KR101435420B1 - 개선된 키메라 독소 수용체 단백질 및 탄저병의 예방 및치료를 위한 키메라 독소 수용체 단백질 - Google Patents
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Abstract
면역글로불린 중쇄의 적어도 일부 및 면역글로불린 경쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 복합체와 연결된 독소 수용체를 가진 키메라 독소 수용체 단백질이 기재되어 있다. 이러한 키메라 독소 수용체 단백질은 상기 경쇄를 갖지 않은 키메라 독소 수용체 단백질과 비교할 때 개선된 안정성을 가진다. 안정성이 증가된 탄저 및 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질도 기재되어 있다.
Description
관련된 출원의 상호참조
본원은 참고로 본원에 도입되는, 2005년 8월 2일자로 출원된 미국 가출원 제60/704,829호의 이익을 주장한다.
이 출원들 각각은 모든 도면 및 서열목록을 포함하는 그 전체가 참고로 본원에 도입된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
연방 연구 지원이 연방 연구 허가 1R43AI053005-01A1의 형태로 제공되었다.
본 발명은 키메라 독소 수용체 단백질, 면역접합체(immunoadhesin), 식물로부터의 이의 제조, 및 독성 및 병원체-매개 질병의 치료 및 예방에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
감염 및 발병기전을 매개하는 독소 및 병원체 성분에 대한 유인물(decoy)로서 작용하는 가용성 수용체 및 결합 단백질은 독성 및 다른 병원체-매개 효과를 치료하고 예방하는 유망한 수단이다.
수용체 유인물로 치료될 수 있는 증상의 한 예는 탄저 감염이다. PA(보호 항원, 탄소 독소의 한 성분)에 대한 2가지 세포-표면 수용체, 즉 종양 내피 마커 8(TEM8) 및 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2)가 동종되어 있다(참고문헌 30 및 31). 이 단백질들 둘다의 세포외 도메인의 가용성 형태는 내인성 독소 수용체를 발현하는 세포의 중독을 억제하는 것으로 밝혀졌다. TEM8의 가용성 형태는 80 nM에서 50%까지 치사 독소 작용을 억제하였다(IC50 = 80 nM)(Bradley, K. A., Mogridge, J., Mourez, M., Collier, R. J. & Young, J. A. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414, 225-9 (2001)). CMG2-유래 단백질은 170 pM에서 PA에 대한 친화성을 나타내었고 마크로파지 보호 분석에서 3.1 nM(67 ng/㎖)의 IC50을 나타내므로 탄저 독소 작용의 잠재적으로 강력한 억제제이다(Scobie, H. M., Rainey, G. J., Bradley, K. A. & Young, J. A. Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 5170-4 (2003); Wigelsworth, D. J., Krantz, B. A., Christensen, K. A., Lacy, D. B., Juris, S. J. & Collier, R. J. Binding stoichiometry and kinetics of the interaction of a human anthrax toxin receptor, CMG2, with protective antigen. J Biol Chem 279, 23349-56 (2004)). 세포 배양 분석에서, 가용성 CMG2 세포외 도메인은 PA와 3:1 몰비에서 50%의 치사 독소 활성을 중화시켰다(Scobie et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 5170-4 (2003)). 그러나, 활성 감염 기간 동안 혈액 중의 바실러스(bacillus)의 높은 농도 는 보호를 제공하기 위해 높은 투여량의 항독소를 필요로 할 만큼 PA의 농도가 꽤 높을 수 있음을 시사한다.
수용체 유인물로 치료될 수 있는 증상의 또 다른 예는 흔한 감기가다. 흔한 감기는 일반적으로 비교적 가벼운 질환이다. 그러나, 감기로부터 발생되는 상당한 합병증 예컨대, 중이염, 동염 및 천식 악화가 흔하다. 인간 리노바이러스(rhinoviruse; HRV)는 모든 성인 감기의 최대 50% 및 어린이 감기의 최대 25%를 야기한다(Bella and Rossmann, J Struct Biol. 128:69-74, 1999, and Sperber and Hayden, Antimicrob Agents Chemother. 32:409-19, 1988). 이로 인해 1년에 소요되는 사회적 비용이 막대하다. 이 작은 비-피복 RNA 바이러스는 피코르나바이러스(picornavirus)의 하위군을 대표하며(Rueckert, Virology, pp. 507-548, eds. Fields, et al., Raven Press, Ltd. New York, 1990), 리노 바이러스의 X-선 결정술은 직경이 300 옹스트롬이고(1 옹스트롬 = 0.1 nm) 정이십면체 대칭을 가지며 바이러스 외피(coat) 단백질 VP1, VP2 및 VP3 각각의 6개 복제물로부터 제작된 캡시드(capsid)를 확인시켜 주었다(Rossmann, Nature 317:145-153, 1985). HRV 상의 표면 함몰 또는 "협곡(canyon)"은 수용체 결합 부위로서 제시되었다(Colonno, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85:5449-5453, 1985; Rossmann, et al. Nature 317:145-153, 1985). 특징규명된 102가지 HRV 혈청형 중 91가지(주요 군으로서 공지되어 있음)는 세포내 부착 분자-I(ICAM-1)로서 공지된 세포 표면 당단백질을 그들의 수용체로서 공유하며(Greve, et al., Cell 56:839-847, 1989; Staunton, et al., Cell 56:849-853, 1989); 결합 부위는 N-말단 도메인 1 내에 위치한다(Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Staunton, et al., Cell 61:243- 254, 1990).
ICAM-1은 5개의 세포외 도메인, 소수성 경막 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 가진 막 단백질이다. ICAM-1은 면역 및 염증 반응에서 중요한 많은 세포 상에서 발현되며 다른 세포 상에서는 유도가능하다(Casasnovas, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:4134-9, 1998). ICAM-1은 백혈구 인테그린 LFA-1 및 Mac-1에 대한 리간드로서 작용한다(Springer, Cell 76:301-14, 1994; Staunton et al., Cell 61:243-254, 1990). 세포 표면 상에서, ICAM-1은 경막 도메인의 결합 때문에 주로 이량체이다(Miller, et al., J Exp Med. 182:1231-41, 1995; Reilly, et al J Immunol. 155:529-32, 1995).
5개의 세포외 도메인으로 구성된 ICAM-1의 재조합 가용성 형태(sICAM-1)는 시험관 내에서 인간 세포의 리노바이러스 감염을 차단하는 데 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다(Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, et al., Nature. 344:70-2, 1990). 광범위한 실험실 균주 및 필드 단리물(field isolates)에 대한 sICAM-1 활성의 평가는 HRV의 모든 주요 균주가 sICAM-1에 민감하다는 것을 보여주었다. 수용체로서 ICAM을 사용하지 않는 소수의 균주는 sICAM-1에 의해 영향을 받지 않았다(Crump et al., Antiviral Chem Chemother. 4:323-327, 1993; Ohlin, et al., Antimicrob Agents Chemother. 38:1413-5, 1994).
시험관 내에서 가용성 ICAM-1의 항-바이러스 활성은 하나 이상의 기작에 의해 매개되는 것으로 보인다. 이 기작들로는 결합 부위에 대한 세포-표면 ICAM-1과 의 경쟁, 바이러스 도입 또는 탈피복의 저해, 및 바이러스 RNA의 조기 방출 및 빈 캡시드의 형성에 의한 직접적인 불활성화가 있다(Arruda, et al., Antimicrob Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Greve, et al., J Virol. 65:6015-6023, 1991; Marlin, et al., Nature 344:70-2, 1990; Martin et al., J Virol. 67:3561-8, 1993).
HRV의 숙주 범위는 영장류로 한정되어 있다. 최근 연구는 가용성 ICAM-1이 침팬지에서 리노바이러스 감염을 방해하는 데 효과적임을 보였다(Huguenel, et al., Am J Respir Crit Care Med. 155:1206-10, 1997). 침팬지가 임상적 증상을 보이지 않는다고 하더라도, 감염은 혈청전환 및 바이러스 전파(shedding)의 측정에 의해 입증되었다. 비강내 분무로서 투여된 단회 투여량 10 mg의 가용성 ICAM-1은 HRV와 동시에 투여되는 경우 또는 상기 바이러스가 10분 후에 투여된 경우 HRV-16의 감염을 예방하는 데 효과적이었다.
가용성 ICAM-1을 사용한 인간 임상 시험은 ICAM-1이 실험적 HRV 감기의 심각성을 경감시킨다는 것을 보여주었다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999). 이 시험에서 총 196명의 피실험체는 다양한 제제 중의 가용성 ICAM-1 또는 플라세보를 투여받았다. 일부 피실험체는 HRV 39로의 접종 7시간 전부터 가용성 ICAM-1 또는 플라세보를 투여받았고, 나머지 피실험체는 바이러스 접종 12시간 후부터 투여받았다. 약물은 7일 동안 매일 6회 투여량(1일 당 총 4.4 mg)으로 주어진 비강내 용액 또는 산제로서 투여되었다. 본 연구에서, 가용성 ICAM-1은 바이러스 단리 또는 혈청전환에 의한 측정 시 감염을 방해하지 못하였다(플라세보-처리의 경우 92% 의 감염률 대 가용성 ICAM-1 처리의 경우 85%의 감염률). 그러나, 가용성 ICAM-1은 질병의 모든 척도에 대해 영향을 주었다. 총 증상 스코어는 45%까지 감소되었고, 임상적 감기를 가진 피실험체의 비율은 23% 감소되었으며, 비강 점막 중량은 56%까지 감소되었다. 산제 사용과 용액 제제의 사용 사이, 또는 접종 전 군과 접종 후 군 사이에는 유의한 차이가 없었다. 가용성 ICAM-1을 사용한 치료는 어떠한 불리한 효과를 나타내거나 비강 점막을 통한 흡수의 증거를 나타내지 않았다. 항-HRV 유형-특이적 항체의 발생에 대한 억제도 없었다.
논의된 바와 같이, ICAM-1은 세포 표면 상에서 이량체로 존재한다. 마틴(Martin)과 그의 동료들은(Martin et al., in J Virol. 67:3561-8, (1993))은 다량체 가용성 ICAM에 의한 HRV에의 다가(multivalent) 결합이 결합친화성(avidity)으로 불리는 보다 높은 효과적인 친화성을 발생시켜, 바이러스의 탈피복을 용이하게 한다고 최초로 제안하였다. 이들은 다가 ICAM-1/면역글로불린 분자가 HRV를 중화시키는 데 있어서 일가(monovalent) 가용성 ICAM-1보다 더 효과적일 것이므로 증가된 치료적 유용성을 가질 것이라는 가정 하에 다가 ICAM-1/면역글로불린 분자를 제작하였다. 이 ICAM-1/면역글로불린 분자는 IgA1(IC1-2D/IgA), IgM(IC1-2D/IgM) 및 IgG1(IC1 -2D/IgG)의 중쇄의 힌지(hinge) 및 불변 도메인에 융합된 ICAM-1 아미노-말단 도메인 1 및 2를 포함하였다. 또한, 5개의 세포외 도메인은 IgA1(IC1-5D/IgA)에 융합되었다. 이 ICAM-1/면역글로불린 분자들은 HRV 결합, 감염성 및 입체구조의 분석에서 2개의 (sIC1-2D) 및 5개의 (sIC1-5D) 도메인을 가진 ICAM-1의 가용성 형태와 비교되었다. ICAM-1/IgA 면역글로불린(IC1-5D/IgA)은 가용성 ICAM-1 보다 200배 더 효과적이었고, ICAM-1/IgM 면역글로불린(IC1-2D/IgM) 및 ICAM-1/IgG 면역글로불린 분자(IC1-2D/IgG)는 가용성 ICAM-1보다 25배 및 10배 더 효과적이었다. 이 분자들은 리노바이러스와 세포의 결합 억제 및 바이러스 캡시드의 입체구조 파괴에 매우 효과적이었다. ICAM-1/IgA 면역글로불린 분자는 나노몰 농도 범위에서 효과적이었다. IC1-2D/IgA와 IC1-2D/IgG의 비교는 사용된 Ig 불변 영역의 클래스(class)가 효능에 큰 영향을 준다는 것을 보여주었다.
후속 연구는 9가지 주요 HRV 혈청형 및 가용성 ICAM-1에 대한 중간 정도의 내성에 대해 선별된 HRV-39의 변이체에 대한 가용성 ICAM-1 및 IC1-5D/IgA의 억제 활성을 비교하였다(Crump, et al., Antimicrob Agents Chemother. 38:1425-7, 1993). IC1-5D/IgA는 표준 혈청형에 대해 중량 기준으로 단량체 가용성 ICAM-1보다 50 내지 143배까지 더 강력하였으며, 표준 혈청형에 대해 몰 기준으로 단량체 가용성 ICAM-1보다 60 내지 170배까지 더 강력하였다. HRV-39 변이체는 야생형보다 가용성 ICAM-1에 대해 38배 더 높은 내성을 보였지만, IC1-5D/IgA에 대해서는 단지 5배 더 높은 내성을 보였다. 이는 다가 분자에 의한 억제로부터의 바이러스 회피가 단량체 가용성 수용체에 의한 억제로부터의 바이러스 회피보다 더 낮은 빈도로 일어날 것으로 예측된다는 가설과 일치한다(Martin, et al., J Virol. 67:3561-8, 1993). 바이러스 불활성화를 측정하기 위해 디자인된 분석은 HRV-39 및 HRV-13이 가용성 ICAM-1에 의해 상당한 정도까지 직접적으로 불활성화되지 않는다는 것을 보였다(감염성에서 <0.5 log.sub.1O 감소). 그러나, IC1-5D/IgA와 함께 항온처리하면 이 바이러스들의 감염성이 약 1.0 log10까지 감소되었다(Crump, et al., Antimicrob Agents Chemother. 38:1425-7, 1994). 마틴과 그의 동료들(J Virol. 67:3561-8, 1993)의 결과는 결합가(valence)가 클수록, 분자의 효능이 더 높다는 것을 시사한다. IC1-2/IgM의 이량체 및 십량체 형태는 슈크로즈 구배 침강에 의해 분리될 수 있었다. 십량체 형태는 HRV와 HeLa 세포의 결합 차단에 있어서 이량체 형태보다 5배 더 효과적이었다.
효능을 보장하는 데 필요한 수용체 유인물 단백질의 양을 최소화하기 위해, 수용체 유인물의 특이적 활성 또는 효능을 훨씬 더 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 보다 높은 활성 및 개선된 약동학적 특성을 가진 강력한 유인물이 여전히 필요하다.
공지되어 있는 수용체 유인물은 어려운 제조 기법 및 이 제조 방법과 관련된 고비용을 비롯한 여러 단점을 가진다. 또한, 이 수용체 유인물들은 이 분자들이 병원체를 불활성화시킬 필요가 있는 가혹한 환경 하에 다량체로서의 한정된 안정성을 가진다. 따라서, 수율을 증가시키기 위해 증가된 안정성을 가지며 적당한 비용으로 상업적으로 적합한 부피로 제조될 수 있는 유인 기술이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 독소 수용체가 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부 및 면역글로불린 경쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 복합체와 연결되어 있는 키메라 독소 수용체 단백질에 관한 것이다. 독소 수용체는 병원체 효과를 이끌어내거나 발휘하는 독소 또는 단백질에 결합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 키메라 독소 수용체 단백질은 경쇄가 없는 키메라 독소 수용체 단백질에 비해 개선된 안정성을 가진다. 독소 수용체와 면역글로불린 복합체 사이의 연결은 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합 또는 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 통한 것일 수 있다. 공유결합은 전형적으로 링커, 예를 들면, 유연한 폴리펩티드 서열 (Gly3Ser)3이다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 제1 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합뿐만 아니라 제2 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 독소 수용체 및 제2 독소 수용체는 동일한 아미노산 서열을 가지나, 다른 실시양태에서, 상기 수용체들은 상이한 서열을 가진다.
기재된 키메라 독소 수용체 단백질 내의 면역글로불린 중쇄는 임의의 종류의 중쇄, 예를 들면, IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgE, IgM 또는 키메라 면역글로불린 중쇄일 수 있다. 중쇄가 IgA, IgD 또는 IgG 중쇄인 경우, 이 중쇄의 일부는 불변 영역 2 및 3일 수 있다. 별법으로, 중쇄가 IgM 또는 IgE 중쇄인 경우, 이 중쇄의 일부는 불변 영역 2, 3 및 4일 수 있다.
면역글로불린 경쇄는 바람직하게는 경쇄 불변 도메인을 포함하고 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 비롯한 식물에서 식물 게놈의 일부로서 발현된다. 담배는 발현에 바람직한 식물이다. 배양된 포유동물 세포에서의 발현과 대조적으로 식물 내에서의 발현 은 키메라 독소 수용체 단백질의 제조 비용을 상당히 감소시킨다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 키메라 독소 수용체 단백질의 제조에 사용되는 모든 단백질은 인간 단백질이다. 식물 또는 식물 세포 내에서의 생성 이외에, 본 발명은 식물, 척추동물 또는 무척추동물, 예컨대, 포유동물 세포, 모상근 세포 또는 식물 조직 배양 세포로부터 유래된 이종 세포 내에서 발현된 키메라 독소 수용체 단백질에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 독소 수용체를 비롯한 면역접합체(immunoadhesin)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 2개 이상의 키메라 독소 수용체 단백질을 포함하는 다량체이다. 다른 실시양태에서, 면역접합체는 연결(J) 쇄와 연결된 키메라 독소 수용체 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, J 쇄와 연결된 면역접합체를 포함하는 조성물은 분비 성분과 추가로 연결되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 식물-특이적 글리코실화를 가진 키메라 독소 수용체 단백질에 관한 것이다. 자신의 아미노산 서열 내에 글리코실화 신호 아스파라진-X-세린/쓰레오닌(이때, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음)을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 식물 세포 내에서 발현될 때 서열의 아스파라진 잔기에 연결된 올리고사카라이드를 통해 글리코실화된다. 글리코실화 신호로서 작용하는 폴리펩티드 서열의 일반적인 검토를 위해서는 문헌(Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) and Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974))을 참조한다. 이 신호들은 포유동물 및 식물 세포 둘다에서 인식된다. 식물 또는 식물 세포 내에서 발현된 단백질들은 이들의 성숙 말기에서 포유동물 세포 및 곤충 세포를 비롯한 다른 종류의 세포 내에서 발현된 단백질들의 글리코실화 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 가진다. 식물-특이적 글리코실화의 특징규명, 및 이것과 다른 종류의 세포 내에서의 글리코실화를 비교하는 상세한 연구는 예를 들면, 문헌(Cabanes-Macheteau et al, Glycobiology 9(4):365-372 (1999), and Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997))에 기재된 연구에서 수행된 바 있다. 이 연구진 및 다른 연구진은 식물-특이적 글리코실화가 만노즈에 β(1,2)-결합된 크실로즈를 가진 글리칸을 발생시키지만, 크실로즈는 포유동물 및 곤충 세포 내에서의 글리코실화로 인해 만노즈에 β(1,2)-결합하지 않는다는 것을 밝혔다. 식물-특이적 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,3)-결합하게 하지만, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,6)-결합하게 한다. 더욱이, 식물-특이적 글리코실화는 단백질 글리칸의 말단에 시알산을 부가시키지 못하는 반면, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화의 경우, 시알산이 부가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 식물성 물질을 추가로 포함한다. 존재하는 식물성 물질은 식물 세포 벽, 식물 소기관, 식물 세포질, 온전한 식물 세포, 식물 종자, 생존 식물 등일 수 있다. 존재할 수 있는 구체적인 식물성 물질 또는 식물성 거대분자로는 리불로즈 비스포스페이트 카르복실라제(ribulose bisphosphate carboxylase), 집광 복합체(light harvesting complex), 색소, 2차 대사물질 또는 클로로필 및 이들의 단편이 있다. 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.001 질량% 내지 99.9 질량%의 키메라 독소 수용체 단백질 농도를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 물을 제외하고 0.01 질량% 내지 99 질량%의 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.01 질량% 내지 99 질량%의 농도로 존재하는 식물성 물질 또는 식물성 거대분자를 가진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 병원체 항원과 키메라 독소 수용체 단백질을 접촉시킴으로써 병원체 항원의 결합을 감소시키는 방법을 제공하는데, 이때 상기 병원체는 숙주 세포에 대한 병원성 분자, 병원체성 바이러스 또는 병원체성 세포 유기체일 수 있다. 다른 측면은 병원체의 이환율 및 치사율, 및 독소와 같은 병원성 분자로 인한 이환율 및 치사율을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 병원체 항원은 이 용어가 본원에 사용될 때 항체의 형성을 자극할 수 있거나 자극할 수 없다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄의 일부를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 면역글로불린 경쇄의 일부를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제1 독소 수용체 단백질을 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 시스템을 제공하는데, 이때 숙주 세포 내에서의 발현 시 상기 면역글로불린 중쇄, 상기 면역글로불린 경쇄 및 상기 제1 독소 수용체 단백질은 키메라 독소 수용체 단백질을 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄의 일부와 연결된 면역글로 불린 중쇄의 일부를 가진 면역글로불린 복합체 및 이 면역글로불린 복합체와 연결되어 있는 제1 독소 수용체 단백질을 함께 발현하는 하나 이상의 발현 벡터들을 제공하는 단계; 이 하나 이상의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 상기 면역글로불린 복합체와 상기 제1 독소 수용체 단백질을 발현시켜 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는, 키메라 독소 수용체 단백질의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 복합체와 연결되어 있는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 고려한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 탄저 독소 수용체는 본 빌레브랜트 인자 타입 A/인테그린 삽입(Von Willebrand Factor Type A/integrin inserted)(VW/I) 도메인을 가질 것이다. 전형적으로, 탄저 독소 수용체는 상기 수용체 분자의 세포외 도메인을 가질 것이다. 탄저 독소 수용체는 공지된 수용체 종양 내피 마커 8(TEM8) 및 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2)를 포함하는, 보호 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 탄저 독소 수용체는 프로테아제-감수성 아미노산 서열을 갖지 않는다. 예를 들면, 탄저 독소 수용체가 CMG2 단백질인 경우, 탄저 독소 수용체는 바람직하게는 아미노산 서열 TEILELQPSSVCVG(서열번호 102)를 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄는 모든 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 가진 IgA, IgD 또는 IgG 중쇄이다. 다른 실시양태에서, 중쇄는 중쇄 불변 영역 2 및 3만을 가진다.
탄저 독소 수용체 단백질과 면역글로불린 중쇄의 일부 사이의 공유결합은 면역글로불린 힌지 또는 임의의 종류의 링커, 바람직하게는 (Gly3Ser)3 아미노산 서열을 가진 링커일 수 있다.
탄저 키메라 독소 수용체의 바람직한 실시양태는 1) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 링커에 의해 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 2) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 링커 및 면역글로불린 힌지에 의해 중쇄 불변 영역 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 3) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 면역글로불린 힌지에 의해 중쇄 불변 영역 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 4) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 링커에 의해 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 5) CMG2 수용체의 VWA/I 도메인을 가진 탄저 독소 수용체 단백질이 면역글로불린 힌지 및 링커에 의해 중쇄 불변 영역 2 및 3을 가진 면역글로불린 중쇄의 일부와 공유결합된 것; 및 6) 상기 탄저 독소 수용체 단백질의 세포외 도메인의 임의의 일부가 IgA2 중쇄의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 중쇄와 공유결합된 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 탄저 키메라 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 복합체 내에서 면역글로불린 중쇄와 연결되어 있는 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 전술한 바와 같이, 독소 수용체와 면역글로불린 복합체 사이의 연결은 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합 또는 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 통한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 제1 독소 수용체와 중쇄 사이의 공유결합뿐만 아니라 제2 독소 수용체와 경쇄 사이의 공유결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 독소 수용체와 제2 독소 수용체는 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 다른 실시양태에서, 상기 수용체들은 상이한 서열을 가진다.
상기 수용체 단백질 또는 이의 일부에 대한 변이체 및 변형체도 고려하되, 이러한 변형체는 독소, 독물, 병원체 또는 병원체 성분과 결합하는 상기 수용체의 능력을 파괴하지 않는다.
모든 종류의 키메라 독소 수용체 단백질에 대해 전술한 바와 같이, 탄저 키메라 독소 수용체 단백질은 식물 및 다양한 이종 세포 내에서 발현될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 키메라 독소 수용체 단백질을 제조하는 데 사용되는 모든 단백질은 인간 단백질이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 탄저 키메라 독소 수용체, 예컨대, 2개 이상의 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 가진 다량체, J 쇄와 연결되어 있는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질, 및 J 쇄 및 분비 성분과 연결되어 있는 탄저 키메라 독소 수용체 단백질을 비롯한 면역접합체를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 식물-특이적 글리코실화를 가진 탄저 키메라 독소 수용체 단백질, 및 식물성 물질과 추가로 연결되어 있는 상기 조성물을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis)의 보호 항원(PA)을 본원에 기재된 탄저 키메라 독소 수용체와 접촉시킴으로써 PA와 숙주 세포의 결합을 감소시키거나 방해하는 방법을 특징으로 한다. 다른 측면은 탄저병의 이환율 및 치사율, 및 보호 항원으로 인한 이환율 및 치사율을 감소시키는 방법을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 탄저 키메라 독소 수용체를 포함하는 약학 조성물, 이러한 수용체 대한 발현 벡터, 및 이러한 수용체의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 상이한 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 복합체가 보툴리늄(botulinum) 독소 수용체 단백질과 연결되어 있는 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 가진 것인 키메라 보튤리늄 독소 수용체 단백질을 제공한다.
도 1은 인간 ICAM-1의 처음 5개 도메인을 함유하는 키메라 ICAM-1 분자를 코딩하는 DNA와 인간 IgA2m(2)의 Fc 영역을 코딩하는 DNA가 융합되어 있는 pSSPHuA2 벡터를 나타낸 것이다[서열번호 9 및 48]. 이 벡터는 신호 펩티드, 및 인간 IgA2m(2) 중쇄의 불변 영역의 발현을 유도하기 위한 SuperMas 프로모터를 함유한다. ICAM 도메인 1 내지 5를 코딩하는 서열은 신호 펩티드와 Cα1 도메인 사이에의 삽입을 위한 편리한 제한효소 부위(5' Spel 및 3' Spel)가 함유되도록 PCR에 의해 증폭되었다. 컨스트럭트(construct)의 발현 수준을 급격히 증가시키기 위해 ER 보유 신호(RSEKDEL)를 코딩하는 DNA[서열번호 5]가 중쇄의 3' 말단에 부가되었다.
도 2는 키메라 ICAM 분자를 나타낸 것이다. 2A는 키메라 ICAM-1 분자가 제조 된 DNA 발현 카세트를 보여준다. 2B는 신호 펩티드 절단 후 융합 단백질의 성숙 형태의 아미노산 서열을 보여준다[서열번호 8]. 클로닝 과정에 의해 도입된 아미노산은 밑줄로 표시되어 있고 ICAM-1의 5개 세포외 도메인과 IgA2m(2) 중쇄의 Cα1-Cα3 도메인 사이의 접합부(junction)를 표시한다. 굵은 글자체로 표시된 N은 15개의 잠재적 글리코실화 부위를 표시한다.
도 3은 독립적으로 형질전환된 담배 유합조직(tobacco callus) 내에서의 면역접합체의 발현을 나타낸다. 3A는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여주는데, 이때 상기 겔 상에서 상이한 형질전환 담배 유합조직(C) 및 수성 추출물(Aq)을 함유하는 샘플들이 런닝되었고 인간 ICAM의 존재에 대해 프로빙되었다. 분자량 마커가 표시되어 있으며, 기준 표준물(R)은 인간 ICAM(~75 kD)과 인간 SigA(>>250 kD)의 혼합물(각각 ~75 ng)이었다. 3B는 유합조직 Rhi107-11로부터 부분적으로 정제된 면역접합체의 다양한 분획을 함유하는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여준다. 분석된 정제 분획은 쥬스(3), G-100 분획(G), 멸균 여과된 G-100 분획(SG), 및 인간 SigA(75 ng)와 인간 ICAM-1(75 ng)의 혼합물(RS)인 기준 표준물이었다. 블롯은 인간 ICAM(~ICAM), 인간 IgA 중쇄(~α), 인간 분비 성분(~SC) 및 인간 J 쇄(~J)에 대한 항체들로 프로빙되었다. 필요에 따라 2차 효소-접합 항체를 사용하여 알칼리성 포스파타제로 면역-양성 밴드를 표지하였다.
도 4는 항-ICAM mAb에의 결합에 대해 식물 추출물과 가용성 ICAM-1 사이의 경쟁을 보여주는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 결과를 나타낸 것이다. 상기 분석을 위해, 96-웰 플레이트를 0.25 ㎍의 가용성 ICAM-1/㎖로 피복하였다. 사각형 은 증가하는 농도의 sICAM을 나타내고, 원은 일정량의 마우스(항-인간 ICAM) 항체에 대해 부착된 ICAM과 경쟁하는 데 사용된 증가량의 유합조직 추출물(G-100으로부터 멸균 여과된 분획)을 나타낸다.
도 5는 HeLa 세포의 인간 리노바이러스 사멸을 억제하는 면역접합체의 능력을 보여주는 분석(세포변성 효과 또는 CPE 분석)의 결과를 나타낸 것이다. 5A는 ICAM-Fc 융합체 내에 면역접합체(IC1-5D/IgA)를 함유하거나 독소루비신에 대한 항체를 함유하는 부분적으로 정제된 추출물의 존재 하에 HeLa 세포 상의 인간 리노바이러스의 CPE를 비교하는 분석의 결과를 보여준다. (정삼각형 및 역삼각형은 면역접합체를 함유하는, Rhi107-11로부터 유래된 2개의 추출물을 나타낸다.) 5B는 ICAM-Fc 융합체(IC1-5D/IgA) 내의 면역접합체로부터의 가용성 인간 ICAM-1 또는 추출물의 존재 하에 HeLa 세포 상의 인간 리노바이러스의 CPE를 비교하는 분석의 결과를 보여준다. 삽입도는 가용성 ICAM(1.35 ㎍/㎖) 및 IC1-5D/IgA(0.12 ㎍/㎖; 11.3 배 더 적음)에 대한 IC50의 범위에서의 규모 팽창을 보여준다.
도 6은 최종 면역접합체 1 g을 제조하기 위한 제조 필수품의 평가를 보여준다. 이 도표에서, 예측된 발현 수준 및 식물 중량에서 20% 수율로 1 g의 면역접합체의 제조에 필요한 식물의 수가 기재되어 있다. 상이한 수준의 면역접합체 발현(mg/kg 생중량) 및 총 회수율(20%로 설정됨)에서, 각 식물의 중량 및 그에 따른 식물의 총 수는 타당한 가능성의 영역(점으로 표시된 사각형) 내에서 명시된 제조 표적(1 g/수거)에 대해 측정될 수 있다. 필요한 식물의 수는 명시된 성장 및 재성 장 기간의 숫자에 역으로 감소한다. 시간과 성장 조건의 함수인 예측된 생체질량(biomass) 생성은 수거 시간 및 수거 사이의 기간에 영향을 준다. 이 성장 기간은 식물을 심는 날짜와 수거하는 날짜를 교대로 엇갈리게 함으로써 정제 스케쥴의 현실성에 맞춰질 수 있다.
도 7은 표 2에 나열된 면역글로불린 유전자 및 단백질 각각의 코딩 서열 및 아미노산 서열을 보여준다[서열번호 15 내지 47 및 서열번호 52 내지 62].
도 8은 본 발명의 면역접합체의 발현 연구에 사용하기 위한, 실시예 2에 기재된 바와 같은 식물을 형질전환시키는 데 사용된 플라스미드의 서열을 보여준다.
도 8A는 플라스미드 PSSpICAMHuA2에 대한 뉴클레오티드 서열[서열번호 9] 및 단백질 서열[서열번호 48]을 보여준다.
도 8B는 콩 레구민(legumin) 신호 펩티드의 뉴클레오티드 및 단백질 서열[서열번호 10]을 보여준다.
도 8C는 pSHuJ의 단백질 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열[서열번호 11] 및 아미노산 서열[서열번호 50]을 보여준다.
도 8D는 pSHuSC의 단백질 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열[서열번호 12] 및 아미노산 서열[서열번호 51]을 보여준다.
도 8E는 플라스미드 pBMSP-1의 뉴클레오티드 서열[서열번호 13]을 보여준다.
도 8F는 플라스미드 pBMSP-1spJSC의 뉴클레오티드 서열[서열번호 14]을 보여준다.
도 9는 ICAM-1 및 인간 IgA2에 대한 뉴클레오티드 및 단백질 서열[서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8], 및 다른 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 10은 ATR-IgA2 융합체(면역접합체)의 전체 뉴클레오티드 서열[서열번호 98] 및 아미노산 서열[서열번호 99]을 보여준다.
도 11은 플라스미드 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2의 T-DNA 경계 사이의 서열[서열번호 100]을 보여준다.
도 12는 플라스미드 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC의 T-DNA 경계 사이의 서열[서열번호 101]을 보여준다.
도 13은 세포변성 효과 분석을 보여준다. ICAM-1/IgA2(다이아몬드)와 가용성 ICAM-1(사각형)은 인간 리노바이러스와 다양한 농도에서 혼합된 후, HeLa 세포에 첨가되었다. 세포 사멸의 억제를 4일째 날에 정량하였다.
도 14는 CMG2-IgG 컨스트럭트 및 변이체의 아미노산 서열을 보여준다. 굵은 글자체의 시스테인(상기 서열의 Cys185, 및 공개된 CMG2 서열(참고문헌 31)의 Cys218)은 VWA/I 도메인의 마지막 아미노산이다. 뒤따르는 14개의 아미노산(이탤릭체로 표시됨)은 CMG2의 일부이지만, VWA/I 도메인이 아니다. 서열 위의 표지는 IgG1 Cγ1, Cγ2 및 Cγ3의 시작 부위를 표시한다. 밑줄로 표시된 서열은 IgG1 힌지 영역이다. 변이체의 서열(V1, V2a, V2b 및 V3)은 결실된 아미노산을 나타내는 대시(-)로 표시되어 있다. 굵은 글자체의 아미노산 위의 숫자는 (문맥 내에 기재된) 시퀀싱된 단편의 아미노 말단을 나타낸다.
도 15는 단백질-A 정제된 CMG2-IgG 및 1H IgG의 은-염색 겔이다. 레인 1 및 4는 단백질 크기 표준물이고; 레인 2는 환원된 CMG2-IgG이며; 레인 3은 환원된 1H이고; 레인 5 및 6은 2개의 분리된 표본으로부터의 비-환원된 CMG2-IgG이며; 레인 7은 비-환원된 1H이다. 재조합 단백질 샘플은 레인 당 50 ng의 단백질을 함유한다. CMG2-IgG 면역접합체 및 가능한 분해 생성물을 나타내는 밑그림은 우측에 나타나 있다.
도 16은 CMG2-IgG 및 변이체의 코마시에-염색 SDS-PAGE이다. 레인 1 내지 7은 비-환원 조건 하에 런닝되었다. 레인 8 내지 13은 환원 조건(100 mM DTT) 하에 런닝되었다. 레인 1 및 8은 본래의 CMG2-IgG이며; 레인 2 및 9는 V1이고; 레인 3 및 10은 V2a이고; 레인 4 및 11은 V2b이며; 레인 5 및 12는 V3이고; 레인 6 및 13은 CMG2-IgG + 카파 쇄이고; 레인 7은 분자량 마커이다.
도 17은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분획화된, 식물-유래의 CMG2-IgG V2b의 용출 프로파일이다. 담배 식물로부터 정제된 단백질-A-정제 CMG2-IgG V2b를 토소(Tosoh) G4000SW 컬럼에 가하고 PBS로 용출하였다. 단백질을 280 nm에서의 흡광도로 모니터링하였다. 컬럼을 런닝 전에 분자량 표준물로 보정하였다. 체류 시간 및 산출된 분자량은 프로파일 상에 표시되어 있다. 내부 표준물 p-아미노벤조산(15.3분의 체류시간에서의 피크)은 분리 전에 샘플에 첨가되었다.
도 18은 CMG2-IgG 변이체에 의한 치사 독소 세포독성의 중화를 보여준다. RAW 264.7 마우스 마크로파지-유사 세포는 PA + LF 및 증가하는 농도(0 내지 1.25 ㎍/㎖)의 본래의 CMG2-IgG(사각형), CMG2-IgG V2b(다이아몬드) 또는 관련없는 식물-제조 IgG(원형)에 노출된다. 각 점은 3회 반복실험의 평균이다.
도 19는 CMG2-IgG V2b의 모델이다. 한 PA 분자와 연결된 항독소의 동종이량체를 가상적으로 도시한 것이다. 상기 분자의 일부(CMG2와 Cγ2 사이)에 있는 힌지 영역 내에 하나의 이황화 결합이 있을 수 있을지라도, 상기 항독소는 Cγ3 도메인 사이의 비공유 상호작용에 의해 서로 연결된 상태로 도시되어 있다. 막대는 크기를 표시한다. 구조 파일은 단백질 데이타 베이스로부터 얻은 것이며, 분자 그래픽적 이미지는 샌 프란시스코 소재의 캘리포니아 대학에 있는 리소스 포 바이오컴퓨팅, 비쥬얼라이제이션 앤드 인포매틱스(Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatic)(NIH P41 RR-01081로부터 지원받음(참고문헌 54)) 로부터 얻은 UCSF 키메라 팩키지를 사용하여 생성하였다.
도 20은 CMG2-카파 변이체를 보여준다. CMG2-카파는 CMG2-IgG V1 또는 CMG2-IgG V3을 가진 니코티아나 벤싸미아나(N. benthamiana)에서 발현되었고 단백질 A에의해 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하여 코마시에로 염색하였다. 레인 1 및 2는 비-환원 조건 하에 런닝되었다. 레인 3 및 4는 환원 조건(100 mM DTT) 하에 런닝되었고, 레인 5는 분자량 마커이다.
표의 간단한 설명
표 1은 ICAM-1의 5개 세포외 도메인의 경계를 나열한 것이다.
표 2는 면역글로불린 중쇄 유전자들 및 이 유전자들에 의해 코딩된 단백질들의 유전자은행(Genbank) 검색 번호를 보여준다.
표 3은 다른 키메라 리노바이러스 독소 수용체 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있는 ICAM-1 상동성을 가진 분자의 예의 목록을 제공한다.
표 4는 공지된 보툴리늄 수용체 및 추정되는 결합 도메인을 보여준다.
표 5는 실시예 9에서 수행된 무작위 리노바이러스 챌린지 연구에 대한 연구 디자인을 보여준다.
표 6은 실시예 16에 기재된 바와 같은, 일시적으로 형질감염된 니코티아나 벤싸미아나 잎에서의 키메라 탄저 독소 수용체 생성을 보여준다.
표 7은 실시예 18에 있어서 산출된 IC50 및 이 IC50에서의 항독소와 PA의 몰비를 보여준다.
표 8은 실시예 19에 있어서 다양한 CMG-IgG 키메라 변이체의 구조를 보여준다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 하기 약어 및 용어들은 하기 정의를 포함하지만 반드시 하기 정의로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., (1987)); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); M. J. MacPherson, et al., eds. Pcr 2: A Practical Approach (1995); Harlow and Lane, eds, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), and H. Jones, Methods In Molecular Biology vol. 49, "Plant Gene Transfer And Expression Protocols" (1995)]을 참조한다.
면역접합체: 면역글로불린 불변 영역의 일부에 융합된 키메라 독소 수용체 단백질 분자를 함유하고 경우에 따라 분비 성분 및 J 쇄를 함유하는 복합체.
키메라 독소 수용체 단백질: 독소 수용체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부, 및 면역글로불린 복합체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부를 가진 독소 수용체-기재 단백질.
독소 수용체: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 키메라 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성을 가지면서 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는, 본원에서 정의된 바와 같은 병원체 항원, 독소, 또는 임의의 단백질, 지단백질, 당단백질, 폴리사카라이드 또는 리포폴리사카라이드에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 독소 수용체는 바이러스 부착 수용체, 예컨대, ICAM-1, 인간 리노바이러스에 대한 수용체, 또는 박테리아 독소에 대한 수용체, 예컨대, 탄저 보호 항원에 대한 수용체들 중 하나 또는 보툴리늄 독소일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 독소 수용체는 최소한 독소/병원체 성분의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이지만 경우에 따라 하나 이상의 추가 폴리펩티드도 포함할 수 있다.
면역글로불린 분자 또는 항체: 서로 공유 커플링되어 있으며 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 중쇄와 면역글로불린 경쇄의 면역학적 활성 부위를 함유하는 폴리펩티드 또는 다량체 단백질. 면역글로불린 또는 항체 분자는 IgM, IgD, IgG, IgA, 분비 IgA(SIgA) 및 IgE와 같은 여러 종류의 분자를 포함하는 큰 분자 족(family)이다.
면역글로불린 복합체: 면역글로불린 중쇄의 일부 또는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 일부 둘다를 포함할 수 있는 폴리펩티드 복합체. 상기 두 성분은 이황화 결합과 같은 공유결합을 비롯한 다양한 상이한 수단을 통해 서로 연결될 수 있다.
면역글로불린 중쇄의 일부: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 본원에서 기재된 바와 같은 키메라 독소 수용체 단백질에 대해 하기 성질들 중 하나 이상의 성질을 부여하는 데 필요한 중쇄의 영역을 말한다: 다량체화 능력, 이펙터(effector) 기능, 단백질 G 또는 A에 의해 정제되는 능력, 또는 개선된 약동학적 성질. 전형적으로, 이것은 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
면역글로불린 경쇄의 일부: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 전술된 키메라 독소 수용체 단백질의 안정성을 증가시켜 생성 수율을 증가시키는 데 필요한 경쇄의 영역을 말한다. 전형적으로, 이것은 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
중쇄 불변 영역: 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드. 전형적으로, IgG, IgD 및 IgA 면역글로불린 중쇄는 그의 천연 형태에서 하나의 가변 영역에 연결된 3개의 불변 영역을 함유한다. IgM 및 IgE는 하나의 가변 영역에 연결된 4개의 불변 영역을 함유한다. 본원에 기재된 바와 같이, 불변 영역은 가변 도메인에 인접한 영역으로부터 순차적으로 번호가 매겨져 있다. 예를 들면, IgG, IgD 및 IgA 중쇄에서, 상기 영역들은 다음과 같이 지칭된다: 가변 영역, 불변 영역 1, 불변 영역 2 및 불변 영역 3. IgM 및 IgE의 경우, 상기 영역들은 다음과 같이 지칭된다: 가변 영역, 불변 영역 1, 불변 영역 2, 불변 영역 3 및 불변 영역 4.
키메라 면역글로불린 중쇄: 상이한 이소타입 또는 서브타입의 면역글로불린 중쇄, 또는 일부 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부를 가진 면역글로불린 유래의 중쇄. 전형적으로, 키메라 면역글로불린 중쇄는 면역글로불린 중쇄의 2가지 이상의 상이한 이소타입 또는 서브타입으로부터 유래된 아미노산 잔기 서열을 가진다.
J 쇄: 면역글로불린의 중합, 및 내피 세포를 통한 중합된 면역글로불린의 수송에 관여하는 폴리펩티드. 문헌[The Immunoglobulin Helper: The J Chain in Immunoglobulin Genes, at pg. 345, Academic Press (1989)]을 참조한다. J 쇄는 오량체 IgM 및 이량체 IgA에서 발견되며, 전형적으로 이황화 결합을 통해 부착된다. J 쇄는 마우스 및 인간 둘다에서 연구되어 있다.
분비 성분( SC ): 면역글로불린을 불활성화제로부터 보호하여 분비 면역글로불린의 생물학적 효능을 증가시키는 것을 보조하는 분비 면역글로불린의 성분. 분비 성분은 마우스 또는 인간을 비롯한 임의의 포유동물 또는 설치류로부터 유래될 수 있다.
링커: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 재조합적으로 제조된 폴리펩티드의 폴딩(folding) 및 안정성을 촉진하는 데 사용되는 임의의 폴리펩티드 서열을 말한다. 바람직하게는, 이 링커는 유연한 링커, 예컨대, (Gly3Ser)3 또는 (Gly4Ser)3과 같은 폴리펩티드 서열로 구성된 것이다.
형질전환 식물: 유전적으로 개조된 식물 또는 유전적으로 개조된 식물의 자손. 형질전환 식물은 통상적으로 하나 이상의 관련없는 유기체, 예컨대, 바이러스, 또 다른 식물 또는 동물로부터 유래된 물질을 함유한다.
단자엽 식물: 그 배아가 하나의 자엽 또는 떡잎을 가진 화초 식물. 단자엽 식물의 예로는 백합; 해수; 옥수수; 귀리, 밀 및 보리를 포함하는 곡류; 난초; 붓꽃; 양파 및 종려나무가 있다.
쌍자엽 식물: 그 배아가 2개의 떡잎 또는 자엽을 가진 화초 식물. 쌍자엽 식물의 예로는 담배; 토마토; 자주개자리를 포함하는 콩류; 귀리; 단풍나무; 장미; 민트; 호박; 데이지; 호두나무; 선인장; 제비꽃; 및 미나리아재비가 있다.
글리코실화: 올리고사카라이드에 의한 단백질의 변형. 글리코실화 신호로서 작용하는 폴리펩티드 서열의 일반적인 검토를 위해서는 문헌(Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) and Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974))을 참조한다. 이 신호는 포유동물 및 식물 세포 둘다에서 인식된다.
식물-특이적 글리코실화: 포유동물 또는 곤충 세포에서 제조된 단백질에서 발견되는 것과 상이한, 식물-발현 단백질 상에서 발견되는 글리코실화 패턴. 식물 또는 식물 세포에서 발현된 단백질은 포유동물 세포 및 곤충 세포를 비롯한 다른 종류의 세포에서 발현된 단백질과 상이한 글리코실화 패턴을 가진다. 식물-특이적 글리코실화를 특징규명하고 이를 다른 종류의 세포에서의 글리코실화와 비교하는 상세한 연구는 문헌[Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4):365-372 (1999), Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38:31-48 (1998) and Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997)]의 저자들에 의해 수행된 바 있다. 식물-특이적 글리코실화는 만노즈에 베타(1,2)-결합된 크실로즈를 가진 글리칸을 발생시킨다. 포유동물 또는 곤충 글리코실화는 만노즈에 베타(1,2)-결합된 크실로즈를 발생시키지 않는다. 식물은 글리칸의 말단에 결합된 시알산을 가지지 않는 반면, 포유동물 세포는 글리칸의 말단에 결합된 시알산을 가진다. 또한, 식물-특이적 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 알파(1,3)-결합하게 하지만, 포유동물 세포에서의 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 알파(1,6)-결합하게 한다.
병원체 항원: 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는 임의의 분자, 예를 들면, 독소. 병원성 항원은 항체의 형성을 자극할 수 있거나 없다.
탄저 독소 수용체: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용할 수 있도록 작용하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 보호 항원(PA)(바실러스 안쓰라시스가 숙주 세포를 파괴하기 위해 사용하는 3개의 상호작용 단백질들 중 하나)에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 2가지 내인성 세포 탄저 독소 수용체가 당업계에서 동정되어 있다: 탄저 독소 수용체/종양 내피 마커 8(ATR/TEM8) (Bradley et al., 2001) 및 모세혈관 형태형성 인자 2(CMG2)(Scobie et al., 2001). 이 ATR들의 세포외 도메인은 후술된 VWA/I 도메인을 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같은 탄저 독소 수용체는 최소한 PA의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이지만, 하나 이상의 추가 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 탄저 독소 수용체 코딩 서열 내로 스플라이싱됨으로써 발생될 수 있는 하나 이상의 추가 폴리펩티드(예를 들면, 수용체 유인물로서의 탄저 독소 수용체의 용도를 개선시키는 폴리펩티드)를 경우에 따라 포함할 수도 있다.
