DE69535557T2

DE69535557T2 - Verfahren zur herstellung von schutzproteine enthaltende immunoglobuline und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69535557T2
Application number: DE69535557T
Authority: DE
Inventors: Andrew C. San Diego Hiatt; Julian K.-C. Ma; Thomas Barnet LEHNER; Keith E. San Francisco Mostov
Original assignee: Kings College London; University of California; Planet Biotechnology Inc
Current assignee: Kings College London; University of California; Planet Biotechnology Inc
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2015-12-28
Also published as: US20020159958A1; US6303341B1; DE69535557D1; DK0807173T3; EP0807173A1; AU722668B2; EP1911767A2; ATE369423T1; CA2208783A1; JPH11504901A; AU4608896A; WO1996021012A1; CA2208783C; EP1911767A3; CN1183802A; EP0807173B1; ES2292173T3

Description

Bereich der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression von Immunglobulin in Pflanzen, die ein Schutzprotein enthalten, ebenso wie eine transgene Pflanze, die solche Immunglobuline exprimiert. Die therapeutische Anwendung dieser Immunglobuline ist auch vorgesehen.
Stand der Technik
Monoklonale Antikörper besitzen bedeutendes Potenzial für eine Vielzahl therapeutischer Zwecke. Zu den Vorteilen monoklonaler Antikörper in der Therapeutik verglichen mit konventionellen pharmazeutischen Mitteln zählen deren hervorragende Wählbarkeit, Mehrfach-Effektor-Funktionen und Einfachheit bei der Manipulation wie Radioisotopen-Labelling und anderen Typen von Konjugation. Siehe zum Beispiel: Therapeutic Monoclonal Antibodies, C. A. K. Borrebaeck and J. W. Larrick Hrsg., Stockton Press, New York, 1990, und The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, M. Rosenberg and G. P. Moore Hrsg., Springer-Verlag, Berlin, 1994.
Eine therapeutische Anwendung für monoklonale Antikörper ist die passive Immuntherapie, bei der exogen erzeugte Immunglobuline direkt an das Tier, das durch Injektion oder Ingestion verabreicht werden. Um erfolgreich zu sein, muss eine passive Immuntherapie eine adäquate Menge eines Immunglobulins an das Tier abgeben, da die passive Immuntherapie nicht auf eine Immunantwort des Tieres gestützt ist, das behandelt wird. Das Immunglobulin, das verabreicht wird, muss spezifisch für den Erreger oder das gewünschte Molekül sein, um die Behandlung herbeizuführen. Ein Vorteil der passiven Immuntherapie besteht in der Geschwindigkeit, mit der die Antikörper mit verglichen mit einer normalen Immunantwort dem Ziel in Kontakt gebracht werden kann. Die passive Immuntherapie kann auch als eine Prophylaxe angewendet werden, um einem Ausbrechen von Krankheiten oder Infektionen vorzubeugen.
Eine wichtige potenzielle Anwendung der passiven Immuntherapie besteht in der Bekämpfung bakterieller Infektionen. Das jüngste Auftauchen gegen Antibiotika resistenter Bakterien macht eine Behandlung bakterieller Infektionen mit passiver Immuntherapie erwünscht. Eine Behandlung mit Antibiotika, die auf einen einzelnen Erreger ausgerichtet ist, führt häufig eine vollständige Vernichtung einer großen Population normaler Mikroorganismen mit sich, und dies kann unerwünschte Nebenwirkungen haben. Eine alternative Herangehensweise hat darin bestanden, die inhärente Spezifizität der Immunglobuline für eine Inhibition einer spezifischen pathogenen Funktion in sehr spezifischen mikrobiellen Populationen auszunutzen. In dieser Strategie würden gereinigte Immunglobuline der entsprechenden Spezifizität verabreicht, um eine passive Barriere gegen Pathogeninvasion bereitzustellen.
Darüber hinaus müssen die für passive Immuntherapien, zum Beispiel für orale Verabreichung von Immunglobulinen, bestimmte Anforderungen erfüllen. Erstens muss das Immunglobulin in sehr rauen Umgebungen, wie im Magen-Darm-Trakt, funktionell sein. Zweitens muss das Immunglobulin resistent gegen die Aktionen von Proteasen sein, so dass es vor seiner Inaktivierung des Ziels nicht abgebaut wird.
