａｑ）を含有するサンプルをゲル上で泳動させ、ヒトＩＣＡＭの存在を調べた。分子量マーカーを表示する。参考の標準物（Ｒ)は、ヒトＩＣＡＭ（〜７５ｋＤ）とヒトＳＩｇＡ(＞＞２５０ｋＤ)との混合物(各〜７５ng）であった。３Ｂは、カルスＲｈｉ１０７−１１由来の部分精製のイムノアドヘシンの種々のフラクションを含有する非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの免疫ブロットを示す。分析された精製フラクションは、ジュース(Ｊ)、Ｇ-１００フラクション(Ｇ)、滅菌濾過済Ｇ-１００フラクション(ＳＧ)、ヒトＳiｇＡ(７５ng)およびヒトＩＣＡＭ−１(７５ng)(ＲＳ)の参照標準混合物である。ブロットは、ヒトＩＣＡＭ（〜ＩＣＡＭ)、ヒトＩｇＡ重鎖(〜α)、ヒト分泌成分(〜ＳＣ)、ヒトＪ鎖(〜Ｊ)に対する抗体で調べた。二次的に、酵素コンジュゲート抗体を、アルカリホスファターゼにより免疫陽性バンドを標識するために必要に応じ用いた。
図４は、抗ＩＣＡＭｍＡｂとの結合に対する、植物抽出物と可溶性ＩＣＡＭ−１との競合を示す酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ)の結果を示す。アッセイについて、９６ウェル・プレートを０.２５μｇ可溶性ＩＣＡＭ−１/mlで被覆した。ＩＣＡＭ−１の増加濃度は四角で示し、一定量のマウス(抗ヒトＩＣＡＭ）抗体についての接着ＩＣＡＭとの競合のために使用したカルス抽出物（Ｇ-１００由来の滅菌濾過フラクション）の増加量を丸で示す。
図５は、ＨｅＬａ細胞を死滅させるヒト・ライノウイルスを阻害するイムノアドヘシンの能力を示すアッセイ（細胞障害作用すなわちＣＰＥアッセイ）の結果を示すものである。５Ａは、ＩＣＡＭ-Ｆｃ融合物中のイムノアドヘシン(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)を含有するか、ドキソルビシンに対する抗体を含有する部分精製された抽出物の存在下での、ＨｅＬａ細胞に対するヒト・ライノウイルスのＣＰＥを比較したアッセイの結果を示す（通常三角形および逆三角形は、イムノアドヘシンを含有する Ｒｈｉ１０７-１１由来の２種の抽出物を表す）。５Ｂは、ＨｅＬａ細胞に対するヒト・ライノウイルスのＣＰＥを、溶性ヒトＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ-Ｆｃ融合(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)中のイムノアドヘシンからの抽出物の存在において、比較したアッセイの結果を示す。挿入図は、可溶性ＩＣＡＭ（１.３５μg/ml)およびＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ(０.１２μg/ml；１１.３倍少ない）についてのＩＣ50の範囲を拡大スケールで示す。
図６は、１ｇの最終的イムノアドヘシンをつくるのに必要な産生についての評価を示す。この図において、１ｇのイムノアドヘシンに要する植物数、２０％収率、発現の期待レベルで、植物重量を表示する。異なるレベルのイムノアドヘシンの発現(mg/kg 新鮮重量）および全体の回収（２０％に設定）で、各植物の重量および植物の全数を、合理的な可能性の範囲（点線での四角枠）内での具体的な産生目標（１g/採取）について決定できる。必要な植物の数は、具体的な成長および再成長期間の数とは逆に減少する。期待されるバイオマス産生、時間と成長条件の関数は、採取までの時間および採取間の時間に影響を与える。この成長期間を精製スケジュールの実際に、植え付けおよび収穫する日をずらして、調整できる。
図７は、表２に挙げた各免疫グロブリン遺伝子およびタンパク質のコード配列およびアミノ酸配列を示す[配列番号：１５〜４７、および配列番号：５２〜６２]。
図８は、本発明のイムノアドヘシンの発現試験における使用のため、実施例２に記載のように、植物を形質転換するのに用いられるプラスミドの配列を示す。
図８Ａは、プラスミドＰＳＳｐＩＣＡＭＨｕＡ２についてのヌクレオチド[配列番号：９]およびタンパク質[配列番号：４８]の配列を示す。
図８Ｂは、ビーン・レグミン・シグナル・ペプチドについてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列[配列番号：１０]を示す。
図８Ｃは、ｐＳＨｕＪのタンパク質コード領域についてのヌクレオチド[配列番号：１１]およびアミノ酸[配列番号：５０]の配列を示す。
図８Ｄは、ｐＳＨｕＳＣのタンパク質コード領域についてのヌクレオチド[配列番号：１２]およびアミノ酸[配列番号：５１]の配列を示す。
図８Ｅは、プラスミドｐＢＭＳＰ−１についてのヌクレオチド配列[配列番号：１３]を示す。
図８Ｆは、プラスミドｐＢＭＳＰ-１ｓｐＪＳＣ についてのヌクレオチド配列[配列番号：１４]を示す。
図９は、ＩＣＡＭ−１およびヒトＩｇＡ２についてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および他のヌクレオチド配列を含む。
図１０は、ＡＴＲ−ＩｇＡ２融合物(イムノアドヘシン)の全ヌクレオチド(配列番号：９８)およびアミノ酸配列(配列番号：９９)を示す。
図１１は、プラスミドｐＧＰＴＶ-kan-ocs−ＡＴＲ−ＩｇＡ２．の T-DNA 境界の間の配列(配列番号：１００)を示す。
図１２は、プラスミドpGPTV-hpt-ocs-35SJ/SCのT-DNA境界の間にある配列(配列番号：１０１)を示す。
図１３は、細胞変性効果アッセイを示す。ＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ２(菱形)および可溶性ＩＣＡＭ−１(四角)をヒト・ライノウイルスと様々な濃度で混合し、次いでＨｅＬａ細胞に添加した。細胞死の阻害を4日目に定量した。
図１４は、ＣＭＧ２-ＩｇＧ構築体および変異体のアミノ酸配列を示す。太字のシステイン(上記配列のＣｙｓ１８５、および公開したＣＭＧ２配列３１のＣｙｓ２１８)が、ＶＷＡ／Ｉドメインの最小のアミノ酸である。下記の１４個のアミノ酸(イタリック)は、ＣＭＧ２の一部であるが、ＶＷＡ／Ｉドメインではない。標識の上記配列は、ＩｇＧ1、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３の開始部分を示す。下線配列は、ＩｇＧ１ヒンジ領域である。変異体(Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂおよびＶ３の配列)は、削除したアミノ酸を破線によって示される。太字のアミノ酸の上の数字は、配列決定したフラグメントのアミノ末端を示す(文字で示した)。
図１５は、タンパク質-Ａ精製済ＣＭＧ２-ＩｇＧおよび１ＨＩｇＧの銀染色ゲルである。レーン１および４、タンパク質サイズ標準物；レーン２、還元ＣＭＧ２-ＩｇＧ；レーン３、還元１Ｈ；レーン５＆６、２つの別の調製物由来の非還元ＣＭＧ２-ＩｇＧ；レーン７、非還元１Ｈ。組換えタンパク質サンプルはレーンあたり50 ngのタンパク質を含有する。ＣＭＧ２-ＩｇＧイムノアドヘシンおよび可能な分解産物の図解表示を右に示した。
図１６は、ＣＭＧ２-ＩｇＧおよび変異体のコマジー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１ー７は非還元条件下で泳動した。レーン８-１３は還元条件下(100 mM DTT)で泳動した。レーン１および８、元々のＣＭＧ２-ＩｇＧ；レーン２および９、Ｖ１；レーン３および１０、Ｖ２ａ；レーン４および１１、Ｖ２ｂ、レーン５および１２、Ｖ３；レーン６および１３、ＣＭＧ２-ＩｇＧ＋κ鎖；レーン７、分子量マーカー。
図１７は、サイズ溶出クロマトグラフィーによって分画した植物由来ＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂの溶出プロファイルである。タバコ植物からのタンパク質-Ａ精製済のＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂをTosoh G4000SW columnに重層し、ＰＢＳを用いて溶出した。タンパク質を280nmでの吸光度により追跡した。カラムを泳動前に分子量標準を用いて較正した。保持時間および計算分子量をプロファイルに示した。内部標準p-アミノ安息香酸(15.3分間の保持時間を有するピーク)を分離する前にサンプルに添加した。
図１８は、ＣＭＧ２-ＩｇＧ 変異体による致死毒細胞毒性の中和を示す。ＲＡＷ264.7 マウスマクロファージ様細胞を、ＰＡ＋ＬＦに加え、元々のＣＭＧ２-ＩｇＧ(四角)、ＣＭＧ２-ＩｇＧ V2b (菱形)または無関係の植物から作成したＩｇＧ(丸)のいずれかの濃度を徐々に増加させて(0〜1.25μg/ml)、暴露した。各時点は３回反復した平均である。
図１９はＣＭＧ２-ＩｇＧ V2bのモデルである。抗毒素素のホモ二量体と一分子のPAとの結合に関する仮説図。該抗毒素はＣγ３ドメイン間の非共有結合相互作用によって共に形成した場合を示すがしかし分子の一部のヒンジ領域(ＣＭＧ２およびＣγ２)内のジスルフィド結合であってもよい。直線は縮尺比を示す。構造ファイルは、タンパク質データベースからのものであり、分子画像はthe Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco (NIH P41 RR-01081によって支持される)54 からのUCSFキメラパッケージを用いて作成した。
図２０は、ＣＭＧ２-κ変異体を示す。ＣＭＧ２-κをＣＭＧ２-ＩｇＧＶ１またはＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ３のいずれかを用いてN. benthamiana中で発現させ、タンパク質Ａによって精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、コマジーブルーで染色した。レーン１＆２は、非還元条件下で泳動させた。レーン３＆４は還元条件(100 mM DTT)下で泳動させる；レーン５、分子量マーカー。
表の簡単な説明
表１は、ＩＣＡＭ−１の５つの細胞外ドメインについての境界を挙げた。
表２は、免疫グロブリン重鎖遺伝子のGenBank アクセス番号および該遺伝子によってコードされたタンパク質を示す。
表３は、他の化学的ライノウイルス毒素受容体タンパク質を構築するために使用され得るＩＣＡＭ−１ホモロジーを有する分子の例示のリストを提供する。
表４は、既知のボツリヌス菌受容体および推定結合ドメインを示す。
表５は、実施例９で行ったランダム化ライノウイルス攻撃試験についての試験略図を示す。
表６は、実施例１６に記載したような一過的形質転換したN. benthamiana葉におけるキメラ炭疽菌毒素受容体産生を示す。
表７は、実施例１８について計算したＩＣ50と、該ＩＣ50での抗毒素素とＰＡとのモル比を示す。
表８は、実施例１９における様々なＣＭＧ−ＩｇＧキメラ変異体の構造を示す。
（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
本明細書での使用において、下記の略号および用語は、必ずしもそれに限定されるわけでないが、下記の定義を含む。
本発明の実施において、特に別記しない限り、当技術分野内にある免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡについての通常の技術を用いる。参照、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., (1987)); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); M.J. MacPherson et al., eds. Pcr 2: A Practical Approach (1995); Harlow and Lane, eds, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), and H. Jones, Methods In Molecular Biology vol. 49, "Plant Gene Transfer And Expression Protocols" (1995)。
イムノアドヘシン：免疫グロブリン定常領域の一部と融合したキメラ毒素受容体タンパク質分子、および所望により分泌成分およびＪ鎖を含有する複合体。
キメラ毒素受容体タンパク質：毒素受容体から得たそのアミノ酸配列の少なくとも一部および免疫グロブリン複合体由来の少なくとも一部を有する毒素受容体を基にしたタンパク質。
毒素受容体：本明細書に使用したとおりに、この用語は、キメラ毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして機能できるのに十分な親和性および結合力を持つ病原体効果の発揮または発揮させる、本明細書に規定したような病原体抗原、毒素またはあらゆるタンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、多糖またはリポ多糖を結合するあらゆるポリペプチドを指す。例えば、毒素受容体は、ウイルス付着受容体、例えばＩＣＡＭ−１、ヒト・ライノウイルスに対する受容体、またはバクテリア毒素についての受容体、例えば炭疽菌保護抗原またはボツリヌス菌毒素についての受容体の一つであり得る。本明細書において使用したような毒素受容体は、毒素/病原体成分の結合のための最小の機能的エレメントを含有するであろうが、所望により１以上の追加のポリペプチドを包含してもよい。
免疫グロブリン分子または抗体：抗原と、一緒に共有結合し、特異的に結合し得る免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な一部を含有するポリペプチドまたは高分子タンパク質。免疫グロブリンまたは抗体分子は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ(ＳＩｇＡ)およびＩｇＥなどのいくつかの型の分子を含む大きいファミリーの分子である。
免疫グロブリン複合体：免疫グロブリン重鎖の一部、または免疫グロブリン重鎖の一部および免疫グロブリン軽鎖の両方を包含し得るポリペプチド複合体。２つの成分は、多様な手段、例えばジスルフィド結合などの共有結合を含むを介して互いに会合され得る。
免疫グロブリン重鎖の一部：本明細書で使用する場合、該用語は、本明細書に記載したようなキメラ毒素受容体タンパク質に対して後記特性の少なくとも一つを付与するために必要である重鎖領域を指す：重合化能力、エフェクター機能、タンパク質ＧまたはＡによって精製される能力、または改良された薬物動態。典型的に、定常領域の少なくとも一部を包含する。
免疫グロブリン軽鎖の一部：明細書で使用したとおり、該用語は、記載したキメラ毒素受容体タンパク質の安定性を増加し、こうして産生収率を増加させるために必要である軽鎖の領域を示す。典型的に、これは定常領域の少なくとも一部を包含する。
重鎖定常領域：重鎖免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有するポリペプチド。典型的に、その天然形態、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ免疫グロブリン重鎖は一つの可変領域に結合した３つの定常領域を含有する。ＩｇＭおよびＩｇＥは、１つの可変領域と結合した４つの定常領域を含有する。本明細書に記載したような、この定常領域は、可変性ドメインに近接した領域、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇ重鎖から連続して番号を付けられ、該領域は次のように呼ばれる：可変領域、定常領域１、定常領域２、定常領域３。ＩｇＭおよびＩｇＥについて、該領域は次のように呼ばれる：可変領域、定常領域１、定常領域２、定常領域３および定常領域４。
キメラ免疫グロブリン重鎖：異なるイソタイプまたはサブタイプあるいはある種他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の免疫グロブリン重鎖から得られるそのアミノ酸配列の少なくとも一部を有する免疫グロブリン由来の重鎖。通常、キメラ免疫グロブリン重鎖は、少なくとも２つの異なるイソタイプまたはサブタイプの免疫グロブリン重鎖から得たそのアミノ酸残基配列を有する。
Ｊ鎖：免疫グロブリンの重合化および重合免疫グロブリンの上皮細胞を経る移動に関与するポリペプチド。参照、Immunoglobuline Helper:The J chain in Immunoglobuline Gees at pg. 345, Academic Press (1989)。Ｊ鎖は、五量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＡにおいて認められ、典型的にはジスルフィド結合で連結する。Ｊ鎖はマウスとヒトの両方で研究されている。
分泌成分（ＳＣ)：不活性化物質に対して免疫グロブリンを保護し、もって分泌免疫グロブリンの生物学的効力を増加するのを助ける分泌免疫グロブリンの成分。分泌成分は、ヒトおよびマウスを含む哺乳動物や齧歯類に由来し得る。
リンカー：本明細書で使用したように、該用語は、組み換え的に産生したポリペプチドの折り畳みおよび安定性を促進するために使用されたあらゆるポリペプチド配列を指す。好ましくは、このリンカーは、柔軟なリンカー、例えばポリペプチド配列、例えば(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含むものである。
トランスジェニック植物：遺伝子工学的に作成した植物または遺伝子工学的に作成した植物の産物。トランスジェニック植物は、通常少なくとも１つの非関連生物、例えばウイルス、別の植物または動物由来の材料を含有する。
単葉類（monocots)：胚が１つの種子葉すなわち子葉を有する下記の顕花植物。この例としては、ユリ類、草類、トウモロコシ、オートムギ、コムギおよびオオムギを含む穀類、ラン類、ユリ類、タマネギ類、ヤシ類がある。
双子葉類（dicots)：胚が２つの種子葉すなわち子葉を有する下記の顕花植物。この例としては、タバコ、トマト、アルファルファを含む豆果、カシ類、カエデ類、バラ類、ミント類、カボチャ類、ヒナギク類、クルミ類、サボテン類、スミレ類、キンポウゲ類がある。
グリコシル化：オリゴ糖によるタンパク質の修飾。グリコシル化シグナルとして機能するポリペプチド配列の総説については、Marshall, Ann. Rev. Biochem., 421: 673 (1972) および Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974)を参照されたい。これらのシグナルは哺乳動物および植物の細胞で認められている。
植物特異的グリコシル化：植物発現タンパク質に認められるグリコシル化パターン。これは哺乳動物または昆虫の細胞で作られたタンパク質で認められるものと相違する。植物体または植物細胞中で発現されるタンパク質は、哺乳動物または昆虫の細胞を含む他の型の細胞中で発現されるタンパク質と異なるパターンのグリコシル化を有する。植物特異的グリコシル化の特徴解明および他の細胞型でのグリコシル化との比較についての詳細な研究は、下記に発表されている：Cabanes-Macheteau et alk Glycobiology 9(4): 365-372 (1999)、Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38: 31-48 (1998)、Altmann, Glycocojugate J. 14: 643-646 (1997)。植物特異的グリコシル化はマンノースにβ(１,２) 結合したキシロースを有するグリカンをつくる。哺乳動物および昆虫のグリコシル化はマンノースにβ(１,２)結合したキシロースをつくらない。植物はグリカンの末端に結合したシアル酸を有さないが、哺乳動物細胞は有する。さらに、植物特異的グリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃにα(１,３)結合したフコースをもたらすが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃにα(１,６)結合したフコースをもたらす。
病原体抗原：病原性の効果を発揮するかまたは発揮させるあらゆる分子、例えば毒素。病原体抗原は、抗体の形成を刺激できても、出来なくてもよい。
炭疽菌毒素受容体：本明細書で使用する場合、該用語は保護抗原（ＰＡ）に結合するあらゆるポリペプチドを指すものであり、宿主細胞を破壊するようにバシラス・アンスラシス（Bacillus anthracis）によって使用した３つの相互作用するタンパク質の内の一つであって、キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして作用させるため作用するのに十分な親和性および結合力を有する。２つの内生細胞性炭疽菌毒素受容体は当分野で同定されている：炭疽菌毒素受容体/腫瘍内皮マーカー８（ＡＴＲ／ＴＥＭ８)(Bradley et al., 2001)および毛細血管形態形成ファクター２(ＣＭＧ２)(Scobie et al., 2001)。これらのＡＴＲの細胞外ドメインは、下記に説明したＶＷＡ／Ｉドメインを含有する。本明細書で使用したような炭疽菌毒素受容体は、ＰＡの結合のための機能的要素を最小限で含有するが、所望により炭疽菌毒素受容体コード配列中にさらなる追加のポリペプチドの一つをコードする配列をスプライシングすることによって生成され得るさらなる追加のポリペプチド(例えば、受容体デコイとして炭疽菌毒素受容体の使用を改良するもの)の一つを包含してもよい。
ＶＷＡ／Ｉドメイン：本明細書で使用したように、該用語は、フォンビルブランド因子タイプＡドメイン(ＶＷＡドメイン)を指し、また一般的にはインテグリン挿入ドメイン(Ｉドメイン)と呼ばれており、これは２つの既知の炭疽菌毒素受容体、ＴＥＭ８およびＣＭＧ２の細胞外ドメイン内のドメインであり、受容体への適切なＰＡ結合のために重要である金属の鉄依存性付着部位(ＭＩＤＡＳ)を含有すると考えられる。
キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質：炭疽菌毒素受容体から得られたそのアミノ酸配列の少なくとも一部および免疫グロブリン複合体から得られた少なくとも一部を有する炭疽菌毒素受容体を基にしたタンパク質。該免疫グロブリン複合体は、免疫グロブリン重鎖の一部または重鎖の一部および軽鎖の一部の両方を含有し得る。
ボツリヌス菌毒素受容体：キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして作用できるように十分な親和性および結合力を有する、ボツリヌス菌毒を結合する任意のポリペプチド。例示には、ＳＶ２およびシナプトタグミンが含まれる。
有効量：本発明の免疫グロブリンの有効量は、ウイルスまたは細菌感染（場合によって）、細胞毒性または複製を検出可能的に阻害するのに、または感染の重症度または長さを低下させるのに十分な量である。
構築体またはベクター：標的植物組織または細胞に移行されるべき人工的に会合したＤＮＡセグメント。典型的に、構築体は、遺伝子または特定挿入物の遺伝子、マーカー遺伝子および適切なコントロール配列を包含する。用語「プラスミド」は、自立性、自己複製する染色体外のＤＮＡ分子を指す。適切な調節エレメントを含有するプラスミド構築体は、"発現カセット"を指す。好ましい実施形態において、プラスミド構築体は、またスクリーニングまたは選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子を含有する。
選択マーカー：トランスジェニック組織の増殖が選択培地で可能である産物をコードする遺伝子。選択マーカーの非限定な例示は、抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシンなどをコードする遺伝子である。他の選択可能なマーカーは、当業者に知られている。
改良された安定性を有するキメラ毒素受容体タンパク質
本明細書に記載したキメラ毒素受容体タンパク質は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含有する免疫グロブリン複合体と会合した毒素受容体を有する。毒素受容体タンパク質は、重鎖、軽鎖、または両方と会合され得る。いくつかの実施形態において、単独または分泌成分と会合したJ鎖は、イムノアドヘシンを形成するためにキメラ毒素受容体タンパク質と会合される。別の実施形態において、キメラ毒素受容体タンパク質は、植物特異的グリコシル化を有する。
理論にしばられることは望まないが、本明細書に記載したようにキメラ毒素受容体タンパク質は、多価受容体による高い活性、免疫グロブリンＦｃのエフェクター機能、Ｆｃを理由とする改善された薬物動態、および植物において作成された場合に低産生コストを包含する、存在するモノクローナル抗体または受容体デコイを基にした予防薬または治療法を超える有意な利点を持つことが考えられる。
多価に関する利点は、ヒトＩＣＡＭ−１の細胞外ドメインと免疫グロブリン重鎖の融合によって示されてきた[Martin, S., Casasnovas, J. M., Staunton, D. E. & Springer, T. A. Efficient neutralization and disruption of rhinovirus by chimeric ICAM-1/immunoglobuline molecules. J Virol 67, 3561-8 (1993)]。ＩＣＡＭ−１は、ヒト・ライノウイルス(ＨＲＶ)、すなわち一般的な風邪ウイルス、に対する細胞表面受容体である。キメライムノアドヘシンは、細胞へのＨＲＶ結合を阻害する際およびウイルス・カプシドの構造を破壊する際に可溶性ＩＣＡＭ−１よりもより効果的である(Martin et al. J Virol 67, 3561-8 (1993))。ＨＲＶの細胞変性効果から細胞を保護する場合に可溶性ＩＣＡＭ−１の特異的活性を１０倍以上有するＩＣＡＭ−１／ＩｇＡ２キメラ(RhinoRx)が、トランスジェニックタバコにおいて発現される。
Ｆｃ領域の存在は、補体の存在において、免疫グロブリンエフェクター機能、例えば細胞の特異的分解を媒介する能力を付与すべきである。免疫グロブリンの重鎖定常領域ドメインは、このドメインを含有する特定分子に対する抗体エフェクター機能として知られる様々な特性を与える。例示のエフェクター機能には、補体結合、胎盤通過、連鎖球菌（staphyloccal）タンパク質への結合、連鎖球菌タンパク質Ｇへの結合、単核細胞、好中球またはマスト細胞および好塩基球への結合が挙げられる。これらのエフェクター機能を有する特定のドメインおよび特定の免疫グロブリンイソ型との会合は十分に知られており、例えばImmunology, Roitt et al., Mosby St. Louis, Mo. (1993 3rd Ed.)において説明されている。
さらに、ＦｃＲｎへのＦｃの結合は、より長期の循環においてイムノアドヘシンを継続できなければならない[Ober, R. J., Martinez, C., Vaccaro, C., Zhou, J. & Ward, E. S. Visualizing the Site and Dynamics of IgG Salvage by the MHC Class I-Related Receptor, FcRn. J Immunol 172, 2021-2029 (2004)]。このことにより、抗毒素を予防薬として使用できる。
宿主細胞、宿主組織または宿主生物、植物細胞、植物組織またはインタクトな植物中で産生される場合、キメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシン分子または複合体の生産性の増加は、該分子の高収率、および加工の際の製造コストの低下をもたらす。このような増強した生産性は、キメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシンまたはイムノアドヘシン複合体の構成鎖を産生における高効率、および／またはイムノアドヘシン複合体会合の高効率の結果であり得る。特に免疫グロブリン重鎖の一部および軽鎖の一部の両方を含むキメラ毒素受容体タンパク質またはイムノアドヘシンの場合において、精製または部分精製したイムノアドヘシンの活性の明らかなレベル増加は、構成鎖の利用性増加および／または複合体の会合における高効率および／または受容体の多価性または前記全ての組合せが理由であり得る。
当業者は、本明細書に記載したキメラ毒素受容体タンパク質が機能および安定性を改善する必要がある場合、プロテアーゼ感受性ドメインを除き、リンカーを包含するように必要に応じて修飾され得ると理解する。かかる修飾を導入するための方法は、当業者にはよく知られている；しかし、かかる修飾の正確な性質(例えば、除くドメイン、リンカーの長さおよび位置)は先験的に知られていない。
毒素受容体
毒素受容体は、キメラ毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして作用出来るように十分な親和性および結合力を有する病原性効果を発揮するかまたは発揮をもたらす病原体抗原、毒素またはあらゆるタンパク質を結合するあらゆるポリペプチドである。例えば、抗ウイルスまたは抗微生物の実施形態において、目的とするウイルス、細菌または細菌を結合するのに有効な１以上の受容体タンパク質またはその従属成分（例えば、ウイルスまたは細菌によって産生されたタンパク質、およびウイルスまたは細菌にとってその病原性効果を発揮するかまたは発揮させる過程を開始するのに必要なタンパク質）が使用される。多くのかかる受容体タンパク質は知られており、過度の実験を要せずに当業者により本発明の適切な態様における使用を実行され得る。
毒素受容体の例は、ＩＣＡＭ−１、ヒト・ライノウイルスに対する受容体である。ＩＣＡＭ−１についてのヌクレオチド配列は決定されており、Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988); Greve, et al. Cell 56:839-847 (1989); Greve, et al. J. Virology 65:6015-6023 (1991); Staunton, et al., Cell, 61:243-254 (1990)により特徴付けられ、配列番号：３およびGenBank アクセション番号M24283に記載されている。ＩＣＡＭ−１分子は、５つの細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインを有する膜タンパク質(配列番号：１および２)である。これらの特徴は、Casasnovas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:4134-4139 (1998) and Staunton, et al, Cell 52:925-933 (1988)において説明されている。
記載したキメラ毒素受容体タンパク質において使用した毒素受容体は、完全な毒素受容体であるか、またはキメラ毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして作用できるように十分な親和性および結合力を付与するのに十分な一部であり得る。
例えば、毒素受容体がＩＣＡＭ−１分子であれば、本発明において特に使用するのは、Ｎ末端ドメイン１および２に局在しているヒト・ライノウイルス（Greve et al., J. Virology 65: 6015-6023 (1991); Staunton et al., Cell, 61: 243-254 (1990)）に関与するＩＣＡＭ−１分子のドメインである。また、意図したものは、ＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン１、２、３、４、５のいかなる組合せも含むライノウイルス受容体タンパク質部分にも関する。特に好ましい実施態様において、ライノウイルス受容体タンパク質部分は、ＩＣＡＭ−１分子のドメイン１および２を含み、他の好ましい実施態様において、ＩＣＡＭ−１分子のドメイン１、２、３、４、５が存在する。
ＩＣＡＭ−１の５つの細胞外ドメインの境界は、当技術分野で既知であり、Staunton et al., Cell, 52: 925-933 (1988)に記載されている。配列番号２についての概要のドメイン境界を表１に下記する。
表 1
Figure 2009502205
本発明のいくつかの態様および実施態様における使用において、ＩＣＡＭ−１のドメイン１は約残基１から約残基８８であり；ドメイン２は約残基８９から約残基１０５であり；ドメイン３は約残基１０６から約残基２８４であり；ドメイン４は約残基２８５から約残基３８５であり；ドメイン５は約残基３８６から約残基４５３である。当業者は、これらのドメインの厳密な境界が変り得ることを理解するであろう。
本発明における使用のための炭疽菌受容体および適切なドメインは、章の標題「炭疽菌キメラ毒素受容体」においてより詳細に説明されている。
本発明における使用のためのボツリヌス菌受容体および適切なドメインは、章の標題「ボツリヌス菌キメラ毒素受容体」においてより詳細に説明されている。
免疫グロブリン複合体
免疫グロブリン複合体は、免疫グロブリン重鎖の一部または免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方の一部を包含できる。この２つの成分は、共有結合、例えばジスルフィド結合を包含する多様な異なる手段を介して互いに会合され得る。免疫グロブリン複合体は、少なくとも一つの毒素受容体タンパク質と会合される。会合は、共有結合、イオン相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属リガンド相互作用、または相互作用のあらゆる他のタイプを介してであってよい。
免疫グロブリン重鎖
キメラ毒素受容体タンパク質は、結合した炭疽菌受容体タンパク質を多量体化するか、抗体エフェクター機能を付与するか、植物中のキメラタンパク質を安定化するか、タンパク質ＡまたはＧによって精製される能力を付与するか、または薬物動態を改善する、いずれかの能力を付与するのに十分な少なくとも免疫グロブリン重鎖の一部を含有する。
これらの特性は、重鎖の定常領域によって付与される。キメラ毒素受容体タンパク質が免疫グロブリン重鎖のみを含有する場合、免疫グロブリン複合体中の重鎖の一部、好ましくは少なくともドメインＣＨ２およびＣＨ３を含有し、より好ましくはＣＨ２およびＣＨ３を含有する。キメラ毒素受容体タンパク質が重鎖および軽鎖の両方を含有するなら、免疫グロブリン複合体中の重鎖の一部、好ましくはＣＨ１ドメインを含有する。
当業者は、免疫グロブリン重鎖の定常領域配列を容易に同定できる。例えば、多くの免疫グロブリンＤＮＡおよびタンパク質配列は、GenBank から入手可能である。表２は、免疫グロブリン重鎖遺伝子および該遺伝子によってコードされたタンパク質のGenBankアクセション番号を示す。
表２
Figure 2009502205
Figure 2009502205
Figure 2009502205
Figure 2009502205
Figure 2009502205
従って、特定の実施形態において、免疫グロブリン重鎖から得られたキメラ分子の一部は、上記特性を付与するのに十分な一部を依然として含有している限り、完全な重鎖よりも短いものを含み得る。
免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリンのあらゆるタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたは免疫グロブリン重鎖由来のものであり得る。免疫グロブリン重鎖の一部は、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＤ重鎖のＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３、またはＩｇＭまたはＩｇＥ重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４を含有できる。様々な組合せ物およびこれらの定常ドメインの副結合もまた考えられる。
好ましい実施態様において、重鎖の一部は、免疫グロブリン重鎖がＪ鎖に結合して、これにより分泌成分に結合するのを可能にするＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖の一部である。免疫グロブリン重鎖から得られたキメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質の一部は、ＩｇＡ重鎖またはＩｇＭの重鎖から、または重鎖のいくつかの他のイソタイプから選択された個々のドメインを含み得る。ＩｇＡまたはＩｇＭ以外の免疫グロブリン重鎖から、または免疫グロブリン軽鎖から得られる免疫グロブリン・ドメインは、Ｊ鎖に結合するように分子的に設計して、もって本発明の免疫グロブリンおよびイムノアドヘシンを作成するのに使用できると考えられる。
好ましい実施態様において、キメラ毒素受容体タンパク質は、少なくともＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、マウスまたはヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＭのドメインを含有する。本発明の別の好ましい実施態様は、ＩｇＭの少なくともＣμ１、Ｃμ２、Ｃμ３またはＣμ４ドメインを包含する免疫グロブリン・ドメインである。
当業者は、免疫グロブリンがおよそ１００-１１０アミノ酸残基であるドメインからなることを理解できるであろう。これらの種々のドメインは、当技術分野で知られており、既知の境界を有す。単一ドメインの除去および他の抗体分子のドメインでのその置換は、現在の分子生物学で容易に達成される。該ドメインは鎖間ジスルフィド結合により安定となる球状構造である。このものは、不連続な形態を付与し、ドメインを他の同様に形つくられたドメインで置換または置き換え可能な自己含有単位とする。
重鎖キメラ免疫グロブリン
様々な態様および実施態様は、重鎖を含む免疫グロブリン・ドメインが、重鎖免疫グロブリン・ドメインの異なるイソタイプから得られるキメラ毒素受容体を意図するものである。当業者は、分子技術を用いて、これらのドメインを類似のドメインで置換し、そうして２つの異なる免疫グロブリン分子間のハイブリドである免疫グロブリンをつくり得ると理解するであろう。これらのキメラ免疫グロブリンによって、異なる免疫グロブリン・ドメインにより付与される種々の異なる望ましい特性を含有するようなイムノアドヘシンを構築できる。
特定の態様において、キメラ毒素受容体分子は、ヒト免疫グロブリン重鎖の２つの異なるイソタイプ由来のドメインを含有する。
いくつかの実施態様において、キメラ重鎖免疫グロブリンは、ＩｇＡまたはＩｇＭとＪ鎖との会合に関与するＩｇＡまたはＩｇＭの一部を含有する。このように、キメラ毒素受容体中のキメラ免疫グロブリンを使用することにより、Ｊ鎖が、Ｊ鎖または分泌成分に結合しないイソタイプの優勢なキメラ免疫グロブリンと会合し得る。
本発明はまた、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物の１種から得られるキメラ重鎖免疫グロブリンが意図される。本発明はまた、少なくとも２つの異なるイソタイプの哺乳動物の免疫グロブリンから得られる免疫グロブリン・ドメインを含有するキメラ重鎖免疫グロブリンを意図する。一般的に、いずれの哺乳動物の免疫グロブリンも好ましい実施態様において使用できる。それは下記のようなイソタイプである：ＩｇＧのあらゆるイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭのあらゆるイソタイプ。本発明はまた、２つの異なるイソタイプの齧歯類または霊長類の免疫グロブリンから得られる免疫グロブリン・ドメインを含有するキメラ分子を意図する。齧歯類または霊長類のイソタイプの免疫グロブリンは、当技術分野で既知である。
本発明のキメラ分子は、少なくとも１つの下記の免疫グロブリン・ドメインを含む免疫グロブリン由来重鎖を含有し得る：マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２b、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；マウスＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤのＣＨ１ドメイン；ヒトＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；イソタイプの哺乳動物ＩｇＧ、イソタイプのＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；哺乳動物ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；イソタイプの齧歯類ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；齧歯類ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン；イソタイプの動物ＩｇＧ、イソタイプのＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン；および動物ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン。
本発明はまた、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーである分子から得たタンパク質ドメインのキメラ分子への置換または添加に関する。免疫グロブリンのスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンに相同なアミノ酸残基配列および核酸配列を有する。免疫グロブリンのスーパーファミリーの一部である分子は、アミノ酸または核酸の配列の相同性により同定できる。例えば、Immunoglobulin Genes, Academic Press (1989) p.361を参照されたい。
軽鎖免疫グロブリン
本明細書に記載した免疫グロブリン軽鎖は、発現したキメラ毒素受容体の安定性を増加させるのに十分な免疫グロブリン軽鎖の一部である。好ましくは、本発明の軽鎖には、少なくとも定常ドメインまたは本明細書に記載した重鎖のいずれかと十分に会合するようになる定常ドメインの少なくとも一部を包含する。従って、該鎖は、全長以下のドメインを含有できる。該軽鎖はλまたはκ鎖のいずれかであり得る。
軽鎖に共有結合した毒素受容体の同一性は、キメラ毒素受容体タンパク質/イムノアドヘシンの親和性および結合力に影響するように調節され得る。例えば、軽鎖に共有結合した毒素受容体が重鎖に会合したものと同じ毒素受容体、または同じ毒素受容体であるが異なる受容体ドメインの存在により異なるアミノ酸配列を持つもの、または同じ毒素に対しての代替的な受容体であるなら、それはキメラ毒素受容体タンパク質の親和力を増加させることができる。あるいは、軽鎖は別の毒素に対する受容体に共有結合でき、もって複数の毒素についてデコイとして使用するために適切なキメラ毒素受容体タンパク質を作成できる。
軽鎖のドメインと可変ドメインの間の会合は、結合のあらゆる種類を介して存在し得る。例えば、結合は、柔軟なポリペプチドリンカー、例えば(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３リンカーであり得る。
本明細書に記載したような軽鎖は、本発明の重鎖に記載した内容と同様のバリエーションを生じ得ることが考えられる。例えば、軽鎖定常ドメインは様々な生物や種から得られ得る。
毒素受容体と免疫グロブリン複合体との結合
免疫グロブリン複合体と毒素受容体との結合は、軽鎖と毒素受容体との間の会合、より好ましくは重鎖および毒素受容体の間の会合、および最も好ましくは両方の会合のいずれかであり得る。これらの会合は、本明細書に記載したイムノアドヘシンについて、受容体デコイとして作用するように十分な柔軟性を提供する結合のあらゆるタイプを介し得る。好ましくは、結合は共有結合、例えば共有ペプチド結合である。
例えば、この結合は、本来のアミノ酸配列であり得、ＣＨ２およびＣＨ３の間に見出された免疫グロブリンヒンジ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡまたは柔軟な合成ポリペプチドリンカー、例えば(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３リンカーまたは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３であり得る。一つのキメラ毒素受容体は多くの異なるタイプのリンカーを含有し得る。
