KR20080052566A - 개선된 키메라 독소 수용체 단백질 및 탄저병의 예방 및치료를 위한 키메라 독소 수용체 단백질 - Google Patents

Abstract

면역글로불린 중쇄의 적어도 일부 및 면역글로불린 경쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 복합체와 연결된 독소 수용체를 가진 키메라 독소 수용체 단백질이 기재되어 있다. 이러한 키메라 독소 수용체 단백질은 상기 경쇄를 갖지 않은 키메라 독소 수용체 단백질과 비교할 때 개선된 안정성을 가진다. 안정성이 증가된 탄저 및 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질도 기재되어 있다.

Description

개선된 키메라 독소 수용체 단백질 및 탄저병의 예방 및 치료를 위한 키메라 독소 수용체 단백질{IMPROVED CHIMERIC TOXIN RECEPTOR PROTEINS AND CHIMERIC TOXIN RECEPTOR PROTEINS FOR TREATMENT AND PREVENTION OF ANTHRAX}

관련된 출원의 상호참조

본원은 참고로 본원에 도입되는, 2005년 8월 2일자로 출원된 미국 가출원 제60/704,829호의 이익을 주장한다.

이 출원들 각각은 모든 도면 및 서열목록을 포함하는 그 전체가 참고로 본원에 도입된다.

연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술

연방 연구 지원이 연방 연구 허가 1R43AI053005-01A1의 형태로 제공되었다.

본 발명은 키메라 독소 수용체 단백질, 면역접합체(immunoadhesin), 식물로부터의 이의 제조, 및 독성 및 병원체-매개 질병의 치료 및 예방에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.

감염 및 발병기전을 매개하는 독소 및 병원체 성분에 대한 유인물(decoy)로서 작용하는 가용성 수용체 및 결합 단백질은 독성 및 다른 병원체-매개 효과를 치료하고 예방하는 유망한 수단이다.

수용체 유인물로 치료될 수 있는 증상의 한 예는 탄저 감염이다. PA(보호 항원, 탄소 독소의 한 성분)에 대한 2가지 세포-표면 수용체, 즉 종양 내피 마커 8(TEM8) 및 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2)가 동종되어 있다(참고문헌 30 및 31). 이 단백질들 둘다의 세포외 도메인의 가용성 형태는 내인성 독소 수용체를 발현하는 세포의 중독을 억제하는 것으로 밝혀졌다. TEM8의 가용성 형태는 80 nM에서 50%까지 치사 독소 작용을 억제하였다(IC₅₀ = 80 nM)(Bradley, K. A., Mogridge, J., Mourez, M., Collier, R. J. & Young, J. A. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414, 225-9 (2001)). CMG2-유래 단백질은 170 pM에서 PA에 대한 친화성을 나타내었고 마크로파지 보호 분석에서 3.1 nM(67 ng/㎖)의 IC₅₀을 나타내므로 탄저 독소 작용의 잠재적으로 강력한 억제제이다(Scobie, H. M., Rainey, G. J., Bradley, K. A. & Young, J. A. Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 5170-4 (2003); Wigelsworth, D. J., Krantz, B. A., Christensen, K. A., Lacy, D. B., Juris, S. J. & Collier, R. J. Binding stoichiometry and kinetics of the interaction of a human anthrax toxin receptor, CMG2, with protective antigen. J Biol Chem 279, 23349-56 (2004)). 세포 배양 분석에서, 가용성 CMG2 세포외 도메인은 PA와 3:1 몰비에서 50%의 치사 독소 활성을 중화시켰다(Scobie et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 5170-4 (2003)). 그러나, 활성 감염 기간 동안 혈액 중의 바실러스(bacillus)의 높은 농도 는 보호를 제공하기 위해 높은 투여량의 항독소를 필요로 할 만큼 PA의 농도가 꽤 높을 수 있음을 시사한다.

수용체 유인물로 치료될 수 있는 증상의 또 다른 예는 흔한 감기가다. 흔한 감기는 일반적으로 비교적 가벼운 질환이다. 그러나, 감기로부터 발생되는 상당한 합병증 예컨대, 중이염, 동염 및 천식 악화가 흔하다. 인간 리노바이러스(rhinoviruse; HRV)는 모든 성인 감기의 최대 50% 및 어린이 감기의 최대 25%를 야기한다(Bella and Rossmann, J Struct Biol. 128:69-74, 1999, and Sperber and Hayden, Antimicrob Agents Chemother. 32:409-19, 1988). 이로 인해 1년에 소요되는 사회적 비용이 막대하다. 이 작은 비-피복 RNA 바이러스는 피코르나바이러스(picornavirus)의 하위군을 대표하며(Rueckert, Virology, pp. 507-548, eds. Fields, et al., Raven Press, Ltd. New York, 1990), 리노 바이러스의 X-선 결정술은 직경이 300 옹스트롬이고(1 옹스트롬 = 0.1 nm) 정이십면체 대칭을 가지며 바이러스 외피(coat) 단백질 VP1, VP2 및 VP3 각각의 6개 복제물로부터 제작된 캡시드(capsid)를 확인시켜 주었다(Rossmann, Nature 317:145-153, 1985). HRV 상의 표면 함몰 또는 "협곡(canyon)"은 수용체 결합 부위로서 제시되었다(Colonno, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85:5449-5453, 1985; Rossmann, et al. Nature 317:145-153, 1985). 특징규명된 102가지 HRV 혈청형 중 91가지(주요 군으로서 공지되어 있음)는 세포내 부착 분자-I(ICAM-1)로서 공지된 세포 표면 당단백질을 그들의 수용체로서 공유하며(Greve, et al., Cell 56:839-847, 1989; Staunton, et al., Cell 56:849-853, 1989); 결합 부위는 N-말단 도메인 1 내에 위치한다(Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Staunton, et al., Cell 61:243- 254, 1990).

ICAM-1은 5개의 세포외 도메인, 소수성 경막 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 가진 막 단백질이다. ICAM-1은 면역 및 염증 반응에서 중요한 많은 세포 상에서 발현되며 다른 세포 상에서는 유도가능하다(Casasnovas, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:4134-9, 1998). ICAM-1은 백혈구 인테그린 LFA-1 및 Mac-1에 대한 리간드로서 작용한다(Springer, Cell 76:301-14, 1994; Staunton et al., Cell 61:243-254, 1990). 세포 표면 상에서, ICAM-1은 경막 도메인의 결합 때문에 주로 이량체이다(Miller, et al., J Exp Med. 182:1231-41, 1995; Reilly, et al J Immunol. 155:529-32, 1995).

5개의 세포외 도메인으로 구성된 ICAM-1의 재조합 가용성 형태(sICAM-1)는 시험관 내에서 인간 세포의 리노바이러스 감염을 차단하는 데 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다(Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, et al., Nature. 344:70-2, 1990). 광범위한 실험실 균주 및 필드 단리물(field isolates)에 대한 sICAM-1 활성의 평가는 HRV의 모든 주요 균주가 sICAM-1에 민감하다는 것을 보여주었다. 수용체로서 ICAM을 사용하지 않는 소수의 균주는 sICAM-1에 의해 영향을 받지 않았다(Crump et al., Antiviral Chem Chemother. 4:323-327, 1993; Ohlin, et al., Antimicrob Agents Chemother. 38:1413-5, 1994).

시험관 내에서 가용성 ICAM-1의 항-바이러스 활성은 하나 이상의 기작에 의해 매개되는 것으로 보인다. 이 기작들로는 결합 부위에 대한 세포-표면 ICAM-1과 의 경쟁, 바이러스 도입 또는 탈피복의 저해, 및 바이러스 RNA의 조기 방출 및 빈 캡시드의 형성에 의한 직접적인 불활성화가 있다(Arruda, et al., Antimicrob Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, et al., Nature 344:70-2, 1990; Martin et al., J Virol. 67:3561-8, 1993).

HRV의 숙주 범위는 영장류로 한정되어 있다. 최근 연구는 가용성 ICAM-1이 침팬지에서 리노바이러스 감염을 방해하는 데 효과적임을 보였다(Huguenel, et al., Am J Respir Crit Care Med. 155:1206-10, 1997). 침팬지가 임상적 증상을 보이지 않는다고 하더라도, 감염은 혈청전환 및 바이러스 전파(shedding)의 측정에 의해 입증되었다. 비강내 분무로서 투여된 단회 투여량 10 mg의 가용성 ICAM-1은 HRV와 동시에 투여되는 경우 또는 상기 바이러스가 10분 후에 투여된 경우 HRV-16의 감염을 예방하는 데 효과적이었다.

가용성 ICAM-1을 사용한 인간 임상 시험은 ICAM-1이 실험적 HRV 감기의 심각성을 경감시킨다는 것을 보여주었다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999). 이 시험에서 총 196명의 피실험체는 다양한 제제 중의 가용성 ICAM-1 또는 플라세보를 투여받았다. 일부 피실험체는 HRV 39로의 접종 7시간 전부터 가용성 ICAM-1 또는 플라세보를 투여받았고, 나머지 피실험체는 바이러스 접종 12시간 후부터 투여받았다. 약물은 7일 동안 매일 6회 투여량(1일 당 총 4.4 mg)으로 주어진 비강내 용액 또는 산제로서 투여되었다. 본 연구에서, 가용성 ICAM-1은 바이러스 단리 또는 혈청전환에 의한 측정 시 감염을 방해하지 못하였다(플라세보-처리의 경우 92% 의 감염률 대 가용성 ICAM-1 처리의 경우 85%의 감염률). 그러나, 가용성 ICAM-1은 질병의 모든 척도에 대해 영향을 주었다. 총 증상 스코어는 45%까지 감소되었고, 임상적 감기를 가진 피실험체의 비율은 23% 감소되었으며, 비강 점막 중량은 56%까지 감소되었다. 산제 사용과 용액 제제의 사용 사이, 또는 접종 전 군과 접종 후 군 사이에는 유의한 차이가 없었다. 가용성 ICAM-1을 사용한 치료는 어떠한 불리한 효과를 나타내거나 비강 점막을 통한 흡수의 증거를 나타내지 않았다. 항-HRV 유형-특이적 항체의 발생에 대한 억제도 없었다.

논의된 바와 같이, ICAM-1은 세포 표면 상에서 이량체로 존재한다. 마틴(Martin)과 그의 동료들은(Martin et al., in J Virol. 67:3561-8, (1993))은 다량체 가용성 ICAM에 의한 HRV에의 다가(multivalent) 결합이 결합친화성(avidity)으로 불리는 보다 높은 효과적인 친화성을 발생시켜, 바이러스의 탈피복을 용이하게 한다고 최초로 제안하였다. 이들은 다가 ICAM-1/면역글로불린 분자가 HRV를 중화시키는 데 있어서 일가(monovalent) 가용성 ICAM-1보다 더 효과적일 것이므로 증가된 치료적 유용성을 가질 것이라는 가정 하에 다가 ICAM-1/면역글로불린 분자를 제작하였다. 이 ICAM-1/면역글로불린 분자는 IgA1(IC1-2D/IgA), IgM(IC1-2D/IgM) 및 IgG1(IC1 -2D/IgG)의 중쇄의 힌지(hinge) 및 불변 도메인에 융합된 ICAM-1 아미노-말단 도메인 1 및 2를 포함하였다. 또한, 5개의 세포외 도메인은 IgA1(IC1-5D/IgA)에 융합되었다. 이 ICAM-1/면역글로불린 분자들은 HRV 결합, 감염성 및 입체구조의 분석에서 2개의 (sIC1-2D) 및 5개의 (sIC1-5D) 도메인을 가진 ICAM-1의 가용성 형태와 비교되었다. ICAM-1/IgA 면역글로불린(IC1-5D/IgA)은 가용성 ICAM-1 보다 200배 더 효과적이었고, ICAM-1/IgM 면역글로불린(IC1-2D/IgM) 및 ICAM-1/IgG 면역글로불린 분자(IC1-2D/IgG)는 가용성 ICAM-1보다 25배 및 10배 더 효과적이었다. 이 분자들은 리노바이러스와 세포의 결합 억제 및 바이러스 캡시드의 입체구조 파괴에 매우 효과적이었다. ICAM-1/IgA 면역글로불린 분자는 나노몰 농도 범위에서 효과적이었다. IC1-2D/IgA와 IC1-2D/IgG의 비교는 사용된 Ig 불변 영역의 클래스(class)가 효능에 큰 영향을 준다는 것을 보여주었다.

후속 연구는 9가지 주요 HRV 혈청형 및 가용성 ICAM-1에 대한 중간 정도의 내성에 대해 선별된 HRV-39의 변이체에 대한 가용성 ICAM-1 및 IC1-5D/IgA의 억제 활성을 비교하였다(Crump, et al., Antimicrob Agents Chemother. 38:1425-7, 1993). IC1-5D/IgA는 표준 혈청형에 대해 중량 기준으로 단량체 가용성 ICAM-1보다 50 내지 143배까지 더 강력하였으며, 표준 혈청형에 대해 몰 기준으로 단량체 가용성 ICAM-1보다 60 내지 170배까지 더 강력하였다. HRV-39 변이체는 야생형보다 가용성 ICAM-1에 대해 38배 더 높은 내성을 보였지만, IC1-5D/IgA에 대해서는 단지 5배 더 높은 내성을 보였다. 이는 다가 분자에 의한 억제로부터의 바이러스 회피가 단량체 가용성 수용체에 의한 억제로부터의 바이러스 회피보다 더 낮은 빈도로 일어날 것으로 예측된다는 가설과 일치한다(Martin, et al., J Virol. 67:3561-8, 1993). 바이러스 불활성화를 측정하기 위해 디자인된 분석은 HRV-39 및 HRV-13이 가용성 ICAM-1에 의해 상당한 정도까지 직접적으로 불활성화되지 않는다는 것을 보였다(감염성에서 <0.5 log.sub.1O 감소). 그러나, IC1-5D/IgA와 함께 항온처리하면 이 바이러스들의 감염성이 약 1.0 log₁₀까지 감소되었다(Crump, et al., Antimicrob Agents Chemother. 38:1425-7, 1994). 마틴과 그의 동료들(J Virol. 67:3561-8, 1993)의 결과는 결합가(valence)가 클수록, 분자의 효능이 더 높다는 것을 시사한다. IC1-2/IgM의 이량체 및 십량체 형태는 슈크로즈 구배 침강에 의해 분리될 수 있었다. 십량체 형태는 HRV와 HeLa 세포의 결합 차단에 있어서 이량체 형태보다 5배 더 효과적이었다.

효능을 보장하는 데 필요한 수용체 유인물 단백질의 양을 최소화하기 위해, 수용체 유인물의 특이적 활성 또는 효능을 훨씬 더 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 보다 높은 활성 및 개선된 약동학적 특성을 가진 강력한 유인물이 여전히 필요하다.

공지되어 있는 수용체 유인물은 어려운 제조 기법 및 이 제조 방법과 관련된 고비용을 비롯한 여러 단점을 가진다. 또한, 이 수용체 유인물들은 이 분자들이 병원체를 불활성화시킬 필요가 있는 가혹한 환경 하에 다량체로서의 한정된 안정성을 가진다. 따라서, 수율을 증가시키기 위해 증가된 안정성을 가지며 적당한 비용으로 상업적으로 적합한 부피로 제조될 수 있는 유인 기술이 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 독소 수용체가 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부 및 면역글로불린 경쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 복합체와 연결되어 있는 키메라 독소 수용체 단백질에 관한 것이다. 독소 수용체는 병원체 효과를 이끌어내거나 발휘하는 독소 또는 단백질에 결합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 키메라 독소 수용체 단백질은 경쇄가 없는 키메라 독소 수용체 단백질에 비해 개선된 안정성을 가진다. 독소 수용체와 면역글로불린 복합체 사이의 연결은 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합 또는 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 통한 것일 수 있다. 공유결합은 전형적으로 링커, 예를 들면, 유연한 폴리펩티드 서열 (Gly₃Ser)₃이다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 제1 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합뿐만 아니라 제2 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 독소 수용체 및 제2 독소 수용체는 동일한 아미노산 서열을 가지나, 다른 실시양태에서, 상기 수용체들은 상이한 서열을 가진다.

기재된 키메라 독소 수용체 단백질 내의 면역글로불린 중쇄는 임의의 종류의 중쇄, 예를 들면, IgA, IgA₁, IgA₂, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgD, IgE, IgM 또는 키메라 면역글로불린 중쇄일 수 있다. 중쇄가 IgA, IgD 또는 IgG 중쇄인 경우, 이 중쇄의 일부는 불변 영역 2 및 3일 수 있다. 별법으로, 중쇄가 IgM 또는 IgE 중쇄인 경우, 이 중쇄의 일부는 불변 영역 2, 3 및 4일 수 있다.

면역글로불린 경쇄는 바람직하게는 경쇄 불변 도메인을 포함하고 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 비롯한 식물에서 식물 게놈의 일부로서 발현된다. 담배는 발현에 바람직한 식물이다. 배양된 포유동물 세포에서의 발현과 대조적으로 식물 내에서의 발현 은 키메라 독소 수용체 단백질의 제조 비용을 상당히 감소시킨다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 키메라 독소 수용체 단백질의 제조에 사용되는 모든 단백질은 인간 단백질이다. 식물 또는 식물 세포 내에서의 생성 이외에, 본 발명은 식물, 척추동물 또는 무척추동물, 예컨대, 포유동물 세포, 모상근 세포 또는 식물 조직 배양 세포로부터 유래된 이종 세포 내에서 발현된 키메라 독소 수용체 단백질에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 독소 수용체를 비롯한 면역접합체(immunoadhesin)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 2개 이상의 키메라 독소 수용체 단백질을 포함하는 다량체이다. 다른 실시양태에서, 면역접합체는 연결(J) 쇄와 연결된 키메라 독소 수용체 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, J 쇄와 연결된 면역접합체를 포함하는 조성물은 분비 성분과 추가로 연결되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 식물-특이적 글리코실화를 가진 키메라 독소 수용체 단백질에 관한 것이다. 자신의 아미노산 서열 내에 글리코실화 신호 아스파라진-X-세린/쓰레오닌(이때, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음)을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 식물 세포 내에서 발현될 때 서열의 아스파라진 잔기에 연결된 올리고사카라이드를 통해 글리코실화된다. 글리코실화 신호로서 작용하는 폴리펩티드 서열의 일반적인 검토를 위해서는 문헌(Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) and Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974))을 참조한다. 이 신호들은 포유동물 및 식물 세포 둘다에서 인식된다. 식물 또는 식물 세포 내에서 발현된 단백질들은 이들의 성숙 말기에서 포유동물 세포 및 곤충 세포를 비롯한 다른 종류의 세포 내에서 발현된 단백질들의 글리코실화 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 가진다. 식물-특이적 글리코실화의 특징규명, 및 이것과 다른 종류의 세포 내에서의 글리코실화를 비교하는 상세한 연구는 예를 들면, 문헌(Cabanes-Macheteau et al, Glycobiology 9(4):365-372 (1999), and Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997))에 기재된 연구에서 수행된 바 있다. 이 연구진 및 다른 연구진은 식물-특이적 글리코실화가 만노즈에 β(1,2)-결합된 크실로즈를 가진 글리칸을 발생시키지만, 크실로즈는 포유동물 및 곤충 세포 내에서의 글리코실화로 인해 만노즈에 β(1,2)-결합하지 않는다는 것을 밝혔다. 식물-특이적 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,3)-결합하게 하지만, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,6)-결합하게 한다. 더욱이, 식물-특이적 글리코실화는 단백질 글리칸의 말단에 시알산을 부가시키지 못하는 반면, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화의 경우, 시알산이 부가된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 식물성 물질을 추가로 포함한다. 존재하는 식물성 물질은 식물 세포 벽, 식물 소기관, 식물 세포질, 곤충 식물 세포, 식물 종자, 생존 식물 등일 수 있다. 존재할 수 있는 구체적인 식물성 물질 또는 식물성 거대분자로는 리불로즈 비스포스페이트 카르복실라제(ribulose bisphosphate carboxylase), 집광 복합체(light harvesting complex), 색소, 2차 대사물질 또는 클로로필 및 이들의 단편이 있다. 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.001 질량% 내지 99.9 질량%의 키메라 독소 수용체 단백질 농도를 가질 수 있다. 다른 실시양 태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 물을 제외하고 0.01 질량% 내지 99 질량%의 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.01 질량% 내지 99 질량%의 농도로 존재하는 식물성 물질 또는 식물성 거대분자를 가진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 병원체 항원과 키메라 독소 수용체 단백질을 접촉시킴으로써 병원체 항원의 결합을 감소시키는 방법을 제공하는데, 이때 상기 병원체는 숙주 세포에 대한 병원성 분자, 병원체성 바이러스 또는 병원체성 세포 유기체일 수 있다. 다른 측면은 병원체의 이환율 및 치사율, 및 독소와 같은 병원성 분자로 인한 이환율 및 치사율을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 병원체 항원은 이 용어가 본원에 사용될 때 항체의 형성을 자극할 수 있거나 자극할 수 없다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄의 일부를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 면역글로불린 경쇄의 일부를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제1 독소 수용체 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 시스템을 제공하는데, 이때 숙주 세포 내에서의 발현 시 상기 면역글로불린 중쇄, 상기 면역글로불린 경쇄 및 상기 제1 독소 수용체 단백질은 키메라 독소 수용체 단백질을 형성한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄의 일부와 연결된 면역글로 불린 중쇄의 일부를 가진 면역글로불린 복합체 및 이 면역글로불린 복합체와 연결되어 있는 제1 독소 수용체 단백질을 함께 발현하는 하나 이상의 발현 벡터들을 제공하는 단계; 이 하나 이상의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 상기 면역글로불린 복합체와 상기 제1 독소 수용체 단백질을 발현시켜 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는, 키메라 독소 수용체 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 복합체와 연결되어 있는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 고려한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 탄저 독소 수용체는 본 빌레브랜트 인자 타입 A/인테그린 삽입(Von Willebrand Factor Type A/integrin inserted)(VW/I) 도메인을 가질 것이다. 전형적으로, 탄저 독소 수용체는 상기 수용체 분자의 세포외 도메인을 가질 것이다. 탄저 독소 수용체는 공지된 수용체 종양 내피 마커 8(TEM8) 및 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2)를 포함하는, 보호 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 탄저 독소 수용체는 프로테아제-감수성 아미노산 서열을 갖지 않는다. 예를 들면, 탄저 독소 수용체가 CMG2 단백질인 경우, 탄저 독소 수용체는 바람직하게는 아미노산 서열 TEILELQPSSVCVG(서열번호 102)를 갖지 않는다.

일부 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄는 모든 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 가진 IgA, IgD 또는 IgG 중쇄이다. 다른 실시양태에서, 중쇄는 중쇄 불변 영역 2 및 3만을 가진다.

탄저 독소 수용체 단백질과 면역글로불린 중쇄의 일부 사이의 공유결합은 면역글로불린 힌지 또는 임의의 종류의 링커, 바람직하게는 (Gly₃Ser)₃ 아미노산 서열을 가진 링커일 수 있다.

탄저 키메라 독소 수용체의 바람직한 실시양태는 1) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 링커에 의해 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 2) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 링커 및 면역글로불린 힌지에 의해 중쇄 불변 영역 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 3) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 면역글로불린 힌지에 의해 중쇄 불변 영역 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 4) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 링커에 의해 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 5) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 면역글로불린 힌지 및 링커에 의해 중쇄 불변 영역 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 및 6) 상기 탄저 독소 수용체 단백질의 세포외 도메인의 임의의 일부가 IgA2 중쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 중쇄와 공유결합된 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 탄저 키메라 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 복합체 내에서 면역글로불린 중쇄와 연결되어 있는 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 전술한 바와 같이, 독소 수용체와 면역글로불린 복합체 사이의 연결은 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합 또는 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 통한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 제1 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합뿐만 아니라 제2 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 독소 수용체와 제2 독소 수용체는 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 다른 실시양태에서, 상기 수용체들은 상이한 서열을 가진다.

상기 수용체 단백질 또는 이의 일부에 대한 변이체 및 변형체도 고려하되, 이러한 변형체는 독소, 독물, 병원체 또는 병원체 성분과 결합하는 상기 수용체의 능력을 파괴하지 않는다.

모든 종류의 키메라 독소 수용체 단백질에 대해 전술한 바와 같이, 탄저 키메라 독소 수용체 단백질은 식물 및 다양한 이종 세포 내에서 발현될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 키메라 독소 수용체 단백질을 제조하는 데 사용되는 모든 단백질은 인간 단백질이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 탄저 키메라 독소 수용체, 예컨대, 2개 이상의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 가진 다량체, J 쇄와 연결되어 있는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질, 및 J 쇄 및 분비 성분과 연결되어 있는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 비롯한 면역접합체를 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 식물-특이적 글리코실화를 가진 탄저 키메라 독소 수용체 단백질, 및 식물성 물질과 추가로 연결되어 있는 상기 조성물을 고려한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis)의 보호 항원(PA)을 본원에 기재된 탄저 키메라 독소 수용체와 접촉시킴으로써 PA와 숙주 세포의 결합을 감소시키거나 방해하는 방법을 특징으로 한다. 다른 측면은 탄저병의 이환율 및 치사율, 및 보호 항원으로 인한 이환율 및 치사율을 감소시키는 방법을 특징으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 탄저 키메라 독소 수용체를 포함하는 약학 조성물, 이러한 수용체 대한 발현 벡터, 및 이러한 수용체의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 상이한 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 복합체가 보툴리늄(botulinum) 독소 수용체 단백질과 연결되어 있는 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 가진 것인 키메라 보튤리늄 독소 수용체 단백질을 제공한다.

도 1은 인간 ICAM-1의 처음 5개 도메인을 함유하는 키메라 ICAM-1 분자를 코딩하는 DNA와 인간 IgA2m(2)의 Fc 영역을 코딩하는 DNA가 융합되어 있는 pSSPHuA2 벡터를 나타낸 것이다[서열번호 9 및 48]. 이 벡터는 신호 펩티드, 및 인간 IgA2m(2) 중쇄의 불변 영역의 발현을 유도하기 위한 SuperMas 프로모터를 함유한다. ICAM 도메인 1 내지 5를 코딩하는 서열은 신호 펩티드와 Cα1 도메인 사이에의 삽입을 위한 편리한 제한효소 부위(5' Spel 및 3' Spel)가 함유되도록 PCR에 의해 증폭되었다. 컨스트럭트(construct)의 발현 수준을 급격히 증가시키기 위해 ER 보유 신호(RSEKDEL)를 코딩하는 DNA[서열번호 5]가 중쇄의 3' 말단에 부가되었다.

도 2는 키메라 ICAM 분자를 나타낸 것이다. 2A는 키메라 ICAM-1 분자가 제조 된 DNA 발현 카세트를 보여준다. 2B는 신호 펩티드 절단 후 융합 단백질의 성숙 형태의 아미노산 서열을 보여준다[서열번호 8]. 클로닝 과정에 의해 도입된 아미노산은 밑줄로 표시되어 있고 ICAM-1의 5개 세포외 도메인과 IgA2m(2) 중쇄의 Cα1-Cα3 도메인 사이의 접합부(junction)를 표시한다. 굵은 글자체로 표시된 N은 15개의 잠재적 글리코실화 부위를 표시한다.

도 3은 독립적으로 형질전환된 담배 유합조직(tobacco callus) 내에서의 면역접합체의 발현을 나타낸다. 3A는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여주는데, 이때 상기 겔 상에서 상이한 형질전환 담배 유합조직(C) 및 수성 추출물(Aq)을 함유하는 샘플들이 런닝되었고 인간 ICAM의 존재에 대해 프로빙되었다. 분자량 마커가 표시되어 있으며, 기준 표준물(R)은 인간 ICAM(~75 kD)과 인간 SigA(>>250 kD)의 혼합물(각각 ~75 ng)이었다. 3B는 유합조직 Rhi107-11로부터 부분적으로 정제된 면역접합체의 다양한 분획을 함유하는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여준다. 분석된 정제 분획은 쥬스(3), G-100 분획(G), 멸균 여과된 G-100 분획(SG), 및 인간 SigA(75 ng)와 인간 ICAM-1(75 ng)의 혼합물(RS)인 기준 표준물이었다. 블롯은 인간 ICAM(~ICAM), 인간 IgA 중쇄(~α), 인간 분비 성분(~SC) 및 인간 J 쇄(~J)에 대한 항체들로 프로빙되었다. 필요에 따라 2차 효소-접합 항체를 사용하여 알칼리성 포스파타제로 면역-양성 밴드를 표지하였다.

도 4는 항-ICAM mAb에의 결합에 대해 식물 추출물과 가용성 ICAM-1 사이의 경쟁을 보여주는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 결과를 나타낸 것이다. 상기 분석을 위해, 96-웰 플레이트를 0.25 ㎍의 가용성 ICAM-1/㎖로 피복하였다. 사각형 은 증가하는 농도의 sICAM을 나타내고, 원은 일정량의 마우스(항-인간 ICAM) 항체에 대해 부착된 ICAM과 경쟁하는 데 사용된 증가량의 유합조직 추출물(G-100으로부터 멸균 여과된 분획)을 나타낸다.

도 5는 HeLa 세포의 인간 리노바이러스 사멸을 억제하는 면역접합체의 능력을 보여주는 분석(세포변성 효과 또는 CPE 분석)의 결과를 나타낸 것이다. 5A는 ICAM-Fc 융합체 내에 면역접합체(IC1-5D/IgA)를 함유하거나 독소루비신에 대한 항체를 함유하는 부분적으로 정제된 추출물의 존재 하에 HeLa 세포 상의 인간 리노바이러스의 CPE를 비교하는 분석의 결과를 보여준다. (정삼각형 및 역삼각형은 면역접합체를 함유하는, Rhi107-11로부터 유래된 2개의 추출물을 나타낸다.) 5B는 ICAM-Fc 융합체(IC1-5D/IgA) 내의 면역접합체로부터의 가용성 인간 ICAM-1 또는 추출물의 존재 하에 HeLa 세포 상의 인간 리노바이러스의 CPE를 비교하는 분석의 결과를 보여준다. 삽입도는 가용성 ICAM(1.35 ㎍/㎖) 및 IC1-5D/IgA(0.12 ㎍/㎖; 11.3 배 더 적음)에 대한 IC₅₀의 범위에서의 규모 팽창을 보여준다.

도 6은 최종 면역접합체 1 g을 제조하기 위한 제조 필수품의 평가를 보여준다. 이 도표에서, 예측된 발현 수준 및 식물 중량에서 20% 수율로 1 g의 면역접합체의 제조에 필요한 식물의 수가 기재되어 있다. 상이한 수준의 면역접합체 발현(mg/kg 생중량) 및 총 회수율(20%로 설정됨)에서, 각 식물의 중량 및 그에 따른 식물의 총 수는 타당한 가능성의 영역(점으로 표시된 사각형) 내에서 명시된 제조 표적(1 g/수거)에 대해 측정될 수 있다. 필요한 식물의 수는 명시된 성장 및 재성 장 기간의 숫자에 역으로 감소한다. 시간과 성장 조건의 함수인 예측된 생체질량(biomass) 생성은 수거 시간 및 수거 사이의 기간에 영향을 준다. 이 성장 기간은 식물을 심는 날짜와 수거하는 날짜를 교대로 엇갈리게 함으로써 정제 스케쥴의 현실성에 맞춰질 수 있다.

도 7은 표 2에 나열된 면역글로불린 유전자 및 단백질 각각의 코딩 서열 및 아미노산 서열을 보여준다[서열번호 15 내지 47 및 서열번호 52 내지 62].

도 8은 본 발명의 면역접합체의 발현 연구에 사용하기 위한, 실시예 2에 기재된 바와 같은 식물을 형질전환시키는 데 사용된 플라스미드의 서열을 보여준다.

도 8A는 플라스미드 PSSpICAMHuA2에 대한 뉴클레오티드 서열[서열번호 9] 및 단백질 서열[서열번호 48]을 보여준다.

도 8B는 콩 레구민(legumin) 신호 펩티드의 뉴클레오티드 및 단백질 서열[서열번호 10]을 보여준다.

도 8C는 pSHuJ의 단백질 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열[서열번호 11] 및 아미노산 서열[서열번호 50]을 보여준다.

도 8D는 pSHuSC의 단백질 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열[서열번호 12] 및 아미노산 서열[서열번호 51]을 보여준다.

도 8E는 플라스미드 pBMSP-1의 뉴클레오티드 서열[서열번호 13]을 보여준다.

도 8F는 플라스미드 pBMSP-1spJSC의 뉴클레오티드 서열[서열번호 14]을 보여준다.

도 9는 ICAM-1 및 인간 IgA2에 대한 뉴클레오티드 및 단백질 서열[서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8], 및 다른 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

도 10은 ATR-IgA2 융합체(면역접합체)의 전체 뉴클레오티드 서열[서열번호 98] 및 아미노산 서열[서열번호 99]을 보여준다.

도 11은 플라스미드 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2의 T-DNA 경계 사이의 서열[서열번호 100]을 보여준다.

도 12는 플라스미드 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC의 T-DNA 경계 사이의 서열[서열번호 101]을 보여준다.

도 13은 세포변성 효과 분석을 보여준다. ICAM-1/IgA2(다이아몬드)와 가용성 ICAM-1(사각형)은 인간 리노바이러스와 다양한 농도에서 혼합된 후, HeLa 세포에 첨가되었다. 세포 사멸의 억제를 4일째 날에 정량하였다.

도 14는 CMG2-IgG 컨스트럭트 및 변이체의 아미노산 서열을 보여준다. 굵은 글자체의 시스테인(상기 서열의 Cys185, 및 공개된 CMG2 서열(참고문헌 31)의 Cys218)은 VWA/I 도메인의 마지막 아미노산이다. 뒤따르는 14개의 아미노산(이탤릭체로 표시됨)은 CMG2의 일부이지만, VWA/I 도메인이 아니다. 서열 위의 표지는 IgG1 Cγ1, Cγ2 및 Cγ3의 시작 부위를 표시한다. 밑줄로 표시된 서열은 IgG1 힌지 영역이다. 변이체의 서열(V1, V2a, V2b 및 V3)은 결실된 아미노산을 나타내는 대시(-)로 표시되어 있다. 굵은 글자체의 아미노산 위의 숫자는 (문맥 내에 기재된) 시퀀싱된 단편의 아미노 말단을 나타낸다.

도 15는 단백질-A 정제된 CMG2-IgG 및 1H IgG의 은-염색 겔이다. 레인 1 및 4는 단백질 크기 표준물이고; 레인 2는 환원된 CMG2-IgG이며; 레인 3은 환원된 1H이고; 레인 5 및 6은 2개의 분리된 표본으로부터의 비-환원된 CMG2-IgG이며; 레인 7은 비-환원된 1H이다. 재조합 단백질 샘플은 레인 당 50 ng의 단백질을 함유한다. CMG2-IgG 면역접합체 및 가능한 분해 생성물을 나타내는 밑그림은 우측에 나타나 있다.