Bestimmte Zelltypen, einschließlich epithelialer Zellen und Hepatozyten, besitzen die Fähigkeit zum Zusammensetzen von Immunglobulinmolekülen, die spezifisch angepasst sind, um in rauen Umgebungen zu funktionieren. Diese Immunglobuline werden als sekretorische Immunglobuline (sIg) bezeichnet und enthalten sowohl sekretorische IgA (sIgA) als auch sekretorische IgM (sIgM). Der von endogenen sekretorischen Immunglobulinen bereitgestellte Schutz ist nachgewiesen. Mehrere Mechanismen zum Schutz vor bakterieller Infektion durch sekretorische Immunglobuline sind vorgeschlagen worden, darunter, aber nicht beschränkt auf direktes Abtöten, Agglutination, Inhibition von Epithelansatz und Epithelinvasion, Inaktivierung von Enzymen und Toxinen, Opsonisierung und Komplementaktivierung. In einem Tier sind endogen erzeugte sIgA sehr rauen Umgebungen ausgesetzt, wo eine Vielzahl von Proteasen, wie Darm- und Bakterienenzyme, extrem aktiv sind, und wo Denaturanten wie Magensäure ebenfalls vorkommen.
Ein Bestandteil von sekretorischen Immunglobulinen, die sekretorische Komponente, trägt dazu bei, das Immunglobulin gegen diese inaktivierenden Mittel zu schützen und dabei die biologische Wirksamkeit von sekretorischem Immunglobulin zu steigern.
Der Mechanismus der Synthese und das Zusammenfügen dieser sekretorischen Immunglobuline, wie sIgA und sIgM, sind extrem komplex. In Tierzellen werden sekretorische Immunglobuline in einem Prozess zusammengefügt, an dem verschiedene Zelltypen beteiligt sind. Jedes sekretorische Immunglobulin wird aus von Immunglobulin abgeleiteten schweren und leichten Ketten gebildet, die sich zu einer Kette (J-Kette) und einer sekretorischen Komponente vereinen. Die Immunglobulin produzierenden B-Zellen erzeugen von Immunglobulin abgeleitete schwere und leichte Ketten und fügen diese mit J-Ketten zusammen, um dimere oder polymere IgM oder IgA zu erzeugen. Die sekretorische Komponente wird von einem zweiten Zelltyp erzeugt, entweder epithelialen Zellen oder Hepatozyten, und sekretorisches Immunglobulin wird in diesen Zellen zusammengefügt und von diesen Zellen abgesondert. Der Mechanismus, mit dem diese Zellen das sekretorische Immunglobulin zusammenfügen und absondern, ist extrem komplex und erfordert die Bereitstellung einer einzigartigen Mikroumgebung, zum Beispiel in Form von Schleimhautgewebe. Die Mikroumgebung platziert die B-Zellen, die das polymere Immunglobulin erzeugen, in der Nähe der Zellen, die das sekretorische Immunglobulin zusammenfügen und auf die Schleimhautoberfläche eines Tieres absondern.
Die epithelialen Zellen haben einen Rezeptor, den Polyimmunglobulinrezeptor (pIgR), der spezifisch polymeres Immunglobulin/J-Kette enthaltend, erkennt und bindet, es internalisiert und durch die epitheliale Zelle transportiert. Auf die basolaterale Zelloberfläche exprimiert besitzt das pIgR ein N-Terminus-Signalpeptid von 18 Aminosäuren, einen extrazellulären Polyimmunglobulin bindenden Anteil von 629 Aminosäuren, ein Transmembransegment von 23 hydrophoben Resten und einen zytoplasmatischen Schwanz von 103 Aminosäuren. Der extrazelluläre Anteil enthält fünf Immunglobulin-artige Domänen von je 110–111 Aminosäuren und bildet die sekretierte Form des Moleküls. Siehe zum Beispiel: Mostov, Ann. Rev. Immol., 12:63–84 (1994). Die Stelle, an der der Polyimmunglobulinrezeptor gespalten ist, um reife sekretorische Komponenten zu erzeugen, ist nicht exakt festgelegt worden.