イムノアドヘシン
本発明は、少なくとも一つのキメラ毒素受容体タンパク質を包含するポリペプチドであるイムノアドヘシンも包含し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のイムノアドヘシンは、J鎖および／または分泌成分も包含する。別の実施形態において、イムノアドヘシンは、１以上のキメラ毒素受容体タンパク質を包含する。
Ｊ鎖
本発明のイムノアドヘシンは、キメラ毒素受容体タンパク質に加えて、免疫グロブリン由来重鎖に結合したＪ鎖を含有する。好ましい実施態様において、本発明のイムノアドヘシンは、２または４のキメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質および少なくとも１つのキメラタンパク質に結合しているＪ鎖を含む。Ｊ鎖は当技術分野で既知である。参照、例えば、M. Koshland, The Immunoglobulin Helper: The J chain, in Immunogloblin Genes, Academic Press, London, pg. 345 (1989) and Matsuuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 456-460 (1986)。該Ｊ鎖の配列は米国における種々のデータベースで利用可能である。
分泌成分
イムノアドヘシンは、キメラ毒受容体タンパク質と会合した分泌成分を有する。この会合は、水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン相互作用、これらの多様な結合の組合せによって生じ得る。
本発明は、ヒト、ラット、ウサギ、ウシなどを含む多くの異なる種類に由来する分泌成分の使用に関する。これらの分子のヌクレオチド配列は当技術分野で既知である。例えば、米国特許６,０４６,０３７には多数の配列が含まれており、出典明示により本明細書の一部とする。分泌成分、キメラ炭疽菌受容体タンパク質およびＪ鎖を含有する本発明のイムノアドヘシンは、典型的には下記のようなものによって共に結合している：水素結合、ジスルフィド結合、共有結合、イオン相互作用、これらの結合の組合せ。
多量体形態のイムノアドヘシン
本発明は、１以上のタンパク質分子を含むイムノアドヘシン、例えばそれらはキメラ毒素受容体分子を含有できる。イムノアドヘシンは、単量体単位であり、他のキメラ毒素受容体分子とジスルフィド結合していないキメラ毒素受容体分子を含有し得る。好ましい実施態様において、イムノアドヘシンは、他のキメラ毒素受容体分子と会合して、二量体および多価分子を形成するキメラ毒素受容体分子を含有する。典型的には、キメラ毒素受容体分子は、キメラ分子の免疫グロブリン部分の会合のために、二量体として存在する。キメラ毒素受容体分子の免疫グロブリン部分は、２つのキメラ炭疽菌毒素受容体分子の会合を可能にして、毒素受容体タンパク質部分からつくられる２つの活性結合部分を有するニ量体分子を形成する。好ましい実施態様において、二量体化は、自然生成の免疫グロブリン分子の一部としての免疫グロブリン・ドメインとの間に通常生じるジスルフィド結合領域を介して起こる。当業者は、天然の免疫グロブリン分子に通常存在するこれらのジスルフィド結合を、キメラ毒素受容体分子の二量体を形成する能力を維持したままで、修飾、移動、除去できることを理解するであろう。
いくつかの好ましい実施形態において、イムノアドヘシンの多量体形態は、４つのキメラ毒素受容体分子を有し、毒素受容体および免疫グロブリン重鎖の融合から得られる２つのキメラ毒素受容体分子は、互いにジスルフィド結合され、各々かかるジスルフィド結合したキメラ毒分子は、同様に毒素受容体とおよび免疫グロブリン軽鎖の融合から得られた別のキメラ毒素受容体分子にジスルフィド結合されて、四量体構造を形成する。かかる四量体キメラ毒素受容体分子の免疫グロブリン重鎖がＩｇＡ分子から得られる場合、Ｊ鎖の添加により、上記した四量体構造の２つを含有する複合体および８つのキメラ毒素受容体分子を有する複合体の形成が可能となる。
他の好ましい実施態様において、イムノアドヘシンは、Ｊ鎖とキメラ毒素受容体分子の免疫グロブリン部分との会合により、キメラ毒素受容体分子の多量体形態を含有する。Ｊ鎖の２つのキメラ毒素受容体分子の二量体との会合は、イムノアドヘシンの四量体形態の形成を可能にする。好ましい実施態様において、キメラ毒素受容体分子の免疫グロブリン部分はＩｇＡ分子から得られ、Ｊ鎖の添加により、４つのキメラ毒素受容体分子および４つの結合部位を含有する四量体複合体の形成が可能となる。他の好ましい実施態様において、キメラ分子の免疫グロブリン重鎖部分はＩｇＭから得られ、１０または１２分子を含有する多価複合体が形成し得る。他の好ましい実施態様において、キメラ毒素受容体分子がキメラ免疫グロブリン重鎖を使用すると、キメラ毒素受容体分子が、Ｊ鎖結合の役割を担うＩｇＡまたはＩｇＭのいずれかに由来するドメインを介して、二量体またはさらに高い多価複合体を形成し得る。他のキメラ免疫グロブリン分子において、２つの免疫グロブリン重鎖間のジスルフィド結合および/または免疫グロブリン軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合に関与する免疫グロブリン部分を、キメラ免疫グロブリン分子に入れると、二量体またはさら高い多価複合体の形成が可能になる。
植物特異的グリコシル化
本発明の特定の実施態様において、イムノアドヘシンおよび上記したキメラ毒素受容体タンパク質を、植物特異的グリコシル化を有するタンパク質を生成する方法によって発現せしめる。このグリコシル化が、植物、哺乳動物および昆虫細胞におけるタンパク質の主要な修飾であることは当分野でよく知られている（Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38: 31-48, 1998)。グリコシル化過程は、新生ポリペプチド鎖の特異的残基への前駆物質オリゴ糖の共翻訳的移行により小胞体において始まる。このオリゴ糖の異なるタイプへのグリカンへのプロセシングは、存在残基の型および残基間の結合性質で異なり、糖タンパク質が小胞体からその最終目的地に移動するにつれ分泌経路中でおこる。当業者には理解されるであろうが、この成熟の終了点で、植物体または植物細胞中で発現されたタンパク質は、哺乳動物や昆虫の細胞を含む他の型の細胞中で発現されるタンパク質とは異なるパターンのグリコシル化を有する。植物特異的グリコシル化の特徴解明および他の細胞型中のグリコシル化との比較についての詳細な研究は、例えば、下記の文献に記載されている：Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4): 365-372 (1999) および Altmann, Glycoconjugate J. 14: 643-646 (1997)。これらの文献などによると、植物特異的グリコシル化はマンノースに結合β(１,２)したキシロースを有するグリカンをつくるが、哺乳動物および昆虫の細胞においてはグリコシル化の結果としてキシロースがマンノースにβ(１,２)結合していない。植物特異的グリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃにα(１,３) 結合したフコースをもたらすが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化は隣接ＧｌｃＮＡｃにα(１,６)結合したフコースをもたらす。さらに、植物特異的グリコシル化はシアル酸をタンパク質グリカンの末端に付加しないが、哺乳動物細胞におけるグリコシル化ではシアル酸が付加される。
本発明のイムノアドヘシンおよびキメラ毒素受容体タンパク質を形成するポリペプチドの全てのアミノ酸配列はよく知られている。当業者に知られているように、グリコシル化部位はトリペプチドＡｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ/Ｔｈｒ(Ｘはプロリンおよびアスパラギン酸を除くいかなるアミノ酸でもあり得る）である（Kornfeld and Kornfeld, Annu Rev Biochem 54: 631-664, 1985)。従って、当業者であれば理解されるであろうが、植物特異的グリコシル化を有する本明細書に記載のタンパク質を形成するポリペプチドのアミノ酸は、植物特異的グリコシル化を持つ。
所望により、植物特異的グリコシル化は、キシロースおよびフコース結合が実質的に低下または排除される修飾された翻訳後のグリコシル化をもたらす小胞体以外の部位へ、キメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシンを形成する植物産生ポリペプチドの翻訳後のプロセシングを導く配列を付加することにより修飾され得る。免疫グロブリンのＣ末端をコードしている配列へのＫＤＥＬ付加は、このタイプの修飾されたグリコシル化に導く。
本発明の別の好ましい態様および実施態様において、特にＦｃ受容体相互作用がウイルス、細菌、真菌類または、それらによって産生されるかまたは該産物が投与される対象中に存在する毒素分子の病理学的影響を防止するか、または治療を提供するために機能的キメラ毒素受容体タンパク質/イムノアドヘシン産物を必要としない場合には、Ｎ結合またはＯ結合したグリコシル化、あるいはこれらの両方のグリコシル化の形態を排除することが望まれる。
機能的誘導体
本明細書で提供されるものは、イムノアドヘシンおよびキメラ毒素受容体タンパク質機能的誘導体である。「機能的誘導体」とは、本発明のポリペプチドまたは核酸の「化学的誘導体」、「断片」または「変種」であって、タンパク質機能、例えばタンパク質特異的抗体との反応性、酵素活性または結合活性の少なくとも一部を保持し、本発明において有用性をもたらすものを意味する。当技術分野で知られているように、遺伝子コードの縮重により多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードできる。また、よく知られているように、アミノ酸において保存的変化をつくって、元の機能を保持するタンパク質またはポリペプチドを達成できる。両方の場合とも、すべての置換は本開示により包含されるものとする。
誘導体を、イムノアドヘシンの多量および/または比較的に純粋または単離された量を生成できるような親和性精製タグを含め得るように、通常の方法に従って設計した。イムノアドヘシンの１以上の成分中に組み込み得る多くの異なる種類のタグが存在し、タグの不存在においてイムノアドヘシンの望ましい結合活性を破壊しないのが好ましい。このようなタグは、発明のイムノアドヘシンをコードする核酸配列と融合した発現可能なコード化核酸配列として設計できる。タグをさらに処理して、市販の酵素などで取り除き得る。
さらに、コドンを欠失させるか、または１以上のコドンを縮重コドン以外のコドンで置換して、構造的に改変されたポリペプチド、しかし改変されていない核酸分子により生成されたポリペプチドと同じ有用性または活性を実質的に有するコドンをつくることが可能である。当技術分野で認められているように、核酸分子間の相違が遺伝子コードの縮重に関連がなくとも、２つのポリペプチドは、それらの産生をもたらす２つの核酸分子である場合に、機能的に等価であり得る。
この種の操作および産生後の化学的誘導化を行って、例えば、安定性、溶解性、吸収性、生物学的および治療的効果および/または生物学的半減期を改善できる。このような作用に関与し得る物質は、例えば、Ｒemington's Ｐharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Eaton, PA (1990) に開示されている。本発明の範囲内にある機能的誘導体は、天然のポリペプチドに比して１以上のアミノ酸を欠くか、追加または置換されたアミノ酸を含有する「変種」ポリペプチドである。この変種は、Ｃ末端、Ｎ末端および/または天然配列内の１以上の部位で１以上のアミノ酸についてのコドンを、付加、除去、および／または改変するようにタンパク質ＤＮＡコード配列を適切に改変することにより、天然に生じる複合体成分から得られ得る。理解されるように、付加、置換および/または追加のアミノ酸を有するこのような変種は、上記のように天然タンパク質の１以上の特徴的部分を保持する。
欠失、挿入および/または置換のアミノ酸残基を有するタンパク質の機能的誘導体を、当業者によく知られる標準的技術を用いて調製できる。例えば、機能的誘導体の改変成分を、部位特異的変異導入法（例えば、Adelman et al., 1983, DNA 2: 183)を用いて作成できる。そこでは、ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを改変して、改変コード配列をつくり、ついで上記のような技術を用いて、真核または原核の宿主細胞中で、この組換えＤＮＡを発現させる。あるいは、欠失、挿入および/または置換を有するタンパク質は、当業者には既知の方法を用いて、直接的な化学合成によって従来的に調製され得る。タンパク質の機能的誘導体は、通常、天然のタンパク質と同じ性質の生物学的活性を示す。
さらに、本発明のイムノアドヘシンは、単なるキメラ受容体タンパク質／Ｉｇイムノアドヘシンだけではなく、他の本来の受容体タンパク質ファミリーメンバー、イソタイプおよび/または他の相同なアミノ酸配列（例えば、ヒト、霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、鳥類など）も含み得る。さらに、イムノアドヘシンにおいて使用されるＩｇ型は様々であり、例えば、所定の種内または種外で異なるＩｇファミリー・メンバーの同一性を推定できる。Ｉｇは様々であって、所定の生物で多かれ少なかれ異なる有用性を持つ異なるイムノアドヘシンをつくるのに当業者が行い得る十分知られた配列を示す。例えば、説明として、他のイムノアドヘシンをつくるのに使用できるＩＣＡＭ−１相同性をもつ分子の例示に関する限定的な例は、下記の表中のものを含む。
表３
Figure 2009502205
Figure 2009502205
Figure 2009502205
Figure 2009502205
炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシン
本発明は、免疫グロブリン重鎖を含有する免疫グロブリン複合体と会合した炭疽菌毒素受容体を有するキメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質を包含する。所望により、免疫グロブリン軽鎖は、安定性を改善するために該複合体に含まれる。あるいは、いずれの場合においても、好ましくはそのＮ末端でかかる免疫グロブリン軽鎖の免疫グロブリン軽鎖またはフラグメントと会合した炭疽菌毒素受容体は、安定性を改善するために該複合体に包含される、そして／または炭疽菌毒素との結合を改善するためにさらなる炭疽菌毒素受容体を提供する。
炭疽菌毒素受容体タンパク質は、重鎖、軽鎖または両方と会合され得る。いくつかの実施形態において、J鎖および分泌成分は、キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質と会合されて、イムノアドヘシンを形成する。別の実施形態において、キメラ毒素受容体タンパク質は、植物特異的グリコシル化を有する。
キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質
本明細書に記載したキメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質は、免疫グロブリン重鎖を含有する免疫グロブリン複合体と会合した少なくとも１つの炭疽菌毒素受容体タンパク質を含有する。
炭疽菌毒素受容体
炭疽菌毒素受容体は、キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして作用できるのに十分な親和性を持つ保護抗原を結合するあらゆるポリペプチド(ＰＡ)である。
本明細書に記載したような炭疽菌毒素受容体は、当分野で同定されている２つの内生細胞性炭疽菌毒素受容体の一つであり得る：炭疽菌毒素受容体/腫瘍内皮マーカー８(ＡＴＲ／ＴＥＭ８)(Bradley et al., 2001)および毛細血管形態形成因子２(ＣＭＧ２)(Scobie et al., 2001)。両方の受容体は、タイプ１膜貫通タンパク質として機能し、共通の特徴、例えばシグナル・ペプチド、細胞外ドメインおよびシングルパス膜貫通領域を共有する。いくつかのタンパク質イソ型は、可溶性変異体を包含する選択的スプライシングを介して予測されてきた。
本明細書に記載した炭疽菌毒素受容体は、ＰＡの結合のための機能的エレメントを最小で含有し、所望により１以上のさらなるポリペプチド(例えば、受容体デコイとしての炭疽菌毒素受容体の使用を改善するもの)を包含し得る。ＡＴＲのＰＡへの結合を媒介するドメインは、十分特徴づけられている(32-27)。インテグリン挿入ドメイン(Ｉドメイン)として知られているフォンビルブランド因子タイプＡドメイン(ＶＷＡドメイン)は、この受容体との適切なＰＡ結合に重要であることが判っている金属イオン依存性付着部位(ＭＩＤＡＳ)を含有する[（Scobie HM, Rainey GJ, Bradley KA, Young JA (2003) Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5170-5174. Bradley KA, Mogridge J, Mourez M, Collier RJ, Young JA (2001) Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414: 225-229. を参照されたい]。好ましい実施形態において、炭疽菌毒素受容体タンパク質は、受容体の全細胞外ドメインを包含する。
好ましい実施形態において、炭疽菌毒素受容体は、プロテアーゼ感受性部位を除くために設計された。例えば、炭疽菌毒素受容体がＣＭＧ２タンパク質である場合、好ましくはＶＷＡ／Ｉドメインの部分ではない１４個のアミノ酸を欠失している。この１４個のアミノ酸配列およびその対応するヌクレオチド配列は、下記のものである：
ＴＥＩＬＥＬＱＰＳＳＶＣＶＧ(配列番号１０２)
act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg (配列番号１０３)
ボツリヌス菌キメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシン
本発明は、免疫グロブリン重鎖を含有する免疫グロブリン複合体と会合したボツリヌス菌毒素受容体を有するキメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質を包含する。所望により、免疫グロブリン軽鎖は、安定性を改善するために該複合体中に包含される。あるいは、免疫グロブリン軽鎖またはかかる免疫グロブリン軽鎖のフラグメントと会合したボツリヌス菌毒素受容体は、どちらの場合においても、好ましくはそのＮ末端で、安定性を改善するために該複合体中に包含され、そして／またはボツリヌス菌毒素との結合を改善するために別のボツリヌス菌毒素受容体を提供する。
ボツリヌス菌毒素受容体タンパク質は、重鎖、軽鎖または両方と会合される。いくつかの実施形態において、J鎖および分泌成分は、イムノアドヘシンを形成するためにキメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質と会合される。別の実施形態において、キメラ毒素受容体タンパク質は植物特異的グリコシル化を有する。
キメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質
本明細書に記載したキメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質は、免疫グロブリン重鎖を含有する免疫グロブリン複合体と会合した少なくとも１つのボツリヌス菌毒素受容体タンパク質を含有する。
ボツリヌス菌毒素受容体
ボツリヌス菌毒素受容体は、キメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質が受容体デコイとして作用し得るに十分な親和性および結合力を有するボツリヌス菌毒を結合するあらゆるポリペプチドである。
７つのボツリヌス菌毒素(ＢｏＮＴ／Ａ−Ｇ)が存在する。受容体および推定結合ドメインは、また全てのボツリヌス菌毒素について同定されるべきであるが、当業者は一旦かかる受容体が同定されれば、それらは本明細書に記載したキメラボツリヌス菌毒素受容体を生成するように修飾され得ることが理解される。
既知の受容体および推定結合ドメインは以下の表に提供されている：
表４
Figure 2009502205
Figure 2009502205
上記した推定結合ドメイン境界部のいくつかは、非ヒトタンパク質に対するものである。当業者は、ヒトタンパク質に対する相同な残基を同定するために配列比較技術を簡単に使用できる。
本明細書に記載したボツリヌス菌毒素受容体は、ボツリヌス菌毒の結合のために最小で機能的エレメントを含有し、そして、所望により１以上の追加のポリペプチド(例えば、受容体デコイとしてのボツリヌス菌毒素受容体の使用を改善するもの）を包含し得る。
ボツリヌス菌毒およびその受容体に関連のあるさらなる引用文献は、下記に提供されており、出典明示によりそれらが教示する全ての教示が導入される：
BoNTまたは分岐毒素:
Ahnert-Hilger, G and Bigalke, H (1995). Molecular Aspects of Tetanus and Botulinum Neurotoxin Poisoning. Prog Neurobiol 46: 83-96
Arnon, SS, Schecter, R, Inglesby, TV, Henderson, DA, Bartlett, JG, Ascher, MS, Eitzen, E, Fine, AD, Hauer, J, Layton, M, Lillibridge, S, Osterholm, MT, O’Toole, T, Parker, G, Perl, TM, Russell, PK, Swerdlow, DL and Tonat, K (2001) Botulism toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA 283(8):1059-1070. Also at: http://jama.amaassn.org/cgi/content/full/285/8/1059?maxtoshow=&HITS=10＆hits=10&RESULTFORMAT=＆fulltext=botulism&searchid=1049721556467_1604&stored_search=＆FIRSTINDEX=0&journalcode=jama
Dolly, OJ, Black, J, Williams, RS and Melling, J (1984). Acceptors for botulinum neurotoxin reside on motor nerve terminals and mediate its internalization. Nature 307(2):457-460.
Falnes, Poe and Sanvig, K (2000). Penetration of protein toxin into cells. Curr Opin Cell Biol 12:407-419.
Johnson, EA (1999). Clostridial toxins as therapeutic agents: benefits of nature’s most toxic proteins. Annu Rev Microbiol 53:551-575.
Keller, JE, Cai, F and Neale, EA (2004). Uptake of botulinum neurotoxin into cultured neurons. Biochemistry 43:526-532.
Montecucco, C (1986). How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronal membranes? TIBS 11:314-317.
Montecucco, C, Rossetto, O and Schiavo, G (2004). Presynaptic receptor arrays for clostridial neurotoxins. Trends Microbiol 12(10):442-446.
Schiavo, G, Santucci, A, Dasgupta, BR, Mehta, PP, Jontes, J, Benfenati, F, Wilson, MC and Montecucco, C (1993). Botulinum neurotoxins serotypes A and E cleave SNAP-25 at distinct COOH-terminal peptide bonds. FEBS 335(1):99-103.
Schiavo, G, Matteoli, M and Montecucco, C (2000). Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol Rev 80(2):717-766.
Schiavo, G, Benfenati, F, Poulain, B, Rosetto, O, Polverino de Laureto, P, DasGuptal, B and Montecucco, C (1992). Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature 359:832-835.
Jahn, R (2006). A neuronal receptor for botulinum toxin. Science 312:540-541.
Suedhof, TC (2004). The synaptic vesicle cycle. Annu Rev Neurosci 27:509-547.
ガングリオシド：
Bullens, RWM, O'Hanlon, GM, Wagner, E, Molenaar, PC, Furukawa, K, Furukawa, K, Plomp, JJ and Wilson, H (2002). Complex gangliosides at the neuromuscular junction are membrane receptors for autoantibodies and botulinum neurotoxin but redundant for normal synaptic function. J Neurosci 22(16):6876-6884.
Kitamura, M, Iwamori, M and Nagai, Y (1980). Interaction between Clostridium botulinum neurotoxin and gangliosides. Biochim BioPhys Acta 628:328-335.
Kitamura, M, Takamiya, K, Aizawa, S, Furukawa, K and Furukawa, K (1999). Gangliosides are the binding substances in neural cells for tetanus and botulinum toxins in mice. Biochim Biophys Acta 1441:1-3.
Rummel, A, Mahrhold, S, Bigalke, H and Binz, T (2004). The Hcc-domain of botulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding site displaying serotype specific carbohydrate interaction. Mol Microbiol 51(3):631-643.
Yowler, BC and Schengrund, C-L (2004). Botulinum neurotoxin A changes conformation upon binding to ganglioside GT1b. Biochemistry 43:9725-9731.
Yowler, BC, Kensinger, RD and Schengrund, C-L (2002). Botulinum neurotoxin A activity is dependent upon the presence of specific gangliosides in neuroblastoma cells expressing synaptotagmin I. J Biol Chem 277(36):32815-32819.
ＳＶ２:
Bajjalieh, SM, Frantz, GD, Weimann, JM, McConnell, SK and Scheller, RH (1994). Differential expression of synaptic vesicle protein 2 (SV2) isoforms. J Neurosci 14(9):5223-5235.
Buckley, K and Kelly, RB (1985). Identification of a transmembrane glycoprotein specific for secretory vesicles of neuronal and endocrine cells. J Cell Biol 100:1284-1294.
Crowder, KM, Gunther, JM, Jones, TA, Hale, BD, Zhang, HZ, Peterson, MR, Scheller, RH, Chavkin, C and Bajjalieh, SM (1999). Abnormal neurotransmission in mice lacking synaptic vesicle protein 2A (SV2A). Proc Natl Acad Sci USA 96(26):15268-15273.
Custer, K, Austin, NS, Sullivan, JM and Bajjalieh, SM (2006). Synaptic vesicle protein 2 enhances release probability at quiescent synapses. J Neurosci 26(4):1303-1313.
Janz, R and Suedhof, TC (1999). SV2C is a synaptic vesicle protein with an unusually restricted localization: anatomy of a synaptic vesicle protein family. Neurosci 94(4):1279-1290.
Janz, R, Goda, Y, Geppert, M Missler, M and Suedhof, TC (1999). SV2A and SV2B function as redundant Ca2+ regulators in neurotransmitter release. Neuron 24:1003-1016.
Lynch, BA, Lambeng, N, Nocka, K, Kensel-Hammes, P, Bajjalieh, SM, Matagne, A and Fuks, B (2004). SV2A: more than just a new target for AEDs. Proc Natl Aced Sci 101:9861-9866.
Lynch, BA, Lambeng, N, Nocka, K, Kensel-Hammes, P, Bajjalieh, SM, Matagne, A and Fuks, B (2004). The synaptic vesicles protein SV2A is the binding site for the antiepileptic drug levetiracetam. Proc Natl Acad Sci 101(26):9861-9866.
Dong, M, Yeh, F, Tepp, WH, Dean, C, Johnson, EA, Janz, R and Chapman, ER (2006). SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxin A. Science 312:592-596.
シナプトタグミン：
Dong, M, Richards, DA, Goodnough, MC, Tepp, WH, Johnson, EA and Chapman, ER (2003). Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J Cell Biol 162(7):1293-1303.
Matteoli, M, Takei, K, Perin, MS, Suedhof, TC and De Camilli, P (1992). Exo-endocytotic recycling of synaptic vesicles in developing processes of cultured hippocampal neurons. J Cell Biol 117(4):849-861.
Nishiki, T-i, Tokuyama, Y, Kamata, Y, Nemoto, Y, Yoshida, A, Sato, K, Sekiguchi, M, Takahashi, M and Kozaki, S (1996). The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a. FEBS Lett 378:253-257.
Nishiki, T-i, Kamata, Y, Nemoto, Y, Omori, A, Ito, T, Takahashi, and Kozaki, S (1994). Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes. J Biol Chem 269(14):10498-10503.
Rummel, A, Karnath, T, Henke, T, Bigalke, H and Binz (2004). Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G. J Biol Chem 279(29):30865-30870.
キメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシンを含有するベクター、細胞および植物体
本発明はまた、本発明のキメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンを含有する発現ベクターおよびクローニングベクター、細胞、植物に関する。タンパク質の様々な部分をコードしている遺伝子を単離するための技術は当業者にはよく知られており、発現ベクターおよびクローニングベクター中へ様々な所要の遺伝子を挿入するために使用され得る。例えば、それらのベクターは、植物細胞、植物およびトランスジェニック植物を包含する真核細胞中に導入され得る。
本発明は、下記の工程を含むイムノアドヘシンを会合せしめる方法に関する：生物体へキメラ受容体タンパク質分子、Ｊ鎖をコードするＤＮＡセグメントを導入すること、および同じ生物体へ分泌成分をコードするＤＮＡを導入すること。好ましい分泌成分は、ヒト・ポリ免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ)アミノ酸残基配列の残基１〜約６０６または他種由来の類似のアミノ酸残基の少なくとも１つのセグメントを含有する（Mostov, Ann Dev. Immu. 12: 63-84, 1994)。前記ヒトｐＩｇＲに加えて使用され得る分泌成分配列のなかのものは、ヒトｐＩｇＲのアミノ酸残基配列の残基１〜約６２７の少なくとも一つのセグメントを含有するものである。
本発明は、本発明のキメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンを含有する植物細胞を含む真核細胞に関する。本発明はまた、本発明のキメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンの種々の成分をコードするヌクレオチド配列を含有する植物細胞に関する。当業者は、分泌成分保護タンパク質およびキメラ受容体分子およびＪ鎖をコードするヌクレオチド配列が、一般的には操作可能にプロモーターに結合されており、発現ベクターまたはカセットの部分として存在することを理解するであろう。通常、使用される真核細胞は植物細胞であれば、使用されるプロモーターは植物細胞中で機能可能なプロモーターである。キメラ受容体タンパク質遺伝子、分泌細胞遺伝子およびＪ鎖遺伝子を単離した後、それらを発現ベクター中で転写プロモーターに操作可能に結合する。本発明はまた、発現のための調節配列に操作可能に結合されているキメラ受容体タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターに関する。この発現ベクターは、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の転写および発現されるべきヌクレオチド配列をもたらすプロモーター配列の３'の特定細胞で発現されるようにヌクレオチドを位置つける。発現ベクターは、この転写の効率を改善する種々のエンハンサー配列を含有し得る。さらに、ターミネーターなどの配列、ポリアデニル化（poly Ａ)部位、他の３'末端プロセシングシグナルを含めて、特定の細胞内で転写されるヌクレオチド配列の量を増強し得る。
選択する生物体における成分の発現は、独立的に複製のプラスミドから、染色体の恒常成分から、または該成分をコードする転写物を一時的に生じ得るＤＮＡのあらゆる一部から得られ得る。形質転換に適した生物体は、真核または原核生物のいずれでもあり得る。複合体成分の導入は、生物体へのパーティクルガン（Biolistic）法の送達による直接ＤＮＡ形質転換によってもあり得るし、また他の生物体、例えば組換えAgrobacteriumの植物細胞に対して作用によって媒介され得る。トランスジェニック生物におけるタンパク質の発現は、適当なプロモーター・エレメントとポリアデニル化シグナルの共導入を通常必要とする。本発明の一実施態様において、プロモーター・エレメントは植物のすべての細胞において成分の構成的発現を強力に進め得る。大部分またはすべての細胞で生じる構成的発現は、前駆物質が会合が生じるのに要するであろう同じ細胞の内膜システムを占有できるのを確実にする。
発現ベクター
宿主細胞に和合性の発現ベクター、好ましくは植物細胞に和合性のベクターを用いて、本発明の遺伝子を発現せしめる。植物における遺伝子の発現に有用な典型的な発現ベクターは公知であり、Agrobacterium tumefaciens の腫瘍誘導(Ｔｉ)プラスミドから得られるベクターを包含する（Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153: 253-277, 1987)。しかし、いくつかの他の発現ベクター系が植物で機能するのが知られている。参照、例えば、Verma et al., PCT 公開 WO 87/00551; Cocking and Davey, Science, 236: 1259-1262 (1987)。
上記の発現ベクターはプロモーターを含む発現調節エレメントを含有する。発現されるべき遺伝子は、発現ベクターに操作可能に結合され、所望のポリペプチド・コード遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ結合および合成へと進み得る。遺伝子を発現する際に有用なプロモーターは、誘発プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、構成プロモーター、調節プロモーターである。どのような発現ベクターを選択するか、または最終的にどのようなプロモーターに本発明のイムノアドヘシンの一部をコードするヌクレオチド配列を操作可能に結合せしめるかは、当技術分野でよく知られるように、所望の機能的特性、例えばタンパク質発現の位置および時期、および形質転換される宿主細胞に依存しており、これらは、組換えＤＮＡ分子の構築法に固有の制限である。しかし、本発明の実施に有用な発現ベクターは、複製を少なくとも導き得るものであって、好ましくはまた、操作的に連結しているＤＮＡセグメントに含まれるポリペプチド・コード遺伝子の発現を導き得るものである。
好ましい実施態様において、遺伝子の発現に使用される発現ベクターは植物細胞で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい薬剤耐性選択マーカーは、発現がカナマイシン耐性をもたらすような遺伝子、すなわちノパリン・シンターゼ・プロモーター、Ｔｎ５ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼIIおよびノパリン・シンターゼ３'非翻訳領域（Rogers et al., in Methods For Plant Molecular Biology, A Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988))を含有するキメラ遺伝子である。有用な植物発現ベクターは、Pharmacia, Piscataway, N.J. から市販されている。植物における外来タンパク質の発現のための発現ベクターおよびプロモーターは、米国特許 5,188,642、5,349,124、5,352,605、5,034,322（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
相補的な接着性末端により、ＤＮＡをベクターに操作可能に結合するために、様々な方法が開発されてきた。例えば、相補性ホモポリマー・トラックをＤＮＡセグメントに加えて、ベクターＤＮＡに挿入されるべきである。ベクターとＤＮＡセグメントを相補的なホモポリマー・テイル間の水素結合で結合し、組換えＤＮＡ分子を形成する。あるいは、１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーを用いて、ＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合できる。合成リンカーを平滑末端ＤＮＡセグメントへ連結するには、平滑末端ＤＮＡセグメントを大過剰の合成リンカー分子とともに、平滑末端ＤＮＡの連結反応を触媒し得る酵素、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートする。このように、反応産物は末端に合成リンカー配列を保持するＤＮＡセグメントである。ついで、これらのＤＮＡセグメントを、適当な制限エンドヌクレアーゼで開裂せしめ、合成リンカーに和合性の末端をつくる酵素で開裂された発現ベクター中に連結する。様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、New England BioLabs, Bevery, Mass. を含む多くの会社から市販されている。
本発明の分泌成分、Ｊ鎖、キメラ受容体タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を、同じ植物細胞中に直接的に導入するか、または各成分を植物細胞中に導入し、植物を再生し、種々の成分と交差ハイブリドして、すべての必要な成分を含有する最終の植物細胞をつくる。
キメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンの発現
いずれの方法を用いても、本発明のキメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンの成分をコードするヌクレオチド配列を真核細胞に導入できる。例えば、遺伝子を植物に導入する方法には、Agrobacterium 媒介植物形質転換、プロトプラスト体形質転換、花粉中への遺伝子移動、再生臓器への挿入、未成熟胚への挿入がある。これらの方法の各々は、明白な長所と欠点を有する。すなわち、遺伝子を特定の真核細胞または植物種へ導入するひとつの特定の方法は、必ずしも他の真核細胞または植物種にとって最も効果的というわけではない。