도 16은 CMG2-IgG 및 변이체의 코마시에-염색 SDS-PAGE이다. 레인 1 내지 7은 비-환원 조건 하에 런닝되었다. 레인 8 내지 13은 환원 조건(100 mM DTT) 하에 런닝되었다. 레인 1 및 8은 본래의 CMG2-IgG이며; 레인 2 및 9는 V1이고; 레인 3 및 10은 V2a이고; 레인 4 및 11은 V2b이며; 레인 5 및 12는 V3이고; 레인 6 및 13은 CMG2-IgG + 카파 쇄이고; 레인 7은 분자량 마커이다.

도 17은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분획화된, 식물-유래의 CMG2-IgG V2b의 용출 프로파일이다. 담배 식물로부터 정제된 단백질-A-정제 CMG2-IgG V2b를 토소(Tosoh) G4000SW 컬럼에 가하고 PBS로 용출하였다. 단백질을 280 nm에서의 흡광도로 모니터링하였다. 컬럼을 런닝 전에 분자량 표준물로 보정하였다. 체류 시간 및 산출된 분자량은 프로파일 상에 표시되어 있다. 내부 표준물 p-아미노벤조산(15.3분의 체류시간에서의 피크)은 분리 전에 샘플에 첨가되었다.

도 18은 CMG2-IgG 변이체에 의한 치사 독소 세포독성의 중화를 보여준다. RAW 264.7 마우스 마크로파지-유사 세포는 PA + LF 및 증가하는 농도(0 내지 1.25 ㎍/㎖)의 본래의 CMG2-IgG(사각형), CMG2-IgG V2b(다이아몬드) 또는 관련없는 식물-제조 IgG(원형)에 노출된다. 각 점은 3회 반복실험의 평균이다.

도 19는 CMG2-IgG V2b의 모델이다. 한 PA 분자와 연결된 항독소의 동종이량체를 가상적으로 도시한 것이다. 상기 분자의 일부(CMG2와 Cγ2 사이)에 있는 힌지 영역 내에 하나의 이황화 결합이 있을 수 있을지라도, 상기 항독소는 Cγ3 도메인 사이의 비공유 상호작용에 의해 서로 연결된 상태로 도시되어 있다. 막대는 크기를 표시한다. 구조 파일은 단백질 데이타 베이스로부터 얻은 것이며, 분자 그래픽적 이미지는 샌 프란시스코 소재의 캘리포니아 대학에 있는 리소스 포 바이오컴퓨팅, 비쥬얼라이제이션 앤드 인포매틱스(Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatic)(NIH P41 RR-01081로부터 지원받음(참고문헌 54)) 로부터 얻은 UCSF 키메라 팩키지를 사용하여 생성하였다.

도 20은 CMG2-카파 변이체를 보여준다. CMG2-카파는 CMG2-IgG V1 또는 CMG2-IgG V3을 가진 니코티아나 벤싸미아나(N. benthamiana)에서 발현되었고 단백질 A에의해 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하여 코마시에로 염색하였다. 레인 1 및 2는 비-환원 조건 하에 런닝되었다. 레인 3 및 4는 환원 조건(100 mM DTT) 하에 런닝되었고, 레인 5는 분자량 마커이다.

표의 간단한 설명

표 1은 ICAM-1의 5개 세포외 도메인의 경계를 나열한 것이다.

표 2는 면역글로불린 중쇄 유전자들 및 이 유전자들에 의해 코딩된 단백질들의 유전자은행(Genbank) 검색 번호를 보여준다.

표 3은 다른 키메라 리노바이러스 독소 수용체 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있는 ICAM-1 상동성을 가진 분자의 예의 목록을 제공한다.

표 4는 공지된 보툴리늄 수용체 및 추정되는 결합 도메인을 보여준다.

표 5는 실시예 9에서 수행된 무작위 리노바이러스 챌린지 연구에 대한 연구 디자인을 보여준다.

표 6은 실시예 16에 기재된 바와 같은, 일시적으로 형질감염된 니코티아나 벤싸미아나 잎에서의 키메라 탄저 독소 수용체 생성을 보여준다.

표 7은 실시예 18에 있어서 산출된 IC₅₀ 및 이 IC₅₀에서의 항독소와 PA의 몰비를 보여준다.

표 8은 실시예 19에 있어서 다양한 CMG-IgG 키메라 변이체의 구조를 보여준다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 하기 약어 및 용어들은 하기 정의를 포함하지만 반드시 하기 정의로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., (1987)); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); M. J. MacPherson, et al., eds. Pcr 2: A Practical Approach (1995); Harlow and Lane, eds, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), and H. Jones, Methods In Molecular Biology vol. 49, "Plant Gene Transfer And Expression Protocols" (1995)]을 참조한다.

면역접합체: 면역글로불린 불변 영역의 일부에 융합된 키메라 독소 수용체 단백질 분자를 함유하고 경우에 따라 분비 성분 및 J 쇄를 함유하는 복합체.

키메라 독소 수용체 단백질: 독소 수용체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부, 및 면역글로불린 복합체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부를 가진 독소 수용체-기재 단백질.

독소 수용체: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 키메라 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성을 가지면서 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는, 본원에서 정의된 바와 같은 병원체 항원, 독소, 또는 임의의 단백질, 지단백질, 당단백질, 폴리사카라이드 또는 리포폴리사카라이드에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 독소 수용체는 바이러스 부착 수용체, 예컨대, ICAM-1, 인간 리노바이러스에 대한 수용체, 또는 박테리아 독소에 대한 수용체, 예컨대, 탄저 보호 항원에 대한 수용체들 중 하나 또는 보툴리늄 독소일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 독소 수용체는 최소한 독소/병원체 성분의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이지만 경우에 따라 하나 이상의 추가 폴리펩티드도 포함할 수 있다.

면역글로불린 분자 또는 항체: 서로 공유 커플링되어 있으며 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 중쇄와 면역글로불린 경쇄의 면역학적 활성 부위를 함유하는 폴리펩티드 또는 다량체 단백질. 면역글로불린 또는 항체 분자는 IgM, IgD, IgG, IgA, 분비 IgA(SIgA) 및 IgE와 같은 여러 종류의 분자를 포함하는 큰 분자 족(family)이다.

면역글로불린 복합체: 면역글로불린 중쇄의 일부 또는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 일부 둘다를 포함할 수 있는 폴리펩티드 복합체. 상기 두 성분은 이황화 결합과 같은 공유결합을 비롯한 다양한 상이한 수단을 통해 서로 연결될 수 있다.

면역글로불린 중쇄의 일부: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 본원에서 기재된 바와 같은 키메라 독소 수용체 단백질에 대해 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 부여하는 데 필요한 중쇄의 영역을 말한다: 다량체화 능력, 이펙터(effector) 기능, 단백질 G 또는 A에 의해 정제되는 능력, 또는 개선된 약동학적 성질. 전형적으로, 이것은 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.

면역글로불린 경쇄의 일부: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 전술된 키메라 독소 수용체 단백질의 안정성을 증가시켜 생성 수율을 증가시키는 데 필요한 경쇄의 영역을 말한다. 전형적으로, 이것은 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.

중쇄 불변 영역: 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드. 전형적으로, IgG, IgD 및 IgA 면역글로불린 중쇄는 그의 천연 형태에서 하나의 가변 영역에 연결된 3개의 불변 영역을 함유한다. IgM 및 IgE는 하나의 가변 영역에 연결된 4개의 불변 영역을 함유한다. 본원에 기재된 바와 같이, 불변 영역은 가변 도메인에 인접한 영역으로부터 순차적으로 번호가 매겨져 있다. 예를 들면, IgG, IgD 및 IgA 중쇄에서, 상기 영역들은 다음과 같이 지칭된다: 가변 영역, 불변 영역 1, 불변 영역 2 및 불변 영역 3. IgM 및 IgE의 경우, 상기 영역들은 다음과 같이 지칭된다: 가변 영역, 불변 영역 1, 불변 영역 2, 불변 영역 3 및 불변 영역 4.

키메라 면역글로불린 중쇄: 상이한 이소타입 또는 서브타입의 면역글로불린 중쇄, 또는 일부 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 유래의 중쇄. 전형적으로, 키메라 면역글로불린 중쇄는 면역글로불린 중쇄의 2가지 이상의 상이한 이소타입 또는 서브타입으로부터 유래된 아미노산 잔기 서열을 가진다.

J 쇄: 면역글로불린의 중합, 및 내피 세포를 통한 중합된 면역글로불린의 수송에 관여하는 폴리펩티드. 문헌[The Immunoglobulin Helper: The J Chain in Immunoglobulin Genes, at pg. 345, Academic Press (1989)]을 참조한다. J 쇄는 오량체 IgM 및 이량체 IgA에서 발견되며, 전형적으로 이황화 결합을 통해 부착된다. J 쇄는 마우스 및 인간 둘다에서 연구되어 있다.

분비 성분( SC ): 면역글로불린을 불활성화제로부터 보호하여 분비 면역글로불린의 생물학적 효능을 증가시키는 것을 보조하는 분비 면역글로불린의 성분. 분비 성분은 마우스 또는 인간을 비롯한 임의의 포유동물 또는 설치류로부터 유래될 수 있다.

링커: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 재조합적으로 제조된 폴리펩티드의 폴딩(folding) 및 안정성을 촉진하는 데 사용되는 임의의 폴리펩티드 서열을 말한다. 바람직하게는, 이 링커는 유연한 링커, 예컨대, (Gly₃Ser)₃ 또는 (Gly₄Ser)₃과 같은 폴리펩티드 서열로 구성된 것이다.

형질전환 식물: 유전적으로 개조된 식물 또는 유전적으로 개조된 식물의 자손. 형질전환 식물은 통상적으로 하나 이상의 관련없는 유기체, 예컨대, 바이러스, 또 다른 식물 또는 동물로부터 유래된 물질을 함유한다.

단자엽 식물: 그 배아가 하나의 자엽 또는 떡잎을 가진 화초 식물. 단자엽 식물의 예로는 백합; 해수; 옥수수; 귀리, 밀 및 보리를 포함하는 곡류; 난초; 붓꽃; 양파 및 종려나무가 있다.

쌍자엽 식물: 그 배아가 2개의 떡잎 또는 자엽을 가진 화초 식물. 쌍자엽 식물의 예로는 담배; 토마토; 자주개자리를 포함하는 콩류; 귀리; 단풍나무; 장미; 민트; 호박; 데이지; 호두나무; 선인장; 제비꽃; 및 미나리아재비가 있다.

글리코실화: 올리고사카라이드에 의한 단백질의 변형. 글리코실화 신호로서 작용하는 폴리펩티드 서열의 일반적인 검토를 위해서는 문헌(Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) and Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974))을 참조한다. 이 신호는 포유동물 및 식물 세포 둘다에서 인식된다.

식물-특이적 글리코실화: 포유동물 또는 곤충 세포에서 제조된 단백질에서 발견되는 것과 상이한, 식물-발현 단백질 상에서 발견되는 글리코실화 패턴. 식물 또는 식물 세포에서 발현된 단백질은 포유동물 세포 및 곤충 세포를 비롯한 다른 종류의 세포에서 발현된 단백질과 상이한 글리코실화 패턴을 가진다. 식물-특이적 글리코실화를 특징규명하고 이를 다른 종류의 세포에서의 글리코실화와 비교하는 상세한 연구는 문헌[Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4):365-372 (1999), Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38:31-48 (1998) and Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997)]의 저자들에 의해 수행된 바 있다. 식물-특이적 글리코실화는 만노즈에 베타(1,2)-결합된 크실로즈를 가진 글리칸을 발생시킨다. 포유동물 또는 곤충 글리코실화는 만노즈에 베타(1,2)-결합된 크실로즈를 발생시키지 않는다. 식물은 글리칸의 말단에 결합된 시알산을 가지지 않는 반면, 포유동물 세포는 글리칸의 말단에 결합된 시알산을 가진다. 또한, 식물-특이적 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 알파(1,3)-결합하게 하지만, 포유동물 세포에서의 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 알파(1,6)-결합하게 한다.

병원체 항원: 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는 임의의 분자, 예를 들면, 독소. 병원성 항원은 항체의 형성을 자극할 수 있거나 없다.

탄저 독소 수용체: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용할 수 있도록 작용하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 보호 항원(PA)(바실러스 안쓰라시스가 숙주 세포를 파괴하기 위해 사용하는 3개의 상호작용 단백질들 중 하나)에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 2가지 내인성 세포 탄저 독소 수용체가 당업계에서 동정되어 있다: 탄저 독소 수용체/종양 내피 마커 8(ATR/TEM8) (Bradley et al., 2001) 및 모세혈관 형태형성 인자 2(CMG2)(Scobie et al., 2001). 이 ATR들의 세포외 도메인은 후술된 VWA/I 도메인을 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같은 탄저 독소 수용체는 최소한 PA의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이지만, 하나 이상의 추가 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 탄저 독소 수용체 코딩 서열 내로 스플라이싱됨으로써 발생될 수 있는 하나 이상의 추가 폴리펩티드(예를 들면, 수용체 유인물로서의 탄저 독소 수용체의 용도를 개선시키는 폴리펩티드)를 경우에 따라 포함할 수도 있다.

VWA /I 도메인: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 2가지 공지된 탄저 독소 수용체인 TEM8 및 CMG2의 세포외 도메인 내의 도메인이며 PA와 상기 수용체의 적절한 결합에 필수적인 금속 이온-의존성 부착 부위(MIDAS)를 함유하는 것으로 생각되는 통상적으로 인테그린 삽입 도메인(I 도메인)으로도 지칭되는 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인(VWA 도메인)을 지칭한다.

키메라 탄저 독소 수용체 단백질: 탄저 독소 수용체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부, 및 면역글로불린 복합체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부를 가진 탄저 독소-수용체 기재 단백질. 상기 면역글로불린 복합체는 면역글로불린 중쇄의 일부만을 함유할 수 있거나, 중쇄의 일부 및 경쇄의 일부 둘다를 함유할 수 있다.

보툴리늄 독소 수용체: 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 보툴리늄 독소에 결합하는 임의의 폴리펩티드.

유효량: 본 발명의 면역접합체의 유효량은 바이러스 또는 박테리아 감염(경우에 따라 가능함), 세포독성 또는 복제를 검출가능하게 억제하거나; 감염의 심각도 또는 감염 기간을 감소시키는 데 충분하다.

컨스트럭트 또는 벡터: 표적 식물 조직 또는 세포 내로 전달될 인공적으로 조립된 DNA 절편. 전형적으로, 컨스트럭트는 특별히 관심있는 유전자 또는 유전자들, 마커 유전자 및 적절한 조절 서열을 포함할 것이다. 용어 "플라스미드"는 자발적으로 자가-복제할 수 있는 염색체외 DNA 분자를 지칭한다. 적합한 조절 요소를 함유하는 플라스미드 컨스트럭트는 "발현 카세트"로도 지칭된다. 바람직한 실시양태에서, 플라스미드 컨스트럭트는 검색 또는 선별가능한 마커 예컨대, 항생제 내성 유전자도 함유한다.

선별가능한 마커: 선별 배지 상의 형질전환 조직의 성장을 허용하는 생성물을 코딩하는 유전자. 선별가능한 마커의 비-제한적 예로는 항생제 내성에 대해 코딩하는 유전자, 예를 들면, 앰피실린, 가나마이신 등이 있다. 다른 선별가능한 마커는 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

안정성이 개선된 키메라 독소 수용체 단백질

본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 독소 수용체를 가진다. 독소 수용체 단백질은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘다와 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단독으로 존재하거나 분비 성분과 연결되어 있는 J 쇄는 키메라 독소 수용체 단백질과 연결되어 면역접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진다.

이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질은 수용체의 다결합가로 인한 보다 높은 활성, 면역글로불린 Fc의 이펙터 기능, Fc로 인한 개선된 약동학적 성질, 및 식물에서 제조될 때 보다 낮은 제조 비용을 포함하는, 기존 단일클론 항체 또는 수용체 유인물-기재 예방법 또는 치료법에 비해 상당한 이점을 가질 것이라고 생각된다.

다결합가의 이점은 인간 ICAM-1의 세포외 도메인과 면역글로불린 중쇄의 융합체에 의해 입증된 바 있다(Martin, S., Casasnovas, J. M., Staunton, D. E. & Springer, T. A. Efficient neutralization and disruption of rhinovirus by chimeric ICAM-1 /immunoglobulin molecules. J Virol 67, 3561-8 (1993)). ICAM-1은 흔한 감기 바이러스인 인간 리노바이러스(HRV)에 대한 세포-표면 수용체이다. 키메라 면역접합체는 HRV와 세포의 결합을 억제하고 바이러스 캡시드의 구조를 파괴하는 데 있어서 가용성 ICAM-1보다 훨씬 더 효과적이다(Martin et al. J Virol 67, 3561-8 (1993)). HRV의 세포변성 효과로부터 세포를 보호하는 데 있어서 가용성 ICAM-1의 특이적 활성보다 10배 더 높은 활성을 가진 ICAM-1/IgA2 키메라(RhinoRx)는 형질전환 담배 내에서 발현된다.

Fc 영역의 존재는 면역글로불린 이펙터(effector) 기능, 예컨대, 보체의 존재 하에 세포의 특이적 용해를 매개하는 능력을 부여해야 한다. 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 도메인은 그 도메인을 함유하는 특정한 분자에게 항체 이펙터 기능으로서 공지된 다양한 성질을 부여한다. 예시적 이펙터 기능으로는 보체 고정, 태반 전달, 스타필로코칼 단백질에의 결합, 스트렙토코칼 단백질 G에의 결합, 단핵 세포, 호중구 또는 비만 세포 및 호염기구에의 결합이 있다. 특정한 도메인 및 특정한 면역글로불린 이소타입과 이들 이펙터 기능들의 관련성은 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Immunology, Roitt et al., Mosby St. Louis, Mo. (1993 3rd Ed.))에 기재되어 있다.

또한, FcRn과 Fc의 결합은 면역접합체가 순환계 내에서 훨씬 더 오래 지속되도록 해야 한다(Ober, R. J., Martinez, C., Vaccaro, C., Zhou, J. & Ward, E. S. Visualizing the Site and Dynamics of IgG Salvage by the MHC Class I-Related Receptor, FcRn. J Immunol 172, 2021-2029 (2004)). 이로 인해 항독소는 예방제로서 사용될 수 있다.

숙주 세포, 숙주 조직 또는 숙주 유기체, 식물 세포, 식물 조직 또는 온전한 식물 내에서 제조되는 경우, 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체 분자 또는 복합체의 생산성의 증가는 분자의 수율을 높이고 가공처리될 때 제조 비용을 낮춘다. 이러한 보다 높은 생산성은 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체 또는 면역접합체 복합체를 구성하는 쇄의 제조에 있어서의 보다 높은 효율, 및/또는 면역접합체 복합체의 조립의 보다 높은 효율의 결과일 수 있다. 특히, 면역글로불린 중쇄의 일부 및 경쇄의 일부 둘다를 포함하는 키메라 독소 수용체 단백질 또는 면역접합체의 경우, 정제된 또는 부분적으로 정제된 면역접합체의 활성 수준의 외관상 증가는 면역접합체를 구성하는 쇄의 이용률의 증가 및/또는 상기 복합체의 조립에서의 보다 높은 효율, 및/또는 수용체의 다결합가 또는 상기 모든 것의 조합 때문일 수 있다.

당업자는 필요에 따라 기능 및 안정성을 개선시키기 위해 필요에 따라 프로테아제-감수성 도메인이 제거되고 링커가 포함되도록 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질을 변형시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으나, 이러한 변형의 정확한 성질(예를 들면, 어떤 도메인을 제거할 것인지, 링커의 길이 및 위치)은 선험적으로 공지되어 있지 않다.

독소 수용체

독소 수용체는 키메라 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는 병원체 항원, 독소 또는 임의의 단백질에 결합하는 임의의 폴리펩티드이다. 예를 들면, 항바이러스 또는 항박테리아 실시양태에서, 관심있는 바이러스, 박테리아들 또는 박테리아 또는 이들의 하위성분, 예컨대, 바이러스 또는 박테리아가 그의 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는 과정을 개시하기에 필요한, 상기 바이러스 또는 박테리아에 의해 제조된 단백질에 결합하기에 효과적인 하나 이상의 수용체 단백질이 사용된다. 이러한 수용체 단백질은 많이 공지되어 있고 과도한 실험을 수행하지 않고 당업자에 의해 본 발명의 적당한 측면에서 사용될 수 있다.

독소 수용체의 한 예는 인간 리노바이러스에 대한 수용체인 ICAM-1이다. ICAM-1에 대한 뉴클레오티드 서열은 문헌(Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988); Greve, et al. Cell 56:839-847 (1989); Greve, et al., J. Virology 65:6015-6023 (1991); Staunton, et al., Cell, 61 :243-254 (1990))의 저자들에 의해 결정되고 특징규명되었으며, 서열번호 3 및 유전자은행 검색 번호 M24283에 기재되어 있다. ICAM-1 분자는 5개의 세포외 도메인, 소수성 경막 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 가진 막 단백질(서열번호 1 및 2)이다. 이 특징들은 문헌(Casasnovas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:4134-4139 (1998) and Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988))에 기재되어 있다.

기재된 키메라 독소 수용체 단백질에서 사용된 독소 수용체는 전체 독소 수용체일 수 있거나, 키메라 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성을 부여하기에 충분한 독소 수용체의 일부일 수 있다.

예를 들면, 독소 수용체가 ICAM-1인 경우, 본 발명의 적당한 측면에서 구체적으로 사용되는 것은 인간 리노바이러스의 결합을 담당하며 N-말단 도메인 1 및 2에 편재되어 있는 ICAM-1 분자의 도메인이다(Greve, et al., J. Virol., 65:6015-6023 1991, and Staunton, et al., Cell, 61:243-245 1990). ICAM-1 분자의 세포외 도메인 1, 2, 3, 4 및 5의 임의의 조합물을 포함하는 리노바이러스 수용체 단백질의 일부도 고려된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 리노바이러스 수용체 단백질의 일부는 ICAM-1 분자의 도메인 1 및 2를 포함하며, 다른 바람직한 실시양태에서, ICAM-1 분자의 도메인 1, 2, 3, 4 및 5가 존재한다.

ICAM-1의 5개 세포외 도메인의 경계는 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌(Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988))에 기재되어 있다. 서열번호 2에 있어서 대략적인 도메인 경계는 하기 표 1에 나타나 있다:

ICAM-1 도메인	아미노산
1	1-88
2	89-105
3	106-284
4	285-385
5	386-453

본 발명의 일부 측면 및 실시양태에서 사용된 바와 같이, ICAM-1 도메인 1은 약 잔기 1부터 약 잔기 88까지이고; 도메인 2는 약 잔기 89부터 약 잔기 105까지이며; 도메인 3은 약 잔기 106부터 약 잔기 284까지이고; 도메인 4는 약 잔기 285부터 약 잔기 385까지이고; 도메인 5는 약 잔기 386부터 453까지이다. 당업자는 이들 도메인의 정확한 경계가 달라질 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명에서 사용될 탄저 수용체 및 적합한 도메인은 "탄저 키메라 독소 수용체"라는 표제의 단락에 보다 상세히 기재되어 있다.

본 발명에 사용될 보툴리늄 수용체 및 적합한 도메인은 "보툴리늄 키메라 독소 수용체"라는 표제의 단락에 보다 상세히 기재되어 있다.

면역글로불린 복합체

면역글로불린 복합체는 면역글로불린 중쇄의 일부 또는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 둘다의 일부를 포함할 수 있다. 상기 두 성분은 이황화 결합과 같은 공유결합을 비롯한 다양한 상이한 수단을 통해 서로 연결될 수 있다. 면역글로불린 복합체는 하나 이상의 독소 수용체 단백질과 연결되어 있다. 연결은 공유결합, 이온성 상호작용, 수소결합, 이온결합, 반 데르발스 힘, 금속-리간드 상호작용 또는 임의의 다른 종류의 상호작용을 통해 이루어질 수 있다.

면역글로불린 중쇄

키메라 독소 수용체 단백질은 부착된 탄저 수용체 단백질을 다량체화하는 능력, 항체 이펙터 기능, 식물에서 키메라 단백질을 안정화시키는 능력, 단백질 A 또는 G에 의해 정제되는 능력 또는 약동학적 성질을 개선시키는 능력을 부여하기에 충분한 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 함유한다.

이 성질들은 중쇄의 불변 영역에 의해 부여된다. 키메라 독소 수용체 단백질이 면역글로불린 중쇄만을 함유하는 경우, 면역글로불린 복합체 내의 중쇄의 일부는 바람직하게는 적어도 도메인 CH2 및 CH3을 함유하고, 보다 바람직하게는 CH2 및 CH3만을 함유한다. 키메라 독소 수용체 단백질이 중쇄 및 경쇄 둘다를 함유하는 경우, 면역글로불린 복합체 내의 중쇄의 일부는 바람직하게는 CH1 도메인도 함유한다.

당업자는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 다수의 면역글로불린 DNA 및 단백질 서열이 유전자은행을 통해 입수가능하다. 하기 표 2는 면역글로불린 중쇄 유전자들 및 이 유전자들에 의해 코딩된 단백질의 유전자은행 검색 번호를 보여준다.

그러므로, 일부 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 키메라 분자의 일부는 그것이 전술된 성질을 부여하기에 충분한 일부를 여전히 함유하는 한 전체 중쇄보다 작은 중쇄를 함유할 수 있다.

면역글로불린 중쇄는 임의의 종류의 면역글로불린, 예컨대, IgA, IgA₁, IgA₂, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgD₃, IgE, IgM 또는 키메라 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 일부는 IgA, IgG 또는 IgD 중쇄의 CH1, CH2 또는 CH3, 또는 IgM 또는 IgE 중쇄의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4를 함유할 수 있다. 이들 불변 도메인들의 다양한 조합물 및 하위조합물들도 고려된다.

바람직한 실시양태에서, 중쇄의 일부는 그 면역글로불린 중쇄가 J 쇄에 결합하여 분비 성분에 결합할 수 있게 하는 IgM 또는 IgA 중쇄의 일부이다. 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 키메라 독소 수용체 단백질의 일부는 IgA 중쇄 및 IgM 중쇄로부터 선택되거나 중쇄의 일부 다른 이소타입으로부터 선택된 개별 도메인들로 구성될 수 있다는 것도 고려된다. IgA 또는 IgM 이외의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 면역글로불린 도메인은 J 쇄에 결합되도록 분자적으로 개조되어 본 발명의 면역글로불린 및 면역접합체를 생성하는 데 사용될 수 있다는 것도 고려된다.

바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 마우스 또는 인간 IgA1, IgA2 또는 IgM의 적어도 CH1, CH2, CH 도메인을 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 IgM의 적어도 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4 도메인을 포함하는 면역글로불린 도메인을 함유한다.

당업자는 면역글로불린이 약 100 내지 110개 아미노산 잔기들로 이루어진 도메인으로 구성된다는 것을 이해할 것이다. 이들 다양한 도메인들은 당업계에 잘 공지되어 있고 공지된 경계를 가진다. 단일 도메인의 제거 및 또 다른 항체 분자의 도메인으로의 치환은 현대 분자생물학으로 용이하게 달성된다. 도메인은 쇄내 이황화 결합에 의해 안정화되는 구형 구조를 가진다. 이것은 상이한 형태를 부여하고 도메인을 다른 유사 형태의 도메인으로 치환될 수 있거나 교체될 수 있는 자가-함유 단위체(self-contained unit)로 만든다.

중쇄 키메라 면역글로불린

다양한 측면 및 실시양태는 중쇄를 포함하는 면역글로불린 도메인이 중쇄 면역글로불린의 다양한 이소타입으로부터 유래된 것인 키메라 독소 수용체 분자를 고려한다. 당업자는 분자적 기법을 이용하여 이 도메인들을 유사한 도메인으로 치환시킴으로써 2개의 상이한 면역글로불린 분자 사이의 하이브리드인 면역글로불린을 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이 키메라 면역글로불린은 상이한 면역글로불린 도메인에 의해 부여되는 상이하면서도 다양한 바람직한 성질을 함유하는 면역접합체가 제조될 수 있게 한다.

일부 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 분자는 인간 면역글로불린 중쇄의 2가지 상이한 이소타입으로부터 유래된 도메인을 함유한다.

일부 실시양태에서, 키메라 중쇄 면역글로불린은 J 쇄와 IgA 및 IgM의 연결을 책임지는 IgA 또는 IgM의 일부를 함유한다. 따라서, 키메라 독소 수용체 분자 내의 키메라 면역글로불린을 사용함으로써 J 쇄를 J 쇄 또는 분비 성분에 결합하지 않는 우세한 이소타입인 키메라 면역글로불린과 연결할 수 있다.

인간, 마우스 또는 다른 포유동물과 같은 종으로부터 유래된 키메라 중쇄 면역글로불린이 고려된다. 본 발명은 포유동물 면역글로불린의 2가지 이상의 상이한 이소타입으로부터 유래된 면역글로불린 도메인을 함유하는 키메라 중쇄 면역글로불린을 고려한다. 일반적으로, 임의의 포유동물 면역글로불린, 예컨대, 하기 이소타입들이 바람직한 실시양태에서 사용될 수 있다: IgG의 임의의 이소타입, 또는 IgA의 임의의 이소타입, IgE, IgD 또는 IgM. 본 발명은 설치류 또는 영장류 면역글로불린의 2가지 상이한 이소타입으로부터 유래된 면역글로불린 도메인을 함유하는 키메라 분자도 고려한다. 설치류 또는 영장류 면역글로불린의 이소타입은 당업계에 잘 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 분자는 하나 이상의 하기 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 유래의 중쇄를 함유할 수 있다: 마우스 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA5, IgE 또는 IgD의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 마우스 IgE 또는 IgM의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인; 인간 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgD의 CH1 도메인; 인간 IgM 또는 IgE의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인; 포유동물 IgG의 이소타입, IgA의 이소타입, IgE 또는 IgD의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 포유동물 IgE 또는 IgM의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인; 설치류 IgG, IgA, IgE 또는 IgD의 이소타입의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 동물 IgG의 이소타입, IgA의 이소타입, IgE 또는 IgD의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 및 동물 IgE 또는 IgM의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인.

본 발명은 면역글로불린 거대족(superfamily)의 구성원인 분자들로부터 유래된 단백질 도메인을 키메라 분자 내로 치환시키거나 부가하는 것도 고려한다. 면역글로불린 거대족에 속하는 분자는 면역글로불린과의 아미노산 잔기 서열 및 핵산 서열 상동성을 가진다. 면역글로불린 거대족의 일부인 상기 분자는 아미노산 또는 핵산 서열 상동성에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 문헌(p. 361 of Immunoglobulin Genes, Academic Press (1989))을 참조한다.

경쇄 면역글로불린

본원에 기재된 면역글로불린 경쇄의 일부는 발현된 키메라 독소 수용체의 안정성을 증가시키기에 충분한 면역글로불린 경쇄의 일부이다. 바람직하게는, 본 발명의 경쇄는 적어도 불변 도메인을 포함하거나 본원에 기재된 중쇄들 중 임의의 중쇄와 결합되기에 충분한 불변 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 따라서, 상기 쇄는 전체 도메인보다 작은 도메인을 함유할 수 있다. 경쇄는 람다 또는 카파 쇄일 수 있다.

경쇄에 공유결합된 독소 수용체의 본질(identity)은 키메라 독소 수용체 단백질/면역접합체의 친화성 및 결합친화성에 영향을 주도록 조절될 수 있다. 예를 들면, 경쇄에 공유결합된 독소 수용체가 중쇄와 연결된 독소 수용체와 동일한 독소 수용체이거나, 상이한 수용체 도메인의 존재로 인해 상이한 아미노산 서열을 가진 점을 제외하고 동일한 독소 수용체이거나, 동일한 독소에 대한 대안적 수용체인 경우, 경쇄에 연결된 독소 수용체는 키메라 독소 수용체 단백질의 결합친화성을 증가시킬 수 있다. 별법으로, 경쇄는 또 다른 독소에 대한 수용체에 공유결합됨으로써, 다수의 독소에 대한 유인물로서 사용되기에 적합한 키메라 독소 수용체 단백질을 생성시킬 수 있다.

경쇄의 도메인과 가변 도메인 사이의 연결은 임의의 종류의 결합을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 결합은 유연한 폴리펩티드 링커, 예컨대, (Gly₃Ser)₃ 링커일 수 있다.

본원에 기재된 경쇄는 본 발명의 중쇄에 대해 기재된 것과 유사한 변이로 일어날 수도 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 경쇄 불변 도메인은 상이한 유기체 또는 종으로부터 유래될 수 있다.

독소 수용체와 면역글로불린 복합체 사이의 결합

면역글로불린 복합체와 독소 수용체 사이의 결합은 경쇄와 독소 수용체 사이의 연결, 보다 바람직하게는 중쇄와 독소 수용체 사이의 연결, 가장 바람직하게는 이들 연결 둘다를 통해 이루어질 수 있다. 이들 연결은 본원에 기재된 면역접합체가 수용체 유인물로서 작용하기에 충분한 유연성을 제공하는 임의의 종류의 결합을 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합은 공유결합, 예를 들면, 공유 펩티드 결합이다.

예를 들면, 상기 결합은 IgG, IgD 및 IgA의 CH2와 CH3 사이에서 발견되는 면역글로불린 힌지인 천연 아미노산 서열 또는 유연한 합성 폴리펩티드 링커, 예컨대, (Gly₃Ser)₃ 링커 또는 (Gly₄Ser)₃일 수 있다. 한 키메라 독소 수용체는 임의의 수의 상이한 종류의 링커를 함유할 수 있다.

면역접합체

본 발명은 하나 이상의 키메라 독소 수용체 단백질을 포함하는 폴리펩티드인 면역접합체도 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역접합체는 J 쇄 및/또는 분비 성분도 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 키메라 독소 수용체 단백질을 포함한다.

J 쇄

본 발명의 면역접합체는 키메라 독소 수용체 단백질 이외에 면역글로불린 유래의 중쇄에 연결된 J 쇄를 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 2개 또는 4개의 키메라 탄저 독소 수용체 단백질, 및 이 키메라 단백질의 적어도 하나에 연결된 J 쇄를 포함한다. 상기 J 쇄는 당업계에 기재되어 있고 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(M. Koshland, The Immunoglobulin Helper: The J Chain, in Immunoglobulin Genes, Academic Press, London, pg. 345, (1989) and Matsuuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 456-460 (1986))을 참조한다. J 쇄의 서열은 미국의 다양한 데이타베이스 상에서 입수가능하다.

분비 성분

면역접합체는 키메라 독소 수용체 단백질과 연결된 분비 성분을 가질 수도 있다. 이 연결은 수소결합, 이황화 결합, 공유결합, 이온성 상호작용 또는 이들 다양한 결합의 조합에 의해 일어날 수 있다.