Der Polyimmunglobulinrezeptor ist auf der basolateralen Oberfläche der epithelialen Zellen von Tieren lokalisiert. Polymere, J-Ketten enthaltende Immunglobuline, die in B-Zellen erzeugt sind, interagieren mit dem Rezeptor und sind an diesen gebunden, und dies resultiert in Vesikularisierung, Transport über die epitheliale Zelle und einer ultimativen Ausscheidung auf der Schleimhautoberfläche. Der transepitheliale Transport führt auch eine Proteolyse und Phosphorylierung mit sich, um das reife SIg zu erzeugen, das die sekretorische Komponente enthält. Die enge Verbindung der erforderlichen Zellen, die in der Schleimhaut-Mikroumgebung zu finden sind, spezifisch der B-Lymphozyten und epithelialen Zellen, ist erforderlich für das Zusammenfügen des sekretorischen Immunglobulins.
Das Targeting der Erzeugung von Immunglobulinen in transgenen Organismen, wie in Mäusen, ist extrem schwierig, und transgene Organismen, die aus Pilzen oder Pflanzen erzeugt sind, enthalten nicht die passenden Zelltypen und Schleimhaut-Mikroumgebungen für die Erzeugung sekretorischer Immunglobuline. Die Erzeugung großer Mengen von sekretorischen Immunglobulinen in transgenen Organismen und Zellkultur ist vor dieser Erfindung nicht möglich gewesen. Wenn der Wunsch besteht, ein sekretorisches Immunglobulin in Zellkultur oder einem transgenen Organismus zu erzeugen, müssen die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, die von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette und die J-Kette in einem B-Lymphozyten exprimiert werden. Zur Nachahmung der sachgerechten Schleimhaut-Mikroumgebung müsste eine Zelle, die den pIgR-Rezeptor auf ihrer Oberfläche hat, auch anwesend und in enger Verbindung mit dem B-Lymphozyten sein, um überhaupt zu versuchen, ein funktional sekretorisches Immunglobulin zusammenzufügen.
Dieser aufwendige Prozess für ein natürliches Zusammenfügen von sekretorischem Immunglobulin lässt sich in Zellkultur oder transgenen Organismen extrem schwierig duplizieren. Die Produktion von sIg in Zellkultur oder transgenen Organismen würde eine Kopplung der Funktionen von Zellen, die Immunglobulin erzeugen, mit den Funktionen von epithelialen Zellen in künstlichen (in-vitro)-Systemen erfordern. Wenn es sich außerdem bei dem gewünschten transgenen Organismus um einen Pilz, eine Bakterie oder eine Pflanze handelt, sind die Zelltypen und Wege der vom Rezeptor vermittelten Internalisierung, Transzytose und Ausscheidung ganz einfach nicht vorhanden. Diesen Organismen fehlen epitheliale Zellen und die erforderliche Schleimhaut-Mikroumgebung.
Bis heute ist nur über ein Zusammenfügen von Immunglobulinen, die leichte, schwere und J-Kette in der gleichen Zelle aufweisen berichtet. Siehe: Carayannopoulos et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 91:8348–8352 (1994). Das Zusammenfügen eines Immunglobulins, das die zusätzliche Proteinkomponente, die sekretorische Komponente, innerhalb einer einzelnen Zelle aufweist, ist nicht beschrieben.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein neuartiges Verfahren für das Zusammenfügen dieser komplexen Moleküle. Anstatt den tetrameren Komplex an der Zelloberfläche durch die Interaktion eines an die Membran gebundenen Polyimmunglobulinrezeptors mit Immunglobulin zusammenzufügen, haben wir sekretorisches Immunglobulin, das aus alpha-, J- und kappa-Immunglobulin-Ketten, die mit einem von pIgR abgeleiteten Schutzprotein assoziiert waren, zusammengefügt. Diese Erfindung erzeugt transgene Pflanzen, die sekretorische Immunglobuline mit hoher Effizienz zusammenfügen. Die vorliegende Erfindung macht die passive Immuntherapie wirtschaftlich durchführbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle wie in Anspruch 1 dargelegt bereit. Bevorzugte oder fakultative Ausführungsformen der Pflanzenzellen sind in den Ansprüchen 2 bis 29 dargelegt.