植物体
例えば、遺伝子を植物体に導入するための方法は、Agrobacterium媒介植物形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉中への遺伝子移送、再生臓器中への注入および未熟胚中への移入を包含する。これらの各方法は、明確な利点および欠点持つ。従って、遺伝子を特定の真核性細胞または植物種に導入するある特定の方法は、必ずしも別の真核性細胞または植物種に最も有効であるというわけではない。
遺伝子は、植物またはその子孫のゲノムを永久または安定に変更させずに、目的とするタンパク質を迅速に生成するように設計された一過的方法において、植物細胞中に導入され得る。この一過性発現がどのようにして達成できるかという一実施態様は、遺伝子またはバイナリーベクター中の目的とする遺伝子を含有するAgrobacterium tumefaciensの懸濁液を用いるインタクトな植物の葉における細胞間空隙の浸潤によるものであり、数時間後にタンパク質の抽出のために前記の葉を回収することである。Voinnet O, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D (2003)。トマトブッシースタントウイルスのp１９タンパク質による遺伝子サイレンシグの抑制を基にした植物において増強した一過性発現系。The Plant Journal 33: 949-956。
Agrobacterium tumefaciens 媒介性移送は、遺伝子を植物細胞中に導入するのに広く用いられている系である。これは、ＤＮＡを全植物組織に導入でき、プロトプラスト由来の無傷の植物の再生についての必要性を回避できるからである。Agrobacterium 媒介性発現ベクターを用いてＤＮＡを植物細胞に導入することは、当技術分野でよく知られている。参照、例えば、Fraley et al., Biotechnology, 3: 629 (1985) および Rogers et al., Methods in Enzymology, 153: 253-277 (1987)。さらに、Ｔｉ-ＤＮＡの組込みは、ほとんど再調整を必要としない比較的正確な方法である。移送されるべきＤＮＡの領域は境界配列により規定され、介在ＤＮＡは、通常、Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205: 34 (1986); Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207: 471 (1987)に記載されているように植物ゲノムに挿入される。最新のAgrobacterium 形質転換ベクターは、大腸菌およびAgrobacterium において複製可能であり、Klee et al., in Plant DNA Infectious Agents, T. Hohn and J. Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)に記載のとおり、簡単な操作を可能にする。Agrobacterium媒介遺伝子移送のためのベクターについてさらに最近の技術的進歩は、ベクター中の遺伝子および制限部位の調節を改善し、様々なポリペプチドコード遺伝子を発現し得るベクターの構築を容易にする。Rogers et al., Methods in Enzymology, 153: 253-277 (1987) に記載のベクターは、挿入されたポリペプチド・コード遺伝子の直接的発現のためにプロモーターとポリアデニル化部位にはさまれた便利な多リンカー領域を有し、本目的に適している。
Agrobacterium 媒介形質転換が効果的であるこれらの植物種において、遺伝子移送の容易で明確な性質を理由とする選択の方法である。リーフ・ディスクなどの組織のAgrobacterium 媒介形質転換は、Agrobacterium tumefaciens が天然に感染する植物種に限られているようである。従って、Agrobacterium 媒介形質転換は双子葉植物において最も効果的である。
単子葉類のほとんどは Agrobacterium の天然宿主でないようであるが、トランスジェニック植物は、アスパラガスにおいてAgrobacterium ベクターを用いて作られている[Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 5345 (1987)]。従って、商業的に重要な穀類、コメ、トウモロコシ、コムギは、別の方法を用いて形質転換されるべきであろう。植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈降法、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションおよびこれらの方法の組合せを基にする方法を用いて行い得る。参照、例えば、Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199: 183 (1983); Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature, 319: 791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204: 204 (1986); Callis et al., Genes and Develpment, 1: 1183 (1987); Marcotte et al., Nature, 335: 454 (1988)。
これらの方法の異なる植物種への適用は、プロトプラストから特定の植物種を再生する能力に依存する。プロトプラストから穀類の再生についての説明的な方法は下記の文献に記載されている：Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2: 74 (1985); Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73: 16 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep., 4: 85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology, 4: 1087 (1986)。
プロトプラストからうまく再生されない植物種を形質転換するためには、ＤＮＡを無傷の細胞または組織に導入する別の方法を利用できる。例えば、未熟の胚または外植物体からの穀類の再生は、Vasil, Biotechnology, 6: 397 (1988) に記載のようにできる。さらに、「パーティクルガン」すなわち高速マイクロプロジェクト法を使用できる。このような技術を用いて、ＤＮＡは、細胞壁を介して、毎秒百から数百メートルに加速されている小さい（０.５２５μm）金属粒子と接する細胞質中に運ばれる[(Klein et al., Nature, 327: 70 (1987); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 8502 (1988); McCabe et al., Biotechnology, 6: 923 (1988)]。金属粒子が細胞の数層を貫通し、外植物体の組織内で細胞の形質転換を可能にする。金属粒子を用いて、トウモロコシ細胞をうまく形質転換し、また生殖力のある安定な形質転換されたタバコおよび大豆がつくられている。外植物体組織の形質転換は、プロトプラスト段階を経る必要がないのでトランスジェニック植物の産生を促進する。
ＤＮＡはまた、花粉への直接的ＤＮＡ移入により植物に導入できる（Zhou et al., Methods in Enzymology, 101: 433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6: 165 (1988))。ポリペプチド・コード遺伝子の発現は、植物の生殖器官中へのＤＮＡの注入により行い得る（Pena et al., Nature, 325: 274 (1987))。ＤＮＡはまた未熟胚の細胞中に直接注入でき、乾燥胚の再水和を行う（Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75: 30 (1987); Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp 27-54 (1986)。
単一の植物プロトプラストまたは種々の外植物体からの植物の再生は当技術分野でよく知られている。参照、例えば、Methods For Plant Molecular Biology, A Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988))。この再生および成長プロセスは、形質転換体の細胞および新芽の選択の過程、形質転換体の新芽の植えつけおよび土壌での植物の成長についての工程を含む。
葉の外植物体から Agrobacterium tumefaciens により導入された外来遺伝子を含有する植物の再生は、Horsch et al., Science, 227: 1229-1231 (1985) に記載のようして達成され得る。この方法において、形質転換体は選択剤の存在において、および形質転換された植物種中に新芽の再生を誘発する培地において成長せしめる（Fraley et al., Proc, Natl, Acad. Sci, U.S.A. 80: 4803 (1983)。この方法は、通常、２から４週以内に新芽をつくり、ついで形質転換新芽を、選択剤および細菌成長防止用の抗生物質を含有する適当な根誘発培地に移す。選択剤の存在下で植え付けて小植物体を形成した形質転換新芽を土壌に移植し、根がつくられるようにする。これらの方法は、用いる特定の植物種によって変わり、その変形は当技術分野でよく知られている。
本発明のイムノアドヘシンは、単子葉または双子葉の植物、ナス科、アルファルファ科、豆類、タバコから誘導される植物細胞を含むすべての植物細胞から作り得る。
本発明のトランスジェニック植物は、当業者に既知のあらゆる方法を用いて、形質転換できる性交差可能な植物種から作り得る。有用な植物種は、タバコ、トマト、豆類、アルファルファ、オーク材およびカエデ類を含む双子葉植物；草類、トウモロコシ類、穀類、オートムギ、コムギ、ハダカムギを含む単子葉植物；裸子植物、針葉樹植物、トクサ類、ヒカゲノカズラ類、ゼニゴケ類、マツモ類、コケ類、藻類、配偶体、胞子体、シダ植物を含む下等植物である。
真核細胞
本発明はまた、哺乳動物細胞を含む真核細胞中でのキメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンの発現に関する。当業者は、哺乳動物細胞におけるイムノアドヘシンの発現に利用可能な種々のシステムを理解し、これらのシステムを容易に改変して、これらの細胞中で本発明のイムノアドヘシンおよびキメラタンパク質受容体分子、例えばＩＣＡＭ−１分子を発現し得る。好ましいＩＣＡＭの態様において、本発明のキメラＩＣＡＭ−１、Ｊ鎖、分泌成分分子は、すでに発表されている［Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 8573-8577 (1987)］ベクターｐＣＤＭ８に入れる。ｐＣＤＭ８構築体の使用は決して特別なものでなく、ｃｏｇ細胞発現システムを利用しない、キメラＩＣＡＭ−１やイムノアドヘシンの他の分子とともに使用され得る多くの他の真核発現システムが利用できる。
キメラ毒素受容体およびイムノアドヘシンを含有する組成物
本発明はまた、本発明のキメラ毒素受容体またはイムノアドヘシンを植物のマクロ分子または材料とともに含有する組成物に関する。典型的には、これらの植物のマクロ分子または材料は、本発明で有用なあらゆる植物から誘導する。植物マクロ分子は、本発明のキメラ毒素受容体またはイムノアドヘシンとともに、例えば植物細胞、植物細胞抽出物、植物体中に存在する。組成物において典型的な植物マクロ分子は、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼ、集光性色素タンパク質複合体(ＬＨＣＰ)、二次代謝体またはクロロフィルである。本発明の組成物は、植物材料またはマクロ分子を、水分を除き０.０１％から９９％の重量濃度で有する。他の組成物として、本発明のキメラ毒素受容体またはイムノアドヘシンが水分を除き１％から９９％の重量濃度で存在する組成物である。他の組成物は、水分を除きイムノアドヘシンを５０％から９０％の重量濃度でキメラ毒素受容体またはイムノアドヘシンを含む。
本発明の組成物は、植物マクロ分子を、水分を除き０.１％から５％の濃度で含有し得る。典型的には、組成物中に存在するものは、本発明の植物マクロ分子またはキメラ毒素受容体からなっている。本発明のタンパク質が、より高いまたはより低い濃度で存在していると、組成物中に存在の植物マクロ分子の濃度は逆に変動する。他の実施態様において、植物マクロ分子の組成物は、水分を除き０.１２％から１％の濃度で存在する。
本発明は、下記のすべてまたは部分を含む組成物に関する：キメラタンパク質受容体分子、Ｊ鎖または分泌成分。これらの成分は複合体を形成し、上記したように会合される。通常、組成物は、植物から得られた分子も含有する。この組成物はまた、機能的キメラ毒素受容体またはイムノアドヘシンおよび植物誘導分子を得る抽出プロセスの後に得ることもできる。
抽出法は、複合体含有の植物に力をかける工程を含み、それによって植物のアポプラスト分画が該複合体を放出しながら破壊される。この力はアポプラスト液を放出する主要な方法としてのせん断を含む。全植物または植物抽出物は、キメラ毒素受容体／イムノアドヘシンと植物の種々の他のマクロ分子との混合物を含有する。混合物中に含有されるマクロ分子には、リブロース・ビスホスフェート・カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ)またはＲｕＢｉｓＣｏの断片がある。他のマクロ分子はＬＨＣＰである。他の分子はクロロフィルである。組成物をつくるための有用な他の方法は、種々の溶媒による抽出および植物材料への真空適用を含む。本発明の組成物は植物マクロ分子を、水分を除き０.１％から５％の濃度で含有し得る。
本発明はまた、植物誘導分子および動物誘導分子の相対比を変え得ることにも関する。ＲｕＢｉｓＣｏやクロロフィルなどの具体的な植物タンパク質の量は、水分を除き抽出物重量の、少ないと０.０１％または多いと９９.９％であり得る。
本発明はまた、患者または動物の処置に使用できる治療用組成物に関する。治療用組成物の投与は、植物などのトランスジェニック生物の抽出の前または後であり得る。一旦抽出してから、キメラ毒素受容体／イムノアドヘシンをさらに従来技術、例えばサイズ除外法、イオン交換法、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製もできる。植物分子を複合体とともに同時投与できる。
本発明はまた、特定の治療成分のさらなる精製なしにキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンを含有する治療的植物抽出物の直接的使用に関する。投与は、局所適用、経口摂取、経鼻噴霧、または粘膜標的病原体にキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンを送達するのに適したいかなる他の方法によってもなし得る。
医薬組成物、製剤法および投与経路
本明細書に記載のキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンは、患者に、好ましくは適当な医薬組成物の形態で投与され得る。かかる組成物は、上記のものに加えて、あるいは代わりに成分を含み得る。該組成物は、投与されたときに治療と予防のいずれかまたは両方の特性を好ましくは発揮する。この組成物の調製は、当技術分野での通常の方法にしたがって行うことができ、種々の形態、例えば、溶液、懸濁液、エマルション、摂取の前に液体に入れるのに適した固体の形態がある。ポリペプチドおよびタンパク質の製剤および投与についての技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Eaton, PA, 最新版 に記載がある。これらの方法を用いて、当業者は本発明のイムノアドヘシンを過度の実験なしに使用できる。
投与経路
本発明における適当な投与経路には、例えば、経口、経鼻、吸入、経眼、経咽頭、経気管支、経粘膜、静脈内、筋肉内、腹腔内または経腸投与がある。あるいは、化合物を局所的な手法、例えば、化合物を好ましい作用部位への注射などの適用により投与できる。
製剤法
本発明の医薬組成物は、それ自体既知の方法で製造できる。例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣、摩砕、乳化、封入、包含、凍結乾燥などによる。賦形剤および/または他の補助剤を含む１以上の生理的に許容される担体を用いて、活性化合物を医薬製剤に容易に処理できる。適切な製剤は、選択した特定の投与経路に依存する。
注射のためには、本発明の物質を水溶液に製剤でき、好ましくは、ハンクス液、リンガー液、生理食塩水などの生理的に和合性のある緩衝液に製剤できる。
経粘膜投与のためには、浸透されるべきバリアーに適した浸透剤を製剤に使用する。浸透剤は当技術分野で広く知られている。
経口投与のためには、活性化合物を当業者にはよく知られた薬学的に許容される担体と組み合せて、化合物を容易に製剤できる。このような担体によって、本発明の化合物を、処置されるべき患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤できる。適当な担体は下記の賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、および／またはソルビトールを含む糖類などの増量剤；セルロース製剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)を含む。必要に応じ、崩壊剤を加えることができる。例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどを加えることができる。
糖衣のコアに適当な被覆を施す。この目的のために、濃厚糖液を使用でき、この液は選択的に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー液、適当な有機溶媒または溶媒混合物を含む。染料または色素を、錠剤または糖衣の被覆物に加えて、活性化合物の用量について様々な組合せを同定または特徴分析に役立て得る。
経口で使用される医薬製剤は、ゼラチンからつくられる硬カプセルおよびグリセロールやソルビトールなどの可塑剤およびゼラチンからつくられる軟密封カプセルを含む。硬カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、タルクやステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および所望により安定剤を有する混合物において含有し得る。軟カプセルにおいて、活性化合物を、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体中に溶解または懸濁し得る。さらに安定化剤を添加できる。経口投与用のすべての製剤はその投与に適した含量とする。
口腔投与のために、組成物は、通常の方法で製剤された錠剤または口内錠の形態を取り得る。
吸入による投与のために、本発明で使用される化合物は、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素などの適当な気体を伴って、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾル・スプレーの形態で都合よく送達され得る。加圧エアゾルの場合、用量単位は、決められた量を送達するバルブによって決定され得る。吸入器またはインスフレーターでの使用のためのゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジは、化合物とラクトースやデンプンなどの適当な粉末基剤の粉状混合物を含有するように製剤され得る。
あるいは、活性成分は、無菌のピロジェン不含有の水などの適当な担体で使用前に調製する粉末形態であってもよい。
さらに、化合物をデポ製剤としても製剤できる。このような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与できる。例えば、化合物を、適当な重合性または疎水性材料(例えば、許容される油のエマルジョン）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性塩などの難溶性誘導体として、製剤できる。
さらに、治療物質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスなどの持続放出システムを用いて、化合物を送達できる。種々の持続放出材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に応じて、数週間から１００日を超えてまで化合物を放出する。治療物質の化学的本質および生物学的安定性によって、タンパク質の安定化のために追加の処置を用いることができる。
医薬組成物はまた、適当な固体またはゲル相の担体あるいは賦形剤を含み得る。かかるい担体または賦形剤の例として、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（ポリエチレングリコールなどのポリマーがある。
薬学的に許容し得る塩は多くの酸と共に形成され得る。その酸は、限定でないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸などである。塩は、対応する遊離塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中でさらに溶解し易い傾向がある。溶液において、ｐＨの調整も、所望の性質を最適化するのに日常的に使用される。
有効用量および用量範囲の決定
本発明の使用に適する医薬組成物は、意図する目的、例えば治療的および/または予防的な使用ができる有効量で活性成分を含有する組成物を含む。医薬的に有効な量は、疾患の症状の予防、軽減、改善のために、または処置される対象者の生存を長くするためにに有効な化合物の量を意味する。医薬的に有効な量の決定は、当業者の能力の範囲内にあり、約０.５μg/kg/日と５００g/kg/日との間であり、個々の用量は、典型的にはイムノアドヘシンを１ナノグラムから数グラム含有する。
本発明方法で使用されるいずれの化合物についても、治療的に有効な量は細胞培養アッセイからまず評価される。例えば、用量を変えて、異なる動物または細胞培養物に投与し、効果を比較する。このようにして、望ましい濃度範囲を定め、ついでその量で調製し投与する。最適化は当業者にとって通常のことである。
医薬的効果の検討に加えて、当業者は調剤の標準的手法に従って細胞培養または実験動物での毒性を検討する。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対する有効量）を決定する。毒性量と有効量の用量比率は治療インデクスであり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比で表され得る。高い治療インデクスを示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータをヒトでの使用における用量範囲の決定に用いる。このような化合物の用量は、毒性が無か、ほとんどないようなＥＤ５０を含む濃度範囲にあるのが好ましい。この用量は、用いる投与の形態および経路に依存する範囲内で変わり得る。実際の製剤、投与経路および用量は、患者の状態に応じて個々の医師により選定され得る（参照、例えば、Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", ch. 1 p.1)。
用量および頻度を調節して、医薬効果、例えば治療的および/または予防的効果を維持または提供するのに十分なキメラ毒素受容体またはイムノアドヘシンの循環レベルを提供する。最小有効濃度（ＭＥＣ）は、各製剤について変化するが、イン・ビボまたはイン・ビトロのデータから推定できる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個々の特性および投与経路に依存する。しかし、本明細書に記載のアッセイを用いて、循環濃度を決定でき、次いで量および正確な製剤においてさらに最適化できる。
投薬間隔もＭＥＣ値を用いて決定できる。該時間の１０−９０％、好ましくは３０−９０％、最も好ましくは５０−９０％で、ＭＥＣ以上の循環レベルを保持する処方を用いて、化合物を投与できる。
組成物は、所望により、活性成分を含有する１以上の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提供できる。パックは、例えば金属またはプラスチックの薄片を含むものであり、例えばブリスター(blister)パックである。パックまたはディスペンサー装置には投与のための説明書を添付する。パックまたはディスペンサー装置にはまた、医薬品の製造、使用、販売を規制する政府当局により定められている形態の容器に関連する注意書も添付する。この注意書はヒトおよび動物への投与用のイムノアドヘシンの形態について当局が承認したことを示す。この注意書は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局による承認の表示であり、または承認された製品の挿入物であってもよい。適切な医薬担体中に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製され、適当な容器に入れられ、適応症の処置、例えば宿主生物／患者のタンパク質受容体分子により媒介される疾患の治療または予防について表示される。
感染の治療および予防の方法
本発明の治療的および/または予防的なキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンを必要とする患者は、例えば炭疽菌に対抗するために、医薬的に有効な量の所望のキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンを、好ましくは上記のように定められ、製造され、投与される医薬組成物の部分として、投与され得る。この製剤および送達の様相は非常に多様である。下記の予備的方法を用いて、ヒトおよび動物の両方において、有効量および毒性を推測でき、また治療および予防のパラメーターおよび範囲を決定できる。これらの方法は説明のためだけであって、本発明を限定する意図ではない。さらに、これらの方法は当業者にとって通常のことである。
ヒトにおける感染を低下させるためのキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンの能力：用量増加耐容試験
本発明のキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンについて、感染に対して、例えば静脈または筋肉内投与の効果を決定するために無作為比較試験を用いて試験され得る。他の投与経路も使用できる。効果をモニターするのに使用できる種々のアッセイが存在する。これらの試験により、患者に与えられたキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンが感染をどの程度まで予防または治療し得るかを評価できる。例えば、感染者および感染はしていないが暴露された対象は、キメラ毒素受容体／イムノアドヘシンを投与され、類似の感染対象または暴露されたが処置されていない対象と比較して、病気の進行を評価するために一定期間判断され得る。
本発明のキメラ毒素受容体／イムノアドヘシンは、キメラ毒素受容体／イムノアドヘシンの変動量を有する緩衝液生理食塩水として製剤し、種々の間隔で患者に投与できる。単回漸増用量および複数漸増用量の試験を用いて、免疫接着物の安全性を評価できる。各症例において、１以上の対象者を各用量レベルで評価でき、数名はイムノアドヘシンを摂取し、１以上の者が選択的にプラセボを服用する。いずれの試験でも、複数の用量レベルを評価できる。用量レベルは変動するが、典型的にはナノグラムからグラムの範囲である。
投薬を、秒、分、時間、週、月にわたって行い、毒性および/または医薬的効果を評価さできる。
安全性および毒性の検定を、例えば、刺激または炎症の徴候について鼻粘膜の視覚試験によって行い得る。血液安全性検査も、通常の方法およびＥＬＩＳＡなどの感度のよいアッセイを用いて行い、循環するイムノアドヘシンおよびライノウイルスの量を含む種々の血液成分を調べることができる。鼻洗浄試験を同様に通常の方法に従って行い得る。
通常の統計解析および計算を行い、単一の患者および/または患者−レシピエントの集団について時間経過ともに推定の効力および毒性を調べることができる。
キメラ毒素受容体タンパク質、例えば炭疽菌細菌および炭疽菌芽胞によって標的化した病原体が、制御された臨床試験においてヒト対象に倫理的に投与され得ない場合、ヒトにおいて計画された用量の有効性は、炭疽菌バクテリアまたは芽胞に暴露された霊長類を包含し得る適切な動物種において実験的に決定され得る。有効量は、キメラ毒素受容体タンパク質投与の様々な濃度および経路にて処理済および制御動物の生存により決定され得る。血清、粘膜および／または組織サンプルは、投与されたキメラ毒素受容体タンパク質の薬物動態および薬力学を決定するために対象から採取され、このデータから、動物対象の保護的な最小有効濃度およびキメラ毒素受容体タンパク質の投与経路が決定できる。ヒト患者についての最小有効濃度を評価するために、正常な男性および女性対象は、上記した動物の対象試験において有効であることを決定した同じ投与経路によってキメラ毒素受容体タンパク質を用いて投薬され、そしてこれらのヒト患者から血清、粘膜および／または組織サンプルが採取され得る。ヒト対象に投与されたキメラ毒素受容体タンパク質の濃度は、動物試験およびサンプル中で有効または保護的であることを先に示したものと同じ濃度を得るために調整され得る。
病原体（例えば炭疽菌、ボツリヌス菌毒素、野兎病など）への生命を脅かす暴露に関する処理および／または予防用製品の安全性および効果に関する動物およびヒト治験のためのガイドラインは、米国食品医薬品局によって公布されており、Federal Register: May 31, 2002 (Volume 67, Number 105), Rules and Regulations, Page 37988-37998を包含する様々な出版物において公的に入手できる。この規定は、the Federal Register Online via GPO Access [wais.access.gpo.gov and may be found in the Code of Federal regulations, Food and Drug Administration, 21 CFR Parts 314 and 601.から利用し得る。
下記実施例は、開示した発明の態様および実施態様を説明するものである。これらの実施例は、本願発明の範囲を制限するものではない。
実施例１．ＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンの発現カセットの構築
ＩＣＡＭ−１の全５細胞外ドメインＤ１からＤ５をコードするカセットをＰＣＲクローニングにより調製した。具体的には、ＩＣＡＭ−１の全ての５つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する断片を、プラスミドｐＣＤＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ (Martin et al., 参照）から下記のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅した。
5’-TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3’
（配列番号６）
5’-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCTCGCGG-3’
（配列番号７）
これら２つのプライマーを設計して、ＰＣＲ断片の５'および３'末端にＳｐｅＩ部位を導入した（下線ヌクレオチド）。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼと共に行い（Stratagene)、エラーの蓄積を低下させた。ＰＣＲ断片を、ベクターＰＣＲＳｃｒｉｐｔにクローン化し(Stratagene)、ヒトＩｇＡ２カセットに融合する前に配列決定した[カルボキシ末端でのＳＥＫＤＥＬ（配列番号：４）の有無で]。
ヒトＪ鎖および分泌成分、ならびにヒトＩｇＡ２重鎖の植物内発現のための構築体を作成した。重鎖発現カセットベクターをつくり、ｐＳＳｐＨｕＡ２とした（参照、図１）。これは、マメ・レグミン・シグナル・ペプチド（Baumlein et al., Nucleic Acids Res. 14(6), 2707-2720,1986)をコードする配列を含有する。マメ・レグミン配列は、GenBankアクセス番号Ｘ０３６７７として提供され、マメ・レグミン・シグナル・ペプチドの配列は配列番号：１０（参照、図８）であって、ＳｐｅＩおよびＳａｃＩ部位を間に有するＩｇＡ２ｍ(２)定常領域、およびシグナル・ペプチドとヒトＩｇＡ２ｍ(２)重鎖の定常領域の発現を駆動するためのＳｕｐｅｒＭａｓプロモーターがある。
ヒトＩＣＡＭ−１の最初の５つのドメインをコードする増幅されたＤＮＡとヒト ＩｇＡ２ｍ(２)Ｆｃ領域とを植物発現カセットにおいて融合せしめ、図２Ａに示したキメラ ＩＣＡＭ−１分子発現構築体をつくった。これは、ＩＣＡＭ−１の５つの細胞外ドメインをコードする断片をベクター ｐＳＳｐＨｕＡ２中にクローニングして、ｐＳＳＰＩＣＡＭＨｕＡ２をつくることにより行った。便利な制限部位（５'ＳｐｅＩおよび３'ＳｐｅＩ）によって、増幅された断片をシグナル・ペプチドとＣα１ドメインとの間に挿入することが可能となった。得られた構築体において、キメラＩＣＡＭ−１分子の発現は、構成的プロモーター"ｓｕｐｅｒＭＡＳ" (Ni et al., 1995)および nos３'ターミネーター領域の制御下にある。
得られたキメラＩＣＡＭ−１分子構築体は可変領域を含有しない。ｍＲＮＡの翻訳においてシグナル・ペプチド開裂がＩＣＡＭ−１重鎖融合を植物細胞の小胞体(ＥＲ)に入れると推定する。ＥＲ保持シグナル（ＲＳＥＫＤＥＬ、配列番号５）をコードするＤＮＡを、構築体の発現レベルを強化するために、重鎖の３'末端につけた。アミノ酸配列ＳＥＫＤＥＬ配列番号：４）は、植物細胞中の小胞体におけるタンパク質の保持のための共通シグナル配列である。この配列は、植物における抗体の蓄積レベルを高めることが示されている（Schouten et al., Plant Molecular Biology 30: 781-793, 1996)。キメラＩＣＡＭ−１分子構築体のアミノ酸配列を図２Ｂに示す。構築体のＤＮＡ配列および翻訳フレームを確認してから粒子衝撃に使用した。
最近の報告によると、Ｊ鎖とＩｇＡとの会合はゴルジ体で生じ（Yoo et al., J. Biol. Chem. 274: 33771-33777, 1999)、そして重鎖のＳＥＫＤＥＬを有さない重鎖の構築が同様になされている。ＩＣＡＭ−１断片を、ＳＥＫＤＥＬなしでＩｇＡ２ｍ(２) 定常領域を含有する発現カセット中にクローニングした。
実施例２．植物における会合されたＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンの発現
Ａ．イムノアドヘシン発現ベクター
プラスミドｐＳＳＰＩＣＡＭＨｕＡ２(配列番号：９および図８Ａ）は、長さが６３１３bpである。ヌクレオチド４９-１１６５は、スーパープロモーター(Ni et al., Plant Journal 7: 661-676, 1995)を表す。ヌクレオチド１１６６-３６６２は、ヒトＩＣＡＭ−１/ヒト ＩｇＡ２ｍ(２)定常ハイブリドをコードする配列およびリンカー配列を含む。共通するＫｏｚａｋ配列（Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986)を含めて(nt 1186-1192)、Ｖ. fabaレグミンからの翻訳開始およびシグナル・ペプチドを高める（nt 1189-1257; Baeumlein et al., Nucleic Acids Reg．14(6): 2707-2720 (1986)。ヒトＩｇＡ２ｍ(２) 定常領域の配列 (nt 3663-3633)は、すでに発表されている（Chintalacharuvu et al., J. Imm. 152: 5299-5304, 1994)。小胞体保持シグナルＳＥＫＤＥＬ（配列番号：４）をコードする配列は、重鎖（nt 3634-3654)の末端についている。ヌクレオチド３６６３-３９３３はノパリン・シンターゼの３'末端から得られる（転写終結およびポリアデニル化シグナル；Depicker et al., 1982)。プラスミドの残余部はベクターｐＳＰ７２(Promega)から得られる。
プラスミドｐＳＨｕＪ(図８Ｃ）は長さが４２８３ bp である。ヌクレオチド１４-１１３６はスーパープロモーター(Ni et al., Plant Journal 7: 661-676, 1995)を表し、ヌクレオチド１１３７-１６４８は図８に示し、本来のシグナル・ペプチド（Max and Korsmeyer, J Imm 152: 5299-5304, 1985) を含むヒトＪ鎖をコードする配列をリンカー配列とともに含む。共通Ｋｏｚａｋ配列（Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986)を含めて(nt 1162-1168)、翻訳開始を高める。ヌクレオチド１６４９-１９０２は、ノパリン・シンターゼ３'末端から得られる（転写終結およびポリアデニル化シグナル；Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982)。プラスミドの残余部はベクターｐＳＰ７２(Promega)から得られる。
プラスミドｐＳＨｕＳＣ(図８Ｄ）は長さが５６５０bp である。ヌクレオチド１３-１１３６はスーパープロモーター(Ni et al., Plant Journal 7: 661-676, 1995)から得られ、ヌクレオチド１１３７-２９８１は、元々のシグナル・ペプチドを含むヒト分泌成分（Krajci, et al ., Biochem. and Biophys. Res. Comm 158:783, 1994）をコードする配列をリンカー配列（配列番号：１２）とともに含む。共通Ｋｏｚａｋ配列（Kozak, Cell 44(2): 283-92, 1986)を含めて(nt 1151-1157)、翻訳開始を増強させる。ヌクレオチド２９８２−３２３６はノパリン・シンターゼの３'末端から得られ、転写終結およびポリアデニル化シグナルを提供する[Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982)]。プラスミドの残余部はベクターｐＳＰ７２(Promega)から得られる。
プラスミドｐＢＭＳＰ−１（配列番号：１３および図８Ｅ）は、ｐＧＰＴＶ-ＫＡＮから得られる。左側のＴ-ＤＮＡ境界の近くに位置する選択可能なマーカーをもつ新規植物バイナリーベクターおよび左右境界の外側の配列がBecker et al., in Plant Molecular Biology 20, 1195-1197, (1992)に発表されている。ｐＢＭＳＰ-１のヌクレオチド１８-１８７は右側のＴ−ＤＮＡ境界を表し、ヌクレオチド１８１１-７７５はｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを表す。ヌクレオチド２３９３-２６６３はＮＯＳプロモーター（Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6): 561-73, 1982）を表し、ヌクレオチド２６９８-３４９２は ＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）をコードし、ヌクレオチド３５１１-３７３３は、Ａ. tumefaciens 遺伝子７（Gielen et al., Embo J 3: 835-46, 1984)からのポリアデニル化シグナルである。ヌクレオチド１７６８-９７６はＮＰＴＩＩ遺伝子をコードし、ヌクレオチド４３１７-４４６４は左側のＴ-ＤＮＡ境界を表す。
プラスミドｐＢＭＳＰ-1ｓｐＪＳＣ（配列番号：１４および図８Ｆ）はｐＢＭＳＰから得られ、スーパープロモーターの制御下にＪおよびＳＣの両方を含有する。このプラスミドにおいて、ヌクレオチド１-１４９は、左側のＴ-ＤＮＡ境界を表す。ヌクレオチド９５５-７３３は、Ａ. tumefaciens 遺伝子からのポリアデニル化シグナルであり、ヌクレオチド１７６８-９７６はＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）をコードし、ヌクレオチド２０７３-１８０３はＮＯＳプロモーターを表す。ヌクレオチド２６３５-３７６８はｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを表し、ヌクレオチド３７７４-５５９５はヒト分泌成分をコードし、ヌクレオチド５６０３-５８５７はＮＯＳポリアデニル化シグナルを表す。ヌクレオチド５８８０-６９９１は ｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを表し、ヌクレオチド７００７-７４９０はヒトＪ鎖をコードし、ヌクレオチド７５０４-７７５７はＮＯＳポリアデニル化シグナルを表す。ヌクレオチド７８８６-８０５７は右側のＴ-ＤＮＡ境界を表す。
プラスミドｐＧＰＴＶ-ＨＰＴは、ヒグロマイシン耐性を付与する酵素をコードしており、Max-Planck-Institut fuer Zuechtungsforchung (ドイツ）から購入できる。これは Becker: Plant Molecular Biology 20, 1195-1197 (1992) に記載されている。
Ｂ．植物形質転換および植物でのイムノアドヘシンの発現
上記の発現カセットを用いて、植物において会合されたイムノアドヘシンをつくった。プラスミドｐＳＳＰＩＣＡＭＨｕＡ２、ｐＳＨｕＪ、ｐＳＨｕＳＣおよびｐＢＭＳＰ-１をタバコ葉の組織（N. tabacum cultivar Xanthi) 中に共衝撃し、形質転換されたミクロカルス(microcalli)をカナマイシンの存在下に栄養寒天上で選択した。個々のミクロカルスは、独立の形質転換事象の指標であり、親組織から切開し、カナマイシンとともに栄養寒天上で繁殖せしめた。
カルス組織を形質転換発現のためにスクリーニングした。カルス＃７１３２がキメラＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンおよびＪ鎖を発現したのを免疫ブロッティングおよびＰＣＲにより示す（データは表示せず）。このカルスは、ＳＣをコードするＤＮＡを有さなかった。カルスは培養でよく成長した。十分な量の蓄積時に＃７１３２を、今回は上記プラスミドの２つ、Ｊ鎖とＳＣの両者についての発現カセットを含有するＰＢＭＳＰ-１ ＳｐＪＳＣ、およびヒグロマイシン耐性を付与するｈｐｔＩ遺伝子についての発現カセットを含有する ｐＧＰＴＶ-ＨＰＴを用いて、再び衝撃した。栄養寒天上での選択および成長の後に、いくつかの独立の形質転換体を免疫ブロッティングで同定した、これはキメラＩＣＡＭ−１分子、Ｊ鎖およびＳＣをいくつかの会合状態で発現した。