본 발명은 인간, 래트, 토끼, 소 등을 비롯한 다수의 상이한 종으로부터 유래된 분비 성분의 사용을 고려한다. 이 분자들에 대한 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,046,037호는 상기 서열들의 대다수를 포함하며, 이 특허는 본원에 참고로 도입된다. 분비 성분, 키메라 탄저 수용체 단백질 및 J 쇄를 함유하는 본 발명의 면역접합체는 전형적으로 하기 결합들 중 하나에 의해 서로 연결된다: 수소결합, 이황화 결합, 공유결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합.

다량체형 면역접합체

본 발명은 하나 이상의 수용체 단백질 분자를 포함하는 면역접합체도 고려하는데, 예를 들면, 상기 면역접합체는 단량체형 단위체이면서 다른 키메라 독소 수용체 분자에 이황화 결합되지 않은 키메라 독소 수용체 분자를 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역접합체는 다른 키메라 독소 수용체 분자와 연결되어 이량체 및 다른 다가 분자를 형성하는 키메라 독소 수용체 분자를 함유한다. 전형적으로, 키메라 독소 수용체 분자는 키메라 분자의 면역글로불린 부분의 연결 때문에 이량체로서 존재한다. 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 부분은 2개의 키메라 탄저 독소 수용체 분자가 연결되어 독소 수용체 단백질의 일부를 구성하는 2개의 활성 결합 부분을 가진 이량체 분자를 형성하게 한다. 바람직한 실시양태에서, 이량체화는 천연-발생 면역글로불린 분자의 일부로서 면역글로불린 도메인 사이에 일반적으로 일어나는 이황화 결합을 통해 일어난다. 당업자는 천연 면역글로불린 분자에 일반적으로 존재하는 이 이황화 결합이 키메라 독소 수용체 분자의 이량체를 형성하는 능력을 여전히 유지하면서 변형되거나, 이동되거나 제거될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일부 바람직한 실시양태에서, 면역접합체의 다량체 형태는 4개의 키메라 독소 수용체 분자를 가질 것이며, 이때 상기 키메라 독소 수용체 분자들 중 2개는 독소 수용체와 면역글로불린 중쇄의 융합으로부터 유도되며 서로 이황화 결합되어 있고, 이처럼 이황화 결합된 키메라 독소 분자 각각은 독소 수용체와 면역글로불린 경쇄의 융합으로부터 유도된 또 다른 키메라 독소 수용체 분자도 이황화 결합됨으로써 사량체 구조를 형성한다. 이러한 사량체형 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 중쇄가 IgA 분자로부터 유래된 경우, J 쇄의 부가는 전술된 사량체 구조 각각의 2개를 함유하는 복합체, 및 8개의 키메라 독소 수용체 분자를 가진 복합체의 형성을 가능하게 한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 면역접합체는 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 부분과 J의 연결로 인해 키메라 독소 수용체 분자의 다량체 형태를 함유한다. 2개의 키메라 독소 수용체 분자의 이량체와 J 쇄의 연결은 면역접합체의 사량체 형태의 형성을 가능하게 한다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 부분은 IgA 분자로부터 유래되며, J 쇄의 부가는 4개의 키메라 독소 수용체 분자 및 4개의 결합 부위를 함유하는 사량체형 복합체의 형성을 가능하게 한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 분자의 면역글로불린 중쇄 부분은 IgM으로부터 유래되며, 10개 또는 12개의 분자를 함유하는 다가 복합체가 형성될 수 있다. 키메라 독소 수용체 분자가 키메라 면역글로불린 중쇄를 사용하는 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 분자는 J 쇄 결합을 책임지는 IgA 또는 IgM으로부터 유래된 도메인을 통해 이량체 또는 다른 보다 높은 차수의 다가 복합체를 형성할 수 있다. 다른 키메라 면역글로불린 분자에 있어서, 2개의 면역글로불린 중쇄 사이의 이황화 결합 및/또는 면역글로불린 경쇄와 중쇄 사이의 이황화 결합을 책임지는 면역글로불린의 일부는 키메라 면역글로불린 분자 내에 배치되어 이량체 또는 다른 보다 높은 차수의 다가 복합체를 형성시킬 수 있다.

식물-특이적 글리코실화

본 발명의 일부 실시양태에서, 전술한 면역접합체 및 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진 단백질을 발생시키는 방법에 의해 발현된다. 글리코실화가 식물, 포유동물 및 곤충 세포를 비롯한 진핵 세포 내에서의 단백질의 주요 변형이라는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다(Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38:31-48, 1998). 글리코실화 과정은 번역과 동시에 전구체 올리고사카라이드가 생성중인 폴리펩티드 쇄의 특정한 잔기에 전달됨으로써 소포체(endoplasmic reticulum) 내에서 개시된다. 존재하는 잔기의 종류 및 잔기들 사이의 결합의 성질 면에서 상이한 다른 종류의 글리칸으로의 상기 올리고사카라이드의 가공처리는 당단백질이 소포체로부터 나와 그의 최종 목적지로 이동하는 분비 경로에서 일어난다. 당업자는 식물 또는 식물 세포 내에서 발현된 단백질이 그들의 성숙 말기에서 포유동물 세포 및 곤충 세포를 비롯한 다른 종류의 세포 내에서 발현된 단백질과는 상이한 글리코실화 패턴을 가진다는 것을 이해할 것이다. 식물-특이적 글리코실화를 특징규명하고 이를 다른 종류의 세포 내에서의 글리코실화와 비교하는 상세한 연구는 예를 들면, 문헌(Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4):365-372 (1999), and Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997))에 기재된 연구에서 수행된 바 있다. 상기 문헌의 연구진과 다른 연구진들은 식물-특이적 글리코실화가 만노즈에 β(1,2)-결합된 크실로즈를 가진 글리칸을 발생시키지만, 크실로즈는 포유동물 및 곤충 세포 내에서의 글리코실화로 인해 만노즈에 β(1,2)-결합하지 않는다는 것을 밝혔다. 식물-특이적 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,3)-결합하게 하지만, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,6)-결합하게 한다. 더욱이, 식물-특이적 글리코실화는 단백질 글리칸의 말단에 시알산을 부가시키지 않는 반면, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화의 경우, 시알산이 부가된다.

본 발명의 면역접합체 및 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 모든 폴리펩티드의 아미노산 서열은 공지되어 있다. 당업자는 글리코실화 부위가 트리펩티드 Asn-X-Ser/Thr이고, 이때 X가 프롤린 및 아스파르트산을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다는 것을 알 것이다(Kornfeld and Kornfeld, Annu Rev Biochem 54:631-664, 1985). 그러므로, 당업자는 본원에 기재된 단백질을 형성하는 폴리펩티드의 아미노산이 식물-특이적 글리코실화를 가질 것임을 알 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 측면 및 실시양태에서, 식물-특이적 글리코실화를 가진 면역접합체는 상기 키메라 분자와 연결되어 있는 J쇄 및 분비 성분을 추가로 포함한다. 키메라 분자의 경우와 마찬가지로, 당업자는 J 쇄 및 분비 성분 서열 내에서 식물-특이적 글리코실화 부위를 확인할 수 있을 것이다.

원하는 경우, 식물-특이적 글리코실화는 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체를 형성하는 식물-제조 폴리펩티드의 번역 후 가공처리가 크실로즈와 퓨코즈 결합이 실질적으로 감소하거나 제거되어 있는 변형된 번역 후 글리코실화를 이끌어내는 소포체 이외의 부위에서 일어나게 하는 서열을 부가함으로써 변형시킬 수 있다. 면역글로불린의 C-말단을 코딩하는 서열에 KDEL을 부가하는 것은 이러한 종류의 변형된 글리코실화를 이끌어낸다.

본 발명의 다른 바람직한 측면 및 실시양태에서, 특히 기능성 키메라 독소 수용체 단백질/면역접합체 생성물이 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 이들에 의해 생성된 독소 분자, 또는 상기 생성물이 투여된 대상체(subject) 내에 존재하는 독소 분자의 병리학적 효과를 예방하거나 상기 병리학적 효과에 대한 치료법을 제공하는 데 있어서 Fc 수용체 상호작용이 요구되지 않는 경우, N-결합 글리코실화 또는 O-결합 글리코실화 또는 이들 형태의 글리코실화 둘다를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.

기능성 유도체

본원에서 면역접합체 및 키메라 독소 수용체 단백질의 기능성 유도체도 제공된다. "기능성 유도체"라 함은 이것이 본 발명에 따라 이용될 수 있게 하는 단백질의 기능의 적어도 일부, 예를 들면, 단백질에 대해 특이적인 항체와의 반응성, 효소적 활성 또는 결합 활성을 보유하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 "화학적 유도체", "단편" 또는 "변이체"를 의미한다. 유전적 코드의 축퇴성 때문에 다수의 상이한 핵산 서열이 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본래의 단백질의 기능을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 발생시키도록 아미노산에서의 보존적 변화를 가할 수 있다는 것도 당업계에 잘 공지되어 있다. 두 경우에서, 모든 치환이 본 개시내용에 포함된다.

유도체는 상당한 양 및/또는 비교적 순수한 또는 단리된 양의 면역접합체가 생성될 수 있도록 친화성 정제 태그를 포함하게끔 통상적인 방법에 따라 개조될 수도 있다. 바람직하게는 태그의 부재 하에서의 면역접합체의 원하는 결합 활성을 파괴하지 않으면서 면역접합체의 하나 이상의 성분 내로 도입될 수 있는 태그의 많은 상이한 버젼이 존재한다. 이러한 태그는 본 발명의 면역접합체를 코딩하는 핵산 서열과 융합된 발현가능한 코딩 핵산 서열로서 개조될 수 있다. 태그는 예를 들면, 시판되는 효소로 제거되도록 더 개조될 수 있다.

또한, 구조적으로 변형되어 있지만 변형되지 않은 핵산 분자에 의해 생성된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 유용성 또는 활성을 가진 폴리펩티드를 생성하기 위해 코돈을 결실시킬 수 있거나 하나 이상의 코돈을 축퇴 코돈 이외의 코돈으로 치환시킬 수 있다. 당업계에 인식되어 있는 바와 같이, 핵산 분자 사이의 차이가 유전적 코드의 축퇴성과 관련되어 있지 않을지라도 2개의 폴리펩티드는 이들을 생성하는 2개의 핵산 분자와 마찬가지로 기능적으로 동등할 수 있다.

이러한 종류의 조작 및 생성 후 화학적 유도체화는 예컨대, 안정성, 가용성, 흡수성, 생물학적 또는 치료적 효과, 및/또는 생물학적 반감기를 개선하기 위해 실시될 수 있다. 이러한 효과들을 매개할 수 있는 잔기(moiety)는 예를 들면, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990))에 개시되어 있다. 본 발명의 범위 내에 있는 기능성 유도체는 천연 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산이 결실되어 있거나 추가 또는 치환된 아미노산을 함유하는 "변이체" 폴리펩티드이다. 하나 이상의 아미노산에 대한 코돈을 C-말단, N-말단 및/또는 천연 서열 내의 하나 이상의 부위에 부가하고/하거나, 제거하고/하거나, 변형시키기 위해 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 적절하게 변형시킴으로써 상기 변이체를 천연 발생 복합체 성분으로부터 유도할 수 있다. 부가된 아미노산, 치환된 아미노산 및/또는 추가 아미노산을 가진 이러한 변이체가 전술한 바와 같이 천연 단백질의 특징적인 일부를 하나 이상 보유한다는 것은 이해될 수 있을 것이다.

결실된 아미노산 잔기, 삽입된 아미노산 잔기 및/또는 치환된 아미노산 잔기를 가진 단백질의 기능성 유도체는 당업자에게 잘 공지된 표준 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 기능성 유도체의 변형된 성분은 (문헌(Adelman et. al., 1983, DNA 2:183)에 예시된 바와 같은) 부위-지정 돌연변이유발 기법을 이용하여 제조할 수 있으며, 이때 DNA 코딩 서열 내의 뉴클레오티드는 변형된 코딩 서열이 생성된 후, 이 재조합 DNA가 전술한 바와 같은 기법을 이용하여 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현되도록 변형된다. 별법으로, 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환을 가진 단백질은 당업계에 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 직접적인 화학적 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 상기 단백질의 기능성 유도체는 전형적으로 천연 단백질과 질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타낸다.

추가로, 본 발명의 면역접합체는 키메라 수용체 단백질/Ig 면역접합체일 수 있을 뿐만 아니라, 다른 천연 수용체 단백질 족 구성원, 이소타입, 및/또는 다른 상동성 아미노산 서열, 예를 들면, 인간, 영장류, 설치류, 개, 고양이, 소, 조류 등도 포함할 수 있다. 더욱이, 면역접합체에서 사용된 Ig 종류는 달라질 수 있고, 예를 들어, 소정의 종 내에서 또는 소정의 종이 없는 상태에서 상이한 Ig 족 구성원일 수 있다. Ig는 다양하고 잘 공지된 서열을 가지므로 당업자라면 치료를 받는 소정의 유기체 내에서 다소 상이한 유용성을 가진 상이한 면역접합체를 생성하는 데 있어서 Ig를 활용할 수 있다. 예를 들면, 다른 키메라 리노바이러스 수용체 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있는, ICAM-1과 상동성을 가진 분자들의 예의 예시적 비제한적 목록은 하기 표에 기재된 것들을 포함한다.

탄저 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체

본 발명은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 탄저 독소 수용체를 가진 키메라 탄저 독소 수용체 단백질도 포함한다. 경우에 따라, 안정성을 개선시키기 위해 면역글로불린 경쇄를 상기 복합체 내에 포함시킨다. 별법으로, 바람직하게는 그의 N-말단에서 면역글로불린 경쇄 또는 이러한 면역글로불린 경쇄의 단편과 연결된 탄저 독소 수용체는 안정성을 개선시키고/시키거나 추가 탄저 독소 수용체를 제공하여 탄저 독소와의 결합을 개선시키기 위해 상기 복합체 내에 포함된다.

탄저 독소 수용체 단백질은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘다와 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, J 쇄 및 분비 성분은 키메라 탄저 독소 수용체 단백질과 연결되어 면역접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진다.

키메라 탄저 독소 수용체 단백질

본원에 기재된 키메라 탄저 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 하나 이상의 탄저 독소 수용체 단백질을 함유한다.

탄저 독소 수용체

탄저 독소 수용체는 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용할 수 있게 하기에 충분한 친화성으로 보호 항원(PA)에 결합하는 임의의 폴리펩티드이다.

본원에 기재된 탄저 독소 수용체는 당업계에서 동정된 2가지 내인성 세포 탄저 독소 수용체, 즉 탄저 독소 수용체/종양 내피 마커 8(ATR/TEM8)(Bradley et al., 2001) 및 모세혈관 형태형성 인자 2(CMG2)(Scobie et al., 2001) 중 하나일 수 있다. 상기 수용체 둘다가 타입 1 경막 단백질로서 작용하며, 신호 펩티드, 세포외 도메인 및 단일-횡단 경막 영역과 같은 공통된 특징을 공유한다. 가용성 변이체를 비롯한 여러 단백질 이소폼(isoform)이 택일적 스플라이싱(alternative splicing)을 통해 예측된다.

본원에 기재된 탄저 독소 수용체는 최소한 PA의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이고 경우에 따라 하나 이상의 추가 폴리펩티드(예컨대, 수용체 유인물로서의 탄저 독소 수용체의 용도를 개선시키는 폴리펩티드)도 포함할 수 있다. ATR과 PA의 결합을 매개하는 도메인들의 특징은 잘 규명되어 있다(참고문헌 32 내지 37). 인테그린 삽입 도메인(I 도메인)으로도 공지되어 있는 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인(VWA 도메인)은 이 수용체와 PA의 적절한 결합에 필수적인 것으로 보이는 금속 이온-의존성 부착 부위(MIDAS)를 함유한다. 문헌(Scobie HM, Rainey GJ, Bradley KA, Young JA (2003) Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5170-5174. Bradley KA, Mogridge J, Mourez M, Collier RJ, Young JA (2001) Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414: 225-229)을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 탄저 독소 수용체 단백질은 이 수용체의 전체 세포외 도메인을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 탄저 독소 수용체는 프로테아제-감수성 부위가 제거되도록 개조되어 있다. 예를 들면, 탄저 독소 수용체가 CMG2 단백질인 경우, 상기 수용체는 바람직하게는 VWA/I 도메인의 일부가 아닌 14개의 아미노산을 갖지 않는다. 이 14개의 아미노산으로 된 서열 및 이의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 하기에 기재되어 있다:

TEILELQPSSVCVG(서열번호 102)

act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg(서열번호 103)

보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체

본 발명은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 보툴리늄 독소 수용체를 가진 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질도 포함한다. 경우에 따라, 안정성을 개선시키기 위해 면역글로불린 경쇄를 상기 복합체 내에 포함시킨다. 별법으로, 바람직하게는 그의 N-말단에서 면역글로불린 경쇄 또는 이러한 면역글로불린 경쇄의 단편과 연결되어 있는 보툴리늄 독소 수용체를 상기 복합체 내에 포함시켜 안정성을 개선시키고/시키거나 추가 보툴리늄 독소 수용체를 제공하여 보툴리늄 독소와의 결합을 개선시킨다.

보툴리늄 독소 수용체 단백질은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘다와 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, J 쇄 및 분비 성분은 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질과 연결되어 면역접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진다.

키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질

본원에 기재된 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 하나 이상의 보툴리늄 독소 수용체 단백질을 함유한다.

보툴리늄 독소 수용체

탄저 독소 수용체는 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용할 수 있게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 보툴리늄 독소에 결합하는 임의의 폴리펩티드이다.

7가지 보툴리늄 독소(BoNT/A-G)가 있다. 수용체 및 추정되는 결합 도메인은 모든 보툴리늄 독소에 대해 아직 동정되어 있지 않지만, 당업자라면 이러한 수용체들이 일단 동정되면, 이들을 변형시켜 본원에 기재된 키메라 보툴리늄 독소 수용체를 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

공지된 수용체 및 추정되는 결합 도메인은 하기 표에 기재되어 있다:

전술된 추정되는 결합 도메인 경계 중 일부가 비-인간 단백질에 대한 것일지라도, 당업자라면 서열 비교 기법을 이용하여 인간 단백질에 대한 유사 잔기들을 용이하게 확인할 수 있을 것이다.

본원에 기재된 보툴리늄 독소 수용체는 최소한 보툴리늄 독소의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이고 경우에 따라 하나 이상의 추가 폴리펩티드(예컨대, 수용체 유인물로서의 보툴리늄 독소 수용체의 용도를 개선시키는 폴리펩티드)도 포함할 수 있다.

보툴리늄 독소 및 이의 수용체에 관한 추가 참고문헌은 아래에 기재되어 있고 이 참고문헌들이 교시하는 모든 것이 도입되어 있다:

BoNT 또는 이성분( Bipartite ) 독소:

강글리오사이드 ( Ganglioside ):

SV2:

시냅토태그민 ( Synaptotagmin ):

키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체를 함유하는 벡터, 세포 및 식물

본 발명은 본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 함유하는 발현 및 클로닝 벡터, 세포 및 식물도 고려한다. 상기 단백질의 다양한 일부를 코딩하는 유전자들을 단리하는 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 요구되는 다양한 유전자들을 발현 벡터 및 클로닝 벡터, 예컨대, 식물 세포, 식물 및 형질전환 식물을 비롯한 진핵 세포 내로 도입될 수 있는 벡터 내로 삽입하는 데 적용될 수 있다.

본 발명은 키메라 수용체 단백질 분자 및 J 쇄를 코딩하는 DNA 절편을 유기체 내로 도입하는 단계, 및 분비 성분을 코딩하는 DNA를 상기 유기체 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역접합체를 조립하는 방법을 고려한다. 바람직한 분비 성분은 적어도 인간 폴리면역글로불린 수용체(pIgR) 아미노산 잔기 서열의 아미노산 잔기 1 내지 잔기 약 606 또는 다른 종으로부터의 유사한 아미노산 잔기들로 이루어진 절편을 함유한다(Mostov, Ann Dev. Immu. 12:63-84 1994). 상기 인간 pIgR 이외에 사용될 수 있는 분비 성분 서열들 중에는 적어도 인간 pIgR의 아미노산 잔기 1 내지 약 627로 이루어진 절편을 함유하는 서열이다.

본 발명은 본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 함유하는 식물 세포를 비롯한 진핵 세포를 고려한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체의 다양한 성분들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 식물 세포를 고려한다. 당업자라면 분비 성분 보호 항원, 키메라 수용체 단백질 분자 및 J 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 또는 카세트의 일부로서 존재할 것임을 이해할 것이다. 전형적으로, 사용되는 진핵 세포가 식물 세포인 경우, 사용되는 프로모터는 식물 세포 내에서 작동할 수 있는 프로모터일 것이다. 키메라 수용체 단백질 유전자, 분비 성분 유전자 및 J 쇄 유전자를 단리한 후, 이들을 전형적으로 발현 벡터 내의 전사 프로모터에 작동가능하게 연결시킨다. 본 발명은 발현을 위한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 키메라 수용체 단백질 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터도 고려한다. 이 발현 벡터는 특정 세포 내에서 발현될 뉴클레오티드 서열을, 뉴클레오티드 서열이 전사되고 발현되게 하는 프로모터 서열의 3'에 위치시킨다. 발현 벡터는 이 전사의 효율을 개선시키는 다양한 인핸서 서열도 함유할 수 있다. 추가로, 종결자(terminator), 폴리아데닐화(poly A) 부위 및 다른 3' 말단 처리 신호와 같은 서열을 포함시켜 특정 세포 내에서 전사되는 뉴클레오티드 서열의 양을 상승시킬 수 있다.

선택된 유기체 내에서의 성분들의 발현은 독립적으로 복제하는 플라스미드, 염색체의 영구적 성분, 또는 상기 성분들을 코딩하는 전사체를 일시적으로 발생시킬 수 있는 DNA의 임의의 조각으로부터 유도될 수 있다. 형질전환에 적합한 유기체는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 복합체의 성분들은 직접적인 DNA 형질전환 또는 유기체 내로의 유전자주입(biolistic) 전달, 또는 또 다른 유기체에 의한 매개, 예를 들어, 식물 세포에 대한 재조합 아그로박테리움(Agrobacterium)의 작용에 의해 도입될 수 있다. 형질전환 유기체 내에서의 단백질의 발현은 통상적으로 적절한 프로모터 요소 및 폴리아데닐화 신호의 동시-도입을 필요로 한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 프로모터 요소는 모든 식물 세포 내에서 성분들의 기본구성적(constitutive) 발현을 야기할 수 있다. 대부분 또는 모든 세포 내에서 일어나는 기본구성적 발현은 전구체가 조립이 일어나는 데 요구되는 것과 동일한 세포 내막(endomembrane) 시스템을 확실히 차지할 수 있게 할 것이다.

발현 벡터

숙주 세포와 상용가능한 발현 벡터, 바람직하게는 식물 세포와 상용가능한 발현 벡터가 본 발명의 유전자를 발현하는 데 사용된다. 식물 내에서의 유전자의 발현에 유용한 전형적인 발현 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌(Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153:253-277 (1987))에 기재된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도(Ti) 플라스미드로부터 유도된 벡터들을 포함한다. 그러나, 여러 다른 발현 벡터 시스템들이 식물 내에서 작용하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Verma et al., PCT 공보 제WO87/00551호; and Cocking and Davey, Science, 236: 1259-1262 (1987))을 참조한다.

전술된 발현 벡터들은 프로모터를 비롯한 발현 조절 요소들을 함유한다. 발현될 유전자는 프로모터 서열이 RNA 중합효소 결합 및 원하는 폴리펩티드 코딩 유전자의 합성을 지시할 수 있도록 발현 벡터에 작동가능하게 연결된다. 유도가능한 프로모터, 바이러스 프로모터, 합성 프로모터, 기본구성적 프로모터 및 조절되는 프로모터가 유전자를 발현하는 데 유용하다. 당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 사용될 발현 벡터의 선택 및, 궁극적으로 본 발명의 면역접합체의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결될 프로모터의 선택은 원하는 기능적 성질, 예컨대, 단백질 발현의 위치 및 시기, 및 형질전환될 숙주 세포에 의해 직접적으로 좌우되고, 이것은 당업계에 내재된 재조합 DNA 분자의 제작의 한계이다. 그러나, 본 발명을 실시하는 데 유용한 발현 벡터는 적어도 복제를 지시할 수 있고, 바람직하게는 상기 벡터에 작동가능하게 연결된 DNA 절편 내에 포함된 폴리펩티드 코딩 유전자의 발현도 지시할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 유전자를 발현하는 데 사용되는 발현 벡터는 식물 세포 내에서 효과적인 선별 마커, 바람직하게는 약물 내성 선별 마커를 포함한다. 바람직한 약물 내성 마커는 그 발현이 가나마이신 내성을 야기하는 유전자, 즉 문헌(Rogers et al., in Methods For Plant Molecular Biology, a Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988))에 의해 기재된 노팔린(nopaline) 합성효소 프로모터, Tn5 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 및 노팔린 합성효소 3' 비번역 영역을 함유하는 키메라 유전자이다. 유용한 식물 발현 벡터는 파마샤(Pharmacia, Piscataway, N.J.)로부터 시판된다. 식물 내에서 외래 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터 및 프로모터는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,188,642호; 제5,349,124호; 제5,352,605호 및 제5,034,322호에 기재되어 있다.

발현 벡터의 제작

상보적 부착 말단(cohesive termini)을 통해 DNA를 벡터에 작동가능하게 연결시키기 위한 다양한 방법이 개발되어 있다. 예를 들면, 상보적 단독중합체 트랙(track)이 벡터 DNA 내로 삽입될 DNA 절편에 부가될 수 있다. 그 후, 벡터와 DNA 절편은 상보적 단독중합체성 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다. 별법으로, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 부위를 함유하는 합성 링커를 사용하여 DNA 절편을 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 합성 링커는 블런트-말단(blunt-ended) DNA 분자의 결찰(ligation)을 촉진할 수 있는 효소, 예컨대, 박테리오파지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 블런트-말단 DNA 절편을 과량의 합성 링커 분자와 함께 항온처리함으로써 블런트-말단 DNA 절편에 부착시킬 수 있다. 따라서, 반응 생성물은 그의 말단에서 합성 링커 서열을 보유하는 DNA 절편이다. 그 후, 이 DNA 절편은 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 합성 링커의 말단과 상용가능한 말단을 발생시키는 효소로 절단된 발현 벡터 내로 결찰된다. 다양한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs, Beverly, Mass)를 비롯한 많은 공급원으로부터 시판된다.

분비 성분, J 쇄 및 본 발명의 키메라 수용체 단백질 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 식물 세포 내로 직접 도입되거나, 각각의 성분들을 식물 세포 내로 도입하고 식물을 재생시키고 다양한 성분들을 교차-혼성화하여 모든 필요한 성분들을 함유하는 최종 식물 세포를 생산함으로써 간접적으로 도입할 수 있다.

키메라 독소 수용체 및 면역접합체의 발현

본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체의 성분들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 진핵 세포 내로 도입하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 유전자를 식물 내로 도입하는 방법은 아그로박테리움-매개 식물 형질전환, 원형질체 형질전환, 화분 내로의 유전자의 전달, 재생성 기관 내로의 주입 및 미성숙 배아 내로의 주입을 포함한다. 이 방법들 각각은 상이한 장점 및 단점을 가진다. 따라서, 특정한 진핵 세포 또는 식물 종 내로 유전자를 도입하는 한 특정한 방법은 반드시 또 다른 진핵 세포 또는 식물 종에 대해 가장 효과적일 필요는 없다.

식물

예를 들면, 유전자를 식물 내로 도입하는 방법은 아그로박테리움-매개 식물 형질전환, 원형질체 형질전환, 화분 내로의 유전자의 전달, 재생성 기관 내로의 주입 및 미성숙 배아 내로의 주입을 포함한다. 이 방법들 각각은 명백한 장점 및 단점을 가진다. 따라서, 유전자를 특정한 진핵 세포 또는 식물 종 내로 도입하는 구체적인 방법은 반드시 또 다른 진핵 세포 또는 식물 종에 대해 가장 효과적일 필요는 없다.

유전자는 식물 또는 그의 자손의 게놈을 영구적으로 또는 안정하게 변화시키지 않으면서 원하는 단백질을 신속히 생성하도록 디자인된 일시적인 방식으로 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 어떻게 이 일시적 발현이 달성될 수 있는가에 대한 일례는 이원(binary) 벡터 내에 원하는 유전자 또는 유전자들을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스의 현탁액을 온전한 식물의 잎 내의 세포내 공극으로 침투시키고 일정 시간 경과 후 단백질의 추출을 위해 상기 잎을 수거하는 것이다(Voinnet O, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal 33: 949-956).

아그로박테리움 투메파시엔스-매개 전달은 DNA가 전체 식물 조직 내로 도입되어 원형질체로부터 온전한 식물을 재생시킬 필요가 없기 때문에 유전자를 식물 세포 내로 도입하는 데 널리 적용가능한 시스템이다. DNA를 식물 세포 내로 도입하기 위한 아그로박테리움-매개 발현 벡터의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Fraley et al., Biotechnology, 3:629 (1985) and Rogers et al., Methods in Enzymology, 153:253-277 (1987))에 기재된 방법을 참조한다. 또한, Ti-DNA의 삽입은 재배열을 거의 야기하지 않는 비교적 정확한 과정이다. 전달될 DNA의 영역은 경계 서열에 의해 한정되며, 개재 DNA는 통상적으로 문헌(Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205:34 (1986) and Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207:471 (1987))에 기재된 바와 같이 식물 게놈 내로 삽입된다. 모뎀(modem) 아그로박테리움 형질전환 벡터는 아그로박테리움뿐만 아니라 에쉬케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서도 복제할 수 있으므로 문헌(Klee et al., in Plant DNA Infectious Agents, T. Hohn and J. Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985))에 기재된 바와 같이 편리하게 조작될 수 있다. 아그로박테리움-매개 유전자 전달용 벡터에 있어서 보다 최근의 기술적 진보는 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자들을 발현할 수 있는 벡터의 제작을 용이하게 하기 위해 벡터 내의 유전자 및 제한 부위의 재배열을 개선시켰다. 문헌(Rogers et al., Methods in Enzymology, 153:253 (1987))에 기재된 벡터는 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접적인 발현을 위한 프로모터 및 폴리아데닐화 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 편리한 다중-링커 영역을 가지며 본 목적에 적합하다.

아그로박테리움-매개 형질전환이 효율적인 식물 종에서, 아그로박테리움-매개 형질전환은 유전자 전달의 용이함 및 정의된 성질 때문에 선택되는 방법이다. 엽편(leaf disk) 및 다른 조직의 아그로박테리움-매개 형질전환은 아그로박테리움 투메파시엔스가 천연적으로 감염시키는 식물 종으로 한정되는 듯하다. 따라서, 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.

형질전환 식물이 문헌(Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345 (1987))에 기재된 바와 같이 아그로박테리움 벡터를 사용하여 아스파라거스에서 생산되었다 하더라도, 아그로박테리움에 대한 천연 숙주로 보이는 단자엽 식물은 거의 없다. 그러므로, 벼, 옥수수 및 밀과 같은 상업적으로 중요한 곡물은 별법을 이용하여 형질전환해야 한다. 식물 원형질체의 형질전환은 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공 및 이 처리들의 조합을 기초로 한 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985); Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178 (1985); Fromm et al., Nature, 319:791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204:204 (1986); Callis et al., Genes and Development, 1:1183 (1987); and Marcotte et al., Nature, 335:454 (1988))을 참조한다.

이 방법들을 상이한 식물 종에 적용하는 것은 원형질체로부터 특정한 식물 종을 재생시키는 능력에 달려 있다. 원형질체로부터 곡물을 재생시키는 예시적 방법은 문헌(Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2:74 (1985); Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73:16 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep., 4:85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087 (1986))에 기재되어 있다.

원형질체로부터 성공적으로 재생될 수 없는 식물 종을 형질전환시키기 위해, DNA를 온전한 세포 또는 조직 내로 도입하는 다른 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 곡물을 미성숙 배아 또는 외식편(explant)으로부터 재생하는 것은 문헌(Vasil, Biotechnology, 6: 397 (1988))에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 또한, "입자 총" 또는 고속 미세발사(microprojectile) 기술이 이용될 수 있다. 문헌(Klein et al., Nature, 327:70 (1987); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8502 (1988); and McCabe et al., Biotechnology, 6:923 (1988))에 기재된 바와 같이, DNA는 이러한 기술의 이용에 의해 세포 벽을 통해 초당 1 내지 수백 미터의 속도로 가속화된 작은(0.525 μm) 금속 입자의 표면 상의 세포질 내로 운반된다. 상기 금속 입자는 여러 세포층을 투과하므로 조직 외식편 내의 세포가 형질전환될 수 있게 한다. 금속 입자는 옥수수 세포를 성공적으로 형질전환시키고 번식능력이 있는 안정하게 형질전환된 담배 및 대두 식물을 발생시키는 데 사용되어 왔다. 조직 외식편의 형질전환은 원형질체 단계를 통한 계대(passage)의 필요성을 없애므로 형질전환 식물의 발생을 가속화시킨다.

문헌(Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988))에 기재된 바와 같이 DNA를 화분 내로 직접 전달함으로써 DNA를 식물 내로 도입시킬 수도 있다. 폴리펩티드 코딩 유전자의 발현은 문헌(Pena et al., Nature, 325:274 (1987))에 기재된 바와 같이 DNA를 식물의 재생성 기관 내로 주입함으로써 달성할 수 있다. 또한, DNA는 미성숙 배아 세포 내로 직접 주입될 수 있으며 탈수된 배아의 재수화는 문헌(Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); and Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986))에 기재된 바와 같이 수행된다.

단일 식물 원형질체 또는 다양한 외식편으로부터 식물을 재생시키는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988))을 참조한다. 이 재생 및 성장 과정은 형질전환체 세포를 선별하고 발아시키는 단계, 형질전환체 발아를 뿌리내리게 하는 단계 및 토양에서 묘목을 성장시키는 단계를 포함한다.

잎 외식편으로부터의 아그로박테리움 투메파시엔스에 의해 도입된 외래 유전자를 함유하는 식물의 재생은 문헌(Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985))에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 이 과정에서, 형질전환체는 문헌(Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983))에 기재된 바와 같이 형질전환되는 식물 종에서 발아의 재생을 유도하는 배지 중에서 선별제의 존재 하에 성장한다. 이 과정은 전형적으로 2 내지 4주 내에 발아를 일으키고, 그 후 이 형질전환체 발아는 선별제 및 박테리아 성장 방지용 항생제를 함유하는 적절한 뿌리 내리기-유도 배지로 옮겨진다. 묘목을 형성하기 위해 선별제의 존재 하에 뿌리 내린 형질전환체 발아를 토양에 이식하여 뿌리 내리게 한다. 이 과정들은 사용된 구체적인 식물 종에 따라 다를 것이고, 이러한 변동은 당업계에 잘 공지되어 있다.