VWA /I 도메인: 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 2가지 공지된 탄저 독소 수용체인 TEM8 및 CMG2의 세포외 도메인 내의 도메인이며 PA와 상기 수용체의 적절한 결합에 필수적인 금속 이온-의존성 부착 부위(MIDAS)를 함유하는 것으로 생각되는 통상적으로 인테그린 삽입 도메인(I 도메인)으로도 지칭되는 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인(VWA 도메인)을 지칭한다.
키메라 탄저 독소 수용체 단백질: 탄저 독소 수용체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부, 및 면역글로불린 복합체로부터 유래된 아미노산 서열의 적어도 일부를 가진 탄저 독소-수용체 기재 단백질. 상기 면역글로불린 복합체는 면역글로불린 중쇄의 일부만을 함유할 수 있거나, 중쇄의 일부 및 경쇄의 일부 둘다를 함유할 수 있다.
보툴리늄 독소 수용체: 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 보툴리늄 독소에 결합하는 임의의 폴리펩티드.
유효량: 본 발명의 면역접합체의 유효량은 바이러스 또는 박테리아 감염(경우에 따라 가능함), 세포독성 또는 복제를 검출가능하게 억제하거나; 감염의 심각도 또는 감염 기간을 감소시키는 데 충분하다.
컨스트럭트 또는 벡터: 표적 식물 조직 또는 세포 내로 전달될 인공적으로 조립된 DNA 절편. 전형적으로, 컨스트럭트는 특별히 관심있는 유전자 또는 유전자들, 마커 유전자 및 적절한 조절 서열을 포함할 것이다. 용어 "플라스미드"는 자발적으로 자가-복제할 수 있는 염색체외 DNA 분자를 지칭한다. 적합한 조절 요소를 함유하는 플라스미드 컨스트럭트는 "발현 카세트"로도 지칭된다. 바람직한 실시양태에서, 플라스미드 컨스트럭트는 검색 또는 선별가능한 마커 예컨대, 항생제 내성 유전자도 함유한다.
선별가능한 마커: 선별 배지 상의 형질전환 조직의 성장을 허용하는 생성물을 코딩하는 유전자. 선별가능한 마커의 비-제한적 예로는 항생제 내성에 대해 코딩하는 유전자, 예를 들면, 앰피실린, 가나마이신 등이 있다. 다른 선별가능한 마커는 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
안정성이 개선된
키메라
독소 수용체 단백질
본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 독소 수용체를 가진다. 독소 수용체 단백질은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘다와 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단독으로 존재하거나 분비 성분과 연결되어 있는 J 쇄는 키메라 독소 수용체 단백질과 연결되어 면역접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진다.
이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질은 수용체의 다결합가로 인한 보다 높은 활성, 면역글로불린 Fc의 이펙터 기능, Fc로 인한 개선된 약동학적 성질, 및 식물에서 제조될 때 보다 낮은 제조 비용을 포함하는, 기존 단일클론 항체 또는 수용체 유인물-기재 예방법 또는 치료법에 비해 상당한 이점을 가질 것이라고 생각된다.
다결합가의 이점은 인간 ICAM-1의 세포외 도메인과 면역글로불린 중쇄의 융합체에 의해 입증된 바 있다(Martin, S., Casasnovas, J. M., Staunton, D. E. & Springer, T. A. Efficient neutralization and disruption of rhinovirus by chimeric ICAM-1 /immunoglobulin molecules. J Virol 67, 3561-8 (1993)). ICAM-1은 흔한 감기 바이러스인 인간 리노바이러스(HRV)에 대한 세포-표면 수용체이다. 키메라 면역접합체는 HRV와 세포의 결합을 억제하고 바이러스 캡시드의 구조를 파괴하는 데 있어서 가용성 ICAM-1보다 훨씬 더 효과적이다(Martin et al. J Virol 67, 3561-8 (1993)). HRV의 세포변성 효과로부터 세포를 보호하는 데 있어서 가용성 ICAM-1의 특이적 활성보다 10배 더 높은 활성을 가진 ICAM-1/IgA2 키메라(RhinoRx)는 형질전환 담배 내에서 발현된다.
Fc 영역의 존재는 면역글로불린 이펙터(effector) 기능, 예컨대, 보체의 존재 하에 세포의 특이적 용해를 매개하는 능력을 부여해야 한다. 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 도메인은 그 도메인을 함유하는 특정한 분자에게 항체 이펙터 기능으로서 공지된 다양한 성질을 부여한다. 예시적 이펙터 기능으로는 보체 고정, 태반 전달, 스타필로코칼 단백질에의 결합, 스트렙토코칼 단백질 G에의 결합, 단핵 세포, 호중구 또는 비만 세포 및 호염기구에의 결합이 있다. 특정한 도메인 및 특정한 면역글로불린 이소타입과 이들 이펙터 기능들의 관련성은 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Immunology, Roitt et al., Mosby St. Louis, Mo. (1993 3rd Ed.))에 기재되어 있다.
또한, FcRn과 Fc의 결합은 면역접합체가 순환계 내에서 훨씬 더 오래 지속되도록 해야 한다(Ober, R. J., Martinez, C., Vaccaro, C., Zhou, J. & Ward, E. S. Visualizing the Site and Dynamics of IgG Salvage by the MHC Class I-Related Receptor, FcRn. J Immunol 172, 2021-2029 (2004)). 이로 인해 항독소는 예방제로서 사용될 수 있다.
숙주 세포, 숙주 조직 또는 숙주 유기체, 식물 세포, 식물 조직 또는 온전한 식물 내에서 제조되는 경우, 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체 분자 또는 복합체의 생산성의 증가는 분자의 수율을 높이고 가공처리될 때 제조 비용을 낮춘다. 이러한 보다 높은 생산성은 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체 또는 면역접합체 복합체를 구성하는 쇄의 제조에 있어서의 보다 높은 효율, 및/또는 면역접합체 복합체의 조립의 보다 높은 효율의 결과일 수 있다. 특히, 면역글로불린 중쇄의 일부 및 경쇄의 일부 둘다를 포함하는 키메라 독소 수용체 단백질 또는 면역접합체의 경우, 정제된 또는 부분적으로 정제된 면역접합체의 활성 수준의 외관상 증가는 면역접합체를 구성하는 쇄의 이용률의 증가 및/또는 상기 복합체의 조립에서의 보다 높은 효율, 및/또는 수용체의 다결합가 또는 상기 모든 것의 조합 때문일 수 있다.
당업자는 필요에 따라 기능 및 안정성을 개선시키기 위해 필요에 따라 프로테아제-감수성 도메인이 제거되고 링커가 포함되도록 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질을 변형시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으나, 이러한 변형의 정확한 성질(예를 들면, 어떤 도메인을 제거할 것인지, 링커의 길이 및 위치)은 선험적으로 공지되어 있지 않다.
독소 수용체
독소 수용체는 키메라 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는 병원체 항원, 독소 또는 임의의 단백질에 결합하는 임의의 폴리펩티드이다. 예를 들면, 항바이러스 또는 항박테리아 실시양태에서, 관심있는 바이러스, 박테리아들 또는 박테리아 또는 이들의 하위성분, 예컨대, 바이러스 또는 박테리아가 그의 병원성 효과를 발휘하거나 병원성 효과의 발휘를 이끌어내는 과정을 개시하기에 필요한, 상기 바이러스 또는 박테리아에 의해 제조된 단백질에 결합하기에 효과적인 하나 이상의 수용체 단백질이 사용된다. 이러한 수용체 단백질은 많이 공지되어 있고 과도한 실험을 수행하지 않고 당업자에 의해 본 발명의 적당한 측면에서 사용될 수 있다.
독소 수용체의 한 예는 인간 리노바이러스에 대한 수용체인 ICAM-1이다. ICAM-1에 대한 뉴클레오티드 서열은 문헌(Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988); Greve, et al. Cell 56:839-847 (1989); Greve, et al., J. Virology 65:6015-6023 (1991); Staunton, et al., Cell, 61 :243-254 (1990))의 저자들에 의해 결정되고 특징규명되었으며, 서열번호 3 및 유전자은행 검색 번호 M24283에 기재되어 있다. ICAM-1 분자는 5개의 세포외 도메인, 소수성 경막 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 가진 막 단백질(서열번호 1 및 2)이다. 이 특징들은 문헌(Casasnovas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:4134-4139 (1998) and Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988))에 기재되어 있다.
기재된 키메라 독소 수용체 단백질에서 사용된 독소 수용체는 전체 독소 수용체일 수 있거나, 키메라 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용하게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성을 부여하기에 충분한 독소 수용체의 일부일 수 있다.
예를 들면, 독소 수용체가 ICAM-1인 경우, 본 발명의 적당한 측면에서 구체적으로 사용되는 것은 인간 리노바이러스의 결합을 담당하며 N-말단 도메인 1 및 2에 편재되어 있는 ICAM-1 분자의 도메인이다(Greve, et al., J. Virol., 65:6015-6023 1991, and Staunton, et al., Cell, 61:243-245 1990). ICAM-1 분자의 세포외 도메인 1, 2, 3, 4 및 5의 임의의 조합물을 포함하는 리노바이러스 수용체 단백질의 일부도 고려된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 리노바이러스 수용체 단백질의 일부는 ICAM-1 분자의 도메인 1 및 2를 포함하며, 다른 바람직한 실시양태에서, ICAM-1 분자의 도메인 1, 2, 3, 4 및 5가 존재한다.
ICAM-1의 5개 세포외 도메인의 경계는 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌(Staunton, et al., Cell 52:925-933 (1988))에 기재되어 있다. 서열번호 2에 있어서 대략적인 도메인 경계는 하기 표 1에 나타나 있다:
ICAM-1 도메인 | 아미노산 |
1 | 1-88 |
2 | 89-105 |
3 | 106-284 |
4 | 285-385 |
5 | 386-453 |
본 발명의 일부 측면 및 실시양태에서 사용된 바와 같이, ICAM-1 도메인 1은 약 잔기 1부터 약 잔기 88까지이고; 도메인 2는 약 잔기 89부터 약 잔기 105까지이며; 도메인 3은 약 잔기 106부터 약 잔기 284까지이고; 도메인 4는 약 잔기 285부터 약 잔기 385까지이고; 도메인 5는 약 잔기 386부터 453까지이다. 당업자는 이들 도메인의 정확한 경계가 달라질 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에서 사용될 탄저 수용체 및 적합한 도메인은 "탄저 키메라 독소 수용체"라는 표제의 단락에 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 사용될 보툴리늄 수용체 및 적합한 도메인은 "보툴리늄 키메라 독소 수용체"라는 표제의 단락에 보다 상세히 기재되어 있다.
면역글로불린 복합체
면역글로불린 복합체는 면역글로불린 중쇄의 일부 또는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 둘다의 일부를 포함할 수 있다. 상기 두 성분은 이황화 결합과 같은 공유결합을 비롯한 다양한 상이한 수단을 통해 서로 연결될 수 있다. 면역글로불린 복합체는 하나 이상의 독소 수용체 단백질과 연결되어 있다. 연결은 공유결합, 이온성 상호작용, 수소결합, 이온결합, 반 데르발스 힘, 금속-리간드 상호작용 또는 임의의 다른 종류의 상호작용을 통해 이루어질 수 있다.
면역글로불린
중쇄
키메라 독소 수용체 단백질은 부착된 탄저 수용체 단백질을 다량체화하는 능력, 항체 이펙터 기능, 식물에서 키메라 단백질을 안정화시키는 능력, 단백질 A 또는 G에 의해 정제되는 능력 또는 약동학적 성질을 개선시키는 능력을 부여하기에 충분한 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 함유한다.
이 성질들은 중쇄의 불변 영역에 의해 부여된다. 키메라 독소 수용체 단백질이 면역글로불린 중쇄만을 함유하는 경우, 면역글로불린 복합체 내의 중쇄의 일부는 바람직하게는 적어도 도메인 CH2 및 CH3을 함유하고, 보다 바람직하게는 CH2 및 CH3만을 함유한다. 키메라 독소 수용체 단백질이 중쇄 및 경쇄 둘다를 함유하는 경우, 면역글로불린 복합체 내의 중쇄의 일부는 바람직하게는 CH1 도메인도 함유한다.
당업자는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 다수의 면역글로불린 DNA 및 단백질 서열이 유전자은행을 통해 입수가능하다. 하기 표 2는 면역글로불린 중쇄 유전자들 및 이 유전자들에 의해 코딩된 단백질의 유전자은행 검색 번호를 보여준다.
그러므로, 일부 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 키메라 분자의 일부는 그것이 전술된 성질을 부여하기에 충분한 일부를 여전히 함유하는 한 전체 중쇄보다 작은 중쇄를 함유할 수 있다.
면역글로불린 중쇄는 임의의 종류의 면역글로불린, 예컨대, IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD3, IgE, IgM 또는 키메라 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 일부는 IgA, IgG 또는 IgD 중쇄의 CH1, CH2 또는 CH3, 또는 IgM 또는 IgE 중쇄의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4를 함유할 수 있다. 이들 불변 도메인들의 다양한 조합물 및 하위조합물들도 고려된다.
바람직한 실시양태에서, 중쇄의 일부는 그 면역글로불린 중쇄가 J 쇄에 결합하여 분비 성분에 결합할 수 있게 하는 IgM 또는 IgA 중쇄의 일부이다. 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 키메라 독소 수용체 단백질의 일부는 IgA 중쇄 및 IgM 중쇄로부터 선택되거나 중쇄의 일부 다른 이소타입으로부터 선택된 개별 도메인들로 구성될 수 있다는 것도 고려된다. IgA 또는 IgM 이외의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 면역글로불린 도메인은 J 쇄에 결합되도록 분자적으로 개조되어 본 발명의 면역글로불린 및 면역접합체를 생성하는 데 사용될 수 있다는 것도 고려된다.
바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 마우스 또는 인간 IgA1, IgA2 또는 IgM의 적어도 CH1, CH2, CH 도메인을 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 IgM의 적어도 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4 도메인을 포함하는 면역글로불린 도메인을 함유한다.
당업자는 면역글로불린이 약 100 내지 110개 아미노산 잔기들로 이루어진 도메인으로 구성된다는 것을 이해할 것이다. 이들 다양한 도메인들은 당업계에 잘 공지되어 있고 공지된 경계를 가진다. 단일 도메인의 제거 및 또 다른 항체 분자의 도메인으로의 치환은 현대 분자생물학으로 용이하게 달성된다. 도메인은 쇄내 이황화 결합에 의해 안정화되는 구형 구조를 가진다. 이것은 상이한 형태를 부여하고 도메인을 다른 유사 형태의 도메인으로 치환될 수 있거나 교체될 수 있는 자가-함유 단위체(self-contained unit)로 만든다.
중쇄
키메라
면역글로불린
다양한 측면 및 실시양태는 중쇄를 포함하는 면역글로불린 도메인이 중쇄 면역글로불린의 다양한 이소타입으로부터 유래된 것인 키메라 독소 수용체 분자를 고려한다. 당업자는 분자적 기법을 이용하여 이 도메인들을 유사한 도메인으로 치환시킴으로써 2개의 상이한 면역글로불린 분자 사이의 하이브리드인 면역글로불린을 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이 키메라 면역글로불린은 상이한 면역글로불린 도메인에 의해 부여되는 상이하면서도 다양한 바람직한 성질을 함유하는 면역접합체가 제조될 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 분자는 인간 면역글로불린 중쇄의 2가지 상이한 이소타입으로부터 유래된 도메인을 함유한다.
일부 실시양태에서, 키메라 중쇄 면역글로불린은 J 쇄와 IgA 및 IgM의 연결을 책임지는 IgA 또는 IgM의 일부를 함유한다. 따라서, 키메라 독소 수용체 분자 내의 키메라 면역글로불린을 사용함으로써 J 쇄를 J 쇄 또는 분비 성분에 결합하지 않는 우세한 이소타입인 키메라 면역글로불린과 연결할 수 있다.
인간, 마우스 또는 다른 포유동물과 같은 종으로부터 유래된 키메라 중쇄 면역글로불린이 고려된다. 본 발명은 포유동물 면역글로불린의 2가지 이상의 상이한 이소타입으로부터 유래된 면역글로불린 도메인을 함유하는 키메라 중쇄 면역글로불린을 고려한다. 일반적으로, 임의의 포유동물 면역글로불린, 예컨대, 하기 이소타입들이 바람직한 실시양태에서 사용될 수 있다: IgG의 임의의 이소타입, 또는 IgA의 임의의 이소타입, IgE, IgD 또는 IgM. 본 발명은 설치류 또는 영장류 면역글로불린의 2가지 상이한 이소타입으로부터 유래된 면역글로불린 도메인을 함유하는 키메라 분자도 고려한다. 설치류 또는 영장류 면역글로불린의 이소타입은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 분자는 하나 이상의 하기 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 유래의 중쇄를 함유할 수 있다: 마우스 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA5, IgE 또는 IgD의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 마우스 IgE 또는 IgM의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인; 인간 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgD의 CH1 도메인; 인간 IgM 또는 IgE의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인; 포유동물 IgG의 이소타입, IgA의 이소타입, IgE 또는 IgD의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 포유동물 IgE 또는 IgM의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인; 설치류 IgG, IgA, IgE 또는 IgD의 이소타입의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 동물 IgG의 이소타입, IgA의 이소타입, IgE 또는 IgD의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인; 및 동물 IgE 또는 IgM의 CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인.
본 발명은 면역글로불린 거대족(superfamily)의 구성원인 분자들로부터 유래된 단백질 도메인을 키메라 분자 내로 치환시키거나 부가하는 것도 고려한다. 면역글로불린 거대족에 속하는 분자는 면역글로불린과의 아미노산 잔기 서열 및 핵산 서열 상동성을 가진다. 면역글로불린 거대족의 일부인 상기 분자는 아미노산 또는 핵산 서열 상동성에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 문헌(p. 361 of Immunoglobulin Genes, Academic Press (1989))을 참조한다.
경쇄
면역글로불린
본원에 기재된 면역글로불린 경쇄의 일부는 발현된 키메라 독소 수용체의 안정성을 증가시키기에 충분한 면역글로불린 경쇄의 일부이다. 바람직하게는, 본 발명의 경쇄는 적어도 불변 도메인을 포함하거나 본원에 기재된 중쇄들 중 임의의 중쇄와 결합되기에 충분한 불변 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 따라서, 상기 쇄는 전체 도메인보다 작은 도메인을 함유할 수 있다. 경쇄는 람다 또는 카파 쇄일 수 있다.
경쇄에 공유결합된 독소 수용체의 본질(identity)은 키메라 독소 수용체 단백질/면역접합체의 친화성 및 결합친화성에 영향을 주도록 조절될 수 있다. 예를 들면, 경쇄에 공유결합된 독소 수용체가 중쇄와 연결된 독소 수용체와 동일한 독소 수용체이거나, 상이한 수용체 도메인의 존재로 인해 상이한 아미노산 서열을 가진 점을 제외하고 동일한 독소 수용체이거나, 동일한 독소에 대한 대안적 수용체인 경우, 경쇄에 연결된 독소 수용체는 키메라 독소 수용체 단백질의 결합친화성을 증가시킬 수 있다. 별법으로, 경쇄는 또 다른 독소에 대한 수용체에 공유결합됨으로써, 다수의 독소에 대한 유인물로서 사용되기에 적합한 키메라 독소 수용체 단백질을 생성시킬 수 있다.
경쇄의 도메인과 가변 도메인 사이의 연결은 임의의 종류의 결합을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 결합은 유연한 폴리펩티드 링커, 예컨대, (Gly3Ser)3 링커일 수 있다.
본원에 기재된 경쇄는 본 발명의 중쇄에 대해 기재된 것과 유사한 변이로 일어날 수도 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 경쇄 불변 도메인은 상이한 유기체 또는 종으로부터 유래될 수 있다.
독소 수용체와 면역글로불린 복합체 사이의 결합
면역글로불린 복합체와 독소 수용체 사이의 결합은 경쇄와 독소 수용체 사이의 연결, 보다 바람직하게는 중쇄와 독소 수용체 사이의 연결, 가장 바람직하게는 이들 연결 둘다를 통해 이루어질 수 있다. 이들 연결은 본원에 기재된 면역접합체가 수용체 유인물로서 작용하기에 충분한 유연성을 제공하는 임의의 종류의 결합을 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합은 공유결합, 예를 들면, 공유 펩티드 결합이다.
예를 들면, 상기 결합은 IgG, IgD 및 IgA의 CH2와 CH3 사이에서 발견되는 면역글로불린 힌지인 천연 아미노산 서열 또는 유연한 합성 폴리펩티드 링커, 예컨대, (Gly3Ser)3 링커 또는 (Gly4Ser)3일 수 있다. 한 키메라 독소 수용체는 임의의 수의 상이한 종류의 링커를 함유할 수 있다.
면역접합체
본 발명은 하나 이상의 키메라 독소 수용체 단백질을 포함하는 폴리펩티드인 면역접합체도 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역접합체는 J 쇄 및/또는 분비 성분도 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 키메라 독소 수용체 단백질을 포함한다.
J 쇄
본 발명의 면역접합체는 키메라 독소 수용체 단백질 이외에 면역글로불린 유래의 중쇄에 연결된 J 쇄를 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 2개 또는 4개의 키메라 탄저 독소 수용체 단백질, 및 이 키메라 단백질의 적어도 하나에 연결된 J 쇄를 포함한다. 상기 J 쇄는 당업계에 기재되어 있고 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(M. Koshland, The Immunoglobulin Helper: The J Chain, in Immunoglobulin Genes, Academic Press, London, pg. 345, (1989) and Matsuuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 456-460 (1986))을 참조한다. J 쇄의 서열은 미국의 다양한 데이타베이스 상에서 입수가능하다.
분비 성분
면역접합체는 키메라 독소 수용체 단백질과 연결된 분비 성분을 가질 수도 있다. 이 연결은 수소결합, 이황화 결합, 공유결합, 이온성 상호작용 또는 이들 다양한 결합의 조합에 의해 일어날 수 있다.
본 발명은 인간, 래트, 토끼, 소 등을 비롯한 다수의 상이한 종으로부터 유래된 분비 성분의 사용을 고려한다. 이 분자들에 대한 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,046,037호는 상기 서열들의 대다수를 포함하며, 이 특허는 본원에 참고로 도입된다. 분비 성분, 키메라 탄저 수용체 단백질 및 J 쇄를 함유하는 본 발명의 면역접합체는 전형적으로 하기 결합들 중 하나에 의해 서로 연결된다: 수소결합, 이황화 결합, 공유결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합.
다량체형 면역접합체
본 발명은 하나 이상의 수용체 단백질 분자를 포함하는 면역접합체도 고려하는데, 예를 들면, 상기 면역접합체는 단량체형 단위체이면서 다른 키메라 독소 수용체 분자에 이황화 결합되지 않은 키메라 독소 수용체 분자를 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역접합체는 다른 키메라 독소 수용체 분자와 연결되어 이량체 및 다른 다가 분자를 형성하는 키메라 독소 수용체 분자를 함유한다. 전형적으로, 키메라 독소 수용체 분자는 키메라 분자의 면역글로불린 부분의 연결 때문에 이량체로서 존재한다. 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 부분은 2개의 키메라 탄저 독소 수용체 분자가 연결되어 독소 수용체 단백질의 일부를 구성하는 2개의 활성 결합 부분을 가진 이량체 분자를 형성하게 한다. 바람직한 실시양태에서, 이량체화는 천연-발생 면역글로불린 분자의 일부로서 면역글로불린 도메인 사이에 일반적으로 일어나는 이황화 결합을 통해 일어난다. 당업자는 천연 면역글로불린 분자에 일반적으로 존재하는 이 이황화 결합이 키메라 독소 수용체 분자의 이량체를 형성하는 능력을 여전히 유지하면서 변형되거나, 이동되거나 제거될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 면역접합체의 다량체 형태는 4개의 키메라 독소 수용체 분자를 가질 것이며, 이때 상기 키메라 독소 수용체 분자들 중 2개는 독소 수용체와 면역글로불린 중쇄의 융합으로부터 유도되며 서로 이황화 결합되어 있고, 이처럼 이황화 결합된 키메라 독소 분자 각각은 독소 수용체와 면역글로불린 경쇄의 융합으로부터 유도된 또 다른 키메라 독소 수용체 분자도 이황화 결합됨으로써 사량체 구조를 형성한다. 이러한 사량체형 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 중쇄가 IgA 분자로부터 유래된 경우, J 쇄의 부가는 전술된 사량체 구조 각각의 2개를 함유하는 복합체, 및 8개의 키메라 독소 수용체 분자를 가진 복합체의 형성을 가능하게 한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 면역접합체는 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 부분과 J의 연결로 인해 키메라 독소 수용체 분자의 다량체 형태를 함유한다. 2개의 키메라 독소 수용체 분자의 이량체와 J 쇄의 연결은 면역접합체의 사량체 형태의 형성을 가능하게 한다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 분자의 면역글로불린 부분은 IgA 분자로부터 유래되며, J 쇄의 부가는 4개의 키메라 독소 수용체 분자 및 4개의 결합 부위를 함유하는 사량체형 복합체의 형성을 가능하게 한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 분자의 면역글로불린 중쇄 부분은 IgM으로부터 유래되며, 10개 또는 12개의 분자를 함유하는 다가 복합체가 형성될 수 있다. 키메라 독소 수용체 분자가 키메라 면역글로불린 중쇄를 사용하는 다른 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 분자는 J 쇄 결합을 책임지는 IgA 또는 IgM으로부터 유래된 도메인을 통해 이량체 또는 다른 보다 높은 차수의 다가 복합체를 형성할 수 있다. 다른 키메라 면역글로불린 분자에 있어서, 2개의 면역글로불린 중쇄 사이의 이황화 결합 및/또는 면역글로불린 경쇄와 중쇄 사이의 이황화 결합을 책임지는 면역글로불린의 일부는 키메라 면역글로불린 분자 내에 배치되어 이량체 또는 다른 보다 높은 차수의 다가 복합체를 형성시킬 수 있다.
식물-특이적
글리코실화
본 발명의 일부 실시양태에서, 전술한 면역접합체 및 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진 단백질을 발생시키는 방법에 의해 발현된다. 글리코실화가 식물, 포유동물 및 곤충 세포를 비롯한 진핵 세포 내에서의 단백질의 주요 변형이라는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다(Lerouge et al., Plant Molecular Biology 38:31-48, 1998). 글리코실화 과정은 번역과 동시에 전구체 올리고사카라이드가 생성중인 폴리펩티드 쇄의 특정한 잔기에 전달됨으로써 소포체(endoplasmic reticulum) 내에서 개시된다. 존재하는 잔기의 종류 및 잔기들 사이의 결합의 성질 면에서 상이한 다른 종류의 글리칸으로의 상기 올리고사카라이드의 가공처리는 당단백질이 소포체로부터 나와 그의 최종 목적지로 이동하는 분비 경로에서 일어난다. 당업자는 식물 또는 식물 세포 내에서 발현된 단백질이 그들의 성숙 말기에서 포유동물 세포 및 곤충 세포를 비롯한 다른 종류의 세포 내에서 발현된 단백질과는 상이한 글리코실화 패턴을 가진다는 것을 이해할 것이다. 식물-특이적 글리코실화를 특징규명하고 이를 다른 종류의 세포 내에서의 글리코실화와 비교하는 상세한 연구는 예를 들면, 문헌(Cabanes-Macheteau et al., Glycobiology 9(4):365-372 (1999), and Altmann, Glycoconjugate J. 14:643-646 (1997))에 기재된 연구에서 수행된 바 있다. 상기 문헌의 연구진과 다른 연구진들은 식물-특이적 글리코실화가 만노즈에 β(1,2)-결합된 크실로즈를 가진 글리칸을 발생시키지만, 크실로즈는 포유동물 및 곤충 세포 내에서의 글리코실화로 인해 만노즈에 β(1,2)-결합하지 않는다는 것을 밝혔다. 식물-특이적 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,3)-결합하게 하지만, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화는 퓨코즈가 인접한 GlcNAc에 α(1,6)-결합하게 한다. 더욱이, 식물-특이적 글리코실화는 단백질 글리칸의 말단에 시알산을 부가시키지 않는 반면, 포유동물 세포 내에서의 글리코실화의 경우, 시알산이 부가된다.
본 발명의 면역접합체 및 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 모든 폴리펩티드의 아미노산 서열은 공지되어 있다. 당업자는 글리코실화 부위가 트리펩티드 Asn-X-Ser/Thr이고, 이때 X가 프롤린 및 아스파르트산을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다는 것을 알 것이다(Kornfeld and Kornfeld, Annu Rev Biochem 54:631-664, 1985). 그러므로, 당업자는 본원에 기재된 단백질을 형성하는 폴리펩티드의 아미노산이 식물-특이적 글리코실화를 가질 것임을 알 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 측면 및 실시양태에서, 식물-특이적 글리코실화를 가진 면역접합체는 상기 키메라 분자와 연결되어 있는 J쇄 및 분비 성분을 추가로 포함한다. 키메라 분자의 경우와 마찬가지로, 당업자는 J 쇄 및 분비 성분 서열 내에서 식물-특이적 글리코실화 부위를 확인할 수 있을 것이다.
원하는 경우, 식물-특이적 글리코실화는 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체를 형성하는 식물-제조 폴리펩티드의 번역 후 가공처리가 크실로즈와 퓨코즈 결합이 실질적으로 감소하거나 제거되어 있는 변형된 번역 후 글리코실화를 이끌어내는 소포체 이외의 부위에서 일어나게 하는 서열을 부가함으로써 변형시킬 수 있다. 면역글로불린의 C-말단을 코딩하는 서열에 KDEL을 부가하는 것은 이러한 종류의 변형된 글리코실화를 이끌어낸다.
본 발명의 다른 바람직한 측면 및 실시양태에서, 특히 기능성 키메라 독소 수용체 단백질/면역접합체 생성물이 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 이들에 의해 생성된 독소 분자, 또는 상기 생성물이 투여된 대상체(subject) 내에 존재하는 독소 분자의 병리학적 효과를 예방하거나 상기 병리학적 효과에 대한 치료법을 제공하는 데 있어서 Fc 수용체 상호작용이 요구되지 않는 경우, N-결합 글리코실화 또는 O-결합 글리코실화 또는 이들 형태의 글리코실화 둘다를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
기능성 유도체
본원에서 면역접합체 및 키메라 독소 수용체 단백질의 기능성 유도체도 제공된다. "기능성 유도체"라 함은 이것이 본 발명에 따라 이용될 수 있게 하는 단백질의 기능의 적어도 일부, 예를 들면, 단백질에 대해 특이적인 항체와의 반응성, 효소적 활성 또는 결합 활성을 보유하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 "화학적 유도체", "단편" 또는 "변이체"를 의미한다. 유전적 코드의 축퇴성 때문에 다수의 상이한 핵산 서열이 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본래의 단백질의 기능을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 발생시키도록 아미노산에서의 보존적 변화를 가할 수 있다는 것도 당업계에 잘 공지되어 있다. 두 경우에서, 모든 치환이 본 개시내용에 포함된다.
유도체는 상당한 양 및/또는 비교적 순수한 또는 단리된 양의 면역접합체가 생성될 수 있도록 친화성 정제 태그를 포함하게끔 통상적인 방법에 따라 개조될 수도 있다. 바람직하게는 태그의 부재 하에서의 면역접합체의 원하는 결합 활성을 파괴하지 않으면서 면역접합체의 하나 이상의 성분 내로 도입될 수 있는 태그의 많은 상이한 버젼이 존재한다. 이러한 태그는 본 발명의 면역접합체를 코딩하는 핵산 서열과 융합된 발현가능한 코딩 핵산 서열로서 개조될 수 있다. 태그는 예를 들면, 시판되는 효소로 제거되도록 더 개조될 수 있다.
또한, 구조적으로 변형되어 있지만 변형되지 않은 핵산 분자에 의해 생성된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 유용성 또는 활성을 가진 폴리펩티드를 생성하기 위해 코돈을 결실시킬 수 있거나 하나 이상의 코돈을 축퇴 코돈 이외의 코돈으로 치환시킬 수 있다. 당업계에 인식되어 있는 바와 같이, 핵산 분자 사이의 차이가 유전적 코드의 축퇴성과 관련되어 있지 않을지라도 2개의 폴리펩티드는 이들을 생성하는 2개의 핵산 분자와 마찬가지로 기능적으로 동등할 수 있다.
이러한 종류의 조작 및 생성 후 화학적 유도체화는 예컨대, 안정성, 가용성, 흡수성, 생물학적 또는 치료적 효과, 및/또는 생물학적 반감기를 개선하기 위해 실시될 수 있다. 이러한 효과들을 매개할 수 있는 잔기(moiety)는 예를 들면, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990))에 개시되어 있다. 본 발명의 범위 내에 있는 기능성 유도체는 천연 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산이 결실되어 있거나 추가 또는 치환된 아미노산을 함유하는 "변이체" 폴리펩티드이다. 하나 이상의 아미노산에 대한 코돈을 C-말단, N-말단 및/또는 천연 서열 내의 하나 이상의 부위에 부가하고/하거나, 제거하고/하거나, 변형시키기 위해 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 적절하게 변형시킴으로써 상기 변이체를 천연 발생 복합체 성분으로부터 유도할 수 있다. 부가된 아미노산, 치환된 아미노산 및/또는 추가 아미노산을 가진 이러한 변이체가 전술한 바와 같이 천연 단백질의 특징적인 일부를 하나 이상 보유한다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
결실된 아미노산 잔기, 삽입된 아미노산 잔기 및/또는 치환된 아미노산 잔기를 가진 단백질의 기능성 유도체는 당업자에게 잘 공지된 표준 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 기능성 유도체의 변형된 성분은 (문헌(Adelman et. al., 1983, DNA 2:183)에 예시된 바와 같은) 부위-지정 돌연변이유발 기법을 이용하여 제조할 수 있으며, 이때 DNA 코딩 서열 내의 뉴클레오티드는 변형된 코딩 서열이 생성된 후, 이 재조합 DNA가 전술한 바와 같은 기법을 이용하여 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현되도록 변형된다. 별법으로, 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환을 가진 단백질은 당업계에 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 직접적인 화학적 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 상기 단백질의 기능성 유도체는 전형적으로 천연 단백질과 질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타낸다.
추가로, 본 발명의 면역접합체는 키메라 수용체 단백질/Ig 면역접합체일 수 있을 뿐만 아니라, 다른 천연 수용체 단백질 족 구성원, 이소타입, 및/또는 다른 상동성 아미노산 서열, 예를 들면, 인간, 영장류, 설치류, 개, 고양이, 소, 조류 등도 포함할 수 있다. 더욱이, 면역접합체에서 사용된 Ig 종류는 달라질 수 있고, 예를 들어, 소정의 종 내에서 또는 소정의 종이 없는 상태에서 상이한 Ig 족 구성원일 수 있다. Ig는 다양하고 잘 공지된 서열을 가지므로 당업자라면 치료를 받는 소정의 유기체 내에서 다소 상이한 유용성을 가진 상이한 면역접합체를 생성하는 데 있어서 Ig를 활용할 수 있다. 예를 들면, 다른 키메라 리노바이러스 수용체 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있는, ICAM-1과 상동성을 가진 분자들의 예의 예시적 비제한적 목록은 하기 표에 기재된 것들을 포함한다.
탄저
키메라
독소 수용체 단백질 및 면역접합체
본 발명은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 탄저 독소 수용체를 가진 키메라 탄저 독소 수용체 단백질도 포함한다. 경우에 따라, 안정성을 개선시키기 위해 면역글로불린 경쇄를 상기 복합체 내에 포함시킨다. 별법으로, 바람직하게는 그의 N-말단에서 면역글로불린 경쇄 또는 이러한 면역글로불린 경쇄의 단편과 연결된 탄저 독소 수용체는 안정성을 개선시키고/시키거나 추가 탄저 독소 수용체를 제공하여 탄저 독소와의 결합을 개선시키기 위해 상기 복합체 내에 포함된다.
탄저 독소 수용체 단백질은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘다와 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, J 쇄 및 분비 성분은 키메라 탄저 독소 수용체 단백질과 연결되어 면역접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진다.
키메라
탄저
독소 수용체 단백질
본원에 기재된 키메라 탄저 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 하나 이상의 탄저 독소 수용체 단백질을 함유한다.
탄저
독소 수용체
탄저 독소 수용체는 키메라 탄저 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용할 수 있게 하기에 충분한 친화성으로 보호 항원(PA)에 결합하는 임의의 폴리펩티드이다.
본원에 기재된 탄저 독소 수용체는 당업계에서 동정된 2가지 내인성 세포 탄저 독소 수용체, 즉 탄저 독소 수용체/종양 내피 마커 8(ATR/TEM8)(Bradley et al., 2001) 및 모세혈관 형태형성 인자 2(CMG2)(Scobie et al., 2001) 중 하나일 수 있다. 상기 수용체 둘다가 타입 1 경막 단백질로서 작용하며, 신호 펩티드, 세포외 도메인 및 단일-횡단 경막 영역과 같은 공통된 특징을 공유한다. 가용성 변이체를 비롯한 여러 단백질 이소폼(isoform)이 택일적 스플라이싱(alternative splicing)을 통해 예측된다.
본원에 기재된 탄저 독소 수용체는 최소한 PA의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이고 경우에 따라 하나 이상의 추가 폴리펩티드(예컨대, 수용체 유인물로서의 탄저 독소 수용체의 용도를 개선시키는 폴리펩티드)도 포함할 수 있다. ATR과 PA의 결합을 매개하는 도메인들의 특징은 잘 규명되어 있다(참고문헌 32 내지 37). 인테그린 삽입 도메인(I 도메인)으로도 공지되어 있는 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인(VWA 도메인)은 이 수용체와 PA의 적절한 결합에 필수적인 것으로 보이는 금속 이온-의존성 부착 부위(MIDAS)를 함유한다. 문헌(Scobie HM, Rainey GJ, Bradley KA, Young JA (2003) Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5170-5174. Bradley KA, Mogridge J, Mourez M, Collier RJ, Young JA (2001) Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414: 225-229)을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 탄저 독소 수용체 단백질은 이 수용체의 전체 세포외 도메인을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 탄저 독소 수용체는 프로테아제-감수성 부위가 제거되도록 개조되어 있다. 예를 들면, 탄저 독소 수용체가 CMG2 단백질인 경우, 상기 수용체는 바람직하게는 VWA/I 도메인의 일부가 아닌 14개의 아미노산을 갖지 않는다. 이 14개의 아미노산으로 된 서열 및 이의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 하기에 기재되어 있다:
TEILELQPSSVCVG(서열번호 102)
act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg(서열번호 103)
보툴리늄
키메라
독소 수용체 단백질 및 면역접합체
본 발명은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 보툴리늄 독소 수용체를 가진 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질도 포함한다. 경우에 따라, 안정성을 개선시키기 위해 면역글로불린 경쇄를 상기 복합체 내에 포함시킨다. 별법으로, 바람직하게는 그의 N-말단에서 면역글로불린 경쇄 또는 이러한 면역글로불린 경쇄의 단편과 연결되어 있는 보툴리늄 독소 수용체를 상기 복합체 내에 포함시켜 안정성을 개선시키고/시키거나 추가 보툴리늄 독소 수용체를 제공하여 보툴리늄 독소와의 결합을 개선시킨다.
보툴리늄 독소 수용체 단백질은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘다와 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, J 쇄 및 분비 성분은 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질과 연결되어 면역접합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, 키메라 독소 수용체 단백질은 식물-특이적 글리코실화를 가진다.
키메라
보툴리늄
독소 수용체 단백질
본원에 기재된 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질은 면역글로불린 중쇄를 함유하는 면역글로불린 복합체와 연결된 하나 이상의 보툴리늄 독소 수용체 단백질을 함유한다.
보툴리늄
독소 수용체
탄저 독소 수용체는 키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질이 수용체 유인물로서 작용할 수 있게 하기에 충분한 친화성 및 결합친화성으로 보툴리늄 독소에 결합하는 임의의 폴리펩티드이다.
7가지 보툴리늄 독소(BoNT/A-G)가 있다. 수용체 및 추정되는 결합 도메인은 모든 보툴리늄 독소에 대해 아직 동정되어 있지 않지만, 당업자라면 이러한 수용체들이 일단 동정되면, 이들을 변형시켜 본원에 기재된 키메라 보툴리늄 독소 수용체를 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
공지된 수용체 및 추정되는 결합 도메인은 하기 표에 기재되어 있다:
전술된 추정되는 결합 도메인 경계 중 일부가 비-인간 단백질에 대한 것일지라도, 당업자라면 서열 비교 기법을 이용하여 인간 단백질에 대한 유사 잔기들을 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 보툴리늄 독소 수용체는 최소한 보툴리늄 독소의 결합을 위한 기능적 요소를 함유할 것이고 경우에 따라 하나 이상의 추가 폴리펩티드(예컨대, 수용체 유인물로서의 보툴리늄 독소 수용체의 용도를 개선시키는 폴리펩티드)도 포함할 수 있다.
보툴리늄 독소 및 이의 수용체에 관한 추가 참고문헌은 아래에 기재되어 있고 이 참고문헌들이 교시하는 모든 것이 도입되어 있다:
BoNT 또는 이성분( Bipartite ) 독소:
강글리오사이드 ( Ganglioside ):
SV2:
시냅토태그민 ( Synaptotagmin ):
키메라
독소 수용체 단백질 및 면역접합체를 함유하는 벡터, 세포 및 식물
본 발명은 본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 함유하는 발현 및 클로닝 벡터, 세포 및 식물도 고려한다. 상기 단백질의 다양한 일부를 코딩하는 유전자들을 단리하는 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 요구되는 다양한 유전자들을 발현 벡터 및 클로닝 벡터, 예컨대, 식물 세포, 식물 및 형질전환 식물을 비롯한 진핵 세포 내로 도입될 수 있는 벡터 내로 삽입하는 데 적용될 수 있다.
본 발명은 키메라 수용체 단백질 분자 및 J 쇄를 코딩하는 DNA 절편을 유기체 내로 도입하는 단계, 및 분비 성분을 코딩하는 DNA를 상기 유기체 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역접합체를 조립하는 방법을 고려한다. 바람직한 분비 성분은 적어도 인간 폴리면역글로불린 수용체(pIgR) 아미노산 잔기 서열의 아미노산 잔기 1 내지 잔기 약 606 또는 다른 종으로부터의 유사한 아미노산 잔기들로 이루어진 절편을 함유한다(Mostov, Ann Dev. Immu. 12:63-84 1994). 상기 인간 pIgR 이외에 사용될 수 있는 분비 성분 서열들 중에는 적어도 인간 pIgR의 아미노산 잔기 1 내지 약 627로 이루어진 절편을 함유하는 서열이다.
본 발명은 본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 함유하는 식물 세포를 비롯한 진핵 세포를 고려한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체의 다양한 성분들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 식물 세포를 고려한다. 당업자라면 분비 성분 보호 항원, 키메라 수용체 단백질 분자 및 J 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 또는 카세트의 일부로서 존재할 것임을 이해할 것이다. 전형적으로, 사용되는 진핵 세포가 식물 세포인 경우, 사용되는 프로모터는 식물 세포 내에서 작동할 수 있는 프로모터일 것이다. 키메라 수용체 단백질 유전자, 분비 성분 유전자 및 J 쇄 유전자를 단리한 후, 이들을 전형적으로 발현 벡터 내의 전사 프로모터에 작동가능하게 연결시킨다. 본 발명은 발현을 위한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 키메라 수용체 단백질 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터도 고려한다. 이 발현 벡터는 특정 세포 내에서 발현될 뉴클레오티드 서열을, 뉴클레오티드 서열이 전사되고 발현되게 하는 프로모터 서열의 3'에 위치시킨다. 발현 벡터는 이 전사의 효율을 개선시키는 다양한 인핸서 서열도 함유할 수 있다. 추가로, 종결자(terminator), 폴리아데닐화(poly A) 부위 및 다른 3' 말단 처리 신호와 같은 서열을 포함시켜 특정 세포 내에서 전사되는 뉴클레오티드 서열의 양을 상승시킬 수 있다.
선택된 유기체 내에서의 성분들의 발현은 독립적으로 복제하는 플라스미드, 염색체의 영구적 성분, 또는 상기 성분들을 코딩하는 전사체를 일시적으로 발생시킬 수 있는 DNA의 임의의 조각으로부터 유도될 수 있다. 형질전환에 적합한 유기체는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 복합체의 성분들은 직접적인 DNA 형질전환 또는 유기체 내로의 유전자주입(biolistic) 전달, 또는 또 다른 유기체에 의한 매개, 예를 들어, 식물 세포에 대한 재조합 아그로박테리움(Agrobacterium)의 작용에 의해 도입될 수 있다. 형질전환 유기체 내에서의 단백질의 발현은 통상적으로 적절한 프로모터 요소 및 폴리아데닐화 신호의 동시-도입을 필요로 한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 프로모터 요소는 모든 식물 세포 내에서 성분들의 기본구성적(constitutive) 발현을 야기할 수 있다. 대부분 또는 모든 세포 내에서 일어나는 기본구성적 발현은 전구체가 조립이 일어나는 데 요구되는 것과 동일한 세포 내막(endomembrane) 시스템을 확실히 차지할 수 있게 할 것이다.
발현 벡터
숙주 세포와 상용가능한 발현 벡터, 바람직하게는 식물 세포와 상용가능한 발현 벡터가 본 발명의 유전자를 발현하는 데 사용된다. 식물 내에서의 유전자의 발현에 유용한 전형적인 발현 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌(Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153:253-277 (1987))에 기재된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도(Ti) 플라스미드로부터 유도된 벡터들을 포함한다. 그러나, 여러 다른 발현 벡터 시스템들이 식물 내에서 작용하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Verma et al., PCT 공보 제WO87/00551호; and Cocking and Davey, Science, 236: 1259-1262 (1987))을 참조한다.
전술된 발현 벡터들은 프로모터를 비롯한 발현 조절 요소들을 함유한다. 발현될 유전자는 프로모터 서열이 RNA 중합효소 결합 및 원하는 폴리펩티드 코딩 유전자의 합성을 지시할 수 있도록 발현 벡터에 작동가능하게 연결된다. 유도가능한 프로모터, 바이러스 프로모터, 합성 프로모터, 기본구성적 프로모터 및 조절되는 프로모터가 유전자를 발현하는 데 유용하다. 당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 사용될 발현 벡터의 선택 및, 궁극적으로 본 발명의 면역접합체의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결될 프로모터의 선택은 원하는 기능적 성질, 예컨대, 단백질 발현의 위치 및 시기, 및 형질전환될 숙주 세포에 의해 직접적으로 좌우되고, 이것은 당업계에 내재된 재조합 DNA 분자의 제작의 한계이다. 그러나, 본 발명을 실시하는 데 유용한 발현 벡터는 적어도 복제를 지시할 수 있고, 바람직하게는 상기 벡터에 작동가능하게 연결된 DNA 절편 내에 포함된 폴리펩티드 코딩 유전자의 발현도 지시할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 유전자를 발현하는 데 사용되는 발현 벡터는 식물 세포 내에서 효과적인 선별 마커, 바람직하게는 약물 내성 선별 마커를 포함한다. 바람직한 약물 내성 마커는 그 발현이 가나마이신 내성을 야기하는 유전자, 즉 문헌(Rogers et al., in Methods For Plant Molecular Biology, a Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1988))에 의해 기재된 노팔린(nopaline) 합성효소 프로모터, Tn5 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 및 노팔린 합성효소 3' 비번역 영역을 함유하는 키메라 유전자이다. 유용한 식물 발현 벡터는 파마샤(Pharmacia, Piscataway, N.J.)로부터 시판된다. 식물 내에서 외래 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터 및 프로모터는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,188,642호; 제5,349,124호; 제5,352,605호 및 제5,034,322호에 기재되어 있다.