図３は、独立的に形質転換されたタバコのカルスにおけるキメラＩＣＡＭ−１分子の発現を示す。図３Ａは非還元ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルの免疫ブロットを示し、ゲル上で異なる形質転換体タバコ・カルス（Ｃ）を含むサンプルおよび水性抽出物（Ａｑ）を泳動させ、ヒトＩＣＡＭの存在を調べた。イムノアドヘシンの可溶性からして、抽出を容易に行うことができ、シグナルの類似性から発現の再現性を確認できた。図３Ｂは、カルスＲｈｉ１０７-１１由来の部分的精製のイムノアドヘシンの種々のフラクションを含有する非還元ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルの免疫ブロットを示す。ブロットを、ヒトＩＣＡＭ−１ (〜ＩＣＡＭ)、ヒト ＩｇＡ 重鎖(〜α)、ヒト分泌成分(〜ＳＣ)、ヒトＪ鎖(〜Ｊ）に対する抗体を用いて調べた。次に、酵素コンジュゲート抗体を、必要であれば免疫陽性バンドをアルカリホスファターゼにて標識した。免疫ブロッティングの特異性を、非発現カルスの抽出物で免疫陽性バンドを検出しないことによりさらに評価した(データは示さず)。グリコシル化がない二量体キメラＩＣＡＭ−１分子の予測したＭＷは１７３,３１８である；この形態は、ＩＣＡＭ−１および重鎖について免疫陽性であるので、２５０ｋＤマーカーの直下に移動するバンド中に存在するようである。このバンドはＳＣ（全予測ＭＷ〜２４８ｋＤ）についても免疫陽性であるが、Ｊ鎖については陽性でない。これはＳＩｇＡ会合の正統の経路からすると幾分予想外である。ＳＩｇＡ会合は２つの細胞型(哺乳動物において）を含み、ＳＣの会合の前にＪ鎖の存在を必要とする。四量体イムノアドヘシンは、Ｊ鎖の単一分子およびＳＣの単一分子を含有し、グリコシル化の前に予測ＭＷ〜４４０ｋＤを有する。２００ｋＤを十分越える分子量のいくつかの種は、全ての４つのプローブを有する免疫陽性であり、容易に識別できる。
ＤＮＡ被覆ミクロ注入による衝撃を用いて、植物と動物の両方で安定な形質転換体をつくる（総説、Sanford et al., Meth. Enz. 217: 483-509, 1993)。本発明のイムノアドヘシンをコードするベクターでの粒子媒介形質転換を、ＰＤＳ-１０００／Ｈｅ粒子増速装置（Bio-RaD 社製）を用いて行った。ＰＤＳ-１０００／Ｈｅ粒子増速装置はヘリウム圧を使用して、標的細胞に対するＤＮＡ被覆ミクロ粒子を加速する。この技術の物理特性は、物理的性質からして用途が広く、使用が容易である。タバコを分泌ＩｇＡの全４成分で同時に形質転換させた。
基本的な生物的方法を下記のように実施した：ミクロ注入物のストック懸濁液を、粒子６０mgの絶対エタノール液１ｍｌを混合して調製した。該懸濁液をかき混ぜ、２５-５０μlを取りだし、無菌の微小遠心管に入れた。３０秒間微小遠心分離した後にエタノールを除去し、ペレットを１ｍｌの無菌水に再懸濁し、５分間遠心分離した。次いで水分を除き、プラスミドＤＮＡの混合物を含有するＤＮＡ液２５-５０μl 中にペレットを再懸濁した。しかし、常に等モル量ではない。加えられたプラスミドの量は各製剤につき０.５ｎｇから１μｇの範囲で変化した。下記のものを順次加えた：無菌水２２０μl、２.５ＭＣａＣｌ2 ２５０μl、０.１Ｍスペルミジン５０μl。この混合物を少なくとも１０分間かき混ぜ、次いで５分間遠心分離した。上澄み液を除き、絶対エタノール６００μl中に沈澱したＤＮＡ/ミクロ注入物を混合し、１分間遠心分離した。エタノールを除去し、ペレットをエタノール３６μl に再懸濁した。懸濁液１０μl を、Ｋapton (DuPont) からつくられたミクロキャリアーシートの中心にできるだけ均一に置き、エタノールを蒸発させた。ミクロキャリアーシートおよび破裂ディスクをこのユニットに置いた。表面無菌タバコを含有するペトリ皿を停止スクリーンの下に置いた。チャンバを、２８-２９mm Ｈｇに減圧し、標的に衝撃を１度加えた。タバコおよび他の植物についてのプロトコールを最適化するために、Ｈｅ圧、被覆粒子、ミクロキャリアーと停止スクリーンとの距離、停止スクリーンから組織への飛行距離を変えた。
キメラＩＣＡＭ−１分子の発現カセットを、Agrobacterium媒介形質転換に使用のためにバイナリーベクターに会合せしめた。ヒトＪ鎖およびヒト分泌成分の両方の発現およびカナマイシン耐性のために設計されたAgrobacterium バイナリーベクターを、Ａ. tumefaciens 株 ＬＢＡ４４０４中に導入した。他のバイナリーベクター中のキメラＩＣＡＭ/ＩｇＡ分子も使用して、ＬＢＡ４４０４を形質転換した。両株の一夜培養物を、標準的プロトコール（Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985) にしたがって、タバコ葉の同時「共培養」のために使用した。
衝撃およびAgrobacterium 両方の形質転換タバコ葉ディスクの再製についての標準的プロトコールを使用した（Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985)。衝撃された組織から再生された形質転換植物は成熟時に遺伝子サイレンシングをしばしば受けるので、トランスジェニックタバコ植物を、高収率の発現成熟植物をもたらすAgrobacterium 媒介形質転換により作った。
実施例３：会合されたＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンの精製
実施例２にしたがって発現したイムノアドヘシンを精製した。カルスを大量に成長せしめ、抽出法の進行を容易にした。部分精製法により、イムノアドヘシンのさらなる精製のための続くクロマトグラフィー技術の調査のために、種々の緩衝条件で利用できる安定な濃縮物を提供した（参照、図３）。カルスを、クエン酸ナトリウム（０.６Ｍ, ｐＨ７.４)および尿素（最終濃度２Ｍ)を含有する緩衝液中に浸すとともに、２つのステンレス鋼ギア間で組織を粉砕する搾り器で抽出した。木綿布（チーズクロス）で粗くろ過した後、該液（〜１mg/g 生重量）を０.６７容量の飽和硫酸アンモニウムにより沈降せしめた。緑色ペレットを遠心分離後に集め、Ｄounce ホモゲナイザーで少量の５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６.６)に完全に抽出した。追加の遠心分離後に、澄んだ褐色の上澄み液を集め、脱塩モードの緩衝交換時に、Ｓephadex Ｇ-１００カラムを通すことにより部分的に精製した。脱塩/緩衝液交換工程により、所望の緩衝液中に部分精製した濃縮物（〜０.２ ml/g 生重量カルス）を調製できた；Ｇ-１００カラムを０.２５ Ｘ リン酸生理食塩緩衝液で溶出した。この溶出物は２-８℃で少なくとも１０日間安定であった。
実施例４：ヒト・ライノウイルス感染を阻止するイムノアドヘシン
ヒト・ライノウイルスによる細胞の感染が、実施例３で調製したイムノアドヘシンにより阻止されることを示した。実施例３により調製されたカルス抽出物は、可溶性ＩＣＡＭ−１への抗ＩＣＡＭ モノクローナル抗体の結合についてうまく競合した。図４は、酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ)によるデータを示す。このアッセイのために、９６ウェル・プレートを０.２５μｇ可溶性ＩＣＡＭ−１/mlで被覆した。マウス（抗ヒトＩＣＡＭ）抗体の一定量に対して接着したＩＣＡＭと競合するために使用した、四角はsＩＣＡＭの増加濃度を表し、丸はカルス抽出物（Ｇ-１０Ｑからの無菌ろ過画分）の増加量を表す。ウェルを洗浄後、接着マウス抗体をホースラディシュ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウス抗体で検出した。接着酵素活性を４９０nm で基質としてオルト-フェニレンジアミンで測定した。データ（四角：sＩＣＡＭ; 丸：抽出物）は、このＳ字型、ＯＤ４９０=ｙ=ｙ０+ａ/[１＋ｅ-{(ｘ-ｘｏ)/ｂ}]で十分に記載されている。式中、ａ=ｙ max、ｙ０=ｙ分間、ｂ=曲線の急速に変化する部分の傾斜、ｘ０=５０％応答レベルでのｘ値である。可溶性ＩＣＡＭ−１に比して、ここで試験したイムノアドヘシン抽出物は等量の〜２５０μg ＩＣＡＭ/mlを含有する；これは、ＩＣＡＭ−１ 重鎖融合物の二量体および四量体会合物の予測された親和結合効果による過大評価である。このように、ＥＬＩＳＡによると、イムノアドヘシンは抗ＩＣＡＭ ｍＡｂへの結合について可溶性ＩＣＡＭ−１と競合することがわかる。
競合ＥＬＩＳＡによって、５０％応答を得るのに必要な種々のフラクションの正常量と比較して、活性回復についての定量検定ができる。精製において、イムノアドヘシン調製物の力価は、５０％応答を得るのに１ミリグラムのイムノアドヘシンを稀釈しなければならないミリリットル数、すなわち逆数稀釈として表現できる。このＥＬＩＳＡはイムノアドヘシンによって精製プロセスの進行を容易にする。
細胞変性効果アッセイ（ＣＰＥ)は、部分精製されたイムノアドヘシンがヒト・ライノウイルスによるヒト細胞の感染を阻止する特異的能力を明らかにした（図５)。ライノウイルス血清型ＨＲＶ−３９を、ヒトＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ/ＩｇＡ融合物（Tim Springer 博士より受領）、または本発明のＩＣＡＭ−１/ＳＩｇＡイムノアドヘシンまたは他の異なる抗体を発現するいずれかのカルスからの抽出物と共に３３℃で予めインキュベートし、ついでＨｅＬａＳ３細胞と共に各混合物を播種した。３日後に、生存細胞を固定し、クリスタル・バイオレットのメタノール溶液で染色した。５７０nmでの光学密度が細胞生存性についての比較測定値を提供する。
Ｒｈｉ１０７-１１から得た２つの抽出物は、イムノアドヘシンを含有し、ＨｅＬａＳ３細胞に感染しそれを殺すウイルスの能力を明らかに阻止した（図５Ａ、三角形および逆三角形）。抽出物が部分的にのみ精製されているので、化学療法剤、ドキソルビシンに対するヒトＩｇＡ２ｍ(２)を含有した類似の調製した抽出物もアッセイした。この抽出物は、非関連結合特異性を有する類似のイムノアドヘシンを含有しており、ライノウイルスの感染性を阻止できず、そしてＩＣＡＭ−１重鎖融合物の発現が阻止に対する特異性を付与することを示す。ＣＰＥアッセイにより、予測されるように、可溶性ＩＣＡＭ−１およびＩＣ１-５/ＩｇＡ (Martin et al., 1993) がウイルス感染性を阻止する差別的能力が示された（図５Ｂ)。図５Ｂ中の挿入図は、可溶性ＩＣＡＭ−１(１.３５μg/ml)およびＩＣＩ-５/
ＩｇＡ(０.１２μg/ml; １１.３倍以下)のＩＣ50 範囲の拡大図である。
実施例５：臨床試験および毒性試験のためのイムノアドヘシンの調製および精製
提案された臨床的および毒物学的必要性を満たすイムノアドヘシンの産生を、トランスジェニックタバコ植物をつくって行う。イムノアドヘシン（ＥＲ保持シグナルなし）を発現するトランスジェニックタバコを、Agrobacterium 媒介した形質転換により作成した。ＥＲ保持シグナルの不存在は、会合を高めると予測される。ＳＩｇＡは、ＳＣがｄＩｇＡに、パルス追跡試験により示唆されるように共有結合している特にトランス-ゴルジ器官を包含する本来の全ゴルジ体を介して処理される（Chintala Charuvu & Morrison, Immunotechnology 4: 165-174, 1999)。Agrobacterium 媒介形質転換がトランスジーン発現の一定レベルをもつ植物をつくるようなので、これらの植物の子孫を、臨床用のイムノアドヘシンの生産に使用されるであろう。
発現レベルを最大にし、真の繁殖系を構築するために、同型接合の植物をつくるのが望ましい。最も高い産生植物（世代Ｔ０)は種子採取前に温室で自己繁殖し得る。１／４のＴ１植物が同型接合であると考えられる。これらを温室で生育し、いくつかの植物からの種子サンプルをカナマイシン含有培地に別個に発芽させる。同型接合陽性植物からのすべての子孫（Ｔ２)が緑色であると推定される。異型接合植物のいくつかの子孫は白色または淡黄色と推定される。同型接合は、子孫の野生型と戻し交配することおよび子孫の抽出物を免疫ブロッティングすることにより確認される。
収穫と処理を生産過程中に継続的にかみあわことができ、特に一回の植付けから複数の収穫物を得ることができるので、１収穫について土レベルに減らした植物を次ぎの収穫のために再び生育させる。イムノアドヘシンの生産規模を考慮する場合、最終のイムノアドヘシンの必要量を決定し、発現レベル（存在するイムノアドヘシン mg/タバコ新鮮重量 kg)を計上し、植物の成長速度、平均的植物の推定重量、精製計画の全収率（２０％で設定）を知る必要がある。最終イムノアドヘシン３gを必要とすると、最終のイムノアドヘシン１gの推定収量を各々が有する４回の収穫を要する。
これらの標的およびパラメーターが与えられると、必要な植物の数および今後の植物生育のための空間的要件を決める。図６は、最終のイムノアドヘシン１グラムをつくるのに必要産物の検討である。このグラフにおいて、イムノアドヘシン１gに要する植物数を、２０％の収率での、発現の推定レベルおよび植物重量にて示す。イムノアドヘシンの発現の様々なレベル（mg/kg 新鮮重量）および全体の回収量（２０％で設定）にて、各植物の重量および植物数を、合理的な可能性の範囲内で（破線の四角形）具体的な生産標的（１g/収穫）について決定し得る。必要な植物数は、逆に、具体的な成長の数および再成長の期間とともに減少する。期待したバイオマス生産、時間の関数、成長条件は、収穫までの時間および収穫間の時間に影響を与える。これらの成長期間を、植え付けおよび収穫の時期を変えることにより精製計画の実際に調節できる。例えば、イムノアドヘシン１００mg/kg 新鮮重量の妥当な発現レベルを有する植物からの最終イムノアドヘシン１ｇは、２００g/植物（発芽後８０〜）の重量で収穫する場合に、２５０の植物を必要とする。この規模で、これらの植物は約１０m2の成長空間を必要とし、１５０日以上に２回収穫される。
ある時点でのバイオマス５０+ｋｇの処理は、すべて食品加工産業において対応物を有するいくつかの適度に大規模な操作を必要とする。これには、バルク材の処理、サイズ減少、ジュース化、ろ過がある。Vincent PressおよびDurcoろ過系を用いて、この量を効率よく処理できる。ジュース化工程には、認められ、かつ簡単なクエン酸ナトリウムと尿素の緩衝液を用いる。これらの成分は抽出物を緩衝し、フェノール性の酸化およびタンパク質との会合を防止するのを助け（Gegenheimer, Methods in Enzymology 182: 174-193, 1990; Loomis, Methods in Enzymology, 31, 528-544, 1974; Van Sumere et al., The Chemistry and Biochemistry of Plant Proteins, 1975)、次ぎの酸沈降におけるイムノアドヘシンの安定性を確実にする。
酸不溶性脂質およびタンパク質（全体の〜９０％)のろ過を、タンゼンシャル・フロー超ろ過に供し、イムノアドヘシンを濃縮し、少量のタンパク質、特にフェノール性物を除去する。膜分離精製法は、小分子の除去を高め、短期間保存およびその後のクロマトグラフィーのための調製の際に緩衝液を交換する。ＳＰセファロース（ｐＨ５.０以下で結合）またはＱセファロース（ｐＨ５.５以上で結合）のいずれかは、イムノアドヘシンのろ過に使用できるイオン交換の一つである。これらは、容易に入手でき、拡大縮小可能で、安定で、高性能である。特に、これらはろ過前の工程のストリンジェンシーを下げる流動層形式（expanded-bed formats）に利用できる。アニオン交換クロマトグラフィーよりも選択性が高いカチオン交換クロマトグラフィーを、最初に使用する。イムノアドヘシンを数種の潜在的に存在するタンパク質から、少なくとも９５％のタンパク質がＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ、ＩＣＡＭ−１/dＩｇＡまたはＩＣＡＭ−１/ＳＩｇＡの形態で存在するまで精製する、これは２価および４価のＩＣＡＭ−１ドメイン存在が強力な抗ウイルス活性に重要であるためである。次いで精製されたイムノアドヘシンを、エンドトキシン、ニコチンなどのアルカロイドの許容レベルおよび生物負荷について試験した。さらに、効力レベル（ＥＬＩＳＡおよびＣＰＥアッセイにより規定した）、タンパク質濃度、ｐＨおよび外観をモニターする。ついで、イムノアドヘシンの臨床ロットの安定性を決定し、患者が完全に強いイムノアドヘシンを摂取できるようにする。部分精製した抽出物でも凍結すると１０日間安定であることがわかっている。臨床用に製剤したイムノアドヘシン（リン酸緩衝生理食塩水中）の力価および効力も、−２０℃、２〜８℃および３７℃で３〜６月間保存して試験する。
実施例６：植物特異的グリコシル化を有するイムノアドヘシン
つくられたイムノアドヘシンを分析して、存在するグリコシル化のパターンを決定する。Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4): 365-372 (1999)は、植物発現の抗体構築体に対して植物の典型的ないくつかのグリコシル化部分の存在を明らかにしている。この方法を用いて、実施例１、２、３に従って作製されたイムノアドヘシンが植物特異的グリコシル化パターンを有することを示す。その多様性はイムノアドヘシンについての多様な起源によるのであろう。粗抽出物がイン・ビトロで抗ウイルス活性を有することを示しているため（データ表示せず）、グリコシル化自体は効力に影響を及ぼさない。Ｎ結合グリコシル化（図２はキメラＩＣＡＭ−１分子単独で１５の可能性部位が存在することを示す）は、おそらく免疫ブロットで見られる多様なバンドに関与する。イムノアドヘシン製剤は、ブロッティングの前にＮグリコシダーゼＡで消化されて、バンドパターンの相違により極少数の個別のバンドに分けられることを示す。この場合、糖型は還元または非還元ポリアクリルアミド・ゲルで主に特徴解明できる。さらに、消化および模擬消化フラクションは、ＣＰＥアッセイおよび競合ＥＬＩＳＡで試験すると、イン・ビトロで効力および力価に対するＮ-グリコシル化の作用を示す。
実施例７：ヒト・ライノウイルスを不活化するイムノアドヘシン
実施例１、２、３でつくった免疫接着物を、その能力、ウイルスとの結合によるＨＲＶの不活化、ウイルス侵入の阻止、空のウイルス・カプシドの形成誘導について調べる。イムノアドヘシンのＨＲＶとの結合を測定するために、イムノアドヘシンを［3Ｈ］ロイシン標識 ＨＲＶ−３９ともに３０分間インキュベートし、次いでＨｅＬａ細胞に加えて１時間インキュベートした。洗浄後、細胞と結合したウイルスをＴriton Ｘ-１００で分離し、［3Ｈ］をシンチレーション・カウンターで測定する。
イムノアドヘシンとのインキュベーションによるＨＲＶ−３９の不活性化を、ｓＩＣＡＭ−１によるＨＲＶ不活性化と比較する。ＨＲＶ−３９は単量体sＩＣＡＭ−１によるインキュベーションにより有意の程度（＜０.５ log10 感染能の低下）に直接的に不活性化されないが、ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ とのインキュベーションは感染能を約１.０ log10 低下させる（Arruda et al., Antimicrob. Agents chemother 36: 1186-1191, 1992; Crump et al., Antimicrob. Agents chemother 38: 1425-7, 1994)。ＨＲＶ−３９を不活性化するイムノアドヘシンの能力を試験するために、１０６ ５０％組織培養感染用量(ＴＣＩＤ50)のＨＲＶ−３９を、このウイルスに対する各分子のＩＣ50の１０倍に等しい濃度のsＩＣＡＭ−１またはイムノアドヘシンを含有する培地で、またはなにも含まない培地で、１時間３３℃でロッカー・プラットホーム上でインキュベートする。各ウイルスイムノアドヘシンまたはウイルス-培地の混合物を連続的に１０倍稀釈法で稀釈し、９６ウェル・プレートのＨｅＬａ細胞に対する力価を測定する。
宿主細胞とのＨＲＶ接着に対するイムノアドヘシンの作用を、ＨｅＬａ細胞をＨＲＶ−３９とともに０.３のＭＯＩでイムノアドヘシンの存在または不存在でインキュベートして試験した。吸光度が１時間４℃で進行し、細胞を洗い、培地をイムノアドヘシンプラスまたはマイナスとして置き換えた。細胞を１０時間３３℃でインキュベートし(１回の複製が可能)、ウイルスを細胞の凍結／解凍により採取する。ウイルスのＨｅＬａ細胞に対する力価を調べる。
ＩＣＡＭ-ＩｇＡ (ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)は、ＨＲＶでの立体配座の変化を誘導することでＳｉｃａｍ−１よりもより効果的であり、空の非感染性ウイルス粒子の形成をもたらす(Martin et al., J. Virol. 67: 3561-8, 1993)。ＨＲＶでの立体配座の変化を誘導し、ウイルスＲＮＡの放出をおこす、実施例１、２、３に従って作られたイムノアドヘシンの能力を調べるために、精製イムノアドヘシンを、［3Ｈ］ロイシン標識 ＨＲＶ−３９とともに３０分間インキュベートし、ついでウイルスを５から３０％のスクロース勾配に重層した。９０分間４０,０００ rpm で遠心分離した後、フラクションを集め、［3Ｈ］を測定し、フラクションを感染能について評価した(スクロース勾配に対する１４９Ｓでの無傷 ＨＲＶセグメント、一方７５ＳでＲＮＡセグメントを欠く空のカプシド(Martin et al., J. Virol. 67: 3561-8, 1993))。この原子価の増加により、ＩＣＡＭ/ＳＩｇＡイムノアドヘシンがＩＣＡＭ-ＩｇＡよりも、空の非感染性粒子を誘導するのにより効力があると考えられる。
メジャーおよびマイナー(受容体としてＩＣＡＭ−１を使用しない）両方のＨＲＶ血清型のパネルに対する精製イムノアドヘシンの阻止作用を、ＣＰＥアッセイを用いて試験した。ＨＲＶ感染を阻害するＩＣＡＭ−１の能力は、ウイルス単離体によって変わる。文献(Crump et al., Antimicrob. Agents chemother 38: 1425-7, 1994)によると、sＩＣＡＭ−１についてのＥＣ50は、ＨｅＬａ細胞を用いるＨＲＶメジャー受容体血清型アッセイのパネルで試験した場合、０.６μg/mlから＞３２μg/mlの範囲にあることが示される。われわれのパネルは、９つのメジャー血清型(ＨＲＶ−３、-１３、-１４、-１６、-２３、-３９、-６８、-７３、-８０)およびマイナー受容体血清型ＨＲＶ−１Ａを含む。
実施例８：ヒトにおける感染能を低下させるＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンの能力を示す臨床試験：用量増加耐容試験
本発明のイムノアドヘシンについて２つの無作為比較試験を行い、実験的ライノウイルス風邪における感染、ＩＬ-８応答、病態に対するイムノアドヘシンの経鼻投与の作用を調べる。この２つの試験では、ライノウイルス接種の前と後で対象者が摂取したイムノアドヘシンを評価する。ここで使用する臨床プロトコールは、ライノウイルス感染に対する効果について組換え可溶性ＩＣＡＭ−１分子を評価したときに以前に用いたプロトコール(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)を基としている。
Ａ．対象者
ヴァージニア大学、Chalottesville、の関係者から対象者を募集する。対象者は健康で、非喫煙者で、年齢１８から６０歳である。アレルギー疾患または非アレルギー鼻炎の病歴、異常な鼻腔形態または粘膜、最近２週間以内の呼吸器感染のある者は除外する。妊娠中および授乳中の女性および医学的に認められていない受胎コントロール中の女性も除外する。試験的ウイルス攻撃試験において(Ｉ/ＩＩ相、下記参照)、対象者は、ウイルスに対する血清中和抗体力価が１：４以下でもわかるように試験ウイルスに感受性を有することを要し、試験開始の９０日以内に測定した。
Ｂ．試験薬物
本発明のイムノアドヘシンを、２.６mg/ml 含有のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）噴霧液として製剤する。プラセボはＰＢＳからなり、外観は活性製剤と同じである。溶液の投与には、計量鼻噴霧ポンプを装着した薬物ビンを用いる。このポンプはイムノアドヘシン１８３μｇを含有する溶液７０μｌを各噴霧毎に送り出す。薬物は鼻腔ごと２回噴霧、１日６回(３時間間隔)で投与し、合計１日量は４.４mgである。これは、mgタンパク質／日において、tremacamra 試験感染での可溶性ＩＣＡＭ−１(Turner et al., JAMA 281: 1797-804,1999)について使用された用量と同じである。イムノアドヘシンのモル数は、sＩＣＡＭ−１のモル数の約２倍量である。しかし、sＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ/ＩｇＡ融合物の間のイン・ビトロ活性の相違からして、イムノアドヘシンは sＩＣＡＭ−１よりモルベースで何倍も有効である。このように、この量はなにが必要であるかについての控え目の計算である。用量増加試験でこの量に問題が起きたとき以外は、この量を用いる。
Ｃ．試験の設計
単一の増加量および複数の増加量で試験を使用して、イムノアドヘシンの安全性を評価する。各症例において、３人の対象者に対して各用量レベルで評価し、２人はイムノアドヘシンを、１人がプラセボを摂取する。単一増加量試験において、４つの用量レベルを評価した。最低量は攻撃試験での使用予定量の半分であり、最大量は攻撃試験での使用予定量の２倍である。用量レベルは次ぎのとおりである：各鼻腔１噴霧(計３６６μg)、各鼻腔２噴霧(計７３２μg)、各鼻腔３噴霧(計１０９８μg)、各鼻腔４回の噴霧(計１４６４μg)。
同じ用量レベルを複数回の増加量試験で用いる。対象者は３時間ごと(１日６回)、５日間摂取する。両試験において、対象者を各用量レベルで調べ、各次ぎのレベルの開始への移行は前のレベルで急性毒性のないことが明らかになってからとする。すべての対象者は最初の投与後に単一用量２１日に戻り、６週で追跡する(イムノアドヘシンに対する血清抗体の測定のため)。
１２人の患者の別個の群に各鼻腔に２回噴霧を１回投与し（計７３２μｇ）、鼻洗浄を１、２、４、８、１６時間に行う(各時点で２対象者)。イン・ビボでの半減期を計算するために、洗浄物をＰanorama ＲesearchでＥＬＩＳＡによりイムノアドヘシンについてアッセイする。用量増加試験および半減期試験(全２８人の対象者について)で使用したイムノアドヘシンの全量は約２７０mgとなる。
Ｄ．安全性の評価
通常の有害副作用に加えて、イムノアドヘシンの安全性を３つの方法で調べる。第１は、最初の投与の前および最後の投与の後に、鼻粘膜、特に刺激または炎症の徴候について視覚検査を行う。あらゆる見られる変化を記録する。第２に、標準的血液安全性評価を、処置の前および試験１、４、８日（および複数増加用量試験では、２１日)の最後の投与後に採取したサンプルについて行う。第３に、血清サンプルを貯め、凍結し、イムノアドヘシンが鼻粘膜を経て血液に移行し得るかどうかを調べるために用いる。これは次ぎの２つの方法で行う。第１に、血清サンプル中のイムノアドヘシンの存在をＥＬＩＳＡで測定する。この方法では、ミクロタイタープレートに吸収された抗ヒトＩｇＡ抗体が血清中のあらゆるイムノアドヘシンを捕捉する。これを抗ＩＣＡＭ 抗体が検出する。アッセイ感度の測定には、既知濃度のイムノアドヘシンを有する正常ヒト血清サンプルを用いる。あるいは、抗ＩＣＡＭ抗体をプレートに吸着せしめ、血清中のイムノアドヘシンを捕捉する。これを抗ＩｇＡで検出する。第２に、イムノアドヘシンに対する免疫応答の存在を、ミクロタイタープレートに吸収されたイムノアドヘシンを使用するＥＬＩＳＡ法で調べる。血清中の抗イムノアドヘシン抗体が抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭと結合し、これを検出する。処置前と処置後の血清サンプルを比較して、力価の変化をイムノアドヘシン摂取の証拠とする。抗イムノアドヘシン抗体の存在が陽性であれば、追加のアッセイをおこなって抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗ＩｇＡ活性の識別をおこなう。
患者をイムノアドヘシンに対するアレルギー反応の発生についてスクリーニングする（以前の試験で、鼻に局所適用した可溶性ＩＣＡＭ−１または口腔に適用した植物体で副作用の症状がなかった)。鼻のアレルギー徴候を表す者を、鼻洗液中の抗イムノアドヘシン特異的ＩｇＥ抗体について、感受性２工程ＥＬＩＳＡ(R & D System)を用いて試験した。
Ｅ．統計解析
この試験のサンプルのサイズは、以前のライノウイルス攻撃モデルを用いる試験を基とする。保護試験に計画されたサンプルのサイズは、プラセボで７５％、活性処置群で２５％で臨床風邪の発生の低下を検出するに十分でなければならない。αの１側レベル＝０.０５、１−β＝０．８０である。さらにサンプルのサイズは、全徴候スコアの５単位、ＳＤ５.８単位で変化を検出できるのに十分であるべきである。
実施例９：ヒトにおける感染を減少するイムノアドヘシンの能力を示す臨床試験：攻撃試験
攻撃試験を用いて、本発明のイムノアドヘシンでの処置が臨床の風邪を防御し、ウイルス攻撃後の風邪の症状を低下することを示した。
Ａ．攻撃ウイルス
本試験で使用する攻撃ウイルスは、ライノウイルス３９(ＨＲＶ−３９)である。ライノウイルス３９型は、細胞との接着にＩＣＡＭ−１を必要とするライノウイルスの主要な群である。攻撃ウイルスプールは共通指針にしたがって安全に試験される(Gwaltney et al., Prog. Med. Virol. 39: 256-263, 1992)。すべての対象者に約２００平均組織培養感染量(ＴＣＩＤ50)を接種する。対象者をあお向けにして、ウイルスを液滴として、鼻腔ごと２５０μｌの２つの接種物を約１５分間隔で投与する。
表５
Figure 2009502205
Ｂ．試験計画
２つの無作為ライノウイルス攻撃試験を行う(参照、表５)。本発明のイムノアドヘシンの同じ製剤を接種試験の前と後で検査する。両試験において薬物を、６用量として毎日、５日間投与する。対象者を各試験に入る時点で無作為に割付け、イムノアドヘシンまたは対応プラセボのいずれかを摂取するようにする。この試験は盲検であり、すべての臨床関係者、対象者、Ｐanorama Ｒesearch従業員には、全てのデータ回収時まで盲検である。
前接種試験において、薬物投与はウイルス攻撃の４時間前に開始する(２用量)。ウイルス攻撃をイムノアドヘシン(またはプラセボ)の第２回投与の１時間後に行い、第１日目の残りの投与を予定のとおり行う。この試験で、１８人が活性物処理を摂取し、１８人がプラセボを摂取する。
後接種試験では、薬物投与をウイルス攻撃２４時間後に開始する。この時点を選択したのは、ウイルス攻撃からの保護について他の試験で使用されていたからであり、また風邪症状が明らかに存在するようになるからである(Harris & Gwaltney, Clin. Infect. Dis. 23: 1287-90, 1996)。この試験でのウイルス攻撃は、試験１日目の朝の試験薬物の第１投与の約２４時間前、試験０日目の朝に行う。この試験で、３６人が活性物処理を摂取し、１８人がプラセボを摂取する。
対象者をホテルの個々の部屋に試験０日(ウイルス攻撃日)から試験６日まで隔離する。これらの期間毎日、症候スコアとウイルス単離のための鼻腔洗浄を、薬物投与の第１回の前に朝におこない、第２症候スコアを各夜に行う。試験６日目に対象者の隔離を止めるが、１４日間は各晩に症候スコアを記録し続ける。対象者は、試験２１日に試験場所にもどり、そこで抗イムノアドヘシン抗体の検出のための最終血清サンプルを採取する。２回のウイルス攻撃試験(全５４人について)で使用すべきイムノアドヘシンの全量は約１２００mgである。
Ｃ．ウイルスの単離
ウイルスの脱離を細胞培養でのウイルス単離により検出する。鼻腔洗浄検体を各鼻腔への０.９％食塩液（５ｍｌ）の点滴により採取する。この洗液を、プラスチックのカップに入れ、１または２時間冷やし、ついでウイルス培養に供する。イムノアドヘシンを、アガロース支持体(Affi-Gel 10, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に吸着した抗ＩＣＡＭ−１抗体での処理によりイムノアドヘシンの標本から除去した。一部の各処理標本を-８０℃で保存し、他の部分をＨｅＬａ-１細胞、ＩＣＡＭ−１の産生に富むＨｅＬａ細胞系中(Arruda et al., J. Clin. Microb. 34: 1277-1279, 1996) の２つの試験管に接種する。ライノウイルスを、典型的な細胞障害作用の発達により同定する。攻撃後試験日のいずれかにおいて陽性のウイルス培養を有する対象者を感染者とする。-８０℃に保存された標本中のウイルス力価を、ＨｅＬａ-１細胞のマイクロタイター・プレートでの連続的１０倍稀釈法での培養により決定される。
攻撃ウイルスに対する抗体を、標準的方法(Gwaltney et al., Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections p. 579-614, American Public Health Association)を用いる血清中和力価で検出する。抗体試験のための血清標本を、スクリーニングの際、ウイルス攻撃の直前および２１日後(回復期)にも採取する。回復期の血清サンプルを急性期血清サンプルと比較したときに、攻撃ウイルスに対する抗体力価が少なくとも４倍上昇している対象者を感染者とみなす。
Ｄ．疾患の重篤度の評価
疾患の重篤度を前に記載(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)したように調べる。症候スコアをウイルス攻撃(出発点)の前に記録し、さらに毎日２回、約１２時間間隔で次ぎの６日間記録する。試験７日から１４日に各日の晩に１回症候スコアを記録する。各検査時に最近の症候検査からの期間中に下記８つの症候について最大の重篤度を判定するように対象者に求める：くしゃみ、鼻漏、鼻つまり、咽喉痛、せき、頭痛、吐き気、寒気。各症候について、なし、軽い、中程度、重篤との症候の重篤度の報告に対応して、重篤度スコア０から３を割りあてる。症候が出発点で存在していると、報告された症候スコアから出発点スコアを引く。２つの各日の評価値の高い方を、各症候についての各日の症候スコアとする。ウイルス攻撃後の最初の５日間(試験１-５日)についてのすべての各日症候スコアを合計し、試験５日の晩に、すべての対象者に「風邪をひいていると思いますか」とたずねる。全症候スコアが少なくとも６であり、かつ少なくとも３日間の鼻漏または風邪をひいているとの主観のいずれかをもつ対象者を、臨床的に風邪であるとする。
排出された鼻分泌物の重量を１-７日間、予め計量した鼻紙の小さい包をすべての対象者に渡して測定する。鼻紙を使用した後に、それを密封のプラスチック・バッグに保管する。毎朝、使用済鼻紙を、元の小さい包からの未使用の鼻紙と合わせて、収集し、計量する。
Ｅ．ＩＬ−８アッセイ
最近の研究によると、宿主炎症応答、特にインターロイキン８(ＩＬ-８)がライノウイルス感染による通常の風邪症候の病因に関与し得る。鼻洗浄におけるＩＬ-８の濃度を市販のＥＬＩＳＡ(R & D Systems, Minneapolis, Minn)で、前に記載(Turner et al., JAMA 281: 1797-804, 1999)のように測定する。
Ｆ．安全性の評価
実施例８に記載の用量増加試験と同じ評価を、攻撃試験について行う。
Ｇ．統計解析
統計解析を、実施例８に記載の用量増加試験について記載した解析と同様に行う。
主にＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンに関する前記実施例および議論は、当業者により容易に採用され、イムノアドヘシンのウイルスおよびバクテリア病原体の他のタイプまたはサブタイプの使用を達成および実行される。下記の実施例は、受容体タンパク質としての炭疽菌毒素受容体(ＡＴＲ)の使用を為す抗バクテリアイムノアドヘシンの実施形態を説明するものである。
実施例１０：ＡＴＲイムノアドヘシン発現カセットの構築
ヒト炭疽菌毒素受容体(ＡＴＲ)の細胞外ドメインの一部をコードするカセットをＰＣＲクローニングにより調製した。特に、アミノ酸４４-２１６(いわゆるフォンビルブランド因子タイプＡドメイン)をコードしている５２３ bpのフラグメントを、下記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、プラスミドＡＴＲ(Bradley et al., 2001)またはプラスミドＴＥＭ８(St Croix et al., 2000)から増幅した：
5’-GACCTGTACTTCATTTTGGACAAATCAGG-3’ (配列番号９１)
5’-GAGCTCAAAATTGAGTGGATGATGCCTTGCAGAG -3’ (配列番号９２）
二次プライマー(配列番号９２)をＡＴＲ細胞外ドメインのコード領域(実線)の３’末端でSac I 部位を導入するように設計した。ＰＣＲを、Ｐｆｕポリメラーゼ (Strata Gene)を用いて行い、エラーの蓄積を低下させる。５’非翻訳領域および植物シグナル・ペプチドを包含する１２４bpの第二フラグメントを、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、プラスミド8ATG-TOPO#4(これは、Invitrogen cloning vector pCR4-TOPOにおける植物至適化５’非翻訳領域およびシグナル・ペプチドのＰＣＲクローンである)から増幅させた：
5’-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3’ (配列番号９３)
5’-GTCCAAAATGAAGTACAGGTCAGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3’ (配列番号９４)
第一プライマー(配列番号９３)を、ＰＣＲフラグメントの５’末端にてＫｐｎＩ部位(実線)を導入するように設計した。２つのＰＣＲフラグメントは、相補配列(点線)の２０ntを持つ。２つのＰＣＲフラグメントを一緒に混合し、６２６bpのフラグメントを配列番号９３および配列番号９２を用いて増幅させた。得られるＰＣＲフラグメントをベクターＰＣＲＳｃｒｉｐｔ(Strata Gene)にクローニングして、ベクターｐＭＳＰ−ｃｏＩＣＡＭに置いてＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の間にクローニングする前に配列決定して、プラスミドｐＭＳＰ−ＡＴＲ−ＩｇＡ２を得る。これは、ＡＴＲの細胞外ドメインおよびヒトＩｇＡ２の定常領域の遺伝子的融合をもたらす。このヒトＩｇＡ２の定常領域は、タバコ細胞において発現に適切なコドンを使用するために合成された。ＡＴＲ−ＩｇＡ２融合物(イムノアドヘシン)の全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１０に示す。得られる構築体において、キメラＡＴＲ−ＩｇＡ２分子の発現は、構成的プロモーター“ｓｕｐｅｒＭＡＳ”(Ni et al., 1995)およびａｇｓ３’ターミネーター領域の制御下にある。
完全な発現カセット(プロモーター＋ＡＴＲ−ＩｇＡ２＋ターミネーター)を、ｐＭＳＰ−ＡＴＲ−ＩｇＡ２から制限酵素ＡｓｃＩを用いて取り出し、バイナリーAgrobacterium ＴｉプラスミドベクターｐＧＰＴＶ-ｋａｎ-ｏｃｓ中にクローニングして、プラスミドｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓ−ＡＴＲ−ＩｇＡ２を得る。ベクターｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓを、ｐＧＰＴＶ−ｋａｎ(Becker et al., 1992)から得て、下記の方法で修飾した。完全なｕｉｄＡ遺伝子を包含するｐＧＰＴＶ−ｋａｎのＥｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位の間の配列を取り出し、ｎｐｔＩＩ遺伝子に配向したｏｃｓ３’ターミネーター領域で置き換えて、ＡｓｃＩおよびＳａｃＩについての制限部位を加えた(MacDonald et al., 1991)。Ｔ−ＤＮＡの右側に隣接するこのターミネーターの目的は、右側境界の外側で植物ＤＮＡにおいて生じる転写によるトランス遺伝子による転写妨害を排除することである(Ingelbrecht et al., 1991)。
プラスミドｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓ−ＡＴＲ−ＩｇＡ２のＴ−ＤＮＡ境界の間の配列を図１１に示す。左側および右側の境界の外側の配列は記載したとおりである(Becker et al., 1992)。ヌクレオチド１８-１８７は、右側のＴ−ＤＮＡ境界部を示す。ヌクレオチド３１１-６３０は、ｏｃｓ３’ターミネーター領域を示す。ヌクレオチド９２７-１９７６は、ｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターを示す。ヌクレオチド１９９０-２０１７は、Nicotiana sylvestris psaDb 遺伝子由来の５’非翻訳領域を示す(Yamamoto et al., 1995)。開始ＡＴＧ周辺の内容(ヌクレオチド２０１２-２０２６)を、高度に発現した植物遺伝子において見出したものと一致させるように設計した(Sawant et al., 1999)。ヌクレオチド２０１８-２０８６は、ソラマメのレグニン（Vicia faba legumin）のシグナル・ペプチドの修飾形態をコードしている配列を含む(Baumlein et al., 1986)。ヌクレオチド２０８７−２６０５は、ＡＴＲのフォンビルブランド因子タイプＡドメインをコードする配列を含む(Bradley et al., 2001)。ヌクレオチド２６０６-３６３１は、ヒトＩｇＡ２m(２)定常領域をコードする配列を含む(Chintalacharuvu et al., 1994)。ヌクレオチド３７９４-４１０８は、アグロピン合成酵素(ａｇｓ)ターミネーターから得られる。ヌクレオチド４５３０-４８００はＮＯＳプロモーターを示す(Depicker et al., 1982)。ヌクレオチド４８３５-５６２６は、ｎｐｔＩＩ遺伝子をコードする(カナマイシンに対する耐性を付与する)。ヌクレオチド５６４８-５８７０は、A. tumefaciens 遺伝子７由来のポリアデニル化シグナルである(Gielen et al., 1984)。ヌクレオチド６４５４-６６０２は左側のＴ−ＤＮＡ境界を示す。
ヒトＪ鎖および分泌成分に関する植物中での発現用構築体も開発されてきた。この構築体ｐＧＰＴＶ−ｈｐｔ−ｏｃｓ−３５ＳＪ／ＳＣは、上記のｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓに記載した同じ方法でｐＧＰＴＶ−ｈｐｔから得られたベクターｐＧＰＴＶ−ｈｐｔ−ｏｃｓを基にしている。プラスミドｐＧＰＴＶ−ｈｐｔ−ｏｃｓ−３５ＳＪ／ＳＣのＴ−ＤＮＡ境界部分の間の配列は、図１２に示されている。左側および右側の境界の外側の配列は記載したとおりである(Becker et al., 1992)。ヌクレオチド１-１４９は、左側のＴ−ＤＮＡ境界部分を示す。ヌクレオチド７３３-９５５(相補鎖)は、A. tumefaciens 遺伝子７からのポリアデニル化シグナルを示す(Gielen et al., 1984)。ヌクレオチド９８０-２００２(相補鎖)はｈｐｔ遺伝子を示す（ヒグロマイシンに対する耐性を付与する)。ヌクレオチド２０４９-２３１８(相補鎖)は、ＮＯＳプロモーターを示す(Depicker et al., 1982)。ヌクレオチド２８９８-３２３０は、その本来のシグナル・ペプチド(ヌクレオチド３２３６-５０５６)を包含するヒト分泌成分遺伝子の発現を駆動するカリフラワー・モザイク・ウイルス(ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを示し、ヌクレオチド５０６０−５４４５はマメ科のｒｂｃＳ−Ｅ９遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを示す(Mogen et al., 1992)。ヌクレオチド５４５７-５７８８は、その本来のシグナル・ペプチド(ヌクレオチド５７９７-６２７３)を包含するヒト・ジョイニング(Ｊ)鎖遺伝子の発現を駆動させるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの第二の複製物を示し、ヌクレオチド６２８１-６４９４は、遺伝子７ターミネーターを示す。ヌクレオチド６５０１-６８１９(相補鎖)は、ocs ３’ターミネーター領域を示す。ヌクレオチド６９４４-７１１３は、右側Ｔ−ＤＮＡ境界部分を示す。
実施例１１：植物中の植物形質転換およびＡＴＲイムノアドヘシン発現