Immunglobuline können ein Schutzprotein enthalten, das mit einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette mit mindestens einem Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne assoziiert ist. Immunglobuline können ferner eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit mindestens einem Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne enthalten, die mit der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette assoziiert ist.
Die Schutzproteine, wie hierin beschrieben, verleihen den Immunglobulinen, die diese Proteine enthalten, wertvolle Eigenschaften einschließlich Beständigkeit gegen chemischen und enzymatischen Abbau und Beständigkeit gegen Denaturierung. Diese Schutzproteine verbesserten die Beständigkeit der Immunglobuline gegen Umgebungsbedingungen.
Die Schutzproteine, wie hierin beschrieben, können Aminosäurereste 1 bis 606 von nativem Polyimmunglobulinrezeptor (pIgR) von jeder beliebigen Säugerart umfassen. Andere nützliche Schutzproteine umfassen Schutzproteine, die erste und zweite Anteile des pIgR-Moduls enthalten. Die ersten und zweiten Anteile sind verschieden und können alle oder Teile von: Aminosäuren 1–118 (Domäne I von Kaninchen pIgR), Aminosäuren 1 bis 223 (Domänen I und II von Kaninchen pIgR); Aminosäuren 1 bis 332 (Domänen I, II und III von Kaninchen pIgR); Aminosäuren 1 bis 441 (Domänen I, II und III von Kaninchen pIgR); Aminosäuren 1 bis 552 (Domänen I, II, III, VI und V von Kaninchen pIgR); und Aminosäuren 1 bis 606 oder 1 bis 627 von pIgR umfassen. Zusätzliche Aminosäuren, die entweder von der pIgR-Sequenz 653–755 oder von anderen Quellen abgeleitet sind, können enthalten sein, solange sie kein funktionales Transmembransegment bilden.
Immunglobuline, wie hierin beschrieben, können ein Schutzprotein aufweisen, das eine erste Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen den Aminosäureresten 1 bis 606 oder 1 bis 627 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens entspricht, und eine zweite Aminosäurerestsequenz, angrenzend an die erste Aminosäuresequenz, aufweist, wobei die Aminosäurerestsequenz dem Transmembransegment des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens entspricht.
Die zweite Aminosäurerestsequenz kann mindestens einen Anteil einer Aminosäuresequenz aufweisen, die den Aminosäureresten 655 bis 755 eines Polyimmunglobulinrezeptors entspricht. In anderen Ausführungsformen ist der zweite Aminosäurerest mindestens ein Anteil von einem oder mehreren von Folgendem: einer intrazellulären Domäne eines Polyimmunglobulinmoleküls, einer Domäne eines A-Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Superfamilie, eines Enzyms, eines Toxins oder eines Linkers.
Schutzproteine, wie hierin beschrieben, haben keinen Aminosäurerest entsprechend dem Transmembransegment des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens, sie können jedoch Aminosäurereste entsprechend der intrazellulären Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens aufweisen und sind somit Deletionsmutanten des Rezeptors.
Die Schutzproteine, wie hierin beschrieben, können von vielen Säugerarten, einschließlich Nagetieren, Menschen, Rindern, Schweinen, Geflügel, Schafen, Ziegen, Mäusen, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen abgeleitet werden.
Immunglobuline, wie hierin beschrieben, können zwei oder vier von Immunglobulin abgeleitete schwere Ketten enthalten, die eine mit dem Schutzprotein assoziierte Antigenbindungsdomäne aufweisen, und zwei oder vier von Immunglobulin abgeleitete leichte Ketten, die an jede der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten gebunden sind.