발현 벡터의 제작
상보적 부착 말단(cohesive termini)을 통해 DNA를 벡터에 작동가능하게 연결시키기 위한 다양한 방법이 개발되어 있다. 예를 들면, 상보적 단독중합체 트랙(track)이 벡터 DNA 내로 삽입될 DNA 절편에 부가될 수 있다. 그 후, 벡터와 DNA 절편은 상보적 단독중합체성 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다. 별법으로, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 부위를 함유하는 합성 링커를 사용하여 DNA 절편을 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 합성 링커는 블런트-말단(blunt-ended) DNA 분자의 결찰(ligation)을 촉진할 수 있는 효소, 예컨대, 박테리오파지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 블런트-말단 DNA 절편을 과량의 합성 링커 분자와 함께 항온처리함으로써 블런트-말단 DNA 절편에 부착시킬 수 있다. 따라서, 반응 생성물은 그의 말단에서 합성 링커 서열을 보유하는 DNA 절편이다. 그 후, 이 DNA 절편은 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 합성 링커의 말단과 상용가능한 말단을 발생시키는 효소로 절단된 발현 벡터 내로 결찰된다. 다양한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs, Beverly, Mass)를 비롯한 많은 공급원으로부터 시판된다.
분비 성분, J 쇄 및 본 발명의 키메라 수용체 단백질 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 식물 세포 내로 직접 도입되거나, 각각의 성분들을 식물 세포 내로 도입하고 식물을 재생시키고 다양한 성분들을 교차-혼성화하여 모든 필요한 성분들을 함유하는 최종 식물 세포를 생산함으로써 간접적으로 도입할 수 있다.
키메라
독소 수용체 및 면역접합체의 발현
본 발명의 키메라 독소 수용체 및 면역접합체의 성분들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 진핵 세포 내로 도입하기 위해 임의의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 유전자를 식물 내로 도입하는 방법은 아그로박테리움-매개 식물 형질전환, 원형질체 형질전환, 화분 내로의 유전자의 전달, 재생성 기관 내로의 주입 및 미성숙 배아 내로의 주입을 포함한다. 이 방법들 각각은 상이한 장점 및 단점을 가진다. 따라서, 특정한 진핵 세포 또는 식물 종 내로 유전자를 도입하는 한 특정한 방법은 반드시 또 다른 진핵 세포 또는 식물 종에 대해 가장 효과적일 필요는 없다.
식물
예를 들면, 유전자를 식물 내로 도입하는 방법은 아그로박테리움-매개 식물 형질전환, 원형질체 형질전환, 화분 내로의 유전자의 전달, 재생성 기관 내로의 주입 및 미성숙 배아 내로의 주입을 포함한다. 이 방법들 각각은 명백한 장점 및 단점을 가진다. 따라서, 유전자를 특정한 진핵 세포 또는 식물 종 내로 도입하는 구체적인 방법은 반드시 또 다른 진핵 세포 또는 식물 종에 대해 가장 효과적일 필요는 없다.
유전자는 식물 또는 그의 자손의 게놈을 영구적으로 또는 안정하게 변화시키지 않으면서 원하는 단백질을 신속히 생성하도록 디자인된 일시적인 방식으로 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 어떻게 이 일시적 발현이 달성될 수 있는가에 대한 일례는 이원(binary) 벡터 내에 원하는 유전자 또는 유전자들을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스의 현탁액을 온전한 식물의 잎 내의 세포내 공극으로 침투시키고 일정 시간 경과 후 단백질의 추출을 위해 상기 잎을 수거하는 것이다(Voinnet O, Rivas S, Mestre P, Baulcombe D (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal 33: 949-956).
아그로박테리움 투메파시엔스-매개 전달은 DNA가 전체 식물 조직 내로 도입되어 원형질체로부터 온전한 식물을 재생시킬 필요가 없기 때문에 유전자를 식물 세포 내로 도입하는 데 널리 적용가능한 시스템이다. DNA를 식물 세포 내로 도입하기 위한 아그로박테리움-매개 발현 벡터의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Fraley et al., Biotechnology, 3:629 (1985) and Rogers et al., Methods in Enzymology, 153:253-277 (1987))에 기재된 방법을 참조한다. 또한, Ti-DNA의 삽입은 재배열을 거의 야기하지 않는 비교적 정확한 과정이다. 전달될 DNA의 영역은 경계 서열에 의해 한정되며, 개재 DNA는 통상적으로 문헌(Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205:34 (1986) and Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207:471 (1987))에 기재된 바와 같이 식물 게놈 내로 삽입된다. 모뎀(modem) 아그로박테리움 형질전환 벡터는 아그로박테리움뿐만 아니라 에쉬케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서도 복제할 수 있으므로 문헌(Klee et al., in Plant DNA Infectious Agents, T. Hohn and J. Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985))에 기재된 바와 같이 편리하게 조작될 수 있다. 아그로박테리움-매개 유전자 전달용 벡터에 있어서 보다 최근의 기술적 진보는 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자들을 발현할 수 있는 벡터의 제작을 용이하게 하기 위해 벡터 내의 유전자 및 제한 부위의 재배열을 개선시켰다. 문헌(Rogers et al., Methods in Enzymology, 153:253 (1987))에 기재된 벡터는 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접적인 발현을 위한 프로모터 및 폴리아데닐화 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 편리한 다중-링커 영역을 가지며 본 목적에 적합하다.
아그로박테리움-매개 형질전환이 효율적인 식물 종에서, 아그로박테리움-매개 형질전환은 유전자 전달의 용이함 및 정의된 성질 때문에 선택되는 방법이다. 엽편(leaf disk) 및 다른 조직의 아그로박테리움-매개 형질전환은 아그로박테리움 투메파시엔스가 천연적으로 감염시키는 식물 종으로 한정되는 듯하다. 따라서, 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.
형질전환 식물이 문헌(Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345 (1987))에 기재된 바와 같이 아그로박테리움 벡터를 사용하여 아스파라거스에서 생산되었다 하더라도, 아그로박테리움에 대한 천연 숙주로 보이는 단자엽 식물은 거의 없다. 그러므로, 벼, 옥수수 및 밀과 같은 상업적으로 중요한 곡물은 별법을 이용하여 형질전환해야 한다. 식물 원형질체의 형질전환은 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공 및 이 처리들의 조합을 기초로 한 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985); Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178 (1985); Fromm et al., Nature, 319:791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204:204 (1986); Callis et al., Genes and Development, 1:1183 (1987); and Marcotte et al., Nature, 335:454 (1988))을 참조한다.
이 방법들을 상이한 식물 종에 적용하는 것은 원형질체로부터 특정한 식물 종을 재생시키는 능력에 달려 있다. 원형질체로부터 곡물을 재생시키는 예시적 방법은 문헌(Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2:74 (1985); Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73:16 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep., 4:85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087 (1986))에 기재되어 있다.
원형질체로부터 성공적으로 재생될 수 없는 식물 종을 형질전환시키기 위해, DNA를 온전한 세포 또는 조직 내로 도입하는 다른 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 곡물을 미성숙 배아 또는 외식편(explant)으로부터 재생하는 것은 문헌(Vasil, Biotechnology, 6: 397 (1988))에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 또한, "입자 총" 또는 고속 미세발사(microprojectile) 기술이 이용될 수 있다. 문헌(Klein et al., Nature, 327:70 (1987); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8502 (1988); and McCabe et al., Biotechnology, 6:923 (1988))에 기재된 바와 같이, DNA는 이러한 기술의 이용에 의해 세포 벽을 통해 초당 1 내지 수백 미터의 속도로 가속화된 작은(0.525 μm) 금속 입자의 표면 상의 세포질 내로 운반된다. 상기 금속 입자는 여러 세포층을 투과하므로 조직 외식편 내의 세포가 형질전환될 수 있게 한다. 금속 입자는 옥수수 세포를 성공적으로 형질전환시키고 번식능력이 있는 안정하게 형질전환된 담배 및 대두 식물을 발생시키는 데 사용되어 왔다. 조직 외식편의 형질전환은 원형질체 단계를 통한 계대(passage)의 필요성을 없애므로 형질전환 식물의 발생을 가속화시킨다.
문헌(Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988))에 기재된 바와 같이 DNA를 화분 내로 직접 전달함으로써 DNA를 식물 내로 도입시킬 수도 있다. 폴리펩티드 코딩 유전자의 발현은 문헌(Pena et al., Nature, 325:274 (1987))에 기재된 바와 같이 DNA를 식물의 재생성 기관 내로 주입함으로써 달성할 수 있다. 또한, DNA는 미성숙 배아 세포 내로 직접 주입될 수 있으며 탈수된 배아의 재수화는 문헌(Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); and Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986))에 기재된 바와 같이 수행된다.
단일 식물 원형질체 또는 다양한 외식편으로부터 식물을 재생시키는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988))을 참조한다. 이 재생 및 성장 과정은 형질전환체 세포를 선별하고 발아시키는 단계, 형질전환체 발아를 뿌리내리게 하는 단계 및 토양에서 묘목을 성장시키는 단계를 포함한다.
잎 외식편으로부터의 아그로박테리움 투메파시엔스에 의해 도입된 외래 유전자를 함유하는 식물의 재생은 문헌(Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985))에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 이 과정에서, 형질전환체는 문헌(Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983))에 기재된 바와 같이 형질전환되는 식물 종에서 발아의 재생을 유도하는 배지 중에서 선별제의 존재 하에 성장한다. 이 과정은 전형적으로 2 내지 4주 내에 발아를 일으키고, 그 후 이 형질전환체 발아는 선별제 및 박테리아 성장 방지용 항생제를 함유하는 적절한 뿌리 내리기-유도 배지로 옮겨진다. 묘목을 형성하기 위해 선별제의 존재 하에 뿌리 내린 형질전환체 발아를 토양에 이식하여 뿌리 내리게 한다. 이 과정들은 사용된 구체적인 식물 종에 따라 다를 것이고, 이러한 변동은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 면역접합체는 쌍자엽 식물, 단자엽 식물, 가지과 식물, 자주개자리 식물, 콩과 식물, 홍화와 같은 종유 식물 또는 담배로부터 유래된 식물 세포를 비롯한 임의의 식물 세포 내에서 생성될 수 있다.
본 발명의 형질전환 식물은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있는 임의의 유성 교배 식물 종으로부터 생성될 수 있다. 유용한 식물 종은 담배, 토마토, 콩과 식물, 자주개자리 식물, 오크(oak) 및 단풍나무를 비롯한 쌍자엽 식물; 잔디, 옥수수, 곡물, 귀리, 밀 및 보리를 비롯한 단자엽 식물; 및 겉씨 식물, 구과 식물, 속새 식물, 석송류, 우산이끼, 붕어마름, 이끼, 해초, 배우체, 포자체 또는 양치 식물을 비롯한 저등 식물이다.
진핵 세포
본 발명은 포유동물 세포를 비롯한 진핵 세포 내에서 키메라 독소 수용체 및 면역접합체를 발현하는 것도 고려한다. 당업자는 포유동물 세포 내에서의 발현에 이용가능한 다양한 시스템을 이해할 것이고, 상기 세포 내에서 면역접합체 및 키메라 단백질 수용체 분자, 예컨대, ICAM-1 분자가 발현되도록 상기 시스템들을 용이하게 변형할 수 있을 것이다. 바람직한 ICAM 실시양태에서, 본 발명의 키메라 ICAM-1, J 쇄 및 분비 성분 분자는 문헌(Aruffo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:8573-8577 (1987))에 이미 기재되어 있는 벡터 pCDM8 내에 위치된다. 결코 PCDM8 컨스트럭트만이 사용될 수 있는 것은 아니며, cog 세포 발현 시스템을 이용하지 않으면서 키메라 ICAM-1 및 면역접합체의 다른 분자와 함께 사용될 수 있는 다수의 다른 진핵 발현 시스템이 이용가능하다.
키메라
독소 수용체 및 면역접합체를 함유하는 조성물
본 발명은 식물성 거대분자 또는 물질과 함께 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 함유하는 조성물도 고려한다. 전형적으로, 이 식물성 거대분자 또는 식물성 물질은 본 발명에서 유용한 임의의 식물로부터 유래된다. 식물성 거대분자는 예를 들면, 식물 세포, 식물 세포의 추출물 또는 식물 내에서 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체와 함께 존재한다. 조성물 중의 전형적인 식물성 거대분자는 리불로즈 비스포스페이트 카르복실라제, 집광 복합체 색소(LHCP), 2차 대사물질 또는 클로로필이다. 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.01 질량% 내지 99 질량%의 농도로 식물성 물질 또는 식물성 거대분자를 가진다. 다른 조성물은 물을 제외하고 1 질량% 내지 99 질량%의 농도로 존재하는 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 가진 조성물을 포함한다. 다른 조성물은 물을 제외하고 50 질량% 내지 90 질량%의 농도로 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 물을 제외하고 0.1 질량% 내지 5 질량%의 농도로 식물성 거대분자를 함유할 수 있다. 전형적으로, 조성물 중에 존재하는 질량은 식물성 거대분자, 및 본 발명의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체로 구성될 것이다. 본 발명의 단백질이 더 높거나 더 낮은 농도로 존재하는 경우, 조성물에 존재하는 식물성 거대분자의 농도는 역으로 달라질 것이다. 다른 실시양태에서, 식물성 거대분자 조성물은 물을 제외하고 0.12 질량% 내지 1 질량%의 농도로 존재한다.
본 발명은 하기 성분들 전부 또는 일부를 포함하는 물질 조성물을 고려한다: 키메라 단백질 수용체 분자, J 쇄 또는 분비 성분. 이 성분들은 복합체를 형성하고 이미 공지된 바와 같이 연결된다. 전형적으로, 상기 조성물은 식물로부터 유래된 분자들도 함유한다. 이 조성물은 기능적 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체 및 식물-유래 분자를 제공하는 추출 과정 후에 수득될 수도 있다.
추출 방법은 상기 복합체를 함유하는 식물에 힘을 인가하여 식물의 아포플라스트 구획(apoplastic compartment)을 파열시켜 상기 복합체를 방출하는 단계를 포함한다. 상기 힘은 아포플라스트 액을 방출시키는 일차 방법으로서 전단(shearing)을 수반한다. 전체 식물 또는 식물 추출물은 키메라 독소 수용체/면역접합체와 다양한 다른 식물성 거대분자의 혼합물을 함유한다. 상기 혼합물 중에 함유되는 거대분자 중에는 리불로즈 비스포스페이트 카르복실라제(RuBisCo) 또는 RuBisCo의 단편이 있다. 다른 거대분자는 LHCP이다. 또 다른 분자는 클로로필이다. 조성물의 제조에 유용한 다른 방법으로는 다양한 용매를 사용한 추출 방법 및 진공을 식물성 물질에 적용하는 방법이 있다. 본 발명의 조성물은 물을 제외하고 약 0.1 질량% 내지 5 질량%의 농도로 식물성 거대분자를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물-유래 분자와 동물-유래 분자의 상대적 비율이 달라질 수 있다는 것도 고려한다. RuBisCo 또는 클로로필과 같은 특정한 식물성 단백질의 양은 물을 제외하고 추출물의 질량의 0.01%만큼 적을 수 있거나 추출물의 질량의 99.9%만큼 많을 수 있다.
또한, 본 발명은 환자 또는 동물의 치료에 사용될 수 있는 치료 조성물을 고려한다. 이 치료 조성물은 식물 또는 다른 형질전환 유기체로부터의 추출 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 일단 키메라 독소 수용체/면역접합체가 추출되면, 이것은 크기 배제, 이온 교환 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 기법에 의해 더 정제될 수도 있다. 식물성 분자는 상기 복합체와 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 특정한 치료 성분의 어떠한 추가 정제 없이 키메라 독소 수용체/면역접합체를 함유하는 치료 식물 추출물을 직접 사용하는 것도 고려한다. 투여는 국소 도포, 경구 섭취, 비강 분무, 또는 키메라 독소 수용체/면역접합체를 점막 표적 병원체에 전달하기에 적합한 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
약학 조성물, 제형 및 투여 경로
본원에 기재된 키메라 독소 수용체/면역접합체는 바람직하게는 적절한 약학 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 전술된 것들 이외에 또는 대신에 성분들을 함유할 수 있다. 조성물은 투여된 경우 바람직하게는 치료적 성질 및 예방적 성질 중 어느 하나 또는 이들 둘다를 나타낸다. 이러한 조성물의 제조는 당업계의 통상적인 방법에 따라 행해질 수 있으며, 임의의 다양한 형태, 예컨대, 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 섭취 전에 액체 중에 함유시키기에 적합한 고체 형태를 취할 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질의 제형화 및 투여를 위한 기법은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition)에서 찾을 수 있다. 당업자라면 이 방법들을 이용하여 본 발명의 면역접합체를 활용함으로써 과도한 실험 없이 성공을 달성할 수 있다.
투여 경로
본 발명의 투여에 적합한 경로는 예를 들면, 경구, 비강, 흡입, 안구내, 인두, 기관지, 경점막, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 장 투여를 포함한다. 별법으로, 화합물을 국소적 방식, 예컨대, 원하는 작용 부위에 화합물을 주사하거나 도포함으로써 투여할 수 있다.
제형
본 발명의 약학 조성물은 그 자체로 공지된 방식, 예컨대, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 환제화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다. 부형제 및/또는 다른 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 활성 화합물이 약학 제제로 가공되는 것을 용이하게 할 수 있다. 적절한 제형은 선택된 구체적인 투여 경로에 달려 있다.
주사의 경우, 본 발명의 물질은 수용액, 바람직하게는 핸크스(Hanks) 용액, 링거 용액 또는 생리학적 식염수 완충제와 같은 생리학적으로 상용가능한 완충제 중에서 제형화될 수 있다.
경점막 투여의 경우, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형 중에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
경구 투여의 경우, 화합물은 당업계에 잘 공지되어 있는 약학적으로 허용가능한 담체와 활성 화합물을 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 화합물이 치료될 환자에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있게 한다. 적합한 담체에는 부형제, 예를 들면, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 및/또는 소르비톨을 비롯한 당과 같은 충전제; 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸쓰, 메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로즈, 소듐 카르복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 셀룰로즈 제제가 포함된다. 원하는 경우, 붕해제 예컨대, 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대, 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다.
당의정 코어는 적절한 코팅물을 구비하고 있다. 이 목적을 위해, 경우에 따라 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락카 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 투여량의 확인 또는 활성 화합물 투여량의 다양한 조합물의 특징규명을 위해 염료 또는 색소가 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가될 수 있다.
경구 투여될 수 있는 약학 제제에는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 밀봉된 연질 캡슐이 포함된다. 푸쉬-피트 캡슐은 락토즈와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및, 경우에 따라, 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 예컨대, 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 이러한 투여에 적합한 제형이어야 한다.
협측 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태 또는 수용성 겔의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적합한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체를 사용하여 가압된 팩 또는 분사기로부터의 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 단위 투여량은 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴으로 만들어진 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적절한 분말 베이스(base), 예컨대, 락토즈 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
별법으로, 활성 성분은 사용 전에 적절한 비히클, 예컨대, 멸균 발열원-무함유 물을 사용한 재구성화용 분말 형태일 수 있다.
또한, 화합물은 데포(depot) 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 오래 작용하는 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 제형화될 수 있거나, 서서히 용해되는 유도체, 예를 들면, 서서히 용해되는 염으로서 제형화될 수 있다.
또한, 화합물은 서방 시스템, 예컨대, 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체로 이루어진 반투과성 매트릭스를 사용하여 전달할 수 있다. 다양한 서방 물질이 확립되어 있고 당업자에게 잘 공지되어 있다. 서방 캡슐은 그의 화학적 성질에 따라 수 주 내지 최대 100일에 걸쳐 화합물을 방출할 수 있다. 치료제의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라 단백질 안정화를 위한 추가 방법이 이용될 수 있다.
약학 조성물은 적절한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
약학적으로 상용가능한 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 석신산, 구연산 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 산을 사용하여 형성할 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에서 더 높은 가용성을 나타내는 경향이 있다. 용액에서, pH의 조작도 원하는 성질을 최적화하기 위해 관용적으로 이용된다.
유효 투여량 및 투약법의 결정
본 발명에서 사용하기에 적합한 약학 조성물에는 활성 성분이 의도하는 목적, 예를 들면, 치료적 및/또는 예방적 사용을 달성하기에 효과적인 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 약학적 유효량은 질환의 증상을 예방하거나, 완화시키거나 개선시키거나, 치료될 대상체의 생존을 연장하기에 효과적인 화합물의 양을 의미한다. 약학적 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있고, 전형적으로 약 0.5 pg/kg/일 내지 약 500 g/kg/일의 양일 것이며, 개별 투여량은 전형적으로 약 1 ng 내지 수 g의 면역접합체를 포함할 것이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적 유효 투여량은 세포 배양 분석으로부터 먼저 추정될 수 있다. 예를 들면, 다양한 투여량을 상이한 동물 또는 세포 배양물에 투여하여 효과를 비교할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 농도 범위를 확인함으로써 그 양을 준비하여 투여할 수 있다. 최적화는 당업자에게 관용적인 것이다.
당업자는 약학적 효능을 고려하는 것 이외에 예컨대, LD50(집단의 50%에게 치사 효과를 나타내는 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료 효과를 나타내는 투여량)을 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서의 약학적 표준 절차에 따른 독성도 고려한다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이며, 이는 LD50과 ED50 사이의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 치수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 설정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투약 제형 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. (예를 들면, 문헌(Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics,". Ch. 1 p.l)을 참조한다.)
투여량 및 투여 빈도는 약학적 효과, 예를 들면, 치료 및/또는 예방 효과를 유지하거나 제공하기에 충분한 순환 수준의 키메라 독소 수용체 또는 면역접합체를 제공하도록 조절될 수 있다. 최소 유효 농도(MEC)는 제형마다 다를 것이지만, 시험관 내 및/또는 생체 내 데이타로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개체의 특징 및 투여 경로에 달려 있을 것이다. 그러나, 본원에 기재된 분석은 추후 양 및 정확한 제형에서 더 최적화될 수 있는 순환 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
투여 간격은 MEC 값을 이용하여 결정할 수도 있다. 화합물은 기간의 10% 내지 90%, 기간의 30% 내지 90% 또는 가장 바람직하게는 기간의 50% 내지 90% 동안 MEC보다 높은 순환 수준을 유지하는 투약법을 이용하여 투약할 수 있다.
원하는 경우, 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투약 제형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배 장치 내에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들면, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여를 위한 설명서를 수반할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 약물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기에 부착된 고시(notice)를 수반할 수 있으며, 이 고시는 인간 또는 동물 투여를 위한 면역접합체 형태로 정부 기관에 의해 승인받았음을 나타낸다. 이러한 고시는 예를 들면, 처방 약물에 대한 미국 식품의약청에 의해 승인받은 표지, 또는 승인받은 제품 삽입물일 수 있다. 상용가능한 약학적 담체 중에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 제조될 수 있고, 적절한 용기 내에 배치될 수 있으며, 특정한 증상의 치료, 예컨대, 숙주 유기체/환자 단백질 수용체 분자에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방용으로 표지될 수 있다.
감염의 치료 및 예방 방법
예를 들면, 탄저 감염에 대항하기 위해 본 발명의 치료적 및/또는 예방적 키메라 독소 수용체/면역접합체를 필요로 하는 환자는 바람직하게는 전술된 바와 같이 결정되고 제조되며 투여되는 약학 조성물의 일부로서 약학적 유효량의 원하는 키메라 독소 수용체/면역접합체를 투여받을 수 있다. 이 제형들 및 전달 양상은 광범위하게 달라질 수 있다. 이하, 유효량 및 독성을 유추하는 데 사용된 후 인간 및 다른 동물 둘다에서 치료 및 예방 매개변수 및 투약법을 결정하는 데 편리하게 사용될 수 있는 예비 과정이 기재된다. 이 과정은 설명을 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 또한, 이 과정은 당업자에게 관용적인 것이다.
인간에서 감염성을 감소시키는
키메라
독소 수용체/면역접합체의 능력: 투여량 상승 내성 연구
감염에 대한 투여 예컨대, 정맥내 또는 근육내 투여의 효과를 측정하기 위해, 본 발명의 키메라 독소 수용체/면역접합체를 예를 들면, 무작위 제어 시험을 이용하여 시험할 수 있다. 다른 투여 경로가 이용될 수 있다. 효과를 모니터링하는 데 이용될 수 있는 다양한 분석이 존재한다. 이 연구는 환자 대상체에 의해 섭취된 키메라 독소 수용체/면역접합체가 감염을 치료하거나 예방할 수 있는 정도를 평가할 수 있다. 예를 들면, 감염된 대상체 및 노출되었지만 감염되지 않은 대상체에게 키메라 독소 수용체/면역접합체를 투여하고 시간 경과에 따라 평가함으로써 감염되었거나 노출되었지만 치료받지 않은 유사한 대상체와 비교할 때 질병 진행을 평가할 수 있다.
본 발명의 키메라 독소 수용체/면역접합체는 다양한 양의 키메라 독소 수용체/면역접합체를 가진 완충 식염수로서 제형화되어 다양한 시간 간격을 두고 환자에게 투여될 수 있다. 단일 상승 투여량 및 다중 상승 투여량 연구는 면역접합체의 안전성을 평가하는 데 이용될 수 있다. 각각의 경우, 하나 이상의 대상체가 각 투여량 수준에서 평가될 수 있고, 이때 일부 대상체는 면역접합체를 투여받고 경우에 따라 하나 이상의 대상체가 플라세보를 투여받는다. 각각의 연구에서, 다양한 투여량 수준이 평가될 수 있다. 투여량 수준은 달라질 수 있으나, 전형적으로 ng 내지 g 범위 내에 있다.
투여량은 수 초, 수 분, 수 시간, 수 주 및 수 개월에 걸쳐 투여될 수 있고, 독성 및/또는 약학적 효과에 대해 평가될 수 있다.
안전성 및 독성은 자극 또는 염증의 징후에 대해, 예를 들어, 비강 점막의 가시적 검사에 의해 평가될 수 있다. 또한, 혈액 안전성 평가는 순환 면역접합체 및 리노바이러스 양을 비롯한 다양한 혈액 성분들을 측정하기 위한 ELISA와 같은 민감한 분석을 사용하여 관용적인 방법에 따라 이용될 수 있다. 유사하게, 비강 세척 시험은 관용적인 방법에 따라 행해질 수 있다.
관용적인 통계학적 분석 및 계산을 이용하여 단일 환자 및/또는 환자-수용체의 집단에 대해 시간 경과에 따라 예측된 효능 및 독성을 측정할 수 있다.
키메라 독소 수용체 단백질에 의해 표적화되는 병원체, 예컨대, 탄저 박테리아 및 탄저 포자가 제어된 임상 시험에서 인간 피실험체에게 윤리적으로 투여될 수 없는 경우, 인간에서 추정되는 투약 효능은 탄저 박테리아 또는 포자에 노출된 영장류 종을 포함할 수 있는 적절한 동물 종에서 실험적으로 결정될 수 있다. 유효량은 키메라 독소 수용체 단백질 투여의 다양한 농도 및 경로에서의 처리된 동물 및 대조군 동물의 생존율에 의해 결정될 수 있다. 투여된 키메라 독소 수용체 단백질의 약동학적 및 약력학적 성질을 결정하기 위해 혈청, 점액 및/또는 조직 샘플을 피실험체로부터 채취할 수 있고, 이 데이타로부터 동물 피실험체를 보호하는 키메라 독소 수용체 단백질의 최소 유효 농도 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 인간 피실험체에 대한 최소 유효 농도를 확립하기 위해, 전술한 동물 피실험체 시험에서 효과적인 것으로 결정된 투여 경로와 동일한 투여 경로를 통해 정상 수컷 및 암컷 피실험체에게 키메라 독소 수용체 단백질을 투여할 수 있고, 혈청, 점액 및/또는 조직 샘플을 이 인간 피실험체로부터 채취할 수 있다. 인간 피실험체에서 투여된 키메라 독소 수용체 단백질의 농도는 동물 시험 및 샘플에서 효과 및 보호를 나타내는 것으로 이미 밝혀진 농도와 동일한 농도를 얻도록 조절될 수 있다.
탄저, 보툴리늄 독소, 야토병 등과 같은 병원체에의 생명-위협 노출을 치료하고/하거나 예방하기 위한 제품의 안전성 및 효능의 확립을 위한 동물 및 인간 시험에 대한 지침은 미국 식품의약청에 의해 공표되었고 문헌(Federal Register: May 31, 2002 (Volume 67, Number 105), Rules and Regulations, Page 37988-37998)을 비롯한 다양한 공개문헌에서 공개적으로 이용될 수 있다. 이 규칙은 GPO 접근[wais.access.gpo.gov]을 통해 연방 관보 온라인으로부터 입수될 수 있고, 연방 규제 식품의약 시행 규칙 21 CFR 파트 314 및 601에서 찾을 수 있다.
하기 실시예는 개시된 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태를 설명한다. 이 실시예는 청구된 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.
실시예
1:
ICAM
-1 면역접합체 발현 카세트의 제작
ICAM-1 세포외 도메인 D1 내지 D5를 코딩하는 카세트를 PCR 클로닝으로 제조하였다. 구체적으로, ICAM-1의 5개 세포외 Ig-유사 도메인 모두를 함유하는 단편 을, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 pCDIC1-5D/IgA(Martin, et al. J. Virol. 67:3561-8, 1993)로부터 증폭하였다:
5'-TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3'(서열번호 6)
5'-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCTCGCGG-3'(서열번호 7).
이들 두 프라이머는 PCR 단편의 5' 말단 및 3' 말단에서 SpeI 부위(밑줄친 뉴클레오티드들)를 도입하도록 디자인되었다. PCR은 에러의 축적을 감소시키기 위해 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 수행하였다. PCR 단편을 벡터 PCRScript(Stratagene) 내로 클로닝하고, (카르복시-말단에서 SEKDEL(서열번호 4)을 갖거나 갖지 않은) 인간 IgA2 카세트에 융합하기 전에 시퀀싱하였다.
인간 J 쇄 및 분비 성분뿐만 아니라 인간 IgA2 중쇄를 식물 내에서 발현시키기 위한 컨스트럭트가 개발되었다. 중쇄 발현 카세트 벡터를 제조하고 pSSpHuA2로 지칭하였다(도 1 참조). 상기 벡터는 콩 레구민(legumin) 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 함유한다(Baumlein et al., Nucleic Acids Res. 14(6), 2707-2720, 1986). 콩 레구민의 서열은 유전자은행 검색 번호 제X03677호로서 제공되어 있으며, 콩 레구민 신호 펩티드의 서열은 서열번호 10이고(도 8 또한 참조), SpeI 부위와 SacI 부위 사이에 개재되어 있는 상기 두 부위를 가진 IgA2m(2) 불변 영역, 및 신호 펩티드 및 인간 IgA2m(2) 중쇄의 불변 영역의 발현을 유도하기 위한 SuperMas 프로모터가 존재한다.
인간 ICAM-1의 최초 5개 도메인 및 인간 IgA2m(2)의 Fc 영역을 코딩하는 증폭된 DNA를 식물-발현 카세트 내에서 융합시켜 도 2A에 나타낸 키메라 ICAM-1 분자 발현 컨스트럭트를 제조하였다. 이는 ICAM-1의 5개 세포외 도메인을 코딩하는 단편을 벡터 pSSPHuA2 내로 클로닝하여 pSSPICAMHuA2를 생성함으로써 달성되었다. 편리한 제한부위(5' SpeI 및 3' SpeI)는 증폭된 단편이 신호 펩티드와 Cα1 도메인 사이에 삽입되게 하였다. 생성된 컨스트럭트에서, 키메라 ICAM-1 분자의 발현은 기본구성적 프로모터 "superMAS"(Ni et. al., 1995) 및 nos 3' 종결자 영역의 조절 하에 있다.
생성된 키메라 ICAM-1 분자 컨스트럭트는 가변 영역을 전혀 함유하지 않는다. mRNA의 번역 시, 신호 펩티드 절단은 ICAM-1-중쇄 융합체를 식물 세포의 소포체(ER) 내에 축적시키는 것으로 예측된다. 컨스트럭트의 발현 수준을 급격히 상승시키기 위해 ER 보유 신호(RSEKDEL, 서열번호 5)를 코딩하는 DNA를 중쇄의 3' 말단에 부착시켰다. 아미노산 서열 SEKDEL(서열번호 4)은 식물 세포 내의 소포체 내에서 단백질을 보유하기 위한 컨센서스 신호 서열이다. 이 서열은 식물 내에서 항체의 축적 수준을 상승시키는 것으로 밝혀졌다(Schouten et al., Plant Molecular Biology 30:781-793, 1996). 키메라 ICAM-1 분자 컨스트럭트의 아미노산 서열은 도 2B에 나타나 있다. 이 컨스트럭트의 DNA 서열 및 번역 프레임은 입자 충격(bombardment)에 사용되기 전에 검증되었다.
J 쇄와 IgA의 조립이 골기체 내에서 일어난다는 것은 최근에 밝혀졌고(Yoo et al., J. Biol. Chem. 274:33771-33777, 1999), SEKDEL(서열번호 4)을 갖지 않은 중쇄도 마찬가지로 제작되었다. ICAM-1 단편을 SEKDEL(서열번호 4)을 갖지 않은 IgA2m(2) 불변 영역을 함유하는 발현 카세트 내로 클로닝하였다.
실시예
2: 식물 내에서 조립된
ICAM
-1 면역접합체의 발현
A. 면역접합체 발현 벡터
플라스미드 pSSPICAMHuA2(서열번호 9 및 도 8A)는 길이가 6313 bp이다. 뉴클레오티드 49-1165는 수퍼프로모터를 나타낸다(Ni et al., Plant Journal 7:661-676, 1995). 뉴클레오티드 1166-3662는 링커 서열을 가진 인간 ICAM-1/인간 IgA2m(2) 불변 하이브리드를 코딩하는 서열을 포함한다. 컨센서스 코작(Kozak) 서열(Kozak, Cell 44(2):283-92, 1986)(뉴클레오티드 1186-1192)을 포함시켜 번역 개시를 상승시킬 뿐만 아니라, 비시아 파바(V. faba) 레구민으로부터의 신호 펩티드를 포함시킨다(뉴클레오티드 1189-1257; Baumlein et al., Nucleic Acids Reg. 14(6):2707-2720 (1986)). 인간 IgA2m(2) 불변 영역의 서열(뉴클레오티드 3663-3633)은 이미 공개되어 있다(chintalacharuva, et al., J. Imm. 152: 5299-5304, 1994). 소포체 보유 신호 SEKDEL(서열번호 4)을 코딩하는 서열은 중쇄(뉴클레오티드 3634-3654)의 말단에 부착시킨다. 뉴클레오티드 3663-3933은 노팔린 합성효소 3' 말단(전사 종결 및 폴리아데닐화 신호; Depicker et al., 1982)으로부터 유래된다. 상기 플라스미드의 나머지는 벡터 pSP72(Promega)로부터 유래된다.
플라스미드 pSHuJ(도 8C)는 길이가 4283 bp이다. 뉴클레오티드 14-1136은 수퍼프로모터(Ni et al., Plant Journal 7:661-676, 1995)를 나타내며, 뉴클레오티드 1137-1648은 도 8(서열번호 11)에 나타나 있고 링커 서열과 함께 천연 신호 펩티드(Max and Korsmeyer, J. Imm. 152:5299-5304, 1985)를 포함하는 인간 J 쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 컨센서스 코작(Kozak) 서열(Kozak, Cell 44(2):283-92, 1986)(뉴클레오티드 1162-1168)을 포함시켜 번역 개시를 상승시킨다. 뉴클레오티드 1649-1902는 노팔린 합성효소 3' 말단(전사 종결 및 폴리아데닐화 신호; Depicker et al., J Mol Appl Genet 1(6):561-73, 1982)으로부터 유래된다. 상기 플라스미드의 나머지는 벡터 pSP72(Promega)로부터 유래된다.
플라스미드 pSHuSC(도 8D)는 길이가 5650 bp이다. 뉴클레오티드 13-1136은 수퍼프로모터(Ni et al., Plant Journal 7:661-676, 1995)로부터 유래되고, 뉴클레오티드 1137-2981은 링커 서열(서열번호 12)과 함께 천연 신호 펩티드(Krajci, et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm 158:783, 1994)를 포함하는 인간 분비 성분을 코딩하는 서열을 포함한다. 컨센서스 코작 서열(Kozak, Cell 44(2):283-92, 1986)(뉴클레오티드 1151-1157)을 포함시켜 번역 개시를 상승시킨다. 뉴클레오티드 2982-3236은 문헌(Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6):561-73 (1982))에 기재된, 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호를 제공하는 노팔린 합성효소 3' 말단으로부터 유래된다. 상기 플라스미드의 나머지는 벡터 pSP72(Promega)로부터 유래된다.
플라스미드 pBMSP-1(서열번호 13 및 도 8E)은 pGPTV-KAN으로부터 유래된다. 문헌(Becker et al., in Plant Molecular Biology 20, 1195-1197, (1992))에는 좌측 T-DNA 경계에 인접하여 위치된 선별 마커, 및 좌측 및 우측 경계의 외부에 있는 서열을 가진 신규 식물 이원 벡터가 기재되어 있다. pBMSP-1의 뉴클레오티드 18-187은 우측 T-DNA 경계를 나타내며, 뉴클레오티드 1811-775는 SuperMAS 프로모터를 나타낸다. 뉴클레오티드 2393-2663은 NOS 프로모터(Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6):561-73, 1982)를 나타내고, 뉴클레오티드 2698-3492는 NPTII 유 전자(가나마이신에 대한 내성을 부여함)를 코딩하고, 뉴클레오티드 3511-3733은 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 7(Gielen et al., Embo. J. 3:835-46, 1984)로부터 유래된 폴리아데닐화 신호이다. 뉴클레오티드 1768-976은 NPTII 유전자를 코딩하고, 뉴클레오티드 4317-4464는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다.
플라스미드 pBMSP-1spJSC(서열번호 14 및 도 8F)는 수퍼프로모터의 조절 하에 있는 J 및 SC 둘다를 함유하는 pBMSP의 유도체이다. 이 플라스미드에서, 뉴클레오티드 1-149는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다. 뉴클레오티드 955-733은 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자로부터 유래된 폴리아데닐화 신호이고, 뉴클레오티드 1768-976은 NPTII 유전자(가나마이신에 대한 내성을 부여함)를 코딩하고, 뉴클레오티드 2073-1803은 NOS 프로모터를 나타낸다. 뉴클레오티드 2635-3768은 SuperMAS 프로모터를 나타내고, 뉴클레오티드 3774-5595는 인간 분비 성분을 코딩하며, 뉴클레오티드 5603-5857은 NOS 폴리아데닐화 신호를 나타낸다. 뉴클레오티드 5880-6991은 SuperMAS 프로모터를 나타내고, 뉴클레오티드 7007-7490은 인간 J 쇄를 나타내며, 뉴클레오티드 7504-7757은 NOS 폴리아데닐화 신호를 나타낸다. 뉴클레오티드 7886-8057은 우측 T-DNA 경계를 나타낸다.
히그로마이신 내성을 부여하는 효소를 코딩하는 플라스미드 pGPTV-HPT는 시판되고 있다(Max-Planck-Institut fur Zuchtungsforschung (Germany)). 상기 플라스미드는 문헌(Becker in Plant Molecular Biology 20, 1195-1197 (1992))에 기재되어 있다.
B. 식물 형질전환 및 식물에서의 ICAM-1 면역접합체 발현
전술된 발현 카세트를 사용하여 식물 내에서 조립된 면역접합체를 생성하였다. 플라스미드 pSSPICAMHuA2, pSHuJ, pSHuSC 및 pBMSP-1을 담배 잎 조직(엔. 타바쿰 컬티바르 잔티(N. tabacum cultivar Xanthi)) 내로 동시에 입자충격으로 도입시키고, 형질전환된 미세유합조직(microcallus)을 가나마이신의 존재 하에 영양 아가 상에서 선별하였다. 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내는 개개의 미세유합조직을 모 조직으로부터 절개하여 가나마이신을 함유하는 영양 아가 상에서 증식시켰다.
유합조직을 형질전환유전자 발현에 대해 스크리닝하였다. 유합조직 #7132는 면역-블롯팅 및 PCR(데이타는 나타내지 않음)에 의해 키메라 ICAM-1 면역접합체 및 J 쇄를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 이 유합조직은 SC를 코딩하는 DNA를 보유하지 않았다. 상기 유합조직은 배양물 중에서 잘 성장하였고, 충분한 질량의 축적 시 전술된 플라스미드들 중 2개의 플라스미드, 즉 J 쇄 및 SC 둘다에 대한 발현 카세트를 함유하는 PBMSP-1 SpJSC, 및 히그로마이신 내성을 부여하는 hpt I 유전자에 대한 발현 카세트를 함유하는 pGPTV-HPT를 #7132 내로 입자충격으로 도입하였다. 영양 아가 상에서의 선별 및 성장 기간 후, 여러 조립 상태에서 키메라 ICAM-1 분자, J 쇄 및 SC를 발현하는 독립적인 여러 형질전환체를 면역-블롯팅으로 확인하였다.
도 3은 독립적으로 형질전환된 담배 유합조직에서의 키메라 ICAM-1 분자의 발현을 보여준다. 도 3A는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여주는데, 이때 상기 겔 상에서 상이한 형질전환 담배 유합조직(C) 및 수성 추출물(Aq)을 함유하는 샘플들이 런닝되었고 인간 ICAM의 존재에 대해 프로빙되었다. 면역접합체의 가용성은 본 발명자들에게 추출이 용이하게 수행될 수 있다는 것을 확인시 켜 주었고, 신호의 유사성은 본 발명자들로 하여금 발현의 재현가능성을 믿게 하였다. 도 3B는 유합조직 Rhi107-11로부터 부분적으로 정제된 면역접합체의 다양한 분획을 함유하는 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 면역-블롯을 보여준다. 블롯은 인간 ICAM (~ICAM), 인간 IgA 중쇄(~α), 인간 분비 성분(~SC) 및 인간 J 쇄(~J)에 대한 항체로 프로빙되었다. 필요에 따라 2차 효소-접합 항체를 사용하여 알칼리성 포스파타제로 면역-양성 밴드를 표지하였다. 면역-블롯팅의 특이성은 비-발현 유합조직의 추출물 중에서 면역-양성 밴드를 검출하지 못하였다는 사실(나타내지 않음)에 의해 더 입증되었다. 글리코실화되지 않은 이량체화 키메라 ICAM-1 분자의 예측된 MW는 173,318이고, 이 형태는 ICAM-1 및 중쇄에 대해 면역-양성을 나타내기 때문에 250 kD 마커의 바로 아래에서 이동하는 밴드 중에 존재하는 것 같다. 이 밴드는 SC(~248 kD의 총 예측된 MW)에 대해서도 면역-양성을 나타내지만, J 쇄에 대해서는 면역-양성을 나타내지 않는데, 이는 (포유동물에서) 2가지 세포를 수반하며 SC의 조립 전에 J 쇄의 존재를 요구하는, SIgA 조립에 대한 통상적인 경로가 존재한다는 다소 예상외의 결과를 나타낸다. 단일 분자의 J 쇄 및 단일 분자의 SC를 함유하는 사량체 면역접합체는 글리코실화 전에 ~440 kD의 예측된 MW를 가진다. 분자량이 200 kD을 훨씬 초과하며 모든 4개 프로브의 사용 시 면역-양성을 나타내는 여러 종이 용이하게 식별된다.
DNA로 피복된 미세발사체를 사용한 입자충격을 이용하여 식물 및 동물 둘다에서 안정한 형질전환체를 발생시킨다(문헌(Sanford et al., Meth. Enz. 217:483-509, 1993)에 검토되어 있음). 본 발명의 면역접합체를 코딩하는 벡터를 사용한 입 자-매개 형질전환은 바이오-라드(Bio-Rad)에 의해 제작된 PDS-1000/He 입자 가속화 장치를 이용하여 수행하였다. PDS-1000/He 입자 가속화 장치 시스템은 헬륨 압력을 이용하여 표적 세포를 향하는 DNA로 피복된 미세입자를 가속화시킨다. 이 기법의 물성은 상기 기법을 매우 다용도로 용이하게 사용될 수 있게 한다. 본 발명자들은 담배를 분비 IgA의 모든 4개 성분들로 동시에 성공적으로 형질전환시켰다.
기본적인 유전자주입 과정은 다음과 같이 수행되었다: 60 mg의 입자를 1 ㎖의 무수 에탄올 중에서 혼합하여 미세발사체의 원액 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 볼텍싱하고 25 내지 50 ㎕를 분취하여 멸균 미세원심분리 튜브에 첨가하였다. 30초 동안 미세원심분리한 후, 에탄올을 제거하고, 펠릿을 1 ㎖의 멸균수 중에 재현탁시키고 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 물을 제거하고 통상적으로 등몰량(그러나, 언제나 등몰량은 아님)으로 플라스미드 DNA 혼합물을 함유하는 25 내지 50 ㎕의 DNA 용액 중에 펠릿을 현탁시켰다. 첨가된 플라스미드의 양은 제제 당 0.5 ng 내지 1 ㎍의 범위 내에서 다양하였다. 하기 물질들을 순차적으로 첨가하였다: 220 ㎕의 멸균수, 250 ㎕의 2.5 M CaCl2 및 50 ㎕의 0.1 M 스퍼미딘. 이 혼합물을 10분 이상 동안 볼텍싱한 후, 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, DNA/미세발사체를 600 ㎕의 무수 에탄올 중에 침전시키고, 혼합하고 1분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고, 펠릿을 36 ㎕의 에탄올 중에 재현탁시켰다. 이어서, 캡톤(Kapton(DuPont))으로 만들어진 거대담체(macrocarrier) 시트의 중앙 위에 10 ㎕의 상기 현탁액을 가능한 균일하게 도포하고 에탄올을 증발시켰다. 상기 거대담 체 시트 및 파열 디스크를 장치 내에 배치하였다. 표면-멸균 담배 잎을 함유하는 페트리 디쉬를 정지 스크린 아래에 배치하였다. 챔버를 28 내지 29 mm Hg까지 비우고 표적물을 1회 입자충격을 이용하여 도입하였다. 이 프로토콜은 담배에 대해 최적화된 것이지만, He 압력, 피복된 입자의 양, 거대담체와 정지 스크린 사이의 거리, 및 정지 스크린으로부터 조직까지의 비행 거리와 같은 매개변수를 변화시킴으로써 다른 식물에 대해서도 최적화된다.