上記した発現カセットを使用して、Agrobacterium媒介性形質転換によって植物中で会合したイムノアドヘシンを産生する。プラスミドｐＧＰＴＶ−ｈｐｔ−ｏｃｓ−３５ＳＪ／ＳＣおよびｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓ−ＡＴＲ−ＩｇＡ２を、別々にA tumefaciens 株 LBA4404に導入する。両方の株の一晩培養物を、標準的方法に従ってタバコの葉の一片と同時に「共培養」に使用した (Horsch et al., 1985)。形質転換した植物組織を、カナマイシン(１００μg/mL)およびヒグロマイシン(２５μg/mL)の両方を含有する再生培地で選択した。
抗生物質の存在下で再生する植物体を、トランス遺伝子発現のためにスクリーニングした。これを、リン酸緩衝溶液中(ＰＢＳ)で葉の組織の抽出物を調製し、清澄にした抽出物をニトロセルロース紙上にスポッティングすることによって行った。これらの“ドット”ブロットは、ヒトＩｇＡ、Ｊ鎖または分泌成分に特異的なアルカリホスファターゼと結合させた抗血清を用いてプローブした。試験が最初のスクリーニングで陽性であった植物を、ウェスタンブロッティングおよびＰＣＲを包含する次のスクリーニングに供した。ＡＴＲ−ＩｇＡ２イムノアドヘシンは５９ｋＤａのサブユニットＭＷであると考えられた。重鎖定常領域の天然の二量体化のために、〜１１８ｋＤａの二量体を形成すると予測される。これらの二量体は、Ｊ鎖の存在において植物細胞内でさらに二量体化し、〜２５２ｋＤａの分子を形成する。分泌成分の添加により、〜３２０ｋＤａの分子種を観察した。
キメラ重鎖、Ｊ鎖および分泌成分構築体におけるシグナル・ペプチドの存在は、多量体イムノアドヘシンへの会合のために重要である。ｍＲＮＡの翻訳の際に、シグナル・ペプチドの解裂により各タンパク質を植物細胞の小胞体(ＥＲ)に蓄積すると考えられる。多量体イムノアドヘシン中への会合は、ＥＲおよびゴルジ体中でおこると考えられ、次いで会合した分子が該細胞から分泌される。
実施例１２：会合したＡＴＲイムノアドヘシンの精製
会合したＡＴＲイムノアドヘシンの精製は、実施例３のＩＣＡＭ−１イムノアドヘシンについて記載したように主に行い得る（上掲）。
実施例１３：哺乳動物細胞に対する毒性作用を阻害するＡＴＲイムノアドヘシン
上記した発現カセットを使用して、植物抽出物から精製した会合したイムノアドヘシンを生成する。精製したイムノアドヘシンを使用して、単純なバイオアッセイにおいてＣＨＯ−Ｋ１細胞が殺傷されるのを防いだ。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＰＡが細胞表面上で結合する受容体を有するが、毒素に感受性ではない。ＰＡおよびジフテリア毒素の触媒Ａ鎖と結合したＬＦのＮ末端２５５個のアミノ酸からなる融合タンパク質であるＬＦＮ−ＤＴＡによって攻撃した場合に、それらは殺傷される。この組換え体毒素は、本来のＬＦおよびＯＦタンパク質の結合と侵入に必要とされる同じＬＦ−ＰＡ−受容体相互作用を発揮する。イムノアドヘシンの保護効果を試験するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、一定（毒素）量のＰＡおよびＬＦＮ−ＤＴＡの存在下でＡＴＲ−ＩｇＡ２の増加量と混合し、そしてタンパク質合成に対するその後の効果を測定した。ＡＴＲ−ＩｇＡ２は毒素作用の有効な阻害剤であり、可溶性ＡＴＲよりも低い濃度で毒性作用を阻害する。
実施例１４：ヒト対象において毒性作用を阻害するＡＴＲイムノアドヘシン
精製したイムノアドヘシンを、医薬的に許容し得る緩衝液中で調製し、炭疽菌に感染したヒト対象に投与した。投与経路は、吸入用エアゾールとしてまたは注射としてのいずれかであり得る。一般的に死亡する可能性のある感染後期の対象を、イムノアドヘシンにより毒性作用から保護した。
実施例１５：別のＡＴＲイムノアドヘシン発現カセットの構築体
ヒトＡＴＲ(アミノ酸２４-３２０)の全細胞外部分をコードするカセットを、ＰＣＲクローニングにより調製した。特に、８７８bpのフラグメントを、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、プラスミドＡＴＲ(Bradley et al., 2001)またはプラスミドＴＥＭ８ (St Croix et al., 2000)から増幅させた：
5’-GGGGGACGCAGGGAGGATGGGGGTCCAG-3’ (配列番号９５)
5’-GAGCTCCCGTCAGAACAGTGTGTGGTGGTG-3’ (配列番号９６)
第二プライマー(配列番号９６)を設計して、ＡＴＲ細胞外ドメインのコード領域(実線)の３’末端でＳａｃＩ部位を導入した。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼ (Stratagene)を用いて行い、エラーの蓄積を低下させた。５’非翻訳領域および植物シグナル・ペプチドを包含する１２１bpの第二のフラグメントを、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミド.delta. ＡＴＧ−ＴＯＰＯ＃４から増幅させた。
5’-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3’ (配列番号９３)
5’-ATCCTCCCTGCGTCCCCCAGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3’ (配列番号９７)
第一プライマー(配列番号９３)を設計して、ＰＣＲフラグメント(実線)の５’末端でＫｐｎＩ部位を導入する。この２つのＰＣＲフラグメントは、相補的な配列(点線)の２０ｎｔを持つ。該２つのＰＣＲフラグメントを一緒に混合して、９８１bpのフラグメントを配列番号９３および配列番号９６を用いて増幅させた。得られるＰＣＲフラグメントを植物発現カセットにクローニングして、部分的ＡＴＲ細胞外ドメインと同じ方法(実施例１)で、ヒトＩｇＡ２と共に遺伝子融合物を形成させる。
この同じ方法を用いる別の構築体はアミノ酸４１-２２７を増幅させる。
実施例１６：炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質の産生：ＣＭＧ２-ＩｇＧおよび高親和性抗ＰＡ抗体
ＩｇＧと融合したＣＭＧ２(ＣＭＧ２-ＩｇＧ)の構築体と高親和性抗ＰＡ抗体
簡単には、コドン至適化抗ＰＡ重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントおよびヒト炭疽菌毒素受容体(ＣＭＧ２)の細胞外ドメインの一部をコードするフラグメントを合成した。ＣＭＧ２および抗ＰＡ重鎖可変領域配列を、構成的な植物プロモーター(ＣａＭＶ３５Ｓ)の制御下にあるAgrobacterium バイナリーベクターにおけるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域ドメインをコードするＤＮＡフラグメントおよび植物３’ポリアデニル化シグナル配列にそれぞれ結合させた。同様のκ鎖ベクターを、１Ｈ軽鎖Ｖ領域について調製した。これらのベクターの構築体を下記に詳細に説明した。
プログラム“シグナルＩＰ”を使用して、ＣＭＧ２のシグナル・ペプチド解裂部位がアミノ酸３３および３４４５の間にあると予測した。高度に発現した植物遺伝子から得たコドン頻度表を用いて、我々は、短い５’非翻訳領域、Arabidopsis thaliana46の２Ｓ２アルブミン貯蔵タンパク質のシグナル・ペプチドおよびＣＭＧ２のアミノ酸３４-２３２を含む６９７bpのＤＮＡフラグメントを設計して、合成した(図１４)。ＣＭＧ２のコード部分は、可溶性タンパク質31としてScobieらにより使用されたものに相当した。この配列を確認した後、該フラグメントを、ヒトＩｇＧ１の定常領域を既に含有するベクターｐＭＳＰ−ＩｇＧ中のＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の間にクローニングし、プラスミドｐＭＳＰ−ＣＭＧ２-ＩｇＧを得る。これは、ＣＭＧ２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１の定常領域の遺伝子融合をもたらした。このヒトＩｇＧ１定常領域は、タバコでの発現に最適なコドンを使用するために合成されてきた。得られる構築体において、キメラＣＭＧ２-ＩｇＧ１分子の発現は、高度に発現した構成的プロモーターＣａＭＶ３５Ｓ４７およびａｇｓ３’ターミネーター領域の制御下にあった。成熟タンパク質の予測したアミノ酸配列を図１４に示した。
完全な発現カセット(プロモーター＋ＣＭＧ２-ＩｇＧ1＋ターミネーター)を、ｐＭＳＰ−ＣＭＧ２-ＩｇＧから、バイナリーAgrobacterium ＴｉプラスミドベクターｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓ中にサブクローニングして、プラスミドｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓ−ＣＭＧ２-ＩｇＧを得る。ベクターｐＧＰＴＶ−ｋａｎ−ｏｃｓをｐＧＰＴＶ−ｋａｎから得たが、これ自体は、より一般的なバイナリーベクターｐＢＩＮ１９４８から得た。該発現カセットは、翻訳エンハンサー49の特徴を有するNicotiana sylvestris psaDb 遺伝子由来の５’非翻訳領域を使用した。開始ＡＴＧ周辺の内容を、高度に発現した植物遺伝子50において見出されたものと合致させるように設計した。
抗ＰＡ抗体の発現のために、植物至適化コドンを用いて１Ｈの重鎖可変領域をコードしているＤＮＡフラグメントを、我々のコドン至適化ヒトＩｇＧ１定常領域配列との結合のために３’末端でＳａｃＩ部位を有するよう合成した。同様に、我々のコドン至適化ヒトκ定常領域との結合のために、３’末端でＨｉｎｄ ＩＩＩを有する抗体１ＨのＶｋ領域をコードする配列もまた合成した。これらの配列は、ＣＭＧ２遺伝子について使用したものと同一の５’ＵＴＲおよびシグナル・ペプチドを組み込んだ。両方の可変領域を、対応する重鎖および軽鎖定常領域とインフレームに、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御の下にある別の発現ベクター中にクローニングした。
Agrobacterium tumefaciens媒介一過性発現系を用いるタバコでのタンパク質産生
１Ｈ重鎖および軽鎖の発現用カセットを担持する２つのAgrobacterium株を、Nicotiana benthamianaの葉内に同時浸潤させ、７日後に収穫し、抗体51を精製するために直ぐに処理した。同様に、ＣＭＧ２-ＩｇＧ発現カセットを担持するAgrobacterium 株を葉中に浸潤させた。一過的に形質転換したタバコ植物からの葉の抽出物を調製して、タンパク質Ａクロマトグラフィーにより分画した。迅速で、高機能かつ再現性のある方法を用いて、１ＨおよびＣＭＧ２-ＩｇＧの少量のサンプルを精製した。表６は標準的な実験結果を示す。
表６．一過的に形質転換したN. benthamiana葉からのタンパク質の単離および精製
Figure 2009502205
精製タンパク質を、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色に供した(図１５)。１ＨＩｇＧ調製物には、１５０ｋＤａの一本のバンドが含まれており、５０および２６ｋＤａの２つのバンドに分けられる。ウェスタンブロットにより、ヒトγ重鎖およびκ軽鎖(示さず)としてこれらの２つのバンドを確認した。タンパク質Ａから溶出したＣＭＧ２-ＩｇＧ調製物は、非還元条件下で４５ｋＤａおよび還元条件下で２９ｋＤａの主要なバンドを有するタンパク質の異種混合物であった。ＣＭＧ２-ＩｇＧ 単量体のアミノ酸配列を元にした予測されたサイズは５８ｋＤａであった。還元条件下では、５３ｋＤａバンドが少量の存在しており、おそらくインタクトなＣＭＧ２-ＩｇＧ単量体を示すものであろう。より急速に凝集するバンドは、ＶＷＡ／Ｉドメイン＋全てまたは一部のＣγ１を欠失しているタンパク質分解産物である。全てのバンドは抗ＩｇＧＩ抗血清と反応した(データは示しておらず)。
ＣＭＧ２-ＩｇＧ調製物を、還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動させ、該ゲルをＰＶＤＦにブロッティングし、コマジーブルーで染色した。５３、３４および２９ｋＤａフラグメントを含有する３つの薄片(図１５)を、Ｅｄｍａｎ分解(Ｎ末端アミノ酸配列決定)のためにUC Davisでthe Molecular Structure Facilityに発送した。５３ｋＤａバンドからは配列を回収できなかった。このため、“ブロックされた”残基の存在が示唆され、これはＣＭＧ２のアミノ末端に対して予測したＧｌｎに対応する。３４および２９ｋＤａフラグメントのアミノ末端は各々アミノ酸２６８および２９７であった(図１４において太字のアミノ酸番号１および２)。これらの結果は、図１５の図解モデルと一致する。
実施例１７：イン・ビトロでの炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質の抗炭疽菌毒活性についての試験
この実施例は、本明細書に記載したキメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシンの抗炭疽菌毒活性を試験するための方法を示す。
精製した１ＨＩｇＧプラントボディ（plantibody）およびＣＭＧ２-ＩｇＧ1抗毒素を、致死毒素を用いるマウスマクロファージアッセイにおいてＰＡを中和する能力について試験した。植物から得た１ＨＩｇＧまたはＣＭＧ２-ＩｇＧ１の様々な濃度と共に、ＰＡ＋致死因子(100 ng/ml PA, 50 ng/ml LF)の投与後のＲＡＷ２６４.７マウスマクロファージ様細胞の生存性を決定した25。抗毒素タンパク質を、マクロファージを加える前に３０分間毒素とともに予めインキュベートした。毒素への暴露３時間後に、間接的な生存能アッセイを行った。植物由来の１ＨＩｇＧの力価により、該抗体は動物細胞で生じた同じ抗体と非常に類似している〜０.３μg/mlのＩＣ５０を有することが決定された（表示せず)。ＣＭＧ２-ＩｇＧ 調製物を、濃度範囲１−１０μg/mlにおけるマクロファージを保護した。これは、ＣＭＧ２-ＩｇＧが強力な抗毒素であることを示唆するものであった。
実施例１８：炭疽菌毒素受容体タンパク質イムノアドヘシンＣＭＧ２-ＩｇＧ変異体
この実施例は、本明細書に記載したキメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシンの安定性および収量を改善するために行った代表的な修飾を示す。
変異体の産生および発現
ＰＣＲを用いて、修飾物を、ＣＭＧ２-ＩｇＧ構築体のＣＭＧ２およびＩｇＧコード領域の間の分岐点でのＳａｃＩ部位周辺に導入した。結晶構造34にて規定されたＶＷＡ／Ｉドメインの一部ではなかった１４個のアミノ酸を変異体１中で除去した(図１４においてＶ１)。除去したアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を下記に示した：
ＴＥＩＬＥＬＱＰＳＳＶＣＶＧ(配列番号１０２)
act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg (配列番号１０３)
変異体２ａ(図１４中でＶ２ａ)について、Ｃγ１ドメインを除去した。これは、上記の分析からこの領域においてプロテアーゼ感受性部位が存在するということが示唆されたためである。変異体２ｂにおいて、１４個のアミノ酸およびＣγ１ドメイン両方を除去した。変異体３において、該Ｃγ１は残すが、該１４個のアミノ酸は柔軟なリンカー(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３により置換した。
これら４つの変異体全てと、本来のＣＭＧ２-ＩｇＧを、N. benthamianaで一過的に発現させ、タンパク質Ａクロマトグラフィーにより葉の抽出物から精製した。さらに、元々のＣＭＧ−ＩｇＧをヒトκ鎖と一緒に発現させた。各タンパク質の等量を、非還元および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、該ゲルをコマジーブルーにて染色した(図１６)。全ての変異体は、元々あったＣＭＧ２-ＩｇＧよりも最高分子量の形態よりも顕著に大きなものを含有する。変異体Ｖ１およびＶ３は、元々のＣＭＧ２-ＩｇＧと同じ分解フラグメント(３０および３３ｋＤａ)を持つことが判ったが、変異体Ｖ２aはおよそ３０ｋＤａの２つの様々なフラグメントを持つ。これらのフラグメントのアミノ末端の配列決定(図１６中で枠によって囲まれ、番号４および５によって同定された)により、それらがＶ２ａのヒンジ領域の直前から開始することが明らかとなった(図１５)。
ＣＭＧ２＋ＩｇＧのＣγ２/Ｃγ３のＶＷＡ／Ｉドメインのみを含んでいる変異体Ｖ２ｂは、他のものよりもより安定であった。還元条件(レーン１１、図１６)下では、大部分のタンパク質は、５０ｋＤａのバンドであり、見たところ明白な分解は殆どなかった(aa配列を基にしたこのタンパク質の予測サイズは４６.５ｋＤａである)。非還元条件下で(図１６、レーン５)、〜４０ｋＤａおよび〜９７ｋＤａでの主要バンドが存在する。これらの両方のバンドは、５０kDa単量体まで低下し、それらが単量体およびジスルフィド結合した二量体形態に対応することが示される（データは示さず）。Ｖ２ｂタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)は、７５ｋＤａのシングルピークを示す(図１７)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣの組合せから、タンパク質がジスルフィド結合した二量体および非共有結合的に会合した二量体の混合物であり、おそらくＣγ３ドメイン間の相互作用によって一緒に保持したものであることが示唆された。
κ軽鎖の存在下でのＣＭＧ２-ＩｇＧの発現
また、κ鎖の存在下で発現したＣＭＧ２-ＩｇＧに何が起こっているかが興味の対象である。約１３７ｋＤａで開始して、３５kDaのユニットに達するバンドのラダーを形成する(レーン６、図１６)。還元した場合、このラダーは、６０、４０および２８ｋＤａ(レーン１３)の３つのバンドに分解する。２８ｋＤａのバンドは、κ鎖であり、６０ｋＤａバンドは完全長のＣＭＧ２-ＩｇＧである。このレーン(図１６において番号３)から４０ｋＤａバンドを、エドマン分解に供し、そのアミノ末端がＶ１９６であったことを示した。κ鎖は、ＣＭＧ２由来の余剰の１４個のアミノ酸配列にはないＣγ１における解裂を防止できることを示している。
抗毒活性についての試験
元々のＣＭＧ２-ＩｇＧおよびＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂを、ネガティブコントロール抗体(図１８)と共にマクロファージ保護アッセイにおいて抗毒活性について試験した。ＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂは、元々のものより優れており、他の変異体は中間の活性(データ示さず)を有する。５０％(ＩＣ５０)まで炭疽菌毒活性を中和するのに要するＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂの濃度は、３５ng/mlであった(２つのアッセイの平均、表２)。これは、ヒト・ゲノム・サイエンス(ＩＣ50＝５０ng/ml)52、Ｅｌｕｓｙｓ（ＩＣ５０＝80 ng/ml)27およびＡｖａｎｉｒ(ＩＣ５０＝３０〜７０ng/ml)23によって開発された抗ＰＡ抗体との比較である。ＩＣ５０でのＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂとＰＡとのモル比は０．３８であり、ＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂの分子は、炭疽菌致死毒素の大部分の３つの分子を中和できることを意味する。
構造分析
３つの結晶構造−ＩｇＧ Ｆｃ(タンパク質データベース53における１Ｅ４Ｋ)、ＣＭＧ２のＶＷＡ／Ｉドメイン(内部ジスルフィド結合を持つ、1SHU34)、およびＰＡ(１Ｔ６Ｂ36)に結合したＣＭＧ２−を重ねることによって、どのようなＣＭＧ−ＩｇＧ Ｖ２ｂ構造の予測モデルであって、どのようにＰＡに結合するかに関する予測モデルが得られた(図１９)。サイズ排除クロマトグラフィーから、大部分のＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖａｒ２ｂは二量体形態であることが示唆されるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、少なくとも５０％の二量体は非共有結合であることが示唆された。これは、さらに伸長した免疫グロブリンＣγ１ ドメインよりもさらに球状体であるＣＭＧ２ ＶＷＡ／Ｉドメインの形状によるものであろう(図１９)。立体障害は、ＩｇＧ Ｆｃのヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を効率良く形成するのに十分に接近することから防止できる。
ＣＭＧ２-κの存在下でＣＭＧ２-ＩｇＧの発現
第一のＣＭＧ２の１９９個のアミノ酸およびヒトκ鎖定常ドメイン(ＣＭＧ２-κ)を含んだ構築体を組み立てた。ＣＭＧ２-κを、変異体１または変異体３と一緒に一過的に発現させ(これらの両方はインタクトなＣγ１ドメインを含有する)、得られるタンパク質をタンパク質Ａセファロースにて精製した。両方の場合において、優性な分子種は、およそ１８０および１６０ｋＤａの一対のバンドであった(図２０)。還元条件下では、５７ｋＤａ、３４ｋＤａおよび１３ｋＤａのバンドが存在する。免疫ブロッド(示していないが)が示したことは、５７ｋＤａバンドがＩｇＧ重鎖を含有し、最小のバンドがκ鎖特異的抗血清と反応したことであった。最小バンドのサイズは、ＣＭＧ２ ＶＷＡ／Ｉドメインとκ定常領域の１４個のアミノ酸における解裂部と一致する。主な非還元バンドは、両方の抗ＩｇＧと抗κ抗血清と反応し、おそらく２つの“重鎖”および２つの“軽鎖”と会合した四量体分子を示す。これらの分子を、ＲＡＷマクロファージ保護アッセイで試験した。ＩＣ５０は、Ｖ１/ｋについては４４ng/mlおよびＶ３／ｋについては３２ng/ml(表２)であった。その大きなサイズのために、ＩＣ５０の抗毒素素：ＰＡのモル比は、新規タンパク質の両方に対してさらに低かった：Ｖ１/ｋについては０．２５およびＶ３/ｋについては０．１８。
表７．計算したＩＣ５０(ng/mL)およびＩＣ５０での抗毒対ＰＡのモル比。元々のＣＭＧ２-ＩｇＧおよび変異体の調製物を、ＲＡＷマクロファージ保護アッセイにおいてＰＡの80 ng/mlおよびＬＦの80 ng/mlと混合した(プロトコールについて、D.1.5を参照)。結果は、異なる３日目のアッセイからのものである。
Figure 2009502205
ＦｃγＲを介するＩｇＧ排除およびＮグリカンの効果
現在開発されている様々な抗毒素による炭疽菌毒および／またはB. anthracis 感染のイン・ビボでの中和および排除に関するこのメカニズムは、ほとんど理解されていない。抗体およびイムノアドヘシンの場合では、イン・ビボでの毒素：抗毒複合体の中和は、ＦｃγＲとの相互作用に依存し得る。白血球の多くのタイプは、ＦｃγＲとして知られているＩｇＧ上のＦｃ領域に対する細胞表面受容体を有する。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を介する抗原-抗体複合体とこれら細胞との結合は、抗体依存性の細胞毒性(ＡＤＣＣ)および受容体リガンド複合体の内在化を包含する多くの反応において生じ得る。
結晶構造は、ＦｃγＲが重鎖Ｆｃ領域55のＣγ２の低いヒンジ領域に結合することを示す。遺伝子および生化学アプローチは、この相互作用を制御するアミノ酸残基、さらにＩｇＧ Ｆｃに対するＮ結合グリカンの役割を同定した。Ｎ結合グリカンは、糖タンパク質の特定のアスパラギン残基と共有結合したオリゴサッカリド構造である。結晶構造分析から、ヒトＩｇＧのＡｓｎ297でのＮグリカンは、ＦｃγＲ結合を促進する55, 56Ｆｃ領域の特異的なコンフォメーションを安定化させることが示唆される(図２１)。このＮグリカンの排除により、イン・ビトロでの３つの主なＦｃγＲアイソフォームについてＩｇＧの親和性が劇的に低下するが、イン・ビボでの半減期57, 58, 59には影響しない。
グリコシル化またはその欠落により、炭疽菌致死毒素またはB. anthracis 感染に対するＣＭＧ２-ＩｇＧのイン・ビボでの保護効果を示すことはいまだ知られていない。抗毒素素-ＰＡ複合体の効率的な排除/破壊はＦｃγＲとの結合によって影響を受けるなら、抗毒素のグリコシル化状態によって影響され得る。Avanir Pharmaceuticalsの科学者は、その抗ＰＡ抗体の２つのグリコシルされた形態およびグリコシル形態のイン・ビボ活性を比較して、保護効果における差違は殆どないことを認めた23。この結果から、それらが致死毒中和は、Ｆｃエフェクターが介在しなかったことを結論づけた。しかし、これは一つの実験であって、グリコシル化抗体の一つによって低下した効率が存在した。この理由に対して、ＣＭＧ２-ＩｇＧイムノアドヘシンのアグリコシル（aglycosyl）(これらの実施例で試験した形態)およびグリコシル化形態を試験した。
動物および植物の糖タンパク質のＮグリカンにおける微妙な違いが存在する。いくつかのものが、植物糖タンパク質60, 61の強い免疫原性/アレルギー誘発性についての懸念が高くなってきた。これらの実験において、１Ｈ ＩｇＧおよびＣＭＧ２-ＩｇＧは、アグリコシル重鎖定常領域を用いて作成した。免疫原性は、グリコシル化されていたとしても植物が作ったイムノアドヘシンを基にした炭疽菌中和治療について重要な問題ではないと考えられる。免疫原性が重要な問題であることが判ったなら、「ヒト化」そのＮグリカン62-67に対して植物を遺伝子的に修飾することができるべきである。
結論
ヒトＩｇＧ１(ＣＭＧ２-ＩｇＧ)のＦｃ領域と融合したヒト炭疽菌毒素受容体ＣＭＧ２の細胞外ドメインを含む植物が生成したイムノアドヘシンは、ナノモル濃度での炭疽菌致死毒効果からマウスマクロファージを保護できる。イムノアドヘシンの特異活性は、最良の利用可能なモノクローナル抗体と同程度であることが判る。
実施例１９：さらなるＣＭＧ２-ＩｇＧ キメラ変異体
この実施例は、キメラ毒素受容体タンパク質および本明細書に記載したイムノアドヘシンの安定性と収率を改良するように為し得る代表的な修飾を示す。
変異体２ｂは、さらに収量を増加させるために修飾される。ＶＷＡ／ＩとＣγ２ドメインとの間の柔軟性のある(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３リンカーの導入は(図１９における構造を参照されたい)、ジスルフィド結合の高い％の二量体を持つ変異体をもたらし、イン・ビボでそれをより安定におよび／または活性にする。ＣＭＧ２-κ 構築体中のＣＭＧ２ ＶＷＡ／ＩドメインおよびＣκの間の１４個のアミノ酸をまた、a(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３リンカーで置換する。これらの２つの新規タンパク質を、一過的に形質転換したタバコ植物で産生し、タンパク質Ａ−セファロースクロマトグラフィーを用いて精製した。それらを、適切な会合および安定性について試験した。結合定数を表面プラスモン共鳴によって決定した。それらの活性を、ＲＡＷマクロファージ保護アッセイで現存するイムノアドヘシンの活性と比較した。グリコシル化は、この細胞を基にしたアッセイでは活性に影響すると予測されない。しかし、グリコシル化は、イン・ビボでの活性には影響するかもしれないため、最も強力なイムノアドヘシン抗毒素を選択した後、Ｃγ２ドメインにおけるグリコシル化部位を再導入した。グリコシルおよびアグリコシルバージョンの両方をイン・ビボで試験した。
タバコにおけるＣＭＧ２-ＩｇＧの発現のための分子構築体
変異体４は、柔軟性のあるリンカーの付加を有する変異体２ｂと同一であり、変異体３(アミノ酸１-１９６、図１４)からのＶＷＡ／Ｉドメイン＋(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３ リンカーをコードするＤＮＡフラグメントを、ＩｇＧヒンジおよび変異体２ｂ(アミノ酸298-531、図１４)からの定常ドメインＣγ２−Ｃγ３をコードするＤＮＡフラグメントに結合することによって構築した。
さらに、ＣＭＧ２-κは、余剰の１４個のアミノ酸を、柔軟な(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３リンカーで置換することによって修飾される。各変異体は、構成的な植物プロモーター(ＣａＭＶ３５Ｓ、または我々の選択に関する別のプロモーター)および植物の３’ポリアデニル化シグナル配列の制御下で、発現カセット中に置かれる。該発現カセットをバイナリーベクターｐＧＰＴＶ48中にクローニングし、得られるプラスミドをAgrobacterium tumefaciens 株 EHA105中に形質転換した。
表８
Figure 2009502205
最も強力な抗毒素を選択した後(マクロファージ保護アッセイを用いて)、部位特異的突然変異を行い、市販購入できるキットを用いてコドンをＧｌｎ(図１４の３８１位置で)からＡｓｎに変更する。
タバコの一過性発現系
変異体２ｂ、４、５または６の発現のためのバイナリーベクターを担持するAgrobacterium tumefaciensの株、または変異体３＋新規ＣＭＧ２κを担持する２つのAgrobacterium株を、サイレンシングウイルスサプレッサーをコードするバイナリーベクター（Ｐ１９)を担持する別の株と共に、Nicotiana benthamiana (およそ100)の葉内に浸潤させた。このサイレンシグサプレッサーは、発現の高レベルを達成するのに使用される。浸潤の後、各Agrobacteriumは、バイナリーベクターからのそのＴ−ＤＮＡを(発現カセットを含有している)植物細胞中に移入し、そこで統合されて転写される。次いで、イムノアドヘシンは、葉内において高レベルで蓄積し、これは浸潤７日後に回収され、そしてイムノアドヘシンの精製のために処理される。イン・ビトロでかつ細胞培養分析に十分量、ならびにラットのイン・ビボでの毒中和試験について十分な各少量のこれらの５つのキメラタンパク質(＜５mg)を、このタバコの一過性発現系51を用いて、短時間で産生できた。
小規模のイムノアドヘシン精製および生物物理学的特徴
タバコの葉(N. tabacum または N. benthamiana)を、均質化して、水性緩衝液中で抽出し、固形物を除き、無傷のＩｇＧ−Ｆｃ領域を有するタンパク質をタンパク質Ａ−セファロースクロマトグラフィーにより精製し、ＰＢＳで透析し、濾過滅菌した。精製タンパク質を、ヒトＩｇＧ１(またはκ鎖)に対する抗体を用いてコマジー染色および免疫ブロッティングにより特徴分析した。４つの基準を用いて、この段階で成功を評価した。最初に、タンパク質Ａで精製したキメラタンパク質は、主に１つのサイズ種を構成する。第二に、コードしたタンパク質配列と一致する見かけの分子量を有する。第三に、それは抗ＩｇＧ抗血清と反応する。第四に、それはＲＡＷマクロファージ保護アッセイにおいて、現在のＣＭＧ−ＩｇＧＶ２ｂよりも高い活性を示す。我々は、保護抗原(List Biologicaal Labs)に対するイムノアドヘシンの結合反応速度を、BIAcore (Pharmacia Biosensor)において表面プラスモン共鳴により測定し、Ｋｄを計算するために使用した。
毒性攻撃に対するマウスマクロファージの保護
毒素と共にＣＭＧ２-ＩｇＧの投与後のＲＡＷ２６４.７マウスマクロファージ様細胞(ＡＴＣＣ #ＴＩＢ−７１)の生存を、主に上記68したように決定した。ＣＭＧ２-ＩｇＧを、１０-１０００ ng/mlから力価決定し、細胞に添加する前に毒素(８０ ng/ml ＰＡ、８０ ng/ml ＬＦ)と共に３０分間予めインキュベートした。毒素への暴露３時間後、間接的な生存能アッセイを、ＭＴＴ(３-(４，５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を用いておこなった。細胞を、ＭＴＴ(２mg/ml)を含有する培地と共に３０分間インキュベートし、酸性イソプロパノール(４０ mM ＨＣｌ、９０％イソプロピルアルコール中の０.５% ＳＤＳ)を用いて可溶化し、この吸光度をＡ595で測定した。偽処理細胞と比較した場合、特定の試薬用量で毒素攻撃を生存する細胞％を、ＭＴＴアッセイ［(試験ウェルの平均−８つの毒素単独のウェルの平均)x １００％/８つの無毒ウェルの平均］にて測定したものと示す。用量応答曲線から、ＩＣ５０値(活性の５０％が中和された時点の抗毒素濃度)が推定される。また、有効モル比、またはＩＣ50での抗毒素と毒素の比率を、各キメラタンパク質について決定した。
柔軟な(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３リンカーの付加により、二量体のジスルフィド結合、またはイン・ビトロの中和活性、またはその両方において測定可能な改善をもたらした。
実施例２０：炭疽菌感染の動物モデルにおけるＣＭＧ２-ＩｇＧの抗毒素活性
この実施例は、本発明のキメラ毒素受容体タンパク質およびイムノアドヘシンを同定するために実施され得る動物試験を示す。
選択されたイムノアドヘシンのＦｃに対するＮグリカンの存在または非存在は、毒素またはB.anthracis 胞子攻撃に対してイン・ビボでの有効性に影響し得、これはＦｃ受容体との相互作用および／または抗毒素の血清半減期の差違を理由とする。アグリコシルおよびグリコシル化されたＣＭＧ２-ＩｇＧの形態の両方を、Fischerラット毒中和アッセイで試験した。これは、ウサギでの両方の形態のイン・ビボでの半減期の試験に供し、次いでウサギ胞子攻撃アッセイにおける有効性に供した。ラットのイン・ビボ毒中和アッセイには、およそ３mgの各抗毒素が必要であり、一過性タバコ形質転換から容易に供給される。ウサギの薬物動態パターンおよび胞子攻撃試験は、安定に形質転換したタバコから精製した約２００mgの各抗毒素素を必要とする。
イン・ビボでのFischerラット炭疽菌毒中和
イン・ビボでの炭疽菌毒中和実験を、ＣＭＧ２-ＩｇＧのグリコシル化された、およびアグリコシル形態を用いて、基本的にIvins69により記載されたように行った。頸静脈カテーテルを備え、２００〜２５０gの間の体重のオスのFischer 344 ラット(Charles River Laboratories)を、製造者の指示書に従ってIsofluorane ＥＺ麻酔チャンバー内で麻酔した(Euthanex Corp, PA)。抗毒素(0.25 および 0.12 nmols/ラット、致死毒素に対する1x および0.5x モル等量に対応する)の用量を、カテーテルにて0.2 ml PBS/0.1% BSA（pH 7.4）を投与した。５分後に、致死毒(0.2 ml/200 gラットにおいて、PA 20 μg / LF 4 μg)を投与した。ネガティブコントロールは、関連のない植物から生成したヒトＩｇＧ１(我々の研究室)である。各試験群(５匹の動物/群 x ２用量 x ２抗毒素素＝２０匹の動物)では５匹の動物を使用し、各群のコントロールにおいて４匹用いた(４匹の動物/群 x ２用量コントロールＩｇＧ＝８匹動物)。動物を、呼吸および心拍の停止によって評価して、不快感と生存に対する死亡時間について追跡した。ラットを、致死毒素に暴露後５時間または死亡まで麻酔下で維持し、不快感を最小にする。５時間の間生存するラットをより長い期間追跡した(７２時間まで)。血清サンプルを、生存しているラットから５時間間隔で採取し、ＥＬＩＳＡにより抗毒素濃度をアッセイした。同様の試験において、Avanir Pharmaceuticalsによって産生されたある抗体は、毒素23に対して０.５xモル等量で致死毒素のこの用量に対して全ての動物を保護した。我々は、我々が作成した植物由来のイムノアドヘシンは十分に効力を発揮すると考える。必要であれば、実験を、致死毒素に対してより低いモル比でも、イムノアドヘシンを用いて反復した。最小有効用量は、２つの抗毒素形態について決定される。
ウサギにおける薬物動態パラメーター
静脈注射経路(i.v.)によるＣＭＧ２-ＩｇＧの薬物動態（ＰＫ）を確立するために、Dutch banded rabbits (群毎に三匹、1.5〜2.0 kg)を、ＣＭＧ２-ＩｇＧを10 mg/ウサギにて内側の耳動脈を介するi.v.により注射した。血液サンプルを、注射前の１h、および１、４および８時間、および注射後１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、１７、１９および２１日目にて、各動物の耳動脈から採血した。血清を、凝固および遠心分離後に得て、−８０℃にて分析まで凍結保存した。
ウサギ血清サンプル中でＣＭＧ２-ＩｇＧの濃度を機能的ＥＬＩＳＡにより測定した。精製したＣＭＧ２-ＩｇＧを標準として使用した。保護抗原(List Biological Labs)を1 μg/mlの濃度にて、ミクロタイタープレート(Costar Corp.)のウェルに被覆し(100 μl/ウェル)、４℃で一晩インキュベートした。非結合抗原を洗い流して、該ウェルを、ＰＢＳ＋５％無脂肪乾燥ミルクを用いて１時間室温でブロキングした。このブロッキング溶液を次いで吸引した。サンプルおよび標準物を、ＰＡ被覆プレートに３７℃で１時間適用し、３回の洗浄に供した。この過程に、１時間３７℃でヤギ抗ヒトＩｇＧホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)複合体を添加し、３回洗浄する。抗体複合体を、ＨＲＰ基質を添加することによって検出し、３０分間室温でインキュベートする。発色(405 nmでの吸光度)をBenchmark Microplate Readerを用いて決定した。ＥＬＩＳＡを、ウサギの血清干渉および非特異的結合について試験した。
記述的なＰＫパラメーターを、ＣＭＧ２-ＩｇＧについて個々の血清濃度−時間のデータを基にして標準モデル非依存的方法70によって決定した。i.v投与についての投薬前の時点を、ＰＫ計算について最初の時点の濃度値に割り当てる。最高の血清濃度(Ｃｍａｘ)Ｃｍａｘ面積に達成するに要した時間、その曲線下の面積、全身性クリアランス、定常状態での分布体積、末期的半減期、および絶対的生物利用性(Ｆ)は、各ウサギについて分析される。
Bacillus anthracis胞子によるウサギのエアロゾル攻撃
モルモット29, 71, 72 マウス73-75およびウサギ76での、炭疽菌感染に対する受動保護を試験するための動物モデルが開発されてきた。マウスモデルに関する一つの利点は、かなり少ない量しか抗毒素素を要しないことである。しかし、抗ＰＡ抗体との最良の保護はウサギ24, 27において生じており、そのため我々は、このモデルを使用してＣＭＧ２-ＩｇＧを試験することを計画した。
約１６ヶ月に開始して、グリコシルおよびアグリコシルキメラ毒素受容体タンパク質の両方を、暴露前の予防試験において試験した。ウサギがこの試験で上手く保護されれば(抗毒素の最高の用量時にて１００%)、その後我々は暴露後約２１ヶ月に開始するの処理試験を行う。Dutch banded rabbits(1.5〜2 kg)を、４匹のオスと４匹のメスの動物を含む群に無作為に分けた。暴露前の予防のために、０日目にウサギに、１回用量のＣＭＧ２-ＩｇＧをi.v.投与(ＣＭＧ２-ＩｇＧの１、２または４mg/内部の耳動脈を介するウサギ)、またはコントロールとして炭疽菌胞子攻撃前の３０〜４５分間にリン酸緩衝生理食塩水(PBS) i.v.投与をうける。暴露後の効果を評価するために、ウサギを、０日目に胞子によって攻撃し、次いで胞子攻撃の２４、３６、または４８時間後一回のi.v.注射で４mgのＣＭＧ２-ＩｇＧ/ウサギを与えるか、または攻撃の４８時間後にＰＢＳi.v.注射を与えた。ウサギを、標準プロトコールに従って鼻腔部のみを暴露する系を介して攻撃した。この攻撃についての標的エアロゾル暴露は、Ames株の５０％の致死用量(ＬＤ50) (Ames ＬＤ50 ＝1.05 x 105 胞子76)の２００倍である。実際の攻撃用量は、開始濃度および暴露中に積算した１分間の容量から決定される。全ての動物を、日に２回攻撃後２８日にわたって観察した。血液および血清を、攻撃前および１、２、７、１０、１４、２１および２８日攻撃後に回収した。可能な場合、血液および血清サンプルは、瀕死の、または死亡直後(「死亡時」)の動物から回収され、B. anthracisの存在について分析される。２８日目に、全生存者を安楽死させ、肺、脾臓および胸腔内リンパ節を回収し、培養した。血清サンプルを滅菌濾過して、分析のためにPlanet Biotechnologyへ送る前に培養することによって非感染物とし、血清ＣＭＧ２-ＩｇＧレベル(as in D.2.3)およびウサギ抗ＰＡ力価(下記)を決定する。
イムノアドヘシンに応答するウサギ抗ＰＡ抗体の測定
以前の試験では、抗ＰＡモノクローナル抗体によって、吸入炭疽菌から保護されたウサギはそれら自身の抗ＰＡ抗体の保護力価を上げることが見出された。血清中のＣＭＧ２-ＩｇＧを定量するために使用したものと同様のＥＬＩＳＡを用いて、炭疽菌胞子により攻撃されたウサギでのＰＡに対する免疫応答を測定した。このアッセイにおいて、ミクロタイタープレートを１μg/mlの濃度にてＰＡを用いて被覆し、４℃で一晩インキュベートした。非結合抗原を洗浄し、ウェルをブロッキングした。次いでブロッキング溶液を吸引した。血清サンプルの希釈物を、プレート上にて１時間３７℃でインキュベートした。ヤギ抗ウサギＩｇＧＨＲＰ結合体(Santa Cruz Biotech)を３０分間３７℃で添加し、ＨＲＰ基質を添加して室温で３０分間インキュベートして発色させた。発色(405 nmでの吸光度)を、Benchmark Microplate Readerを用いて決定した。１．０の光学密度シグナルをもたらす血清希釈物を応答測定値として使用した(力価)。
実施例２１：ボツリヌス菌キメラ毒素受容体タンパク質
キメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質を、ボツリヌス菌毒素受容体を重鎖定常領域と融合することによって構築した。シナプトタグミンＩ(ＳＴＩ)ボツリヌス菌キメラ毒素受容体タンパク質およびＳＶ２ボツリヌス菌キメラ毒素受容体タンパク質を構築した。
重鎖と融合したボツリヌス菌毒素受容体
蓄積、可溶性、精製、タンパク質分解耐性、患者および標的における免疫原性を変化させるかまたはその半減期を増加させるその後の修飾、例えばＧｔ１ｂおよびＧｄ１aのようにガングリオシドと上手く相互作用する能力が必要な場合、ＳＴＩ(ｆｒａｇＳＴＩ)およびＳＶ２(ｆｒａｇＳＶ２)の一部、毒素結合のために十分なそれらアミノ酸配列を、さらなるタンパク質配列を有する重鎖定常領域と融合させた。ポリペプチドリンカー、例えば((Ｇｌｙ)ｘＳｅｒ)ｎは、ホールディングの要件およびこれらの配列の機能性を防護するために包含される。これらのポリペプチドをコードする核酸配列を至適化し、クローニングおよび形質転換中の組み換えを避け、発現の小分子ＲＮＡ媒介阻害を避けるための同義コドンの使用を包含する。
重鎖定常領域と融合したボツリヌス菌毒素受容体部分は、ｆｒａｇＳＴＩまたはｆｒａｇＳＶ２のホモおよびヘテロ多量体であり得る。ホモ多量体について、重鎖定常領域と融合したボツリヌス菌毒素受容体部分は一本のポリペプチド鎖であり、ｆｒａｇＳＴＩまたはｆｒａｇＳＶ２のいずれかの配列が２倍以上で存在する、即ちこのフラグメントの配列は一本の初期アミノ酸配列で連続して存在する。多量体化した結合フラグメントは、親和効果によって見かけの結合親和性を増加させる、即ち効力を増加させると考えられる。ヘテロ多量体について、重鎖定常領域と融合したボツリヌス菌毒素受容体部分は一本のポリペプチド鎖であり、そこではｆｒａｇＳＴＩおよびｆｒａｇＳＶ２の両方の配列が１回以上の存在する。即ち、フラグメントの配列は一本の初期アミノ酸配列で連続して存在する。直線アレイにおいて反復フラグメント配列の位置を変えて、結合親和力を増加させ、即ち効力を増加させる。
キメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質
上記したボツリヌス菌毒素受容体部分の各々を、ＩｇＧまたはＩｇＡのＦｃ領域、特に重鎖定常領域１、２および３(α１、α２、α３およびγ１、γ２およびγ３)または重鎖定常領域２および３(α２およびα３またはγ２およびγ３)のアミノまたはカルボキシ末端と融合した。重鎖定常領域のキメラもまた構築し得る。例えば定常重鎖領域γ１、γ２、α２およびα３のキメラを用いて、タンパク質Ｇアフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進させた。
軽鎖定常領域を有する改善したキメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質