Immunglobuline, wie hierin beschrieben, umfassen ferner eine Immunglobulin-J-Kette, die an mindestens eine der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten gebunden ist. Die Bestandteile des Immunglobulins sind vorzugsweise durch Wasserstoffbindungen, Disulfidbindungen, kovalente Bindungen, ionische Interaktionen oder Kombinationen dieser Bindungen zusammengebunden. Immunglobuline, wie hierin beschrieben, können Schutzproteine und/oder von Immunglobulin abgeleitete schwere, leichte oder J-Ketten enthalten, die frei von N-gebundenen und/oder O-gebundenen Oligosacchariden sind.
Immunglobuline, wie hierin beschrieben, können Anwendung finden als therapeutisches Immunglobulin gegen, zum Beispiel, Antigene eines pathogenen Schleimhautparasiten. In bevorzugten Ausführungsformen können die Immunglobuline Zahnkaries vorbeugen, indem sie ein Antigen von den Serotypen c, e und f von S. mutans und den Stereotypen d und g von S. sobrinus, bei Anwendung der älteren Nomenklatur: a, d, d, e, f, g und h von S. mutans binden.
Die Nukleotidsequenzen, die in den transgenen Pflanzenzellen der Erfindung enthalten sind, umfassen RNA- und geeignete DNA-Moleküle, die für Expression angeordnet sind.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung Bestandteile einer Pflanze wie einer vollständigen Pflanze. Die vorliegende Erfindung sieht die Anwendung aller Typen von Pflanzen vor, sowohl zweikeimblättrigen als auch einkeimblättrigen, einschließlich Alfalfa und Tabak.
Ebenfalls beschrieben werden Zusammensetzungen, die ein Immunglobulin und Pflanzenmakromolekülen. die von einer der Pflanzen abgeleitet sind, umfassen. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten Ribulosebiphosphatcarboxylase, Lichtsammelkomplex, Farbstoffe, sekundäre Metaboliten und Chlorophyll und ein Immunglobulin wie hierin beschrieben. Bevorzugte Zusammensetzungen haben eine Immunglobulin-Konzentration von zwischen 0,001 % und 99,9 % Masse ohne Wasser. In mehr bevorzugten Ausführungsformen liegen die in der Zusammensetzung vorliegenden Immunglobulin-Konzentrationen zwischen 0,1 % und 99 %. Andere bevorzugte Zusammensetzungen weisen Pflanzenmakromoleküle auf, die in einer Konzentration von zwischen 1 % und 99 % Masse ohne Wasser vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle gemäß der Beschreibung in Anspruch 30 bereit. Bevorzugte Aspekte des Verfahrens sind in den Ansprüchen 31 bis 38 erläutert.
Andere Verfahren umfassen ferner den Schritt, in die gleiche Pflanzenzelle einen Expressionsvektor einzubringen, der eine Nukleotidsequenz enthält, die eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette kodiert, die mindestens einen Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne enthält, die operativ mit einem transkriptionalen Promotor verknüpft ist. Andere bevorzugte Verfahren umfassen auch das Einbringen eines Expressionsvektors, der eine von Immunglobulin abgeleitete J-Kette kodiert, die mindestens einen Abschnitt einer operativ mit einem transkriptionalen Promotor verknüpften Antigenbindungsdomäne enthält, in eine Pflanzenzelle.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung zusammengefügter Immunglobuline bereit, die schwere, leichte und J-Ketten und ein Schutzprotein aufweisen, wobei Nukleotidsequenzen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, die für Expression operativ verknüpft sind für ein Kodieren einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette, die eine Antigenbindungsdomäne aufweist, einer von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette, die eine Antigenbindungsdomäne aufweist, und einer Immunglobulin-J-Kette und einem Schutzprotein wie hierin beschrieben. Das Verfahren umfasst außerdem ein Beibehalten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Herstellen und Zusammenfügen der von Immunglobulin abgeleiteten schweren und leichten Ketten zusammen mit der Immunglobulin-J-Kette und dem Schutzprotein zur Bildung eines Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulins, das widerstandsfähig (d. h. stabiler) ist gegenüber verschiedenen Umgebungsbedingungen einschließlich rauer Bedingungen durch operatives Verknüpfen einer Nukleotidsequenz, die eine erwünschte Antigenbindungsdomäne, die von einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette abgeleitet ist, kodiert, mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine von einer Immunglobulins abgeleitete schwere alpha-(IgA)-Kette kodiert, um eine Nukleotidsequenz zu bilden, die eine chimäre, von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette kodiert und diese in einer transgenen Pflanzenzelle exprimiert, die außerdem mindestens ein Molekül aus nachstehender Liste Aufzählung enthält; ein Schutzprotein, wie hierin beschrieben, eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, die eine Antigenbindungsdomäne aufweist, und eine Immunglobulin-J-Kette. Das Verfahren umfasst ferner, der chimären, von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette ein Zusammenfügen mit den anderen, in der gleichen Zelle vorhandenen Molekülen zu ermöglichen, um ein Immunglobulin zu bilden, das widerstandsfähig (d. h. stabiler) gegenüber verschiedenen Umgebungsbedingungen ist.