키메라 ICAM-1 분자에 대한 발현 카세트도 아그로박테리움-매개 형질전환에서 사용하기 위한 이원 벡터 내에서 조립될 수도 있다. 인간 J 쇄 및 인간 분비 성분 둘다뿐만 아니라 가나마이신 내성의 발현을 위해 디자인된 아그로박테리움 이원 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 내로 도입하였다. 또 다른 이원 벡터 내의 키메라 ICAM/IgA 분자도 LBA4404를 형질전환시키는 데 사용하였다. 두 균주의 밤샘 배양물은 표준 프로토콜(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985)에 따라 담배의 잎 조각과 함께 동시 "공-배양"하는 데 사용되었다.
입자충격을 받은 담배 옆편 및 아그로박테리움-형질전환 담배 옆편 둘다의 재생을 위한 표준 프로토콜을 이용하였다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 입자충격을 받은 조직으로부터 재생된 형질전환 식물이 성숙 시 종종 유전자-침묵 변이를 받기 때문에, 성숙 식물의 보다 높은 발현 수율을 제공하는 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 형질전환 담배 식물을 제조하였다.
실시예
3: 조립된
ICAM
-1 면역접합체의 정제
실시예 2에 따라 발현된 면역접합체를 정제하였다. 추출 과정의 진행을 용이 하게 위해 유합조직을 대량으로 성장시켰다. 면역접합체의 추가 정제를 위한 후속 크로마토그래피 기법의 연구를 위해 부분 정제 스케쥴을 통해 다양한 완충제 조건 하에 이용가능한 안정한 농축물을 얻었다(도 3 참조). 구연산나트륨(0.6 M, pH 7.4) 및 우레아(2 M의 최종 농도)를 함유하는 완충제 중에 침지된 동안에 2개의 스테인레스-강철 기아 사이에서 조직을 파쇄하는 과즙기에서 유합조직을 추출하였다. 치즈천(cheesecloth)을 통한 조질 여과 후, 쥬스(~1 mk/g 생중량(fresh weight))를 0.67 부피의 포화 황산암모늄으로 침전시켰다. 원심분리 후 녹색 펠릿을 모으고 작은 부피의 50 mM 구연산나트륨(pH 6.6) 중에서 다운스(Dounce) 균질화기로 철처히 추출하였다. 추가 원심분리 후, 투명한 갈색 상청액을 모으고, 탈염 모드로 완충제를 교환하는 동안에 상기 상청액을 세파덱스 G-100 컬럼에 통과시킴으로써 부분적으로 정제하였다. 탈염/완충제 교환 단계를 통해 원하는 완충제 중의 부분적으로 정제된 농축물(~0.2 ㎖/g 생중량 유합조직)을 제조하였고, G-100 컬럼을 0.25 X 인산염 완충 식염수로 용출하였다. 이 용출물은 2 내지 8℃에서 10일 이상 동안 안정한 것으로 보였다.
실시예
4:
ICAM
-1 면역접합체는 인간
리노바이러스
감염을 억제한다.
인간 리노바이러스에 의한 세포의 감염은 실시예 3에 따라 제조된 면역접합체에 의해 억제되는 것으로 입증되었다. 실시예 3에 따라 제조된 유합조직 추출물은 가용성 ICAM-1에 대한 항-ICAM 단일클론 항체의 결합에 대해 성공적으로 경쟁하였다. 도 4는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)으로부터 얻은 데이타를 보여준다. 상기 분석을 위해, 96-웰 플레이트를 0.25 ㎍의 가용성 ICAM-1/㎖으로 피복하였다. 사각형은 증가하는 농도의 sICAM을 나타내고, 원은 일정한 양의 마우스 (항-인간 ICAM) 항체에 대해 부착된 ICAM과 경쟁하는 데 사용된 증가하는 양의 유합조직 추출물(G-100으로부터의 멸균 여과 분획)을 나타낸다. 웰을 세척한 후, 부착된 마우스 항체를 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 항-마우스 항체로 검출하였다. 부착된 효소의 활성은 오르토-페닐렌 디아민을 기질로 사용하여 490 nm에서 측정하였다. 데이타(사각형, sICAM; 원, 추출물)는 S자형의 식 OD490=y=yO+a/[1+e-{(x-x0)/b}]으로 잘 표시되어 있는데, 이때 a는 y최대이고, y0은 y분이며, b는 곡선 중에서 급격히 변하는 부분의 기울기이고, x0은 50% 반응 수준에서의 x의 값이다. 가용성 ICAM-1에 비해, 여기서 시험된 면역접합체 추출물은 250 ㎍ ICAM/㎖의 등가물을 함유하는데, 이는 ICAM-1-중쇄 융합체의 이량체 및 사량체 조립의 예측된 결합친화성 효과로 인해 과대평가된 것이다. 따라서, 이 ELISA는 면역접합체가 항-ICAM mAb와의 결합에 대해 가용성 ICAM-1과 경쟁한다는 것을 입증한다.
50% 반응을 제공하는 데 필요한 표준화된 양의 다양한 분획을 비교함으로써 활성의 회복을 경쟁적 ELISA로 정량적으로 평가할 수 있다. 정제 시, 면역접합체 제제의 역가는 역 희석율로서 표현될 수 있거나, 50% 반응을 제공하기 위해 1 mg의 면역접합체가 희석되어야 하는 ㎖의 수로서 표현될 수 있다. 이 ELISA는 면역접합체의 정제 과정의 진행을 용이하게 할 것이다.
세포변성 효과 분석(CPE)은 인간 리노바이러스에 의한 인간 세포의 감염을 억제하는 부분적으로 정제된 면역접합체의 특이적 능력을 입증하였다(도 5). 리노바이러스 혈청형 HRV-39는 인간 ICAM-1 또는 ICAM/IgA 융합체(팀 스프링거 박사로 부터 얻음)과 함께 예비-항온처리되거나, 본 발명자들의 ICAM-1/SIgA 면역접합체 또는 또 다른 상이한 항체를 발현하는 유합조직으로부터의 추출물과 함께 예비-항온처리된 후, 혼합물 각각을 HeLa S3 세포와 함께 33℃에서 플레이팅하였다. 3일 후, 생존가능한 세포를 고정시키고 메탄올성 크르스탈 바이올렛(Crystal Violet) 용액으로 염색하였는데, 570 nm에서의 광학 밀도는 세포 생존가능성의 비례적 척도를 제공한다.
면역접합체를 함유하는, Rhi107-11로부터 유래된 2개의 추출물은 HeLa S3 세포를 감염시키고 사멸시키는 바이러스의 능력을 명백히 억제하였다(도 5A, 정삼각형 및 역삼각형). 추출물이 부분적으로만 정제되었기 때문에, 본 발명자들은 화학요법제인 독소루비신에 대해 유도된 인간 IgA2m(2)를 함유하는 유사하게 제조된 추출물도 분석하였다. 관련없는 결합 특이성을 가진 유사한 면역글로불린을 함유하는 상기 추출물은 리노바이러스의 감염을 억제할 수 없었고 ICAM-1-중쇄 융합체의 발현이 억제에 대한 특이성을 부여한다는 것을 입증한다. 예측된 바와 같이, CPE 분석은 바이러스 감염을 억제하는 가용성 ICAM-1 및 IC1-5/IgA(Martin, et al, 1993)의 상이한 능력을 입증하였다(도 5B). 도 5B에서 삽입도는 가용성 ICAM-1에 대한 IC50(1.35 ㎍/㎖) 및 IC1-5/IgA에 대한 IC50(0.12 ㎍/㎖; 11.3 배 미만)의 범위 내에서의 크기 확대도이다.
실시예
5: 임상적 및 독성학적 연구를 위한 면역접합체의 제조 및 정제
제안된 임상적 및 독성학적 필요에 충분한 면역접합체의 제조는 형질전환 담 배 식물을 제조함으로써 수행한다. (ER 보유 신호가 없는) 면역접합체를 발현하는 형질전환 식물은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 발생된다. ER 보유 신호의 부재는 조립을 상승시킬 것으로 예측되는데, 이는 SC가 펄스-추적 실험(Chintalacharuvu & Morrison, Immunotechnology 4:165-174, 1999)에 의해 제안된 바와 같이 dIgA에 공유결합되어 있는 특히, 트랜스-골기를 비롯한 전체 골기체를 통해 초기발생 SIGA가 가공처리되기 때문이다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일정한 수준의 형질전환 발현을 가진 식물을 발생시킬 가능성이 훨씬 더 높기 때문에, 이 식물의 자손은 임상적 등급의 면역접합체의 제조에 사용될 가능성이 있다.
발현 수준을 최대화하고 진정한-혈통을 발생시키기 위해, 동종접합 식물을 발생시키는 것이 바람직하다. 최대 생성 식물(세대 TO)은 종자가 모아지기 전에 온실에서 자가 수정할 수 있다. T1 식물의 1/4은 동종접합인 것으로 예측된다. 이들은 온실에서 성장하고, 여러 식물로부터의 종자 샘플은 가나마이신을 함유하는 배지 상에서 따로 발아한다. 동종접합 양성 식물로부터의 모든 자손(T2)은 녹색을 띨 것으로 예측된다. 이종접합 식물의 자손들 중 일부는 흰색 또는 누르스름한 색을 띨 것으로 예측된다. 동종접합은 야생형과의 역-교배 및 자손의 추출물의 면역-블롯팅에 의해 확인된다.
수거 및 가공처리는 제조 기간 동안 연속적으로 맞물릴 수 있는데, 이는 특히 다수의 수거물이 단일 식수(planting)로부터 수득될 수 있기 때문이다. 즉, 한 번 수거된 후 토양 수평면까지 절단된 나무는 후속 수거를 위해 다시 성장하기 때문이다. 면역접합체의 제조를 위한 크기 감도(scale sensitivity)를 발달시키기 위 해, 최종 면역접합체의 필요량을 결정하고, 발현 수준(존재하는 mg 면역접합체/kg 생중량 담배)을 밝히고, 식물의 성장률, 평균 식물의 예측된 중량 및 정제 스케쥴(20%로 설정됨)의 총 수율을 알 필요가 있다. 총 필요량을 3 g의 최종 면역접합체로 설정하려면 4개 수거물을 준비할 필요가 있는데, 각각의 수거물에서 최종 면역접합체의 예측된 수율은 1 g이다.
이 표적들 및 매개변수들이 주어진 경우, 필요한 식물의 수가 결정되고 그에 따라 식물 성장에 대한 공간 요건이 결정된다. 도 6은 1 g의 최종 면역접합체를 제조하기 위한 생산 필수요건의 평가를 보여준다. 이 도표에서, 예측된 발현 수준 및 식물 중량에서 20%의 수율로 면역접합체 1 g을 제조하는 데 필요한 식물의 수가 나타나 있다. 다양한 수준의 면역접합체 발현(mg/kg 생중량) 및 총 회수율(20%로 설정됨)에서, 각 식물의 중량 및 그에 따른 식물의 총 수는 근거 있는 가능성을 가진 영역(window)(점으로 표시된 사각형) 내에서 특정된 생성 표적(1 g/수거)에 대해 결정될 수 있다. 필요한 식물의 수는 특정된 성장 및 재성장 기간의 수에 역으로 감소한다. 시간과 성장 조건의 함수인 예측된 생체질량 생성은 수거 시간 및 수거 간격에 영향을 준다. 이 성장 기간은 식수일과 수거일을 서로 교차시킴으로써 정제 스케쥴의 현실성에 맞추어질 수 있다. 예를 들면, 적당한 발현 수준이 100 mg의 면역접합체/kg 생중량인 식물로부터의 최종 면역접합체 1 g은 식물 당 200 g의 중량 중량에서 수거될 때(발아 후 ~80일) 250개의 식물을 필요로 한다. 이 규모에서, 이 식물들은 약 10 m2의 성장 공간을 필요로 하고 150일에 걸쳐 2회 수거된다.
동시에 50+ kg의 생체질량을 가공처리하는 것은 식품-가공 산업에서 모두 대응-부품을 가진 여러 적절히 큰 규모의 작업을 필요로 한다. 이들에는 부피가 큰 물질의 취급, 크기 감소, 즙짜기 및 여과가 포함된다. 빈센트 프레스(Vincent Press) 및 듀코(Durco) 여과 시스템을 이용하여 이 양을 효율적으로 가공처리한다. 즙짜는 단계는 구연산나트륨 및 우레아로 이루어진 입증된 단순한 완충제를 사용한다. 이 성분들은 추출물을 완충시키고, 페놀계 물질의 산화 방지 및 상기 물질과 단백질의 결합 방지를 돕고(Gegenheimer, Methods in Enzymology 182:174-193, 1990; Loomis, Methods in Enzymology, 31:528-544, 1974; Van Sumere, et al., The Chemistry and Biochemistry of Plant Proteins, 1975.), 후속 산 침전 과정 동안 면역접합체의 가용성을 보장한다.
산-불용성 지질 및 단백질의 여과(총 ~90%) 후 접선류 한외여과(tangential flow ultrafiltration)를 행하여 면역접합체를 농축하고 작은 단백질, 특히 폐놀계 물질을 제거한다. 투석여과는 소분자의 제거를 상승시키고, 단기 저장 및 후속 크로마토그래피를 위한 준비에서 완충제를 교환시킨다. SP-세파로스(pH 5.0 이하에서 결합함) 또는 Q-세파로스(pH 5.5 이상에서 결합함)는 면역접합체를 여과하는 데 사용될 수 있는 이온-교환수지에 속한다. 이들은 용이하게 입수가능하며, 저울로 중량이 측정될 수 있으며, 강하며, 높은 용량을 가진다. 특히 , 이들은 여과 단계 전의 엄격도(stringency)를 감소시키는 팽창된-층 포맷(format)에 대해 이용가능하다. 음이온-교환 크로마토그래피보다 더 선택적일 수 있는 양이온-교환 크로마토그래피가 먼저 사용된다. 면역접합체는 2가 및 4가 ICAM-1 도메인의 존재가 강력한 항-바이러스 활성에 결정적으로 중요하기 때문에 단백질의 95% 이상이 ICAM-1/IgA, ICAM-1/dIgA 또는 ICAM-1/SIgA의 형태로 존재하는 시점까지 잠재적으로 존재하는 여러 단백질 종으로부터 정제된다. 그 후, 정제된 면역접합체는 니코틴과 같은 알칼로이드인 내독소의 허용가능한 수준 및 생체 유해물질의 존재량에 대해 시험된다. 또한, (ELISA 및 CPE 분석에 의해 정의된) 효능 수준, 단백질 농도, pH 및 외관이 모니터링된다. 그 후, 환자가 강력한 면역접합체를 완전히 수용하도록 하기 위해 임상적 양의 면역접합체의 안정성을 결정한다. 심지어 부분적으로 정제된 추출물도 냉장보관 시 10일 동안 안정한 것으로 밝혀졌다. -20℃, 2 내지 8℃ 및 37℃에서 3 내지 6개월의 기간에 걸쳐 저장된 경우, (인산염-완충 식염수 중의) 임상적으로 제형화된 면역접합체의 역가 및 효능도 시험한다.
실시예
6: 면역접합체는 식물-특이적
글리코실화를
가진다.
생성된 면역접합체를 분석하여 존재하는 글리코실화의 패턴을 결정한다. 문헌(Cabanes-Macheteau et al.,Glycobiology 9(4):365-372 (1999))은 식물에 전형적인 여러 글리코실 잔기가 식물에서 발현된 항체 컨스트럭트 상에 존재한다는 것을 입증하였다. 상기 문헌의 방법은 실시예 1, 2 및 3에 따라 제조된 면역접합체가 식물-특이적 글리코실화 패턴을 가진다는 것을 입증하는 데 사용된다. 본 발명자들은 이 다양성도 면역접합체에 대한 가변성의 원인일 것이라고 추정한다. 미정제 추출물이 시험관 내에서 항바이러스 활성을 가지는 것으로 밝혀졌기 때문에 (데이타는 나타내지 않음), 글리코실화는 그 자체로 효능에 영향을 주지 않는 것 같다. N-결합 글리코실화(도 2는 키메라 ICAM-1 분자에만 15개의 잠재적 부위가 존재한다는 것을 보여줌)는 면역-블롯에서 관찰된 밴드의 다양성에 기여할 가능성이 있다. 면역접합체 제제는 N-글리코시다제 A로 분해된 후, 블롯팅되며, 블롯팅은 밴드 패턴에서의 차이가 밴드를 보다 소수의 상이한 밴드로 나눈다는 것을 보여준다. 이 방식으로, 글리코형태(glycoform)는 환원 및 비-환원 폴리아크릴아미드 겔에 의해 먼저 특징규명된다. 또한, 분해된 분획 및 가상-분해된 분획은 CPE 분석 및 경쟁 ELISA에서 시험되고, 이 시험은 시험관 내에서 효능 및 역가에 대한 N-결합 글리코실화의 영향을 보여준다.
실시예
7:
ICAM
-1 면역접합체는 인간
리노바이러스를
불활성화시킨다.
실시예 1, 2 및 3에 따라 제조된 면역접합체는 바이러스에 결합하여 바이러스 도입을 차단하고 빈 바이러스 캡시드의 형성을 유도함으로써 HRV를 불활성화시키는 그의 능력에 대해 분석된다. 면역접합체와 HRV의 결합을 측정하기 위해, 면역접합체를 [3H]류신-표지 HRV-39와 함께 30분 동안 항온처리한 후, HeLa 세포에 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 세포 및 결합된 바이러스를 트립톤 X-100으로 탈착시키고 섬광계수기(scintillation counter)에서 [3H]를 측정한다.
면역접합체와의 항온처리에 의한 HRV-39의 불활성화는 sICAM-1에 의한 HRV 불활성화와 비교된다. HRV-39는 단량체 sICAM-1과의 항온처리에 의해 상당한 정도(감염성에서 <0.5 로그10 감소)까지 직접 불활성화되지 않지만, IC1-5D/IgA와의 항온처리는 감염성을 약 1.0 로그10 만큼 감소시킨다(Arruda, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 36:1186-1191, 1992; Crump, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1425-7, 1994). HRV-39를 불활성화시키는 면역접합체의 능력을 시험하기 위해, 106의 50% 조직 배양물 감염 투여량(TCID50)의 HRV-39는 상기 바이러스에 대한 각 분자의 IC50의 10배에 해당하는 농도의 sICAM-1 또는 면역접합체를 함유하는 배지 또는 통상의 배지 중에서 33℃의 락커 플랫폼 상에서 1시간 동안 항온처리된다. 이어서, 각각의 바이러스-면역접합체 또는 바이러스-배지 혼합물을 순차적으로 10배 희석하고, 96-웰 플레이트에서 HeLa 세포에 대해 역가를 측정하였다.
HRV와 숙주 세포의 부착에 대한 면역접합체의 영향은 면역접합체의 존재 또는 부재 하에서 0.3의 MOI에서 HeLa 세포를 HRV-39로 접종함으로써 시험한다. 4℃에서 1시간 동안 흡광도를 측정한 후, 세포를 세척하고, 배지를 면역접합체가 함유된 또는 함유되지 않은 배지로 교체하였다. (1회 복제를 허용하기 위해) 세포를 33℃에서 10시간 동안 항온처리하고, 세포를 동결/해동시켜 바이러스를 수거하였다. HeLa 세포에 대한 바이러스의 역가를 측정하였다.
ICAM-1GA(IC1-5D/IgA)는 빈 비-감염성 바이러스 입자의 형성을 초래하는 HRV의 입체구조적 변화를 유도함에 있어서 Sicam-1보다 더 효율적이다(Martin, et al., J. Virol. 67:3561-8, 1993). 바이러스 RNA의 방출을 초래하는 HRV의 입체구조적 변화를 유도하는, 실시예 1, 2 및 3에 따라 제조된 면역접합체의 능력을 조사하기 위해, 정제된 면역접합체를 [3H]류신-표지 HRV-39와 함께 30분 동안 항온처리한 후, 바이러스를 5 내지 30% 슈크로즈 구배 상에 올려놓았다. 40,000 rpm에서 90 분 동안 원심분리한 후, 분획을 모아, [3H]를 측정하고, 감염성에 대해 분획을 평가한다. (온전한 HRV는 슈크로즈 구배 시 149S에서 침강하지만, RNA가 없는 빈 캡시드는 75S에서 침강한다(Martin, et al., J. Virol. 67:3561-8, 1993)). 본 발명자들은 ICAM/SIgA 면역접합체가 그의 증가된 결합가로 인해 빈 비-감염성 입자를 유도함에 있어서 ICAM-1gA보다 더 효율적일 것이라고 예측한다.
주요 HRV 혈청 및 소수 HRV 혈청(수용체로서 ICAM-1을 사용하지 않음) 둘다의 패널에 대한 정제된 면역접합체의 억제 효과는 CPE 분석을 이용하여 조사한다. HRV 감염을 억제하는 ICAM-1의 능력은 바이러스 단리물에 따라 다르다. HeLa 세포를 사용한 HRV 주요 수용체 혈청형 분석의 패널에 대해 시험된 경우, sICAM-1의 EC50은 0.6 ㎍/㎖ 내지 >32 ㎍/㎖이라는 것이 밝혀졌다(Crump, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1425-7, 1994). 본 발명자들의 패널은 9가지 주요 혈청형(HRV-3, -13, -14, -16, -23, -39, -68, -73, 및 -80) 및 소수 수용체 혈청형 HRV-1A를 포함한다.
실시예
8: 인간에서 감염성을 감소시키는 ICAM-1 면역접합체의 능력을 입증하는 임상 연구: 투여량 상승 내성 연구
본 발명의 면역접합체는 실험적 리노바이러스 감기에서 감염, IL-8 반응 및 질병에 대한 상기 면역접합체의 비강내 투여의 효과를 알아보기 위해 2가지 무작위 제어 시험에서 시험된다. 이 2가지 연구는 리노바이러스 접종 전 또는 후에 피실험체가 섭취한 면역접합체를 평가한다. 여기서 사용된 임상 프로토콜은 리노바이러스 감염에 대한 효능에 대한 재조합 가용성 ICAM-1 분자의 평가에서 이전에 사용된 프로토콜을 기초로 한 것이다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999).
A. 피실험체
피실험체는 찰로테스빌(Charlottesville)에 소재하는 버지니아 대학의 대학 공동체로부터 동원되었다. 피실험체는 건강이 양호한 비-흡연자이며 연령이 18 내지 62세이어야 한다. 알레르기성 질환 또는 비알레르기성 비염, 해부학적으로 비정상적인 비강 또는 점막, 또는 과거에 2주 내에 호흡관 감염의 병력이 있는 피실험체는 제외되었다. 임신 또는 수유 여성 또는 의학적으로 승인된 출산 조절을 받지 않은 여성도 제외되었다. 실험적인 바이러스 챌린지 연구(I/II 기, 하기 참조)에서, 피실험체는 시험 개시로부터 90일 내에 측정된 바이러스에 대한 혈청 중화 항체 역가가 1:4 이하라는 점에 의해 입증되는 바와 같이 연구 바이러스에 대한 감수성을 가질 것이 요구된다.
B. 연구 투약
본 발명의 면역접합체는 2.6 mg/㎖을 함유하는 인산염-완충 식염수(PBS) 분무 용액으로서 제형화된다. 플라세보는 PBS로 구성되고 활성 제제와 외관상 동일하다. 상기 용액은 계량된 비강 분무 펌프가 장착된 투약 병을 이용하여 투여된다. 상기 펌프는 각각의 분무 시 183 ㎍의 면역접합체를 함유하는 70 ㎕의 용액을 전달한다. 투약은 총 1일 투여량이 4.4 mg인 경우 1일 6회씩 (3시간 간격으로) 콧구멍 당 2회의 분무로서 투여된다. 이는 트레마캄라(tremacamra) 연구 감염(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999)에서 가용성 ICAM-1에 대해 사용된 바와 동일한 투 여량으로서 mg 단백질/일 단위의 투여량이다. 1 몰의 면역접합체는 1 몰의 sICAM-1의 약 2배 질량을 가진다. 그러나, sICAM-1과 ICAM/IgA 융합체 사이에 시험관 내 활성이 상이한 경우, 면역접합체는 몰 기준으로 sICAM-1보다 훨씬 더 효과적이다. 따라서, 이 양은 필요한 양의 보존적 계산치이다. 투여량 상승 연구가 이 투여량에서 문제점을 나타내는 경우를 제외하고 이 투여량이 사용된다.
C. 연구 디자인
면역접합체의 안전성을 평가하기 위해 단일 상승 투여량 및 다중 상승 투여량 연구를 이용한다. 각각의 경우, 3명의 피실험체가 각각의 투여량 수준에서 평가되고, 이들 중 2명은 면역접합체를 투여받으며, 한 명은 플라세보를 투여받는다. 단일 상승 투여량 연구에서, 4가지 투여량 수준이 평가된다. 최저 개별 투여량은 챌린지 연구에서 사용될 것으로 예상된 투여량의 절반이며, 최대 개별 투여량은 예상된 챌린지 연구 투여량의 2배이다. 투여량 수준은 다음과 같다: 각 콧구멍에서 1회 분무(총 366 ㎍), 각 콧구멍에서 2회 분무(총 732 ㎍), 각 콧구멍에서 3회 분무(총 1098 ㎍), 각 콧구멍에서 4회 분무(총 1464 ㎍).
동일한 투여량 수준이 다중 상승 투여량 연구에서 사용된다. 피실험체는 5일 동안 (1일 당 6회) 3시간마다 투약을 제공받는다. 두 연구에서, 피실험체는 이전 투여량 수준에서 급성 독성이 없음이 명확할 때까지 각각의 후속 투여량 수준의 개시를 서로 엇갈리게 하는 각각의 투여량 수준에서 평가된다. 모든 피실험체는 첫 번째 투약 후 21 동안 단일 투약을 제공받은 다음, (면역접합체에 대한 혈청 항체의 측정을 위해) 6주째 되는 시점에서 사후 검사를 받는다.
12명의 피실험체로 구성된 별개의 군은 각각의 콧구멍을 통해 2회 분무의 단일 투약을 제공받고(총 732 ㎍ ), 비강 세척을 1, 2, 4, 8 및 16시간(각 시점에서 2명의 피실험체)에서 수행한다. 면역접합체의 생체 내 반감기를 산출하기 위해 파노라마 리서치(Panorama Research)에서 면역접합체에 대한 ELISA를 행하여 세척물을 분석한다. (총 28명의 피실험체에 대한) 투여량 상승 및 반감기 측정 연구에서 사용될 면역접합체의 총량은 약 270 mg일 것이다.
D. 안전성 평가
관용적인 부작용 기록 이외에, 면역접합체의 안전성을 3가지 방식으로 평가한다. 첫째, 첫 번째 투약 전 및 마지막 투약 후, 연구자들은 특히 자극 또는 염증의 징후를 찾기 위해 비강 점막의 가시적 조사를 수행한다. 임의의 가시적 변화가 인지된다. 둘째, 연구 1일째, 4일째 및 8일째 (및 다중 상승 투여량 연구에서 21일째) 날에 치료 전 및 마지막 투약 후 채취한 샘플에 대해 표준 혈액 안전성 평가를 행한다. 셋째, 혈청 샘플은 남겨 동결시키고, 면역접합체가 비강 점막을 통해 혈액 내로 들어갈 수 있는 지를 확인하는 데 사용한다. 이는 2가지 방식으로 달성된다. 첫째, 혈청 샘플 중의 면역접합체의 존재는 ELISA에 의해 측정된다. 이 방식에서, 마이크로타이터 플레이트에 흡착된 항-인간 IgA 항체는 항-ICAM 항체에 의해 검출되는, 혈청 중의 임의의 면역접합체를 포획한다. 상기 분석의 감수성은 공지된 농도의 면역접합체를 함유하는 정상 인간 혈청 샘플을 사용하여 측정한다. 별법으로, 항-ICAM 항체는 항-IgA에 의해 검출될, 혈청 중의 면역접합체를 포획하기 위해 플레이트에 흡착될 수 있다. 둘째, 면역접합체에 대한 면역반응의 존재는 마이크로타 이터 플레이트에 흡착된 면역접합체를 사용하는 ELISA 방법으로 분석한다. 혈청 중의 임의의 항-면역접합체 항체는 결합되고, 항-인간 IgG 또는 항-인간 IgM에 의해 검출된다. 처리 전 혈청 샘플과 처리 후 혈청 샘플을 비교하고, 역가에서의 임의의 변화를 면역접합체의 흡수의 증거로서 간주한다. 항-면역접합체 항체의 임의의 긍정적 증거가 존재하는 경우, 항-ICAM-1 활성과 항-IgA 활성을 식별하기 위한 추가 분석이 수행된다.
면역접합체에 대한 알레르기 반응의 발생에 대해 환자를 검색한다. (이전 연구에서, 코에 국소 도포된 가용성 ICAM 또는 구강 내에 국소 도포된 플랜티바디(plantibody)의 사용 시 불리한 반응은 발생하지 않았다.) 비강 알레르기의 증상을 나타내는 개체는 민감한 2-단계 ELISA(R & D Systems)를 이용한 비강 세척액 중의 항-면역접합체-특이적 IgE 항체에 대해 시험된다.
E. 통계학적 분석
이 연구들의 경우 샘플 크기는 리노바이러스 챌린지 모델을 사용한 이전 연구를 기초로 한 것이다. 보호 연구에 대해 계획된 샘플 크기는 α=0.05 및 1-β=0.80의 1-측 수준에서 임상적 감기 발병률이 플라세보 군에서 75%부터 활성 처리 군에서 25%까지 감소되는 것을 검출하는 데 적합해야 한다. 또한, 샘플 크기는 SD가 5.8 유니트라고 가정할 때 5 유니트의 총 증상 스코어의 변화를 검출하는 데 적합해야 한다.
실시예
9: 인간에서 감염성을 감소시키는 면역접합체의 능력을 입증하는 임상 연구:
챌린지
연구
챌린지 연구를 이용하여, 본 발명의 면역접합체를 사용한 처리가 바이러스 챌린지 후 임상적 감기로부터 보호하거나 감기 증상을 감소시킨다는 것을 입증한다.
A. 챌린지 바이러스
본 연구에서 사용된 챌린지 바이러스는 리노바이러스 39(HRV-39)이다. 리노바이러스 타입 39는 세포에의 부착을 위해 ICAM-1을 필요로 하는 리노바이러스의 주요 군이다. 챌린지 바이러스 풀(pool)은 컨센서스 지침에 따라 안전성에 대해 시험된다(Gwaltney, et al., Prog. Med. Virol. 39:256-263, 1992). 모든 피실험체를 약 200의 중간 조직 배양 감염 투여량(TCID50)으로 접종시킨다. 상기 바이러스는 피실험체가 반드시 드러누워 있는 동안 약 15분 간격으로 콧구멍 당 250 ㎕의 2회 접종으로 소적으로서 투여된다.
|
일 | ||||||||
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7-14 | 21 | |
접종 전 연구 계획표 | |||||||||
투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | ||||
접종 | 4시간 | ||||||||
증상 스코어 | m/e | m/e | m/e | m/e | m/e | m/e | e | ||
비강 세척 | m | m | m | m | m | m | |||
혈청 샘플 | X | X | |||||||
접종 전 연구 계획표 | |||||||||
투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | 6회 투약 | ||||
접종 | 0 시간 | ||||||||
증상 스코어 | m/e | m/e | m/e | m/e | m/e | m/e | e | ||
비강 세척 | m | M | m | m | m | m | |||
혈청 샘플 | X | X | |||||||
각주 1일째 내지 5일째 날에 두 연구에서, 0, 3, 6, 9, 12 및 15시간에 투약한다 m = 아침 e= 저녁 |
B. 연구 디자인
2가지 무작위 리노바이러스 챌린지 연구를 수행한다(상기 표 5 참조). 본 발명의 면역접합체로 구성된 동일한 제형을 접종 전 및 접종 후 연구에서 평가한다. 두 연구에서, 약물은 5일 동안 매일 6회 투약으로서 제공된다. 피실험체는 각 연구에 등록한 때 면역접합체 또는 상응하는 플라세보를 투여받도록 무작위로 배정된다. 연구는 맹검으로 수행되고, 모든 임상 시험 직원, 피실험체 및 파노라마 리서치의 고용인은 모든 데이타가 모아질 때까지 맹검 상태로 있었다.
접종 전 연구에서, 투약은 바이러스 챌린지 4시간 전에 (2가지 투여량) 시작된다. 바이러스 챌린지는 면역접합체 (또는 플라세보)의 두 번째 투약으로부터 1시간 후에 투여되고, 연구 약물의 남은 4회 투약이 첫날 동안 예정대로 제공된다. 본 연구에서, 18명의 피실험체가 활성 치료를 받고 18명의 피실험체가 플라세보를 받는다.
접종 후 연구에서, 투약은 바이러스 챌린지로부터 24시간 후에 시작된다. 이 시점이 선택된 이유는 상기 시점이 바이러스 챌린지로부터의 다른 보호 연구에 사용되고 있고 감기 증상이 명확히 존재하기 때문이다(Harris & Gwaltney, Clin. Infect. Dis. 23:1287-90, 1996). 본 연구에서의 바이러스 챌린지는 연구 1일째 날 아침에 연구 약물의 첫 번째 투약으로부터 약 24시간 전인 연구 0일째 날 아침에 투여된다. 본 연구에서, 36명의 피실험체가 활성 치료를 받고, 18명의 피실험체가 플라세보를 받는다.
피실험체는 연구 0일째 날(바이러스 챌린지 당일)부터 연구 6일째 날까지 개별 호텔 방 내에 격리된다. 이 기간 동안 매일 증상 스코어 및 바이러스 단리용 비강 세척을 약물의 첫 번째 투약 전 아침에 수행하고, 제2 증상 스코어를 매일 저녁에 수행한다. 연구 6일째 날, 피실험체를 격리로부터 자유롭게 하되, 14일째 날까지 매일 저녁에 증상 스코어를 계속 기록한다. 피실험체는 항-면역접합체 항체의 검출을 위한 최종 혈청 샘플이 모아진 때인 연구 21일째 날 연구 장소에 돌아온다. (총 54명의 피실험체에 대한) 2가지 바이러스 챌린지 연구에서 사용될 면역접합체의 총량은 약 1200 mg이다.
C. 바이러스 단리
바이러스 방출이 세포 배양물 중의 바이러스 단리에 의해 검출된다. 비강 세척 표본은 5 ㎖의 0.9% 식염수를 각각의 콧구멍 내로 주입함으로써 수집된다. 그 후, 이 세척물을 플라스틱 컵 내로 배출시키고 바이러스 배양을 위해 가공처리될 때까지 1 내지 2시간 동안 냉장 보관한다. 아가로스 지지체(Affi-Gel 10, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)에 흡착된 항-ICAM-1 항체로 처리함으로써 면역접합체를 상기 표본으로부터 제거한다. 가공처리된 각 표본의 일부를 -80℃에서 저장하고, 또 다른 일부를 ICAM-1의 생성을 위해 증식시킨 HeLa 세포주인 HeLa-1 세포가 함유된 2개의 튜브 내로 접종시킨다(Arruda, et al., J. Clin. Microb. 34:1277-1279, 1996). 리노바이러스는 전형적인 세포변성 효과의 발생에 의해 확인된다. 챌린지 후, 연구 기간 중 임의의 날에 양성 바이러스 배양물을 가진 피실험체는 감염된 것으로 간주된다. -80℃에서 저장된 표본 중의 바이러스 역가는 HeLa-1 세포의 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 10배 희석된 희석물을 배양함으로써 측정된다.
챌린지 바이러스에 대한 항체는 표준 방법(Gwaltney, et al., Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections, p. 579-614, American Public Health Association)을 이용하여 수행된 혈청 중화 역가에 의해 검출된다. 항체 시험용 혈청 표본은 바이러스 챌린지(급성) 직전 검색하는 동안에 모으고 그로부터 21일 후(회복기) 다시 모은다. 회복기 혈청 샘플이 급성 혈청 샘플과 비교될 때 챌린지 바이러스에 대한 항체 역가에서 4배 이상 증가되어 있는 피실험체는 감염된 것으로 간주된다.
D. 질병 심각도의 평가
질병 심각도는 이미 공지되어 있는 바와 같이 평가된다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999). 증상 스코어는 바이러스 챌린지 전에 기록되고 (기준치), 그 후 6일 동안 약 12시간 간격으로 매일 2회씩 기록된다. 연구 7일째 날부터 14일째 날까지, 각 피실험체는 저녁에 매일 1회씩 그의/그녀의 증상 스코어를 기록한다. 각각의 평가에서, 피실험체는 마지막 증상 평가 이후로 상기 시간 간격에서 하기 8가지 증상의 최대 심각도를 판단하도록 요청받는다: 재치기, 콧물, 코막힘, 인후통, 기침, 두통, 권태감 및 오한. 각각의 증상은 없음, 경미함, 중간 또는 심각함이라는 증상 심각도 보고에 상응하는 0 내지 3의 심각도 스코어를 배정받았다. 증상이 기준치에 존재하는 경우, 기준 증상 스코어는 보고된 증상 스코어로부터 빼어야 한다. 매일 2회 평가하여 보다 더 높은 것이 각각의 증상에 대한 1일 증상 스코어로서 간주된다. 8가지 개별적인 증상에 대한 1일 증상 스코어를 합산하여 총 1일 증상 스코어를 산출한다. 바이러스 챌린지 후 처음 5일(연구 1일째 날 내지 5일째 날) 동안 총 1일 증상 스코어를 합산하고 연구 5일째 날 저녁에 모든 피실험체에게 "당신은 감기를 앓는 것 같습니까?"라고 질문한다. 총 증상 스코어가 6 이상이고 콧물이 나오는 날이 3일 이상이거나 감기를 앓고 있다는 주관적인 느낌을 가진 피실험체는 임상적 감기를 앓는 것으로서 정의된다.
배출된 비강 분비물의 중량은 미리 중량이 측정된 비강 티슈의 다발을 모든 피실험체에게 제공함으로써 1일째 날 내지 7일째 날에 측정된다. 상기 티슈는 사용된 후, 밀폐된 플라스틱 백 내에 저장된다. 매일 아침 사용된 티슈를 원래의 다발로부터 얻은 임의의 미사용된 티슈와 함께 모아 중량을 측정한다.
E. IL-8 분석
최근 연구는 숙주 염증 반응, 특히 인터루킨 8(IL-8)이 리노바이러스 감염으로 인한 흔한 감기 증상의 발병기전에서 일정 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 비강 세척물 중의 IL-8의 농도는 이미 공지된 바와 같이 시판되는 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, Minn.)로 측정된다(Turner, et al., JAMA 281:1797-804, 1999).
F. 안전성 평가
동일한 평가가 실시예 8에 기재된 투여량 상승 연구에서와 같이 챌린지 연구에서 수행된다.
G. 통계학적 분석
통계학적 분석은 실시예 8에 기재된 투여량 상승 연구에 대해 전술한 바와 유사하게 수행된다.
상기 실시예 및 논의는 주로 ICAM-1 면역접합체에 대해 설명하지만 당업자라면 이를 용이하게 변경하여 다른 유형 또는 하위유형의 바이러스 및 박테리아 병원체에 대해 활성을 나타내는 다른 유형의 면역접합체의 사용을 달성하고 실시할 수 있을 것이다. 하기 실시예는 탄저 독소 수용체(ATR)를 수용체 단백질로서 사용하는 항-박테리아 면역접합체 실시양태를 설명한다.
실시예
10:
ATR
면역접합체 발현 카세트의 제작
인간 탄저 독소 수용체(ATR)의 세포외 도메인의 일부를 코딩하는 카세트를 PCR 클로닝으로 제조한다. 구체적으로, 아미노산 44-216(소위, 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인)을 코딩하는 523 bp의 단편은 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 ATR(Bradley et al., 2001) 또는 플라스미드 TEM8(St Croix et al., 2000)로부터 증폭한다:
5'-GACCTGTACTTCATTTTGGACAAATCAGG-3'(서열번호 91)
5'-GAGCTCAAAATTGAGTGGATGATGCCTTGCAGAG-3'(서열번호 92).
제2 프라이머(서열번호 92)는 ATR 세포외 도메인의 코딩 영역의 3' 말단에서 SacI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. PCR은 에러의 축적을 감소시키기 위해 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 수행한다. 5' 비번역 영역 및 식물 신호 펩티드를 포함하는 124 bp의 제2 단편은 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 8 ATG-TOPO#4(이는 인비트로겐 클로닝 벡터 pCR4-TOPO 내의 식물-최적화 5' 비번역 영역 및 신호 펩티드의 PCR 클론임)로부터 증폭한다:
5'-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3'(서열번호 93)
5'-GTCCAAAATGAAGTACAGGTCAGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3'(서열번호 94).
제1 프라이머(서열번호 93)는 상기 PCR 단편의 5' 말단에서 KpnI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. 2개의 PCR 단편은 20개의 뉴클레오티드로 구성된 상보적 서열(점선으로 밑줄침)을 가진다. 상기 2개의 PCR 단편을 함께 혼합하고, 626 bp의 단편을 서열번호 93 및 92를 이용하여 증폭시킨다. 생성된 PCR 단편은 벡터 PCRScript(Stratagene) 내로 클로닝하고 시퀀싱한 후, 벡터 pMSP-coICAM 내의 KpnI 부위와 SacI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pMSP-ATR-IgA2를 발생시킨다. 이는 ATR의 세포외 도메인과 인간 IgA2의 불변 영역의 유전적 융합체를 발생시킨다. 이 인간 IgA2 불변 영역은 담배 세포 내에서의 발현에 최적인 코돈을 사용하도록 합성된다. ATR-IgA2 융합체(면역접합체)의 전체 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 10에 나타나 있다. 생성된 컨스트럭트에서, 키메라 ATR-IgA2 분자의 발현은 기본구성적 프로모터 "SuperMAS"(Ni et al., 1995) 및 ags 3' 종결자 영역의 조절 하에 있다.
전체 발현 카세트(프로모터+ATR-IgA2+종결자)는 제한효소 AscI을 이용하여 pMSP-ATR-IgA2로부터 제거하고 이원 아그로박테리움 Ti 플라스미드 벡터 pGPTV-kan-ocs 내로 클로닝함으로써 플라스미드 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2를 발생시킨다. 벡터 pGPTV-kan-ocs는 하기 방식으로 변형된 pGPTV-kan(Becker et al., 1992)으로부터 유도된다. 전체 uid A 유전자를 포함하는, pGPTV-kan의 EcoRI 부위와 HindIII 부위 사이의 서열은 제거되고 npt II 유전자를 향하여 배향된 ocs 3' 종결자 영역(MacDonald et al., 1991) + AscI 및 SacI에 대한 제한 부위로 치환된다. 이 종결자를 T-DNA의 우측 경계에 인접하게 배치한 목적은 우측 경계 외부의 식물 DNA에서의 전사 방향으로 인해 형질전환유전자의 전사가 방해받지 않도록 하기 위한 것이다(Ingelbrecht et al., 1991).
플라스미드 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2의 T-DNA 경계 사이의 서열은 도 11에 나타나 있다. 좌측 경계 및 우측 경계 외부의 서열은 공지된 바와 같다(Becker et al., 1992). 뉴클레오티드 18-187은 우측 T-DNA 경계를 나타낸다. 뉴클레오티드 311-630은 ocs 3' 종결자 영역을 나타낸다. 뉴클레오티드 927-1976은 SuperMAS 프로모터를 나타낸다. 뉴클레오티드 1990-2017은 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris) psaDb 유전자로부터의 5' 비번역 영역을 나타낸다(Yamamoto et al., 1995). 개시 ATG 주변의 서열(뉴클레오티드 2012-2026)은 고도로 발현된 식물 유전자에서 발견되는 것과 일치하도록 디자인된다(Sawant et al., 1999). 뉴클레오티드 2018-2086은 비시아 파바 레구민의 신호 펩티드의 변형된 버젼을 코딩하는 서열을 포함한다(Baumlein et al., 1986). 뉴클레오티드 2087-2605는 ATR의 본 빌레브랜트 인자 타입 A 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다(Bradley et al., 2001). 뉴클레오티드 2606-3631은 인간 IgA2m(2) 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다(Chintalacharuvu et al., 1994). 뉴클레오티드 3794-4108은 아그로파인(agropine) 합성효소(ags) 종결자로부터 유래된다. 뉴클레오티드 4530-4800은 NOS 프로모터를 나타낸다(Depicker et al., 1982). 뉴클레오티드 4835-5626은 npt II 유전자(가나마이신에 대한 내성을 부여함)를 코딩한다. 뉴클레오티드 5648-5870은 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 7로부터의 폴리아데닐화 신호이다(Gielen et al., 1984). 뉴클레오티드 6454-6602는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다.
인간 J 쇄 및 분비 성분을 식물 내에서 발현시키기 위한 컨스트럭트도 개발되어 있다. 이 컨스트럭트 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC는 pGPTV-kan-ocs에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 pGPTV-hpt로부터 유도된 벡터 pGPTV-hpt-ocs를 기초로 한 것이다. 플라스미드 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC의 T-DNA 경계 사이의 서열은 도 12에 나타나 있다. 좌측 경계와 우측 경계 외부의 서열은 공지되어 있다(Becker et al., 1992). 뉴클레오티드 1-149는 좌측 T-DNA 경계를 나타낸다. 뉴클레오티드 733-955(상보체)는 아그로박테리움 투메파시엔스 유전자 7로부터의 폴리아데닐화 신호를 나타낸다(Gielen et al., 1984). 뉴클레오티드 980-2002(상보체)는 hpt 유전자(히그로마이신에 대한 내성을 부여함)를 나타낸다. 뉴클레오티드 2049-2318(상보체)은 NOS 프로모터를 나타낸다(Depicker et al., 1982). 뉴클레오티드 2898-3230은 그의 천연 신호 펩티드(뉴클레오티드 3236-5056)를 포함하는 인간 분비 성분 유전자의 발현을 유발하는 양배추꽃 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터를 나타내고, 뉴클레오티드 5060-5445는 완두 rbcS-E9 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호를 나타낸다(Mogen et al., 1992). 뉴클레오티드는 5457-5788은 그의 천연 신호 펩티드(뉴클레오티드 5797-6273)를 포함하는 인간 J 쇄 유전자의 발현을 유발하는 CaMV 35S 프로모터의 제2 카피를 나타내고, 뉴클레오티드 6281-6494는 유전자 7 종결자를 나타낸다. 뉴클레오티드 6501-6819(상보체)는 ocs 3' 종결자 영역을 나타낸다. 뉴클레오티드 6944-7113은 우측 T-DNA 경계를 나타낸다.
실시예
11: 식물 형질전환 및 식물에서의
ATR
면역접합체 발현
전술된 발현 카세트를 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 식물 내에서 조립된 면역접합체를 생성한다. 플라스미드 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC 및 pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 내로 따로 도입한다. 상기 두 균주의 밤샘 배양물은 표준 프로토콜에 따라 담배의 잎 조각을 사용한 동시적 "공-배양"을 위해 사용된다. 형질전환된 식물 조직은 가나마이신(100 ㎍/㎖) 및 히그로마이신(25 ㎍/㎖)을 함유하는 재생 배지 상에서 선별된다.