上記したボツリヌス菌毒素受容体部分の各々を、上記したＩｇＧまたはＩｇＡのＦｃ領域に融合し、また別にポリペプチド鎖、軽鎖(κまたはλ)の定常領域とアミノまたはカルボキシ末端のいずれかで融合した。抗体の定常領域は、合成および細胞成熟中に四量体へと会合される、これは該重鎖および該軽鎖定常領域が、様々な定常領の間で共有および非共有結合したタンパク質−タンパク質相互作用によって標準的な様式で会合する場合である。
軽鎖定常領域および抗体可変ドメインを有する改善されたキメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質
デコイ性能を改善する結合特異性を持つ抗体可変ドメインを、ボツリヌス菌毒素受容体部分および軽鎖の定常領域と共に複合体に導入する。デコイ性能を改善するために可変ドメインの特異性の下記の型を用いた：ボツリヌス菌毒が濃縮すると知られているシナプス膜にデコイを導く抗ガングリオシド結合特異性；デコイがシナプス膜から離れて他の血清または細胞成分、例えば結合毒素の迅速な破壊を確実にするためにＦｃ媒介による排除に参加するのものに向かう結合特異性；毒素交差結合ならびに結合増加を促進するように選択され得る他の毒素のアミノ酸配列を認識する可変領域を有することによる毒素結合または広範な毒素認識を増加させる抗毒特異性。
高次構造多量体
高次構造多量体ｓＩｇＡ様融合物を、上記したポリペプチドを重鎖定常領域α２およびα３と融合することによって形成した、これはジョイニング鎖(Ｊ鎖)および分泌成分(ＳＣ)または保護タンパク質(ＰＰ)のさらなる会合を導く。
高次構造多量体を、上記したポリペプチドを、Ｊ鎖およびいくつかの(５つの)抗体様融合物のＩｇＭ様デコイ受容体への会合を可能にするＩｇＭの重鎖定常領域に融合することによって形成した。
追加文献
下記の引例は、それらが教示する全ての文献を出典明示により本明細書の一部とする。
1. Dixon, T. C., Fadl, A. A., Koehler, T. M., Swanson, J. A. & Hanna, P. C. 初期のBacillus anthracis-マクロファージ相互作用：細胞内の生存性および回避。Cell Microbiol 2, 453-63. (2000)。
2. Leppla, S. H. Anthrax toxin edema factor：真核性細胞のサイクリックＡＭＰ濃度を増加させる細菌のアデニル酸シクラーゼ。Proc Natl Acad Sci U S A 79, 3162-6. (1982).
3. Vitale, G., Pellizzari, R., Recchi, C., Napolitani, G., Mock, M. & Montecucco, C. 炭疽菌致死毒素は、培養したマクロファージにおいてＭＡＰＫＫのＮ末端を解裂して、ＭＡＰＫのチロシン/スレオニンリン酸化を誘導する。Biochem Biophys Res Commun 248, 706-11. (1998).
4. Duesbery, N. S. et al. 炭疽菌致死因子によるＭＡＰキナーゼ−kinに対するタンパク質不活性化。Science 280, 734-7. (1998).
5. Friedlander, A. M. マクロファージは酸依存性プロセスによる炭疽菌致死毒素に対して感受性である。J Biol Chem 261, 7123-6. (1986).
6. Hanna, P. C., Acosta, D. & Collier, R. J. 炭疽菌におけるマクロファージの役割。Proc Natl Acad Sci U S A 90, 10198-201. (1993).
7. Popov, S. G. et al. ネズミ炭疽菌における全身性サイトカイン応答。Cell Microbiol 6, 225-33 (2004).
8. Alibek, K. & Handelman, S. Biohazard -世界において最大の秘密生物兵器プログラムの恐るべき実話−それを行った者の内部告発 (Random House, 1999).
9. Karginov, V. A. et al. シプロフロキサシンおよびBacillus anthracisの保護抗原に対する抗体の組合による炭疽菌感染の処理。FEMS Immunol Med Microbiol 40, 71-4 (2004).
10. Joellenbeck, L. M., ZwanzＩｇＥr, L. L., Durch, J. S. & Strom, B. L. (eds.) 炭疽菌ワクチン：それは安全なのか？それは機能するのか？ (Natl. Acad. Press, Washington, DC, 2002).
11. Ivins, B. E., Welkos, S. L., Little, S. F., Crumrine, M. H. & Nelson, G. O. アジュバンドと組み合わせたBacillus anthracisの保護抗原を用いる炭疽菌に対する免疫性付与。Infect Immun 60, 662-8. (1992).
12. Hambleton, P. & Turnbull, P. C. 炭疽菌ワクチン開発：継続中の話. Adv Biotechnol Processes 13, 105-22 (1990).
13. Tan, Y., Hackett, N. R., Boyer, J. L. & Crystal, R. G. アデノウイルスを基にしたヒト化保護抗原をコードするワクチンの単回筋肉内投与後の炭疽菌致死毒素に対して誘発した保護免疫。Hum Gene Ther 14, 1673-82 (2003).
14. Galloway, D. R. & Baillie, L. 炭疽菌に対するＤＮＡワクチン。Expert Opin Biol Ther 4, 1661-7 (2004).
15. Rhie, G. E., Roehrl, M. H., Mourez, M., Collier, R. J., Mekalanos, J. J. & Wang, J. Y. bacilliおよび毒素の両方に対する保護を付与する重活性な炭疽菌ワクチン。Proc Natl Acad Sci U S A 100, 10925-30 (2003).
16. Hermanson, G. et al. 陽イオン脂質−製剤化プラスミドＤＮＡワクチンは、エアロゾル化した炭疽菌胞子に対して持続した抗体媒介性保護を付与する。Proc Natl Acad Sci U S A 101, 13601-6 (2004).
17. Watson, J., Koya, V., Leppla, S. H. & Daniell, H. タバコ、非食料/飼料作物のトランスジェニッククロロプラストにおけるBacillus anthracis 保護抗原の発現。Vaccine 22, 4374-4384 (2004).
18. Rainey, G. J. & Young, J. A. 抗毒素：生物テロに関する薬剤を標的とする新規方法。Nat Rev Microbiol 2, 721-6 (2004).
19. Artenstein, A. W. et al. クロロキンはBacillus anthracis中毒における生存率を高める。The Journal of Infectious Diseases 190, 1655-1660 (2004).
20. Shoop, W. L. et al. 炭疽菌致死因子阻害。Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7958-63 (2005).
21. Forino, M. et al. 炭疽菌致死因子の効率的な合成阻害剤。Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9499-9504 (2005).
22. Wang, F. et al. ７量体の会合を阻害することによる炭疽菌毒を中和するヒトモノクローナル抗体。Hum Antibodies 13, 105-10 (2004).
23. Sawada-Hirai, R. et al. 吸着した炭疽菌ワクチンによりワクチン投与を受けるドナーから得たモノクローナル抗体を中和するヒト抗炭疽菌保護抗原。J Immune Based Ther Vaccines 2, 5 (2004).
24. Peterson, J. W. et al. 米国微生物学会。ヒトモノクローナル抗ＰＡ抗体は完全にウサギを保護し、吸入炭疽菌に対してマウスおよびモルモットを保護する際にシプロフロキサシンと共に相乗作用する。(2005).
25. Maynard, J. A. et al. 組換え抗体フラグメントによる炭疽菌毒に対する保護は抗原親和性と相関する。Nat Biotechnol 20, 597-601 (2002).
26. Harvey, B. R., Georgiou, G., Hayhurst, A., Jeong, K. J., Iverson, B. L. & Rogers, G. K. 固定化ペリプラズム発現、Escherichia coliの発現ライブラリーからの高親和性抗体の単離物についての多用途技術。Proc Natl Acad Sci U S A 101, 9193-8 (2004).
27. Mohamed, N. et al.エアロゾル化したBacillus anthracis胞子攻撃前後に炭疽菌保護抗原に対する高親和性モノクローナル抗体がウサギを受動的に保護する。Infect Immun 73, 795-802 (2005).
28. Beebe, L. et al.第43回抗菌薬および化学療法に関する学術会議のプログラムおよび要約集 47。ウサギおよびカニクイザルにおける保護抗原に対するヒトモノクローナル抗体による吸入炭疽菌誘導性死亡率に対する保護[要約書3836]。(American Society for Microbiology, (Chicago). Washington, DC, 2003).
29. Altboum, Z., Gozes, Y., Barnea, A., Pass, A., White, M. & Kobiler, D. 炭疽菌に対する暴露後の予防法：鼻腔内感染モルモットにおける様々な処理療法の評価。Infect Immun 70, 6231-41 (2002).
30. Bradley, K. A., Mogridge, J., Mourez, M., Collier, R. J. & Young, J. A. 炭疽菌毒素についての細胞性受容体の同定。Nature 414, 225-9 (2001).
31. Scobie, H. M., Rainey, G. J., Bradley, K. A. & Young, J. A. 炭疽菌毒素受容体としてのヒト毛細血管形態形成タンパク質２の機能。Proc Natl Acad Sci U S A 100, 5170-4 (2003).
32. Liu, S. & Leppla, S. H. 細胞表面腫瘍内皮マーカー８細胞質の尾部独立性炭疽菌毒結合、タンパク質プロセシング、オリゴマー形成および内面化。J Biol Chem 278, 5227-34 (2003).
33. Rosovitz, M. J. et al. 炭疽菌毒保護抗原のドメイン４においてアラニンを精査する変異により、細胞性受容体および中和化モノクローナル抗体と結合するために重要な残基を明らかになる。J Biol Chem 278, 30936-44 (2003).
34. Lacy, D. B., Wigelsworth, D. J., Scobie, H. M., Young, J. A. & Collier, R. J. ヒト毛細血管形態形成タンパク質２のフォン・ヴィレブランド因子Ａドメインの結晶構造：炭疽菌毒素受容体。Proc Natl Acad Sci U S A 101, 6367-72 (2004).
35. Lacy, D. B., Wigelsworth, D. J., Melnyk, R. A., Harrison, S. C. & Collier, R. J. ７量体の保護抗原の構造は炭疽菌毒素受容体と結合する:ｐＨ依存性の胞子形成において受容体についての役割。Proc Natl Acad Sci U S A (2004).
36. Santelli, E., Bankston, L. A., Leppla, S. H. & Liddington, R. C. 炭疽菌毒およびその宿主細胞受容体の間の複合体の結晶構造。Nature 430, 905-8 (2004).
37. Wigelsworth, D. J., Krantz, B. A., Christensen, K. A., Lacy, D. B., Juris, S. J. & Collier, R. J. 保護抗原と、ヒト炭疽菌毒素受容体、ＣＭＧ２との相互作用に関する結合化学量論および反応速度論。J Biol Chem 279, 23349-56 (2004).
38. Scobie, H. M. & Young, J. A. 炭疽菌毒素受容体と保護抗原の間の相互作用。Curr Opin Microbiol 8, 106-12 (2005).
39. Martin, S., Casasnovas, J. M., Staunton, D. E. & Springer, T. A. キメラＩＣＡＭ−１/免疫グロブリン分子によるライノウイルスの効率的な中和および崩壊。J Virol 67, 3561-8 (1993).
40. Ober, R. J., Martinez, C., Vaccaro, C., Zhou, J. & Ward, E. S. ＭＨＣクラスＩ関連受容体、ＦｃＲｎによるＩｇＧ救出の部位および力学の可視化. J Immunol 172, 2021-2029 (2004).
41. Ma, J. et al. ヒトにおける組換え植物モノクローナル分泌抗体の特徴分析および予防的免疫治療。Nature Medicine 4, 601-606 (1998).
42. Ma, J. K. et al. 植物における分泌抗体の生成および会合。Science 268, 716-719 (1995).
43. Larrick, J. W., Yu, L., Chen, J., Jaiswal, S. & Wycoff, K. トランスジェニック植物における抗体産生。Res Immunol 149, 603-8. (1998).
44. Organisms, C. o. t. B. C. o. G. E. 6 遺伝子工学生物の生物学的制限(National Research Council, Washington, D.C., 2004).
45. Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S. & von Heijne, G. 原核生物および真核性シグナル・ペプチドの同定、およびその解裂部位の予測。Protein Engineering 10, 1-6 (1997).
46. Guerche, P., Tire, C., De Sa, F. G., De Clercq, A., Van Montagu, M. & Krebbers, E. Arabidopsis 2S Albumin 遺伝子の差示的発現および、遺伝子ファミリーサイズを増加させる効果。Plant Cell 2, 469-478 (1990).
47. Odell, J. T., Nagy, F. & Chua, N. H. カリフラワー・モザイク・ウイルス 35S プロモーターの活性を必要としたＤＮＡ配列の同定。Nature 313, 810-812 (1985).
48. Becker, D., Kemper, E., Schell, J. & Masterson, R. 左側のＴ−ＤＮＡ境界と最も近位に位置する選択可能なマーカーを有する新規植物バイナリーベクター。Plant Cell Biology 20, 1195-1197 (1992).
49. Yamamoto, Y. Y., Tsuji, H. & Obokata, J. Nicotiana sylvestris, psaDb,における遺伝子の光化学系Ｉの５'リーダーは翻訳エンハンサーを含有する。J Biol Chem 270, 12466-70 (1995).
50. Sawant, S. V., Singh, P. K., Gupta, S. K., Madnala, R. & Tuli, R. 植物における高度に発現した遺伝子内で保存されたヌクレオチド配列。Journal of Genetics 78, 123-131 (1999).
51. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. & Baulcombe, D. トマトモザイクウイルス（tomato bushy stunt virus)のp19 タンパク質による遺伝子サイレンシングの抑制を基にした植物における増強した一過性発現系。Plant J 33, 949-56 (2003).
52. Zhang, X. et al.
第43回抗菌薬および化学療法に関する学術会議のプログラムおよび要約集 277。ウサギおよびカニクイザルにおける保護抗原に対するヒトモノクローナル抗体による吸入炭疽菌誘導性死亡率に対する保護[要約書 3976]の保護抗原に対する強力なヒト中和化モノクローナル抗体の選択(American Society for Microbiology, (Chicago). Washington, DC, 2003).
53. Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V. & Jacob, U. ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント-ＦｃγRIII複合体の3.2-A 結晶構造。Nature 406, 267-73 (2000).
54. Wein, L. M. & Liu, Y. 食品供給を襲うバイオテロの分析：ミルク中のボツリヌス菌毒の症例。Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9984-9 (2005).
55. Shields, R. L. et al. ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１に対する結合部位の高解像地図およびＦｃγとの改良した結合を有するＩｇＧ1 変異体の設計。R. J Biol Chem 276, 6591-604 (2001).
56. Radaev, S. & Sun, P. D. Ｆｃγ受容体によるＩｇＧの認識。Ｆｃグリコシル化の役割およびペプチド阻害剤の結合。J Biol Chem 276, 16478-83 (2001).
57. Jefferis, R. & Lund, J. ＦｃγＲについてのヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する相互作用部位：現在のモデル。Immunol Lett 82, 57-65 (2002).
58. Dorai, H., Mueller, B. M., Reisfeld, R. A. & Gillies, S. D. アグリコシル化されたキメラマウス/ヒトＩｇＧ１抗体はいくつかのエフェクター機能を保持する。Hybridoma 10, 211-7 (1991).
59. Hand, P. H. et al. 比較の組換えキメラ抗癌腫ｍＡｂの生物学的特性および組換えアグリコシル化変異体。Cancer Immunol Immunother 35, 165-74 (1992).
60. Cabanes-Macheteau, M. et al. トランスジェニックタバコ植物で発現したマウスＩｇＧのＮグリコシル化。Glycobiology 9, 365-72 (1999).
61. Ko, K. et al. 植物誘導性抗ウイルスモノクローナル抗体の機能およびグリコシル化。Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8013-8 (2003).
62. Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. & Faye, L. トランスジェニック植物において産生した組換え医薬糖タンパク質のＮグリコシル化：植物のＮグリカンのヒト化へ。Curr Pharm Biotechnol 1, 347-54 (2000).
63. Palacpac, N. Q. et al. 植物細胞におけるヒトβ１，４-ガラクトシルトランスフェラーゼの安定な発現はＮ結合グリコシル化パターンを修飾する。Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4692-7 (1999).
64. Bakker, H. et al. トランスジェニック植物によって産生された抗体のガラクトース伸長グリカン。Proc Natl Acad Sci U S A 98, 2899-904. (2001).
65. Misaki, R., Kimura, Y., Palacpac, N. Q., Yoshida, S., Fujiyama, K. & Seki, T. ヒトβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する植物培養細胞はガラクトース伸長Ｎ結合グリカンを有する糖タンパク質を分泌する。Glycobiology 13, 199-205 (2003).
66. Pagny, S. et al. Arabidopsis β 1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性およびゴルジ体への標的化のための構造的要件。Plant J 33, 189-203 (2003).
67. Koprivova, A. et al. 植物特異的免疫原性Ｎグリカンを欠失するPhyscomitrellaの標的化ノックアウト。Plant Biotechnology Journal 2, 517-523 (2004).
68. Varughese, M., Chi, A., Teixeira, A. V., Nicholls, P. J., Keith, J. M. & Leppla, S. H. 細胞表面の抗-c-Myc 抗体により媒介されたBacillus anthracis 保護抗原-c-Myc 融合タンパク質の内在化。Mol Med 4, 87-95 (1998).
69. Ivins, B. E., Ristroph, J. D. & Nelson, G. O. 炭疽菌致死毒素に対するFischer 344匹のラットの応答に対する体重の影響. Appl Environ Microbiol 55, 2098-100 (1989).
70. Perrier, D. & Gibaldi, M. 定常状態の特定の関数を達成するための時間に対する方程式の一般的な偏差。J Pharm Sci 71, 474-5 (1982).
71. Little, S. F., Ivins, B. E., Fellows, P. F. & Friedlander, A. M. モルモットにおけるBacillus anthracis 感染に対するポリクローナル抗体による受動的保護。Infect Immun 65, 5171-5 (1997).
72. Kobiler, D., Gozes, Y., Rosenberg, H., Marcus, D., Reuveny, S. & Altboum, Z. 受動免疫性付与によって、Bacillus anthracis 胞子を用いる感染に対するモルモットの保護の効率性。Infect Immun 70, 544-60 (2002).
73. Lyons, C. R. et al. 肺炭疽のネズミモデル：播種に関する反応速度、組織病理およびマウス系統の感受性。Infect Immun 72, 4801-9 (2004).
74. Steward, J., Lever, M. S., Simpson, A. J., Sefton, A. M. & Brooks, T. J.マウスのおける全身性炭疽菌の暴露後の予防およびフルオロキノロンによる処理。J Antimicrob Chemother 54, 95-9 (2004).
75. Brossier, F., Levy, M., Landier, A., Lafaye, P. & Mock, M. 中和化モノクローナル抗体を用いることによるBacillus anthracis 保護抗原の機能分析。Infect Immun 72, 6313-7 (2004).
76. Zaucha, G. M., Pitt, L. M., Estep, J., Ivins, B. E. & Friedlander, A. M. k吸入および皮下接種により暴露されたウサギにおける実験的炭疽菌の病理. Arch Pathol Lab Med 122, 982-92 (1998).
77. Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. & Fraley, R. T. 植物への遺伝子移動のための単純かつ一般的な方法。Science 227, 1229-1231 (1985).
78. Rogers, S. G., Horsch, R. B. & Fraley, R. T. 植物への遺伝子移入：Ｔｉプラスミドベクターを用いる形質転換植物の産生。Methods Enzymol. 118, 627-640 (1986).
79. Cundell, A. 無菌方法のサポートを支援における微生物試験。Pharmaceutical Technology 28, 56-66 (2004).
80. Hariharan, M., VanNoord, T. & Greden, J. F. 血清中のニコチンおよびコチニンの経路同時決定のための高速液体クロマトグラフィー方法。Clin Chem 34, 724-9 (1988).
81. Little, S. F. et al. 致死ファクター結合および細胞モノクローナル抗体を用いるBacillus anthracisの保護抗原の受容体結合ドメインの特徴分析。Microbiology 142 (Pt 3), 707-15 (1996).
82. Baeumlein H, Wobus U, Pustell J, Kafatos FC (1986) レグミン遺伝子ファミリー： Vicia fabaのB型遺伝子および潜在的なレグミン遺伝子特異的調節エレメントの構造。Nucl. Acids Res. 14: 2707-2713
83. Becker D, Kemper E, Schell J, Masterson R (1992). 左側のＴ−ＤＮＡ境界線と最も近い位置にある選択可能なマーカーを有する新規植物バイナリーベクター。Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197.
84. Bradley K A, Mogridge J, Mourez M, Collier R J, Young J A T (2001) 炭疽菌毒素についての細胞性受容体の同定。Nature 414: 掲載前
85. Chintalacharuvu K R, Raines M, Morrison S L (1994) ヒトα鎖定常領域遺伝子配列の相違。新規組換えα２遺伝子。Journal of Immunology 152: 5299-5304
86. Crump et al. (1994)。可溶性細胞間接着分子-１(ＩＣＡＭ−１)およびキメラＩＣＡＭ−１免疫グロブリンＡ分子の比較可能な抗ライノウイルス活性。Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 38:6, p. 1425-1427
87. Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman H M (1982) ノパリンシンターゼ：転写マッピングおよびＤＮＡ配列。J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-573
88. Gielen J, De Beuckeleer M, Seurinck J, Deboeck F, De Greve H, Lemmers M, Van Montagu M, Schell J (1984)．Agrobacterium tumefaciens プラスミドｐＴｉＡｃｈ５のＴＬ−ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列。Embo J 3: 83546
89. Greve et al.(1991) EP 0468257, ヒト・ライノウイルス受容体タンパク質の多量体形態。
90. Horsch R B, Fry J E, Hoffmann N L, Eichholtz D, Rogers S G, Fraley R T (1985)．遺伝子を植物に移入するための単純かつ一般的方法。Science 227: 1229-1231
91. Ingelbrecht I, Breyne P, Vancompernolle K, Jacobs A, Van Montagu M, Depicker A (1991)トランスジェニック植物における転写妨害。Gene 109: 239-242
92. MacDonald M H, Mogen B D, Hunt A G (1991) Ｔ−ＤＮＡコードしたオクトピン合成遺伝子由来のポリアデニル化シグナルの特徴付け。Nucleic Acid Res 19: 5575-81
93. Martin et al. (1993), キメラＩＣＡＭ−１／免疫グロブリン分子によるライノウイルスの効率的な中和および分解。J. of Virology, 67:6, p. 3561-3568.
94. Mogen B D, MacDonald M H, Leggewie G, Hunt A G (1992). マメ ｒｂｃＳ遺伝子における有効なｍＲＮＡ３’末端の形成に必要な配列エレメントの幾つかの異なる型。Mol Cell Biol 12: 5406-14
95. Ni M, Cui D, Einstein J, Narasimhulu S, Vergara C E, Gelvin S B (1995). オクトピンおよびマンノピン合成遺伝子から得たキメラプロモーターの強度および組織特異性。Plant Journal 7: 661-676
96. Sawant S V, Singh P K, Gupta S K, Madnala R, Tuli R (1999). 植物において高度に発現した遺伝子に保存されたヌクレオチド配列。Journal of Genetics 78: 123-131.
97. St Croix B, Rago C, Velculescu V, Traverso G, Romans K E, Montgomery E, Lai A, RigGins G J, Lengauer C, Vogelstein B, Kinzler K W (2000) ヒト腫瘍内種細胞中に発現した遺伝子。Science 289: 1197-202.
98. Yamamoto Y Y, Tsuji H, Obokata J (1995) 翻訳エンハンサーを含有するNicotiana sylvestrisにおいて光化学系Ｉ遺伝子、psaDbの５’リーダー。J Biol Chem 270: 12466-70.
前記実施例は、本発明の様々な態様および実施形態を限定するものではなく、単なる代表例である。全て引用書類は、本発明に関連のある分野の技術者のレベルにて指標となるものである。各書類の開示内容とは、先行技術であると認められる各々が個々にその全体に導入されている場合にはその範囲まで本明細書の文献により導入される。
当業者は、本発明がその目的を実行するため、記載した目的および利点、ならびに本明細書に特有なそれらの点を得るために十分適用することは容易に理解される。好ましい実施形態を説明する記載した方法および組成物は例示的であって、本発明の範囲を限定するものとして意図しない。特定の修飾およびその他の使用は、当業者には明らかであろうし、請求の範囲に規定したような本発明の意図に含まれる。
置換および修飾を変化させて、本発明の範囲および精神から逸脱せずに本発明を行い得ることは当業者には容易に理解されるであろう。従って、かかる別の実施形態は、本発明の範囲および下記クレームの範囲内である。
明細書中に実例的に記載した本発明は、明細書に具体的に開示していないあらゆるエレメントまたは複数のエレメント、限定または複数の限定の非存在下でも実施できる。用いた用語および表現は、非限定的単語として使用される。記載された特性のあらゆる等価物をかかる用語および表現またはその一部の使用において排除する意図はない。様々な修飾が請求した本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明は、好ましい実施態様によって具体的に開示されるが、所望の実施態様、修飾および開示された本明細書の概念は、当業者によって使用され、かかる修飾および修飾は、明細書の説明および請求項によって規定されたような本発明の範囲内であると考えられると解されるべきであろう。
さらに、本発明の特性または態様がマーカッシュ形式または別の他の代替の形式に関して記載されている場合、当業者は、本発明が、その形式によりあらゆるマーカッシュ形式の個々のメンバーまたは複数メンバーのサブグループ、適切な場合には個々のメンバーの排除に関して説明されていると認識される。
その他の実施形態は請求の範囲内にある。
図１は、ベクターｐＳＳＰＨｕＡ２を示しており、このベクターにおいて、ヒトＩＣＡＭ−１の最初の５つのドメインを含有するキメラＩＣＡＭ−１分子をコードするＤＮＡとヒトＩｇＡ２ｍ(２)のＦｃ領域が融合している[配列番号；９、４８]。このベクターは、シグナル・ペプチドの発現を駆動するためのＳｕｐｅｒＭａｓプロモーターおよびヒトＩｇＡ２ｍ(２)重鎖の定常領域を含有する。ＩＣＡＭドメイン１−５をコードする配列をＰＣＲで増幅させ、シグナル・ペプチドとＣα１ドメインの間への挿入のために都合の良い制限部位（５'ＳｐｅＩおよび３'ＳｐｅＩ）を含有させる。ＥＲ保持シグナル(ＲＳＥＫＤＥＬ)[配列番号：５]をコードするＤＮＡを、構築体の発現レベルを増強するために重鎖の３'末端に付けた。 図２は、キメラＩＣＡＭ分子を示す。２Ａは、キメラＩＣＡＭ−１分子がつくられるＤＮＡ発現カセットを示す。２Ｂは、融合タンパク質の成熟形についての、シグナル・ペプチド開裂後のアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。クローニング法により導入されたアミノ酸に下線を引き、これはＩＣＡＭ−１の５細胞外ドメインとＩｇＡ２ｍ(２)重鎖のＣα１-Ｃα３ドメインとの接合部を印す。太字のＮは、１５個の潜在的なグリコシル化部位を示す。 図３は、独立的に形質転換されたタバコ・カルス（tabacco calli）におけるイムノアドヘシンの発現を示す。３Ａは、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの免疫ブロットを示す。形質転換された異なるタバコ・カルス（Ｃ)および水性抽出物（Ａｑ）を含有するサンプルをゲル上で泳動させ、ヒトＩＣＡＭの存在を調べた。分子量マーカーを表示する。参考の標準物（Ｒ)は、ヒトＩＣＡＭ（〜７５ｋＤ）とヒトＳＩｇＡ(＞＞２５０ｋＤ)との混合物(各〜７５ng）であった。３Ｂは、カルスＲｈｉ１０７−１１由来の部分精製のイムノアドヘシンの種々のフラクションを含有する非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの免疫ブロットを示す。分析された精製フラクションは、ジュース(Ｊ)、Ｇ-１００フラクション(Ｇ)、滅菌濾過済Ｇ-１００フラクション(ＳＧ)、ヒトＳiｇＡ(７５ng)およびヒトＩＣＡＭ−１(７５ng)(ＲＳ)の参照標準混合物である。ブロットは、ヒトＩＣＡＭ（〜ＩＣＡＭ)、ヒトＩｇＡ重鎖(〜α)、ヒト分泌成分(〜ＳＣ)、ヒトＪ鎖(〜Ｊ)に対する抗体で調べた。二次的に、酵素コンジュゲート抗体を、アルカリホスファターゼにより免疫陽性バンドを標識するために必要に応じ用いた。 図４は、抗ＩＣＡＭｍＡｂとの結合に対する、植物抽出物と可溶性ＩＣＡＭ−１との競合を示す酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ)の結果を示す。アッセイについて、９６ウェル・プレートを０.２５μｇ可溶性ＩＣＡＭ−１/mlで被覆した。ＩＣＡＭ−１の増加濃度は四角で示し、一定量のマウス(抗ヒトＩＣＡＭ）抗体についての接着ＩＣＡＭとの競合のために使用したカルス抽出物（Ｇ-１００由来の滅菌濾過フラクション）の増加量を丸で示す。 図５は、ＨｅＬａ細胞を死滅させるヒト・ライノウイルスを阻害するイムノアドヘシンの能力を示すアッセイ（細胞障害作用すなわちＣＰＥアッセイ）の結果を示すものである。５Ａは、ＩＣＡＭ-Ｆｃ融合物中のイムノアドヘシン(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)を含有するか、ドキソルビシンに対する抗体を含有する部分的に精製された抽出物の存在において、ＨｅＬａ細胞に対するヒト・ライノウイルスのＣＰＥを比較したアッセイの結果を示す（通常三角形および逆三角形は、イムノアドヘシンを含有する Ｒｈｉ１０７-１１由来の２種の抽出物を表す）。５Ｂは、ＨｅＬａ細胞に対するヒト・ライノウイルスのＣＰＥを、溶性ヒトＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ-Ｆｃ融合(ＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ)中のイムノアドヘシンからの抽出物の存在において、比較したアッセイの結果を示す。挿入図は、可溶性ＩＣＡＭ（１.３５μg/ml)およびＩＣ１-５Ｄ/ＩｇＡ(０.１２μg/ml；１１.３倍少ない）についてのＩＣ50の範囲を拡大スケールで示す。 図６は、１ｇの最終的イムノアドヘシンをつくるのに必要な産生についての評価を示す。この図において、１ｇのイムノアドヘシンに要する植物数、２０％収率、発現の期待レベルで、植物重量を表示する。異なるレベルのイムノアドヘシンの発現(mg/kg 新鮮重量）および全体の回収（２０％に設定）で、各植物の重量および植物の全数を、合理的な可能性の範囲（点線での四角枠）内での具体的な産生目標（１g/採取）について決定できる。必要な植物の数は、具体的な成長および再成長期間の数とは逆に減少する。期待されるバイオマス産生、時間と成長条件の関数は、採取までの時間および採取間の時間に影響を与える。この成長期間を精製スケジュールの実際に、植え付けおよび収穫する日をずらして、調整できる。 図７は、表２に挙げた各免疫グロブリン遺伝子およびタンパク質のコード配列およびアミノ酸配列を示す[配列番号：１５〜４７、および配列番号：５２〜６２]。 図８は、本発明のイムノアドヘシンの発現試験における使用のため、実施例２に記載のように、植物を形質転換するのに用いられるプラスミドの配列を示す。 図８Ａは、プラスミドＰＳＳｐＩＣＡＭＨｕＡ２についてのヌクレオチド[配列番号：９]およびタンパク質[配列番号：４８]の配列を示す。図８Ｂは、ビーン・レグミン・シグナル・ペプチドについてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列[配列番号：１０]を示す。図８Ｃは、ｐＳＨｕＪのタンパク質コード領域についてのヌクレオチド[配列番号：１１]およびアミノ酸[配列番号：５０]の配列を示す。図８Ｄは、ｐＳＨｕＳＣのタンパク質コード領域についてのヌクレオチド[配列番号：１２]およびアミノ酸[配列番号：５１]の配列を示す。図８Ｅは、プラスミドｐＢＭＳＰ−１についてのヌクレオチド配列[配列番号：１３]を示す。図８Ｆは、プラスミドｐＢＭＳＰ-１ｓｐＪＳＣ についてのヌクレオチド配列[配列番号：１４]を示す。 図９は、ＩＣＡＭ−１およびヒトＩｇＡ２についてのヌクレオチドおよびタンパク質の配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および他のヌクレオチド配列を含む。 図１０は、ＡＴＲ−ＩｇＡ２融合物(イムノアドヘシン)の全ヌクレオチド(配列番号：９８)およびアミノ酸配列(配列番号：９９)を示す。 図１１は、プラスミドｐＧＰＴＶ-kan-ocs−ＡＴＲ−ＩｇＡ２．の T-DNA 境界の間の配列(配列番号：１００)を示す。 図１２は、プラスミドpGPTV-hpt-ocs-35SJ/SCのT-DNA境界の間にある配列(配列番号：１０１)を示す。 図１３は、細胞変性効果アッセイを示す。ＩＣＡＭ−１/ＩｇＡ２(菱形)および可溶性ＩＣＡＭ−１(四角)をヒト・ライノウイルスと様々な濃度で混合し、次いでＨｅＬａ細胞に添加した。細胞死の阻害を4日目に定量した。 図１４は、ＣＭＧ２-ＩｇＧ構築体および変異体のアミノ酸配列を示す。太字のシステイン(上記配列のＣｙｓ１８５、および公開したＣＭＧ２配列３１のＣｙｓ２１８)が、ＶＷＡ／Ｉドメインの最小のアミノ酸である。下記の１４個のアミノ酸(イタリック)は、ＣＭＧ２の一部であるが、ＶＷＡ／Ｉドメインではない。標識の上記配列は、ＩｇＧ1、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３の開始部分を示す。下線配列は、ＩｇＧ１ヒンジ領域である。変異体(Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂおよびＶ３の配列)は、削除したアミノ酸を破線によって示される。太字のアミノ酸の上の数字は、配列決定したフラグメントのアミノ末端を示す(文字で示した)。 図１５は、タンパク質-Ａ精製済ＣＭＧ２-ＩｇＧおよび１ＨＩｇＧの銀染色ゲルである。レーン１および４、タンパク質サイズ標準物；レーン２、還元ＣＭＧ２-ＩｇＧ；レーン３、還元１Ｈ；レーン５＆６、２つの別の調製物由来の非還元ＣＭＧ２-ＩｇＧ；レーン７、非還元１Ｈ。組換えタンパク質サンプルはレーンあたり50 ngのタンパク質を含有する。ＣＭＧ２-ＩｇＧイムノアドヘシンおよび可能な分解産物の図解表示を右に示した。 図１６は、ＣＭＧ２-ＩｇＧおよび変異体のコマジー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１ー７は非還元条件下で泳動した。レーン８-１３は還元条件下(100 mM DTT)で泳動した。レーン１および８、元々のＣＭＧ２-ＩｇＧ；レーン２および９、Ｖ１；レーン３および１０、Ｖ２ａ；レーン４および１１、Ｖ２ｂ、レーン５および１２、Ｖ３；レーン６および１３、ＣＭＧ２-ＩｇＧ＋κ鎖；レーン７、分子量マーカー。 図１７は、サイズ溶出クロマトグラフィーによって分画した植物由来ＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂの溶出プロファイルである。タバコ植物からのタンパク質-Ａ精製済のＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ２ｂをTosoh G4000SW columnに重層し、ＰＢＳを用いて溶出した。タンパク質を280nmでの吸光度により追跡した。カラムを泳動前に分子量標準を用いて較正した。保持時間および計算分子量をプロファイルに示した。内部標準p-アミノ安息香酸(15.3分間の保持時間を有するピーク)を分離する前にサンプルに添加した。 図１８は、ＣＭＧ２-ＩｇＧ 変異体による致死毒細胞毒性の中和を示す。ＲＡＷ264.7 マウスマクロファージ様細胞を、ＰＡ＋ＬＦに加え、元々のＣＭＧ２-ＩｇＧ(四角)、ＣＭＧ２-ＩｇＧ V2b (菱形)または無関係の植物から作成したＩｇＧ(丸)のいずれかの濃度を徐々に増加させて(0〜1.25μg/ml)、暴露した。各時点は３回反復した平均である。 図１９はＣＭＧ２-ＩｇＧ V2bのモデルである。抗毒素素のホモ二量体と一分子のPAとの結合に関する仮説図。該抗毒素はＣγ３ドメイン間の非共有結合相互作用によって共に形成した場合を示すがしかし分子の一部のヒンジ領域(ＣＭＧ２およびＣγ２)内のジスルフィド結合であってもよい。直線は縮尺比を示す。構造ファイルは、タンパク質データベースからのものであり、分子画像はthe Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco (NIH P41 RR-01081によって支持される)54 からのUCSFキメラパッケージを用いて作成した。 図２０は、ＣＭＧ２-κ変異体を示す。ＣＭＧ２-κをＣＭＧ２-ＩｇＧＶ１またはＣＭＧ２-ＩｇＧ Ｖ３のいずれかを用いてN. benthamiana中で発現させ、タンパク質Ａによって精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、コマジーブルーで染色した。レーン１＆２は、非還元条件下で泳動させた。レーン３＆４は還元条件(100 mM DTT)下で泳動させる；レーン５、分子量マーカー。