본 발명의 면역접합체는 쌍자엽 식물, 단자엽 식물, 가지과 식물, 자주개자리 식물, 콩과 식물, 홍화와 같은 종유 식물 또는 담배로부터 유래된 식물 세포를 비롯한 임의의 식물 세포 내에서 생성될 수 있다.

본 발명의 형질전환 식물은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있는 임의의 유성 교배 식물 종으로부터 생성될 수 있다. 유용한 식물 종은 담배, 토마토, 콩과 식물, 자주개자리 식물, 오크(oak) 및 단풍나무를 비롯한 쌍자엽 식물; 잔디, 옥수수, 곡물, 귀리, 밀 및 보리를 비롯한 단자엽 식물; 및 겉씨 식물, 구과 식물, 속새 식물, 석송류, 우산이끼, 붕어마름, 이끼, 해초, 배우체, 포자체 또는 양치 식물을 비롯한 저등 식물이다.

진핵 세포

본 발명은 포유동물 세포를 비롯한 진핵 세포 내에서 키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 발현하는 것도 고려한다. 당업자는 포유동물 세포 내에서의 발현에 이용가능한 다양한 시스템을 이해할 것이고, 상기 세포 내에서 면역접합체 및 키메라 단백질 수용체 분자, 예컨대, ICAM-1 분자가 발현되도록 상기 시스템들을 용이하게 변형할 수 있을 것이다. 바람직한 ICAM 실시양태에서, 본 발명의 키메라 ICAM-1, J 쇄 및 분비 성분 분자는 문헌(Aruffo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:8573-8577 (1987))에 이미 기재되어 있는 벡터 pCDM8 내에 위치된다. 결코 PCDM8 컨스트럭트만이 사용될 수 있는 것은 아니며, cog 세포 발현 시스템을 이용하지 않으면서 키메라 ICAM-1 및 면역접합체의 다른 분자와 함께 사용될 수 있는 다수의 다른 진핵 발현 시스템이 이용가능하다.

키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 함유하는 조성물

본 발명은 식물성 거대분자 또는 물질과 함께 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 함유하는 조성물도 고려한다. 전형적으로, 이 식물성 거대분자 또는 식물성 물질은 본 발명에서 유용한 임의의 식물로부터 유래된다. 식물성 거대분자는 예를 들면, 식물 세포, 식물 세포의 추출물 또는 식물 내에서 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체와 함께 존재한다. 조성물 중의 전형적인 식물성 거대분자는 리불로즈 비스포스페이트 카르복실라제, 집광 복합체 색소(LHCP), 2차 대사물질 또는 클로로필이다. 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.01 질량% 내지 99 질량%의 농도로 식물성 물질 또는 식물성 거대분자를 가진다. 다른 조성물은 물을 제외하고 1 질량% 내지 99 질량%의 농도로 존재하는 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 가진 조성물을 포함한다. 다른 조성물은 물을 제외하고 50 질량% 내지 90 질량%의 농도로 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.1 질량% 내지 5 질량%의 농도로 식물성 거대분자를 함유할 수 있다. 전형적으로, 조성물 중에 존재하는 질량은 식물성 거대분자, 및 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체로 구성될 것이다. 본 발명의 단백질이 더 높거나 더 낮은 농도로 존재하는 경우, 조성물에 존재하는 식물성 거대분자의 농도는 역으로 달라질 것이다. 다른 실시양태에서, 식물성 거대분자 조성물은 물을 제외하고 0.12 질량% 내지 1 질량%의 농도로 존재한다.

본 발명은 하기 성분들 전부 또는 일부를 포함하는 물질 조성물을 고려한다: 키메라 단백질 수용체 분자, J 쇄 또는 분비 성분. 이 성분들은 복합체를 형성하고 이미 공지된 바와 같이 연결된다. 전형적으로, 상기 조성물은 식물로부터 유래된 분자들도 함유한다. 이 조성물은 기능적 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체 및 식물-유래 분자를 제공하는 추출 과정 후에 수득될 수도 있다.

추출 방법은 상기 복합체를 함유하는 식물에 힘을 인가하여 식물의 아포플라스트 구획(apoplastic compartment)을 파열시켜 상기 복합체를 방출하는 단계를 포함한다. 상기 힘은 아포플라스트 액을 방출시키는 일차 방법으로서 전단(shearing)을 수반한다. 전체 식물 또는 식물 추출물은 키메라 독소 수용체/면역접합체와 다양한 다른 식물성 거대분자의 혼합물을 함유한다. 상기 혼합물 중에 함유되는 거대분자 중에는 리불로즈 비스포스페이트 카르복실라제(RuBisCo) 또는 RuBisCo의 단편이 있다. 다른 거대분자는 LHCP이다. 또 다른 분자는 클로로필이다. 조성물의 제조에 유용한 다른 방법으로는 다양한 용매를 사용한 추출 방법 및 진공을 식물성 물질에 적용하는 방법이 있다. 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 약 0.1 질량% 내지 5 질량%의 농도로 식물성 거대분자를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 식물-유래 분자와 동물-유래 분자의 상대적 비율이 달라질 수 있다는 것도 고려한다. RuBisCo 또는 클로로필과 같은 특정한 식물성 단백질의 양은 물을 제외하고 추출물의 질량의 0.01%만큼 적을 수 있거나 추출물의 질량의 99.9%만큼 많을 수 있다.

또한, 본 발명은 환자 또는 동물의 치료에 사용될 수 있는 치료 조성물을 고려한다. 이 치료 조성물은 식물 또는 다른 형질전환 유기체로부터의 추출 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 일단 키메라 독소 수용체/면역접합체가 추출되면, 이것은 크기 배제, 이온 교환 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 기법에 의해 더 정제될 수도 있다. 식물성 분자는 상기 복합체와 동시에 투여될 수 있다.

본 발명은 특정한 치료 성분의 어떠한 추가 정제 없이 키메라 독소 수용체/면역접합체를 함유하는 치료 식물 추출물을 직접 사용하는 것도 고려한다. 투여는 국소 도포, 경구 섭취, 비강 분무, 또는 키메라 독소 수용체/면역접합체를 점막 표적 병원체에 전달하기에 적합한 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.

약학 조성물, 제형 및 투여 경로

본원에 기재된 키메라 독소 수용체/면역접합체는 바람직하게는 적절한 약학 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 전술된 것들 이외에 또는 대신에 성분들을 함유할 수 있다. 조성물은 투여된 경우 바람직하게는 치료적 성질 및 예방적 성질 중 어느 하나 또는 이들 둘다를 나타낸다. 이러한 조성물의 제조는 당업계의 통상적인 방법에 따라 행해질 수 있으며, 임의의 다양한 형태, 예컨대, 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 섭취 전에 액체 중에 함유시키기에 적합한 고체 형태를 취할 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질의 제형화 및 투여를 위한 기법은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition)에서 찾을 수 있다. 당업자라면 이 방법들을 이용하여 본 발명의 면역접합체를 활용함으로써 과도한 실험 없이 성공을 달성할 수 있다.

투여 경로

본 발명의 투여에 적합한 경로는 예를 들면, 경구, 비강, 흡입, 안구내, 인두, 기관지, 경점막, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 장 투여를 포함한다. 별법으로, 화합물을 국소적 방식, 예컨대, 원하는 작용 부위에 화합물을 주사하거나 도포함으로써 투여할 수 있다.

제형

본 발명의 약학 조성물은 그 자체로 공지된 방식, 예컨대, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 환제화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다. 부형제 및/또는 다른 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 활성 화합물이 약학 제제로 가공되는 것을 용이하게 할 수 있다. 적절한 제형은 선택된 구체적인 투여 경로에 달려 있다.

주사의 경우, 본 발명의 물질은 수용액, 바람직하게는 핸크스(Hanks) 용액, 링거 용액 또는 생리학적 식염수 완충제와 같은 생리학적으로 상용가능한 완충제 중에서 제형화될 수 있다.

경점막 투여의 경우, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형 중에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 화합물은 당업계에 잘 공지되어 있는 약학적으로 허용가능한 담체와 활성 화합물을 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 화합물이 치료될 환자에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있게 한다. 적합한 담체에는 부형제, 예를 들면, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 및/또는 소르비톨을 비롯한 당과 같은 충전제; 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸쓰, 메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로즈, 소듐 카르복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 셀룰로즈 제제가 포함된다. 원하는 경우, 붕해제 예컨대, 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대, 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다.

당의정 코어는 적절한 코팅물을 구비하고 있다. 이 목적을 위해, 경우에 따라 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락카 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 투여량의 확인 또는 활성 화합물 투여량의 다양한 조합물의 특징규명을 위해 염료 또는 색소가 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가될 수 있다.

경구 투여될 수 있는 약학 제제에는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 밀봉된 연질 캡슐이 포함된다. 푸쉬-피트 캡슐은 락토즈와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및, 경우에 따라, 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 예컨대, 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 이러한 투여에 적합한 제형이어야 한다.

협측 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태 또는 수용성 겔의 형태를 취할 수 있다.

흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적합한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체를 사용하여 가압된 팩 또는 분사기로부터의 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 단위 투여량은 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴으로 만들어진 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적절한 분말 베이스(base), 예컨대, 락토즈 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.

별법으로, 활성 성분은 사용 전에 적절한 비히클, 예컨대, 멸균 발열원-무함유 물을 사용한 재구성화용 분말 형태일 수 있다.

또한, 화합물은 데포(depot) 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 오래 작용하는 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 제형화될 수 있거나, 서서히 용해되는 유도체, 예를 들면, 서서히 용해되는 염으로서 제형화될 수 있다.

또한, 화합물은 서방 시스템, 예컨대, 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체로 이루어진 반투과성 매트릭스를 사용하여 전달할 수 있다. 다양한 서방 물질이 확립되어 있고 당업자에게 잘 공지되어 있다. 서방 캡슐은 그의 화학적 성질에 따라 수 주 내지 최대 100일에 걸쳐 화합물을 방출할 수 있다. 치료제의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라 단백질 안정화를 위한 추가 방법이 이용될 수 있다.

약학 조성물은 적절한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

약학적으로 상용가능한 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 석신산, 구연산 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 산을 사용하여 형성할 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에서 더 높은 가용성을 나타내는 경향이 있다. 용액에서, pH의 조작도 원하는 성질을 최적화하기 위해 관용적으로 이용된다.

유효 투여량 및 투약법의 결정

본 발명에서 사용하기에 적합한 약학 조성물에는 활성 성분이 의도하는 목적, 예를 들면, 치료적 및/또는 예방적 사용을 달성하기에 효과적인 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 약학적 유효량은 질환의 증상을 예방하거나, 완화시키거나 개선시키거나, 치료될 대상체의 생존을 연장하기에 효과적인 화합물의 양을 의미한다. 약학적 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있고, 전형적으로 약 0.5 pg/kg/일 내지 약 500 g/kg/일의 양일 것이며, 개별 투여량은 전형적으로 약 1 ng 내지 수 g의 면역접합체를 포함할 것이다.

본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적 유효 투여량은 세포 배양 분석으로부터 먼저 추정될 수 있다. 예를 들면, 다양한 투여량을 상이한 동물 또는 세포 배양물에 투여하여 효과를 비교할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 농도 범위를 확인함으로써 그 양을 준비하여 투여할 수 있다. 최적화는 당업자에게 관용적인 것이다.

당업자는 약학적 효능을 고려하는 것 이외에 예컨대, LD₅₀(집단의 50%에게 치사 효과를 나타내는 투여량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서 치료 효과를 나타내는 투여량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서의 약학적 표준 절차에 따른 독성도 고려한다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이며, 이는 LD₅₀과 ED₅₀ 사이의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 치수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 설정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서 ED₅₀을 포함하는 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투약 제형 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. (예를 들면, 문헌(Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics,". Ch. 1 p.l)을 참조한다.)

투여량 및 투여 빈도는 약학적 효과, 예를 들면, 치료 및/또는 예방 효과를 유지하거나 제공하기에 충분한 순환 수준의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 제공하도록 조절될 수 있다. 최소 유효 농도(MEC)는 제형마다 다를 것이지만, 시험관 내 및/또는 생체 내 데이타로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개체의 특징 및 투여 경로에 달려 있을 것이다. 그러나, 본원에 기재된 분석은 추후 양 및 정확한 제형에서 더 최적화될 수 있는 순환 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다.

투여 간격은 MEC 값을 이용하여 결정할 수도 있다. 화합물은 기간의 10% 내지 90%, 기간의 30% 내지 90% 또는 가장 바람직하게는 기간의 50% 내지 90% 동안 MEC보다 높은 순환 수준을 유지하는 투약법을 이용하여 투약할 수 있다.

원하는 경우, 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투약 제형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배 장치 내에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들면, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여를 위한 설명서를 수반할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 약물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기에 부착된 고시(notice)를 수반할 수 있으며, 이 고시는 인간 또는 동물 투여를 위한 면역접합체 형태로 정부 기관에 의해 승인받았음을 나타낸다. 이러한 고시는 예를 들면, 처방 약물에 대한 미국 식품의약청에 의해 승인받은 표지, 또는 승인받은 제품 삽입물일 수 있다. 상용가능한 약학적 담체 중에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 제조될 수 있고, 적절한 용기 내에 배치될 수 있으며, 특정한 증상의 치료, 예컨대, 숙주 유기체/환자 단백질 수용체 분자에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용으로 표지될 수 있다.

감염의 치료 및 예방 방법

예를 들면, 탄저 감염에 대항하기 위해 본 발명의 치료적 및/또는 예방적 키메라 독소 수용체/면역접합체를 필요로 하는 환자는 바람직하게는 전술된 바와 같이 결정되고 제조되며 투여되는 약학 조성물의 일부로서 약학적 유효량의 원하는 키메라 독소 수용체/면역접합체를 투여받을 수 있다. 이 제형들 및 전달 양상은 광범위하게 달라질 수 있다. 이하, 유효량 및 독성을 유추하는 데 사용된 후 인간 및 다른 동물 둘다에서 치료 및 예방 매개변수 및 투약법을 결정하는 데 편리하게 사용될 수 있는 예비 과정이 기재된다. 이 과정은 설명을 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 또한, 이 과정은 당업자에게 관용적인 것이다.

인간에서 감염성을 감소시키는 키메라 독소 수용체/면역접합체의 능력: 투여량 상승 내성 연구

감염에 대한 투여 예컨대, 정맥내 또는 근육내 투여의 효과를 측정하기 위해, 본 발명의 키메라 독소 수용체/면역접합체를 예를 들면, 무작위 제어 시험을 이용하여 시험할 수 있다. 다른 투여 경로가 이용될 수 있다. 효과를 모니터링하는 데 이용될 수 있는 다양한 분석이 존재한다. 이 연구는 환자 대상체에 의해 섭취된 키메라 독소 수용체/면역접합체가 감염을 치료하거나 예방할 수 있는 정도를 평가할 수 있다. 예를 들면, 감염된 대상체 및 노출되었지만 감염되지 않은 대상체에게 키메라 독소 수용체/면역접합체를 투여하고 시간 경과에 따라 평가함으로써 감염되었거나 노출되었지만 치료받지 않은 유사한 대상체와 비교할 때 질병 진행을 평가할 수 있다.

본 발명의 키메라 독소 수용체/면역접합체는 다양한 양의 키메라 독소 수용체/면역접합체를 가진 완충 식염수로서 제형화되어 다양한 시간 간격을 두고 환자에게 투여될 수 있다. 단일 상승 투여량 및 다중 상승 투여량 연구는 면역접합체의 안전성을 평가하는 데 이용될 수 있다. 각각의 경우, 하나 이상의 대상체가 각 투여량 수준에서 평가될 수 있고, 이때 일부 대상체는 면역접합체를 투여받고 경우에 따라 하나 이상의 대상체가 플라세보를 투여받는다. 각각의 연구에서, 다양한 투여량 수준이 평가될 수 있다. 투여량 수준은 달라질 수 있으나, 전형적으로 ng 내지 g 범위 내에 있다.

투여량은 수 초, 수 분, 수 시간, 수 주 및 수 개월에 걸쳐 투여될 수 있고, 독성 및/또는 약학적 효과에 대해 평가될 수 있다.

안전성 및 독성은 자극 또는 염증의 징후에 대해, 예를 들어, 비강 점막의 가시적 검사에 의해 평가될 수 있다. 또한, 혈액 안전성 평가는 순환 면역접합체 및 리노바이러스 양을 비롯한 다양한 혈액 성분들을 측정하기 위한 ELISA와 같은 민감한 분석을 사용하여 관용적인 방법에 따라 이용될 수 있다. 유사하게, 비강 세척 시험은 관용적인 방법에 따라 행해질 수 있다.

관용적인 통계학적 분석 및 계산을 이용하여 단일 환자 및/또는 환자-수용체의 집단에 대해 시간 경과에 따라 예측된 효능 및 독성을 측정할 수 있다.

키메라 독소 수용체 단백질에 의해 표적화되는 병원체, 예컨대, 탄저 박테리아 및 탄저 포자가 제어된 임상 시험에서 인간 피실험체에게 윤리적으로 투여될 수 없는 경우, 인간에서 추정되는 투약 효능은 탄저 박테리아 또는 포자에 노출된 영장류 종을 포함할 수 있는 적절한 동물 종에서 실험적으로 결정될 수 있다. 유효량은 키메라 독소 수용체 단백질 투여의 다양한 농도 및 경로에서의 처리된 동물 및 대조군 동물의 생존율에 의해 결정될 수 있다. 투여된 키메라 독소 수용체 단백질의 약동학적 및 약력학적 성질을 결정하기 위해 혈청, 점액 및/또는 조직 샘플을 피실험체로부터 채취할 수 있고, 이 데이타로부터 동물 피실험체를 보호하는 키메라 독소 수용체 단백질의 최소 유효 농도 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 인간 피실험체에 대한 최소 유효 농도를 확립하기 위해, 전술한 동물 피실험체 시험에서 효과적인 것으로 결정된 투여 경로와 동일한 투여 경로를 통해 정상 수컷 및 암컷 피실험체에게 키메라 독소 수용체 단백질을 투여할 수 있고, 혈청, 점액 및/또는 조직 샘플을 이 인간 피실험체로부터 채취할 수 있다. 인간 피실험체에서 투여된 키메라 독소 수용체 단백질의 농도는 동물 시험 및 샘플에서 효과 및 보호를 나타내는 것으로 이미 밝혀진 농도와 동일한 농도를 얻도록 조절될 수 있다.

탄저, 보툴리늄 독소, 야토병 등과 같은 병원체에의 생명-위협 노출을 치료하고/하거나 예방하기 위한 제품의 안전성 및 효능의 확립을 위한 동물 및 인간 시험에 대한 지침은 미국 식품의약청에 의해 공표되었고 문헌(Federal Register: May 31, 2002 (Volume 67, Number 105), Rules and Regulations, Page 37988-37998)을 비롯한 다양한 공개문헌에서 공개적으로 이용될 수 있다. 이 규칙은 GPO 접근[wais.access.gpo.gov]을 통해 연방 관보 온라인으로부터 입수될 수 있고, 연방 규제 식품의약 시행 규칙 21 CFR 파트 314 및 601에서 찾을 수 있다.

하기 실시예는 개시된 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태를 설명한다. 이 실시예는 청구된 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.

실시예 1: ICAM -1 면역접합체 발현 카세트의 제작

ICAM-1 세포외 도메인 D1 내지 D5를 코딩하는 카세트를 PCR 클로닝으로 제조하였다. 구체적으로, ICAM-1의 5개 세포외 Ig-유사 도메인 모두를 함유하는 단편 을, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 pCDIC1-5D/IgA(Martin, et al. J. Virol. 67:3561-8, 1993)로부터 증폭하였다:

5'-TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3'(서열번호 6)

5'-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCTCGCGG-3'(서열번호 7).

이들 두 프라이머는 PCR 단편의 5' 말단 및 3' 말단에서 SpeI 부위(밑줄친 뉴클레오티드들)를 도입하도록 디자인되었다. PCR은 에러의 축적을 감소시키기 위해 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 수행하였다. PCR 단편을 벡터 PCRScript(Stratagene) 내로 클로닝하고, (카르복시-말단에서 SEKDEL(서열번호 4)을 갖거나 갖지 않은) 인간 IgA2 카세트에 융합하기 전에 시퀀싱하였다.

인간 J 쇄 및 분비 성분뿐만 아니라 인간 IgA2 중쇄를 식물 내에서 발현시키기 위한 컨스트럭트가 개발되었다. 중쇄 발현 카세트 벡터를 제조하고 pSSpHuA2로 지칭하였다(도 1 참조). 상기 벡터는 콩 레구민(legumin) 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 함유한다(Baumlein et al., Nucleic Acids Res. 14(6), 2707-2720, 1986). 콩 레구민의 서열은 유전자은행 검색 번호 제X03677호로서 제공되어 있으며, 콩 레구민 신호 펩티드의 서열은 서열번호 10이고(도 8 또한 참조), SpeI 부위와 SacI 부위 사이에 개재되어 있는 상기 두 부위를 가진 IgA2m(2) 불변 영역, 및 신호 펩티드 및 인간 IgA2m(2) 중쇄의 불변 영역의 발현을 유도하기 위한 SuperMas 프로모터가 존재한다.

인간 ICAM-1의 최초 5개 도메인 및 인간 IgA2m(2)의 Fc 영역을 코딩하는 증폭된 DNA를 식물-발현 카세트 내에서 융합시켜 도 2A에 나타낸 키메라 ICAM-1 분자 발현 컨스트럭트를 제조하였다. 이는 ICAM-1의 5개 세포외 도메인을 코딩하는 단편을 벡터 pSSPHuA2 내로 클로닝하여 pSSPICAMHuA2를 생성함으로써 달성되었다. 편리한 제한부위(5' SpeI 및 3' SpeI)는 증폭된 단편이 신호 펩티드와 Cα1 도메인 사이에 삽입되게 하였다. 생성된 컨스트럭트에서, 키메라 ICAM-1 분자의 발현은 기본구성적 프로모터 "superMAS"(Ni et. al., 1995) 및 nos 3' 종결자 영역의 조절 하에 있다.

생성된 키메라 ICAM-1 분자 컨스트럭트는 가변 영역을 전혀 함유하지 않는다. mRNA의 번역 시, 신호 펩티드 절단은 ICAM-1-중쇄 융합체를 식물 세포의 소포체(ER) 내에 축적시키는 것으로 예측된다. 컨스트럭트의 발현 수준을 급격히 상승시키기 위해 ER 보유 신호(RSEKDEL, 서열번호 5)를 코딩하는 DNA를 중쇄의 3' 말단에 부착시켰다. 아미노산 서열 SEKDEL(서열번호 4)은 식물 세포 내의 소포체 내에서 단백질을 보유하기 위한 컨센서스 신호 서열이다. 이 서열은 식물 내에서 항체의 축적 수준을 상승시키는 것으로 밝혀졌다(Schouten et al., Plant Molecular Biology 30:781-793, 1996). 키메라 ICAM-1 분자 컨스트럭트의 아미노산 서열은 도 2B에 나타나 있다. 이 컨스트럭트의 DNA 서열 및 번역 프레임은 입자 충격(bombardment)에 사용되기 전에 검증되었다.

J 쇄와 IgA의 조립이 골기체 내에서 일어난다는 것은 최근에 밝혀졌고(Yoo et al., J. Biol. Chem. 274:33771-33777, 1999), SEKDEL(서열번호 4)을 갖지 않은 중쇄도 마찬가지로 제작되었다. ICAM-1 단편을 SEKDEL(서열번호 4)을 갖지 않은 IgA2m(2) 불변 영역을 함유하는 발현 카세트 내로 클로닝하였다.

실시예 2: 식물 내에서 조립된 ICAM -1 면역접합체의 발현

A. 면역접합체 발현 벡터

플라스미드 pSSPICAMHuA2(서열번호 9 및 도 8A)는 길이가 6313 bp이다. 뉴클레오티드 49-1165는 수퍼프로모터를 나타낸다(Ni et al., Plant Journal 7:661-676, 1995). 뉴클레오티드 1166-3662는 링커 서열을 가진 인간 ICAM-1/인간 IgA2m(2) 불변 하이브리드를 코딩하는 서열을 포함한다. 컨센서스 코작(Kozak) 서열(Kozak, Cell 44(2):283-92, 1986)(뉴클레오티드 1186-1192)을 포함시켜 번역 개시를 상승시킬 뿐만 아니라, 비시아 파바(V. faba) 레구민으로부터의 신호 펩티드를 포함시킨다(뉴클레오티드 1189-1257; Baumlein et al., Nucleic Acids Reg. 14(6):2707-2720 (1986)). 인간 IgA2m(2) 불변 영역의 서열(뉴클레오티드 3663-3633)은 이미 공개되어 있다(chintalacharuva, et al., J. Imm. 152: 5299-5304, 1994). 소포체 보유 신호 SEKDEL(서열번호 4)을 코딩하는 서열은 중쇄(뉴클레오티드 3634-3654)의 말단에 부착시킨다. 뉴클레오티드 3663-3933은 노팔린 합성효소 3' 말단(전사 종결 및 폴리아데닐화 신호; Depicker et al., 1982)으로부터 유래된다. 상기 플라스미드의 나머지는 벡터 pSP72(Promega)로부터 유래된다.

플라스미드 pSHuJ(도 8C)는 길이가 4283 bp이다. 뉴클레오티드 14-1136은 수퍼프로모터(Ni et al., Plant Journal 7:661-676, 1995)를 나타내며, 뉴클레오티드 1137-1648은 도 8(서열번호 11)에 나타나 있고 링커 서열과 함께 천연 신호 펩티드(Max and Korsmeyer, J. Imm. 152:5299-5304, 1985)를 포함하는 인간 J 쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 컨센서스 코작(Kozak) 서열(Kozak, Cell 44(2):283-92, 1986)(뉴클레오티드 1162-1168)을 포함시켜 번역 개시를 상승시킨다. 뉴클레오티드 1649-1902는 노팔린 합성효소 3' 말단(전사 종결 및 폴리아데닐화 신호; Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6):561-73, 1982)으로부터 유래된다. 상기 플라스미드의 나머지는 벡터 pSP72(Promega)로부터 유래된다.

플라스미드 pSHuSC(도 8D)는 길이가 5650 bp이다. 뉴클레오티드 13-1136은 수퍼프로모터(Ni et al., Plant Journal 7:661-676, 1995)로부터 유래되고, 뉴클레오티드 1137-2981은 링커 서열(서열번호 12)과 함께 천연 신호 펩티드(Krajci, et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm 158:783, 1994)를 포함하는 인간 분비 성분을 코딩하는 서열을 포함한다. 컨센서스 코작 서열(Kozak, Cell 44(2):283-92, 1986)(뉴클레오티드 1151-1157)을 포함시켜 번역 개시를 상승시킨다. 뉴클레오티드 2982-3236은 문헌(Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6):561-73 (1982))에 기재된, 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호를 제공하는 노팔린 합성효소 3' 말단으로부터 유래된다. 상기 플라스미드의 나머지는 벡터 pSP72(Promega)로부터 유래된다.

플라스미드 pBMSP-1(서열번호 13 및 도 8E)은 pGPTV-KAN으로부터 유래된다. 문헌(Becker et al., in Plant Molecular Biology 20, 1195-1197, (1992))에는 좌측 T-DNA 경계에 인접하여 위치된 선별 마커, 및 좌측 및 우측 경계의 외부에 있는 서열을 가진 신규 식물 이원 벡터가 기재되어 있다. pBMSP-1의 뉴클레오티드 18-187은 우측 T-DNA 경계를 나타내며, 뉴클레오티드 1811-775는 SuperMAS 프로모터를 나타낸다. 뉴클레오티드 2393-2663은 NOS 프로모터(Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6):561-73, 1982)를 나타내고, 뉴클레오티드 2698-3492는 NPTII 유 전자(가나마이신에 대한 내성을 부여함)를 코딩하고, 뉴클레오티드 3511-3733은 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 7(Gielen et al., Embo. J. 3:835-46, 1984)로부터 유래된 폴리아데닐화 신호이다. 뉴클레오티드 1768-976은 NPTII 유전자를 코딩하고, 뉴클레오티드 4317-4464는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다.

플라스미드 pBMSP-1spJSC(서열번호 14 및 도 8F)는 수퍼프로모터의 조절 하에 있는 J 및 SC 둘다를 함유하는 pBMSP의 유도체이다. 이 플라스미드에서, 뉴클레오티드 1-149는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다. 뉴클레오티드 955-733은 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자로부터 유래된 폴리아데닐화 신호이고, 뉴클레오티드 1768-976은 NPTII 유전자(가나마이신에 대한 내성을 부여함)를 코딩하고, 뉴클레오티드 2073-1803은 NOS 프로모터를 나타낸다. 뉴클레오티드 2635-3768은 SuperMAS 프로모터를 나타내고, 뉴클레오티드 3774-5595는 인간 분비 성분을 코딩하며, 뉴클레오티드 5603-5857은 NOS 폴리아데닐화 신호를 나타낸다. 뉴클레오티드 5880-6991은 SuperMAS 프로모터를 나타내고, 뉴클레오티드 7007-7490은 인간 J 쇄를 나타내며, 뉴클레오티드 7504-7757은 NOS 폴리아데닐화 신호를 나타낸다. 뉴클레오티드 7886-8057은 우측 T-DNA 경계를 나타낸다.

히그로마이신 내성을 부여하는 효소를 코딩하는 플라스미드 pGPTV-HPT는 시판되고 있다(Max-Planck-Institut fur Zuchtungsforschung (Germany)). 상기 플라스미드는 문헌(Becker in Plant Molecular Biology 20, 1195-1197 (1992))에 기재되어 있다.

B. 식물 형질전환 및 식물에서의 ICAM-1 면역접합체 발현

전술된 발현 카세트를 사용하여 식물 내에서 조립된 면역접합체를 생성하였다. 플라스미드 pSSPICAMHuA2, pSHuJ, pSHuSC 및 pBMSP-1을 담배 잎 조직(엔. 타바쿰 컬티바르 잔티(N. tabacum cultivar Xanthi)) 내로 동시에 입자충격으로 도입시키고, 형질전환된 미세유합조직(microcallus)을 가나마이신의 존재 하에 영양 아가 상에서 선별하였다. 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내는 개개의 미세유합조직을 모 조직으로부터 절개하여 가나마이신을 함유하는 영양 아가 상에서 증식시켰다.

유합조직을 형질전환유전자 발현에 대해 스크리닝하였다. 유합조직 #7132는 면역-블롯팅 및 PCR(데이타는 나타내지 않음)에 의해 키메라 ICAM-1 면역접합체 및 J 쇄를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 이 유합조직은 SC를 코딩하는 DNA를 보유하지 않았다. 상기 유합조직은 배양물 중에서 잘 성장하였고, 충분한 질량의 축적 시 전술된 플라스미드들 중 2개의 플라스미드, 즉 J 쇄 및 SC 둘다에 대한 발현 카세트를 함유하는 PBMSP-1 SpJSC, 및 히그로마이신 내성을 부여하는 hpt I 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하는 pGPTV-HPT를 #7132 내로 입자충격으로 도입하였다. 영양 아가 상에서의 선별 및 성장 기간 후, 여러 조립 상태에서 키메라 ICAM-1 분자, J 쇄 및 SC를 발현하는 독립적인 여러 형질전환체를 면역-블롯팅으로 확인하였다.

도 3은 독립적으로 형질전환된 담배 유합조직에서의 키메라 ICAM-1 분자의 발현을 보여준다. 도 3A는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여주는데, 이때 상기 겔 상에서 상이한 형질전환 담배 유합조직(C) 및 수성 추출물(Aq)을 함유하는 샘플들이 런닝되었고 인간 ICAM의 존재에 대해 프로빙되었다. 면역접합체의 가용성은 본 발명자들에게 추출이 용이하게 수행될 수 있다는 것을 확인시 켜 주었고, 신호의 유사성은 본 발명자들로 하여금 발현의 재현가능성을 믿게 하였다. 도 3B는 유합조직 Rhi107-11로부터 부분적으로 정제된 면역접합체의 다양한 분획을 함유하는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여준다. 블롯은 인간 ICAM (~ICAM), 인간 IgA 중쇄(~α), 인간 분비 성분(~SC) 및 인간 J 쇄(~J)에 대한 항체로 프로빙되었다. 필요에 따라 2차 효소-접합 항체를 사용하여 알칼리성 포스파타제로 면역-양성 밴드를 표지하였다. 면역-블롯팅의 특이성은 비-발현 유합조직의 추출물 중에서 면역-양성 밴드를 검출하지 못하였다는 사실(나타내지 않음)에 의해 더 입증되었다. 글리코실화되지 않은 이량체화 키메라 ICAM-1 분자의 예측된 MW는 173,318이고, 이 형태는 ICAM-1 및 중쇄에 대해 면역-양성을 나타내기 때문에 250 kD 마커의 바로 아래에서 이동하는 밴드 중에 존재하는 것 같다. 이 밴드는 SC(~248 kD의 총 예측된 MW)에 대해서도 면역-양성을 나타내지만, J 쇄에 대해서는 면역-양성을 나타내지 않는데, 이는 (포유동물에서) 2가지 세포를 수반하며 SC의 조립 전에 J 쇄의 존재를 요구하는, SIgA 조립에 대한 통상적인 경로가 존재한다는 다소 예상외의 결과를 나타낸다. 단일 분자의 J 쇄 및 단일 분자의 SC를 함유하는 사량체 면역접합체는 글리코실화 전에 ~440 kD의 예측된 MW를 가진다. 분자량이 200 kD을 훨씬 초과하며 모든 4개 프로브의 사용 시 면역-양성을 나타내는 여러 종이 용이하게 식별된다.

DNA로 피복된 미세발사체를 사용한 입자충격을 이용하여 식물 및 동물 둘다에서 안정한 형질전환체를 발생시킨다(문헌(Sanford et al., Meth. Enz. 217:483-509, 1993)에 검토되어 있음). 본 발명의 면역접합체를 코딩하는 벡터를 사용한 입 자-매개 형질전환은 바이오-라드(Bio-Rad)에 의해 제작된 PDS-1000/He 입자 가속화 장치를 이용하여 수행하였다. PDS-1000/He 입자 가속화 장치 시스템은 헬륨 압력을 이용하여 표적 세포를 향하는 DNA로 피복된 미세입자를 가속화시킨다. 이 기법의 물성은 상기 기법을 매우 다용도로 용이하게 사용될 수 있게 한다. 본 발명자들은 담배를 분비 IgA의 모든 4개 성분들로 동시에 성공적으로 형질전환시켰다.