항생제의 존재 하에 재생하는 묘목은 형질전환유전자 발현에 대해 검색된다. 이는 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 식물 조직 추출물을 제조하고 정화된 추출물을 니트로셀룰로즈 종이 상에 적하시킴으로써 달성된다. 이 "도트" 블롯은 인간 IgA, J 쇄 또는 분비 성분에 특이적인 알칼리성-포스파타제-접합 항혈청으로 프로빙한다. 이 제1 스크린 상에서 양성으로 확인된 식물에 대해 웨스턴 블롯팅 및 PCR을 수반하는 추가 검색을 수행한다. ATR-IgA2 면역접합체는 MW가 59 kDa인 서브유니트를 가질 것으로 예측된다. 중쇄 불변 영역의 천연 이량체화로 인해, ~118 kDa의 이량체도 형성될 것으로 예측된다. 이 이량체는 J 쇄의 존재 하에 식물 세포 내에서 더 이량체화되어 ~252 kDa의 분자를 형성한다. 분비 성분의 추가 시, ~320 kDa의 분자 종이 관찰된다.
키메라 중쇄, J 쇄 및 분비 성분 컨스트럭트 내에 신호 펩티드가 존재한다는 것은 다량체성 면역접합체로의 조립에 중요하다. mRNA의 번역 시, 신호 펩티드 절단은 각각의 단백질을 식물 세포의 소포체(ER) 내로 축적시킬 것으로 예측된다. 다량체성 면역접합체로의 조립은 ER 및 골기체 내에서 일어나고, 그 후 조립된 분자는 세포로부터 분비될 것으로 예측된다.
실시예
12: 조립된
ATR
면역접합체의 정제
조립된 ATR 면역접합체의 정제는 본질적으로 상기 실시예 3의 ICAM-1 면역접합체에 대해 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.
실시예
13:
ATR
면역접합체는 포유동물 세포에 대한 독소 작용을 억제한다.
전술된 발현 카세트는 식물 추출물로부터 정제된 조립된 면역접합체를 생성하는 데 사용된다. 정제된 면역접합체는 간단한 생체분석에서 CHO-K1 세포를 사멸로부터 보호하는 데 사용된다. CHO-K1 세포의 세포 표면 상에는 PA가 결합하는 수용체가 있지만, 상기 세포는 독소에 민감하지 않다. 상기 세포는 디프테리아 독소의 촉매활성 A 쇄에 연결된 LF의 N-말단 255개 아미노산으로 구성된 융합 단백질인 LFN-DTA와 PA로 챌린지된 경우 사멸한다. 이 재조합 독소는 천연 LF 및 OF 단백질의 결합 및 도입에 필요한 동일한 LF-PA-수용체 상호작용을 활용한다. 상기 면역접합체의 보호 효과를 시험하기 위해, CHO-K1 세포를 일정한 (독성) 양의 PA 및 LFN-DTA의 존재 하에 증가하는 양의 ATR-IgA2와 혼합하고, 단백질 합성에 대한 후속 효과를 측정한다. ATR-IgA2는 가용성 ATR보다 낮은 몰 농도에서 독성 작용을 억제하는 독성 작용의 효과적인 억제제이다.
실시예
14:
ATR
면역접합체는 인간
대상체에서
독성 작용을 억제한다.
정제된 면역접합체는 약학적으로 허용가능한 완충제 중에서 제조되어 탄저균에 감염된 인간 대상체에게 투여된다. 투여 경로는 흡입 에어로졸 또는 주사 투여일 수 있다. 일반적으로는 사망할 감염 마지막 단계에 있는 대상체는 면역접합체에 의한 독소 작용으로부터 보호된다.
실시예
15: 대안적
ATR
면역접합체 발현 카세트의 제작
인간 ATR의 전체 세포외 도메인(아미노산 24-320)을 코딩하는 카세트를 PCR 클로닝으로 제조한다. 구체적으로, 878 bp의 단편을, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 ATR(Bradley et al., 2001) 또는 플라스미드 TEM8(St Croix et al., 2000)로부터 증폭한다:
5'-GGGGGACGCAGGGAGGATGGGGGTCCAG-3'(서열번호 95)
5'-GAGCTCCCGTCAGAACAGTGTGTGGTGGTG-3'(서열번호 96).
제2 프라이머(서열번호 96)는 ATR 세포외 도메인의 코딩 영역의 3' 말단에서 SacI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. PCR은 에러의 축적을 감소시키기 위해 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 수행한다. 5' 비번역 영역 및 식물 신호 펩티드를 포함하는 121 bp의 제2 단편은 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 플라스미드 델타 ATG-TOPO#4로부터 증폭한다:
5'-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3'(서열번호 93)
5'-ATCCTCCCTGCGTCCCCCAGCCAAACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3'(서열번호 97).
제1 프라이머는 상기 PCR 단편의 5' 말단에서 KpnI 부위(굵게 밑줄침)를 도입하도록 디자인된다. 2개의 PCR 단편은 20개의 뉴클레오티드로 구성된 상보적 서열(점선으로 밑줄침)을 가진다. 상기 2개의 PCR 단편을 함께 혼합하고, 981 bp의 단편을 서열번호 93 및 96을 이용하여 증폭시킨다. 생성된 PCR 단편은 부분적 ATR 세포외 도메인(실시예 1)과 동일한 방식으로 인간 IgA2와의 유전적 융합체를 형성하도록 식물 발현 카세트 내로 클로닝된다.
이 동일한 방법을 이용한 대안적 제작은 아미노산 41 내지 227을 증폭시킬 것이다.
실시예
16:
탄저
키메라
독소 수용체 단백질의 생성
CMG2
-
IgG
및 고 친화성 항-
PA
항체
IgG(CMG2-IgG)에 융합된 CMG2 및 고 친화성 항-PA 항체의 제작
요약하면, 코돈-최적화된 항-PA 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편, 및 인간 탄저 독소 수용체(CMG2)의 세포외 도메인의 일부를 코딩하는 단편을 합성하였다. CMG2 및 항-PA 중쇄 가변 영역 서열은 기본구성적 식물 프로모터(CaMV35S) 및 식물 3' 폴리아데닐화 신호 서열의 조절 하에 있는 아그로박테리움 이원 벡터 내의 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 도메인을 코딩하는 DNA 단편에 따로 결찰시켰다. 유사한 카파 쇄 벡터가 1H 경쇄 V 영역을 위해 제조되었다. 이 벡터의 제작은 상세히 후술되어 있다.
프로그램 "신호 IP"를 사용하여 CMG2의 신호 펩티드 절단 부위가 아미노산 33과 34 사이에 있다는 것을 예측하였다(참고문헌 45). 본 발명자들은 고도로 발현된 식물 유전자로부터 유래된 코돈-사용 표를 이용하여 짧은 5' 비번역 영역, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(참고문헌 46)의 2S2 알부민 저장 단백질의 신호 펩티드 및 CMG2의 아미노산 34-232를 포함하는 697 bp의 DNA 단편을 디자인하여 합성하였다(도 14). CMG2의 코딩된 부위는 가용성 단백질로서 스코비에(Scobie)와 그의 동료들에 의해 사용된 것에 상응하였다(참고문헌 31). 서열을 확인한 후, 이 단편을 인간 IgG1의 불변 영역을 이미 함유하는 벡터 pMSP-IgG 내의 KpnI과 SacI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pMSP-CMG2-IgG를 발생시켰다. 이는 CMG2의 세포외 도메인과 인간 IgG1의 불변 영역의 유전적 융합체를 발생시켰다. 또한, 이 인간 IgG1 불변 영역은 담배 내에서의 발현에 최적인 코돈을 사용하도록 합성하였다. 생성된 컨스트럭트에서, 키메라 CMG2-IgG1 분자의 발현은 고도로 발현된 기본구성적 프로모터 CaMV35S47 및 ags 3' 종결자 영역의 조절 하에 있었다. 성숙 단백질의 예측된 아미노산 서열은 도 14에 나타나 있다.
전체 발현 카세트(프로모터 + CMG2-IgG1 + 종결자)를 pMSP-CMG2-IgG로부터 이원 아그로박테리움 Ti 플라스미드 벡터 pGPTV-kan-ocs 내로 서브클로닝하여, 플라스미드 pGPTV-kan-ocs-CMG2-IgG를 발생시켰다. 이 벡터 pGPTV-kan-ocs는 pGPTV-kan으로부터 유도되고, 이 pGPTV-kan 자체는 보다 흔한 이원 벡터 pBIN19로부터 유도되었다(참고문헌 48). 발현 카세트는 번역 인핸서의 특징인 니코티아나 실베스트리스 psaDb 유전자로부터의 5' 비번역 영역을 사용한다(참고문헌 49). 개시 ATG 주변의 서열은 고도로 발현되는 식물 유전자 내에서 발견되는 것과 일치하도록 디자인되었다(참고문헌 50).
항-PA 항체의 발현을 위해, 식물-최적 코돈을 사용하며 1H의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 본 발명자들의 코돈-최적화 인간 IgG1 불변 영역 서열에 결찰시키기 위해 3' 말단에서 SacI 부위를 가지도록 합성하였다. 유사하게, 본 발명자들의 코돈-최적화 인간 카파 불변 영역에 결찰시키기 위해 3' 말단에서 HindIII를 가진, 항체 1H의 Vk 영역을 코딩하는 서열도 합성하였다. 이 서열들은 CMG2 유전자에서 사용된 것과 동일한 5' UTR 및 신호 펩티드를 포함하였다. 두 가변 영역을 상응하는 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 인 프레임(in frame)으로 CaMV35S 프로모터의 조절 하의 별도의 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
아그로박테리움 투메파시엔스-매개 일시적 발현 시스템을 사용한 담배 내에서의 단백질 생성
1H 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 카세트를 보유하는 2가지 아그로박테리움 균주를 니코티아나 벤싸미아나의 잎 내로 동시에 침투시키고, 7일 후 수거하여 항체의 정제를 위해 즉시 가공처리하였다(참고문헌 51). 유사하게, CMG2-IgG 발현 카세트를 보유하는 아그로박테리움 균주를 잎 내로 침투시켰다. 일시적으로 형질감염된 담배 식물로부터의 잎 추출물을 제조하여 단백질 A 크로마토그래피로 분획화하였다. 본 발명자들은 이 신속한 고 성능 재현가능한 방법을 이용하여 1H 및 CMG2-IgG로 이루어진 작은 샘플을 정제하였다. 하기 표 6은 전형적인 실험의 결과를 보여준다.
그램 | ㎍/gm | ㎍/gm 수율 | |||
단백질 | 잎 | (ELISA) | 회수된 ㎍ | (OD280) | nmoles |
1H IgG | 100 | 18 | 1740 | 17.4 | 11.6 |
CMG2-IgG | 74 | 데이타 없음 | 1140 | 15.4 | 9.8 |
정제된 단백질은 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분리하고 은 염색을 수행하였다(도 15). 1H IgG 제제는 50 kDa과 26 kDa에서 2개의 밴드로 환원되는 150 kDa의 단일 밴드를 함유하였다. 웨스턴 블롯팅은 이 2개의 밴드가 인간 감마 중쇄 및 카파 경쇄임을 확인시켜 주었다(나타내지 않음). 단백질 A로부터 용출된 CMG2-IgG 제제는 비-환원 조건 하에 45 kDa에서 주요 밴드를 가지며 환원 조건 하에 29 kDa에서 주요 밴드를 가진 불균질한 단백질 혼합물이었다. 아미노산 서열에 기초한 CMG2-IgG 단량체의 예상된 크기는 58 kDa이다. 환원 조건 하에, 온전한 CMG2-IgG 단량체를 나타낼 가능성이 있는 소량의 53 kDa 밴드가 있다. 보다 더 빨리 이동하는 밴드는 VWA/I 도메인 + Cγ1의 전부 또는 일부를 상실한 단백질분해 생성물이었다. 모든 밴드가 항-IgG1 항혈청과 반응하였다(데이타는 나타내지 않음).
CMG2-IgG 제제는 SDS-PAGE 상의 환원 조건 하에 다시 런닝시키고, 겔을 PVDF 상에 블롯팅하고, 코마시에로 염색하였다. 53, 34 및 29 kDa 단편을 함유하는 3개의 슬라이스를 에드만 분해(N-말단 아미노산 시퀀싱)를 위해 UC 데이비스에 소재한 분자 구조 연구소에 보냈다. 53 kDa 밴드로부터는 어떠한 서열도 회수할 수 없었다. 이는 CMG2의 아미노 말단에 대해 예상된 Gln과 일치하는 "차단된" 잔기의 존재를 시사하였다. 34 및 29 kDa 단편의 아미노 말단은 각각 아미노산 268 및 297에 있었다(도 14에서 1번 및 2번으로 번호 매겨진 굵은 글자체의 아미노산). 이 결과는 도 15에 도시된 모델과 일치한다.
실시예
17:
탄저
키메라
독소 수용체 단백질의 시험관 내 항-
탄저
독소 활성에 대한 시험
본 실시예는 키메라 독소 수용체 단백질 및 본원에 기재된 면역접합체의 항-탄저 독소 활성을 시험하기 위한 방법을 설명한다.
정제된 1H IgG 플랜티바디 및 CMG2-IgG1 항독소는 치사 독소를 사용한 마우스 마크로파지 분석에서 PA를 중화시키는 능력에 대해 시험되었다. 다양한 농도의 식물-제조 1H IgG 또는 CMG2-IgG1과 함께 PA + 치사 인자(100 ng/㎖ PA, 50 ng/㎖ LF)를 투여한 후 RAW 264.7 마우스 마크로파지-유사 세포의 생존을 확인하였다. 항독소 단백질을 마크로파지에 첨가하기 30분 전에 독소와 미리 항온처리하였다. 3시간 동안 독소에 노출시킨 후, 간접적인 생존율 분석을 수행하였다. 식물-제조 1H IgG의 적정은 상기 항체가 동물 세포에서 만들어진 동일한 항체와 매우 유사한 ~0.3 ㎍/㎖의 IC50을 가진다는 것을 확인시켜 주었다(나타내지 않음). 또한, CMG2-IgG 제제는 1 내지 10 ㎍/㎖의 농도 범위에서 마크로파지를 보호하였다. 이는 CMG2-IgG가 강력한 항-독소임을 시사하였다.
실시예
18:
탄저
독소 수용체 단백질 면역접합체
CMG2
-
IgG
변이체
본 실시예는 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체의 안정성 및 수율을 개선시키도록 가해진 대표적인 변형을 나타낸다.
변이체의
생성 및 발현
PCR을 이용하여 CMG2-IgG 컨스트럭트의 CMG2 코딩 영역과 IgG 코딩 영역 사이의 접합부에 있는 SacI 부위 주위에 변형을 도입하였다. 결정 구조에 의해 정의된(참고문헌 34) VWA/I 도메인의 일부가 아닌 14개의 아미노산이 변이체 1에서 제거되었다(도 14에서 V1). 제거된 아미노산 서열 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
TEILELQPSSVCVG(서열번호 102)
act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg(서열번호 103)
변이체 2a(도 14에서 V2a)의 경우, Cγ1 도메인이 제거되었는데, 이는 상기 분석이 이 영역 내에 프로테아제-감수성 부위가 존재한다는 것을 시사하기 때문이다. 변이체 2b에서, 14개의 아미노산 및 Cγ1 도메인이 제거되었다. 변이체 3에서, Cγ1은 남아있지만, 14개의 아미노산이 유연한 링커 (Gly3Ser)3로 치환되어 있다.
이 4가지 변이체들 전부 및 본래의 CMG2-IgG를 니코티아나 벤싸미아나 내에서 일시적으로 발현시키고 단백질 A 크로마토그래피로 잎 추출물로부터 정제하였다. 또한, 본래의 CMG-IgG를 인간 카파 쇄와 함께 발현시켰다. 동등한 양의 각 단백질을 비-환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분리하고, 겔을 코마시에 블루로 염색하였다(도 16). 모든 변이체들은 본래의 CMG2-IgG보다 유의하게 많은 최대 분자량 형태를 함유한다. 변이체 V1 및 V3은 본래의 CMG2-IgG와 동일한 분해 단편들(30 및 33 kDa)을 가지는 것으로 보이지만, 변이체 V2a는 약 30 kDa의 2가지 상이한 단편을 가진다. (도 16에서 4번 및 5번으로 확인되어 있으며 박스로 둘러싸인) 이 단편들의 아미노 말단 시퀀싱은 상기 단편들이 V2a의 힌지 영역 직전에서 시작된다는 것을 보여주었다(도 15).
CMG2의 VWA/I 도메인 + IgG의 Cγ2/Cγ3만을 포함하는 변이체 V2b는 다른 것들보다 더 안정하였다. 환원 조건 하에(레인 11, 도 16), 대부분의 단백질은 50 kDa 밴드로 나타나며 외관상 분해는 거의 없었다(아미노산 서열에 기초한 이 단백질의 예상 크기는 46.5 kDa임). 비-환원 조건 하에(도 16, 레인 5), ~40 kDa 및 ~97 kDa에서 주요 밴드가 존재한다. 이 밴드들 둘다가 50 kDa 단량체로 환원되는데, 이는 이들이 단량체 및 이황화-결합 이량체 형태에 상응한다는 것을 의미한다(데이타는 나타내지 않음). V2b 단백질의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 75 kDa에서 단일 피크를 보인다(도 17). SDS-PAGE와 SEC의 조합은 상기 단백질이 이황화-결합 이량체와 비-공유 연결 이량체의 혼합물임을 시사하는데, 상기 비-공유 연결 이량체는 아마도 Cγ3 도메인 사이의 상호작용에 의해 서로 연결되어 있을 것이다.
카파
경쇄의
존재 하에서의
CMG2
-
IgG
의 발현
카파 쇄의 존재 하에 발현되는 CMG2-IgG에게 무엇이 일어나는가도 흥미롭다. CMG2-IgG는 약 137 kDa에서 시작하되어 35 kDa의 단위로 올라가는 래더(ladder)를 형성한다(레인 6, 도 16). 이 래더는 환원되었을 때, 60, 40 및 28 kDa의 3개 밴드로 분리된다(레인 13). 28 kDa 밴드는 카파 쇄이고, 60 kDa 밴드는 전장 CMG2-IgG이다. 이 레인으로부터의 40 kDa 밴드(도 16에서 3번)에 대해 에드만 분해를 수행하였는데, 이 에드만 분해는 그의 아미노산 말단이 V196에 있다는 것을 보여주었다. 이는 카파 쇄가 Cγ1 내에서의 절단을 방해할 수 있으나 CMG2로부터 유래된 여분의 14개 아미노산으로 이루어진 서열 내에서의 절단을 방해할 수 없다는 것을 입증하였다.
항-독소 활성에 대한 시험
본래의 CMG2-IgG 및 CMG2-IgG V2b는 음성 대조군 항체와 함께 마크로파지 보호 분석에서 항-독소 활성에 대해 시험되었다(도 18). CMG2-IgG V2b는 본래의 CMG2-IgG보다 우수하였지만, 다른 변이체들은 중간 활성을 가졌다(데이타는 나타내지 않음). 탄저 독소 활성을 50%까지 중화시키는 데 필요한 CMG2-IgG V2b의 농도(IC50)는 35 ng/㎖이었다(2회 분석의 평균, 표 2). 이는 인간 게놈 사이언스에 의해 개발된 항-PA 항체(IC50 = 50 ng/㎖)(참고문헌 52), 엘루시스(Elusys)(IC50 = 80 ng/㎖)(참고문헌 27) 및 아바니르(Avanir)(IC50 = 30 내지 70 ng/㎖))(참고문헌 23)와 비교할 때 유리하다. 상기 IC50에서 PA에 대한 CMG2-IgG V2b의 몰비는 0.38인데, 이는 각각의 CMG2-IgG V2b 분자가 약 3개의 탄저 치사 독소 분자를 중화시킬 수 있다는 것을 의미한다.
구조 분석
3개의 결정 구조 - IgG Fc(단백질 데이타 베이스에서 1 E4K(참고문헌 53)), CMG2의 VWA/I 도메인(내부 이황화 결합을 가짐, 1SHU34) 및 PA에 연결된 CMG2(1T6B36)를 중첩시킴으로써, CMG-IgG V2b 구조가 무엇과 유사한 지와 CMG-IgG V2b가 PA에 어떻게 결합하는 지에 대한 예측 모델을 유도하였다(도 19). 크기 배제 크로마토그래피는 CMG2-IgG Var2b의 거의 전부가 이량체 형태로 존재한다는 것을 시사하지만, SDS-PAGE 분석은 이 이량체의 50% 이상이 비-공유결합되어 있다는 것을 시사한다. 이는 보다 긴 면역글로불린 Cγ1 도메인보다 더 구형인 CMG2 VWA/I 도메인의 형태에 기인할 수 있다(도 19). 입체 장애는 IgG Fc의 힌지 영역 내의 시스테인이 효율적으로 이황화 결합을 형성하기에 충분히 가깝게 근접하는 것을 방해할 수 있다.
CMG2
-
카파의
존재 하에서의
CMG2
-
IgG
의 발현
CMG2의 처음 199개 아미노산 및 인간 카파 쇄 불변 도메인(CMG2-카파)으로 구성된 컨스트럭트를 조립하였다. CMG2-카파를 변이체 1 또는 변이체 3(이들 둘다가 온전한 Cγ1 도메인을 함유함)과 함께 일시적으로 발현시키고, 생성된 단백질을 단백질 A 세파로스를 이용하여 정제하였다. 두 경우에서, 우세한 분자 종은 약 180 및 160 kDa에 있는 한 쌍의 밴드이었다(도 20). 환원 조건 하에, 57 kDa, 34 kDa 및 13 kDa에서 밴드가 존재하였다. 면역-블롯(나타내지 않음)은 57 kDa 밴드가 IgG 중쇄를 함유하지만, 보다 작은 밴드는 카파-쇄 특이적 항혈청과 반응한다는 것을 입증하였다. 가장 작은 밴드의 크기는 CMG2 VWA/I 도메인과 카파 불변 영역 사이의 14개 아미노산에서의 절단과 일치한다. 주요 비-환원 밴드는 항-IgG 및 항-카파 항혈청 둘다와 반응하였고, 2개의 "중쇄" 및 2개의 "경쇄"와 함께 조립된 사량체 분자를 나타낼 가능성이 있다. 이 분자들을 RAW 마크로파지 보호 분석에서 시험하였다. IC5O은 V1/k에 대해 4 ng/㎖이었고 V3/k에 대해 32 ng/㎖이었다(표 2). 이들의 보다 큰 크기 때문에, 신규 단백질 둘다의 경우 상기 IC50에서 항독소:PA의 몰비는 훨씬 더 낮았다: V1/k의 경우 0.25이고 V3/k의 경우 0.18이었다.
본래의 CMG2-IgG 제제 및 변이체 제제를 RAW 마크로파지 보호 분석(프로토콜은 D.1.5을 참조함)에서 80 ng/㎖의 PA 및 80 ng/㎖의 LF와 혼합하였다. 결과는 상이한 세 날짜에서 분석으로부터 얻었다. | ||||||
분석 07/20/05 | 분석 07/27/05 | 분석 07/28/05 | ||||
변이체 | IC50 | 몰비 | IC50 | 몰비 | IC50 | 몰비 |
본래의 CMG2-IgG | 242 | 2.16 | - | - | 224 | 2.00 |
V1 | - | - | - | - | 197 | 1.80 |
V2a | - | - | - | - | 67 | 0.72 |
V2b | 41 | 0.45 | - | - | 28 | 0.31 |
V3 | - | - | - | - | 100 | 0.91 |
V1/K | - | - | 44 | 0.25 | - | - |
V3/K | - | - | 32 | 0.18 | - | - |
Fc
γR을 통한
IgG
제거 및 N-
글리칸의
효과
현재 개발되어 있는 다양한 항독소에 의한 탄저 독소 및/또는 바실러스 안쓰라시스의 생체 내 중화 및 제거에 관여하는 기작은 잘 밝혀져 있지 않다. 항체 및 면역접합체의 경우, 독소:항독소 복합체의 생체 내 중화는 FcγR과의 상호작용에 의존할 수 있다. 많은 종류의 백혈구가 FcγR로서 공지된, IgG 상의 Fc 영역에 대한 세포 표면 수용체를 가진다. Fc-FcγR 상호작용을 통한 이 세포들과 항원-항체 복합체의 결합은 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 수용체-리간드 복합체의 내부이입을 비롯한 다수의 반응을 야기할 수 있다.
결정 구조는 FcγR이 중쇄 Fc 영역의 Cγ2의 보다 낮은 힌지 영역에 결합한다는 것을 보여준다(참고문헌 55). 유전적 및 생화학적 접근법은 이 상호작용을 조절하는 아미노산 잔기뿐만 아니라, IgG Fc 상의 N-결합 글리칸의 역할을 확인시켜 주었다. N-결합 글리칸은 당단백질의 일부 아스파라진 잔기에 공유 부착된 올리고사카라이드 구조이다. 결정 구조 분석은 인간 IgG의 Asn297에 있는 N-글리칸이 FcγR 결합을 촉진하는 Fc 영역의 특정한 입체구조를 안정화시킨다는 것을 시사한다(참고문헌 55 및 56)(도 21). 이 N-글리칸의 제거는 시험관 내에서 3가지 주요 FcγR 이소폼에 대한 IgG의 친화성을 급격히 감소시키지만, 생체 내 반감기에는 영향을 주지 않는다(참고문헌 57, 58 및 59).
글리코실화 또는 이의 결핍이 탄저 치사 독소 또는 바실러스 안쓰라시스 감염에 대한 CMG2-IgG의 생체 내 보호 효과에 어떤 영향을 미치는지는 아직 공지되어 있지 않다. 항독소-PA 복합체의 효율적인 제거/파괴가 FcγR에의 결합에 의해 영향을 받는 경우, 이는 항독소의 글리코실화된 상태에 의해 영향을 받을 수 있다. 아바니르 파마슈티칼스(Avanir Pharmaceuticals)의 과학자들은 그들의 항-PA 항체들 중 2가지 항체의 글리코실화된 형태와 아글리코실 형태의 생체 내 활성을 비교하였고, 보호 효능에 있어서 거의 차이가 없음을 발견하였다(참고문헌 23). 이로부터, 이들은 치사 독소 중화가 Fc 이펙터에 의해 매개되지 않는다는 결론을 내렸다. 그러나, 이는 단지 하나의 실험일뿐이고, 아글리코실 항체 중 하나에서 나타난 감소된 효능이 있었다. 이러한 이유로, CMG2-IgG 면역접합체의 아글리코실 형태(본 실시예들에서 시험된 형태) 및 글리코실화된 형태가 시험된다.
동물 당단백질의 N-글리칸과 식물 당단백질의 N-글리칸 사이에는 미묘한 차이점들이 있고, 이 차이점들 중 일부가 식물 당단백질의 잠재적인 면역원성/알레르기원성에 대한 관심을 불러 일으켰다(참고문헌 60 및 61). 본 실시예들에서 1H IgG 및 CMG2-IgG는 아글리코실 중쇄 불변 영역을 사용하여 제조하였다. 비록 식물-제조 면역접합체가 글리코실화되어 있다 하더라도, 면역원성은 식물-제조 면역접합체에 기초한 탄저 중화 요법에 있어서 주요 문제점이 아닐 것이라고 생각된다. 면역원성이 유의한 문제점인 것으로 판명된다면, 식물의 N-글리칸이 "인간화"되도록 식물을 유전적으로 변형시킬 수 있다(참고문헌 62 내지 67).
결론
인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 탄저 독소 수용체 CMG2(CMG2-IgG)의 세포외 도메인으로 구성된 식물-제조 면역접합체는 나노몰 농도에서 탄저 치사 독소의 치사 효과로부터 마우스 마크로파지를 보호할 수 있었다. 면역접합체의 특이적 활성은 가장 유용한 단일클론 항체에 필적할만한 것으로 보인다.
실시예
19: 추가
CMG2
-
IgG
키메라
변이체
본 실시예는 본원에 기재된 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체의 안정성 및 수율을 개선시키기 위해 가해질 수 있는 대표적인 변형을 보여준다.
변이체 2b는 수율이 더 증가되도록 변형된다. VWA/I 도메인과 Cγ2 도메인 사이에 유연한 (Gly3Ser)3 링커를 도입하면(도 19의 구조 참조) 생체 내에서 변이체가 보다 안정하고/하거나 보다 높은 활성을 나타내게 하는 보다 높은 비율의 이황화-결합 이량체를 함유하는 변이체가 발생된다. 또한, CMG2-카파 컨스트럭트에서 CMG2 VWA/I 도메인과 Cκ 사이의 14개 아미노산은 (Gly3Ser)3 링커로 치환된다. 이들 2가지 신규 단백질을 일시적으로 형질감염된 담배에서 제조하여 단백질 A-세파로스 크로마토그래피를 이용하여 정제하다. 상기 단백질들을 적절한 조립 및 안정성에 대해 시험하다. 결합 상수를 표면 플라스몬(plasmon) 공명으로 측정한다. 상기 단백질들의 활성을 RAW 마크로파지 보호 분석에서 기존 면역접합체의 활성과 비교한다. 글리코실화는 이 세포-기재 분석에서 활성에 영향을 줄 것으로 예측되지 않는다. 그러나, 글리코실화는 생체 내 활성에 영향을 줄 수 있으므로, 가장 강력한 면역접합체 항독소를 선별한 후 Cγ2 도메인 내의 글리코실화 부위를 재도입한다. 글리코실 및 아글리코실 버젼 둘다를 생체 내에서 시험하다.
담배에서
CMG2
-
IgG
의 발현을 위한 분자
컨스트럭트
변이체 4는 유연한 링커가 부가된 변이체 2b와 동일할 것이며, VWA/1 도메인 + 변이체 3으로부터의 (Gly3Ser)3 링커를 코딩하는 DNA 단편을 IgG 힌지 및 변이체 2b로부터의 불변 도메인 Cγ2-Cγ3(아미노산 298-531, 도 14)을 코딩하는 DNA 단편에 결찰시킴으로써 제작한다.
또한, 여분의 14개 아미노산을 유연한 (Gly3Ser)3 링커로 치환시킴으로써 CMG2-카파를 변형시킨다. 각각의 변이체는 기본구성적 식물 프로모터(CaMV35S, 또는 본 발명자들이 선택하는 또 다른 프로모터) 및 식물 3' 폴리아데닐화 신호 서열의 조절 하에 있는 발현 카세트 내에 위치된다. 상기 발현 카세트는 이원 벡터 pGPTV(참고문헌 48) 내로 클로닝되고, 생성된 플라스미드는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 내로 형질전환된다.
면역접합체 | 도메인 배열 | PA 결합 부위의 예측된 # |
V2b | CMG2-Cγ2-Cγ3 | 2 |
V4 | CMG2-(G3S)3-Cγ2-Cγ3 VWA/I-GGGSGGGSGGGS-EPKSCDKTHTCP-CH2-CH3 |
2 |
V3/CMG-카파 | CMG2-(G3S)3-Cγ1-Cγ2-Cγ3/ CMG2-(G3S)3-Cκ |
4 |
가장 강력한 항독소를 (마크로파지 보호 분석을 이용하여) 선별한 후, 시판되는 키트를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발을 수행함으로써 (도 14에서 위치 381에 있는) Gln에 대한 코돈을 Asn에 대한 코돈으로 전환시킨다.
담배 일시
발현 시스템
변이체 2b, 4, 5 또는 6의 발현을 위한 이원 벡터를 보유하는 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주들 또는 변이체 3 + 신규 CMG2-카파를 보유하는 2가지 아그로박테리움 균주를 바이러스 침묵 억제자(suppressor)를 코딩하는 이원 벡터(P19)를 보유하는 추가 균주와 함께 니코티아나 벤싸미아나(대략 100)의 잎 내로 침투시킨다. 침묵 억제자는 높은 수준의 발현을 달성하는 데 사용된다. 침투 후, 각각의 아그로박테리움은 이원 벡터로부터 (발현 카세트를 함유하는) 그의 T-DNA를 식물 세포 내로 전달하고, 이 식물 세포에서 상기 T-DNA가 삽입되어 전사된다. 그 후, 면역접합체는 잎 내에서 높은 수준으로 축적되고, 침투로부터 7일 후 잎이 수거되어, 면역접합체의 정제를 위해 가공처리된다. 시험관 내 및 세포 배양 분석뿐만 아니라 래트의 생체 내 독소 중화 연구에 충분한 소량의 (<5 mg) 이들 5가지 키메라 단백질 각각을 이 담배 일시 발현 시스템을 이용하여 단기간 내에 생성할 수 있다(참고문헌 51).
소규모 면역접합체 정제 및 생체물리학적 특징규명
담배 잎(니코티아나 타바쿰 또는 니코티아나 벤싸미아나)을 균질화하고 수성 완충제 중에서 추출하고, 원심분리하고 여과하여 고체를 제거한 후, 온전한 IgG-Fc 영역을 가진 단백질을 단백질 A-세파로스 크로마토그래피로 정제하고, PBS에 대해 투석하고 필터로 멸균한다. 정제된 단백질은 코마시에 염색 및 인간 IgG1(또는 카파 쇄)에 대한 항체를 사용한 면역-블롯팅으로 특징규명한다. 4가지 기준을 이용하여 이 단계에서 성공을 평가한다. 첫째, 단백질 A에 의해 정제된 키메라 단백질은 주로 한 크기의 종으로 구성된다. 둘째, 상기 키메라 단백질은 코딩된 단백질 서열(들)과 일치하는 겉보기 분자량을 가진다. 셋째, 상기 키메라 단백질은 항-IgG 항혈청과 반응한다. 넷째, 상기 키메라 단백질은 RAW 마크로파지 보호 분석에서 현재의 CMG-IgG V2b보다 더 높은 활성을 나타낸다. 본 발명자들은 BIAcore(Pharmacia Biosensor)에서 표면 플라즈몬 공명으로 보호 항원(List Biological Labs)에 대한 면역접합체의 결합 속도를 측정하여 Kd를 산출하는 데 이용한다.
독소
챌린지에
대한 마우스
마크로파지의
보호
독소와 함께 CMG2-IgG를 투여한 후, RAW 264.7 마우스 마크로파지-유사 세포(ATCC #TIB-71)의 생존을 본질적으로 공지된 바와 같이 측정한다(참고문헌 68). CMG2-IgG를 10 내지 1000 ng/㎖으로부터 적정하여, 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 독소(80 ng/㎖ PA, 80 ng/㎖ LF)와 함께 미리 항온처리한다. 3시간 동안 독소에 노출시킨 후, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리늄 브로마이드)를 사용하여 간접적인 생존율 분석을 수행한다. 세포를 2 mg/㎖ MTT가 함유된 배지와 함께 30분 동안 항온처리하고, 산성 이소프로판올(40 mM HCl, 90% 이소프로필 알코올 중의 0.5% SDS)로 가용화시키고, A595에서 흡광도를 측정한다. 샴-처리 세포와 비교할 때, 특정된 시약 투여량에서 독소 챌린지로부터 생존하는 세포의 비율은 MTT 분석으로 측정된 바와 같이 보고된다((평균 시험 웰 - 독소만을 함유한 8개의 웰의 평균) x 100%/독소를 함유하지 않은 8개의 웰의 평균). 투여량 반응 곡선으로부터, IC50 값(활성의 50%가 중화되는 항독소의 농도)이 추정된다. 그 IC50에서 독소에 대한 항독소의 효과적인 몰비 또는 비율은 각각의 키메라 단백질에 대해 측정된다.
유연한 (Gly3Ser)3 링커의 부가는 이량체의 이황화 결합 또는 시험관 내 중화 활성, 또는 이들 둘다를 측정가능하게 개선시킨다.
실시예
20:
탄저
감염의 동물 모델에서
CMG2
-
IgG
의 항독소 활성
본 실시예는 본 발명의 키메라 독소 수용체 단백질 및 면역접합체를 확인하기 위해 수행될 수 있는 동물 시험을 설명한다.
선별된 면역접합체의 Fc 상의 N-글리칸의 존재 또는 부재는 Fc 수용체와의 상호작용 및/또는 항독소의 혈청 반감기의 차이 때문에 독소 또는 바실러스 안쓰라시스 포자 챌린지에 대한 생체 내 효능에 영향을 줄 수 있다. CMG2-IgG의 아글리코실 및 글리코실화된 형태 둘다가 피셔(Fischer) 래트 독소 중화 분석에서 시험된다. 그 다음, 토끼에서 상기 두 형태의 생체 내 반감기를 시험한 후 토끼 포자 챌린지 분석에서의 효능을 시험한다. 래트 생체 내 독소 중화 분석은 일시적 담배 형질감염으로부터 용이하게 공급될 약 3 mg의 각각의 항독소를 필요로 한다. 토끼 약동학 및 포자 챌린지 연구는 안정하게 형질전환된 담배로부터 정제될 약 200 mg의 각각의 항독소를 필요로 한다.
피셔 래트 생체 내
탄저
독소 중화
생체 내 탄저 독소 중화 실험은 본질적으로 이빈스(Ivins, 참고문헌 69)에 의해 기재된 바와 같이 CMG2-IgG의 글리코실화된 형태 및 아글리코실 형태를 사용하여 수행한다. 체중이 200 내지 250 g이며 경정맥 카테터를 가진 수컷 피셔 344 래트(Charles River Laboratories)를 제조사의 지침에 따라 이소플루오란 EZ-마취 챔버(Euthanex Corp, PA) 내에서 마취시킨다. 0.2 ㎖ PBS/0.1% BSA(pH 7.4) 중의 일정 투여량의 항독소(치사 독소에 대한 1x 및 0.5x 몰 당량에 상응하는 0.25 및 0.12 nmol/래트)를 카테터를 통해 투여한다. 5분 후, 치사 독소(0.2 ㎖/200 g 래트에서 PA 20 ㎍ / LF 4 ㎍)를 투여한다. 음성 대조군은 관련없는 식물-제조 인간 IgG1(본 발명자들의 실험실)이다. 5 마리의 동물이 각각의 시험군에서 사용되고(5 마리 동물/군 x 2 투여량 x 2 항독소 = 20 마리 동물), 4 마리의 동물이 각각의 대조군에서 사용된다(4 마리 동물/군 x 2 투여량 대조군 IgG = 8 마리 동물). 동물은 호흡 및 심장박동의 중단에 의해 평가될 때 불편함 및 사망 대 생존의 시간에 대해 모니터링된다. 래트를 치사 독소에 노출시킨 후 또는 사망할 때까지 5시간 동안 마취 하에 유지시켜 불편함을 최소화한다. 5시간 동안 생존하는 래트는 보다 긴 시간 (최대 72 시간) 동안 모니터링된다. 혈청 샘플을 5 시간 간격으로 생존 래트로부터 채취하여 ELISA에 의한 항독소의 농도에 대해 분석한다. 유사한 연구에서, 아바니르 파마슈티칼스에 의해 제조된 항체가 독소에 대한 0.5 x 몰 당량에서 이 투여량의 치사 독소에 대해 모든 동물을 보호하였다(참고문헌 23). 본 발명자들은 본 발명자들의 식물-제조 면역접합체도 마찬가지로 작용할 것이라고 예측한다. 필요하다면, 치사 독소에 대한 훨씬 더 낮은 몰비에서 면역접합체를 사용하여 실험을 반복한다. 최소 유효 투여량은 상기 두 항독소 형태 각각에 대해 결정된다.
토끼에서의
약동학적 매개변수
정맥내(i.v.) 경로에 의해 주입된 CMG2-IgG의 약동학적 성질(PK)을 확립하기 위해, 네덜란드 줄무늬 토끼(Dutch banded rabbit)(군 당 3 마리, 1.5 내지 2.0 kg)에게 중앙 귀 동맥을 통해 토끼 당 10 mg의 CMG2-IgG를 정맥내 주사한다. 주사 1시간 전, 주사 후 1, 4 및 8시간, 및 주사 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 17, 19 및 21일에서 각 동물의 귀 동맥으로부터 혈액 샘플을 채취한다. 혈청을 응고 및 원심분리 후 수득하여 분석할 때까지 -80℃에서 동결 저장한다.
토끼 혈청 샘플 중의 CMG2-IgG의 농도는 기능적 ELISA에 의해 측정한다. 정제된 CMG2-IgG는 표준물로서 사용한다. 1 ㎍/㎖의 농도에서 보호 항원(List Biological Labs)을 마이크로타이터 플레이트(Costar Corp.)의 웰(100 ㎕/웰) 상에 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리한다. 결합되지 않은 항원을 세척하여 제거하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 PBS + 5% 탈지 분유로 블로킹한다. 그 후, 블로킹 용액을 흡입 제거한다. 샘플 및 표준물을 37℃에서 PA-피복 플레이트에 1 시간 동안 가한 후 3회 세척한다. 이 과정 후, 37℃에서 1 시간 동안 염소 항-인간 IgG 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 접합체를 첨가하고, 다시 3회 세척한다. 항체 복합체는 HRP 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 항온처리하여 검출한다. 색상 발현(color development)(405 nm에서의 흡광도)은 벤치마크 마이크로플레이트 판독기(Benchmark Microplate Reader)를 이용하여 측정한다. ELISA는 토끼 혈청 간섭 및 비특이적 결합을 ELISA로 시험한다.
설명을 위해 제공되는 PK 매개변수는 CMG2-IgG에 대한 개개의 혈청 농도-시간 데이타를 기초로 하여 표준 모델-독립적 방법(참고문헌 70)으로 결정한다. 정맥내 투여에 대한 투여-전 시점은 PK 산출에 대한 첫 번째 시점의 농도 값을 배정받는다. 최대 혈청 농도(C최대), C최대에 도달하는 데 소요된 시간, 곡선 하의 면적, 전체적 제거, 정적 상태에서의 분포 부피, 말기 반감기, 및 절대 생체이용률(F)을 각각의 토끼에 대해 분석한다.
바실러스
안쓰라시스
포자를 사용한 토끼의 에어로졸
챌린지
기니아 피그(참고문헌 29, 71 및 72), 마우스(참고문헌 9, 및 73 내지 75) 및 토끼(참고문헌 7)에서 탄저 감염에 대한 수동 보호를 연구하기 위한 동물 모델이 개발되어 있다. 마우스 모델의 한 장점은 상기 모델이 훨씬 더 적은 항독소를 필요로 한다는 점이다. 그러나, 항-PA 항체를 사용한 최선의 보호는 토끼에서 있었기 때문에(참고문헌 24 및 27), 본 발명자들은 본 발명자들의 CMG2-IgG를 시험하기 위해 상기 모델을 사용하기로 하였다.
글리코실 및 아글리코실 키메라 독소 수용체 단백질을 약 16월부터 노출 전 예방 연구에서 시험한다. 토끼가 본 연구에서 성공적으로 (최대 투여량의 항독소에서 100%) 보호된다면, 본 발명자들은 약 21월부터 노출 후 처리 연구를 수행한다. 네덜란드 줄무늬 토끼(1.5 내지 2 kg)는 4 마리의 수컷 및 4 마리의 암컷 동물을 포함하는 군으로 무작위로 배정받는다. 노출 전 예방을 위해, 토끼는 0일째 날에 단일 투여량의 CMG2-IgG를 정맥내로 투여받거나(중앙 귀 동맥을 통한 1, 2 또는 4 mg의 CMG2-IgG/토끼), 탄저 포자 챌린지 전 30 내지 45분에 대조군으로서 인산염-완충 식염수(PBS)를 정맥내로 투여받는다. 노출 후 효능을 평가하기 위해, 토끼는 0일째 날에 포자로 챌린지된 후, 챌린지 후 24, 36 또는 48시간에 토끼 당 4 mg의 CMG2-IgG를 단일 정맥내 주사로 투여받거나, 챌린지 후 48시간에 PBS를 정맥내 주사로 투여받는다. 토끼는 표준 프로토콜에 따라 주둥이(muzzle)만 노출되는 시스템을 통해 챌린지된다. 상기 챌린지에 대한 표적 에어로졸 노출은 암스(Ames) 종의 50% 치사 투여량(LD50)(암스 LD50 = 1.05 x 105 포자(참고문헌 76))의 200배이다. 실제 챌린지 투여량은 출발 농도로부터 결정되고, 누적 분시 호흡량(minute volume)은 노출 전체에 걸쳐 합산된다. 모든 동물은 챌린지 후 28일 동안 매일 2회씩 관찰된다. 혈액 및 혈청을 챌린지 전 및 챌린지 후 1, 2, 7, 10, 14, 21 및 28일째 날에 채취한다. 가능한 경우, 혈액 및 혈청 샘플을 죽어가거나 최근에 죽은("사망 시점에서") 동물로부터 채취하여 바실러스 안쓰라시스의 존재에 대해 분석한다. 28일째 날, 모든 생존자를 마취하고, 폐, 비장 및 흉강내 림프절을 수거하여 배양한다. 혈청 샘플은 멸균 여과하고 배양에 의해 감염되지 않은 것으로 간주된 후, 혈청 CMG2-IgG 수준(D.2.3에서와 같음) 및 토끼 항-PA 역가(후술되어 있음)를 측정하기 위한 ELISA 분석을 위해 플래니트 바이오테크놀로지(Planet Biotechnology)로 보낸다.
면역접합체에 대한 토끼 항-
PA
항체 반응의 측정
이전 연구는 항-PA 단일클론 항체에 의한 흡입 탄저로부터 보호된 토끼가 그 자신의 항-PA 항체의 보호 역가를 발생시킨다는 것을 밝혔다. 혈청 중의 CMG2-IgG를 정량하기 위해 이용된 것과 유사한 ELISA를 이용하여 탄저 포자로 챌린지된 토끼에서 PA에 대한 면역 반응을 측정한다. 이 분석에서, 마이크로타이터 플레이트를 1 ㎍/㎖의 농도에서 PA로 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리한다. 결합되지 않은 항원은 세척하여 제거하고 웰을 블로킹한다. 그 다음, 블로킹 용액을 흡입 제거한다. 혈청 샘플의 희석물을 37℃에서 1 시간 동안 플레이트 상에서 항온처리한다. 염소 항-토끼 IgG HRP 접합체(Santa Cruz Biotech)를 37℃에서 30분 동안 첨가하고, HRP 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 항온처리함으로써 색상을 발현시킨다. 색상 발현(405 nm에서의 흡광도)은 벤치마커 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정한다. 광학 밀도 신호가 1.0인 혈청 희석물을 반응의 척도(역가)로서 사용한다.
실시예
21:
보툴리늄
키메라
독소 수용체 단백질
키메라 보툴리늄 독소 수용체 단백질은 보툴리늄 독소 수용체를 중쇄 불변 영역에 융합시킴으로써 제작한다. 시냅토태그민 I(STI) 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질 및 SV2 보툴리늄 키메라 독소 수용체 단백질을 제작한다.
중쇄에
융합된
보툴리늄
독소 수용체
독소 결합에 충분한 아미노산 서열인 STI(fragSTI) 및 SV2(fragSV2)의 일부는 필요에 따라 축적, 가용성, 정제, 프로테아제 내성, 면역원성을 변화시키기 위한 또는 환자 내에서 반감기를 증가시키기 위한 후속 변형, 및 Gt1b 및 Gd1a와 같은 강글리오사이드와 유리하게 상호작용하는 능력과 같은 표적화를 위해 추가 단백질성 서열(들)을 가진 중쇄 불변 영역에 융합시킨다. 또한, ((Gly)xSer)n과 같은 폴리펩티드 링커를 포함시켜 이 서열들의 폴딩 요건과 기능성을 분리한다. 이 폴리펩티드들을 코딩하는 핵산 서열은 클로닝 및 형질전환 과정 중의 재조합을 피하고 발현의 작은 RNA-매개 억제를 피하기 위해 동의(synonomous) 코돈의 사용을 포함하도록 최적화한다.