Claims (84)

  1. 免疫グロブリン軽鎖の一部と会合して免疫グロブリン重鎖の一部を含む免疫グロブリン複合体；および
    該免疫グロブリン複合体と会合している第一の毒素受容体タンパク質、
    を含む、キメラ毒素受容体タンパク質。
  2. 該免疫グロブリン複合体と該第一の毒素受容体タンパク質との該会合が、該免疫グロブリン重鎖の一部と該第一の毒素受容体タンパク質との共有結合である、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  3. 該免疫グロブリン複合体と該第一の毒素受容体タンパク質との該会合が、免疫グロブリン軽鎖の一部と該第一の毒素受容体タンパク質との共有結合である、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  4. 該免疫グロブリン軽鎖と該第一の毒素受容体との間の該共有結合がリンカーを含む、請求項３記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  5. 該リンカーが(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３アミノ酸配列を含む、請求項４記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  6. 該免疫グロブリン重鎖の一部と第二の毒素受容体タンパク質との共有結合をさらに含んでいる、請求項３記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  7. 該第二の毒素受容体タンパク質が、該第一の毒素受容体タンパク質と同じアミノ酸配列を有する、請求項６記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  8. 該免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびキメラ免疫グロブリン重鎖からなる群から選択されている、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  9. 該免疫グロブリン重鎖がＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ重鎖である、請求項８記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  10. 免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域２および３を含む、請求項９記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  11. 該免疫グロブリン重鎖がＩｇＭまたはＩｇＥ重鎖である、請求項８記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  12. 該免疫グロブリン重鎖が、重鎖定常領域２、３および４を含む、請求項１１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  13. 免疫グロブリン軽鎖の該一部が軽鎖定常ドメインを含む、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  14. 該免疫グロブリン軽鎖がκ鎖またはλ鎖である、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  15. 該キメラ毒素受容体タンパク質がトランスジェニック植物で発現される、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  16. 該トランスジェニック植物が単子葉植物である、請求項１５記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  17. 該トランスジェニック植物が双子葉植物である、請求項１５記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  18. 該双子葉植物がタバコ植物である、請求項１７記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  19. 該免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖および第一の毒素受容体タンパク質がヒトタンパク質である、請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  20. 該キメラ毒素受容体タンパク質が、植物、脊椎動物または無脊椎動物から得た異種細胞中で発現されている、請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質。
  21. 該異種細胞が哺乳動物細胞である、請求項２０記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  22. 該異種細胞が毛根細胞である、請求項２０記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  23. 該異種細胞が植物組織培養細胞である、請求項２０記載のキメラ毒素受容体タンパク質。
  24. 請求項１記載の少なくとも２つのキメラ毒素受容体タンパク質を含む、イムノアドヘシン。
  25. 請求項１記載のキメラ毒素受容体タンパク質およびJ鎖を含む、イムノアドヘシン。
  26. 請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質、J鎖および分泌成分を含む、イムノアドヘシン。
  27. 該キメラ毒素受容体タンパク質が植物特異的グリコシル化を有する、請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質。
  28. 請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質および植物材料を含む、組成物。
  29. 病原体抗原の宿主細胞への結合を低下させる方法であって、該抗原を請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質と接触させること、ここで該キメラ毒素受容体タンパク質が該抗原に結合して、該病原体抗原の該宿主細胞への該結合を低下させること、
    を含む方法。
  30. 死亡率および病原体の罹患率を低下させるための方法であって、該病原体の抗原と請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質とを接触させること、ここで該キメラ毒素受容体タンパク質が該抗原に結合し、該病原体抗原の該宿主細胞への該結合を低下させ、これにより該死亡率および病原体の罹患率を低下させること、を含む方法。
  31. ヒト対象において毒素を理由とする死亡率および罹患率を低下するための方法であって、有効量の請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質を該対象に投与すること、ここで該キメラ毒素受容体タンパク質が該毒素に結合し、これにより毒性活性を低下させる、を含む方法。
  32. 請求項１のキメラ毒素受容体タンパク質および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
  33. （ａ）免疫グロブリン重鎖の一部をコードしている第一のヌクレオチド配列；
    （ｂ）免疫グロブリン軽鎖の一部をコードしている第二のヌクレオチド配列；および
    （ｃ）第一の毒素受容体タンパク質をコードしている第三のヌクレオチド配列、
    ここで、細胞性宿主における発現に際して、該免疫グロブリン重鎖、該免疫グロブリン軽鎖および該第一の毒素受容体タンパク質がキメラ毒素受容体タンパク質を形成する、
    を含む、発現ベクター系。
  34. キメラ毒素受容体タンパク質の産生方法であって、
    （ａ）一緒になると、免疫グロブリン軽鎖の一部と会合した免疫グロブリン重鎖の一部を含む免疫グロブリン複合体；および該免疫グロブリン複合体と会合している第一の毒素受容体タンパク質を発現する、１以上の発現ベクターを提供すること、
    （ｂ）１以上の該発現ベクターを細胞宿主に導入すること;そして
    （ｃ）該免疫グロブリン複合体および該第一の毒素受容体タンパク質を発現して、キメラ毒素受容体タンパク質を形成すること、
    を含む、方法。
  35. 少なくとも免疫グロブリン重鎖の一部を含む免疫グロブリン複合体；および、該免疫グロブリン複合体と会合している第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質を含む、キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質。
  36. 免疫グロブリン複合体と該第一の毒素受容体タンパク質との該会合が、該免疫グロブリン重鎖の一部と該第一の毒素受容体タンパク質との共有結合である、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  37. 該第一炭疽菌毒素受容体タンパク質が、フォンビルブランド因子タイプＡ/インテグリン挿入(ＶＷ／Ｉ)ドメインを含む、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  38. 該第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質が受容体の細胞外ドメインを含む、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  39. 該第一の炭疽菌毒素受容体が、腫瘍内皮マーカー８(ＴＥＭ８）および毛細血管形態形成タンパク質２(ＣＭＧ２)からなる群から選択される、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  40. 該第一の炭疽菌毒素受容体がＴＥＭ８である、請求項３９記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  41. 該第一の炭疽菌毒素受容体がＣＭＧ２である、請求項３９記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  42. 該第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質がプロテアーゼ感受性アミノ酸配列を欠失している、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  43. 該第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質がＣＭＧ２であり、アミノ酸残基ＴＥＩＬＥＬＱＰＳＳＶＣＶＧを欠失している、請求項４２記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  44. 該免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＡ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびキメラ免疫グロブリン重鎖からなる群から選択される、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  45. 該免疫グロブリン重鎖がＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ重鎖である、請求項４４記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  46. 該免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域２および３を含む、請求項４５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  47. 該免疫グロブリン重鎖の該一部が、重鎖定常領域１、２および３を含む、請求項４５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  48. 該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドがＩｇＭまたはＩｇＥ重鎖である、請求項４４記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  49. 該第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質と少なくとも免疫グロブリン重鎖の一部との間の該共有結合が免疫グロブリンのヒンジを含む、請求項３６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  50. 該第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質と少なくとも免疫グロブリン重鎖の一部との間の該共有結合がリンカーを含む、請求項３６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  51. 該リンカーが(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３アミノ酸配列を含む、請求項５０記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  52. 該第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質がＣＭＧ２のＶＷＡ／Ｉドメインを含んでおり、免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域１、２および３を含んでおり、該共有結合がリンカーを含んでいる、請求項３６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  53. 該炭疽菌毒素受容体タンパク質がＣＭＧ２のＶＷＡ／Ｉドメインを含んでおり、該免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域２および３を含んでおり、該共有結合がリンカーおよび免疫グロブリンヒンジを含んでいる、請求項３６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  54. 該炭疽菌毒素受容体タンパク質がＣＭＧ２のＶＷＡ／Ｉドメインを含んでおり、該免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域２および３を含んでおり、該共有結合が免疫グロブリンヒンジを含んでいる、請求項３６の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  55. 該炭疽菌毒素受容体タンパク質がＣＭＧ２のＶＷＡ／Ｉドメインを含んでおり、該免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域１、２および３を含んでおり、該共有結合がリンカーを含んでいる、請求項３６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  56. 該炭疽菌毒素受容体タンパク質がＣＭＧ２のＶＷＡ／Ｉドメインを含んでおり、該免疫グロブリン重鎖の該一部が重鎖定常領域２および３を含んでおり、該共有結合が免疫グロブリンヒンジおよびリンカーを含んでいる、請求項３６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  57. キメラ炭疽菌毒素受容体タンパク質が該炭疽菌毒素受容体タンパク質の細胞外ドメインのいずれか一部を含んでおり；そして該免疫グロブリン重鎖が少なくともＩｇＡ2重鎖の一部を含んでいる、請求項３６の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  58. 免疫グロブリン複合体が免疫グロブリン軽鎖をさらに含んでおり、ここで該免疫グロブリン軽鎖が該免疫グロブリン重鎖と会合している、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  59. 該免疫グロブリン複合体と該第一の毒素受容体タンパク質との間の該会合が免疫グロブリン軽鎖の一部と該第一の毒素受容体タンパク質との共有結合である、請求項５８記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  60. 該免疫グロブリン軽鎖と該第一の毒素受容体との間の該共有結合がリンカーを含む、請求項５９記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  61. 該リンカーが、(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３アミノ酸配列を含む、請求項６０記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  62. 該免疫グロブリン重鎖の一部と第二の毒素受容体タンパク質との共有結合をさらに含んでいる、請求項５８記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  63. 該第二の毒素受容体タンパク質が、第一の毒素受容体タンパク質と同じアミノ酸配列を有する、請求項６２記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  64. 該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質が、トランスジェニック植物内で発現される、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  65. 該トランスジェニック植物が単子葉植物である、請求項６４記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  66. 該トランスジェニック植物が双子葉植物である、請求項６４記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  67. 該双子葉植物がタバコ植物である、請求項６６記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  68. 該免疫グロブリン重鎖および第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質がヒトタンパク質である、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  69. 該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質が、植物、脊椎動物または無脊椎動物から得た異種細胞で発現される、請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  70. 該異種細胞が哺乳動物細胞である、請求項６９記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  71. 該異種細胞が毛根細胞である、請求項６９記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  72. 該異種細胞が植物組織培養細胞である、請求項６９記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  73. 請求項３５記載の少なくとも２つの炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を含む、イムノアドヘシン。
  74. 請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質およびJ鎖を含む、イムノアドヘシン。
  75. 請求項３５記載の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質、J鎖および分泌成分を含む、イムノアドヘシン。
  76. 該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質が、植物特異的グリコシル化を有する、請求項３５の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質。
  77. 請求項３５の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質および植物材料を含む組成物。
  78. 宿主細胞へのバシラス・アンスラシスの保護抗原(ＰＡ)の結合を低下させる方法であって、ＰＡと請求項３５の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質とを接触すること、ここで該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質がＰＡと結合して、ＰＡの該宿主細胞への該結合を低下させる、を含む方法。
  79. 炭疽菌感染を理由とする死亡率および罹患率を低下するための方法であって、保護抗原と請求項３５の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質とを接触させること、ここで該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質がＰＡと結合し、該宿主細胞へのＰＡの結合を低下させ、これによって炭疽菌の死亡率および罹患率を低下させる、を含む方法。
  80. ヒト対象において炭疽菌毒を理由とする死亡率および罹患率を低下するための方法であって、該対象に有効量の請求項３５の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を投与すること、ここで該炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質が保護抗原に結合して、これにより毒性活性を低下させる、を含む方法。
  81. 請求項３５の炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
  82. （ａ）免疫グロブリン重鎖の一部をコードしている第一のヌクレオチド配列；および
    （ｂ）第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質をコードしている第二のヌクレオチド配列、
    ここで、細胞性宿主中での発現に際し、免疫グロブリン重鎖の該一部および該第一炭疽菌毒素受容体タンパク質が炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を形成する、
    を含む発現ベクター系。
  83. 炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を生成するための方法であって、
    （ａ）一緒になると、免疫グロブリン重鎖の一部を含んでいる免疫グロブリン複合体、および該免疫グロブリン複合体と会合している第一の炭疽菌毒素受容体タンパク質を発現する、１以上の発現ベクターを提供すること；
    （ｂ）１以上の該発現ベクターを細胞性宿主に導入すること；および
    （ｃ）該免疫グロブリン複合体および該第一炭疽菌毒素受容体タンパク質を発現して、炭疽菌キメラ毒素受容体タンパク質を形成すること、を含む方法。
  84. 少なくとも免疫グロブリン重鎖の一部を含む免疫グロブリン複合体；および
    該免疫グロブリン複合体と会合している該第一ボツリヌス菌毒素受容体タンパク質；を含む、キメラボツリヌス菌毒素受容体タンパク質。
JP2008525193A 2005-08-02 2006-08-02 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質 Pending JP2009502205A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70482905P 2005-08-02 2005-08-02
PCT/US2006/030325 WO2007044115A2 (en) 2005-08-02 2006-08-02 Improved chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013208194A Division JP2014155484A (ja) 2005-08-02 2013-10-03 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009502205A true JP2009502205A (ja) 2009-01-29
JP2009502205A5 JP2009502205A5 (ja) 2009-09-24