기본적인 유전자주입 과정은 다음과 같이 수행되었다: 60 mg의 입자를 1 ㎖의 무수 에탄올 중에서 혼합하여 미세발사체의 원액 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 볼텍싱하고 25 내지 50 ㎕를 분취하여 멸균 미세원심분리 튜브에 첨가하였다. 30초 동안 미세원심분리한 후, 에탄올을 제거하고, 펠릿을 1 ㎖의 멸균수 중에 재현탁시키고 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 물을 제거하고 통상적으로 등몰량(그러나, 언제나 등몰량은 아님)으로 플라스미드 DNA 혼합물을 함유하는 25 내지 50 ㎕의 DNA 용액 중에 펠릿을 현탁시켰다. 첨가된 플라스미드의 양은 제제 당 0.5 ng 내지 1 ㎍의 범위 내에서 다양하였다. 하기 물질들을 순차적으로 첨가하였다: 220 ㎕의 멸균수, 250 ㎕의 2.5 M CaCl₂ 및 50 ㎕의 0.1 M 스퍼미딘. 이 혼합물을 10분 이상 동안 볼텍싱한 후, 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, DNA/미세발사체를 600 ㎕의 무수 에탄올 중에 침전시키고, 혼합하고 1분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고, 펠릿을 36 ㎕의 에탄올 중에 재현탁시켰다. 이어서, 캡톤(Kapton(DuPont))으로 만들어진 거대담체(macrocarrier) 시트의 중앙 위에 10 ㎕의 상기 현탁액을 가능한 균일하게 도포하고 에탄올을 증발시켰다. 상기 거대담 체 시트 및 파열 디스크를 장치 내에 배치하였다. 표면-멸균 담배 잎을 함유하는 페트리 디쉬를 정지 스크린 아래에 배치하였다. 챔버를 28 내지 29 mm Hg까지 비우고 표적물을 1회 입자충격을 이용하여 도입하였다. 이 프로토콜은 담배에 대해 최적화된 것이지만, He 압력, 피복된 입자의 양, 거대담체와 정지 스크린 사이의 거리, 및 정지 스크린으로부터 조직까지의 비행 거리와 같은 매개변수를 변화시킴으로써 다른 식물에 대해서도 최적화된다.

키메라 ICAM-1 분자에 대한 발현 카세트도 아그로박테리움-매개 형질전환에서 사용하기 위한 이원 벡터 내에서 조립될 수도 있다. 인간 J 쇄 및 인간 분비 성분 둘다뿐만 아니라 가나마이신 내성의 발현을 위해 디자인된 아그로박테리움 이원 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 내로 도입하였다. 또 다른 이원 벡터 내의 키메라 ICAM/IgA 분자도 LBA4404를 형질전환시키는 데 사용하였다. 두 균주의 밤샘 배양물은 표준 프로토콜(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985)에 따라 담배의 잎 조각과 함께 동시 "공-배양"하는 데 사용되었다.

입자충격을 받은 담배 옆편 및 아그로박테리움-형질전환 담배 옆편 둘다의 재생을 위한 표준 프로토콜을 이용하였다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 입자충격을 받은 조직으로부터 재생된 형질전환 식물이 성숙 시 종종 유전자-침묵 변이를 받기 때문에, 성숙 식물의 보다 높은 발현 수율을 제공하는 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 형질전환 담배 식물을 제조하였다.

실시예 3: 조립된 ICAM -1 면역접합체의 정제

실시예 2에 따라 발현된 면역접합체를 정제하였다. 추출 과정의 진행을 용이 하게 위해 유합조직을 대량으로 성장시켰다. 면역접합체의 추가 정제를 위한 후속 크로마토그래피 기법의 연구를 위해 부분 정제 스케쥴을 통해 다양한 완충제 조건 하에 이용가능한 안정한 농축물을 얻었다(도 3 참조). 구연산나트륨(0.6 M, pH 7.4) 및 우레아(2 M의 최종 농도)를 함유하는 완충제 중에 침지된 동안에 2개의 스테인레스-강철 기아 사이에서 조직을 파쇄하는 과즙기에서 유합조직을 추출하였다. 치즈천(cheesecloth)을 통한 조질 여과 후, 쥬스(~1 mk/g 생중량(fresh weight))를 0.67 부피의 포화 황산암모늄으로 침전시켰다. 원심분리 후 녹색 펠릿을 모으고 작은 부피의 50 mM 구연산나트륨(pH 6.6) 중에서 다운스(Dounce) 균질화기로 철처히 추출하였다. 추가 원심분리 후, 투명한 갈색 상청액을 모으고, 탈염 모드로 완충제를 교환하는 동안에 상기 상청액을 세파덱스 G-100 컬럼에 통과시킴으로써 부분적으로 정제하였다. 탈염/완충제 교환 단계를 통해 원하는 완충제 중의 부분적으로 정제된 농축물(~0.2 ㎖/g 생중량 유합조직)을 제조하였고, G-100 컬럼을 0.25 X 인산염 완충 식염수로 용출하였다. 이 용출물은 2 내지 8℃에서 10일 이상 동안 안정한 것으로 보였다.

실시예 4: ICAM -1 면역접합체는 인간 리노바이러스 감염을 억제한다.

인간 리노바이러스에 의한 세포의 감염은 실시예 3에 따라 제조된 면역접합체에 의해 억제되는 것으로 입증되었다. 실시예 3에 따라 제조된 유합조직 추출물은 가용성 ICAM-1에 대한 항-ICAM 단일클론 항체의 결합에 대해 성공적으로 경쟁하였다. 도 4는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)으로부터 얻은 데이타를 보여준다. 상기 분석을 위해, 96-웰 플레이트를 0.25 ㎍의 가용성 ICAM-1/㎖으로 피복하였다. 사각형은 증가하는 농도의 sICAM을 나타내고, 원은 일정한 양의 마우스 (항-인간 ICAM) 항체에 대해 부착된 ICAM과 경쟁하는 데 사용된 증가하는 양의 유합조직 추출물(G-100으로부터의 멸균 여과 분획)을 나타낸다. 웰을 세척한 후, 부착된 마우스 항체를 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 항-마우스 항체로 검출하였다. 부착된 효소의 활성은 오르토-페닐렌 디아민을 기질로 사용하여 490 nm에서 측정하였다. 데이타(사각형, sICAM; 원, 추출물)는 S자형의 식 OD490=y=yO+a/[1+e-{(x-x0)/b}]으로 잘 표시되어 있는데, 이때 a는 y최대이고, y0은 y분이며, b는 곡선 중에서 급격히 변하는 부분의 기울기이고, x0은 50% 반응 수준에서의 x의 값이다. 가용성 ICAM-1에 비해, 여기서 시험된 면역접합체 추출물은 250 ㎍ ICAM/㎖의 등가물을 함유하는데, 이는 ICAM-1-중쇄 융합체의 이량체 및 사량체 조립의 예측된 결합친화성 효과로 인해 과대평가된 것이다. 따라서, 이 ELISA는 면역접합체가 항-ICAM mAb와의 결합에 대해 가용성 ICAM-1과 경쟁한다는 것을 입증한다.

50% 반응을 제공하는 데 필요한 표준화된 양의 다양한 분획을 비교함으로써 활성의 회복을 경쟁적 ELISA로 정량적으로 평가할 수 있다. 정제 시, 면역접합체 제제의 역가는 역 희석율로서 표현될 수 있거나, 50% 반응을 제공하기 위해 1 mg의 면역접합체가 희석되어야 하는 ㎖의 수로서 표현될 수 있다. 이 ELISA는 면역접합체의 정제 과정의 진행을 용이하게 할 것이다.

세포변성 효과 분석(CPE)은 인간 리노바이러스에 의한 인간 세포의 감염을 억제하는 부분적으로 정제된 면역접합체의 특이적 능력을 입증하였다(도 5). 리노바이러스 혈청형 HRV-39는 인간 ICAM-1 또는 ICAM/IgA 융합체(팀 스프링거 박사로 부터 얻음)과 함께 예비-항온처리되거나, 본 발명자들의 ICAM-1/SIgA 면역접합체 또는 또 다른 상이한 항체를 발현하는 유합조직으로부터의 추출물과 함께 예비-항온처리된 후, 혼합물 각각을 HeLa S3 세포와 함께 33℃에서 플레이팅하였다. 3일 후, 생존가능한 세포를 고정시키고 메탄올성 크르스탈 바이올렛(Crystal Violet) 용액으로 염색하였는데, 570 nm에서의 광학 밀도는 세포 생존가능성의 비례적 척도를 제공한다.

면역접합체를 함유하는, Rhi107-11로부터 유래된 2개의 추출물은 HeLa S3 세포를 감염시키고 사멸시키는 바이러스의 능력을 명백히 억제하였다(도 5A, 정삼각형 및 역삼각형). 추출물이 부분적으로만 정제되었기 때문에, 본 발명자들은 화학요법제인 독소루비신에 대해 유도된 인간 IgA2m(2)를 함유하는 유사하게 제조된 추출물도 분석하였다. 관련없는 결합 특이성을 가진 유사한 면역글로불린을 함유하는 상기 추출물은 리노바이러스의 감염을 억제할 수 없었고 ICAM-1-중쇄 융합체의 발현이 억제에 대한 특이성을 부여한다는 것을 입증한다. 예측된 바와 같이, CPE 분석은 바이러스 감염을 억제하는 가용성 ICAM-1 및 IC1-5/IgA(Martin, et al, 1993)의 상이한 능력을 입증하였다(도 5B). 도 5B에서 삽입도는 가용성 ICAM-1에 대한 IC₅₀(1.35 ㎍/㎖) 및 IC1-5/IgA에 대한 IC₅₀(0.12 ㎍/㎖; 11.3 배 미만)의 범위 내에서의 크기 확대도이다.

실시예 5: 임상적 및 독성학적 연구를 위한 면역접합체의 제조 및 정제

제안된 임상적 및 독성학적 필요에 충분한 면역접합체의 제조는 형질전환 담 배 식물을 제조함으로써 수행한다. (ER 보유 신호가 없는) 면역접합체를 발현하는 형질전환 식물은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 발생된다. ER 보유 신호의 부재는 조립을 상승시킬 것으로 예측되는데, 이는 SC가 펄스-추적 실험(Chintalacharuvu & Morrison, Immunotechnology 4:165-174, 1999)에 의해 제안된 바와 같이 dIgA에 공유결합되어 있는 특히, 트랜스-골기를 비롯한 전체 골기체를 통해 초기발생 SIGA가 가공처리되기 때문이다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일정한 수준의 형질전환 발현을 가진 식물을 발생시킬 가능성이 훨씬 더 높기 때문에, 이 식물의 자손은 임상적 등급의 면역접합체의 제조에 사용될 가능성이 있다.

발현 수준을 최대화하고 진정한-혈통을 발생시키기 위해, 동종접합 식물을 발생시키는 것이 바람직하다. 최대 생성 식물(세대 TO)은 종자가 모아지기 전에 온실에서 자가 수정할 수 있다. T1 식물의 1/4은 동종접합인 것으로 예측된다. 이들은 온실에서 성장하고, 여러 식물로부터의 종자 샘플은 가나마이신을 함유하는 배지 상에서 따로 발아한다. 동종접합 양성 식물로부터의 모든 자손(T2)은 녹색을 띨 것으로 예측된다. 이종접합 식물의 자손들 중 일부는 흰색 또는 누르스름한 색을 띨 것으로 예측된다. 동종접합은 야생형과의 역-교배 및 자손의 추출물의 면역-블롯팅에 의해 확인된다.

수거 및 가공처리는 제조 기간 동안 연속적으로 맞물릴 수 있는데, 이는 특히 다수의 수거물이 단일 식수(planting)로부터 수득될 수 있기 때문이다. 즉, 한 번 수거된 후 토양 수평면까지 절단된 나무는 후속 수거를 위해 다시 성장하기 때문이다. 면역접합체의 제조를 위한 크기 감도(scale sensitivity)를 발달시키기 위 해, 최종 면역접합체의 필요량을 결정하고, 발현 수준(존재하는 mg 면역접합체/kg 생중량 담배)을 밝히고, 식물의 성장률, 평균 식물의 예측된 중량 및 정제 스케쥴(20%로 설정됨)의 총 수율을 알 필요가 있다. 총 필요량을 3 g의 최종 면역접합체로 설정하려면 4개 수거물을 준비할 필요가 있는데, 각각의 수거물에서 최종 면역접합체의 예측된 수율은 1 g이다.

이 표적들 및 매개변수들이 주어진 경우, 필요한 식물의 수가 결정되고 그에 따라 식물 성장에 대한 공간 요건이 결정된다. 도 6은 1 g의 최종 면역접합체를 제조하기 위한 생산 필수요건의 평가를 보여준다. 이 도표에서, 예측된 발현 수준 및 식물 중량에서 20%의 수율로 면역접합체 1 g을 제조하는 데 필요한 식물의 수가 나타나 있다. 다양한 수준의 면역접합체 발현(mg/kg 생중량) 및 총 회수율(20%로 설정됨)에서, 각 식물의 중량 및 그에 따른 식물의 총 수는 근거 있는 가능성을 가진 영역(window)(점으로 표시된 사각형) 내에서 특정된 생성 표적(1 g/수거)에 대해 결정될 수 있다. 필요한 식물의 수는 특정된 성장 및 재성장 기간의 수에 역으로 감소한다. 시간과 성장 조건의 함수인 예측된 생체질량 생성은 수거 시간 및 수거 간격에 영향을 준다. 이 성장 기간은 식수일과 수거일을 서로 교차시킴으로써 정제 스케쥴의 현실성에 맞추어질 수 있다. 예를 들면, 적당한 발현 수준이 100 mg의 면역접합체/kg 생중량인 식물로부터의 최종 면역접합체 1 g은 식물 당 200 g의 중량 중량에서 수거될 때(발아 후 ~80일) 250개의 식물을 필요로 한다. 이 규모에서, 이 식물들은 약 10 m²의 성장 공간을 필요로 하고 150일에 걸쳐 2회 수거된다.

동시에 50+ kg의 생체질량을 가공처리하는 것은 식품-가공 산업에서 모두 대응-부품을 가진 여러 적절히 큰 규모의 작업을 필요로 한다. 이들에는 부피가 큰 물질의 취급, 크기 감소, 즙짜기 및 여과가 포함된다. 빈센트 프레스(Vincent Press) 및 듀코(Durco) 여과 시스템을 이용하여 이 양을 효율적으로 가공처리한다. 즙짜는 단계는 구연산나트륨 및 우레아로 이루어진 입증된 단순한 완충제를 사용한다. 이 성분들은 추출물을 완충시키고, 페놀계 물질의 산화 방지 및 상기 물질과 단백질의 결합 방지를 돕고(Gegenheimer, Methods in Enzymology 182:174-193, 1990; Loomis, Methods in Enzymology, 31:528-544, 1974; Van Sumere, et al., The Chemistry and Biochemistry of Plant Proteins, 1975.), 후속 산 침전 과정 동안 면역접합체의 가용성을 보장한다.

산-불용성 지질 및 단백질의 여과(총 ~90%) 후 접선류 한외여과(tangential flow ultrafiltration)를 행하여 면역접합체를 농축하고 작은 단백질, 특히 폐놀계 물질을 제거한다. 투석여과는 소분자의 제거를 상승시키고, 단기 저장 및 후속 크로마토그래피를 위한 준비에서 완충제를 교환시킨다. SP-세파로스(pH 5.0 이하에서 결합함) 또는 Q-세파로스(pH 5.5 이상에서 결합함)는 면역접합체를 여과하는 데 사용될 수 있는 이온-교환수지에 속한다. 이들은 용이하게 입수가능하며, 저울로 중량이 측정될 수 있으며, 강하며, 높은 용량을 가진다. 특히 , 이들은 여과 단계 전의 엄격도(stringency)를 감소시키는 팽창된-층 포맷(format)에 대해 이용가능하다. 음이온-교환 크로마토그래피보다 더 선택적일 수 있는 양이온-교환 크로마토그래피가 먼저 사용된다. 면역접합체는 2가 및 4가 ICAM-1 도메인의 존재가 강력한 항-바이러스 활성에 결정적으로 중요하기 때문에 단백질의 95% 이상이 ICAM-1/IgA, ICAM-1/dIgA 또는 ICAM-1/SIgA의 형태로 존재하는 시점까지 잠재적으로 존재하는 여러 단백질 종으로부터 정제된다. 그 후, 정제된 면역접합체는 니코틴과 같은 알칼로이드인 내독소의 허용가능한 수준 및 생체 유해물질의 존재량에 대해 시험된다. 또한, (ELISA 및 CPE 분석에 의해 정의된) 효능 수준, 단백질 농도, pH 및 외관이 모니터링된다. 그 후, 환자가 강력한 면역접합체를 완전히 수용하도록 하기 위해 임상적 양의 면역접합체의 안정성을 결정한다. 심지어 부분적으로 정제된 추출물도 냉장보관 시 10일 동안 안정한 것으로 밝혀졌다. -20℃, 2 내지 8℃ 및 37℃에서 3 내지 6개월의 기간에 걸쳐 저장된 경우, (인산염-완충 식염수 중의) 임상적으로 제형화된 면역접합체의 역가 및 효능도 시험한다.

실시예 6: 면역접합체는 식물-특이적 글리코실화를 가진다.

생성된 면역접합체를 분석하여 존재하는 글리코실화의 패턴을 결정한다. 문헌(Cabanes-Macheteau et al.,Glycobiology 9(4):365-372 (1999))은 식물에 전형적인 여러 글리코실 잔기가 식물에서 발현된 항체 컨스트럭트 상에 존재한다는 것을 입증하였다. 상기 문헌의 방법은 실시예 1, 2 및 3에 따라 제조된 면역접합체가 식물-특이적 글리코실화 패턴을 가진다는 것을 입증하는 데 사용된다. 본 발명자들은 이 다양성도 면역접합체에 대한 가변성의 원인일 것이라고 추정한다. 미정제 추출물이 시험관 내에서 항바이러스 활성을 가지는 것으로 밝혀졌기 때문에 (데이타는 나타내지 않음), 글리코실화는 그 자체로 효능에 영향을 주지 않는 것 같다. N-결합 글리코실화(도 2는 키메라 ICAM-1 분자에만 15개의 잠재적 부위가 존재한다는 것을 보여줌)는 면역-블롯에서 관찰된 밴드의 다양성에 기여할 가능성이 있다. 면역접합체 제제는 N-글리코시다제 A로 분해된 후, 블롯팅되며, 블롯팅은 밴드 패턴에서의 차이가 밴드를 보다 소수의 상이한 밴드로 나눈다는 것을 보여준다. 이 방식으로, 글리코형태(glycoform)는 환원 및 비-환원 폴리아크릴아미드 겔에 의해 먼저 특징규명된다. 또한, 분해된 분획 및 가상-분해된 분획은 CPE 분석 및 경쟁 ELISA에서 시험되고, 이 시험은 시험관 내에서 효능 및 역가에 대한 N-결합 글리코실화의 영향을 보여준다.

실시예 7: ICAM -1 면역접합체는 인간 리노바이러스를 불활성화시킨다.

실시예 1, 2 및 3에 따라 제조된 면역접합체는 바이러스에 결합하여 바이러스 도입을 차단하고 빈 바이러스 캡시드의 형성을 유도함으로써 HRV를 불활성화시키는 그의 능력에 대해 분석된다. 면역접합체와 HRV의 결합을 측정하기 위해, 면역접합체를 [³H]류신-표지 HRV-39와 함께 30분 동안 항온처리한 후, HeLa 세포에 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 세포 및 결합된 바이러스를 트립톤 X-100으로 탈착시키고 섬광계수기(scintillation counter)에서 [³H]를 측정한다.

면역접합체와의 항온처리에 의한 HRV-39의 불활성화는 sICAM-1에 의한 HRV 불활성화와 비교된다. HRV-39는 단량체 sICAM-1과의 항온처리에 의해 상당한 정도(감염성에서 <0.5 로그10 감소)까지 직접 불활성화되지 않지만, IC1-5D/IgA와의 항온처리는 감염성을 약 1.0 로그10 만큼 감소시킨다(Arruda, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Crump, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1425-7, 1994). HRV-39를 불활성화시키는 면역접합체의 능력을 시험하기 위해, 106의 50% 조직 배양물 감염 투여량(TCID₅₀)의 HRV-39는 상기 바이러스에 대한 각 분자의 IC₅₀의 10배에 해당하는 농도의 sICAM-1 또는 면역접합체를 함유하는 배지 또는 통상의 배지 중에서 33℃의 락커 플랫폼 상에서 1시간 동안 항온처리된다. 이어서, 각각의 바이러스-면역접합체 또는 바이러스-배지 혼합물을 순차적으로 10배 희석하고, 96-웰 플레이트에서 HeLa 세포에 대해 역가를 측정하였다.

HRV와 숙주 세포의 부착에 대한 면역접합체의 영향은 면역접합체의 존재 또는 부재 하에서 0.3의 MOI에서 HeLa 세포를 HRV-39로 접종함으로써 시험한다. 4℃에서 1시간 동안 흡광도를 측정한 후, 세포를 세척하고, 배지를 면역접합체가 함유된 또는 함유되지 않은 배지로 교체하였다. (1회 복제를 허용하기 위해) 세포를 33℃에서 10시간 동안 항온처리하고, 세포를 동결/해동시켜 바이러스를 수거하였다. HeLa 세포에 대한 바이러스의 역가를 측정하였다.

ICAM-1GA(IC1-5D/IgA)는 빈 비-감염성 바이러스 입자의 형성을 초래하는 HRV의 입체구조적 변화를 유도함에 있어서 Sicam-1보다 더 효율적이다(Martin, et al., J. Virol. 67:3561-8, 1993). 바이러스 RNA의 방출을 초래하는 HRV의 입체구조적 변화를 유도하는, 실시예 1, 2 및 3에 따라 제조된 면역접합체의 능력을 조사하기 위해, 정제된 면역접합체를 [³H]류신-표지 HRV-39와 함께 30분 동안 항온처리한 후, 바이러스를 5 내지 30% 슈크로즈 구배 상에 올려놓았다. 40,000 rpm에서 90 분 동안 원심분리한 후, 분획을 모아, [³H]를 측정하고, 감염성에 대해 분획을 평가한다. (온전한 HRV는 슈크로즈 구배 시 149S에서 침강하지만, RNA가 없는 빈 캡시드는 75S에서 침강한다(Martin, et al., J. Virol. 67:3561-8, 1993)). 본 발명자들은 ICAM/SIgA 면역접합체가 그의 증가된 결합가로 인해 빈 비-감염성 입자를 유도함에 있어서 ICAM-1gA보다 더 효율적일 것이라고 예측한다.

주요 HRV 혈청 및 소수 HRV 혈청(수용체로서 ICAM-1을 사용하지 않음) 둘다의 패널에 대한 정제된 면역접합체의 억제 효과는 CPE 분석을 이용하여 조사한다. HRV 감염을 억제하는 ICAM-1의 능력은 바이러스 단리물에 따라 다르다. HeLa 세포를 사용한 HRV 주요 수용체 혈청형 분석의 패널에 대해 시험된 경우, sICAM-1의 EC₅₀은 0.6 ㎍/㎖ 내지 >32 ㎍/㎖이라는 것이 밝혀졌다(Crump, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1425-7, 1994). 본 발명자들의 패널은 9가지 주요 혈청형(HRV-3, -13, -14, -16, -23, -39, -68, -73, 및 -80) 및 소수 수용체 혈청형 HRV-1A를 포함한다.

실시예 8: 인간에서 감염성을 감소시키는 ICAM-1 면역접합체의 능력을 입증하는 임상 연구: 투여량 상승 내성 연구

본 발명의 면역접합체는 실험적 리노바이러스 감기에서 감염, IL-8 반응 및 질병에 대한 상기 면역접합체의 비강내 투여의 효과를 알아보기 위해 2가지 무작위 제어 시험에서 시험된다. 이 2가지 연구는 리노바이러스 접종 전 또는 후에 피실험체가 섭취한 면역접합체를 평가한다. 여기서 사용된 임상 프로토콜은 리노바이러스 감염에 대한 효능에 대한 재조합 가용성 ICAM-1 분자의 평가에서 이전에 사용된 프로토콜을 기초로 한 것이다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999).

A. 피실험체

피실험체는 찰로테스빌(Charlottesville)에 소재하는 버지니아 대학의 대학 공동체로부터 동원되었다. 피실험체는 건강이 양호한 비-흡연자이며 연령이 18 내지 62세이어야 한다. 알레르기성 질환 또는 비알레르기성 비염, 해부학적으로 비정상적인 비강 또는 점막, 또는 과거에 2주 내에 호흡관 감염의 병력이 있는 피실험체는 제외되었다. 임신 또는 수유 여성 또는 의학적으로 승인된 출산 조절을 받지 않은 여성도 제외되었다. 실험적인 바이러스 챌린지 연구(I/II 기, 하기 참조)에서, 피실험체는 시험 개시로부터 90일 내에 측정된 바이러스에 대한 혈청 중화 항체 역가가 1:4 이하라는 점에 의해 입증되는 바와 같이 연구 바이러스에 대한 감수성을 가질 것이 요구된다.

B. 연구 투약

본 발명의 면역접합체는 2.6 mg/㎖을 함유하는 인산염-완충 식염수(PBS) 분무 용액으로서 제형화된다. 플라세보는 PBS로 구성되고 활성 제제와 외관상 동일하다. 상기 용액은 계량된 비강 분무 펌프가 장착된 투약 병을 이용하여 투여된다. 상기 펌프는 각각의 분무 시 183 ㎍의 면역접합체를 함유하는 70 ㎕의 용액을 전달한다. 투약은 총 1일 투여량이 4.4 mg인 경우 1일 6회씩 (3시간 간격으로) 콧구멍 당 2회의 분무로서 투여된다. 이는 트레마캄라(tremacamra) 연구 감염(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999)에서 가용성 ICAM-1에 대해 사용된 바와 동일한 투 여량으로서 mg 단백질/일 단위의 투여량이다. 1 몰의 면역접합체는 1 몰의 sICAM-1의 약 2배 질량을 가진다. 그러나, sICAM-1과 ICAM/IgA 융합체 사이에 시험관 내 활성이 상이한 경우, 면역접합체는 몰 기준으로 sICAM-1보다 훨씬 더 효과적이다. 따라서, 이 양은 필요한 양의 보존적 계산치이다. 투여량 상승 연구가 이 투여량에서 문제점을 나타내는 경우를 제외하고 이 투여량이 사용된다.

C. 연구 디자인

면역접합체의 안전성을 평가하기 위해 단일 상승 투여량 및 다중 상승 투여량 연구를 이용한다. 각각의 경우, 3명의 피실험체가 각각의 투여량 수준에서 평가되고, 이들 중 2명은 면역접합체를 투여받으며, 한 명은 플라세보를 투여받는다. 단일 상승 투여량 연구에서, 4가지 투여량 수준이 평가된다. 최저 개별 투여량은 챌린지 연구에서 사용될 것으로 예상된 투여량의 절반이며, 최대 개별 투여량은 예상된 챌린지 연구 투여량의 2배이다. 투여량 수준은 다음과 같다: 각 콧구멍에서 1회 분무(총 366 ㎍), 각 콧구멍에서 2회 분무(총 732 ㎍), 각 콧구멍에서 3회 분무(총 1098 ㎍), 각 콧구멍에서 4회 분무(총 1464 ㎍).

동일한 투여량 수준이 다중 상승 투여량 연구에서 사용된다. 피실험체는 5일 동안 (1일 당 6회) 3시간마다 투약을 제공받는다. 두 연구에서, 피실험체는 이전 투여량 수준에서 급성 독성이 없음이 명확할 때까지 각각의 후속 투여량 수준의 개시를 서로 엇갈리게 하는 각각의 투여량 수준에서 평가된다. 모든 피실험체는 첫 번째 투약 후 21 동안 단일 투약을 제공받은 다음, (면역접합체에 대한 혈청 항체의 측정을 위해) 6주째 되는 시점에서 사후 검사를 받는다.

12명의 피실험체로 구성된 별개의 군은 각각의 콧구멍을 통해 2회 분무의 단일 투약을 제공받고(총 732 ㎍ ), 비강 세척을 1, 2, 4, 8 및 16시간(각 시점에서 2명의 피실험체)에서 수행한다. 면역접합체의 생체 내 반감기를 산출하기 위해 파노라마 리서치(Panorama Research)에서 면역접합체에 대한 ELISA를 행하여 세척물을 분석한다. (총 28명의 피실험체에 대한) 투여량 상승 및 반감기 측정 연구에서 사용될 면역접합체의 총량은 약 270 mg일 것이다.

D. 안전성 평가

관용적인 부작용 기록 이외에, 면역접합체의 안전성을 3가지 방식으로 평가한다. 첫째, 첫 번째 투약 전 및 마지막 투약 후, 연구자들은 특히 자극 또는 염증의 징후를 찾기 위해 비강 점막의 가시적 조사를 수행한다. 임의의 가시적 변화가 인지된다. 둘째, 연구 1일째, 4일째 및 8일째 (및 다중 상승 투여량 연구에서 21일째) 날에 치료 전 및 마지막 투약 후 채취한 샘플에 대해 표준 혈액 안전성 평가를 행한다. 셋째, 혈청 샘플은 남겨 동결시키고, 면역접합체가 비강 점막을 통해 혈액 내로 들어갈 수 있는 지를 확인하는 데 사용한다. 이는 2가지 방식으로 달성된다. 첫째, 혈청 샘플 중의 면역접합체의 존재는 ELISA에 의해 측정된다. 이 방식에서, 마이크로타이터 플레이트에 흡착된 항-인간 IgA 항체는 항-ICAM 항체에 의해 검출되는, 혈청 중의 임의의 면역접합체를 포획한다. 상기 분석의 감수성은 공지된 농도의 면역접합체를 함유하는 정상 인간 혈청 샘플을 사용하여 측정한다. 별법으로, 항-ICAM 항체는 항-IgA에 의해 검출될, 혈청 중의 면역접합체를 포획하기 위해 플레이트에 흡착될 수 있다. 둘째, 면역접합체에 대한 면역반응의 존재는 마이크로타 이터 플레이트에 흡착된 면역접합체를 사용하는 ELISA 방법으로 분석한다. 혈청 중의 임의의 항-면역접합체 항체는 결합되고, 항-인간 IgG 또는 항-인간 IgM에 의해 검출된다. 처리 전 혈청 샘플과 처리 후 혈청 샘플을 비교하고, 역가에서의 임의의 변화를 면역접합체의 흡수의 증거로서 간주한다. 항-면역접합체 항체의 임의의 긍정적 증거가 존재하는 경우, 항-ICAM-1 활성과 항-IgA 활성을 식별하기 위한 추가 분석이 수행된다.

면역접합체에 대한 알레르기 반응의 발생에 대해 환자를 검색한다. (이전 연구에서, 코에 국소 도포된 가용성 ICAM 또는 구강 내에 국소 도포된 플랜티바디(plantibody)의 사용 시 불리한 반응은 발생하지 않았다.) 비강 알레르기의 증상을 나타내는 개체는 민감한 2-단계 ELISA(R & D Systems)를 이용한 비강 세척액 중의 항-면역접합체-특이적 IgE 항체에 대해 시험된다.

E. 통계학적 분석

이 연구들의 경우 샘플 크기는 리노바이러스 챌린지 모델을 사용한 이전 연구를 기초로 한 것이다. 보호 연구에 대해 계획된 샘플 크기는 α=0.05 및 1-β=0.80의 1-측 수준에서 임상적 감기 발병률이 플라세보 군에서 75%부터 활성 처리 군에서 25%까지 감소되는 것을 검출하는 데 적합해야 한다. 또한, 샘플 크기는 SD가 5.8 유니트라고 가정할 때 5 유니트의 총 증상 스코어의 변화를 검출하는 데 적합해야 한다.

실시예 9: 인간에서 감염성을 감소시키는 면역접합체의 능력을 입증하는 임상 연구: 챌린지 연구

챌린지 연구를 이용하여, 본 발명의 면역접합체를 사용한 처리가 바이러스 챌린지 후 임상적 감기로부터 보호하거나 감기 증상을 감소시킨다는 것을 입증한다.

A. 챌린지 바이러스

본 연구에서 사용된 챌린지 바이러스는 리노바이러스 39(HRV-39)이다. 리노바이러스 타입 39는 세포에의 부착을 위해 ICAM-1을 필요로 하는 리노바이러스의 주요 군이다. 챌린지 바이러스 풀(pool)은 컨센서스 지침에 따라 안전성에 대해 시험된다(Gwaltney, et al., Prog. Med. Virol. 39:256-263, 1992). 모든 피실험체를 약 200의 중간 조직 배양 감염 투여량(TCID₅₀)으로 접종시킨다. 상기 바이러스는 피실험체가 반드시 드러누워 있는 동안 약 15분 간격으로 콧구멍 당 250 ㎕의 2회 접종으로 소적으로서 투여된다.

	일
	0	1	2	3	4	5	6	7-14	21
	접종 전 연구 계획표
투약		6회 투약	6회 투약	6회 투약	6회 투약	6회 투약
접종		4시간
증상 스코어		m/e	m/e	m/e	m/e	m/e	m/e	e
비강 세척		m	m	m	m	m	m
혈청 샘플		X							X
	접종 전 연구 계획표
투약		6회 투약	6회 투약	6회 투약	6회 투약	6회 투약
접종		0 시간
증상 스코어		m/e	m/e	m/e	m/e	m/e	m/e	e
비강 세척		m	M	m	m	m	m
혈청 샘플		X							X
각주 1일째 내지 5일째 날에 두 연구에서, 0, 3, 6, 9, 12 및 15시간에 투약한다 m = 아침 e= 저녁

B. 연구 디자인

2가지 무작위 리노바이러스 챌린지 연구를 수행한다(상기 표 5 참조). 본 발명의 면역접합체로 구성된 동일한 제형을 접종 전 및 접종 후 연구에서 평가한다. 두 연구에서, 약물은 5일 동안 매일 6회 투약으로서 제공된다. 피실험체는 각 연구에 등록한 때 면역접합체 또는 상응하는 플라세보를 투여받도록 무작위로 배정된다. 연구는 맹검으로 수행되고, 모든 임상 시험 직원, 피실험체 및 파노라마 리서치의 고용인은 모든 데이타가 모아질 때까지 맹검 상태로 있었다.

접종 전 연구에서, 투약은 바이러스 챌린지 4시간 전에 (2가지 투여량) 시작된다. 바이러스 챌린지는 면역접합체 (또는 플라세보)의 두 번째 투약으로부터 1시간 후에 투여되고, 연구 약물의 남은 4회 투약이 첫날 동안 예정대로 제공된다. 본 연구에서, 18명의 피실험체가 활성 치료를 받고 18명의 피실험체가 플라세보를 받는다.