중쇄 불변 영역에 융합된 보툴리늄 독소 수용체 부분은 fragSTI 또는 fragSV2의 동종- 및 이종-다량체일 수도 있다. 동종-다량체의 경우, 중쇄 불변 영역에 융합된 보툴리늄 독소 수용체 부분은 단일 폴리펩티드 쇄이고, 이 쇄에는 fragSTI 또는 fragSV2의 서열이 2회 이상 존재한다. 즉, 상기 단편의 서열이 단일 일차 아미노산 서열 내에서 연속적으로 존재한다. 다량체화된 결합 단편은 결합친화성 효과에 의한 겉보기 결합 친화성을 증가시킴으로써 효능을 증가시킬 것으로 기대된다. 이종-다량체의 경우, 중쇄 불변 영역에 융합된 보툴리늄 독소 수용체 부분은 단일 폴리펩티드 쇄이고, 이 쇄에는 fragSTI 및 fragSV2 둘다의 서열이 1회 이상 존재한다. 즉, 상기 단편의 서열이 단일 일차 아미노산 서열 내에서 연속적으로 존재한다. 선형 어레이에서 반복된 단편 서열의 위치는 결합친화성을 증가시킴으로써 효능을 증가시키도록 변경된다.
키메라
보툴리늄
독소 수용체 단백질
전술된 보툴리늄 독소 수용체 부분들 각각을 IgG 또는 IgA의 Fc 영역 특히, 중쇄 불변 영역 1, 2 및 3의 아미노 또는 카복시 말단(αl, α2, α3 및 γl, γ2 및 γ3) 또는 중쇄 불변 영역 2 및 3(α2 및 α3 또는 γ2 및 γ3)에 융합시킨다. 중쇄 불변 영역의 키메라도 제작할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 불변 영역 γl, γ2, α2 및 α3의 키메라를 사용하여 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 용이하게 수행할 수 있다.
경쇄
불변 영역을 가진 개선된
키메라
보툴리늄
독소 수용체 단백질
전술된 보툴리늄 독소 수용체 부분들 각각을 전술한 바와 같이 IgG 또는 IgA의 Fc 영역에 융합시키고, 별도의 폴리펩티드 쇄에서 아미노 또는 카르복시 말단에서 경쇄(κ 또는 λ)의 불변 영역에도 융합시킨다. 항체 불변 영역은 합성 및 세포 내에서의 사량체로의 성숙 과정 중에 조립되며, 이때 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역은 다양한 불변 영역들 사이의 공유 및 비-공유 단백질-단백질 상호작용에 의해 통상적인 방식으로 조립된다.
경쇄
불변 영역 및 항체 가변 도메인을 가진 개선된
키메라
보툴리늄
독소 수용체 단백질
유인물 성능을 개선시키는 결합 특이성을 가진 항체 가변 도메인은 보툴리늄 독소 수용체 부분과 경쇄 불변 영역을 가진 복합체 내로 도입된다. 하기 종류의 가변 도메인 특이성을 이용하여 유인물 성능을 개선시킬 수 있다: 보툴리늄 독소가 농축되어 있는 것으로 공지되어 있는 시냅스 막으로 유인물을 유도하는 항-강글리오사이드 결합 특이성; 결합된 독소의 신속한 파괴를 보장하기 위해 시냅스 막으로부터 나온 유인물을 다른 혈청 또는 세포 내 성분, 예컨대, Fc-매개 제거에 참여하는 것들로 유도하는 결합 특이성; 및 증가된 결합뿐만 아니라 독소 가교-결합을 촉진하도록 선택될 수 있는 다른 독소 아미노산 서열을 인식하는 가변 영역을 가짐으로써 독소 결합을 증가시키거나 독소 인식을 넓히는 항-독소 특이성.
보다 높은
차수의
다량체
보다 높은 차수의 다량체 sIgA-유사 융합체는 전술된 폴리펩티드를 J 쇄 및 분비 성분(SC) 또는 보호 단백질(PP)의 추가 조립을 유도하도록 중쇄 불변 영역 α2 및 α3에 융합시킴으로써 형성한다.
또한, 보다 높은 차수의 다량체는 전술된 폴리펩티드를 J 쇄 및 여러 (5가지) 항체-유사 융합체가 IgM-유사 유인물 수용체로 조립되도록 IgM의 중쇄 불변 영역에 융합시킴으로써 형성한다.
추가 참고문헌
하기 참고문헌은 그들이 교시하는 전부에 대해 참고로 본원에 도입된다.
상기 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니고 단지 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태를 대표하는 것이다. 인용된 모든 문헌은 본 발명이 속하는 분야의 기술 수준을 나타낸다. 이들 중 어떠한 문헌도 선행 기술인 것으로 인정하는 것은 아니지만, 각 문헌의 개시내용은 그들 각각이 개별적으로 본원에 참고로 완전히 도입되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
당업자는 본 발명의 목적을 달성하고 전술된 목적 및 이점뿐만 아니라, 그 내에 내재하는 것들을 얻기 위해 본 발명을 충분히 변형할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 전술된 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태들을 나타내며, 예시적인 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 특정한 변형 및 다른 용도가 당업자에게 인식될 것이고, 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 기술적 사상 내에 포함된다.
다양한 치환 및 변형이 본 발명의 범위 및 기술적 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 가해질 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 따라서, 이러한 추가 실시양태는 본 발명의 범위 및 하기 청구의 범위 내에 있다.
본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적절하게 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한 없이 설명을 위한 용어로서 사용되며, 표시되고 기재된 특징들의 임의의 균등물 또는 이의 일부를 배제하는 용어 및 표현들은 의도적으로 사용한 것이 아니다. 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되어 있다 하더라도, 본원에 개시된 임의적 특징, 변형 및 개념의 변경은 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 상기 설명 및 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
추가로, 본 발명의 특징 및 측면이 마쿠시 군 또는 다른 대안적인 분류의 관점에서 기재되어 있는 경우, 당업자는 본 발명이 마쿠시 군 또는 다른 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원으로 이루어진 하위군의 관점에서 필요에 따라 개별 구성원이 배제된 상태로 기재되어 있다는 것을 인식할 것이다.
다른 실시양태는 하기 청구의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> PLANET BIOTECHNOLOGY, Inc.
YU, Lloyd M.
WYCOFF, Keith L.
LARRICK, James W.
<120> IMPROVED CHIMERIC TOXIN PROTEINS AND CHIMERIC TOXIN
RECEPTOR PROTEINS FOR TREATMENT AND PREVENTION OF ANTHRAX
<130> 415142000452
<140> PCT/US2006/030325
<141> 2006-08-02
<150> US 60/704,829
<151> 2005-08-02
<160> 114
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1596
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60
ttcccaggac ctggcaatgc ccagacatct gtgtccccct caaaagtcat cctgccccgg 120
ggaggctccg tgctggtgac atgcagcacc tcctgtgacc agcccaagtt gttgggcata 180
gagaccccgt tgcctaaaaa ggagttgctc ctgcctggga acaaccggaa ggtgtatgaa 240
ctgagcaatg tgcaagaaga tagccaacca atgtgctatt caaactgccc tgatgggcag 300
tcaacagcta aaaccttcct caccgtgtac tggactccag aacgggtgga actggcaccc 360
ctcccctctt ggcagccagt gggcaagaac cttaccctac gctgccaggt ggagggtggg 420
gcaccccggg ccaacctcac cgtggtgctg ctccgtgggg agaaggagct gaaacgggag 480
ccagctgtgg gggagcccgc tgaggtcacg accacggtgc tggtgaggag agatcaccat 540
ggagccaatt tctcgtgccg cactgaactg gacctgcggc cccaagggct ggagctgttt 600
gagaacacct cggcccccta ccagctccag acctttgtcc tgccagcgac tcccccacaa 660
cttgtcagcc cccgggtcct agaggtggac acgcagggga ccgtggtctg ttccctggac 720
gggctgttcc cagtctcgga ggcccaggtc cacctggcac tgggggacca gaggttgaac 780
cccacagtca cctatggcaa cgactccttc tcggccaagg cctcagtcag tgtgaccgca 840
gaggacgagg gcacccagcg gctgacgtgt gcagtaatac tggggaacca gagccaggag 900
acactgcaga cagtgaccat ctacagcttt ccggcgccca acgtgattct gacgaagcca 960
gaggtctcag aagggaccga ggtgacagtg aagtgtgagg cccaccctag agccaaggtg 1020
acgctgaatg gggttccagc ccagccactg ggcccgaggg cccagctcct gctgaaggcc 1080
accccagagg acaacgggcg cagcttctcc tgctctgcaa ccctggaggt ggccggccag 1140
cttatacaca agaaccagac ccgggagctt cgtgtcctgt atggcccccg actggacgag 1200
agggattgtc cgggaaactg gacgtggcca gaaaattccc agcagactcc aatgtgccag 1260
gcttggggga acccattgcc cgagctcaag tgtctaaagg atggcacttt cccactgccc 1320
atcggggaat cagtgactgt cactcgagat cttgagggca cctacctctg tcgggccagg 1380
agcactcaag gggaggtcac ccgcaaggtg accgtgaatg tgctctcccc ccggtatgag 1440
attgtcatca tcactgtggt agcagccgca gtcataatgg gcactgcagg cctcagcacg 1500
tacctctata accgccagcg gaagatcaag aaatacagac tacaacaggc ccaaaaaggg 1560
acccccatga aaccgaacac acaagccacg cctccc 1596
<210> 2
<211> 532
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ala Leu Pro Ala Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Phe Pro Gly Pro Gly Asn Ala Gln Thr Ser Val Ser
20 25 30
Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Cys
35 40 45
Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile Glu Thr Pro Leu
50 55 60
Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys Val Tyr Glu
65 70 75 80
Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser Asn Cys
85 90 95
Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp Thr
100 105 110
Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly
115 120 125
Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala
130 135 140
Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu
145 150 155 160
Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg
165 170 175
Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu
180 185 190
Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln
195 200 205
Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro
210 215 220
Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp
225 230 235 240
Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp
245 250 255
Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Ser Ala
260 265 270
Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu
275 280 285
Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr
290 295 300
Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val Ile Leu Thr Lys Pro
305 310 315 320
Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro
325 330 335
Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala Gln Pro Leu Gly Pro
340 345 350
Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu Asp Asn Gly Arg Ser
355 360 365
Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile His Lys
370 375 380
Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu Asn Ser Gln Gln Thr
405 410 415
Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro Glu Leu Lys Cys Leu
420 425 430
Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu Ser Val Thr Val Thr
435 440 445
Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Arg Ser Thr Gln Gly
450 455 460
Glu Val Thr Arg Lys Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu
465 470 475 480
Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met Gly Thr Ala
485 490 495
Gly Leu Ser Thr Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr
500 505 510
Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln
515 520 525
Ala Thr Pro Pro
530
<210> 3
<211> 3003
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gctataagga tcacgcgccc cagtcgacgc tgagctcctc tgctactcag agttgcaacc 60
tcagcctcgc tatggctccc agcagccccc ggcccgcgct gcccgcactc ctggtcctgc 120
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tcctgccccg gggaggctcc gtgctggtga catgcagcac ctcctgtgac cagcccaagt 240
tgttgggcat agagaccccg ttgcctaaaa aggagttgct cctgcctggg aacaaccgga 300
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ctgatgggca gtcaacagct aaaaccttcc tcaccgtgta ctggactcca gaacgggtgg 420
aactggcacc cctcccctct tggcagccag tgggcaagaa ccttacccta cgctgccagg 480
tggagggtgg ggcaccccgg gccaacctca ccgtggtgct gctccgtggg gagaaggagc 540
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gagatcacca tggagccaat ttctcgtgcc gcactgaact ggacctgcgg ccccaagggc 660
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agaggttgaa ccccacagtc acctatggca acgactcctt ctcggccaag gcctcagtca 900
gtgtgaccgc agaggacgag ggcacccagc ggctgacgtg tgcagtaata ctggggaacc 960
agagccagga gacactgcag acagtgacca tctacagctt tccggcgccc aacgtgattc 1020
tgacgaagcc agaggtctca gaagggaccg aggtgacagt gaagtgtgag gcccacccta 1080
gagccaaggt gacgctgaat ggggttccag cccagccact gggcccgagg gcccagctcc 1140
tgctgaaggc caccccagag gacaacgggc gcagcttctc ctgctctgca accctggagg 1200
tggccggcca gcttatacac aagaaccaga cccgggagct tcgtgtcctg tatggccccc 1260
gactggacga gagggattgt ccgggaaact ggacgtggcc agaaaattcc cagcagactc 1320
caatgtgcca ggcttggggg aacccattgc ccgagctcaa gtgtctaaag gatggcactt 1380
tcccactgcc catcggggaa tcagtgactg tcactcgaga tcttgagggc acctacctct 1440
gtcgggccag gagcactcaa ggggaggtca cccgcaaggt gaccgtgaat gtgctctccc 1500
cccggtatga gattgtcatc atcactgtgg tagcagccgc agtcataatg ggcactgcag 1560
gcctcagcac gtacctctat aaccgccagc ggaagatcaa gaaatacaga ctacaacagg 1620
cccaaaaagg gacccccatg aaaccgaaca cacaagccac gcctccctga acctatcccg 1680
ggacagggcc tcttcctcgg ccttcccata ttggtggcag tggtgccaca ctgaacagag 1740
tggaagacat atgccatgca gctacaccta ccggccctgg gacgccggag gacagggcat 1800
tgtcctcagt cagatacaac agcatttggg gccatggtac ctgcacacct aaaacactag 1860
gccacgcatc tgatctgtag tcacatgact aagccaagag gaaggagcaa gactcaagac 1920
atgattgatg gatgttaaag tctagcctga tgagagggga agtggtgggg gagacatagc 1980
cccaccatga ggacatacaa ctgggaaata ctgaaacttg ctgcctattg ggtatgctga 2040
ggccccacag acttacagaa gaagtggccc tccatagaca tgtgtagcat caaaacacaa 2100
aggcccacac ttcctgacgg atgccagctt gggcactgct gtctactgac cccaaccctt 2160
gatgatatgt atttattcat ttgttatttt accagctatt tattgagtgt cttttatgta 2220
ggctaaatga acataggtct ctggcctcac ggagctccca gtccatgtca cattcaaggt 2280
caccaggtac agttgtacag gttgtacact gcaggagagt gcctggcaaa aagatcaaat 2340
ggggctggga cttctcattg gccaacctgc ctttccccag aaggagtgat ttttctatcg 2400
gcacaaaagc actatatgga ctggtaatgg ttcacaggtt cagagattac ccagtgaggc 2460
cttattcctc ccttcccccc aaaactgaca cctttgttag ccacctcccc acccacatac 2520
atttctgcca gtgttcacaa tgacactcag cggtcatgtc tggacatgag tgcccaggga 2580
atatgcccaa gctatgcctt gtcctcttgt cctgtttgca tttcactggg agcttgcact 2640
attgcagctc cagtttcctg cagtgatcag ggtcctgcaa gcagtgggga agggggccaa 2700
ggtattggag gactccctcc cagctttgga agcctcatcc gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2760
atgtgtagac aagctctcgc tctgtcaccc aggctggagt gcagtggtgc aatcatggtt 2820
cactgcagtc ttgacctttt gggctcaagt gatcctccca cctcagcctc ctgagtagct 2880
gggaccatag gctcacaaca ccacacctgg caaatttgat tttttttttt tttttcagag 2940
acggggtctc gcaacattgc ccagacttcc tttgtgttag ttaataaagc tttctcaact 3000
gcc 3003
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Glu Lys Asp Glu Leu
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Arg Ser Glu Lys Asp Glu Leu
1 5
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Cloning primer
<400> 6
tctgttccca ggaactagtt tggcacagac atctgtgtcc ccctcaaaag tc 52
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Cloning primer
<400> 7
cataccgggg actagtcaca ttcacggtca cctcgcgg 38
<210> 8
<211> 799
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Leu Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly
20 25 30
Ile Glu Thr Pro Leu Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn
35 40 45
Arg Lys Val Tyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met
50 55 60
Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu
65 70 75 80
Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser
85 90 95
Trp Gln Pro Val Gly Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr
130 135 140
Thr Val Leu Val Arg Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg
145 150 155 160
Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr
165 170 175
Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro
180 185 190
Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val
195 200 205
Val Cys Ser Leu Asp Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His
210 215 220
Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu
245 250 255
Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln
260 265 270
Glu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val
275 280 285
Ile Leu Thr Lys Pro Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys
290 295 300
Cys Glu Ala His Pro Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala
305 310 315 320
Gln Pro Leu Gly Pro Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu
325 330 335
Asp Asn Gly Arg Ser Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly
340 345 350
Gln Leu Ile His Lys Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly
355 360 365
Pro Arg Leu Asp Glu Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu
370 375 380
Asn Ser Gln Gln Thr Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro
385 390 395 400
Glu Leu Lys Cys Leu Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu
405 410 415
Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala
420 425 430
Arg Ser Thr Gln Gly Glu Val Thr Arg Glu Val Thr Val Asn Val Thr
435 440 445
Ser Gly Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser
450 455 460
Leu Asp Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val
465 470 475 480
Gln Gly Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser
485 490 495
Gly Gln Asn Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser
500 505 510
Gly Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln
515 520 525
Cys Pro Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn
530 535 540
Ser Ser Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro
545 550 555 560
Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu
565 570 575
Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg
580 585 590
Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser
595 600 605
Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val
610 615 620
Ser Arg Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr
625 630 635 640
Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala
645 650 655
Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu
660 665 670
Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr
675 680 685
Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu
690 695 700
Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser
705 710 715 720
Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile
725 730 735
Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys
740 745 750
Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile
755 760 765
Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met
770 775 780
Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr Arg Ser Glu Lys Asp Glu Leu
785 790 795
<210> 9
<211> 6313
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Expression-type plasmid pSSPICAMHuA2
<400> 9
gaactcgagc agctgaagct tgcatgcctg caggtcgacg gtatcgataa ggatccctga 60
aagcgacgtt ggatgttaac atctacaaat tgccttttct tatcgaccat gtacgtaagc 120
gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg ttgtgggcct gtggtctcaa 180
gatggatcat taatttccac cttcacctac gatggggggc atcgcaccgg tgagtaatat 240
tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag gatccctgaa agcgacgttg gatgttaaca 300
tctacaaatt gccttttctt atcgaccatg tacgtaagcg cttacgtttt tggtggaccc 360
ttgaggaaac tggtagctgt tgtgggcctg tggtctcaag atggatcatt aatttccacc 420
ttcacctacg atggggggca tcgcaccggt gagtaatatt gtacggctaa gagcgaattt 480
ggcctgtagg atccctgaaa gcgacgttgg atgttaacat ctacaaattg ccttttctta 540
tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggaccct tgaggaaact ggtagctgtt 600
gtgggcctgt ggtctcaaga tggatcatta atttccacct tcacctacga tggggggcat 660
cgcaccggtg agtaatattg tacggctaag agcgaatttg gcctgtagga tccgcgagct 720
ggtcaatccc attgcttttg aagcagctca acattgatct ctttctcgag ggagattttt 780
caaatcagtg cgcaagacgt gacgtaagta tccgagtcag tttttatttt tctactaatt 840
tggtcgttta tttcggcgtg taggacatgg caaccgggcc tgaatttcgc gggtattctg 900
tttctattcc aactttttct tgatccgcag ccattaacga cttttgaata gatacgctga 960
cacgccaagc ctcgctagtc aaaagtgtac caaacaacgc tttacagcaa gaacggaatg 1020
cgcgtgacgc tcgcggtgac gccatttcgc cttttcagaa atggataaat agccttgctt 1080
cctattatat cttcccaaat taccaataca ttacactagc atctgaattt cataaccaat 1140
ctcgatacac caaatcgact ctagaggatc tatcgattcc cgggtaccat gggatctaaa 1200
ccttttttgt ctcttctttc attgtcattg cttttgttta catctactag tttggcacag 1260
acatctgtgt ccccctcaaa agtcatcctg ccccggggag gctccgtgct ggtgacatgc 1320
agcacctcct gtgaccagcc caagttgttg ggcatagaga ccccgttgcc taaaaaggag 1380
ttgctcctgc ctgggaacaa ccggaaggtg tatgaactga gcaatgtgca agaagatagc 1440
caaccaatgt gctattcaaa ctgccctgat gggcagtcaa cagctaaaac cttcctcacc 1500
gtgtactgga ctccagaacg ggtggaactg gcacccctcc cctcttggca gccagtgggc 1560
aagaacctta ccctacgctg ccaggtggag ggtggggcac cccgggccaa cctcaccgtg 1620
gtgctgctcc gtggggagaa ggagctgaaa cgggagccag ctgtggggga gcccgctgag 1680
gtcacgacca cggtgctggt gaggagagat caccatggag ccaatttctc gtgccgcact 1740
gaactggacc tgcggcccca agggctggag ctgtttgaga acacctcggc cccctaccag 1800
ctccagacct ttgtcctgcc agcgactccc ccacaacttg tcagcccccg ggtcctagag 1860
gtggacacgc aggggaccgt ggtctgttcc ctggacgggc tgttcccagt ctcggaggcc 1920
caggtccacc tggcactggg ggaccagagg ttgaacccca cagtcaccta tggcaacgac 1980
tccttctcgg ccaaggcctc agtcagtgtg accgcagagg acgagggcac ccagcggctg 2040
acgtgtgcag taatactggg gaaccagagc caggagacac tgcagacagt gaccatctac 2100
agctttccgg cgcccaacgt gattctgacg aagccagagg tctcagaagg gaccgaggtg 2160
acagtgaagt gtgaggccca ccctagagcc aaggtgacgc tgaatggggt tccagcccag 2220
ccactgggcc cgagggccca gctcctgctg aaggccaccc cagaggacaa cgggcgcagc 2280
ttctcctgct ctgcaaccct ggaggtggcc ggccagctta tacacaagaa ccagacccgg 2340
gagcttcgtg tcctgtatgg cccccgactg gacgagaggg attgtccggg aaactggacg 2400
tggccagaaa attcccagca gactccaatg tgccaggctt gggggaaccc attgcccgag 2460
ctcaagtgtc taaaggatgg cactttccca ctgcccatcg gggaatcagt gactgtcact 2520
cgagatcttg agggcaccta cctctgtcgg gccaggagca ctcaagggga ggtcacccgc 2580
gaggtgaccg tgaatgtgac tagtgggagc tcagcatccc cgaccagccc caaggtcttc 2640
ccgctgagcc tcgacagcac cccccaagat gggaacgtgg tcgtcgcatg cctggtccag 2700
ggcttcttcc cccaggagcc actcagtgtg acctggagcg aaagcggaca gaacgtgacc 2760
gccagaaact tcccacctag ccaggatgcc tccggggacc tgtacaccac gagcagccag 2820
ctgaccctgc cggccacaca gtgcccagac ggcaagtccg tgacatgcca cgtgaagcac 2880
tacacgaatt ccagccagga tgtgactgtg ccctgccgag ttcccccacc tcccccatgc 2940
tgccaccccc gactgtcgct gcaccgaccg gccctcgagg acctgctctt aggttcagaa 3000
gcgaacctca cgtgcacact gaccggcctg agagatgcct ctggtgccac cttcacctgg 3060
acgccctcaa gtgggaagag cgctgttcaa ggaccacctg agcgtgacct ctgtggctgc 3120
tacagcgtgt ccagagtact tcctggctgt gcccagccat ggaaccatgg ggagaccttc 3180
acctgcactg ctgcccaccc cgagttgaag accccactaa ccgccaacat cacaaaatcc 3240
ggaaacacat tccggcccga ggtccacctg ctgccgccgc cgtcggagga gctggccctg 3300
aacgagctgg tgacgctgac gtgcctggca cgtggcttca gccccaagga tgtgctggtt 3360
cgctggctgc aggggtcaca ggagctgccc cgcgagaagt acctgacttg ggcatcccgg 3420
caggagccca gccagggcac caccacctat gctgtgacca gcatactgcg cgtggcagcc 3480
gaggactgga agaaggggga gaccttctcc tgcatggtgg gccacgaggc cctgccgctg 3540
gccttcacac agaagaccat cgaccgcttg gcgggtaaac ccacccatat caatgtgtct 3600
gttgtcatgg cggaggcgga cggcacctgc tacagatctg aaaaggatga actttagaat 3660
tcgatatcaa gctaattccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 3720
atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 3780
taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 3840
cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 3900
tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggggatc tgccggtctc cctatagtga 3960
gtcgtattaa tttcgataag ccaggttaac ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 4020
agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 4080
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 4140
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 4200
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 4260
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 4320
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 4380
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 4440
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 4500
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 4560
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 4620
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 4680
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 4740
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 4800
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 4860
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 4920
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 4980
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 5040
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 5100
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 5160
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 5220
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 5280
cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 5340
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 5400
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 5460
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 5520
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 5580
agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 5640
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 5700
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 5760
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 5820
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 5880
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 5940
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 6000
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt 6060
gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 6120
gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 6180
ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatggacata 6240
ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac ataaccttat gtatcataca catacgattt 6300
aggtgacact ata 6313
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> Phaseolus vulgaris
<400> 10
Met Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Ser Thr Cys Leu Ala
20
<210> 11
<211> 508
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Protein coding
region of the plasmid pSHuJ
<400> 11
aggatctatc gattcccggg taccatggag aaccatttgc ttttctgggg agtcctggcg 60
gtttttatta aggctgttca tgtgaaagcc caagaagatg aaaggattgt tcttgttgac 120
aacaaatgta agtgtgcccg gattacttcc aggatcatcc gttcttccga agatcctaat 180
gaggacattg tggagagaaa catccgaatt attgttcctc tgaacaacag ggagaatatc 240
tctgatccca cctcaccatt gagaaccaga tttgtgtacc atttgtctga cctctgtaaa 300
aaatgtgatc ctacagaagt ggagctggat aatcagatag ttactgctac ccagagcaat 360
atctgtgatg aagacagtgc tacagagacc tgctacactt atgacagaaa caagtgctac 420
acagctgtgg tcccactcgt atatggtggt gagaccaaaa tggtggaaac agccttaacc 480
ccagatgcct gctatcctga ctgaattc 508
<210> 12
<211> 1845
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Protein coding
region of plasmid pSHuSC
<400> 12
gtcgattccc gggtaccatg gtgctcttcg tgctcacctg cctgctggcg gtcttcccag 60
ccatctccac gaagagtccc atatttggtc ccgaggaggt gaatagtgtg gaaggtaact 120
cagtgtccat cacgtgctac tacccaccca cctctgtcaa ccggcacacc cggaagtact 180
ggtgccggca gggagctaga ggtggctgca taaccctcat ctcctcggag ggctacgtct 240
ccagcaaata tgcaggcagg gctaacctca ccaacttccc ggagaacggc acatttgtgg 300
tgaacattgc ccagctgagc caggatgact ccgggcgcta caagtgtggc ctgggcatca 360
atagccgagg cctgtccttt gatgtcagcc tggaggtcag ccagggtcct gggctcctaa 420
atgacactaa agtctacaca gtggacctgg gcagaacggt gaccatcaac tgccctttca 480
agactgagaa tgctcaaaag aggaagtcct tgtacaagca gataggcctg taccctgtgc 540
tggtcatcga ctccagtggt tatgtgaatc ccaactatac aggaagaata cgccttgata 600
ttcagggtac tggccagtta ctgttcagcg ttgtcatcaa ccaactcagg ctcagcgatg 660
ctgggcagta tctctgccag gctggggatg attccaatag taataagaag aatgctgacc 720
tccaagtgct aaagcccgag cccgagctgg tttatgaaga cctgaggggc tcagtgacct 780
tccactgtgc cctgggccct gaggtggcaa acgtggccaa atttctgtgc cgacagagca 840
gtggggaaaa ctgtgacgtg gtcgtcaaca ccctggggaa gagggcccca gcctttgagg 900
gcaggatcct gctcaacccc caggacaagg atggctcatt cagtgtggtg atcacaggcc 960
tgaggaagga ggatgcaggg cgctacctgt gtggagccca ttcggatggt cagctgcagg 1020
aaggctcgcc tatccaggcc tggcaactct tcgtcaatga ggagtccacg attccccgca 1080
gccccactgt ggtgaagggg gtggcaggaa gctctgtggc cgtgctctgc ccctacaacc 1140
gtaaggaaag caaaagcatc aagtactggt gtctctggga aggggcccag aatggccgct 1200
gccccctgct ggtggacagc gaggggtggg ttaaggccca gtacgagggc cgcctctccc 1260
tgctggagga gccaggcaac ggcaccttca ctgtcatcct caaccagctc accagccggg 1320
acgccggctt ctactggtgt ctgaccaacg gcgatactct ctggaggacc accgtggaga 1380
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ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca 840
tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg 900
gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg 960
ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat 1020
gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctact ga 1062
<210> 16
<211> 353
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
<210> 17
<211> 1023
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
gcatccccga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctcg acagcacccc ccaagatggg 60
aacgtggtcg tcgcatgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc 120
tggagcgaaa gcggacagaa cgtgaccgcc agaaacttcc cacctagcca ggatgcctcc 180
ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cccagacggc 240
aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc 300
tgcccagttc ccccacctcc cccatgctgc cacccccgac tgtcgctgca ccgaccggcc 360
ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga 420
gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga 480
ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc 540
cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc 600
ccactaaccg ccaacatcac aaaatccgga aacacattcc ggcccgaggt ccacctgctg 660
ccgccgccgt cggaggagct ggccctgaac gagctggtga cgctgacgtg cctggcacgt 720
ggcttcagcc ccaaggatgt gctggttcgc tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc 780
gagaagtacc tgacttgggc atcccggcag gagcccagcc agggcaccac caccttcgct 840
gtgaccagca tactgcgcgt ggcagccgag gactggaaga agggggacac cttctcctgc 900
atggtgggcc acgaggccct gccgctggcc ttcacacaga agaccatcga ccgcttggcg 960
ggtaaaccca cccatgtcaa tgtgtctgtt gtcatggcgg aggtggacgg cacctgctac 1020
tga 1023
<210> 18
<211> 340
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr
1 5 10 15
Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro
100 105 110
Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser
115 120 125
Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly
130 135 140
Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly
145 150 155 160
Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu
165 170 175
Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr
180 185 190
Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser
210 215 220
Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg
225 230 235 240
Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro
260 265 270
Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala
275 280 285
Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His
290 295 300
Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp
325 330 335
Gly Thr Cys Tyr
340
<210> 19
<211> 993
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
<210> 20
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 21
<211> 978
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
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tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960
tccctgtctc cgggtaaa 978
<210> 22
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 23
<211> 1134
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc 300
aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 360
gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctccccca 420
tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccgtgccc aaggtgccca 480
gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggatacc 540
cttatgattt cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600
cccgaggtcc agttcaagtg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780
cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 960
tacaacacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacatcttct catgctccgt gatgcatgag 1080
gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 1134
<210> 24
<211> 377
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 25
<211> 984
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa atga 984
<210> 26
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 27
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
taggctgcct gtgcccccca cctgcctgtc cacaacccag cctctggtac atccatgccc 60
tctgccctaa gcctcacctg cacttttcct tggatttcag agtctccaaa ggcacaggcc 120
tcctccgtgc ccactgcaca accccaagca gagggcagcc tcgccaaggc aaccacagcc 180
ccagccacca cccgtaacac aggtgagaag ccccttccct gcacactcca cccccaccca 240
cctgctcatt cctcagccgc ctcctccagg cagcccttca taactccttg tctgagtctc 300
<210> 28
<211> 383
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg
1 5 10 15
His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser
35 40 45
Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr
50 55 60
Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu
85 90 95
Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro
100 105 110
Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
145 150 155 160
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala
165 170 175
Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val
180 185 190
Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly
195 200 205
Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser
210 215 220
Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu
225 230 235 240
Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro
260 265 270
Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala
275 280 285
Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile
290 295 300
Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe
305 310 315 320
Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala
325 330 335
Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr
340 345 350
Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala
355 360 365
Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met
370 375 380
<210> 29
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
gtcattagct ggatttagcc attccacaat gtacacatat ttcaaacatt gtgttgtata 60
tgataaacat gtataatttt tgtcaattaa aaatttttag gaagaggagg agaagagaag 120
aagaaggaga aggagaaaga ggaacaagaa gagagagaga caaagacacc aggttttttc 180
tgacccctgg gctatcaaaa cacctattgc ccaataacta gttggccgtt ggtgccctaa 240
actattgaag cgattgctgt tatgtggatg ggccccggac acttagaaac tcgtgacccc 300
<210> 30
<211> 429
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
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1 5 10 15
Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr
20 25 30
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Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Met
50 55 60
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Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile
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100 105 110
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115 120 125
Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu
130 135 140
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
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Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val
165 170 175
Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val
180 185 190
Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys
195 200 205
Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn
210 215 220
Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp
225 230 235 240
Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val
260 265 270
Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
290 295 300
Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
305 310 315 320
Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp
325 330 335
Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
340 345 350
Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser
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Ser Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Thr Thr Phe Asp Asp Val Gly
385 390 395 400
Ser Leu Trp Thr Thr Leu Ser Thr Phe Val Ala Leu Phe Ile Leu Thr
405 410 415
Leu Leu Tyr Ser Gly Ile Val Thr Phe Ile Lys Val Lys
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<211> 500
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
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Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
340 345 350
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Ser Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Thr Thr Phe Asp Asp Val Gly
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<213> Homo sapiens
<400> 35
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
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1 5 10 15
Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr
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Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
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Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
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Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp
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Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
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<210> 38
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
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<213> Homo sapiens
<400> 39
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Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
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Ser Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Thr Thr Phe Asp Asp Val Gly
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Leu Leu Tyr Ser Gly Ile Val Thr Phe Ile Lys Val Lys
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
tcaggcttct agcccctgtc tgaccccagg ggctgtcttt caggtgaagt agccccagaa 60
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<213> Homo sapiens
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Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr
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275 280 285
Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
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Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
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Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
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Ser Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Thr Thr Phe Asp Asp Val Gly
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Ser Leu Trp Thr Thr Leu Ser Thr Phe Val Ala Leu Phe Ile Leu Thr
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Leu Leu Tyr Ser Gly Ile Val Thr Phe Ile Lys Val Lys
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<210> 42
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
tttccctgcc tcccgtcacc ctgccgccag ggcctctgcc ctgccctgcc ccttgtcctc 60
aggtttccag cctcagactc ccactgtgtc tgtcttccag cacccaccaa ggctccggat 120
gtgttcccca tcatatcagg gtgcagacac ccaaaggata acagccctgt ggtcctggca 180
tgcttgataa ctgggtacca cccaacgtcc gtgactgtca cctggtacat ggggacacag 240
agccagcccc agagaacctt ccctgagata caaagacggg acagctacta catgacaagc 300
agccagctct ccacccccct ccagcagtgg cgccaaggcg agtacaaatg cgtggtccag 360
cacaccgcca gcaagagtaa gaaggagatc ttccgctggc caggtaggtc gcaccggaga 420
tcacccagaa gggcccccca ggacccccag caccttccac tcagggcctg accacaaaga 480
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<210> 43
<211> 429
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<213> Homo sapiens
<400> 43
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn
210 215 220
Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp
225 230 235 240
Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val
260 265 270
Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
290 295 300
Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
305 310 315 320
Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp
325 330 335
Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
340 345 350
Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser
355 360 365
Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Leu Ala Met Thr Pro Leu Ile Pro Gln
370 375 380
Ser Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Thr Thr Phe Asp Asp Val Gly
385 390 395 400
Ser Leu Trp Thr Thr Leu Ser Thr Phe Val Ala Leu Phe Ile Leu Thr
405 410 415
Leu Leu Tyr Ser Gly Ile Val Thr Phe Ile Lys Val Lys
420 425
<210> 44
<211> 1725
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
atggactgga cctggatcct cttcttggtg gcagcagcca cgcgagtcca ctcccagacg 60
cagttggtgc agtctggggc tgaggtgagg aagcctgggg catcagtgag ggtctcctgc 120
aaggcttctg gatacacctt catcgactcc tatatccact ggatacgaca ggcccctggg 180
cacgggcttg agtgggtggg atggatcaac cctaacagtg gtggcacaaa ctatgctccg 240
agatttcagg gcagggtcac catgaccaga gacgcgtcct tcagtacagc ctacatggac 300
ctgagaagtc tgagatctga cgactcggcc gtgttttact gtgcgaaaag tgaccctttt 360
tggagtgatt attataactt tgactactcg tacactttgg acgtctgggg ccaagggacc 420
acggtcaccg tctcctcagc ctccacacag agcccatccg tcttcccctt gacccgctgc 480
tgcaaaaaca ttccctccaa tgccacctcc gtgactctgg gctgcctggc cacgggctac 540
ttcccggagc cggtgatggt gacctgggac acaggctccc tcaacgggac aactatgacc 600
ttaccagcca ccaccctcac gctctctggt cactatgcca ccatcagctt gctgaccgtc 660
tcgggtgcgt gggccaagca gatgttcacc tgccgtgtgg cacacactcc atcgtccaca 720
gactgggtcg acaacaaaac cttcagcgtc tgctccaggg acttcacccc gcccaccgtg 780
aagatcttac agtcgtcctg cgacggcggc gggcacttcc ccccgaccat ccagctcctg 840
tgcctcgtct ctgggtacac cccagggact atcaacatca cctggctgga ggacgggcag 900
gtcatggacg tggacttgtc caccgcctct accacgcagg agggtgagct ggcctccaca 960
caaagcgagc tcaccctcag ccagaagcac tggctgtcag accgcaccta cacctgccag 1020
gtcacctatc aaggtcacac ctttgaggac agcaccaaga agtgtgcaga ttccaacccg 1080
agaggggtga gcgcctacct aagccggccc agcccgttcg acctgttcat ccgcaagtcg 1140
cccacgatca cctgtctggt ggtggacctg gcacccagca aggggaccgt gaacctgacc 1200
tggtcccggg ccagtgggaa gcctgtgaac cactccacca gaaaggagga gaagcagcgc 1260
aatggcacgt taaccgtcac gtccaccctg ccggtgggca cccgagactg gatcgagggg 1320
gagacctacc agtgcagggt gacccacccc cacctgccca gggccctcat gcggtccacg 1380
accaagacca gcggcccgcg tgctgccccg gaagtctatg cgtttgcgac gccggagtgg 1440
ccggggagcc gggacaagcg caccctcgcc tgcctgatcc agaacttcat gcctgaggac 1500
atctcggtgc agtggctgca caacgaggtg cagctcccgg acgcccggca cagcacgacg 1560
cagccccgca agaccaaggg ctccggcttc ttcgtcttca gccgcctgga ggtgaccagg 1620
gccgaatggg agcagaaaga tgagttcatc tgccgtgcag tccatgaggc agcgagcccc 1680
tcacagaccg tccagcgagc ggtgtctgta aatcccggta aatga 1725
<210> 45
<211> 428
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys
1 5 10 15
Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr
20 25 30
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly
50 55 60
His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys
65 70 75 80
Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp
85 90 95
Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro
100 105 110
Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro
115 120 125
Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr
130 135 140
Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser
165 170 175
Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr
180 185 190
Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
195 200 205
Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser
245 250 255
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys
260 265 270
Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr
275 280 285
Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro
290 295 300
His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro
305 310 315 320
Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly
325 330 335
Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro
340 345 350
Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp
355 360 365
Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe
370 375 380
Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys
385 390 395 400
Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln
405 410 415
Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
420 425
<210> 46
<211> 1884
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc tatgctatca gctgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat gggagggatc atccctatct ttggtacagc aaactacgca 240
cagaagttcc agggcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300
gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgaa aaccgggatc 360
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gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggga gtgcatccgc cccaaccctt 480
ttccccctcg tctcctgtga gaattccccg tcggatacga gcagcgtggc cgttggctgc 540
ctcgcacagg acttccttcc cgactccatc actttctcct ggaaatacaa gaacaactct 600
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tcacaggtgc tgctgccttc caaggacgtc atgcagggca cagacgaaca cgtggtgtgc 720
aaagtccagc accccaacgg caacaaagaa aagaacgtgc ctcttccagt gattgctgag 780
ctgcctccca aagtgagcgt cttcgtccca ccccgcgacg gcttcttcgg caacccccgc 840
agcaagtcca agctcatctg ccaggccacg ggtttcagtc cccggcagat tcaggtgtcc 900
tggctgcgcg aggggaagca ggtggggtct ggcgtcacca cggaccaggt gcaggctgag 960
gccaaagagt ctgggcccac gacctacaag gtgaccagca cactgaccat caaagagagc 1020
gactggctca gccagagcat gttcacctgc cgcgtggatc acaggggcct gaccttccag 1080
cagaatgcgt cctccatgtg tgtccccgat caagacacag ccatccgggt cttcgccatc 1140
cccccatcct ttgccagcat cttcctcacc aagtccacca agttgacctg cctggtcaca 1200
gacctgacca cctatgacag cgtgaccatc tcctggaccc gccagaatgg cgaagctgtg 1260
aaaacccaca ccaacatctc cgagagccac cccaatgcca ctttcagcgc cgtgggtgag 1320
gccagcatct gcgaggatga ctggaattcc ggggagaggt tcacgtgcac cgtgacccac 1380
acagacctgc cctcgccact gaagcagacc atctcccggc ccaagggggt ggccctgcac 1440
aggcccgatg tctacttgct gccaccagcc cgggagcagc tgaacctgcg ggagtcggcc 1500
accatcacgt gcctggtgac gggcttctct cccgcggacg tcttcgtgca gtggatgcag 1560
agggggcagc ccttgtcccc ggagaagtat gtgaccagcg ccccaatgcc tgagccccag 1620
gccccaggcc ggtacttcgc ccacagcatc ctgaccgtgt ccgaagagga atggaacacg 1680
ggggagacct acacctgcgt ggtggcccat gaggccctgc ccaacagggt caccgagagg 1740
accgtggaca agtccaccga gggggaggtg agcgccgacg aggagggctt tgagaacctg 1800
tgggccaccg cctccacctt catcgtcctc ttcctcctga gcctcttcta cagtaccacc 1860
gtcaccttgt tcaaggtgaa atga 1884
<210> 47
<211> 454
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln
130 135 140
Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val
145 150 155 160
Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr
165 170 175
Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser
180 185 190
Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln
195 200 205
Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg
210 215 220
Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val
245 250 255
Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr
260 265 270
Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu
275 280 285
Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys
290 295 300
Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser
305 310 315 320
Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro
325 330 335
Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys
340 345 350
Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln
355 360 365
Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met
370 375 380
Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr
385 390 395 400
Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val
405 410 415
Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp
435 440 445
Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
450
<210> 48
<211> 822
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Protein
encoded by plasmid pSSPICAMHuA2
<400> 48
Met Gly Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala Gln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val
20 25 30
Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys
35 40 45
Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile Glu Thr Pro Leu Pro Lys Lys Glu
50 55 60
Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys Val Tyr Glu Leu Ser Asn Val
65 70 75 80
Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Asp Gly Gln
85 90 95
Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val
100 105 110
Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly Lys Asn Leu Thr
115 120 125
Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val
130 135 140
Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala Val Gly
145 150 155 160
Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg Arg Asp His His
165 170 175
Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe
195 200 205
Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu
210 215 220
Val Asp Thr Gln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp Gly Leu Phe Pro
225 230 235 240
Val Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn
245 250 255
Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val
260 265 270
Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val
275 280 285
Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr
290 295 300
Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val Ile Leu Thr Lys Pro Glu Val Ser Glu
305 310 315 320
Gly Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro Arg Ala Lys Val
325 330 335
Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala Gln Pro Leu Gly Pro Arg Ala Gln Leu
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu Asp Asn Gly Arg Ser Phe Ser Cys Ser
355 360 365
Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile His Lys Asn Gln Thr Arg
370 375 380
Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Glu Arg Asp Cys Pro
385 390 395 400
Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu Asn Ser Gln Gln Thr Pro Met Cys Gln
405 410 415
Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro Glu Leu Lys Cys Leu Lys Asp Gly Thr
420 425 430
Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Leu Glu
435 440 445
Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Arg Ser Thr Gln Gly Glu Val Thr Arg
450 455 460
Glu Val Thr Val Asn Val Thr Ser Gly Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser
465 470 475 480
Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn
485 490 495
Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu
500 505 510
Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr Ala Arg Asn Phe
515 520 525
Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln
530 535 540
Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys
545 550 555 560
His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp Val Thr Val Pro Cys
565 570 575
Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His
580 585 590
Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr
595 600 605
Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp
610 615 620
Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp
625 630 635 640
Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Arg Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln
645 650 655
Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu
660 665 670
Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe
675 680 685
Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu
690 695 700
Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys
705 710 715 720
Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu
725 730 735
Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr
740 745 750
Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys
755 760 765
Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu
770 775 780
Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His
785 790 795 800
Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr Arg
805 810 815
Ser Glu Lys Asp Glu Leu
820
<210> 49
<211> 428
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys
1 5 10 15
Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr
20 25 30
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly
50 55 60
His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys
65 70 75 80
Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp
85 90 95
Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro
100 105 110
Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro
115 120 125
Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr
130 135 140
Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser
165 170 175
Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr
180 185 190
Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
195 200 205
Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser
245 250 255
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys
260 265 270
Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr
275 280 285
Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro
290 295 300
His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro
305 310 315 320
Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly
325 330 335
Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro
340 345 350
Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp
355 360 365
Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe
370 375 380
Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys
385 390 395 400
Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln
405 410 415
Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
420 425
<210> 50
<211> 159
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Glu Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
1 5 10 15
Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp
20 25 30
Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser
35 40 45
Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val
50 55 60
Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg
65 70 75 80
Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro
85 90 95
Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg
115 120 125
Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr
130 135 140
Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
145 150 155
<210> 51
<211> 602
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Met Val Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile
1 5 10 15
Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu
20 25 30
Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn
35 40 45
Arg Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys Ile
50 55 60
Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly Arg
65 70 75 80
Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn Ile
85 90 95
Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu Gly
100 105 110
Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser Gln
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu Gly
130 135 140
Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val Ile
165 170 175
Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg Leu
180 185 190
Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn Gln
195 200 205
Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp Asp
210 215 220
Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro Glu
225 230 235 240
Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe Cys Ala
245 250 255
Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg Gln Ser
260 265 270
Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala Gly Arg
305 310 315 320
Tyr Leu Cys Gly Ala Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly Ser Pro Ile
325 330 335
Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile Pro Arg Ser
340 345 350
Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Ser Ser Val Ala Val Leu Cys
355 360 365
Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp Cys Leu Trp
370 375 380
Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp Ser Glu Gly
385 390 395 400
Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu Glu Glu Pro
405 410 415
Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg Asp
420 425 430
Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu Trp Arg Thr
435 440 445
Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu Lys Val Pro
450 455 460
Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val Pro Cys Phe
465 470 475 480
Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys Lys Trp Asn Asn
485 490 495
Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly Pro Ser Lys Ala
500 505 510
Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser Leu Thr Leu Asn
515 520 525
Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys Gly Val Lys Gln
530 535 540
Gly Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val Ala Val Glu Glu Arg
545 550 555 560
Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala Lys Ala Asp Ala Ala
565 570 575
Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu Ile Glu Asn Lys
580 585 590
Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu
595 600
<210> 52
<211> 2533
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
ggtccaactg caggcctgtg gtgcaggagc tgtgtgacca tggggctgtc accaggcctc 60
tctgtgctgg gttcctccag tatagaggag aggcagtata gaggagaggg ccgcgtcctc 120
acagtgcatt ctgtgttcca gcatccccga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct 180
gcagcaccca gccagatggg aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc 240
aggagccact cagtgtgacc tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc 300
cacccagcca ggatgcctcc ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg 360
ccacacagtg cctagccggc aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca 420
gccaggatgt gactgtgccc tgcccaggtc agagggcagg ctggggagtg gggcggggcc 480
accccgtcgt gccctgacac tgcgcctgca cccgtgttcc ccacagggag ccgccccttc 540
actcacacca gagtggaccc cgggccgagc cccaggaggt ggtggtggac aggccaggag 600
gggcgaggcg ggggcatggg gaagtatgtg ctgaccagct caggccatct ctccactcca 660
gttccctcaa ctccacctac cccatctccc tcaactccac ctaccccatc tccctcatgc 720
tgccaccccc gactgtcact gcaccgaccg gccctcgagg acctgctctt aggttcagaa 780
gcgaacctca cgtgcacact gaccggcctg agagatgcct caggtgtcac cttcacctgg 840
acgccctcaa gtgggaagag cgctgttcaa ggaccacctg agcgtgacct ctgtggctgc 900
tacagcgtgt ccagtgtcct gccgggctgt gccgagccat ggaaccatgg gaagaccttc 960
acttgcactg ctgcctaccc cgagtccaag accccgctaa ccgccaccct ctcaaaatcc 1020
ggtgggtcca gaccctgctc ggggccctgc tcagtgctct ggtttgcaaa gcatattcct 1080
ggcctgcctc ctccctccca atcctgggct ccagtgctca tgccaagtac acagggaaac 1140
tgaggcaggc tgaggggcca ggacacagcc cggggtgccc accagagcag aggggctctc 1200
tcatcccctg cccagccccc tgacctggct ctctaccctc caggaaacac attccggccc 1260
gaggtccacc tgctgccgcc gccgtcggag gagctggccc tgaacgagct ggtgacgctg 1320
acgtgcctgg cacgcggctt cagccccaag gacgtgctgg ttcgctggct gcaggggtca 1380
caggagctgc cccgcgagaa gtacctgact tgggcatccc ggcaggagcc cagccagggc 1440
accaccacct tcgctgtgac cagcatactg cgcgtggcag ccgaggactg gaagaagggg 1500
gacaccttct cctgcatggt gggccacgag gccctgccgc tggccttcac acagaagacc 1560
atcgaccgct tggcgggtaa acccacccat gtcaatgtgt ctgttgtcat ggcggaggtg 1620
gacggcacct gctactgagc cgcccgcctg tccccacccc tgaataaact ccatgctccc 1680
ccaagcagcc ccacgcttcc atccggcgcc tgtctgtcca tcctcagggt ctcagcactt 1740
gggaaagggc cagggcatgg acagggaaga ataccccctg ccctgagcct cggggggccc 1800
ctggcacccc catgagactt tccaccctgg tgtgagtgtg agttgtgagt gtgagagtgt 1860
gtggtgcagg aggcctcgct ggtgtgagat cttaggtctg ccaaggcagg cacagcccag 1920
gatgggttct gagagacgca catgccccgg acagttctga gtgagcagtg gcatggccgt 1980
ttgtccctga gagagccgcc tctggctgta gctgggaggg aatagggagg gtaaaaggag 2040
caggctagcc aagaaaggcg caggtagtgg caggagcggc gagggagtga ggggctggac 2100
tccagggccc cactgggagg acaagctcca ggagggcccc accaccctag tgggtgggcc 2160
tcaggacgtc ccactgacgc atgcaggaag gggcacctcc ccttaaccac actgctctgt 2220
acggggcacg tgggcacagg tgcacactca cactcacata tatgcctgag ccctgcagga 2280
gcggaacgtt cacagcccag acccagttcc agaaaagcca ggggagtccc ctcccaagcc 2340
cccaagctca gcctgctccc ctaggcccct ctggcttccc tgtgtttcca ctgtgcacag 2400
atcaggcacc aactccacag acccctccca ggcagcccct gctccctgcc tggccaagtc 2460
tcccatccct tcctaagccc aactaggacc caaagcatag acagggaggg gccacgtggg 2520
gtggcatcag aag 2533
<210> 53
<211> 2516
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
ggtccaaccg caggcccatg gtgcaggagc tgtgtaacct atggggctgt caccaggcct 60
ctctgtgctg ggttcctcca gtgtagagga gaggcaggta cagcctgtcc tcctggggac 120
atggcatgag ggccgcgtcc tcacagcgca ttctgtgttc cagcatcccc gaccagcccc 180
aaggtcttcc cgctgagcct cgacagcacc ccccaagatg ggaacgtggt cgtcgcatgc 240
ctggtccagg gcttcttccc ccaggagcca ctcagtgtga cctggagcga aagcggacag 300
aacgtgaccg ccagaaactt cccacctagc caggatgcct ccggggacct gtacaccacg 360
agcagccagc tgaccctgcc ggccacacag tgcccagacg gcaagtccgt gacatgccac 420
gtgaagcact acacgaatcc cagccaggat gtgactgtgc cctgcccagg tcagagggca 480
ggctggggag tggggcgggg ccaccccgtc ctgccctgac actgcgcctg cacccgtgtt 540
ccccacaggg agccgcccct tcactcacac cagagtggac cccgggccga gccccaggag 600
gtggtggtgg acaggccagg aggggcgagg cgggggcacg gggaagggcg ttctgaccag 660
ctcaggccat ctctccactc cagttccccc acctccccca tgctgccacc cccgactgtc 720
gctgcaccga ccggccctcg aggacctgct cttaggttca gaagcgaacc tcacgtgcac 780
actgaccggc ctgagagatg cctctggtgc caccttcacc tggacgccct caagtgggaa 840
gagcgctgtt caaggaccac ctgagcgtga cctctgtggc tgctacagcg tgtccagtgt 900
cctgcctggc tgtgcccagc catggaacca tggggagacc ttcacctgca ctgctgccca 960
ccccgagttg aagaccccac taaccgccaa catcacaaaa tccggtgggt ccagaccctg 1020
ctcggggccc tgctcagtgc tctggtttgc aaagcatatt cccggcctgc ctcctccctc 1080
ccaatcctgg gctccagtgc tcatgccaag tacacaggga aactgaggca ggctgagggg 1140
ccaggacaca gcccagggtg cccaccagag cagaggggct ctctcatccc ctgcccagcc 1200
ccctgacctg gctctctacc ctccaggaaa cacattccgg cccgaggtcc acctgctgcc 1260
gccgccgtcg gaggagctgg ccctgaacga gctggtgacg ctgacgtgcc tggcacgtgg 1320
cttcagcccc aaggatgtgc tggttcgctg gctgcagggg tcacaggagc tgccccgcga 1380
gaagtacctg acttgggcat cccggcagga gcccagccag ggcaccacca ccttcgctgt 1440
gaccagcata ctgcgcgtgg cagccgagga ctggaagaag ggggacacct tctcctgcat 1500
ggtgggccac gaggccctgc cgctggcctt cacacagaag accatcgacc gcttggcggg 1560
taaacccacc catgtcaatg tgtctgttgt catggcggag gtggacggca cctgctactg 1620
agccgcccgc ctgtccccac ccctgaataa actccatgct cccccaagca gccccacgct 1680
tccatccggc gcctgtctgt ccatcctcag ggtctcagca cttgggaaag ggccagggca 1740
tggacaggga agaatacccc ctgccctgag cctcgggggg cccctggcac ccccatgaga 1800
ctttccaccc tggtgtgagt gtgagttgtg agtgtgagag tgtgtggtgc aggaggcctc 1860
gctggtgtga gatcttaggt ctgccaaggc aggcacagcc caggatgggt tctgagagac 1920
gcacatgccc cggacagttc tgagtgagca gtggcatggc cgtttgtccc tgagagagcc 1980
gcctctggct gtagctggga gggaataggg agggtaaaag gagcaggcta gccaagaaag 2040
gcgcaggtag tggcaggagc ggcgagggag tgaggggctg gactccaggg ccccactggg 2100
aggacaagct ccaggagggc cccaccaccc tagtgggtgg gcctcaggac gtcccactga 2160
cgcatgcagg aaggggcacc tccccttaac cacactgctc tgtacggggc acgtgggcac 2220
acatgcacac tcacactcac atatacgcct gagccctgca ggagtggaac gttcacagcc 2280
cagacccagt tccagaaaag ccaggggagt cccctcccaa gcccccaagc tcagcctgct 2340
cccccaggcc cctctggctt ccctgtgttt ccactgtgca cagatcaggc accaactcca 2400
cagacccctc ccaggcagcc cctgctccct gcctggccaa gtctcccatc ccttcctaag 2460
cccaactagg acccaaagca tagacaggga ggggccgcgt ggggtggcat cagaag 2516
<210> 54
<211> 2009
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
agctttctgg ggcaggccag gcctgacctt ggctttgggg cagggagggg gctaaggtga 60
ggcaggtggc gccagcaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggacgctgaa 120
cctcgcggac agttaagaac ccaggggcct ctgcgcctgg gcccagctct gtcccacacc 180
gcggtcacat ggcaccacct ctcttgcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct 240
ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 300
ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca 360
caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt 420
gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa 480
caccaaggtg gacaagaaag ttggtgagag gccagcacag ggagggaggg tgtctgctgg 540
aagcaggctc agcgctcctg cctggacgca tcccggctat gcagccccag tccagggcag 600
caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg gagcctctgc ccgccccact catgctcagg 660
gagagggtct tctggctttt tcccaggctc tgggcaggca caggctaggt gcccctaacc 720
caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc tgccaagagc catatccggg 780
aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa ctctccactc cctcagctcg 840
gacaccttct ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct tctctctgca gagcccaaat 900
cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag gcctcgccct 960
ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag gccccagccg 1020
ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg gggaccgtca 1080
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1140
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1200
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1260
taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1320
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1380
aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc 1440
tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtcctacag ggcagccccg agaaccacag 1500
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1740
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gcacgtaccc cctgtacata cttcccgggc gcccagcatg gaaataaagc acccagcgct 1920
gccctgggcc cctgcgagac tgtgatggtt ctttccacgg gtcaggccga gtctgaggcc 1980
tgagtggcat gagggaggca gagcgggtc 2009
<210> 55
<211> 2009
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
agctttctgg ggcgagccgg gcctgacttt ggctttgggg cagggagtgg gctaaggtga 60
ggcaggtggc gccagccagg tgcacaccca atgcccgtga gcccagacac tggaccctgc 120
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cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcctcc accaagggcc catcggtctt 240
ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300
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cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420
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cagcaacacc aaggtggaca agacagttgg tgagaggcca gctcagggag ggagggtgtc 540
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tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc caccaggctc caggcaggca caggctgggt 720
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catatccggg aggaccctgc ccctgaccta agccgacccc aaaggccaaa ctgtccactc 840
cctcagctcg gacaccttct ctcctcccag atccgagtaa ctcccaatct tctctctgca 900
gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccaggta agccagccca ggcctcgccc 960
tccagctcaa ggcgggacag gtgccctaga gtagcctgca tccagggaca ggccccagct 1020
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gtgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga 1200
cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt 1260
ccgtgtggtc agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa 1320
gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa 1380
aggtgggacc cgcggggtat gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg 1440
ccctgggagt gaccgctgtg ccaacctctg tccctacagg gcagccccga gaaccacagg 1500
tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc 1560
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gccctgggcc cctgcgagac tgtgatggtt ctttccgtgg gtcaggccga gtctgaggcc 1980
tgagtggcat gagggaggca gagtgggtc 2009
<210> 56
<211> 2590
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
agctttctgg ggcaggccag gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac 60
gcaggtggcg ccagccaggc gcacacccaa tgcccgtgag cccagacact ggaccctgcc 120
tggaccctcg tggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc 180
cacaccgcag tcacatggcg ccatctctct tgcagcttcc accaagggcc catcggtctt 240
ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 300
caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 360
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420
gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacacc tgcaacgtga atcacaagcc 480
cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcgcagggag ggagggtgtc 540
tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcatcc cggctgtgca gtcccagccc 600
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gctcagggag agggtcttct ggctttttcc accaggctcc gggcaggcac aggctggatg 720
cccctacccc aggcccttca cacacagggg caggtgctgc gctcagagct gccaaaagcc 780
atatccagga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca aaggccaaac tctctactca 840
ctcagctcag acaccttctc tcttcccaga tctgagtaac tcccaatctt ctctctgcag 900
agctcaaaac cccacttggt gacacaactc acacatgccc acggtgccca ggtaagccag 960
cccaggactc gccctccagc tcaaggcggg acaagagccc tagagtggcc tgagtccagg 1020
gacaggcccc agcagggtgc tgacgcatcc acctccatcc cagatccccg taactcccaa 1080
tcttctctct gcagagccca aatcttgtga cacacctccc ccgtgcccac ggtgcccagg 1140
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agtccaggga caggccccag cagggtgctg acgcgtccac ctccatccca gatccccgta 1260
actcccaatc ttctctctgc agagcccaaa tcttgtgaca cacctccccc atgcccacgg 1320
tgcccaggta agccagccca ggcctcgccc tccagctcaa ggcgggacaa gagccctaga 1380
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gcccaaggtg cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg caggacaggt 1560
gccctagagt ggcctgcatc cagggacagg tcccagtcgg gtgctgacac atctgcctcc 1620
atctcttcct cagcacctga actcctggga ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1680
cccaaggata cccttatgat ttcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 1740
agccacgaag accccgaggt ccagttcaag tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1800
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 1860
accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1920
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggtgggac ccgcggggta 1980
tgagggccac atggacagag gccagcttga cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt 2040
gccaacctct gtccctacag gacagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc 2100
ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc 2160
cagcgacatc gccgtggagt gggagagcag cgggcagccg gagaacaact acaacaccac 2220
gcctcccatg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa 2280
gagcaggtgg cagcagggga acatcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa 2340
ccgcttcacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagtgcgac agccggcaag 2400
cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtgtacat 2460
acttcccggg cacccagcat ggaaataaag cacccagcgc tgccctgggc ccctgtgaga 2520
ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc 2580
agagcgggtc 2590
<210> 57
<211> 2028
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac 60
gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca 120
tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc 180
cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt 240
ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300
caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 360
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420
gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc 480
cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc 540
tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc 600
agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca 660
tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg 720
cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca 780
tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc 840
tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga 900
gtccaaatat ggtcccccat gcccatcatg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc 960
cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg 1020
gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 1080
tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 1140
cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 1200
atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1260
accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320
agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380
aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440
gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800
tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860
ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920
tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980
ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028
<210> 58
<211> 106
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
tgccacccca ggactctgtc ttccagcacc caccaaggct ccggatgtgt tccccatcat 60
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<210> 59
<211> 1920
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
ggatccctgc cacggggtcc ccagctcccc catccaggcc ccccaggctg atgggcgctg 60
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cacactccat cgtccacaga ctgggtcgac aacaaaacct tcagcggtaa gagagggcca 420
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ccccaataaa ctgtgcctgc tcagagcccc agtacaccca ttcttgggag cgggcagggc 1920
<210> 60
<211> 574
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gln Thr Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro
20 25 30
Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile
35 40 45
Asp Ser Tyr Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Pro
65 70 75 80
Arg Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Ala Ser Phe Ser Thr
85 90 95
Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Ser Ala Val Phe
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Ser Asp Pro Phe Trp Ser Asp Tyr Tyr Asn Phe Asp
115 120 125
Tyr Ser Tyr Thr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys
145 150 155 160
Cys Lys Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu
165 170 175
Ala Thr Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly
180 185 190
Ser Leu Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Gly His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp
210 215 220
Ala Lys Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr
225 230 235 240
Asp Trp Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr
245 250 255
Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His
260 265 270
Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro
275 280 285
Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val
290 295 300
Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr
305 310 315 320
Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr
325 330 335
Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr
340 345 350
Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser
355 360 365
Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr
370 375 380
Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr
385 390 395 400
Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu
405 410 415
Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val
420 425 430
Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr
435 440 445
His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser
450 455 460
Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp
465 470 475 480
Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe
485 490 495
Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu
500 505 510
Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser
515 520 525
Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu
530 535 540
Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro
545 550 555 560
Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
565 570
<210> 61
<211> 2213
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
gctctagaac tagtggatcc cccgggctgc aggaattctc taaagaagcc cctgggagca 60
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cagtggatgc agagggggca gcccttgtcc ccggagaagt atgtgaccag cgccccaatg 1680
cctgagcccc aggccccagg ccggtacttc gcccacagca tcctgaccgt gtccgaagag 1740
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gtcaccgaga ggaccgtgga caagtccacc gagggggagg tgagcgccga cgaggagggc 1860
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tacagtacca ccgtcacctt gttcaaggtg aaatgatccc aacagaagaa catcggagac 1980
cagagagagg aactcaaagg ggcgctgcct ccgggtctgg ggtcctggcc tgcgtggcct 2040
gttggcacgt gtttctcttc ccgcccggcc tccagttgtg tgctctcaca caggcttcct 2100
tctcgaccgg caggggctgg ctggcttgca ggccacgagg tgggctctac cccacactgc 2160
tttgctgtgt atacgcttgt tgccctgaaa taaatatgca cattttatcc atg 2213
<210> 62
<211> 627
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Ile Leu Gly Pro Tyr Ser Ser Gly Trp
115 120 125
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130 135 140
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu
145 150 155 160
Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val
165 170 175
Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe
180 185 190
Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe
195 200 205
Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu
210 215 220
Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys
225 230 235 240
Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro
245 250 255
Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg
260 265 270
Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln
275 280 285
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290 295 300
Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu
305 310 315 320
Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr
325 330 335
Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val
340 345 350
Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val
355 360 365
Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe
370 375 380
Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr
385 390 395 400
Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn
405 410 415
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420 425 430
Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu
485 490 495
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500 505 510
Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg
565 570 575
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580 585 590
Asp Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu Trp Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ile
595 600 605
Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe
610 615 620
Lys Val Lys
625
<210> 63
<211> 532
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Met Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ala Leu Pro Ala Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Phe Pro Gly Pro Gly Asn Ala Gln Thr Ser Val Ser
20 25 30
Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Cys
35 40 45
Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile Glu Thr Pro Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu
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Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg
165 170 175
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180 185 190
Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln
195 200 205
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210 215 220
Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp
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Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp
245 250 255
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260 265 270
Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu
275 280 285
Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr
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Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro
325 330 335
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340 345 350
Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu Asp Asn Gly Arg Ser
355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
Glu Val Thr Arg Glu Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu
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Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met Gly Thr Ala
485 490 495
Gly Leu Ser Thr Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr
500 505 510
Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln
515 520 525
Ala Thr Pro Pro
530
<210> 64
<211> 275
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Ser Ser Phe Gly Tyr Arg Thr Leu Thr Val Ala Leu Phe Thr Leu
1 5 10 15
Ile Cys Cys Pro Gly Ser Asp Glu Lys Val Phe Glu Val His Val Arg
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Pro Lys Lys Leu Ala Val Glu Pro Lys Gly Ser Leu Glu Val Asn Cys
35 40 45
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65 70 75 80
Ser Asn Ile Ser His Asp Thr Val Leu Gln Cys His Phe Thr Cys Ser
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115 120 125
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130 135 140
Leu Thr Leu Phe Leu Phe Arg Gly Asn Glu Thr Leu His Tyr Glu Thr
145 150 155 160
Phe Gly Lys Ala Ala Pro Ala Pro Gln Glu Ala Thr Ala Thr Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Ala Asp Arg Glu Asp Gly His Arg Asn Phe Ser Cys Leu Ala
180 185 190
Val Leu Asp Leu Met Ser Arg Gly Gly Asn Ile Phe His Lys His Ser
195 200 205
Ala Pro Lys Met Leu Glu Ile Tyr Glu Pro Val Ser Asp Ser Gln Met
210 215 220
Val Ile Ile Val Thr Val Val Ser Val Leu Leu Ser Leu Phe Val Thr
225 230 235 240
Ser Val Leu Leu Cys Phe Ile Phe Gly Gln His Leu Arg Gln Gln Arg
245 250 255
Met Gly Thr Tyr Gly Val Arg Ala Ala Trp Arg Arg Leu Pro Gln Ala
260 265 270
Phe Arg Pro
275
<210> 65
<211> 547
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Met Ala Thr Met Val Pro Ser Val Leu Trp Pro Arg Ala Cys Trp Thr
1 5 10 15
Leu Leu Val Cys Cys Leu Leu Thr Pro Gly Val Gln Gly Gln Glu Phe
20 25 30
Leu Leu Arg Val Glu Pro Gln Asn Pro Val Leu Ser Ala Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Phe Val Asn Cys Ser Thr Asp Cys Pro Ser Ser Glu Lys Ile Ala
50 55 60
Leu Glu Thr Ser Leu Ser Lys Glu Leu Val Ala Ser Gly Met Gly Trp
65 70 75 80
Ala Ala Phe Asn Leu Ser Asn Val Thr Gly Asn Ser Arg Ile Leu Cys
85 90 95
Ser Val Tyr Cys Asn Gly Ser Gln Ile Thr Gly Ser Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Val Tyr Gly Leu Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Pro Trp
115 120 125
Gln Pro Val Gly Gln Asn Phe Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly
130 135 140
Ser Pro Arg Thr Ser Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Trp Glu Glu Glu
145 150 155 160
Leu Ser Arg Gln Pro Ala Val Glu Glu Pro Ala Glu Val Thr Ala Thr
165 170 175
Val Leu Ala Ser Arg Asp Asp His Gly Ala Pro Phe Ser Cys Arg Thr
180 185 190
Glu Leu Asp Met Gln Pro Gln Gly Leu Gly Leu Phe Val Asn Thr Ser
195 200 205
Ala Pro Arg Gln Leu Arg Thr Phe Val Leu Pro Val Thr Pro Pro Arg
210 215 220
Leu Val Ala Pro Arg Phe Leu Glu Val Glu Thr Ser Trp Pro Val Asp
225 230 235 240
Cys Thr Leu Asp Gly Leu Phe Pro Ala Ser Glu Ala Gln Val Tyr Leu
245 250 255
Ala Leu Gly Asp Gln Met Leu Asn Ala Thr Val Met Asn His Gly Asp
260 265 270
Thr Leu Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Ala Asp Gln Glu Gly
275 280 285
Ala Arg Glu Ile Val Cys Asn Val Thr Leu Gly Gly Glu Arg Arg Glu
290 295 300
Ala Arg Glu Asn Leu Thr Val Phe Ser Phe Leu Gly Pro Ile Val Asn
305 310 315 320
Leu Ser Glu Pro Thr Ala His Glu Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Cys
325 330 335
Met Ala Gly Ala Arg Val Gln Val Thr Leu Asp Gly Val Pro Ala Ala
340 345 350
Ala Pro Gly Gln Pro Ala Gln Leu Gln Leu Asn Ala Thr Glu Ser Asp
355 360 365
Asp Gly Arg Ser Phe Phe Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Asp Gly Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Lys Ile Asp Arg Ala Thr Cys Pro Gln His Leu Lys Trp Lys Asp Lys
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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Leu Gly Val Val Thr Ile Val Leu Ala Leu Met Tyr Val Phe Arg Glu
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His Gln Arg Ser Gly Ser Tyr His Val Arg Glu Glu Ser Thr Tyr Leu
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Pro Leu Thr Ser Met Gln Pro Thr Glu Ala Met Gly Glu Glu Pro Ser
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Arg Ala Glu
545
<210> 66
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Gly Val Pro Glu Glu Leu Phe Glu Val Ser Ile Trp Pro Ser Gln Ala
1 5 10 15
Leu Val Glu Phe Gly Gln Ser Leu Val Val Asn Cys Ser Thr Thr Cys
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Pro Asp Pro Gly Pro Ser Gly Ile Glu Thr Phe Leu Lys Lys Thr Gln
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Lys Cys His Val Pro Ser Val Ala Pro Leu Glu Ser Leu Thr Leu Ala
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Ala Val Ala Ser Gln Arg Ala Glu Val Ile Ile Ser Val Arg Ala Gln
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Lys Glu Asn Asp Arg Cys Asn Ser Ser Cys His Ala Glu Leu Asp Leu
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500 505 510
Leu Phe Val Ile Ile Thr Val Ala Leu Gly Val Gly Val Ile Thr Ile
515 520 525
Ala Leu Tyr Leu Ser Tyr Arg Pro Cys Lys Val Asp Arg Arg Lys Leu
530 535 540
Leu Tyr Arg Gln Lys Glu Glu Asp Lys Glu Glu Glu Ser Gln Phe Ala
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565 570 575
Glu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
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1 5 10 15
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195 200 205
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<213> Homo sapiens
<400> 68
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
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580 585 590
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595 600 605
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675 680 685
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<211> 537
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 71
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165 170 175
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180 185 190
Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ala Leu Phe Ser Asn Val Ser Glu Ala
195 200 205
Arg Ser Leu Arg Thr Phe Asp Leu Pro Ala Thr Ile Pro Lys Leu Asp
210 215 220
Thr Pro Asp Leu Leu Glu Val Gly Thr Gln Gln Lys Leu Phe Cys Ser
225 230 235 240
Leu Glu Ala Leu Phe Pro Ala Ser Glu Ala Arg Ile Tyr Leu Glu Leu
245 250 255
Gly Gly Gln Met Pro Thr Gln Glu Ser Thr Asn Ser Ser Asp Ser Val
260 265 270
Ser Ala Thr Ala Leu Val Glu Val Thr Glu Glu Phe Asp Arg Thr Leu
275 280 285
Pro Leu Arg Cys Val Leu Glu Leu Ala Asp Gln Ile Leu Glu Thr Gln
290 295 300
Arg Thr Leu Thr Val Tyr Asn Phe Ser Ala Pro Val Leu Thr Leu Ser
305 310 315 320
Gln Leu Glu Val Ser Glu Gly Ser Gln Val Thr Val Lys Cys Glu Ala
325 330 335
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340 345 350
Pro Thr Pro Gln Val Gln Phe Thr Leu Asn Ala Ser Ser Glu Asp His
355 360 365
Lys Arg Ser Phe Phe Cys Ser Ala Ala Leu Glu Val Ala Gly Lys Phe
370 375 380
Leu Phe Lys Asn Gln Thr Leu Glu Leu His Val Leu Tyr Gly Pro Arg
385 390 395 400
Leu Asp Glu Thr Asp Cys Leu Gly Asn Trp Thr Trp Gln Glu Gly Ser
405 410 415
Gln Gln Thr Leu Lys Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Ser Pro Lys Met
420 425 430
Thr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Gly Ala Leu Leu Pro Ile Gly Val Val
435 440 445
Lys Ser Val Lys Gln Glu Met Asn Gly Thr Tyr Val Cys His Ala Phe
450 455 460
Ser Ser His Gly Asn Val Thr Arg Asn Val Tyr Leu Thr Val Leu Tyr
465 470 475 480
His Ser Gln Asn Asn Trp Thr Ile Ile Ile Leu Val Pro Val Leu Leu
485 490 495
Val Ile Val Gly Leu Val Met Ala Ala Ser Tyr Val Tyr Asn Arg Gln
500 505 510
Arg Lys Ile Arg Ile Tyr Lys Leu Gln Lys Ala Gln Glu Glu Ala Ile
515 520 525
Lys Leu Lys Gly Gln Ala Pro Pro Pro
530 535
<210> 72
<211> 527
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 72
Met Ala Pro Thr Arg Ala Arg Pro Thr Pro Pro Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Ala Val Val Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Gln Val Ser Ile His
20 25 30
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35 40 45
Ser Ser Ser Cys Ser Glu Asn Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Gln Trp
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Ser Asp Ile Gly Asp Asp Ser Lys Pro Leu Cys Phe Glu Asn Cys Gly
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Pro Ile Gln Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ile Val Leu Tyr Ser Phe Pro
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Glu Arg Val Glu Leu Asp Arg Leu Pro Thr Trp Gln Pro Val Gly Lys
115 120 125
Asn Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Asp Gly Gly Thr Pro Arg Ser Gln
130 135 140
Leu Ser Val Lys Leu Leu Arg Gly Gly Glu Val Leu His Gln Glu Pro
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Val Gly Val Asp Ser Arg Asn Pro Lys Glu Val Thr Val Thr Val Leu
165 170 175
Ala Ser Arg Asp Asp His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu
180 185 190
Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ala Leu Phe Pro Asn Val Ser Val Ile
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Arg Gln Leu Trp Thr Phe Asp Leu Pro Val Thr Glu Pro Lys Leu Asp
210 215 220
Thr Pro Asp Leu Leu Glu Val Gly Thr Val Gln Lys Val Met Cys Ser
225 230 235 240
Leu Gly Gly Leu Phe Pro Ala Ala Glu Ala Arg Ile Thr Leu Glu Leu
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Gly Gly His Thr Leu Thr Ser Lys Ser Thr Asn His Arg Asp Leu Val
260 265 270
Ser Ala Thr Ala Leu Val Thr Ala Glu Met Glu Gly Thr Gln Gln Leu
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Arg Cys Val Leu Glu Leu Ala Asp Gln Ile Leu Lys Ala Glu Arg Thr
290 295 300
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340 345 350
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Ile Ile Ile Val Val Ile Leu Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val Leu
485 490 495
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500 505 510
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<210> 73
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<213> Bos taurus
<400> 73
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Leu Cys Ser Gly Ile Cys Asn Lys Ser Gln Val Val Gly Phe Ser Asn
100 105 110
Ile Thr Val Phe Gly Phe Pro Lys Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro
115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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355 360 365
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370 375 380
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<400> 74
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115 120 125
Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val
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Pro Gly Ala Gly Pro Arg Ala Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Arg Gly
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195 200 205
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Pro Ser Leu Leu Glu Val Gly Lys Ala Glu Ile Val Ser Cys Glu Val
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245 250 255
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325 330 335
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340 345 350
Ala Pro Gly Lys Pro Ala Trp Leu Leu Phe Thr Ala Arg Glu Glu Asp
355 360 365
Asp Gly Arg Thr Leu Ser Cys Glu Ala Ser Leu Glu Val Gln Gly Gln
370 375 380
Arg Leu Val Arg Thr Thr Glu Ser Gln Leu His Val Leu Tyr Lys Pro
385 390 395 400
Arg Phe Gln Glu Ser Arg Cys Pro Gly Asn Gln Ile Trp Val Glu Gly
405 410 415
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<211> 548
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 78
Met Lys Met Leu Leu Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Ala Leu Ile Pro
1 5 10 15
Cys Pro Gly Thr Thr Glu Val Leu Phe Gln Val Ser Val His Pro Asn
20 25 30
Gln Ala Leu Val Glu Phe Gly His Ser Leu Thr Ile Asn Cys Ser Thr
35 40 45
Thr Cys Pro Asp Pro Gly Pro Ser Gly Ile Glu Thr Phe Leu Lys Lys
50 55 60
Thr Gln Leu Ser Lys Gly Ser Gln Trp Lys Glu Phe Leu Leu Glu Gly
65 70 75 80
Ile Thr Glu Asn Ser Val Leu Gln Cys Phe Phe Ser Cys Ala Gly Val
85 90 95
Gln Lys Asp Thr Ala Leu Asp Ile Thr Met Tyr Gln Pro Pro Glu Gln
100 105 110
Val Ile Leu Asp Leu Gln Pro Glu Trp Val Ala Ile Asp Glu Ala Phe
115 120 125
Thr Val Lys Cys His Val Pro Ser Val Ala Pro Leu Gln Ser Leu Thr
130 135 140
Leu Thr Leu Leu Gln Gly Asp Gln Glu Leu His Arg Lys Asp Phe Leu
145 150 155 160
Ser Leu Ser Leu Val Ser Gln Arg Ala Glu Val Thr Val Asn Val Arg
165 170 175
Ala Gln Arg Glu Asn Asp Arg His Asn Phe Ser Cys Arg Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Leu Ser Pro His Gly Gly Gly Leu Phe His Gly Ser Ser Ala Thr
195 200 205
Lys Gln Leu Arg Ile Phe Glu Phe Ser Gln Asn Pro Gln Ile Leu Val
210 215 220
Pro Ser Leu Leu Glu Val Gly Met Ala Glu Thr Met Ser Cys Glu Val
225 230 235 240
Val Arg Val Phe Pro Ala Gln Glu Ala Val Phe Arg Met Phe Leu Glu
245 250 255
Asp Gln Glu Leu Ser Pro Phe Ser Ser Trp Lys Gly Asp Ala Ala Trp
260 265 270
Ala Ser Ala Thr Ile Gln Ala Met Glu Thr Gly Asp Gln Glu Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Ser Val Gly Pro Val Glu Gln Lys Ala Arg Lys Pro Val
290 295 300
His Val Tyr Ser Phe Pro Pro Pro Val Leu Glu Ile Glu Asp Ala Tyr
305 310 315 320
Pro Gln Ala Gly Thr Asp Val Asn Val Thr Cys Ser Gly His Val Leu
325 330 335
Thr Ser Pro Ser Pro Thr Leu Arg Leu Gln Gly Ser Leu Asn Leu Ser
340 345 350
Ala Pro Gly Glu Pro Ala Trp Leu Arg Phe Thr Ala Arg Glu Glu Asp
355 360 365
Asp Gly Arg Thr Leu Ser Cys Glu Ala Ser Leu Val Val Gln Gly Gln
370 375 380
Arg Leu Val Lys Thr Thr Lys Ile Gln Leu His Val Leu Tyr Lys Pro
385 390 395 400
Arg Phe Gln Glu Ser Asp Cys Pro Gly Asn Gln Ile Trp Val Glu Gly
405 410 415
Met Asp Gln Met Leu Ala Cys Ile Pro Glu Gly Asn Pro Ile Pro Ala
420 425 430
Leu Val Cys Ile Trp Asn Gly Met Thr Phe Asp Leu Glu Val Pro Gln
435 440 445
Lys Ala Thr Gln Asn His Thr Gly Thr Tyr Ser Cys Thr Ala Thr Asn
450 455 460
Ser Leu Gly Ser Val Ser Lys Asp Ile Ala Val Leu Val Gln Gly Leu
465 470 475 480
His Glu Gly Ile Ser Ser Ser Thr Ile Phe Ile Ile Ile Ile Phe Thr
485 490 495
Leu Gly Met Ala Val Ile Thr Ile Ala Leu Tyr Leu Asn Tyr Gln Pro
500 505 510
Cys Lys Arg Asn Gly Arg Lys Arg Thr His Arg Gln Lys Glu Gln Asn
515 520 525
Lys Gly Gly Glu Arg Gln Phe Ser Asp Ile Gln Ala Glu Glu Cys His
530 535 540
Ala His Leu Cys
545
<210> 79
<211> 396
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 79
Met Gly Ala Pro Ser Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ser
1 5 10 15
Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gln Pro Trp
20 25 30
Thr Ser Asp Glu Thr Val Val Ala Gly Gly Thr Val Val Leu Lys Cys
35 40 45
Gln Val Lys Asp His Glu Asp Ser Ser Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ala
50 55 60
Gln Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Glu Lys Arg Ala Leu Arg Asp Asn Arg
65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Ser Ser Thr Pro His Glu Leu Ser Ile Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Val Ala Leu Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Thr Cys Ser Ile Phe Thr
100 105 110
Met Pro Val Arg Thr Ala Lys Ser Leu Val Thr Val Leu Gly Ile Pro
115 120 125
Gln Lys Pro Ile Ile Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Leu Arg Glu Lys Glu
130 135 140
Thr Ala Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gly Ser Lys Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Leu Thr Trp Arg Lys Gly Asp Gln Glu Leu His Gly Asp Gln Thr Arg
165 170 175
Ile Gln Glu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Phe Thr Val Ser Ser Ser Val
180 185 190
Ser Phe Gln Val Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala Asn Ile Val Cys Ser
195 200 205
Val Asn His Glu Ser Leu Lys Gly Ala Asp Arg Ser Thr Ser Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Val Leu Tyr Thr Pro Thr Ala Met Ile Arg Pro Glu Pro Ala
225 230 235 240
His Pro Arg Glu Gly Gln Lys Leu Leu Leu His Cys Glu Gly Arg Gly
245 250 255
Asn Pro Val Pro Gln Gln Tyr Val Trp Val Lys Glu Gly Ser Glu Pro
260 265 270
Pro Leu Lys Met Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ile Phe Pro Phe Leu Asn
275 280 285
Lys Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr Ala Thr Ser Asn Met Gly
290 295 300
Ser Tyr Thr Ala Tyr Phe Thr Leu Asn Val Asn Asp Pro Ser Pro Val
305 310 315 320
Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr His Ala Ile Ile Gly Gly Ile Val Ala
325 330 335
Phe Ile Val Phe Leu Leu Leu Ile Leu Leu Ile Phe Leu Gly His Tyr
340 345 350
Leu Ile Arg His Lys Gly Thr Tyr Leu Thr His Glu Ala Lys Gly Ser
355 360 365
Asp Asp Ala Pro Asp Ala Asp Thr Ala Ile Ile Asn Ala Glu Gly Gly
370 375 380
Gln Ser Gly Gly Asp Asp Lys Lys Glu Tyr Phe Ile
385 390 395
<210> 80
<211> 662
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val
1 5 10 15
Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln
20 25 30
Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr
35 40 45
Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg
50 55 60
Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr
65 70 75 80
Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile
85 90 95
Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp
100 105 110
Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val
115 120 125
Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr
130 135 140
Cys Glu Val Ser Ser Thr Asn Pro Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu
145 150 155 160
Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser
180 185 190
Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln
195 200 205
Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val
210 215 220
Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu
225 230 235 240
Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg
245 250 255
Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly
260 265 270
Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly
275 280 285
Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr
290 295 300
Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp
325 330 335
Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile
340 345 350
Gln Lys Val Gly Trp Asp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Ala Arg Cys Asn
355 360 365
Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala
370 375 380
Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His
385 390 395 400
Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro
405 410 415
Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys
420 425 430
Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser
435 440 445
Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala
450 455 460
Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met
465 470 475 480
Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu Gly Lys Ser Ala Thr Leu Arg Cys
485 490 495
Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp
500 505 510
Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro
515 520 525
Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser
530 535 540
Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser
545 550 555 560
Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu
565 570 575
Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Asp
580 585 590
Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln Arg Pro Pro Arg Thr Cys Asp Asp Thr
595 600 605
Val Thr Tyr Ser Ala Leu His Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn
610 615 620
Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu
625 630 635 640
Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp
645 650 655
Tyr Val Ile Leu Lys His
660
<210> 81
<211> 505
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 81
Gln Thr Ser Val Ser Pro Pro Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Gln Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Asp Leu Leu Gly
20 25 30
Ile Glu Thr Pro Leu Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Gly Gly Asn Asn
35 40 45
Trp Lys Val Tyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met
50 55 60
Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu
65 70 75 80
Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser
85 90 95
Trp Gln Pro Val Gly Lys Asp Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr
130 135 140
Thr Val Leu Val Glu Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg
145 150 155 160
Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Gln Leu Phe Glu Asn Thr
165 170 175
Ser Ala Pro His Gln Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro
180 185 190
Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val
195 200 205
Val Cys Ser Leu Asp Gly Leu Phe Pro Val Leu Glu Ala Gln Val His
210 215 220
Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu
245 250 255
Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Arg
260 265 270
Glu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val
275 280 285
Ile Leu Thr Lys Pro Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys
290 295 300
Cys Glu Ala His Pro Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala
305 310 315 320
Gln Pro Val Gly Pro Arg Val Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu
325 330 335
Asp Asn Gly Arg Ser Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly
340 345 350
Gln Leu Ile His Lys Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly
355 360 365
Pro Arg Leu Asp Glu Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu
370 375 380
Asn Ser Gln Gln Thr Pro Met Cys Gln Ala Ser Gly Asn Pro Leu Pro
385 390 395 400
Glu Leu Lys Cys Leu Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Val Gly Glu
405 410 415
Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala
420 425 430
Arg Ser Thr Gln Gly Glu Val Thr Arg Lys Val Thr Val Asn Val Leu
435 440 445
Ser Pro Arg Tyr Glu Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val
450 455 460
Ile Met Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Lys Tyr Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys Gly Thr Pro Met
485 490 495
Lys Pro Asn Thr Gln Ala Thr Pro Pro
500 505
<210> 82
<211> 447
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> VARIANT
<222> 12, 77, 78, 79, 80, 145, 146, 147, 155, 156, 157, 158, 159,
160, 161, 162, 163, 268, 269, 279, 282
<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 82
Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser Asn Cys Xaa Asp Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val Glu
20 25 30
Leu Ala Pro Leu Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly Lys Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val Val
50 55 60
Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu Pro Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg Arg Asp His His Gly
85 90 95
Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu
100 105 110
Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe Val
115 120 125
Leu Pro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val
130 135 140
Xaa Xaa Xaa Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
145 150 155 160
Xaa Xaa Xaa Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro
165 170 175
Thr Val Thr Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser
180 185 190
Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile
195 200 205
Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser
210 215 220
Phe Pro Ala Pro Asn Val Ile Leu Thr Lys Pro Glu Val Ser Glu Gly
225 230 235 240
Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro Arg Ala Lys Val Thr
245 250 255
Leu Asn Gly Val Pro Ala Gln Pro Leu Gly Pro Xaa Xaa Gln Leu Leu
260 265 270
Leu Lys Ala Thr Pro Glu Xaa Asn Gly Xaa Ser Phe Ser Cys Ser Ala
275 280 285
Thr Leu Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile His Lys Asn Gln Thr Arg Glu
290 295 300
Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Glu Arg Asp Cys Pro Gly
305 310 315 320
Asn Trp Thr Trp Pro Glu Asn Ser Gln Gln Thr Pro Met Cys Gln Ala
325 330 335
Trp Gly Asn Pro Leu Pro Glu Leu Lys Cys Leu Lys Asp Gly Thr Phe
340 345 350
Pro Leu Pro Ile Gly Glu Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Leu Glu Gly
355 360 365
Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Arg Ser Thr Gln Gly Glu Val Thr Arg Glu
370 375 380
Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu Ile Val Ile Ile Thr
385 390 395 400
Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Tyr
405 410 415
Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr Arg Leu Gln Gln Ala
420 425 430
Gln Lys Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln Ala Thr Pro Pro
435 440 445
<210> 83
<211> 528
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 83