Family

ID=37943267

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008525193A Pending JP2009502205A (ja) 2005-08-02 2006-08-02 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質
JP2013208194A Pending JP2014155484A (ja) 2005-08-02 2013-10-03 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013208194A Pending JP2014155484A (ja) 2005-08-02 2013-10-03 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1922329B1 (ja)
JP (2) JP2009502205A (ja)
KR (1) KR101435420B1 (ja)
CN (1) CN101277970B (ja)
AU (1) AU2006299933A1 (ja)
CA (1) CA2617877A1 (ja)
ES (1) ES2426194T3 (ja)
HK (1) HK1118836A1 (ja)
IL (1) IL189146A0 (ja)
WO (1) WO2007044115A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014155484A (ja) * 2005-08-02 2014-08-28 Planet Biotechnology Inc 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040191887A1 (en) * 2002-10-31 2004-09-30 Chapman Edwin Raymond Botulinum neurotoxin B receptors and use thereof
WO2021245580A1 (ko) * 2020-06-04 2021-12-09 주식회사 엠제이셀바이오 Pa63 도메인 4 변이체를 세포외 결합 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09508524A (ja) * 1994-02-04 1997-09-02 ジー．ディー．サール アンド カンパニー Ｉｌ−３変種造血融合蛋白
JPH11504901A (ja) * 1994-12-30 1999-05-11 プラネット・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法およびその使用
JP2002529090A (ja) * 1998-11-10 2002-09-10 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ケモカインβ−７
JP2003510073A (ja) * 1999-09-24 2003-03-18 ラージ・スケール・バイオロジー・コーポレイション 二重ドメインまたは多重ドメイン分子のための可変長および可変配列リンカー領域の作成
JP2003513271A (ja) * 1999-11-05 2003-04-08 アイシス・イノベーション・リミテッド 汎用蛍光センサー
WO2003064992A2 (en) * 2001-10-26 2003-08-07 Planet Biotechnology, Inc. Novel immunoadhesins for treating and preventing toxicity and pathogen-mediated diseases
JP2003533219A (ja) * 2000-05-18 2003-11-11 アメリカ合衆国 免疫毒素融合タンパク質及びその発現法
WO2004018698A2 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Genitrix, Llc Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE442386T1 (de) * 2000-04-28 2009-09-15 Planet Biotechnology Inc Immunoadhesin zur impfung gegen rhinovirus
GB0423974D0 (en) * 2004-10-28 2004-12-01 Ares Trading Sa Proteins
JP2009502205A (ja) * 2005-08-02 2009-01-29 プラネット・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09508524A (ja) * 1994-02-04 1997-09-02 ジー．ディー．サール アンド カンパニー Ｉｌ−３変種造血融合蛋白
JPH11504901A (ja) * 1994-12-30 1999-05-11 プラネット・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 植物における防御タンパク質を含む免疫グロブリンの製造法およびその使用
JP2002529090A (ja) * 1998-11-10 2002-09-10 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ケモカインβ−７
JP2003510073A (ja) * 1999-09-24 2003-03-18 ラージ・スケール・バイオロジー・コーポレイション 二重ドメインまたは多重ドメイン分子のための可変長および可変配列リンカー領域の作成
JP2003513271A (ja) * 1999-11-05 2003-04-08 アイシス・イノベーション・リミテッド 汎用蛍光センサー
JP2003533219A (ja) * 2000-05-18 2003-11-11 アメリカ合衆国 免疫毒素融合タンパク質及びその発現法
WO2003064992A2 (en) * 2001-10-26 2003-08-07 Planet Biotechnology, Inc. Novel immunoadhesins for treating and preventing toxicity and pathogen-mediated diseases
WO2004018698A2 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Genitrix, Llc Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012010421; Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　Ｖｏｌ．２７９　Ｎｏ．２２　Ｐａｇｅ．２３３４９-２３３５６　（２００４．０５．２８） *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014155484A (ja) * 2005-08-02 2014-08-28 Planet Biotechnology Inc 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
CN101277970A (zh) 2008-10-01
WO2007044115A2 (en) 2007-04-19
EP1922329A2 (en) 2008-05-21
CA2617877A1 (en) 2007-04-19
EP1922329B1 (en) 2013-05-29
AU2006299933A1 (en) 2007-04-19
WO2007044115A3 (en) 2007-11-29
CN101277970B (zh) 2014-05-07
JP2014155484A (ja) 2014-08-28
KR20080052566A (ko) 2008-06-11
KR101435420B1 (ko) 2014-09-25
IL189146A0 (en) 2008-08-07
ES2426194T3 (es) 2013-10-21
HK1118836A1 (en) 2009-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070118934A1 (en) Chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax
JP2010241817A (ja) 毒性および病原体が媒介する疾患を治療しかつ予防するための新規イムノアドヘシン
CA2208783C (en) Methods for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
JP2008161199A (ja) インチミンを単独で、または１以上の他の抗原との融合タンパク質として発現する宿主生物の投与による、免疫応答を刺激する方法
US20080115244A1 (en) Method for producing immunoglobulins containing protection proteins and their use
CA2720268A1 (en) Production of ospa for lyme disease control
JP5008811B2 (ja) ライノウイルス感染を防止するための免疫接着物
EP2486791A2 (en) Highly pathogenic avian influenza virus protein vaccine derived from transgenic plants, and method for preparing same
US7253341B2 (en) Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
AU2001257445A1 (en) Immunoadhesin for the prevention of rhinovirus infection
JP2014155484A (ja) 炭疽菌の処置および予防のための改良されたキメラ毒素受容体タンパクおよびキメラ毒素受容体タンパク質
US20060015969A1 (en) Novel immunoadhesins for treating and prventing toxicity and pathogen-mediated diseases
US20060172298A1 (en) Denaturat stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
AU2012261788A1 (en) Improved chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax
US20180028636A1 (en) Methods and compositions for emergency post-infection treatment of anthrax
Bailey Expression in plants and immunogenicity of a fusion protein containing an epitope from the swine transmissible gastroenteritis virus S protein
JULIAN et al. 7-1 Expressing Antibodies in Plants for Immunotherapy
AU2004201094A1 (en) Methods for Producing Immunoglobulins Containing Protection Proteins in Plants and Their Use

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090803

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090803

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120228

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120525

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120601

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120627

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120704

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120727

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120803

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120828

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20130604

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20131003