접종 후 연구에서, 투약은 바이러스 챌린지로부터 24시간 후에 시작된다. 이 시점이 선택된 이유는 상기 시점이 바이러스 챌린지로부터의 다른 보호 연구에 사용되고 있고 감기 증상이 명확히 존재하기 때문이다(Harris & Gwaltney, Clin. Infect. Dis. 23:1287-90, 1996). 본 연구에서의 바이러스 챌린지는 연구 1일째 날 아침에 연구 약물의 첫 번째 투약으로부터 약 24시간 전인 연구 0일째 날 아침에 투여된다. 본 연구에서, 36명의 피실험체가 활성 치료를 받고, 18명의 피실험체가 플라세보를 받는다.

피실험체는 연구 0일째 날(바이러스 챌린지 당일)부터 연구 6일째 날까지 개별 호텔 방 내에 격리된다. 이 기간 동안 매일 증상 스코어 및 바이러스 단리용 비강 세척을 약물의 첫 번째 투약 전 아침에 수행하고, 제2 증상 스코어를 매일 저녁에 수행한다. 연구 6일째 날, 피실험체를 격리로부터 자유롭게 하되, 14일째 날까지 매일 저녁에 증상 스코어를 계속 기록한다. 피실험체는 항-면역접합체 항체의 검출을 위한 최종 혈청 샘플이 모아진 때인 연구 21일째 날 연구 장소에 돌아온다. (총 54명의 피실험체에 대한) 2가지 바이러스 챌린지 연구에서 사용될 면역접합체의 총량은 약 1200 mg이다.

C. 바이러스 단리

바이러스 방출이 세포 배양물 중의 바이러스 단리에 의해 검출된다. 비강 세척 표본은 5 ㎖의 0.9% 식염수를 각각의 콧구멍 내로 주입함으로써 수집된다. 그 후, 이 세척물을 플라스틱 컵 내로 배출시키고 바이러스 배양을 위해 가공처리될 때까지 1 내지 2시간 동안 냉장 보관한다. 아가로스 지지체(Affi-Gel 10, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)에 흡착된 항-ICAM-1 항체로 처리함으로써 면역접합체를 상기 표본으로부터 제거한다. 가공처리된 각 표본의 일부를 -80℃에서 저장하고, 또 다른 일부를 ICAM-1의 생성을 위해 증식시킨 HeLa 세포주인 HeLa-1 세포가 함유된 2개의 튜브 내로 접종시킨다(Arruda, et al., J. Clin. Microb. 34:1277-1279, 1996). 리노바이러스는 전형적인 세포변성 효과의 발생에 의해 확인된다. 챌린지 후, 연구 기간 중 임의의 날에 양성 바이러스 배양물을 가진 피실험체는 감염된 것으로 간주된다. -80℃에서 저장된 표본 중의 바이러스 역가는 HeLa-1 세포의 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 10배 희석된 희석물을 배양함으로써 측정된다.

챌린지 바이러스에 대한 항체는 표준 방법(Gwaltney, et al., Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections, p. 579-614, American Public Health Association)을 이용하여 수행된 혈청 중화 역가에 의해 검출된다. 항체 시험용 혈청 표본은 바이러스 챌린지(급성) 직전 검색하는 동안에 모으고 그로부터 21일 후(회복기) 다시 모은다. 회복기 혈청 샘플이 급성 혈청 샘플과 비교될 때 챌린지 바이러스에 대한 항체 역가에서 4배 이상 증가되어 있는 피실험체는 감염된 것으로 간주된다.

D. 질병 심각도의 평가

질병 심각도는 이미 공지되어 있는 바와 같이 평가된다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999). 증상 스코어는 바이러스 챌린지 전에 기록되고 (기준치), 그 후 6일 동안 약 12시간 간격으로 매일 2회씩 기록된다. 연구 7일째 날부터 14일째 날까지, 각 피실험체는 저녁에 매일 1회씩 그의/그녀의 증상 스코어를 기록한다. 각각의 평가에서, 피실험체는 마지막 증상 평가 이후로 상기 시간 간격에서 하기 8가지 증상의 최대 심각도를 판단하도록 요청받는다: 재치기, 콧물, 코막힘, 인후통, 기침, 두통, 권태감 및 오한. 각각의 증상은 없음, 경미함, 중간 또는 심각함이라는 증상 심각도 보고에 상응하는 0 내지 3의 심각도 스코어를 배정받았다. 증상이 기준치에 존재하는 경우, 기준 증상 스코어는 보고된 증상 스코어로부터 빼어야 한다. 매일 2회 평가하여 보다 더 높은 것이 각각의 증상에 대한 1일 증상 스코어로서 간주된다. 8가지 개별적인 증상에 대한 1일 증상 스코어를 합산하여 총 1일 증상 스코어를 산출한다. 바이러스 챌린지 후 처음 5일(연구 1일째 날 내지 5일째 날) 동안 총 1일 증상 스코어를 합산하고 연구 5일째 날 저녁에 모든 피실험체에게 "당신은 감기를 앓는 것 같습니까?"라고 질문한다. 총 증상 스코어가 6 이상이고 콧물이 나오는 날이 3일 이상이거나 감기를 앓고 있다는 주관적인 느낌을 가진 피실험체는 임상적 감기를 앓는 것으로서 정의된다.

배출된 비강 분비물의 중량은 미리 중량이 측정된 비강 티슈의 다발을 모든 피실험체에게 제공함으로써 1일째 날 내지 7일째 날에 측정된다. 상기 티슈는 사용된 후, 밀폐된 플라스틱 백 내에 저장된다. 매일 아침 사용된 티슈를 원래의 다발로부터 얻은 임의의 미사용된 티슈와 함께 모아 중량을 측정한다.

E. IL-8 분석

최근 연구는 숙주 염증 반응, 특히 인터루킨 8(IL-8)이 리노바이러스 감염으로 인한 흔한 감기 증상의 발병기전에서 일정 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 비강 세척물 중의 IL-8의 농도는 이미 공지된 바와 같이 시판되는 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, Minn.)로 측정된다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999).

F. 안전성 평가

동일한 평가가 실시예 8에 기재된 투여량 상승 연구에서와 같이 챌린지 연구에서 수행된다.

G. 통계학적 분석

통계학적 분석은 실시예 8에 기재된 투여량 상승 연구에 대해 전술한 바와 유사하게 수행된다.

상기 실시예 및 논의는 주로 ICAM-1 면역접합체에 대해 설명하지만 당업자라면 이를 용이하게 변경하여 다른 유형 또는 하위유형의 바이러스 및 박테리아 병원체에 대해 활성을 나타내는 다른 유형의 면역접합체의 사용을 달성하고 실시할 수 있을 것이다. 하기 실시예는 탄저 독소 수용체(ATR)를 수용체 단백질로서 사용하는 항-박테리아 면역접합체 실시양태를 설명한다.

실시예 10: ATR 면역접합체 발현 카세트의 제작

인간 탄저 독소 수용체(ATR)의 세포외 도메인의 일부를 코딩하는 카세트를 PCR 클로닝으로 제조한다. 구체적으로, 아미노산 44-216(소위, 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인)을 코딩하는 523 bp의 단편은 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 ATR(Bradley et al., 2001) 또는 플라스미드 TEM8(St Croix et al., 2000)로부터 증폭한다:

5'-GACCTGTACTTCATTTTGGACAAATCAGG-3'(서열번호 91)

5'-GAGCTCAAAATTGAGTGGATGATGCCTTGCAGAG-3'(서열번호 92).

제2 프라이머(서열번호 92)는 ATR 세포외 도메인의 코딩 영역의 3' 말단에서 SacI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. PCR은 에러의 축적을 감소시키기 위해 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 수행한다. 5' 비번역 영역 및 식물 신호 펩티드를 포함하는 124 bp의 제2 단편은 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 8 ATG-TOPO#4(이는 인비트로겐 클로닝 벡터 pCR4-TOPO 내의 식물-최적화 5' 비번역 영역 및 신호 펩티드의 PCR 클론임)로부터 증폭한다:

5'-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3'(서열번호 93)

5'-GTCCAAAATGAAGTACAGGTCAGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3'(서열번호 94).

제1 프라이머(서열번호 93)는 상기 PCR 단편의 5' 말단에서 KpnI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. 2개의 PCR 단편은 20개의 뉴클레오티드로 구성된 상보적 서열(점선으로 밑줄침)을 가진다. 상기 2개의 PCR 단편을 함께 혼합하고, 626 bp의 단편을 서열번호 93 및 92를 이용하여 증폭시킨다. 생성된 PCR 단편은 벡터 PCRScript(Stratagene) 내로 클로닝하고 시퀀싱한 후, 벡터 pMSP-coICAM 내의 KpnI 부위와 SacI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pMSP-ATR-IgA2를 발생시킨다. 이는 ATR의 세포외 도메인과 인간 IgA2의 불변 영역의 유전적 융합체를 발생시킨다. 이 인간 IgA2 불변 영역은 담배 세포 내에서의 발현에 최적인 코돈을 사용하도록 합성된다. ATR-IgA2 융합체(면역접합체)의 전체 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 10에 나타나 있다. 생성된 컨스트럭트에서, 키메라 ATR-IgA2 분자의 발현은 기본구성적 프로모터 "SuperMAS"(Ni et al., 1995) 및 ags 3' 종결자 영역의 조절 하에 있다.

전체 발현 카세트(프로모터+ATR-IgA2+종결자)는 제한효소 AscI을 이용하여 pMSP-ATR-IgA2로부터 제거하고 이원 아그로박테리움 Ti 플라스미드 벡터 pGPTV-kan-ocs 내로 클로닝함으로써 플라스미드 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2를 발생시킨다. 벡터 pGPTV-kan-ocs는 하기 방식으로 변형된 pGPTV-kan(Becker et al., 1992)으로부터 유도된다. 전체 uid A 유전자를 포함하는, pGPTV-kan의 EcoRI 부위와 HindIII 부위 사이의 서열은 제거되고 npt II 유전자를 향하여 배향된 ocs 3' 종결자 영역(MacDonald et al., 1991) + AscI 및 SacI에 대한 제한 부위로 치환된다. 이 종결자를 T-DNA의 우측 경계에 인접하게 배치한 목적은 우측 경계 외부의 식물 DNA에서의 전사 방향으로 인해 형질전환유전자의 전사가 방해받지 않도록 하기 위한 것이다(Ingelbrecht et al., 1991).

플라스미드 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2의 T-DNA 경계 사이의 서열은 도 11에 나타나 있다. 좌측 경계 및 우측 경계 외부의 서열은 공지된 바와 같다(Becker et al., 1992). 뉴클레오티드 18-187은 우측 T-DNA 경계를 나타낸다. 뉴클레오티드 311-630은 ocs 3' 종결자 영역을 나타낸다. 뉴클레오티드 927-1976은 SuperMAS 프로모터를 나타낸다. 뉴클레오티드 1990-2017은 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris) psaDb 유전자로부터의 5' 비번역 영역을 나타낸다(Yamamoto et al., 1995). 개시 ATG 주변의 서열(뉴클레오티드 2012-2026)은 고도로 발현된 식물 유전자에서 발견되는 것과 일치하도록 디자인된다(Sawant et al., 1999). 뉴클레오티드 2018-2086은 비시아 파바 레구민의 신호 펩티드의 변형된 버젼을 코딩하는 서열을 포함한다(Baumlein et al., 1986). 뉴클레오티드 2087-2605는 ATR의 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다(Bradley et al., 2001). 뉴클레오티드 2606-3631은 인간 IgA2m(2) 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다(Chintalacharuvu et al., 1994). 뉴클레오티드 3794-4108은 아그로파인(agropine) 합성효소(ags) 종결자로부터 유래된다. 뉴클레오티드 4530-4800은 NOS 프로모터를 나타낸다(Depicker et al., 1982). 뉴클레오티드 4835-5626은 npt II 유전자(가나마이신에 대한 내성을 부여함)를 코딩한다. 뉴클레오티드 5648-5870은 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 7로부터의 폴리아데닐화 신호이다(Gielen et al., 1984). 뉴클레오티드 6454-6602는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다.

인간 J 쇄 및 분비 성분을 식물 내에서 발현시키기 위한 컨스트럭트도 개발되어 있다. 이 컨스트럭트 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC는 pGPTV-kan-ocs에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 pGPTV-hpt로부터 유도된 벡터 pGPTV-hpt-ocs를 기초로 한 것이다. 플라스미드 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC의 T-DNA 경계 사이의 서열은 도 12에 나타나 있다. 좌측 경계와 우측 경계 외부의 서열은 공지되어 있다(Becker et al., 1992). 뉴클레오티드 1-149는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다. 뉴클레오티드 733-955(상보체)는 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 7로부터의 폴리아데닐화 신호를 나타낸다(Gielen et al., 1984). 뉴클레오티드 980-2002(상보체)는 hpt 유전자(히그로마이신에 대한 내성을 부여함)를 나타낸다. 뉴클레오티드 2049-2318(상보체)은 NOS 프로모터를 나타낸다(Depicker et al., 1982). 뉴클레오티드 2898-3230은 그의 천연 신호 펩티드(뉴클레오티드 3236-5056)를 포함하는 인간 분비 성분 유전자의 발현을 유발하는 양배추꽃 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터를 나타내고, 뉴클레오티드 5060-5445는 완두 rbcS-E9 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호를 나타낸다(Mogen et al., 1992). 뉴클레오티드는 5457-5788은 그의 천연 신호 펩티드(뉴클레오티드 5797-6273)를 포함하는 인간 J 쇄 유전자의 발현을 유발하는 CaMV 35S 프로모터의 제2 카피를 나타내고, 뉴클레오티드 6281-6494는 유전자 7 종결자를 나타낸다. 뉴클레오티드 6501-6819(상보체)는 ocs 3' 종결자 영역을 나타낸다. 뉴클레오티드 6944-7113은 우측 T-DNA 경계를 나타낸다.

실시예 11: 식물 형질전환 및 식물에서의 ATR 면역접합체 발현

전술된 발현 카세트를 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 식물 내에서 조립된 면역접합체를 생성한다. 플라스미드 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC 및 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 내로 따로 도입한다. 상기 두 균주의 밤샘 배양물은 표준 프로토콜에 따라 담배의 잎 조각을 사용한 동시적 "공-배양"을 위해 사용된다. 형질전환된 식물 조직은 가나마이신(100 ㎍/㎖) 및 히그로마이신(25 ㎍/㎖)을 함유하는 재생 배지 상에서 선별된다.

항생제의 존재 하에 재생하는 묘목은 형질전환유전자 발현에 대해 검색된다. 이는 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 식물 조직 추출물을 제조하고 정화된 추출물을 니트로셀룰로즈 종이 상에 적하시킴으로써 달성된다. 이 "도트" 블롯은 인간 IgA, J 쇄 또는 분비 성분에 특이적인 알칼리성-포스파타제-접합 항혈청으로 프로빙한다. 이 제1 스크린 상에서 양성으로 확인된 식물에 대해 웨스턴 블롯팅 및 PCR을 수반하는 추가 검색을 수행한다. ATR-IgA2 면역접합체는 MW가 59 kDa인 서브유니트를 가질 것으로 예측된다. 중쇄 불변 영역의 천연 이량체화로 인해, ~118 kDa의 이량체도 형성될 것으로 예측된다. 이 이량체는 J 쇄의 존재 하에 식물 세포 내에서 더 이량체화되어 ~252 kDa의 분자를 형성한다. 분비 성분의 추가 시, ~320 kDa의 분자 종이 관찰된다.

키메라 중쇄, J 쇄 및 분비 성분 컨스트럭트 내에 신호 펩티드가 존재한다는 것은 다량체성 면역접합체로의 조립에 중요하다. mRNA의 번역 시, 신호 펩티드 절단은 각각의 단백질을 식물 세포의 소포체(ER) 내로 축적시킬 것으로 예측된다. 다량체성 면역접합체로의 조립은 ER 및 골기체 내에서 일어나고, 그 후 조립된 분자는 세포로부터 분비될 것으로 예측된다.

실시예 12: 조립된 ATR 면역접합체의 정제

조립된 ATR 면역접합체의 정제는 본질적으로 상기 실시예 3의 ICAM-1 면역접합체에 대해 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.

실시예 13: ATR 면역접합체는 포유동물 세포에 대한 독소 작용을 억제한다.

전술된 발현 카세트는 식물 추출물로부터 정제된 조립된 면역접합체를 생성하는 데 사용된다. 정제된 면역접합체는 간단한 생체분석에서 CHO-K1 세포를 사멸로부터 보호하는 데 사용된다. CHO-K1 세포의 세포 표면 상에는 PA가 결합하는 수용체가 있지만, 상기 세포는 독소에 민감하지 않다. 상기 세포는 디프테리아 독소의 촉매활성 A 쇄에 연결된 LF의 N-말단 255개 아미노산으로 구성된 융합 단백질인 LFN-DTA와 PA로 챌린지된 경우 사멸한다. 이 재조합 독소는 천연 LF 및 OF 단백질의 결합 및 도입에 필요한 동일한 LF-PA-수용체 상호작용을 활용한다. 상기 면역접합체의 보호 효과를 시험하기 위해, CHO-K1 세포를 일정한 (독성) 양의 PA 및 LFN-DTA의 존재 하에 증가하는 양의 ATR-IgA2와 혼합하고, 단백질 합성에 대한 후속 효과를 측정한다. ATR-IgA2는 가용성 ATR보다 낮은 몰 농도에서 독성 작용을 억제하는 독성 작용의 효과적인 억제제이다.

실시예 14: ATR 면역접합체는 인간 대상체에서 독성 작용을 억제한다.

정제된 면역접합체는 약학적으로 허용가능한 완충제 중에서 제조되어 탄저균에 감염된 인간 대상체에게 투여된다. 투여 경로는 흡입 에어로졸 또는 주사 투여일 수 있다. 일반적으로는 사망할 감염 마지막 단계에 있는 대상체는 면역접합체에 의한 독소 작용으로부터 보호된다.

실시예 15: 대안적 ATR 면역접합체 발현 카세트의 제작

인간 ATR의 전체 세포외 도메인(아미노산 24-320)을 코딩하는 카세트를 PCR 클로닝으로 제조한다. 구체적으로, 878 bp의 단편을, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 ATR(Bradley et al., 2001) 또는 플라스미드 TEM8(St Croix et al., 2000)로부터 증폭한다:

5'-GGGGGACGCAGGGAGGATGGGGGTCCAG-3'(서열번호 95)

5'-GAGCTCCCGTCAGAACAGTGTGTGGTGGTG-3'(서열번호 96).

제2 프라이머(서열번호 96)는 ATR 세포외 도메인의 코딩 영역의 3' 말단에서 SacI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. PCR은 에러의 축적을 감소시키기 위해 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 수행한다. 5' 비번역 영역 및 식물 신호 펩티드를 포함하는 121 bp의 제2 단편은 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 델타 ATG-TOPO#4로부터 증폭한다:

5'-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3'(서열번호 93)

5'-ATCCTCCCTGCGTCCCCCAGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3'(서열번호 97).

제1 프라이머는 상기 PCR 단편의 5' 말단에서 KpnI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. 2개의 PCR 단편은 20개의 뉴클레오티드로 구성된 상보적 서열(점선으로 밑줄침)을 가진다. 상기 2개의 PCR 단편을 함께 혼합하고, 981 bp의 단편을 서열번호 93 및 96을 이용하여 증폭시킨다. 생성된 PCR 단편은 부분적 ATR 세포외 도메인(실시예 1)과 동일한 방식으로 인간 IgA2와의 유전적 융합체를 형성하도록 식물 발현 카세트 내로 클로닝된다.

이 동일한 방법을 이용한 대안적 제작은 아미노산 41 내지 227을 증폭시킬 것이다.

실시예 16: 탄저 키메라 독소 수용체 단백질의 생성

CMG2 - IgG 및 고 친화성 항- PA 항체

IgG(CMG2-IgG)에 융합된 CMG2 및 고 친화성 항-PA 항체의 제작

요약하면, 코돈-최적화된 항-PA 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편, 및 인간 탄저 독소 수용체(CMG2)의 세포외 도메인의 일부를 코딩하는 단편을 합성하였다. CMG2 및 항-PA 중쇄 가변 영역 서열은 기본구성적 식물 프로모터(CaMV35S) 및 식물 3' 폴리아데닐화 신호 서열의 조절 하에 있는 아그로박테리움 이원 벡터 내의 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 도메인을 코딩하는 DNA 단편에 따로 결찰시켰다. 유사한 카파 쇄 벡터가 1H 경쇄 V 영역을 위해 제조되었다. 이 벡터의 제작은 상세히 후술되어 있다.

프로그램 "신호 IP"를 사용하여 CMG2의 신호 펩티드 절단 부위가 아미노산 33과 34 사이에 있다는 것을 예측하였다(참고문헌 45). 본 발명자들은 고도로 발현된 식물 유전자로부터 유래된 코돈-사용 표를 이용하여 짧은 5' 비번역 영역, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(참고문헌 46)의 2S2 알부민 저장 단백질의 신호 펩티드 및 CMG2의 아미노산 34-232를 포함하는 697 bp의 DNA 단편을 디자인하여 합성하였다(도 14). CMG2의 코딩된 부위는 가용성 단백질로서 스코비에(Scobie)와 그의 동료들에 의해 사용된 것에 상응하였다(참고문헌 31). 서열을 확인한 후, 이 단편을 인간 IgG1의 불변 영역을 이미 함유하는 벡터 pMSP-IgG 내의 KpnI과 SacI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pMSP-CMG2-IgG를 발생시켰다. 이는 CMG2의 세포외 도메인과 인간 IgG1의 불변 영역의 유전적 융합체를 발생시켰다. 또한, 이 인간 IgG1 불변 영역은 담배 내에서의 발현에 최적인 코돈을 사용하도록 합성하였다. 생성된 컨스트럭트에서, 키메라 CMG2-IgG1 분자의 발현은 고도로 발현된 기본구성적 프로모터 CaMV35S47 및 ags 3' 종결자 영역의 조절 하에 있었다. 성숙 단백질의 예측된 아미노산 서열은 도 14에 나타나 있다.

전체 발현 카세트(프로모터 + CMG2-IgG1 + 종결자)를 pMSP-CMG2-IgG로부터 이원 아그로박테리움 Ti 플라스미드 벡터 pGPTV-kan-ocs 내로 서브클로닝하여, 플라스미드 pGPTV-kan-ocs-CMG2-IgG를 발생시켰다. 이 벡터 pGPTV-kan-ocs는 pGPTV-kan으로부터 유도되고, 이 pGPTV-kan 자체는 보다 흔한 이원 벡터 pBIN19로부터 유도되었다(참고문헌 48). 발현 카세트는 번역 인핸서의 특징인 니코티아나 실베스트리스 psaDb 유전자로부터의 5' 비번역 영역을 사용한다(참고문헌 49). 개시 ATG 주변의 서열은 고도로 발현되는 식물 유전자 내에서 발견되는 것과 일치하도록 디자인되었다(참고문헌 50).

항-PA 항체의 발현을 위해, 식물-최적 코돈을 사용하며 1H의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 본 발명자들의 코돈-최적화 인간 IgG1 불변 영역 서열에 결찰시키기 위해 3' 말단에서 SacI 부위를 가지도록 합성하였다. 유사하게, 본 발명자들의 코돈-최적화 인간 카파 불변 영역에 결찰시키기 위해 3' 말단에서 HindIII를 가진, 항체 1H의 Vk 영역을 코딩하는 서열도 합성하였다. 이 서열들은 CMG2 유전자에서 사용된 것과 동일한 5' UTR 및 신호 펩티드를 포함하였다. 두 가변 영역을 상응하는 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 인 프레임(in frame)으로 CaMV35S 프로모터의 조절 하의 별도의 발현 벡터 내로 클로닝하였다.

아그로박테리움 투메파시엔스-매개 일시적 발현 시스템을 사용한 담배 내에서의 단백질 생성

1H 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 카세트를 보유하는 2가지 아그로박테리움 균주를 니코티아나 벤싸미아나의 잎 내로 동시에 침투시키고, 7일 후 수거하여 항체의 정제를 위해 즉시 가공처리하였다(참고문헌 51). 유사하게, CMG2-IgG 발현 카세트를 보유하는 아그로박테리움 균주를 잎 내로 침투시켰다. 일시적으로 형질감염된 담배 식물로부터의 잎 추출물을 제조하여 단백질 A 크로마토그래피로 분획화하였다. 본 발명자들은 이 신속한 고 성능 재현가능한 방법을 이용하여 1H 및 CMG2-IgG로 이루어진 작은 샘플을 정제하였다. 하기 표 6은 전형적인 실험의 결과를 보여준다.

일시적으로 형질감염된 니코티아나 벤싸미아나 잎으로부터의 단백질의 단리 및 정제

	그램	㎍/gm		㎍/gm 수율
단백질	잎	(ELISA)	회수된 ㎍	(OD280)	nmoles
1H IgG	100	18	1740	17.4	11.6
CMG2-IgG	74	데이타 없음	1140	15.4	9.8

정제된 단백질은 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분리하고 은 염색을 수행하였다(도 15). 1H IgG 제제는 50 kDa과 26 kDa에서 2개의 밴드로 환원되는 150 kDa의 단일 밴드를 함유하였다. 웨스턴 블롯팅은 이 2개의 밴드가 인간 감마 중쇄 및 카파 경쇄임을 확인시켜 주었다(나타내지 않음). 단백질 A로부터 용출된 CMG2-IgG 제제는 비-환원 조건 하에 45 kDa에서 주요 밴드를 가지며 환원 조건 하에 29 kDa에서 주요 밴드를 가진 불균질한 단백질 혼합물이었다. 아미노산 서열에 기초한 CMG2-IgG 단량체의 예상된 크기는 58 kDa이다. 환원 조건 하에, 온전한 CMG2-IgG 단량체를 나타낼 가능성이 있는 소량의 53 kDa 밴드가 있다. 보다 더 빨리 이동하는 밴드는 VWA/I 도메인 + Cγ1의 전부 또는 일부를 상실한 단백질분해 생성물이었다. 모든 밴드가 항-IgG1 항혈청과 반응하였다(데이타는 나타내지 않음).

CMG2-IgG 제제는 SDS-PAGE 상의 환원 조건 하에 다시 런닝시키고, 겔을 PVDF 상에 블롯팅하고, 코마시에로 염색하였다. 53, 34 및 29 kDa 단편을 함유하는 3개의 슬라이스를 에드만 분해(N-말단 아미노산 시퀀싱)를 위해 UC 데이비스에 소재한 분자 구조 연구소에 보냈다. 53 kDa 밴드로부터는 어떠한 서열도 회수할 수 없었다. 이는 CMG2의 아미노 말단에 대해 예상된 Gln과 일치하는 "차단된" 잔기의 존재를 시사하였다. 34 및 29 kDa 단편의 아미노 말단은 각각 아미노산 268 및 297에 있었다(도 14에서 1번 및 2번으로 번호 매겨진 굵은 글자체의 아미노산). 이 결과는 도 15에 도시된 모델과 일치한다.

실시예 17: 탄저 키메라 독소 수용체 단백질의 시험관 내 항- 탄저 독소 활성에 대한 시험

본 실시예는 키메라 독소 수용체 단백질 및 본원에 기재된 면역접합체의 항-탄저 독소 활성을 시험하기 위한 방법을 설명한다.

정제된 1H IgG 플랜티바디 및 CMG2-IgG1 항독소는 치사 독소를 사용한 마우스 마크로파지 분석에서 PA를 중화시키는 능력에 대해 시험되었다. 다양한 농도의 식물-제조 1H IgG 또는 CMG2-IgG1과 함께 PA + 치사 인자(100 ng/㎖ PA, 50 ng/㎖ LF)를 투여한 후 RAW 264.7 마우스 마크로파지-유사 세포의 생존을 확인하였다. 항독소 단백질을 마크로파지에 첨가하기 30분 전에 독소와 미리 항온처리하였다. 3시간 동안 독소에 노출시킨 후, 간접적인 생존율 분석을 수행하였다. 식물-제조 1H IgG의 적정은 상기 항체가 동물 세포에서 만들어진 동일한 항체와 매우 유사한 ~0.3 ㎍/㎖의 IC₅₀을 가진다는 것을 확인시켜 주었다(나타내지 않음). 또한, CMG2-IgG 제제는 1 내지 10 ㎍/㎖의 농도 범위에서 마크로파지를 보호하였다. 이는 CMG2-IgG가 강력한 항-독소임을 시사하였다.

실시예 18: 탄저 독소 수용체 단백질 면역접합체 CMG2 - IgG 변이체

본 실시예는 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체의 안정성 및 수율을 개선시키도록 가해진 대표적인 변형을 나타낸다.

변이체의 생성 및 발현

PCR을 이용하여 CMG2-IgG 컨스트럭트의 CMG2 코딩 영역과 IgG 코딩 영역 사이의 접합부에 있는 SacI 부위 주위에 변형을 도입하였다. 결정 구조에 의해 정의된(참고문헌 34) VWA/I 도메인의 일부가 아닌 14개의 아미노산이 변이체 1에서 제거되었다(도 14에서 V1). 제거된 아미노산 서열 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

TEILELQPSSVCVG(서열번호 102)

act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg(서열번호 103)

변이체 2a(도 14에서 V2a)의 경우, Cγ1 도메인이 제거되었는데, 이는 상기 분석이 이 영역 내에 프로테아제-감수성 부위가 존재한다는 것을 시사하기 때문이다. 변이체 2b에서, 14개의 아미노산 및 Cγ1 도메인이 제거되었다. 변이체 3에서, Cγ1은 남아있지만, 14개의 아미노산이 유연한 링커 (Gly₃Ser)₃로 치환되어 있다.

이 4가지 변이체들 전부 및 본래의 CMG2-IgG를 니코티아나 벤싸미아나 내에서 일시적으로 발현시키고 단백질 A 크로마토그래피로 잎 추출물로부터 정제하였다. 또한, 본래의 CMG-IgG를 인간 카파 쇄와 함께 발현시켰다. 동등한 양의 각 단백질을 비-환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분리하고, 겔을 코마시에 블루로 염색하였다(도 16). 모든 변이체들은 본래의 CMG2-IgG보다 유의하게 많은 최대 분자량 형태를 함유한다. 변이체 V1 및 V3은 본래의 CMG2-IgG와 동일한 분해 단편들(30 및 33 kDa)을 가지는 것으로 보이지만, 변이체 V2a는 약 30 kDa의 2가지 상이한 단편을 가진다. (도 16에서 4번 및 5번으로 확인되어 있으며 박스로 둘러싸인) 이 단편들의 아미노 말단 시퀀싱은 상기 단편들이 V2a의 힌지 영역 직전에서 시작된다는 것을 보여주었다(도 15).

CMG2의 VWA/I 도메인 + IgG의 Cγ2/Cγ3만을 포함하는 변이체 V2b는 다른 것들보다 더 안정하였다. 환원 조건 하에(레인 11, 도 16), 대부분의 단백질은 50 kDa 밴드로 나타나며 외관상 분해는 거의 없었다(아미노산 서열에 기초한 이 단백질의 예상 크기는 46.5 kDa임). 비-환원 조건 하에(도 16, 레인 5), ~40 kDa 및 ~97 kDa에서 주요 밴드가 존재한다. 이 밴드들 둘다가 50 kDa 단량체로 환원되는데, 이는 이들이 단량체 및 이황화-결합 이량체 형태에 상응한다는 것을 의미한다(데이타는 나타내지 않음). V2b 단백질의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 75 kDa에서 단일 피크를 보인다(도 17). SDS-PAGE와 SEC의 조합은 상기 단백질이 이황화-결합 이량체와 비-공유 연결 이량체의 혼합물임을 시사하는데, 상기 비-공유 연결 이량체는 아마도 Cγ3 도메인 사이의 상호작용에 의해 서로 연결되어 있을 것이다.

카파 경쇄의 존재 하에서의 CMG2 - IgG 의 발현

카파 쇄의 존재 하에 발현되는 CMG2-IgG에게 무엇이 일어나는가도 흥미롭다. CMG2-IgG는 약 137 kDa에서 시작하되어 35 kDa의 단위로 올라가는 래더(ladder)를 형성한다(레인 6, 도 16). 이 래더는 환원되었을 때, 60, 40 및 28 kDa의 3개 밴드로 분리된다(레인 13). 28 kDa 밴드는 카파 쇄이고, 60 kDa 밴드는 전장 CMG2-IgG이다. 이 레인으로부터의 40 kDa 밴드(도 16에서 3번)에 대해 에드만 분해를 수행하였는데, 이 에드만 분해는 그의 아미노산 말단이 V196에 있다는 것을 보여주었다. 이는 카파 쇄가 Cγ1 내에서의 절단을 방해할 수 있으나 CMG2로부터 유래된 여분의 14개 아미노산으로 이루어진 서열 내에서의 절단을 방해할 수 없다는 것을 입증하였다.

항-독소 활성에 대한 시험

본래의 CMG2-IgG 및 CMG2-IgG V2b는 음성 대조군 항체와 함께 마크로파지 보호 분석에서 항-독소 활성에 대해 시험되었다(도 18). CMG2-IgG V2b는 본래의 CMG2-IgG보다 우수하였지만, 다른 변이체들은 중간 활성을 가졌다(데이타는 나타내지 않음). 탄저 독소 활성을 50%까지 중화시키는 데 필요한 CMG2-IgG V2b의 농도(IC₅₀)는 35 ng/㎖이었다(2회 분석의 평균, 표 2). 이는 인간 게놈 사이언스에 의해 개발된 항-PA 항체(IC₅₀ = 50 ng/㎖)(참고문헌 52), 엘루시스(Elusys)(IC₅₀ = 80 ng/㎖)(참고문헌 27) 및 아바니르(Avanir)(IC₅₀ = 30 내지 70 ng/㎖))(참고문헌 23)와 비교할 때 유리하다. 상기 IC₅₀에서 PA에 대한 CMG2-IgG V2b의 몰비는 0.38인데, 이는 각각의 CMG2-IgG V2b 분자가 약 3개의 탄저 치사 독소 분자를 중화시킬 수 있다는 것을 의미한다.

구조 분석

3개의 결정 구조 - IgG Fc(단백질 데이타 베이스에서 1 E4K(참고문헌 53)), CMG2의 VWA/I 도메인(내부 이황화 결합을 가짐, 1SHU³⁴) 및 PA에 연결된 CMG2(1T6B³⁶)를 중첩시킴으로써, CMG-IgG V2b 구조가 무엇과 유사한 지와 CMG-IgG V2b가 PA에 어떻게 결합하는 지에 대한 예측 모델을 유도하였다(도 19). 크기 배제 크로마토그래피는 CMG2-IgG Var2b의 거의 전부가 이량체 형태로 존재한다는 것을 시사하지만, SDS-PAGE 분석은 이 이량체의 50% 이상이 비-공유결합되어 있다는 것을 시사한다. 이는 보다 긴 면역글로불린 Cγ1 도메인보다 더 구형인 CMG2 VWA/I 도메인의 형태에 기인할 수 있다(도 19). 입체 장애는 IgG Fc의 힌지 영역 내의 시스테인이 효율적으로 이황화 결합을 형성하기에 충분히 가깝게 근접하는 것을 방해할 수 있다.