Ein bevorzugtes Verfahren gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist dargelegt in Anspruch 7. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren gemäß der Darlegung in Anspruch 48 bereit.
Die großtechnische Produktion der hierin beschriebenen Immunglobuline wird bereitgestellt durch Züchten der Pflanzen der vorliegenden Erfindung und Extrahieren der Immunglobuline aus diesen Pflanzen. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Immunglobulinzusammensetzungen bereit, die Pflanzenmakromoleküle enthalten, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, unter Druck einen Teil einer Pflanze der vorliegenden Erfindung zu scheren, um eine Pulpe zu produzieren, die ein therapeutisches Immunglobulin und Pflanzenmakromoleküle in einer Flüssigkeit, die von dem Apoplast oder Symplast der Pflanze abgeleitet ist, und festes, von der Pflanze erlangtes Material enthält. In bevorzugten Aspekten umfasst das Verfahren weitere Verarbeitungsschritte wie Trennens des festen, von der Pflanze erlangten Materials von der Flüssigkeit. Ein Teil der Pflanze, einschließlich einem Blatt, einem Stiel, einer Wurzel, einer Knolle, einer Blüte, einer Frucht, eines Samens oder der ganzen Pflanze kann verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Anwendung einer mechanischen Vorrichtung oder eines enzymatischen Verfahrens, wobei Flüssigkeit von dem Apoplast oder Symplast der Pflanze freigesetzt wird, und dem fakultativ eine Trennung mittels Zentrifugierung, Ablagerung, Ausflockung oder Filtration folgt.
Immunglobuline innerhalb der verschiedenen Aspekte der Erfindung können chimär sein, und somit enthalten sie Immunglobulindomänen, die von verschiedenen Immunglobulinmolekülen abgeleitet sind. Solche Immunglobuline können Domänen des IgG, IgM und IgA enthalten.
Immunglobuline innerhalb der verschiedenen Aspekte der Erfindung können eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette aufweisen, die aus den Immunglobulindomänen von zwei verschiedenen Isotopen von Immunglobulin besteht. Die verwendeten Immunglobulindomänen können mindestens die C_H1-, C_H2- oder C_H3-Domäne eines IgG, IgG1, IgG2a, IgG3, IgA, IgE oder IgD der Maus oder die Cvar-Domäne umfassen. In anderen Ausführungsformen können die von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten mindestens die Cμ1-, Cμ2-, Cμ3- oder Cμ4-Domäne des IgM der Maus umfassen.
Von Immunglobulinen abgeleitete schwere Ketten können aus Immunglobulindomänen bestehen, die Folgendes umfassen: mindestens die C_H1-, C_H2- oder C_H3-Domäne des IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 oder IgD des Menschen; oder mindestens die Cμ1-, Cμ2-, Cμ3- oder Cμ4-Domäne des IgM des Menschen; oder die Cvar-Domäne. Immunglobulindomänen, die von Säugern oder Nagern abgeleitet sind, können jeden beliebigen IgG-Isotypen, jeden beliebigen IgA-Isotypen, IgE, IgM oder IgD umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch tetratransgene Pflanzen bereit, die aus Zellen bestehen, die vier verschiedene Transgene enthalten, die jedes ein verschiedenes Polypeptid eines Multipeptidmoleküls kodieren, wobei jeweils mindestens eines dieser Polypeptide miteinander verbunden sind, um ein Multipeptidmolekül zu bilden. Solche transgenen Pflanzen enthalten ein Transgen, das ein Schutzprotein wie vorher hierin beschrieben kodiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist das in den transgenen Pflanzenzellen vorhandene Schutzprotein fähig, sich mit von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten zusammenzufügen, um Immunglobuline zu bilden, die das Schutzprotein enthalten.