Ala Pro Ala Leu Pro Arg Leu Pro Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Leu Leu Pro Gly Leu Gly Gly Ala Gln Thr Ser Val Asp Pro Ala Glu
20 25 30
Ala Ile Ile Leu Arg Gly Gly Ser Val Gln Val Asn Cys Ser Thr Ser
35 40 45
Cys Asn Gln Thr Ser Ile Phe Gly Leu Glu Thr Leu Leu Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Val Thr Ser Gly Asp Asn Trp Val Leu Phe Glu Leu Thr Asp Val
65 70 75 80
Gln Glu Asp Ser Lys Leu Ile Cys Phe Ser Asn Cys His Asp Glu Thr
85 90 95
Met Ala Pro Ile Asp Leu Thr Val Tyr Trp Phe Pro Glu Arg Val Glu
100 105 110
Leu Ala Pro Leu Pro Arg Trp Gln Pro Val Gly Glu Asn Leu Thr Met
115 120 125
Thr Cys Gln Val Ala Gly Gly Ala Pro Arg Thr Asn Leu Thr Val Val
130 135 140
Leu Leu Arg Gly Glu Glu Glu Leu Ser Arg Gln Pro Ala Val Gly Glu
145 150 155 160
Pro Ala Glu Val Thr Phe Thr Val Ala Val Gly Arg Glu Asp His Leu
165 170 175
Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Asp Leu Asp Leu Arg His Arg Gly Leu
180 185 190
Gly Leu Phe Gln Asn Ser Ser Ala Pro Arg Gln Leu Gln Thr Phe Val
195 200 205
Leu Pro Glu Thr Pro Pro Arg Leu Ala Thr Pro Pro Ile Val Glu Val
210 215 220
Gly Thr Gln Trp Ser Val Asp Cys Thr Met Asp Gly Val Phe Pro Ala
225 230 235 240
Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Ala Glu Glu Arg Leu His Ser
245 250 255
Thr Val Leu Tyr Lys Lys Asp Ser Leu Leu Ala Thr Ala Asn Val Lys
260 265 270
Ala Asn Pro Glu Asp Glu Gly Thr Gln Gln Leu Trp Cys Glu Val Thr
275 280 285
Leu Gly Asp Glu Asn Arg Arg Trp Gln Glu Asn Val Thr Phe Tyr Ser
290 295 300
Phe Pro Ala Pro Asn Leu Thr Leu Ser Glu Pro Glu Val Ser Glu Trp
305 310 315 320
Thr Thr Val Thr Val Glu Cys Glu Ala Pro Ala Gly Val Val Val Ser
325 330 335
Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Leu Ala Val Pro Arg Ala Gln Phe Gln
340 345 350
Leu Asn Ala Ser Ala Ala Asp Asn Arg Arg Ser Phe Ser Cys Ser Ala
355 360 365
Ala Leu Glu Val Ala Gly His Met Leu Gln Lys Asn Gln Thr Arg Glu
370 375 380
Leu His Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Gln Arg Asp Cys Pro Gly
385 390 395 400
Asn Trp Thr Trp Glu Glu Gly Phe His Gln Thr Leu Lys Cys Gln Ala
405 410 415
Trp Gly Asn Pro Val Pro Glu Leu Lys Cys His Arg Lys Gly Asp Asp
420 425 430
Ala Leu Leu Pro Ile Gly Asp Leu Arg Pro Val Lys Arg Glu Val Ala
435 440 445
Gly Thr Tyr Leu Cys Gln Ala Arg Ser Pro Arg Gly Glu Ile Thr Arg
450 455 460
Glu Val Val Ile Asn Val Ile Tyr His Gln Asn Asn Ile Leu Ile Ile
465 470 475 480
Ile Leu Val Thr Thr Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Ser Val Ala Ala
485 490 495
Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Gln Lys Tyr Lys Leu Gln Lys
500 505 510
Ala Gln Glu Ala Ala Ala Met Lys Leu Asn Thr Pro Ala Thr Pro Pro
515 520 525
<210> 84
<211> 535
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 84
Met Ala Leu Gly Ala Ala Pro Ala Ala Gln Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Gly Thr Leu Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ala Gly Ile Ser Ile His
20 25 30
Pro Ser Lys Ala Ile Ile Pro Arg Gly Asp Ser Leu Thr Val Asn Cys
35 40 45
Ser Asn Ser Cys Asp Gln Lys Ser Thr Phe Gly Leu Glu Thr Val Leu
50 55 60
Ile Lys Glu Glu Val Gly Arg Gly Asp Asn Trp Lys Val Phe Gln Leu
65 70 75 80
Arg Asp Val Gln Glu Asp Ile Glu Leu Phe Cys Tyr Ser Asn Cys His
85 90 95
Lys Glu Gln Thr Ile Ala Ser Met Asn Leu Thr Val Tyr Trp Phe Pro
100 105 110
Glu His Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Leu Trp Gln Pro Val Gly Glu
115 120 125
Glu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Val Ser Gly Gly Ala Pro Arg Ala His
130 135 140
Leu Ser Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Glu Glu Leu Gly Arg Gln Pro
145 150 155 160
Val Gly Lys Gly Glu Pro Ala Lys Val Met Phe Thr Val Gln Ser Arg
165 170 175
Arg Glu Asp His Gly Thr Asn Phe Ser Cys Arg Trp Glu Leu Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Gly Leu Glu Leu Phe Gln Asn Thr Ser Ala Pro Arg Lys
195 200 205
Leu Gln Thr Tyr Val Leu Pro Ser Ile Asp Pro His Leu Glu Val Pro
210 215 220
Pro Ile Val Glu Val Gly Ser Arg Trp Pro Val Asn Cys Thr Leu Asp
225 230 235 240
Gly Leu Phe Pro Ala Ser Asp Ala Lys Val Tyr Leu Val Leu Gly Asp
245 250 255
Gln Lys Leu Glu Ser Asn Ile Thr Tyr Asp Gly Asp Ser Val Leu Ala
260 265 270
Lys Ala Trp Met Glu Glu Asn Glu Glu Gly Thr His Ser Leu Lys Cys
275 280 285
Ser Val Thr Leu Gly Glu Val Ser Arg Arg Thr Gln Glu Asn Val Thr
290 295 300
Val Tyr Ser Phe Pro Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Pro Glu Val
305 310 315 320
Ser Glu Trp Thr Thr Val Thr Val Glu Cys Val Thr Arg Asp Gly Ala
325 330 335
Val Val Lys Leu Asn Gly Thr Ser Ala Val Pro Pro Gly Pro Arg Ala
340 345 350
Gln Leu Lys Leu Asn Ala Ser Ala Ser Asp His Arg Ser Asn Phe Ser
355 360 365
Cys Ser Ala Ala Leu Glu Ile Ala Gly Gln Val Val His Lys His Gln
370 375 380
Thr Leu Glu Leu His Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Gln Arg Asp
385 390 395 400
Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Gln Glu Gly Ser Glu Gln Thr Leu Lys
405 410 415
Cys Glu Ala Gln Gly Asn Pro Ile Pro Lys Leu Asn Cys Ser Arg Lys
420 425 430
Gly Asp Gly Ala Ser Leu Pro Ile Gly Asp Leu Arg Pro Val Arg Arg
435 440 445
Glu Val Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Thr Ser Ala Arg Gly Arg
450 455 460
Val Thr Arg Glu Val Val Leu Asn Val Leu His Gly Gln Asn Ile Leu
465 470 475 480
Asp Ile Val Ile Pro Val Val Ala Val Thr Leu Ile Leu Gly Ala Leu
485 490 495
Gly Thr Ala Gly Tyr Val Tyr Asn Tyr Gln Arg Lys Ile Gln Lys Tyr
500 505 510
Glu Leu Gln Lys Ala Arg Lys Ala Gln Glu Glu Ala Ala Leu Lys Leu
515 520 525
Asn Ala Gln Ser Thr Pro Pro
530 535
<210> 85
<211> 530
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 85
Met Ala Pro Gly Ala Ala Pro Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Gly Thr Leu Leu Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ile Ser Ile His
20 25 30
Pro Pro Lys Ala Ile Ile Pro Arg Gly Gly Ser Leu Arg Val Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Ser Cys Asp Arg Lys Thr Thr Phe Gly Leu Glu Thr Val Leu
50 55 60
Asn Lys Glu Glu Val Ser Arg Gly Pro Asn Trp Lys Val Phe Glu Leu
65 70 75 80
Ser Asp Val Gln Glu Glu Ile Asn Pro Leu Cys Tyr Ser Asn Cys His
85 90 95
Gly Glu Gln Ile Val Ala Ser Met Asn Leu Thr Ile Tyr Trp Phe Pro
100 105 110
Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Leu Trp Gln Pro Val Gly Glu
115 120 125
Glu Leu Asn Leu Ser Cys Gln Val Ser Gly Gly Gly Pro Arg His His
130 135 140
Leu Ser Met Val Leu Leu Arg Gly Glu Glu Glu Leu Asp Arg Gln Pro
145 150 155 160
Val Gly Lys Glu Glu Pro Ala Glu Val Thr Phe Met Val Gln Pro Arg
165 170 175
Arg Glu Asp His Gly Thr Ser Phe Ser Cys Arg Trp Glu Leu Asp Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Gly Leu Glu Leu Phe Gln Asn Thr Ser Ala Pro Arg Lys
195 200 205
Leu Gln Thr Tyr Val Leu Pro Ser Thr Asp Pro His Leu Glu Ala Pro
210 215 220
Pro Val Val Glu Val Gly Ser Arg Trp Pro Val Lys Cys Thr Leu Asp
225 230 235 240
Gly Leu Phe Pro Ala Ser Asp Ala Glu Val Tyr Val Gln Leu Gly Asp
245 250 255
Gln Lys Leu Glu Ser Asn Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Ser Val Leu Ala
260 265 270
Glu Ala Trp Thr Glu Glu Asn Glu Glu Gly Thr His Ser Leu Arg Cys
275 280 285
Ser Val Ser Leu Gly Glu Lys Ile Arg Arg Thr Arg Gly Ser Val Thr
290 295 300
Met Tyr Ser Phe Pro Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Pro Glu Val
305 310 315 320
Ser Glu Trp Thr Thr Val Thr Val Glu Cys Val Thr Arg Asp Gly Ala
325 330 335
Val Val Arg Leu Asn Gly Val Ser Ala Glu Pro Pro Gly Pro Arg Ala
340 345 350
Gln Leu Lys Leu Asn Val Ser Ala Asp Asp His Gly Ser Asn Phe Ser
355 360 365
Cys Ser Ala Ala Leu Lys Ile Ala Gly Gln Glu Val His Lys Ile Gln
370 375 380
Thr Arg Glu Leu His Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Gln Arg Asp
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Cys Leu Gly Asn Trp Thr Trp Gln Glu Gly Ser Glu Gln Thr Leu Lys
405 410 415
Cys Ala Ala Arg Gly Asn Pro Ile Pro Lys Leu Asn Cys Ser Arg Lys
420 425 430
Gly Asp Gly Ala Ser Leu Pro Ile Gly Asp Leu Arg Pro Val Thr Arg
435 440 445
Glu Val Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Trp Ala Thr Ser Ala Arg Gly Gly
450 455 460
Val Thr Arg Glu Val Val Leu Asn Val Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Leu
465 470 475 480
Asp Ile Val Ile Pro Val Val Ala Val Thr Leu Ile Leu Gly Thr Leu
485 490 495
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515 520 525
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530
<210> 86
<211> 545
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 86
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1 5 10 15
Val Ala Val Val Ile Pro Gly Pro Val Gly Ala Gln Val Ser Ile His
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Pro Thr Glu Ala Phe Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Gln Val Asn Cys
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Ser Ser Ser Cys Glu Asp Glu Asn Leu Gly Leu Gly Leu Glu Thr Asn
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Leu Ser Asp Ile Gly Glu Asp Ser Arg Pro Leu Cys Phe Glu Asn Cys
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165 170 175
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Glu Val Ser Glu Gly Asp Gln Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Gly
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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Pro
545
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<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 87
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Ala Ala Leu Gly Leu Gly Ile Leu Gly Ile Ser Ala Val Ala Leu Glu
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130 135 140
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165 170 175
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Thr Leu Gly Gly Glu Ser Arg Glu Thr Gln Glu Asn Leu Thr Val Tyr
305 310 315 320
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340 345 350
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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Gly Ala Ala Arg Leu Glu Arg Leu Gln Val Ser Arg Glu Asp Ala Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 88
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<210> 89
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<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 89
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Ala Cys Asp Leu Ser Asp Asp Ala Glu Tyr Glu Cys Gln Val Gly
115 120 125
Arg Ser Glu Leu Gly Pro Glu Leu Val Ser Pro Lys Val Ile Leu Ser
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Gly Asp Ala Lys Pro Ala Pro Asp Ile Thr Phe Ile Gln Ser Gly Arg
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Thr Ile Leu Asp Val Ser Ser Asn Val Asn Glu Gly Ser Glu Glu Lys
195 200 205
Leu Cys Ile Thr Glu Ala Glu Ala Arg Val Ile Pro Gln Ser Ser Asp
210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Leu Asn Val Lys Tyr Pro Ala Gln Lys Leu Trp Ile Glu Gly Pro Pro
450 455 460
Glu Gly Gln Tyr Ile Arg Thr Gly Thr Arg Val Arg Leu Val Cys Leu
465 470 475 480
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485 490 495
Arg Pro Val Ser Glu Pro Arg Gln Pro Gln Glu Pro Arg Arg Val Gln
500 505 510
Leu Gly Ser Val Glu Lys Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Glu Leu Val
515 520 525
Leu Ile Ile Gly Pro Pro Asp Asn Arg Ala Lys Phe Ser Cys Lys Ala
530 535 540
Gly Gln Leu Ser Ala Ser Thr Gln Leu Val Val Gln Phe Pro Pro Thr
545 550 555 560
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Leu Asn Leu Thr Cys Val Ser Ile Ser Ser Asn Pro Pro Val Asn Leu
580 585 590
Ser Trp Asp Lys Glu Gly Glu Arg Leu Glu Asp Val Ala Ala Lys Pro
595 600 605
Gln Ser Ala Pro Phe Lys Gly Ser Ala Ala Ser Arg Ser Val Phe Leu
610 615 620
Arg Val Ser Ser Arg Asp His Gly Gln Arg Val Thr Cys Arg Ala His
625 630 635 640
Ser Glu Ala Leu Arg Glu Thr Val Ser Ser Phe Tyr Arg Phe Asn Val
645 650 655
Leu Tyr Pro Pro Glu Phe Leu Gly Glu Gln Val Arg Ala Val Thr Val
660 665 670
Val Glu Gln Gly Gln Val Leu Leu Pro Val Ser Val Ser Ala Asn Pro
675 680 685
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Ala Gly Gly Pro Arg His Arg Ile Leu Ser Gly Gly Ala Leu Gln Leu
705 710 715 720
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Asn Ser Glu Gly Thr Ala Glu Ala Leu Leu Lys Leu Asp Val His Tyr
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Leu Asp Asp Met Glu Lys Val Ser Lys Gly Ser Thr Gly Arg Leu Arg
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820 825 830
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930 935 940
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1250
<210> 90
<211> 1256
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 90
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Arg Ser Glu Leu Gly Pro Glu Leu Val Ser Pro Arg Val Ile Leu Ser
130 135 140
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165 170 175
Gly Gly Ala Lys Pro Ala Pro Asp Ile Ile Phe Ile Gln Gly Gly Arg
180 185 190
Thr Val Glu Asp Val Ser Ser Ser Val Asn Glu Gly Ser Glu Glu Lys
195 200 205
Leu Phe Phe Thr Glu Ala Glu Ala Arg Val Thr Pro Gln Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Gly Gln Leu Leu Val Cys Glu Gly Ser Asn Pro Ala Leu Ala Thr
225 230 235 240
Pro Ile Lys Ala Ser Phe Thr Met Asn Ile Leu Phe Pro Pro Gly Pro
245 250 255
Pro Val Ile Asp Trp Pro Gly Leu Asn Glu Gly His Val Arg Ala Gly
260 265 270
Glu Asn Leu Glu Leu Pro Cys Ile Ala Arg Gly Gly Asn Pro Pro Ala
275 280 285
Thr Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Lys Pro Val Ser Ile Ala Trp Gly
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
Leu Leu Arg Trp Trp Leu Gly Gly Arg Gln Leu Leu Pro Thr Asp Glu
385 390 395 400
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435 440 445
Leu Asn Val Lys Tyr Pro Ala Gln Lys Leu Trp Ile Glu Gly Pro Pro
450 455 460
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565 570 575
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580 585 590
Ser Leu Asp Lys Glu Gly Glu Arg Leu Asp Asp Val Ala Ala Lys Pro
595 600 605
Gln Ser Ala Pro Phe Lys Gly Ser Ala Ala Ser Arg Ser Val Phe Leu
610 615 620
Arg Val Ser Ser Arg Asp His Gly His Arg Val Thr Cys Arg Ala His
625 630 635 640
Ser Glu Ala Leu Arg Glu Thr Val Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Asn Val
645 650 655
Leu Tyr Pro Pro Glu Phe Leu Gly Glu Gln Val Arg Ala Val Thr Val
660 665 670
Val Glu Gln Gly Gln Ala Leu Leu Pro Val Ser Val Ser Ala Asn Pro
675 680 685
Ala Pro Glu Ala Phe Asn Trp Thr Phe Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Pro
690 695 700
Ala Gly Gly Pro Arg His Arg Ile Leu Ser Gly Gly Ala Leu Gln Leu
705 710 715 720
Trp Asn Val Thr Arg Ala Asp Asp Gly Phe Tyr Gln Leu His Cys Gln
725 730 735
Asn Ser Glu Gly Thr Ala Glu Ala Leu Leu Lys Leu Asp Val His Tyr
740 745 750
Ala Pro Thr Ile Arg Ala Leu Lys Asp Pro Thr Glu Val Asn Val Gly
755 760 765
Gly Ser Val Asp Ile Val Cys Thr Val Asp Ala Asn Pro Ile Leu Pro
770 775 780
Glu Met Phe Ser Trp Glu Arg Leu Gly Glu Asp Glu Glu Glu Leu Asn
785 790 795 800
Leu Asp Asp Met Glu Lys Met Ser Lys Gly Ser Thr Gly Arg Leu Arg
805 810 815
Ile Arg Gln Ala Lys Leu Ser Gln Ala Gly Ala Tyr Gln Cys Ile Val
820 825 830
Asp Asn Gly Val Ala Pro Ala Ala Arg Gly Leu Val Arg Leu Val Val
835 840 845
Arg Phe Ala Pro Gln Val Asp His Pro Thr Pro Leu Thr Lys Val Ala
850 855 860
Ala Ala Gly Asp Ser Thr Ser Ser Ala Thr Leu His Cys Arg Ala Arg
865 870 875 880
Gly Val Pro Asn Ile Asp Phe Thr Trp Thr Lys Asn Gly Val Pro Leu
885 890 895
Asp Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Thr Glu His Lys Tyr His Gln Gly Val
900 905 910
Val His Ser Ser Leu Leu Thr Ile Ala Asn Val Ser Ala Ala Gln Asp
915 920 925
Tyr Ala Leu Phe Lys Cys Thr Ala Thr Asn Ala Leu Gly Ser Asp His
930 935 940
Thr Asn Ile Gln Leu Val Ser Ile Ser Arg Pro Asp Pro Pro Leu Gly
945 950 955 960
Leu Lys Val Val Ser Val Ser Pro His Ser Val Gly Leu Glu Trp Lys
965 970 975
Pro Gly Phe Asp Gly Gly Leu Pro Gln Arg Phe Gln Ile Arg Tyr Glu
980 985 990
Ala Leu Glu Thr Pro Gly Phe Leu Tyr Met Asp Val Leu Pro Ala Gln
995 1000 1005
Ala Thr Thr Phe Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Ser Thr Arg Tyr Arg
1010 1015 1020
Ile Trp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Leu Gly Asp Ser Gly Leu Thr Asp
1025 1030 1035 1040
Lys Gly Ile Gln Val Ser Ile Thr Thr Pro Gly Leu Asp Gln Ala Pro
1045 1050 1055
Glu Asp Thr Asp Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gln Pro Pro Gly Pro Pro
1060 1065 1070
Arg Leu Pro Leu Leu Pro Val Leu Phe Ala Val Gly Gly Leu Leu Leu
1075 1080 1085
Leu Ser Asn Ala Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Trp Arg Arg Arg Leu
1090 1095 1100
Arg Arg Leu Ala Glu Glu Ile Ser Glu Lys Thr Glu Ala Gly Ser Glu
1105 1110 1115 1120
Glu Asp Arg Ile Arg Asn Glu Tyr Glu Glu Ser Gln Trp Thr Gly Asp
1125 1130 1135
Arg Asp Thr Arg Ser Ser Thr Val Ser Thr Ala Glu Val Asp Pro His
1140 1145 1150
Tyr Tyr Ser Met Arg Asp Phe Ser Pro Gln Leu Pro Pro Thr Leu Glu
1155 1160 1165
Glu Val Ser Tyr Arg Gln Ala Phe Thr Gly Ile Glu Asp Glu Asp Met
1170 1175 1180
Ala Phe Pro Gly His Leu Tyr Asp Glu Val Glu Arg Val Tyr Gly Pro
1185 1190 1195 1200
Pro Gly Val Trp Gly Pro Leu Tyr Asp Glu Val Gln Met Asp Pro Tyr
1205 1210 1215
Asp Leu Arg Trp Pro Glu Val Lys Tyr Glu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr
1220 1225 1230
Asp Gln Val Ala Ala Asp Met Asp Ala Gly Glu Pro Gly Ser Leu Pro
1235 1240 1245
Phe Glu Leu Arg Gly His Leu Val
1250 1255
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 91
gacctgtact tcattttgga caaatcagg 29
<210> 92
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 92
gagctcaaaa ttgagtggat gatgccttgc agag 34
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 93
ggtaccactt ctctcaatcc aactttc 27
<210> 94
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 94
gtccaaaatg aagtacaggt cagccaaact agtagaggtg aacaaaagc 49
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 95
gggggacgca gggaggatgg gggtccag 28
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 96
gagctcccgt cagaacagtg tgtggtggtg 30
<210> 97
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 97
atcctccctg cgtcccccag ccaaactagt agaggtgaac aaaagc 46
<210> 98
<211> 1650
<212> DNA
<213> Unknown Organism
<220>
<221> CDS
<222> (34)..(1647)
<220>
<223> Description of Unknown Organism: ATR-IgA2 fusion
nucleotide
<400> 98
ggtaccactt ctctcaatcc aactttctaa aca atg gct tct aaa cct ttc ttg 54
Met Ala Ser Lys Pro Phe Leu
1 5
tct ctt ctt tct ttg tct ttg ctt ttg ttc acc tct act agt ttg gct 102
Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala
10 15 20
gac ctg tac ttc att ttg gac aaa tca gga agt gtg ctg cac cac tgg 150
Asp Leu Tyr Phe Ile Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp
25 30 35
aat gaa atc tat tac ttt gtg gaa cag ttg gct cac aaa ttc atc agc 198
Asn Glu Ile Tyr Tyr Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser
40 45 50 55
cca cag ttg aga atg tcc ttt att gtt ttc tcc acc cga gga aca acc 246
Pro Gln Leu Arg Met Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr
60 65 70
tta atg aaa ctg aca gaa gac aga gaa caa atc cgt caa ggc cta gaa 294
Leu Met Lys Leu Thr Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu
75 80 85
gaa ctc cag aaa gtt ctg cca gga gga gac act tac atg cat gaa gga 342
Glu Leu Gln Lys Val Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met His Glu Gly
90 95 100
ttt gaa agg gcc agt gag cag att tat tat gaa aac aga caa ggg tac 390
Phe Glu Arg Ala Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr
105 110 115
agg aca gcc agc gtc atc att gct ttg act gat gga gaa ctc cat gaa 438
Arg Thr Ala Ser Val Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu Leu His Glu
120 125 130 135
gat ctc ttt ttc tat tca gag agg gag gct aat agg tct cga gat ctt 486
Asp Leu Phe Phe Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu
140 145 150
ggt gca att gtt tac tgt gtt ggt gtg aaa gat ttc aat gag aca cag 534
Gly Ala Ile Val Tyr Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln
155 160 165
ctg gcc cgg att gcg gac agt aag gat cat gtg ttt ccc gtg aat gac 582
Leu Ala Arg Ile Ala Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro Val Asn Asp
170 175 180
ggc ttt cag gct ctg caa ggc atc atc cac tca att ttg agc tct gct 630
Gly Phe Gln Ala Leu Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Ser Ser Ala
185 190 195
tcc cca acc agc cct aag gtc ttc cct ctc agc ctt gac agc acc cct 678
Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro
200 205 210 215
caa gat ggt aat gtt gtc gtt gct tgc ctt gtc cag ggt ttc ttc cct 726
Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro
220 225 230
cag gag cca ctc tct gtt acc tgg tct gaa tct gga cag aat gtt acc 774
Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr
235 240 245
gcc aga aac ttc cca cct agc cag gat gcc tcc ggt gac ctc tac acc 822
Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr
250 255 260
acc agc tct cag ctc acc ctt cca gcc acc cag tgc cca gat ggt aag 870
Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys
265 270 275
tcc gtt acc tgc cat gtt aag cac tac acc aac tcc agc cag gat gtt 918
Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp Val
280 285 290 295
act gtt cca tgc cgt gtt cca cca cct cca cca tgc tgc cac cca cgt 966
Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Arg
300 305 310
ctc tct ctt cac cgt cct gcc ctt gag gac ttg ctc ttg ggt tct gaa 1014
Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu
315 320 325
gct aac ctc acc tgc acc ctc acc ggt ctc aga gat gcc tct ggt gcc 1062
Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala
330 335 340
acc ttc acc tgg acc cca agc tct ggt aag agc gct gtt caa gga cca 1110
Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro
345 350 355
cct gag cgt gac ctc tgt gga tgc tac tct gtt agc tct gtt ctt cct 1158
Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro
360 365 370 375
ggt tgt gcc cag cct tgg aac cac ggt gag acc ttc acc tgc act gct 1206
Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala
380 385 390
gcc cac cca gag ttg aag acc cca ctt acc gcc aac atc acc aag tcc 1254
Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser
395 400 405
gga aac acc ttc cgt ccc gag gtc cac ctc ttg cca cca cca tct gag 1302
Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu
410 415 420
gag ctt gcc ctc aat gag ctt gtt acc ctc acc tgc ctt gct cgt gga 1350
Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly
425 430 435
ttc agc cca aag gat gtt ctt gtt agg tgg ctt cag gga tct cag gag 1398
Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu
440 445 450 455
ctt cca cgt gag aag tac ctc act tgg gct tcc cgt cag gag cca agc 1446
Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser
460 465 470
cag gga act acc acc tac gct gtt acc agc atc ctt cgt gtt gct gct 1494
Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala
475 480 485
gag gac tgg aag aag ggt gag acc ttc tcc tgc atg gtt ggt cac gag 1542
Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu
490 495 500
gcc ctt cca ctt gcc ttc acc cag aag acc att gat cgt ttg gct gga 1590
Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly
505 510 515
aag cca acc cac atc aat gtt tct gtt gtc atg gct gag gct gat gga 1638
Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly
520 525 530 535
acc tgc tac taa 1650
Thr Cys Tyr
<210> 99
<211> 538
<212> PRT
<213> Unknown Organism
<220>
<223> Description of Unknown Organism: ATR-IgA2 fusion
amino acid
<400> 99
Met Ala Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala Asp Leu Tyr Phe Ile Leu Asp Lys Ser
20 25 30
Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr Phe Val Glu Gln
35 40 45
Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met Ser Phe Ile Val
50 55 60
Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr Glu Asp Arg Glu
65 70 75 80
Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val Leu Pro Gly Gly
85 90 95
Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser Glu Gln Ile Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val Ile Ile Ala Leu
115 120 125
Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr Ser Glu Arg Glu
130 135 140
Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr Cys Val Gly Val
145 150 155 160
Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala Asp Ser Lys Asp
165 170 175
His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu Gln Gly Ile Ile
180 185 190
His Ser Ile Leu Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro
195 200 205
Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys
210 215 220
Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp
245 250 255
Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala
260 265 270
Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr
275 280 285
Thr Asn Ser Ser Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro
290 295 300
Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu
305 310 315 320
Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly
325 330 335
Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly
340 345 350
Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr
355 360 365
Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly
370 375 380
Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu
385 390 395 400
Thr Ala Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His
405 410 415
Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr
420 425 430
Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg
435 440 445
Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp
450 455 460
Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr
465 470 475 480
Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe
485 490 495
Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys
500 505 510
Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val
515 520 525
Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr
530 535
<210> 100
<211> 6602
<212> DNA
<213> Unknown Organism
<220>
<223> Description of Unknown Organism:
pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2
<400> 100
ctggccggcg ccagatctgg ggaacctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg 60
ataaaccttt tcacgccctt ttaaatatcc gattattcta ataaacgctc ttttctctta 120
ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga 180
caatctgatc atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gaccccgccg atgacgcggg 240
acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc actcagccga 300
tctgaattca ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt 360
caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg 420
gtttcggttc attctaatga atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt 480
ctccgttcaa tttactgatt gtaccctact acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca 540
atatattgtg ctgaataggt ttatagcgac atctatgata gagcgccaca ataacaaaca 600
attgcgtttt attattacaa atccaatttt gagctcggcg cgccagctgg acatcatgtt 660
ggatatgaaa caactattat ttatctacat gttttagatg ttatctgatt atttttatac 720
gtagtcttct attgatgagg agtctaaggc tatagaatta tatatctaaa tgattaatat 780
atatattatt aataattaac aataattaat atattataat ttatatatat atattttata 840
ttattataat aatattctta caaatataat tattatattc gacggtatcg gggcaattgt 900
attcgacggt atcgcgataa gctcgcggat ccctgaaagc gacgttggat gttaacatct 960
acaaattgcc ttttcttatc gaccatgtac gtaagcgctt acgtttttgg tggacccttg 1020
aggaaactgg tagctgttgt gggcctgtgg tctcaagatg gatcattaat ttccaccttc 1080
acctacgatg gggggcatcg caccggtgag taatattgta cggctaagag cgaatttggc 1140
ctgtaggatc cctgaaagcg acgttggatg ttaacatcta caaattgcct tttcttatcg 1200
accatgtacg taagcgctta cgtttttggt ggacccttga ggaaactggt agctgttgtg 1260
ggcctgtggt ctcaagatgg atcattaatt tccaccttca cctacgatgg ggggcatcgc 1320
accggtgagt aatattgtac ggctaagagc gaatttggcc tgtaggatcc ctgaaagcga 1380
cgttggatgt taacatctac aaattgcctt ttcttatcga ccatgtacgt aagcgcttac 1440
gtttttggtg gacccttgag gaaactggta gctgttgtgg gcctgtggtc tcaagatgga 1500
tcattaattt ccaccttcac ctacgatggg gggcatcgca ccggtgagta atattgtacg 1560
gctaagagcg aatttggcct gtaggatccg cgagctggtc aatcccattg cttttgaagc 1620
agctcaacat tgatctcttt ctcgatcgag ggagattttt caaatcagtg cgcaagacgt 1680
gacgtaagta tccgagtcag tttttatttt tctactaatt tggtcgttta tttcggcgtg 1740
taggacatgg caaccgggcc tgaatttcgc gggtattctg tttctattcc aactttttct 1800
tgatccgcag ccattaacga cttttgaata gatacgctga cacgccaagc ctcgctagtc 1860
aaaagtgtac caaacaacgc tttacagcaa gaacggaatg cgcgtgacgc tcgcggtgac 1920
gccatttcgc cttttcagaa atggataaat agccttgctt cctattatat cttcccttaa 1980
ttaaggtacc acttctctca atccaacttt ctaaacaatg gcttctaaac ctttcttgtc 2040
tcttctttct ttgtctttgc ttttgttcac ctctactagt ttggctgacc tgtacttcat 2100
tttggacaaa tcaggaagtg tgctgcacca ctggaatgaa atctattact ttgtggaaca 2160
gttggctcac aaattcatca gcccacagtt gagaatgtcc tttattgttt tctccacccg 2220
aggaacaacc ttaatgaaac tgacagaaga cagagaacaa atccgtcaag gcctagaaga 2280
actccagaaa gttctgccag gaggagacac ttacatgcat gaaggatttg aaagggccag 2340
tgagcagatt tattatgaaa acagacaagg gtacaggaca gccagcgtca tcattgcttt 2400
gactgatgga gaactccatg aagatctctt tttctattca gagagggagg ctaataggtc 2460
tcgagatctt ggtgcaattg tttactgtgt tggtgtgaaa gatttcaatg agacacagct 2520
ggcccggatt gcggacagta aggatcatgt gtttcccgtg aatgacggct ttcaggctct 2580
gcaaggcatc atccactcaa ttttgagctc tgcttcccca accagcccta aggtcttccc 2640
tctcagcctt gacagcaccc ctcaagatgg taatgttgtc gttgcttgcc ttgtccaggg 2700
tttcttccct caggagccac tctctgttac ctggtctgaa tctggacaga atgttaccgc 2760
cagaaacttc ccacctagcc aggatgcctc cggtgacctc tacaccacca gctctcagct 2820
cacccttcca gccacccagt gcccagatgg taagtccgtt acctgccatg ttaagcacta 2880
caccaactcc agccaggatg ttactgttcc atgccgtgtt ccaccacctc caccatgctg 2940
ccacccacgt ctctctcttc accgtcctgc ccttgaggac ttgctcttgg gttctgaagc 3000
taacctcacc tgcaccctca ccggtctcag agatgcctct ggtgccacct tcacctggac 3060
cccaagctct ggtaagagcg ctgttcaagg accacctgag cgtgacctct gtggatgcta 3120
ctctgttagc tctgttcttc ctggttgtgc ccagccttgg aaccacggtg agaccttcac 3180
ctgcactgct gcccacccag agttgaagac cccacttacc gccaacatca ccaagtccgg 3240
aaacaccttc cgtcccgagg tccacctctt gccaccacca tctgaggagc ttgccctcaa 3300
tgagcttgtt accctcacct gccttgctcg tggattcagc ccaaaggatg ttcttgttag 3360
gtggcttcag ggatctcagg agcttccacg tgagaagtac ctcacttggg cttcccgtca 3420
ggagccaagc cagggaacta ccacctacgc tgttaccagc atccttcgtg ttgctgctga 3480
ggactggaag aagggtgaga ccttctcctg catggttggt cacgaggccc ttccacttgc 3540
cttcacccag aagaccattg atcgtttggc tggaaagcca acccacatca atgtttctgt 3600
tgtcatggct gaggctgatg gaacctgcta ctaagatctg tgaattcctg cagcccgggg 3660
gatccactag ttctagctag agcggccgcc accgcggtgg cgaattaaca gaggtggatg 3720
gacagacccg ttcttacacc ggactgggcg cgggatagga tattcagatt gggatgggat 3780
tgagcttaaa gccggcgctg agaccatgct caaggtaggc aatgtcctca gcgtcgagcc 3840
cggcatctat gtcgagggca ttggtggagc gcgcttcggg gataccgtgc ttgtaactga 3900
gaccggatat gaggccctca ctccgcttga tcttggcaaa gatatttgac gcatttatta 3960
gtatgtgtta attttcattt gcagtgcagt attttctatt cgatctttat gtaattcgtt 4020
acaattaata aatattcaaa tcagattatt gactgtcatt tgtatcaaat cgtgtttaat 4080
ggatattttt attataatat tgatgataat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 4140
tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 4200
tggcgcgcca agcttcacgc tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc 4260
ggaacacgta gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact 4320
ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct 4380
tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc 4440
tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc 4500
gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atcatgagcg gagaattaag ggagtcacgt 4560
tatgaccccc gccgatgacg cgggacaagc cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca 4620
acgttgaagg agccactcag ccgcgggttt ctggagttta atgagctaag cacatacgtc 4680
agaaaccatt attgcgcgtt caaaagtcgc ctaaggtcac tatcagctag caaatatttc 4740
ttgtcaaaaa tgctccactg acgttccata aattcccctc ggtatccaat tagagtctca 4800
tattcactct caatccagat ctggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4860
aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4920
cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 4980
caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 5040
gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 5100
ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 5160
tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 5220
tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 5280
agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 5340
actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgat gatctcgtcg tgacccatgg 5400
cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 5460
tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 5520
tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 5580
cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 5640
aggatccccc gatgagctaa gctagctata tcatcaattt atgtattaca cataatatcg 5700
cactcagtct ttcatctacg gcaatgtacc agctgatata atcagttatt gaaatatttc 5760
tgaatttaaa cttgcatcaa taaatttatg tttttgcttg gactataata cctgacttgt 5820
tattttatca ataaatattt aaactatatt tctttcaaga tgggaattaa ttcactggcc 5880
gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 5940
gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 6000
caacagttgc gcagcctgaa tggcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 6060
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 6120
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg 6180
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 6240
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt 6300
ataagggatt ttgccgattt cggaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 6360
accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 6420
ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt 6480
gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc caccagccag 6540
ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc 6600
ag 6602
<210> 101
<211> 7129
<212> DNA
<213> Unknown Organism
<220>
<223> Description of Unknown Organism:
pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC
<400> 101
ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 60
ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 120
acacattgcg gacgttttta atgtactggg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc 180
aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg 240
gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggttc cgaaatcggc aaaatccctt 300
ataaatcaaa agaatagccc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 360
cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 420
gcccactacg tgaaccatca cccaaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac 480
taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 540
tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc cattcaggct gcgcaactgt 600
tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 660
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 720
acggccagtg aattaattcc catcttgaaa gaaatatagt ttaaatattt attgataaaa 780
taacaagtca ggtattatag tccaagcaaa aacataaatt tattgatgca agtttaaatt 840
cagaaatatt tcaataactg attatatcag ctggtacatt gccgtagatg aaagactgag 900
tgcgatatta tgtgtaatac ataaattgat gatatagcta gcttagctca tcgggggatc 960
ccggtcggca tctactctat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac 1020
tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt 1080
gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc 1140
aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc 1200
ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt 1260
agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct 1320
cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat 1380
tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc 1440
agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt 1500
cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac 1560
gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc 1620
taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga acagcgggca 1680
gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg 1740
tcaggctctc gctgaatgcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg 1800
caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca 1860
ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga 1920
gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg 1980
cggtgagttc aggctttttc atatcttatt gcccccctag agtcgagatc tggattgaga 2040
gtgaatatga gactctaatt ggataccgag gggaatttat ggaacgtcag tggagcattt 2100
ttgacaagaa atatttgcta gctgatagtg accttaggcg acttttgaac gcgcaataat 2160
ggtttctgac gtatgtgctt agctcattaa actccagaaa cccgcggctg agtggctcct 2220
tcaacgttgc ggttctgtca gttccaaacg taaaacggct tgtcccgcgt catcggcggg 2280
ggtcataacg tgactccctt aattctccgc tcatgatctt gatcccctgc gccatcagat 2340
ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg 2400
cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg 2460
ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca 2520
gatagccagt agctgacatt catccggggt cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac 2580
gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc cctgagtgct tgcggcagcg tgaagcttgg 2640
cgcgccagct ggacatcatg ttggatatga aacaactatt atttatctac atgttttaga 2700
tgttatctga ttatttttat acgtagtctt ctattgatga ggagtctaag gctatagaat 2760
tatatatcta aatgattaat atatatatta ttaataatta acaataatta atatattata 2820
atttatatat atatatttta tattattata ataatattct tacaaatata attattatat 2880
tcgacggtat cggggcaatt gattcccgat cctatctgtc acttcatcaa aaggacagta 2940
gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa 3000
gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa 3060
aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac 3120
gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt 3180
tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaag gtaccatggt 3240
gctcttcgtg ctcacctgcc tgctggcggt cttcccagcc atctccacga agagtcccat 3300
atttggtccc gaggaggtga atagtgtgga aggtaactca gtgtccatca cgtgctacta 3360
cccacccacc tctgtcaacc ggcacacccg gaagtactgg tgccggcagg gagctagagg 3420
tggctgcata accctcatct cctcggaggg ctacgtctcc agcaaatatg caggcagggc 3480
taacctcacc aacttcccgg agaacggcac atttgtggtg aacattgccc agctgagcca 3540
ggatgactcc gggcgctaca agtgtggcct gggcatcaat agccgaggcc tgtcctttga 3600
tgtcagcctg gaggtcagcc agggtcctgg gctcctaaat gacactaaag tctacacagt 3660
ggacctgggc agaacggtga ccatcaactg ccctttcaag actgagaatg ctcaaaagag 3720
gaagtccttg tacaagcaga taggcctgta ccctgtgctg gtcatcgact ccagtggtta 3780
tgtgaatccc aactatacag gaagaatacg ccttgatatt cagggtactg gccagttact 3840
gttcagcgtt gtcatcaacc aactcaggct cagcgatgct gggcagtatc tctgccaggc 3900
tggggatgat tccaatagta ataagaagaa tgctgacctc caagtgctaa agcccgagcc 3960
cgagctggtt tatgaagacc tgaggggctc agtgaccttc cactgtgccc tgggccctga 4020
ggtggcaaac gtggccaaat ttctgtgccg acagagcagt ggggaaaact gtgacgtggt 4080
cgtcaacacc ctggggaaga gggccccagc ctttgagggc aggatcctgc tcaaccccca 4140
ggacaaggat ggctcattca gtgtggtgat cacaggcctg aggaaggagg atgcagggcg 4200
ctacctgtgt ggagcccatt cggatggtca gctgcaggaa ggctcgccta tccaggcctg 4260
gcaactcttc gtcaatgagg agtccacgat tccccgcagc cccactgtgg tgaagggggt 4320
ggcaggaagc tctgtggccg tgctctgccc ctacaaccgt aaggaaagca aaagcatcaa 4380
gtactggtgt ctctgggaag gggcccagaa tggccgctgc cccctgctgg tggacagcga 4440
ggggtgggtt aaggcccagt acgagggccg cctctccctg ctggaggagc caggcaacgg 4500
caccttcact gtcatcctca accagctcac cagccgggac gccggcttct actggtgtct 4560
gaccaacggc gatactctct ggaggaccac cgtggagatc aagattatcg aaggagaacc 4620
aaacctcaag gttcccggga atgtcacggc tgtgctggga gagactctca aggtcccctg 4680
tcactttcca tgcaaattct cctcgtacga gaaatactgg tgcaagtgga ataacacggg 4740
ctgccaggcc ctgcccagcc aagacgaagg ccccagcaag gccttcgtga actgtgacga 4800
gaacagccgg cttgtctccc tgaccctgaa cctggtgacc agggctgatg agggctggta 4860
ctggtgtgga gtgaagcagg gccacttcta tggagagact gcagccgtct atgtggcagt 4920
tgaagagagg aaggcagcgg ggtcccgcga tgtcagccta gcgaaggcag acgctgctcc 4980
tgatgagaag gtgctagact ctggttttcg ggagattgag aacaaagcca ttcaggatcc 5040
caggcttttt gcagagtgaa ttcgttcgta tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc 5100
aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg agttcgagta ttatggcatt 5160
gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg 5220
gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 5280
ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 5340
tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 5400
cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg tagttgtcga cggtatcgat 5460
attaattccc gatcctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac 5520
ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcatt caagatgcct ctgccgacag 5580
tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 5640
cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 5700
atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 5760
gacacgctga aatcaccagt ctctctctag agtaccatgg agaaccattt gcttttctgg 5820
ggagtcctgg cggtttttat taaggctgtt catgtgaaag cccaagaaga tgaaaggatt 5880
gttcttgttg acaacaaatg taagtgtgcc cggattactt ccaggatcat ccgttcttcc 5940
gaagatccta atgaggacat tgtggagaga aacatccgaa ttattgttcc tctgaacaac 6000
agggagaata tctctgatcc cacctcacca ttgagaacca gatttgtgta ccatttgtct 6060
gacctctgta aaaaatgtga tcctacagaa gtggagctgg ataatcagat agttactgct 6120
acccagagca atatctgtga tgaagacagt gctacagaga cctgctacac ttatgacaga 6180
aacaagtgct acacagctgt ggtcccactc gtatatggtg gtgagaccaa aatggtggaa 6240
acagccttaa ccccagatgc ctgctatcct gactgaatcc gcggcgatga gctaagctag 6300
ctatatcatc aatttatgta ttacacataa tatcgcactc agtctttcat ctacggcaat 6360
gtaccagctg atataatcag ttattgaaat atttctgaat ttaaacttgc atcaataaat 6420
ttatgttttt gcttggacta taatacctga cttgttattt tatcaataaa tatttaaact 6480
atatttcttt caagagctca aaattggatt tgtaataata aaacgcaatt gtttgttatt 6540
gtggcgctct atcatagatg tcgctataaa cctattcagc acaatatatt gttttcattt 6600
taatattgta catataagta gtagggtaca atcagtaaat tgaacggaga atattattca 6660
taaaaatacg atagtaacgg gtgatatatt cattagaatg aaccgaaacc ggcggtaagg 6720
atctgagcta cacatgctca ggttttttac aacgtgcaca acagaattga aagcaaatat 6780
catgcgatca taggcgtctc gcatatctca ttaaagcagt gaattcagat cggctgagtg 6840
gctccttcaa cgttgcggtt ctgtcagttc caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc 6900
ggcggggtca taacgtgact cccttaattc tccgctcatg atcagattgt cgtttcccgc 6960
cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag 7020
agcgtttatt agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca 7080
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<210> 102
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Thr Glu Ile Leu Glu Leu Gln Pro Ser Ser Val Cys Val Gly
1 5 10
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 103
actgaaatcc tagaattgca gccctcaagt gtctgtgtgg gg 42
<210> 104
<211> 38
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 104
Asn Thr Phe Phe Arg Asn Cys Thr Phe Ile Asn Thr Val Phe Tyr Asn
1 5 10 15
Thr Asp Leu Phe Glu Tyr Lys Phe Val Asn Ser Arg Leu Val Asn Ser
20 25 30
Thr Phe Leu His Asn Lys
35
<210> 105
<211> 38
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 105
Asp Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ile Glu Ser Thr Thr Phe Tyr Asn
1 5 10 15
Thr Asp Leu Tyr Lys His Lys Phe Ile Asp Cys Arg Phe Ile Asn Ser
20 25 30
Thr Phe Leu Glu Gln Lys
35
<210> 106
<211> 38
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 106
Asn Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Phe Ile Asp Thr Leu Phe Glu Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Gln Asn Cys
20 25 30
Ser Phe Leu His Asn Lys
35
<210> 107
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Gln Lys Phe Met
1 5 10 15
Asn Glu Leu His Lys
20
<210> 108
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Phe Phe
1 5 10 15
Asn Glu Ile Asn Lys Cys
20
<210> 109
<211> 531
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Gln Glu Gln Pro Ser Cys Arg Arg Ala Phe Asp Leu Tyr Phe Val Leu
1 5 10 15
Asp Lys Ser Gly Ser Val Ala Asn Asn Trp Ile Glu Ile Tyr Asn Phe
20 25 30
Val Gln Gln Leu Ala Glu Arg Phe Val Ser Pro Glu Met Arg Leu Ser
35 40 45
Phe Ile Val Phe Ser Ser Gln Ala Thr Ile Ile Leu Pro Leu Thr Gly
50 55 60
Asp Arg Gly Lys Ile Ser Lys Gly Leu Glu Asp Leu Lys Arg Val Ser
65 70 75 80
Pro Val Gly Glu Thr Tyr Ile His Glu Gly Leu Lys Leu Ala Asn Glu
85 90 95
Gln Ile Gln Lys Ala Gly Gly Leu Lys Thr Ser Ser Ile Ile Ile Ala
100 105 110
Leu Thr Asp Gly Lys Leu Asp Gly Leu Val Pro Ser Tyr Ala Glu Lys
115 120 125
Glu Ala Lys Ile Ser Arg Ser Leu Gly Ala Ser Val Tyr Cys Val Gly
130 135 140
Val Leu Asp Phe Glu Gln Ala Gln Leu Glu Arg Ile Ala Asp Ser Lys
145 150 155 160
Glu Gln Val Phe Pro Val Lys Gly Gly Phe Gln Ala Leu Lys Gly Ile
165 170 175
Ile Asn Ser Ile Leu Ala Gln Ser Cys Thr Glu Ile Leu Glu Leu Gln
180 185 190
Pro Ser Ser Val Cys Val Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
195 200 205
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
210 215 220
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
245 250 255
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
260 265 270
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
275 280 285
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
290 295 300
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
305 310 315 320
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
325 330 335
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
340 345 350
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
355 360 365
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
370 375 380
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
385 390 395 400
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
405 410 415
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
420 425 430
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
435 440 445
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
450 455 460
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
465 470 475 480
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
485 490 495
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
500 505 510
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
515 520 525
Pro Gly Lys
530
<210> 110
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Leu Ala Gln Ser Cys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
35 40 45
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
50 55 60
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
85 90 95
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
100 105 110
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
130 135 140
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
145 150 155 160
Pro Glu Val Lys Phe Asn
165
<210> 111
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Leu Ala Gln Ser Cys Thr Glu Ile Leu Glu Leu Gln Pro Ser Ser Val
1 5 10 15
Cys Val Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
20 25 30
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35 40 45
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
50 55 60
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
65 70 75 80
Phe Asn
<210> 112
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Leu Ala Gln Ser Cys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
35 40 45
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
50 55 60
Val Lys Phe Asn
65
<210> 113
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Leu Ala Gln Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
20 25 30
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
35 40 45
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
50 55 60
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
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Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
100 105 110
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
115 120 125
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Gly Asp Arg Gly Lys Ile Ser Lys Gly Leu Glu Asp Leu Lys Arg Val
65 70 75 80
Ser Pro Val Gly Glu Thr Tyr Ile His Glu Gly Leu Lys Leu Ala Asn
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195 200 205
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
210 215 220
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
275 280 285
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
290 295 300
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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355 360 365
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
385 390 395 400
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
405 410 415
Ser Pro Gly Lys
420
Claims (84)
- 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체;및 면역글로불린 중쇄 또는 이의 부분과 공유결합적으로 연결된 것인, 본 빌레브랜트 인자 타입 A/인테그린 삽입(VWA/I) 도메인의 C-말단을 넘어 연장되지 않은 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2) 탄저 독소 수용체 단백질을 포함하는 키메라 독소 수용체 단백질로서, 상기 면역글로불린 중쇄는 IgA, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 면역글로불린 중쇄의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 복합체; 및 서열번호 102번의 아미노산 잔기가 결여된 모세혈관 형태형성 단백질 2(CMG2) 탄저 독소 수용체 단백질을 포함하는 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가의 제1항의 키메라 독소 수용체와 이량체 형태인 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 복합체는 적어도 면역글로불린 경쇄의 부분을 더 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IgG 중쇄 또는 이의 일부 및 서열번호 102번의 아미노산 잔기가 결여된 CMG2 탄저 독소 수용체 단백질이 (Gly3Ser)3 링커를 통해 공유결합적으로 연결된 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IgG 중쇄의 Cγ1 도메인이 제거되어 있는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 CMG2 탄저 독소 수용체 단백질과 상기 IgG 중쇄 사이에 공유결합이 면역글로불린 힌지인 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IgG 중쇄의 부분은 단지 중쇄 불변 영역 2 및 3을 포함하는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IgG 중쇄 및 탄저 독소 수용체 단백질이 인간 단백질인 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 키메라 CMG2-IgG 단백질은 서열 번호 114의 아미노산 서열을 갖는 것인 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항의 CMG2 키메라 독소 수용체 단백질 및 식물 재료를 포함하는 탄저 감염, 탄저 독소의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 식물 재료는 식물 세포 벽, 식물 소기관, 식물 세포질, 온전한 식물 세포, 식물 종자 및 생존 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 키메라 독소 수용체 단백질과 탄저 항원을 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내 탄저 항원과 숙주 세포의 결합을 감소시키는 방법으로서, 상기 키메라 독소 수용체 단백질이 상기 탄저 항원에 결합하고 상기 탄저 항원과 숙주 세포의 상기 결합을 감소시키는 것인 방법.
- 환자 또는 동물에 대한 치료제로서 사용하기 위한 제1항 또는 제2항의 키메라 독소 수용체 단백질.
- 탄저 감염, 또는 탄저 독소의 효과의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 또는 제2항의 키메라 독소 수용체 단백질.
- 제1항 또는 제2항의 CMG2 키메라 독소 수용체 단백질을 코딩하는 발현 벡터.
- 제1항 또는 제2항의 키메라 독소 수용체 단백질을 제조하는 방법으로서, 제1항 또는 제2항의 CMG2 키메라 독소 수용체 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 세포 숙주에 도입하는 단계; 및 면역글로불린 복합체 및 CMG2 탄저 독소 수용체 단백질을 발현시켜 키메라 독소 수용체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 숙주는 식물인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항의 키메라 독소 수용체 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것인 독소의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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