CMG2 - 카파의 존재 하에서의 CMG2 - IgG 의 발현

CMG2의 처음 199개 아미노산 및 인간 카파 쇄 불변 도메인(CMG2-카파)으로 구성된 컨스트럭트를 조립하였다. CMG2-카파를 변이체 1 또는 변이체 3(이들 둘다가 온전한 Cγ1 도메인을 함유함)과 함께 일시적으로 발현시키고, 생성된 단백질을 단백질 A 세파로스를 이용하여 정제하였다. 두 경우에서, 우세한 분자 종은 약 180 및 160 kDa에 있는 한 쌍의 밴드이었다(도 20). 환원 조건 하에, 57 kDa, 34 kDa 및 13 kDa에서 밴드가 존재하였다. 면역-블롯(나타내지 않음)은 57 kDa 밴드가 IgG 중쇄를 함유하지만, 보다 작은 밴드는 카파-쇄 특이적 항혈청과 반응한다는 것을 입증하였다. 가장 작은 밴드의 크기는 CMG2 VWA/I 도메인과 카파 불변 영역 사이의 14개 아미노산에서의 절단과 일치한다. 주요 비-환원 밴드는 항-IgG 및 항-카파 항혈청 둘다와 반응하였고, 2개의 "중쇄" 및 2개의 "경쇄"와 함께 조립된 사량체 분자를 나타낼 가능성이 있다. 이 분자들을 RAW 마크로파지 보호 분석에서 시험하였다. IC_5O은 V1/k에 대해 4 ng/㎖이었고 V3/k에 대해 32 ng/㎖이었다(표 2). 이들의 보다 큰 크기 때문에, 신규 단백질 둘다의 경우 상기 IC₅₀에서 항독소:PA의 몰비는 훨씬 더 낮았다: V1/k의 경우 0.25이고 V3/k의 경우 0.18이었다.

산출된 IC₅₀(ng/㎖) 및 상기 IC₅₀에서 PA에 대한 항독소의 몰비

본래의 CMG2-IgG 제제 및 변이체 제제를 RAW 마크로파지 보호 분석(프로토콜은 D.1.5을 참조함)에서 80 ng/㎖의 PA 및 80 ng/㎖의 LF와 혼합하였다. 결과는 상이한 세 날짜에서 분석으로부터 얻었다.
	분석 07/20/05		분석 07/27/05		분석 07/28/05
변이체	IC50	몰비	IC50	몰비	IC50	몰비
본래의 CMG2-IgG	242	2.16	-	-	224	2.00
V1	-	-	-	-	197	1.80
V2a	-	-	-	-	67	0.72
V2b	41	0.45	-	-	28	0.31
V3	-	-	-	-	100	0.91
V1/K	-	-	44	0.25	-	-
V3/K	-	-	32	0.18	-	-

Fc γR을 통한 IgG 제거 및 N- 글리칸의 효과

현재 개발되어 있는 다양한 항독소에 의한 탄저 독소 및/또는 바실러스 안쓰라시스의 생체 내 중화 및 제거에 관여하는 기작은 잘 밝혀져 있지 않다. 항체 및 면역접합체의 경우, 독소:항독소 복합체의 생체 내 중화는 FcγR과의 상호작용에 의존할 수 있다. 많은 종류의 백혈구가 FcγR로서 공지된, IgG 상의 Fc 영역에 대한 세포 표면 수용체를 가진다. Fc-FcγR 상호작용을 통한 이 세포들과 항원-항체 복합체의 결합은 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 수용체-리간드 복합체의 내부이입을 비롯한 다수의 반응을 야기할 수 있다.

결정 구조는 FcγR이 중쇄 Fc 영역의 Cγ2의 보다 낮은 힌지 영역에 결합한다는 것을 보여준다(참고문헌 55). 유전적 및 생화학적 접근법은 이 상호작용을 조절하는 아미노산 잔기뿐만 아니라, IgG Fc 상의 N-결합 글리칸의 역할을 확인시켜 주었다. N-결합 글리칸은 당단백질의 일부 아스파라진 잔기에 공유 부착된 올리고사카라이드 구조이다. 결정 구조 분석은 인간 IgG의 Asn²⁹⁷에 있는 N-글리칸이 FcγR 결합을 촉진하는 Fc 영역의 특정한 입체구조를 안정화시킨다는 것을 시사한다(참고문헌 55 및 56)(도 21). 이 N-글리칸의 제거는 시험관 내에서 3가지 주요 FcγR 이소폼에 대한 IgG의 친화성을 급격히 감소시키지만, 생체 내 반감기에는 영향을 주지 않는다(참고문헌 57, 58 및 59).

글리코실화 또는 이의 결핍이 탄저 치사 독소 또는 바실러스 안쓰라시스 감염에 대한 CMG2-IgG의 생체 내 보호 효과에 어떤 영향을 미치는지는 아직 공지되어 있지 않다. 항독소-PA 복합체의 효율적인 제거/파괴가 FcγR에의 결합에 의해 영향을 받는 경우, 이는 항독소의 글리코실화된 상태에 의해 영향을 받을 수 있다. 아바니르 파마슈티칼스(Avanir Pharmaceuticals)의 과학자들은 그들의 항-PA 항체들 중 2가지 항체의 글리코실화된 형태와 아글리코실 형태의 생체 내 활성을 비교하였고, 보호 효능에 있어서 거의 차이가 없음을 발견하였다(참고문헌 23). 이로부터, 이들은 치사 독소 중화가 Fc 이펙터에 의해 매개되지 않는다는 결론을 내렸다. 그러나, 이는 단지 하나의 실험일뿐이고, 아글리코실 항체 중 하나에서 나타난 감소된 효능이 있었다. 이러한 이유로, CMG2-IgG 면역접합체의 아글리코실 형태(본 실시예들에서 시험된 형태) 및 글리코실화된 형태가 시험된다.

동물 당단백질의 N-글리칸과 식물 당단백질의 N-글리칸 사이에는 미묘한 차이점들이 있고, 이 차이점들 중 일부가 식물 당단백질의 잠재적인 면역원성/알레르기원성에 대한 관심을 불러 일으켰다(참고문헌 60 및 61). 본 실시예들에서 1H IgG 및 CMG2-IgG는 아글리코실 중쇄 불변 영역을 사용하여 제조하였다. 비록 식물-제조 면역접합체가 글리코실화되어 있다 하더라도, 면역원성은 식물-제조 면역접합체에 기초한 탄저 중화 요법에 있어서 주요 문제점이 아닐 것이라고 생각된다. 면역원성이 유의한 문제점인 것으로 판명된다면, 식물의 N-글리칸이 "인간화"되도록 식물을 유전적으로 변형시킬 수 있다(참고문헌 62 내지 67).

결론

인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 탄저 독소 수용체 CMG2(CMG2-IgG)의 세포외 도메인으로 구성된 식물-제조 면역접합체는 나노몰 농도에서 탄저 치사 독소의 치사 효과로부터 마우스 마크로파지를 보호할 수 있었다. 면역접합체의 특이적 활성은 가장 유용한 단일클론 항체에 필적할만한 것으로 보인다.

실시예 19: 추가 CMG2 - IgG 키메라 변이체

본 실시예는 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체의 안정성 및 수율을 개선시키기 위해 가해질 수 있는 대표적인 변형을 보여준다.

변이체 2b는 수율이 더 증가되도록 변형된다. VWA/I 도메인과 Cγ2 도메인 사이에 유연한 (Gly₃Ser)₃ 링커를 도입하면(도 19의 구조 참조) 생체 내에서 변이체가 보다 안정하고/하거나 보다 높은 활성을 나타내게 하는 보다 높은 비율의 이황화-결합 이량체를 함유하는 변이체가 발생된다. 또한, CMG2-카파 컨스트럭트에서 CMG2 VWA/I 도메인과 Cκ 사이의 14개 아미노산은 (Gly₃Ser)₃ 링커로 치환된다. 이들 2가지 신규 단백질을 일시적으로 형질감염된 담배에서 제조하여 단백질 A-세파로스 크로마토그래피를 이용하여 정제하다. 상기 단백질들을 적절한 조립 및 안정성에 대해 시험하다. 결합 상수를 표면 플라스몬(plasmon) 공명으로 측정한다. 상기 단백질들의 활성을 RAW 마크로파지 보호 분석에서 기존 면역접합체의 활성과 비교한다. 글리코실화는 이 세포-기재 분석에서 활성에 영향을 줄 것으로 예측되지 않는다. 그러나, 글리코실화는 생체 내 활성에 영향을 줄 수 있으므로, 가장 강력한 면역접합체 항독소를 선별한 후 Cγ2 도메인 내의 글리코실화 부위를 재도입한다. 글리코실 및 아글리코실 버젼 둘다를 생체 내에서 시험하다.

담배에서 CMG2 - IgG 의 발현을 위한 분자 컨스트럭트

변이체 4는 유연한 링커가 부가된 변이체 2b와 동일할 것이며, VWA/1 도메인 + 변이체 3으로부터의 (Gly₃Ser)₃ 링커를 코딩하는 DNA 단편을 IgG 힌지 및 변이체 2b로부터의 불변 도메인 Cγ2-Cγ3(아미노산 298-531, 도 14)을 코딩하는 DNA 단편에 결찰시킴으로써 제작한다.

또한, 여분의 14개 아미노산을 유연한 (Gly₃Ser)₃ 링커로 치환시킴으로써 CMG2-카파를 변형시킨다. 각각의 변이체는 기본구성적 식물 프로모터(CaMV35S, 또는 본 발명자들이 선택하는 또 다른 프로모터) 및 식물 3' 폴리아데닐화 신호 서열의 조절 하에 있는 발현 카세트 내에 위치된다. 상기 발현 카세트는 이원 벡터 pGPTV(참고문헌 48) 내로 클로닝되고, 생성된 플라스미드는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 내로 형질전환된다.

면역접합체	도메인 배열	PA 결합 부위의 예측된 #
V2b	CMG2-Cγ2-Cγ3	2
V4	CMG2-(G3S)3-Cγ2-Cγ3 VWA/I-GGGSGGGSGGGS-EPKSCDKTHTCP-CH2-CH3	2
V3/CMG-카파	CMG2-(G3S)3-Cγ1-Cγ2-Cγ3/ CMG2-(G3S)3-Cκ	4

가장 강력한 항독소를 (마크로파지 보호 분석을 이용하여) 선별한 후, 시판되는 키트를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발을 수행함으로써 (도 14에서 위치 381에 있는) Gln에 대한 코돈을 Asn에 대한 코돈으로 전환시킨다.

담배 일시 발현 시스템

변이체 2b, 4, 5 또는 6의 발현을 위한 이원 벡터를 보유하는 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주들 또는 변이체 3 + 신규 CMG2-카파를 보유하는 2가지 아그로박테리움 균주를 바이러스 침묵 억제자(suppressor)를 코딩하는 이원 벡터(P19)를 보유하는 추가 균주와 함께 니코티아나 벤싸미아나(대략 100)의 잎 내로 침투시킨다. 침묵 억제자는 높은 수준의 발현을 달성하는 데 사용된다. 침투 후, 각각의 아그로박테리움은 이원 벡터로부터 (발현 카세트를 함유하는) 그의 T-DNA를 식물 세포 내로 전달하고, 이 식물 세포에서 상기 T-DNA가 삽입되어 전사된다. 그 후, 면역접합체는 잎 내에서 높은 수준으로 축적되고, 침투로부터 7일 후 잎이 수거되어, 면역접합체의 정제를 위해 가공처리된다. 시험관 내 및 세포 배양 분석뿐만 아니라 래트의 생체 내 독소 중화 연구에 충분한 소량의 (<5 mg) 이들 5가지 키메라 단백질 각각을 이 담배 일시 발현 시스템을 이용하여 단기간 내에 생성할 수 있다(참고문헌 51).

소규모 면역접합체 정제 및 생체물리학적 특징규명

담배 잎(니코티아나 타바쿰 또는 니코티아나 벤싸미아나)을 균질화하고 수성 완충제 중에서 추출하고, 원심분리하고 여과하여 고체를 제거한 후, 온전한 IgG-Fc 영역을 가진 단백질을 단백질 A-세파로스 크로마토그래피로 정제하고, PBS에 대해 투석하고 필터로 멸균한다. 정제된 단백질은 코마시에 염색 및 인간 IgG1(또는 카파 쇄)에 대한 항체를 사용한 면역-블롯팅으로 특징규명한다. 4가지 기준을 이용하여 이 단계에서 성공을 평가한다. 첫째, 단백질 A에 의해 정제된 키메라 단백질은 주로 한 크기의 종으로 구성된다. 둘째, 상기 키메라 단백질은 코딩된 단백질 서열(들)과 일치하는 겉보기 분자량을 가진다. 셋째, 상기 키메라 단백질은 항-IgG 항혈청과 반응한다. 넷째, 상기 키메라 단백질은 RAW 마크로파지 보호 분석에서 현재의 CMG-IgG V2b보다 더 높은 활성을 나타낸다. 본 발명자들은 BIAcore(Pharmacia Biosensor)에서 표면 플라즈몬 공명으로 보호 항원(List Biological Labs)에 대한 면역접합체의 결합 속도를 측정하여 K_d를 산출하는 데 이용한다.

독소 챌린지에 대한 마우스 마크로파지의 보호

독소와 함께 CMG2-IgG를 투여한 후, RAW 264.7 마우스 마크로파지-유사 세포(ATCC #TIB-71)의 생존을 본질적으로 공지된 바와 같이 측정한다(참고문헌 68). CMG2-IgG를 10 내지 1000 ng/㎖으로부터 적정하여, 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 독소(80 ng/㎖ PA, 80 ng/㎖ LF)와 함께 미리 항온처리한다. 3시간 동안 독소에 노출시킨 후, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리늄 브로마이드)를 사용하여 간접적인 생존율 분석을 수행한다. 세포를 2 mg/㎖ MTT가 함유된 배지와 함께 30분 동안 항온처리하고, 산성 이소프로판올(40 mM HCl, 90% 이소프로필 알코올 중의 0.5% SDS)로 가용화시키고, A₅₉₅에서 흡광도를 측정한다. 샴-처리 세포와 비교할 때, 특정된 시약 투여량에서 독소 챌린지로부터 생존하는 세포의 비율은 MTT 분석으로 측정된 바와 같이 보고된다((평균 시험 웰 - 독소만을 함유한 8개의 웰의 평균) x 100%/독소를 함유하지 않은 8개의 웰의 평균). 투여량 반응 곡선으로부터, IC₅₀ 값(활성의 50%가 중화되는 항독소의 농도)이 추정된다. 그 IC₅₀에서 독소에 대한 항독소의 효과적인 몰비 또는 비율은 각각의 키메라 단백질에 대해 측정된다.

유연한 (Gly₃Ser)₃ 링커의 부가는 이량체의 이황화 결합 또는 시험관 내 중화 활성, 또는 이들 둘다를 측정가능하게 개선시킨다.

실시예 20: 탄저 감염의 동물 모델에서 CMG2 - IgG 의 항독소 활성

본 실시예는 본 발명의 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체를 확인하기 위해 수행될 수 있는 동물 시험을 설명한다.

선별된 면역접합체의 Fc 상의 N-글리칸의 존재 또는 부재는 Fc 수용체와의 상호작용 및/또는 항독소의 혈청 반감기의 차이 때문에 독소 또는 바실러스 안쓰라시스 포자 챌린지에 대한 생체 내 효능에 영향을 줄 수 있다. CMG2-IgG의 아글리코실 및 글리코실화된 형태 둘다가 피셔(Fischer) 래트 독소 중화 분석에서 시험된다. 그 다음, 토끼에서 상기 두 형태의 생체 내 반감기를 시험한 후 토끼 포자 챌린지 분석에서의 효능을 시험한다. 래트 생체 내 독소 중화 분석은 일시적 담배 형질감염으로부터 용이하게 공급될 약 3 mg의 각각의 항독소를 필요로 한다. 토끼 약동학 및 포자 챌린지 연구는 안정하게 형질전환된 담배로부터 정제될 약 200 mg의 각각의 항독소를 필요로 한다.

피셔 래트 생체 내 탄저 독소 중화

생체 내 탄저 독소 중화 실험은 본질적으로 이빈스(Ivins, 참고문헌 69)에 의해 기재된 바와 같이 CMG2-IgG의 글리코실화된 형태 및 아글리코실 형태를 사용하여 수행한다. 체중이 200 내지 250 g이며 경정맥 카테터를 가진 수컷 피셔 344 래트(Charles River Laboratories)를 제조사의 지침에 따라 이소플루오란 EZ-마취 챔버(Euthanex Corp, PA) 내에서 마취시킨다. 0.2 ㎖ PBS/0.1% BSA(pH 7.4) 중의 일정 투여량의 항독소(치사 독소에 대한 1x 및 0.5x 몰 당량에 상응하는 0.25 및 0.12 nmol/래트)를 카테터를 통해 투여한다. 5분 후, 치사 독소(0.2 ㎖/200 g 래트에서 PA 20 ㎍ / LF 4 ㎍)를 투여한다. 음성 대조군은 관련없는 식물-제조 인간 IgG1(본 발명자들의 실험실)이다. 5 마리의 동물이 각각의 시험군에서 사용되고(5 마리 동물/군 x 2 투여량 x 2 항독소 = 20 마리 동물), 4 마리의 동물이 각각의 대조군에서 사용된다(4 마리 동물/군 x 2 투여량 대조군 IgG = 8 마리 동물). 동물은 호흡 및 심장박동의 중단에 의해 평가될 때 불편함 및 사망 대 생존의 시간에 대해 모니터링된다. 래트를 치사 독소에 노출시킨 후 또는 사망할 때까지 5시간 동안 마취 하에 유지시켜 불편함을 최소화한다. 5시간 동안 생존하는 래트는 보다 긴 시간 (최대 72 시간) 동안 모니터링된다. 혈청 샘플을 5 시간 간격으로 생존 래트로부터 채취하여 ELISA에 의한 항독소의 농도에 대해 분석한다. 유사한 연구에서, 아바니르 파마슈티칼스에 의해 제조된 항체가 독소에 대한 0.5 x 몰 당량에서 이 투여량의 치사 독소에 대해 모든 동물을 보호하였다(참고문헌 23). 본 발명자들은 본 발명자들의 식물-제조 면역접합체도 마찬가지로 작용할 것이라고 예측한다. 필요하다면, 치사 독소에 대한 훨씬 더 낮은 몰비에서 면역접합체를 사용하여 실험을 반복한다. 최소 유효 투여량은 상기 두 항독소 형태 각각에 대해 결정된다.

토끼에서의 약동학적 매개변수

정맥내(i.v.) 경로에 의해 주입된 CMG2-IgG의 약동학적 성질(PK)을 확립하기 위해, 네덜란드 줄무늬 토끼(Dutch banded rabbit)(군 당 3 마리, 1.5 내지 2.0 kg)에게 중앙 귀 동맥을 통해 토끼 당 10 mg의 CMG2-IgG를 정맥내 주사한다. 주사 1시간 전, 주사 후 1, 4 및 8시간, 및 주사 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 17, 19 및 21일에서 각 동물의 귀 동맥으로부터 혈액 샘플을 채취한다. 혈청을 응고 및 원심분리 후 수득하여 분석할 때까지 -80℃에서 동결 저장한다.

토끼 혈청 샘플 중의 CMG2-IgG의 농도는 기능적 ELISA에 의해 측정한다. 정제된 CMG2-IgG는 표준물로서 사용한다. 1 ㎍/㎖의 농도에서 보호 항원(List Biological Labs)을 마이크로타이터 플레이트(Costar Corp.)의 웰(100 ㎕/웰) 상에 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리한다. 결합되지 않은 항원을 세척하여 제거하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 PBS + 5% 탈지 분유로 블로킹한다. 그 후, 블로킹 용액을 흡입 제거한다. 샘플 및 표준물을 37℃에서 PA-피복 플레이트에 1 시간 동안 가한 후 3회 세척한다. 이 과정 후, 37℃에서 1 시간 동안 염소 항-인간 IgG 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 접합체를 첨가하고, 다시 3회 세척한다. 항체 복합체는 HRP 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 항온처리하여 검출한다. 색상 발현(color development)(405 nm에서의 흡광도)은 벤치마크 마이크로플레이트 판독기(Benchmark Microplate Reader)를 이용하여 측정한다. ELISA는 토끼 혈청 간섭 및 비특이적 결합을 ELISA로 시험한다.

설명을 위해 제공되는 PK 매개변수는 CMG2-IgG에 대한 개개의 혈청 농도-시간 데이타를 기초로 하여 표준 모델-독립적 방법(참고문헌 70)으로 결정한다. 정맥내 투여에 대한 투여-전 시점은 PK 산출에 대한 첫 번째 시점의 농도 값을 배정받는다. 최대 혈청 농도(C_최대), C_최대에 도달하는 데 소요된 시간, 곡선 하의 면적, 전체적 제거, 정적 상태에서의 분포 부피, 말기 반감기, 및 절대 생체이용률(F)을 각각의 토끼에 대해 분석한다.

바실러스 안쓰라시스 포자를 사용한 토끼의 에어로졸 챌린지

기니아 피그(참고문헌 29, 71 및 72), 마우스(참고문헌 9, 및 73 내지 75) 및 토끼(참고문헌 7)에서 탄저 감염에 대한 수동 보호를 연구하기 위한 동물 모델이 개발되어 있다. 마우스 모델의 한 장점은 상기 모델이 훨씬 더 적은 항독소를 필요로 한다는 점이다. 그러나, 항-PA 항체를 사용한 최선의 보호는 토끼에서 있었기 때문에(참고문헌 24 및 27), 본 발명자들은 본 발명자들의 CMG2-IgG를 시험하기 위해 상기 모델을 사용하기로 하였다.

글리코실 및 아글리코실 키메라 독소 수용체 단백질을 약 16월부터 노출 전 예방 연구에서 시험한다. 토끼가 본 연구에서 성공적으로 (최대 투여량의 항독소에서 100%) 보호된다면, 본 발명자들은 약 21월부터 노출 후 처리 연구를 수행한다. 네덜란드 줄무늬 토끼(1.5 내지 2 kg)는 4 마리의 수컷 및 4 마리의 암컷 동물을 포함하는 군으로 무작위로 배정받는다. 노출 전 예방을 위해, 토끼는 0일째 날에 단일 투여량의 CMG2-IgG를 정맥내로 투여받거나(중앙 귀 동맥을 통한 1, 2 또는 4 mg의 CMG2-IgG/토끼), 탄저 포자 챌린지 전 30 내지 45분에 대조군으로서 인산염-완충 식염수(PBS)를 정맥내로 투여받는다. 노출 후 효능을 평가하기 위해, 토끼는 0일째 날에 포자로 챌린지된 후, 챌린지 후 24, 36 또는 48시간에 토끼 당 4 mg의 CMG2-IgG를 단일 정맥내 주사로 투여받거나, 챌린지 후 48시간에 PBS를 정맥내 주사로 투여받는다. 토끼는 표준 프로토콜에 따라 주둥이(muzzle)만 노출되는 시스템을 통해 챌린지된다. 상기 챌린지에 대한 표적 에어로졸 노출은 암스(Ames) 종의 50% 치사 투여량(LD₅₀)(암스 LD₅₀ = 1.05 x 10⁵ 포자(참고문헌 76))의 200배이다. 실제 챌린지 투여량은 출발 농도로부터 결정되고, 누적 분시 호흡량(minute volume)은 노출 전체에 걸쳐 합산된다. 모든 동물은 챌린지 후 28일 동안 매일 2회씩 관찰된다. 혈액 및 혈청을 챌린지 전 및 챌린지 후 1, 2, 7, 10, 14, 21 및 28일째 날에 채취한다. 가능한 경우, 혈액 및 혈청 샘플을 죽어가거나 최근에 죽은("사망 시점에서") 동물로부터 채취하여 바실러스 안쓰라시스의 존재에 대해 분석한다. 28일째 날, 모든 생존자를 마취하고, 폐, 비장 및 흉강내 림프절을 수거하여 배양한다. 혈청 샘플은 멸균 여과하고 배양에 의해 감염되지 않은 것으로 간주된 후, 혈청 CMG2-IgG 수준(D.2.3에서와 같음) 및 토끼 항-PA 역가(후술되어 있음)를 측정하기 위한 ELISA 분석을 위해 플래니트 바이오테크놀로지(Planet Biotechnology)로 보낸다.

면역접합체에 대한 토끼 항- PA 항체 반응의 측정

이전 연구는 항-PA 단일클론 항체에 의한 흡입 탄저로부터 보호된 토끼가 그 자신의 항-PA 항체의 보호 역가를 발생시킨다는 것을 밝혔다. 혈청 중의 CMG2-IgG를 정량하기 위해 이용된 것과 유사한 ELISA를 이용하여 탄저 포자로 챌린지된 토끼에서 PA에 대한 면역 반응을 측정한다. 이 분석에서, 마이크로타이터 플레이트를 1 ㎍/㎖의 농도에서 PA로 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리한다. 결합되지 않은 항원은 세척하여 제거하고 웰을 블로킹한다. 그 다음, 블로킹 용액을 흡입 제거한다. 혈청 샘플의 희석물을 37℃에서 1 시간 동안 플레이트 상에서 항온처리한다. 염소 항-토끼 IgG HRP 접합체(Santa Cruz Biotech)를 37℃에서 30분 동안 첨가하고, HRP 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 항온처리함으로써 색상을 발현시킨다. 색상 발현(405 nm에서의 흡광도)은 벤치마커 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정한다. 광학 밀도 신호가 1.0인 혈청 희석물을 반응의 척도(역가)로서 사용한다.

실시예 21: 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질

키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질은 보툴리늄 독소 수용체를 중쇄 불변 영역에 융합시킴으로써 제작한다. 시냅토태그민 I(STI) 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질 및 SV2 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질을 제작한다.

중쇄에 융합된 보툴리늄 독소 수용체

독소 결합에 충분한 아미노산 서열인 STI(fragSTI) 및 SV2(fragSV2)의 일부는 필요에 따라 축적, 가용성, 정제, 프로테아제 내성, 면역원성을 변화시키기 위한 또는 환자 내에서 반감기를 증가시키기 위한 후속 변형, 및 Gt1b 및 Gd1a와 같은 강글리오사이드와 유리하게 상호작용하는 능력과 같은 표적화를 위해 추가 단백질성 서열(들)을 가진 중쇄 불변 영역에 융합시킨다. 또한, ((Gly)_xSer)_n과 같은 폴리펩티드 링커를 포함시켜 이 서열들의 폴딩 요건과 기능성을 분리한다. 이 폴리펩티드들을 코딩하는 핵산 서열은 클로닝 및 형질전환 과정 중의 재조합을 피하고 발현의 작은 RNA-매개 억제를 피하기 위해 동의(synonomous) 코돈의 사용을 포함하도록 최적화한다.

중쇄 불변 영역에 융합된 보툴리늄 독소 수용체 부분은 fragSTI 또는 fragSV2의 동종- 및 이종-다량체일 수도 있다. 동종-다량체의 경우, 중쇄 불변 영역에 융합된 보툴리늄 독소 수용체 부분은 단일 폴리펩티드 쇄이고, 이 쇄에는 fragSTI 또는 fragSV2의 서열이 2회 이상 존재한다. 즉, 상기 단편의 서열이 단일 일차 아미노산 서열 내에서 연속적으로 존재한다. 다량체화된 결합 단편은 결합친화성 효과에 의한 겉보기 결합 친화성을 증가시킴으로써 효능을 증가시킬 것으로 기대된다. 이종-다량체의 경우, 중쇄 불변 영역에 융합된 보툴리늄 독소 수용체 부분은 단일 폴리펩티드 쇄이고, 이 쇄에는 fragSTI 및 fragSV2 둘다의 서열이 1회 이상 존재한다. 즉, 상기 단편의 서열이 단일 일차 아미노산 서열 내에서 연속적으로 존재한다. 선형 어레이에서 반복된 단편 서열의 위치는 결합친화성을 증가시킴으로써 효능을 증가시키도록 변경된다.

키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질

전술된 보툴리늄 독소 수용체 부분들 각각을 IgG 또는 IgA의 Fc 영역 특히, 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3의 아미노 또는 카복시 말단(αl, α2, α3 및 γl, γ2 및 γ3) 또는 중쇄 불변 영역 2 및 3(α2 및 α3 또는 γ2 및 γ3)에 융합시킨다. 중쇄 불변 영역의 키메라도 제작할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 불변 영역 γl, γ2, α2 및 α3의 키메라를 사용하여 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 용이하게 수행할 수 있다.

경쇄 불변 영역을 가진 개선된 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질

전술된 보툴리늄 독소 수용체 부분들 각각을 전술한 바와 같이 IgG 또는 IgA의 Fc 영역에 융합시키고, 별도의 폴리펩티드 쇄에서 아미노 또는 카르복시 말단에서 경쇄(κ 또는 λ)의 불변 영역에도 융합시킨다. 항체 불변 영역은 합성 및 세포 내에서의 사량체로의 성숙 과정 중에 조립되며, 이때 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역은 다양한 불변 영역들 사이의 공유 및 비-공유 단백질-단백질 상호작용에 의해 통상적인 방식으로 조립된다.

경쇄 불변 영역 및 항체 가변 도메인을 가진 개선된 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질

유인물 성능을 개선시키는 결합 특이성을 가진 항체 가변 도메인은 보툴리늄 독소 수용체 부분과 경쇄 불변 영역을 가진 복합체 내로 도입된다. 하기 종류의 가변 도메인 특이성을 이용하여 유인물 성능을 개선시킬 수 있다: 보툴리늄 독소가 농축되어 있는 것으로 공지되어 있는 시냅스 막으로 유인물을 유도하는 항-강글리오사이드 결합 특이성; 결합된 독소의 신속한 파괴를 보장하기 위해 시냅스 막으로부터 나온 유인물을 다른 혈청 또는 세포 내 성분, 예컨대, Fc-매개 제거에 참여하는 것들로 유도하는 결합 특이성; 및 증가된 결합뿐만 아니라 독소 가교-결합을 촉진하도록 선택될 수 있는 다른 독소 아미노산 서열을 인식하는 가변 영역을 가짐으로써 독소 결합을 증가시키거나 독소 인식을 넓히는 항-독소 특이성.

보다 높은 차수의 다량체

보다 높은 차수의 다량체 sIgA-유사 융합체는 전술된 폴리펩티드를 J 쇄 및 분비 성분(SC) 또는 보호 단백질(PP)의 추가 조립을 유도하도록 중쇄 불변 영역 α2 및 α3에 융합시킴으로써 형성한다.

또한, 보다 높은 차수의 다량체는 전술된 폴리펩티드를 J 쇄 및 여러 (5가지) 항체-유사 융합체가 IgM-유사 유인물 수용체로 조립되도록 IgM의 중쇄 불변 영역에 융합시킴으로써 형성한다.

추가 참고문헌

하기 참고문헌은 그들이 교시하는 전부에 대해 참고로 본원에 도입된다.

상기 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니고 단지 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태를 대표하는 것이다. 인용된 모든 문헌은 본 발명이 속하는 분야의 기술 수준을 나타낸다. 이들 중 어떠한 문헌도 선행 기술인 것으로 인정하는 것은 아니지만, 각 문헌의 개시내용은 그들 각각이 개별적으로 본원에 참고로 완전히 도입되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.

당업자는 본 발명의 목적을 달성하고 전술된 목적 및 이점뿐만 아니라, 그 내에 내재하는 것들을 얻기 위해 본 발명을 충분히 변형할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 전술된 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태들을 나타내며, 예시적인 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 특정한 변형 및 다른 용도가 당업자에게 인식될 것이고, 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 기술적 사상 내에 포함된다.

다양한 치환 및 변형이 본 발명의 범위 및 기술적 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 가해질 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 따라서, 이러한 추가 실시양태는 본 발명의 범위 및 하기 청구의 범위 내에 있다.

본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적절하게 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한 없이 설명을 위한 용어로서 사용되며, 표시되고 기재된 특징들의 임의의 균등물 또는 이의 일부를 배제하는 용어 및 표현들은 의도적으로 사용한 것이 아니다. 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되어 있다 하더라도, 본원에 개시된 임의적 특징, 변형 및 개념의 변경은 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 상기 설명 및 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.

추가로, 본 발명의 특징 및 측면이 마쿠시 군 또는 다른 대안적인 분류의 관점에서 기재되어 있는 경우, 당업자는 본 발명이 마쿠시 군 또는 다른 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원으로 이루어진 하위군의 관점에서 필요에 따라 개별 구성원이 배제된 상태로 기재되어 있다는 것을 인식할 것이다.

다른 실시양태는 하기 청구의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> PLANET BIOTECHNOLOGY, Inc. YU, Lloyd M. WYCOFF, Keith L. LARRICK, James W. <120> IMPROVED CHIMERIC TOXIN PROTEINS AND CHIMERIC TOXIN RECEPTOR PROTEINS FOR TREATMENT AND PREVENTION OF ANTHRAX <130> 415142000452 <140> PCT/US2006/030325 <141> 2006-08-02 <150> US 60/704,829 <151> 2005-08-02 <160> 113 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1596 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60 ttcccaggac ctggcaatgc ccagacatct gtgtccccct caaaagtcat cctgccccgg 120 ggaggctccg tgctggtgac atgcagcacc tcctgtgacc agcccaagtt gttgggcata 180 gagaccccgt tgcctaaaaa ggagttgctc ctgcctggga acaaccggaa ggtgtatgaa 240 ctgagcaatg tgcaagaaga tagccaacca atgtgctatt caaactgccc tgatgggcag 300 tcaacagcta aaaccttcct caccgtgtac tggactccag aacgggtgga actggcaccc 360 ctcccctctt ggcagccagt gggcaagaac cttaccctac gctgccaggt ggagggtggg 420 gcaccccggg ccaacctcac cgtggtgctg ctccgtgggg agaaggagct gaaacgggag 480 ccagctgtgg gggagcccgc tgaggtcacg accacggtgc tggtgaggag agatcaccat 540 ggagccaatt tctcgtgccg cactgaactg 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cagatacaac agcatttggg gccatggtac ctgcacacct aaaacactag 1860 gccacgcatc tgatctgtag tcacatgact aagccaagag gaaggagcaa gactcaagac 1920 atgattgatg gatgttaaag tctagcctga tgagagggga agtggtgggg gagacatagc 1980 cccaccatga ggacatacaa ctgggaaata ctgaaacttg ctgcctattg ggtatgctga 2040 ggccccacag acttacagaa gaagtggccc tccatagaca tgtgtagcat caaaacacaa 2100 aggcccacac ttcctgacgg atgccagctt gggcactgct gtctactgac cccaaccctt 2160 gatgatatgt atttattcat ttgttatttt accagctatt tattgagtgt cttttatgta 2220 ggctaaatga acataggtct ctggcctcac ggagctccca gtccatgtca cattcaaggt 2280 caccaggtac agttgtacag gttgtacact gcaggagagt gcctggcaaa aagatcaaat 2340 ggggctggga cttctcattg gccaacctgc ctttccccag aaggagtgat ttttctatcg 2400 gcacaaaagc actatatgga ctggtaatgg ttcacaggtt cagagattac ccagtgaggc 2460 cttattcctc ccttcccccc aaaactgaca cctttgttag ccacctcccc acccacatac 2520 atttctgcca gtgttcacaa tgacactcag cggtcatgtc tggacatgag tgcccaggga 2580 atatgcccaa gctatgcctt gtcctcttgt cctgtttgca tttcactggg agcttgcact 2640 attgcagctc cagtttcctg cagtgatcag ggtcctgcaa gcagtgggga agggggccaa 2700 ggtattggag gactccctcc cagctttgga agcctcatcc gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2760 atgtgtagac aagctctcgc tctgtcaccc aggctggagt gcagtggtgc aatcatggtt 2820 cactgcagtc ttgacctttt gggctcaagt gatcctccca cctcagcctc ctgagtagct 2880 gggaccatag gctcacaaca ccacacctgg caaatttgat tttttttttt tttttcagag 2940 acggggtctc gcaacattgc ccagacttcc tttgtgttag ttaataaagc tttctcaact 3000 gcc 3003 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Glu Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ser Glu Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cloning primer <400> 6 tctgttccca ggaactagtt tggcacagac atctgtgtcc ccctcaaaag tc 52 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cloning primer <400> 7 cataccgggg actagtcaca ttcacggtca cctcgcgg 38 <210> 8 <211> 799 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser 1 5 10 15 Val Leu Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly 20 25 30 Ile Glu Thr Pro Leu Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn 35 40 45 Arg Lys Val Tyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met 50 55 60 Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu 65 70 75 80 Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser 85 90 95 Trp Gln Pro Val Gly Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr 130 135 140 Thr Val Leu Val Arg Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg 145 150 155 160 Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr 165 170 175 Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro 180 185 190 Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val 195 200 205 Val Cys Ser Leu Asp 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caggtcgacg gtatcgataa ggatccctga 60 aagcgacgtt ggatgttaac atctacaaat tgccttttct tatcgaccat gtacgtaagc 120 gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg ttgtgggcct gtggtctcaa 180 gatggatcat taatttccac cttcacctac gatggggggc atcgcaccgg tgagtaatat 240 tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag gatccctgaa agcgacgttg gatgttaaca 300 tctacaaatt gccttttctt atcgaccatg tacgtaagcg cttacgtttt tggtggaccc 360 ttgaggaaac tggtagctgt tgtgggcctg tggtctcaag atggatcatt aatttccacc 420 ttcacctacg atggggggca tcgcaccggt gagtaatatt gtacggctaa gagcgaattt 480 ggcctgtagg atccctgaaa gcgacgttgg atgttaacat ctacaaattg ccttttctta 540 tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggaccct tgaggaaact ggtagctgtt 600 gtgggcctgt ggtctcaaga tggatcatta atttccacct tcacctacga tggggggcat 660 cgcaccggtg agtaatattg tacggctaag agcgaatttg gcctgtagga tccgcgagct 720 ggtcaatccc attgcttttg aagcagctca acattgatct ctttctcgag ggagattttt 780 caaatcagtg cgcaagacgt gacgtaagta tccgagtcag tttttatttt tctactaatt 840 tggtcgttta tttcggcgtg taggacatgg caaccgggcc tgaatttcgc 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taaacaaata 5940 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 6000 atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt 6060 gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 6120 gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 6180 ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatggacata 6240 ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac ataaccttat gtatcataca catacgattt 6300 aggtgacact ata 6313 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Phaseolus vulgaris <400> 10 Met Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ser Thr Cys Leu Ala 20 <210> 11 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Protein coding region of the plasmid pSHuJ <400> 11 aggatctatc gattcccggg taccatggag aaccatttgc ttttctgggg agtcctggcg 60 gtttttatta aggctgttca tgtgaaagcc caagaagatg aaaggattgt tcttgttgac 120 aacaaatgta agtgtgcccg gattacttcc aggatcatcc gttcttccga agatcctaat 180 gaggacattg 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ttcaaacatt gtgttgtata 60 tgataaacat gtataatttt tgtcaattaa aaatttttag gaagaggagg agaagagaag 120 aagaaggaga aggagaaaga ggaacaagaa gagagagaga caaagacacc aggttttttc 180 tgacccctgg gctatcaaaa cacctattgc ccaataacta gttggccgtt ggtgccctaa 240 actattgaag cgattgctgt tatgtggatg ggccccggac acttagaaac tcgtgacccc 300 <210> 30 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg His 1 5 10 15 Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr 20 25 30 His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser Gln 35 40 45 Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Met 50 55 60 Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile 85 90 95 Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr 100 105 110 Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu 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Ile Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg Asp 420 425 430 Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu Trp Arg Thr 435 440 445 Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu Lys Val Pro 450 455 460 Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val Pro Cys Phe 465 470 475 480 Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys Lys Trp Asn Asn 485 490 495 Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly Pro Ser Lys Ala 500 505 510 Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser Leu Thr Leu Asn 515 520 525 Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys Gly Val Lys Gln 530 535 540 Gly Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val Ala Val Glu Glu Arg 545 550 555 560 Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala Lys Ala Asp Ala Ala 565 570 575 Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu Ile Glu Asn Lys 580 585 590 Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu 595 600 <210> 52 <211> 2533 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 ggtccaactg caggcctgtg gtgcaggagc tgtgtgacca tggggctgtc accaggcctc 60 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agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1740 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1800 tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc cgggctctcg cggtcgcacg aggatgcttg 1860 gcacgtaccc cctgtacata cttcccgggc gcccagcatg gaaataaagc acccagcgct 1920 gccctgggcc cctgcgagac tgtgatggtt ctttccacgg gtcaggccga gtctgaggcc 1980 tgagtggcat gagggaggca gagcgggtc 2009 <210> 55 <211> 2009 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 agctttctgg ggcgagccgg gcctgacttt ggctttgggg cagggagtgg gctaaggtga 60 ggcaggtggc gccagccagg tgcacaccca atgcccgtga gcccagacac tggaccctgc 120 ctggaccctc gtggatagac aagaaccgag gggcctctgc gcctgggccc agctctgtcc 180 cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcctcc accaagggcc catcggtctt 240 ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg 360 cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420 gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc tgcaacgtag 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cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga 900 gtccaaatat ggtcccccat gcccatcatg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc 960 cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg 1020 gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 1080 tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 1140 cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 1200 atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1260 accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320 agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380 aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440 gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680 agcaggctaa ccgtggacaa 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Gly Ala Lys Glu Val Thr Val Arg Gly Pro Gly Ala Ser Pro Val 1 5 10 15 His Arg Thr Cys Arg Leu Ile Pro Leu Leu Leu Ala Gly Met Leu Thr 20 25 30 Thr Gly Leu Ala Gln Ser Pro Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Phe 35 40 45 Trp Ala Leu Ser Glu Asn Leu Thr Val Val Glu Gly Ser Thr Ile Lys 50 55 60 Leu Trp Cys Gly Val Arg Ala Pro Gly Ser Val Val Gln Trp Ala Lys 65 70 75 80 Asp Gly Leu Leu Leu Gly Pro Asn Pro Lys Ile Pro Gly Phe Pro Arg 85 90 95 Tyr Ser Leu Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Glu Phe His Leu Leu Ile 100 105 110 Glu Ala Cys Asp Leu Ser Asp Asp Ala Glu Tyr Glu Cys Gln Val Gly 115 120 125 Arg Ser Glu Leu Gly Pro Glu Leu Val Ser Pro Arg Val Ile Leu Ser 130 135 140 Val Leu Val Pro Pro Lys Val Leu Gln Leu Thr Pro Glu Ala Gly Ser 145 150 155 160 Thr Val Thr Trp Val Ala Gly Gln Glu Tyr Val Val Thr Cys Val Ser 165 170 175 Gly Gly Ala Lys Pro Ala Pro Asp Ile Ile Phe Ile Gln Gly Gly Arg 180 185 190 Thr Val Glu Asp Val Ser Ser Ser Val Asn Glu Gly Ser Glu Glu Lys 195 200 205 Leu Phe Phe Thr Glu Ala 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Glu Asp Asn Gly Leu Ser Leu Thr Cys Glu 420 425 430 Ala Phe Ser Asp Ala Phe Ser Lys Glu Thr Phe Lys Lys Ser Leu Thr 435 440 445 Leu Asn Val Lys Tyr Pro Ala Gln Lys Leu Trp Ile Glu Gly Pro Pro 450 455 460 Glu Gly Gln Ser Ile Arg Thr Gly Thr Arg Val Arg Leu Val Cys Leu 465 470 475 480 Ala Ile Gly Gly Asn Pro Glu Pro Ser Leu Thr Trp Leu Lys Asp Ser 485 490 495 Arg Pro Val Asn Asp Pro Arg Gln Ser Gln Glu Pro Arg Arg Val Gln 500 505 510 Leu Gly Ser Val Glu Lys Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Glu Leu Val 515 520 525 Leu Ile Ile Gly Pro Pro Asp Asn Leu Ala Lys Phe Ser Cys Lys Ala 530 535 540 Gly Gln Leu Ser Ala Ser Thr Gln Leu Val Val Gln Phe Pro Pro Thr 545 550 555 560 Asn Leu Thr Ile Leu Ala Asn Ser Ser Ala Leu Arg Pro Gly Asp Ala 565 570 575 Leu Asn Leu Thr Cys Val Ser Ile Ser Ser Asn Pro Pro Val Asn Leu 580 585 590 Ser Leu Asp Lys Glu Gly Glu Arg Leu Asp Asp Val Ala Ala Lys Pro 595 600 605 Gln Ser Ala Pro Phe Lys Gly Ser Ala Ala Ser Arg Ser Val Phe Leu 610 615 620 Arg Val Ser Ser Arg Asp His Gly His Arg Val Thr Cys Arg Ala His 625 630 635 640 Ser Glu Ala Leu Arg Glu Thr Val Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Asn Val 645 650 655 Leu Tyr Pro Pro Glu Phe Leu Gly Glu Gln Val Arg Ala Val Thr Val 660 665 670 Val Glu Gln Gly Gln Ala Leu Leu Pro Val Ser Val Ser Ala Asn Pro 675 680 685 Ala Pro Glu Ala Phe Asn Trp Thr Phe Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Pro 690 695 700 Ala Gly Gly Pro Arg His Arg Ile Leu Ser Gly Gly Ala Leu Gln Leu 705 710 715 720 Trp Asn Val Thr Arg Ala Asp Asp Gly Phe Tyr Gln Leu His Cys Gln 725 730 735 Asn Ser Glu Gly Thr Ala Glu Ala Leu Leu Lys Leu Asp Val His Tyr 740 745 750 Ala Pro Thr Ile Arg Ala Leu Lys Asp Pro Thr Glu Val Asn Val Gly 755 760 765 Gly Ser Val Asp Ile Val Cys Thr Val Asp Ala Asn Pro Ile Leu Pro 770 775 780 Glu Met Phe Ser Trp Glu Arg Leu Gly Glu Asp Glu Glu Glu Leu Asn 785 790 795 800 Leu Asp Asp Met Glu Lys Met Ser Lys Gly Ser Thr Gly Arg Leu Arg 805 810 815 Ile Arg Gln Ala Lys Leu Ser Gln Ala Gly Ala Tyr Gln Cys Ile Val 820 825 830 Asp Asn Gly Val Ala Pro Ala 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tgtggtggtg 30 <210> 97 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 97 atcctccctg cgtcccccag ccaaactagt agaggtgaac aaaagc 46 <210> 98 <211> 1650 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <221> CDS <222> (34)..(1647) <220> <223> Description of Unknown Organism: ATR-IgA2 fusion nucleotide <400> 98 ggtaccactt ctctcaatcc aactttctaa aca atg gct tct aaa cct ttc ttg 54 Met Ala Ser Lys Pro Phe Leu 1 5 tct ctt ctt tct ttg tct ttg ctt ttg ttc acc tct act agt ttg gct 102 Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala 10 15 20 gac ctg tac ttc att ttg gac aaa tca gga agt gtg ctg cac cac tgg 150 Asp Leu Tyr Phe Ile Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp 25 30 35 aat gaa atc tat tac ttt gtg gaa cag ttg gct cac aaa ttc atc agc 198 Asn Glu Ile Tyr Tyr Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser 40 45 50 55 cca cag ttg aga atg tcc ttt att gtt ttc tcc acc cga gga aca acc 246 Pro Gln Leu Arg Met Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg 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Pro Val Asn Asp 170 175 180 ggc ttt cag gct ctg caa ggc atc atc cac tca att ttg agc tct gct 630 Gly Phe Gln Ala Leu Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Ser Ser Ala 185 190 195 tcc cca acc agc cct aag gtc ttc cct ctc agc ctt gac agc acc cct 678 Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro 200 205 210 215 caa gat ggt aat gtt gtc gtt gct tgc ctt gtc cag ggt ttc ttc cct 726 Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro 220 225 230 cag gag cca ctc tct gtt acc tgg tct gaa tct gga cag aat gtt acc 774 Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr 235 240 245 gcc aga aac ttc cca cct agc cag gat gcc tcc ggt gac ctc tac acc 822 Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr 250 255 260 acc agc tct cag ctc acc ctt cca gcc acc cag tgc cca gat ggt aag 870 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys 265 270 275 tcc gtt acc tgc cat gtt aag cac tac acc aac tcc agc cag gat gtt 918 Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr 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Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser 395 400 405 gga aac acc ttc cgt ccc gag gtc cac ctc ttg cca cca cca tct gag 1302 Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu 410 415 420 gag ctt gcc ctc aat gag ctt gtt acc ctc acc tgc ctt gct cgt gga 1350 Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly 425 430 435 ttc agc cca aag gat gtt ctt gtt agg tgg ctt cag gga tct cag gag 1398 Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu 440 445 450 455 ctt cca cgt gag aag tac ctc act tgg gct tcc cgt cag gag cca agc 1446 Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser 460 465 470 cag gga act acc acc tac gct gtt acc agc atc ctt cgt gtt gct gct 1494 Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala 475 480 485 gag gac tgg aag aag ggt gag acc ttc tcc tgc atg gtt ggt cac gag 1542 Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu 490 495 500 gcc ctt cca ctt gcc ttc acc cag aag acc att gat cgt ttg gct gga 1590 Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly 505 510 515 aag cca acc cac atc aat gtt tct gtt gtc atg gct gag gct gat gga 1638 Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly 520 525 530 535 acc tgc tac taa 1650 Thr Cys Tyr <210> 99 <211> 538 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: ATR-IgA2 fusion amino acid <400> 99 Met Ala Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala Asp Leu Tyr Phe Ile Leu Asp Lys Ser 20 25 30 Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr Phe Val Glu Gln 35 40 45 Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met Ser Phe Ile Val 50 55 60 Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr Glu Asp Arg Glu 65 70 75 80 Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val Leu Pro Gly Gly 85 90 95 Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser Glu Gln Ile Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val Ile Ile Ala Leu 115 120 125 Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr Ser Glu Arg Glu 130 135 140 Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr Cys Val Gly Val 145 150 155 160 Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala Asp Ser Lys Asp 165 170 175 His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu Gln Gly Ile Ile 180 185 190 His Ser Ile Leu Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro 195 200 205 Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys 210 215 220 Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser 225 230 235 240 Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp 245 250 255 Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala 260 265 270 Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr 275 280 285 Thr Asn Ser Ser Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro 290 295 300 Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu 305 310 315 320 Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly 325 330 335 Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly 340 345 350 Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr 355 360 365 Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly 370 375 380 Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu 385 390 395 400 Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His 405 410 415 Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr 420 425 430 Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg 435 440 445 Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp 450 455 460 Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr 465 470 475 480 Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe 485 490 495 Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys 500 505 510 Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val 515 520 525 Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr 530 535 <210> 100 <211> 6602 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2 <400> 100 ctggccggcg ccagatctgg ggaacctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg 60 ataaaccttt tcacgccctt ttaaatatcc gattattcta ataaacgctc ttttctctta 120 ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga 180 caatctgatc atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gaccccgccg atgacgcggg 240 acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc actcagccga 300 tctgaattca ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt 360 caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg 420 gtttcggttc attctaatga atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt 480 ctccgttcaa tttactgatt gtaccctact acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca 540 atatattgtg ctgaataggt ttatagcgac atctatgata gagcgccaca ataacaaaca 600 attgcgtttt attattacaa atccaatttt gagctcggcg cgccagctgg acatcatgtt 660 ggatatgaaa caactattat ttatctacat gttttagatg ttatctgatt atttttatac 720 gtagtcttct attgatgagg agtctaaggc tatagaatta tatatctaaa tgattaatat 780 atatattatt aataattaac aataattaat atattataat ttatatatat atattttata 840 ttattataat aatattctta caaatataat tattatattc gacggtatcg gggcaattgt 900 attcgacggt atcgcgataa gctcgcggat ccctgaaagc gacgttggat gttaacatct 960 acaaattgcc ttttcttatc gaccatgtac gtaagcgctt acgtttttgg tggacccttg 1020 aggaaactgg tagctgttgt gggcctgtgg tctcaagatg gatcattaat ttccaccttc 1080 acctacgatg gggggcatcg caccggtgag taatattgta cggctaagag cgaatttggc 1140 ctgtaggatc cctgaaagcg acgttggatg ttaacatcta caaattgcct tttcttatcg 1200 accatgtacg taagcgctta cgtttttggt ggacccttga ggaaactggt agctgttgtg 1260 ggcctgtggt ctcaagatgg atcattaatt tccaccttca cctacgatgg ggggcatcgc 1320 accggtgagt aatattgtac ggctaagagc gaatttggcc tgtaggatcc ctgaaagcga 1380 cgttggatgt taacatctac aaattgcctt ttcttatcga ccatgtacgt aagcgcttac 1440 gtttttggtg gacccttgag gaaactggta gctgttgtgg gcctgtggtc tcaagatgga 1500 tcattaattt ccaccttcac ctacgatggg gggcatcgca ccggtgagta atattgtacg 1560 gctaagagcg aatttggcct gtaggatccg cgagctggtc aatcccattg cttttgaagc 1620 agctcaacat tgatctcttt ctcgatcgag ggagattttt caaatcagtg cgcaagacgt 1680 gacgtaagta tccgagtcag tttttatttt tctactaatt tggtcgttta tttcggcgtg 1740 taggacatgg caaccgggcc tgaatttcgc gggtattctg tttctattcc aactttttct 1800 tgatccgcag ccattaacga cttttgaata gatacgctga cacgccaagc ctcgctagtc 1860 aaaagtgtac caaacaacgc tttacagcaa gaacggaatg cgcgtgacgc tcgcggtgac 1920 gccatttcgc cttttcagaa atggataaat agccttgctt cctattatat cttcccttaa 1980 ttaaggtacc acttctctca atccaacttt ctaaacaatg gcttctaaac ctttcttgtc 2040 tcttctttct ttgtctttgc ttttgttcac ctctactagt ttggctgacc tgtacttcat 2100 tttggacaaa tcaggaagtg tgctgcacca ctggaatgaa atctattact ttgtggaaca 2160 gttggctcac aaattcatca gcccacagtt gagaatgtcc tttattgttt tctccacccg 2220 aggaacaacc ttaatgaaac tgacagaaga cagagaacaa atccgtcaag gcctagaaga 2280 actccagaaa gttctgccag gaggagacac ttacatgcat gaaggatttg aaagggccag 2340 tgagcagatt tattatgaaa acagacaagg gtacaggaca gccagcgtca tcattgcttt 2400 gactgatgga gaactccatg aagatctctt tttctattca gagagggagg ctaataggtc 2460 tcgagatctt ggtgcaattg tttactgtgt tggtgtgaaa gatttcaatg agacacagct 2520 ggcccggatt gcggacagta aggatcatgt gtttcccgtg aatgacggct ttcaggctct 2580 gcaaggcatc atccactcaa ttttgagctc tgcttcccca accagcccta aggtcttccc 2640 tctcagcctt gacagcaccc ctcaagatgg taatgttgtc gttgcttgcc ttgtccaggg 2700 tttcttccct caggagccac tctctgttac ctggtctgaa tctggacaga atgttaccgc 2760 cagaaacttc ccacctagcc aggatgcctc cggtgacctc tacaccacca gctctcagct 2820 cacccttcca gccacccagt gcccagatgg taagtccgtt acctgccatg ttaagcacta 2880 caccaactcc agccaggatg ttactgttcc atgccgtgtt ccaccacctc caccatgctg 2940 ccacccacgt ctctctcttc accgtcctgc ccttgaggac ttgctcttgg gttctgaagc 3000 taacctcacc tgcaccctca ccggtctcag agatgcctct ggtgccacct tcacctggac 3060 cccaagctct ggtaagagcg ctgttcaagg accacctgag cgtgacctct gtggatgcta 3120 ctctgttagc tctgttcttc ctggttgtgc ccagccttgg aaccacggtg agaccttcac 3180 ctgcactgct gcccacccag agttgaagac cccacttacc gccaacatca ccaagtccgg 3240 aaacaccttc cgtcccgagg tccacctctt gccaccacca tctgaggagc ttgccctcaa 3300 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tattttatca ataaatattt aaactatatt tctttcaaga tgggaattaa ttcactggcc 5880 gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 5940 gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 6000 caacagttgc gcagcctgaa tggcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 6060 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 6120 tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg 6180 gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 6240 tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt 6300 ataagggatt ttgccgattt cggaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 6360 accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 6420 ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt 6480 gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc caccagccag 6540 ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc 6600 ag 6602 <210> 101 <211> 7129 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC <400> 101 ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 60 ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 120 acacattgcg gacgttttta atgtactggg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc 180 aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg 240 gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggttc cgaaatcggc aaaatccctt 300 ataaatcaaa agaatagccc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 360 cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 420 gcccactacg tgaaccatca cccaaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac 480 taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 540 tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc cattcaggct gcgcaactgt 600 tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 660 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 720 acggccagtg aattaattcc catcttgaaa gaaatatagt ttaaatattt attgataaaa 780 taacaagtca ggtattatag 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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 245 250 255 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 260 265 270 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 275 280 285 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 290 295 300 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 305 310 315 320 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 325 330 335 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 340 345 350 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 355 360 365 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr 370 375 380 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 385 390 395 400 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 405 410 415 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 420 425 430 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 435 440 445 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 450 455 460 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 465 470 475 480 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 485 490 495 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 500 505 510 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 515 520 525 Pro Gly Lys 530 <210> 110 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Leu Ala Gln Ser Cys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 20 25 30 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 35 40 45 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 50 55 60 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 85 90 95 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 100 105 110 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 130 135 140 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 145 150 155 160 Pro Glu Val Lys Phe Asn 165 <210> 111 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Leu Ala Gln Ser Cys Thr Glu Ile Leu Glu Leu Gln Pro Ser Ser Val 1 5 10 15 Cys Val Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 20 25 30 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 35 40 45 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 80 Phe Asn <210> 112 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Leu Ala Gln Ser Cys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 1 5 10 15 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 20 25 30 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 35 40 45 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 50 55 60 Val Lys Phe Asn 65 <210> 113 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Leu Ala Gln Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 20 25 30 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 35 40 45 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 50 55 60 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 85 90 95 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 100 105 110 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 160 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 165 170 175 Asn

Claims (84)

1. 면역글로불린 경쇄의 일부와 연결된 면역글로불린 중쇄의 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체; 및 상기 면역글로불린 복합체와 연결된 제1 독소 수용체 단백질을 포함하는 키메라 독소 수용체 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 복합체와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 상기 연결이 상기 면역글로불린 중쇄의 일부와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 공유결합인 키메라 독소 수용체 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 복합체와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 상기 연결이 상기 면역글로불린 경쇄의 일부와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 공유결합인 키메라 독소 수용체 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄와 상기 제1 독소 수용체 사이의 상기 공유결합이 링커를 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
5. 제4항에 있어서, 상기 링커가 (Gly₃Ser)₃ 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
6. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄의 일부와 제2 독소 수용체 단백질 사이의 공유결합을 추가로 포함하는 키메라 독소 수용체 단백질.
7. 제6항에 있어서, 상기 제2 독소 수용체 단백질이 상기 제1 독소 수용체 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
8. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 IgA, IgA₁, IgA₂, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgD, IgE, IgM 및 키메라 면역글로불린 중쇄로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
9. 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 IgA, IgD 또는 IgG 중쇄인 키메라 독소 수용체 단백질.
10. 제9항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄의 일부가 중쇄 불변 영역 2 및 3을 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
11. 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 IgM 또는 IgE 중쇄인 키메라 독소 수용체 단백질.
12. 제11항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 중쇄 불변 영역 2, 3 및 4를 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
13. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄의 일부가 경쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
14. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 카파 쇄 또는 람다 쇄인 키메라 독소 수용체 단백질.
15. 제1항에 있어서, 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 형질전환(transgenic) 식물 내에서 발현되는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
16. 제15항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 단자엽 식물(monocot)인 키메라 독소 수용체 단백질.
17. 제15항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 쌍자엽 식물(dicot)인 키메라 독소 수용체 단백질.
18. 제17항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물이 담배 식물인 키메라 독소 수용체 단백 질.
19. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 제1 독소 수용체 단백질이 인간 단백질인 키메라 독소 수용체 단백질.
20. 제1항에 있어서, 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 식물, 척추동물 또는 무척추동물로부터 유래된 이종 세포 내에서 발현되는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
21. 제20항에 있어서, 상기 이종 세포가 포유동물 세포인 키메라 독소 수용체 단백질.
22. 제20항에 있어서, 상기 이종 세포가 모상근 세포인 키메라 독소 수용체 단백질.
23. 제20항에 있어서, 상기 이종 세포가 식물 조직 배양 세포인 키메라 독소 수용체 단백질.
24. 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질을 2 이상 포함하는 면역접합체(immunoadhesin).
25. 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질 및 J 쇄를 포함하는 면역접합체.
26. 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질, J 쇄 및 분비 성분을 포함하는 면역접합체.
27. 제1항에 있어서, 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 식물-특이적 글리코실화를 가지는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
28. 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질 및 식물 재료를 포함하는 조성물.
29. 병원체 항원을 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 병원체 항원과 숙주 세포의 결합을 감소시키는 방법으로서, 이때 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 상기 항원에 결합하고 상기 병원체 항원과 상기 숙주 세포의 상기 결합을 감소시키는 것인 방법.
30. 병원체의 항원을 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 병원체의 치사율 및 이환율을 감소시키는 방법으로서, 이때 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 상기 항원에 결합하고 상기 병원체 항원과 상기 숙주 세포의 상기 결합을 감소시켜 상기 병원체의 치사율 및 이환율을 감소시키는 것인 방법.
31. 유효량의 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 독소로 인한 치사율 및 이환율을 감소시키는 방법으로서, 이때 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 상기 독소에 결합하여 독성 작용을 감소시키는 것인 방법.
32. 제1항의 키메라 독소 수용체 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
33. (a) 면역글로불린 중쇄의 일부를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열;

    (b) 면역글로불린 경쇄의 일부를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및

    (c) 제1 독소 수용체 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 시스템으로서, 숙주 세포 내에서의 발현 시, 상기 면역글로불린 중쇄, 상기 면역글로불린 경쇄 및 상기 제1 독소 수용체 단백질이 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 것인 발현 벡터 시스템.
34. 키메라 독소 수용체 단백질을 제조하는 방법으로서,

    (a) 면역글로불린 경쇄의 일부와 연결된 면역글로불린 중쇄의 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체, 및 상기 면역글로불린 복합체와 연결된 제1 독소 수용체 단백질을 함께 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 제공하는 단계;

    (b) 상기 하나 이상의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및

    (c) 상기 면역글로불린 복합체 및 상기 제1 독소 수용체 단백질을 발현시켜 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
35. 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체; 및 상기 면역글로불린 복합체와 연결된 제1 탄저(Anthrax) 독소 수용체 단백질을 포함하는 키메라 탄저(Anthrax) 독소 수용체 단백질.
36. 제35항에 있어서, 상기 면역글로불린 복합체와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 상기 연결이 상기 면역글로불린 중쇄의 일부와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 공유결합인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
37. 제35항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질이 본 빌레브랜트 인자 타입 A/인테그린 삽입(Von Willebrand Factor Type A/integrin inserted)(VW/I) 도메인을 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
38. 제35항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질이 그 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
39. 제35항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체가 종양 내피 마커 8(TEM8) 및 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
40. 제39항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체가 TEM8인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
41. 제39항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체가 CMG2인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
42. 제35항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질에는 프로테아제(protease)-감수성 아미노산 서열이 결여되어 있는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
43. 제42항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질이 CMG2이고 상기 단백질에는 아미노산 잔기 TEILELQPSSVCVG가 결여되어 있는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
44. 제35항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 IgA, IgA₁, IgA₂, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgD, IgE, IgM 및 키메라 면역글로불린 중쇄로 구성된 군으로부터 선택된 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
45. 제44항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 IgA, IgD 또는 IgG 중쇄인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
46. 제45항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 2 및 3을 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
47. 제45항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
48. 제44항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드가 IgM 또는 IgE 중쇄인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
49. 제36항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질과 상기 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부 사이의 상기 공유결합이 면역글로불린 힌지(hinge)를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
50. 제36항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질과 상기 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부 사이의 상기 공유결합이 링커를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
51. 제50항에 있어서, 상기 링커가 (Gly₃Ser)₃ 아미노산 서열을 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
52. 제36항에 있어서, 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질이 CMG2의 VWA/I 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 포함하며, 상기 공유결합이 링커를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
53. 제36항에 있어서, 상기 탄저 독소 수용체 단백질이 CMG2의 VWA/I 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 2 및 3을 포함하며, 상기 공유결합이 링커 및 면역글로불린 힌지를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
54. 제36항에 있어서, 상기 탄저 독소 수용체 단백질이 CMG2의 VWA/I 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 2 및 3을 포함하 며, 상기 공유결합이 면역글로불린 힌지를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
55. 제36항에 있어서, 상기 탄저 독소 수용체 단백질이 CMG2의 VWA/I 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 포함하며, 상기 공유결합이 링커를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
56. 제36항에 있어서, 상기 탄저 독소 수용체 단백질이 CMG2의 VWA/I 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 중쇄의 상기 일부가 중쇄 불변 영역 2 및 3을 포함하며, 상기 공유결합이 면역글로불린 힌지 및 링커를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
57. 제36항에 있어서, 상기 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 상기 탄저 독소 수용체 단백질의 세포외 도메인의 임의의 일부를 포함하고; 상기 면역글로불린 중쇄가 IgA₂ 중쇄의 적어도 일부를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
58. 제35항에 있어서, 상기 면역글로불린 복합체가 상기 면역글로불린 중쇄와 연결된 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
59. 제58항에 있어서, 상기 면역글로불린 복합체와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 상기 연결이 면역글로불린 경쇄의 상기 일부와 상기 제1 독소 수용체 단백질 사이의 공유결합인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
60. 제59항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄와 상기 제1 독소 수용체 사이의 상기 공유결합이 링커를 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
61. 제60항에 있어서, 상기 링커가 (Gly₃Ser)₃ 아미노산 서열을 포함하는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
62. 제58항에 있어서, 면역글로불린 중쇄의 상기 일부와 제2 독소 수용체 단백질 사이의 공유결합을 추가로 포함하는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
63. 제62항에 있어서, 상기 제2 독소 수용체 단백질이 상기 제1 독소 수용체 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
64. 제35항에 있어서, 상기 탄저 키메라 독소 수용체 단백질이 형질전환 식물 내에서 발현되는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
65. 제64항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 단자엽 식물인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
66. 제64항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 쌍자엽 식물인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
67. 제66항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물이 담배 식물인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
68. 제35항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 및 제1 탄저 독소 수용체 단백질이 인간 단백질인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
69. 제35항에 있어서, 상기 탄저 키메라 독소 수용체 단백질이 식물, 척추동물 또는 무척추동물로부터 유래된 이종 세포 내에서 발현되는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
70. 제69항에 있어서, 상기 이종 세포가 포유동물 세포인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
71. 제69항에 있어서, 상기 이종 세포가 모상근 세포인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
72. 제69항에 있어서, 상기 이종 세포가 식물 조직 배양 세포인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
73. 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 2 이상 포함하는 면역접합체.
74. 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질 및 J 쇄를 포함하는 면역접합체.
75. 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질, J 쇄 및 분비 성분을 포함하는 면역접합체.
76. 제35항에 있어서, 상기 탄저 키메라 독소 수용체 단백질이 식물-특이적 글리코실화를 가지는 것인 탄저 키메라 독소 수용체 단백질.
77. 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질 및 식물 재료를 포함하는 조성물.
78. 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis)의 보호 항원(PA)을 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, PA와 숙주 세포의 결합을 감소시키는 방법으로서, 이때 상기 탄저 키메라 독소 수용체 단백질이 PA에 결 합하고 PA와 상기 숙주 세포의 상기 결합을 감소시키는 것인 방법.
79. 보호 항원을 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄저 감염으로 인한 치사율 및 이환율을 감소시키는 방법으로서, 상기 탄저 키메라 독소 수용체 단백질이 PA에 결합하고 PA와 상기 숙주 세포의 상기 결합을 감소시켜 탄저의 치사율 및 이환율을 감소시키는 것인 방법.
80. 유효량의 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 탄저 독소로 인한 치사율 및 이환율을 감소시키는 방법으로서, 상기 탄저 키메라 독소 수용체 단백질이 보호 항원에 결합하여 독성 작용을 감소시키는 것인 방법.
81. 제35항의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
82. (a) 면역글로불린 중쇄의 일부를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및

    (b) 제1 탄저 독소 수용체 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 시스템으로서, 숙주 세포 내에서의 발현 시 상기 면역글로불린 중쇄의 일부 및 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질이 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 것인 발현 벡터 시스템.
83. 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 제조하는 방법으로서,

    (a) 면역글로불린 중쇄의 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체, 및 상기 면역글로불린 복합체와 연결된 제1 탄저 독소 수용체 단백질을 함께 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 제공하는 단계;

    (b) 상기 하나 이상의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및

    (c) 상기 면역글로불린 복합체 및 상기 제1 탄저 독소 수용체 단백질을 발현시켜 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
84. 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체; 및 상기 면역글로불린 복합체와 연결된 제1 보툴리늄(botulinum) 독소 수용체 단백질을 포함하는 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질.

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