In bevorzugten transgenen Pflanzen exprimieren die Zellen des Organismus vier Transgene, die eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, die mindestens einen Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne aufweist, eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, die mindestens einen Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne aufweist, eine Immunglobulin-J-Kette und ein Schutzprotein, kodieren. In anderen bevorzugten transgenen Pflanzen enthalten die Zellen ein Transgen, das eine chimäre schwere Immunglobulin-Kette, eine zur Bildung einer schweren IgA-Kette abgeleitete schwere Immunglobulin-Kette, ein von einer schweren IgA-Kette abgeleitetes Immunglobulin oder ein von einigen anderen Isotypen von schweren Ketten abgeleitetes Immunglobulin enthält.
Weitere Ausführungsformen von transgenen Pflanzen der Erfindung sind in den Ansprüchen 50 bis 58 dargelegt. Verschiedene Gattungen und Arten von Pflanzen sind durch die vorliegende Erfindung vorgesehen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Zuerst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
1 zeigt die synthetischen Oligonukleotide J1–J5 (die Stellen der Restriktionsenzyme sind unterstrichen), die benutzt wurden, um DNA-Fragmente für Guy's 13 und alpha-Kettendomänen bei der Konstruktion der schweren Hybrid-IgG/A-Ketten zu verstärken. Die relativen Positionen der vom jeweiligen Oligonukleotid kodierten Bereiche sind als Diagramm dargestellt. Weiterhin dargestellt sind die resultierenden rekombinanten schweren Ketten, die durch die Kombination verschiedener DNA-Fragmente, exprimiert in Pflanzen, erzeugt sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen

Dikotyl (zweikeimblättrig): Eine Blütenpflanze, deren Samen zwei Keimblätter oder Kotyledonen hat. Beispiele für Dikotyle sind: Tabak; Tomate; Leguminosen einschließlich Alfalfa; Eichen; Ahorn; Rosen; Minzen; Kürbispflanzen; Radieschen; Walnüsse; Kakteen; Veilchen und Hahnenfuß.
Monokotyl (einkeimblättrig): Eine Blütenpflanze, deren Samen ein Keimblatt hat. Beispiele für Monokotyle sind: Lilien; Gräser; Mais; Getreide einschließlich Hafer; Weizen und Gerste; Orchideen; Schwertlilien; Zwiebeln und Palmen.
Niedere Pflanzen: Jede blütenlose Pflanze einschließlich Farnen, Nacktsamer, Koniferen, Schachtelhalmen, Bärlappen, Lebermoosen, Hornmoosen, Rotalgen, Braunalgen, Gametophyten, Sporophyten von Pteridophyten und Grünalgen.
Eukaryotischer Hybridvektor: Eine DNA, mit deren Hilfe eine DNA-Kodierung für ein Polypeptid (Insert) in eine eukaryotische Zelle eingebracht werden kann.
Extrachromosomale ribosomale DNA (rDNA): Eine in einzelligen Eukaryoten außerhalb der Chromosome zu findende DNA, die ein oder mehrere Gene trägt, welche für ribosomale RNA kodieren und autonom replizieren (unabhängig von der Replikation der Chromosome).
Palindromische DNA-Sequenz: Eine DNA-Sequenz mit einer oder zwei Symmetrieachsen.
DNA: Desoxyribonukleinsäure.
T-DNA: Ein Abschnitt von transferierter DNA.
rDNA: ribosomale DNA.
RNA: Ribonukleinsäure.
rRNA: Ribosomale RNA.
Ti-Plasmid: Tumor-induzierendes Plasmid.
Ti-DNA: Ein DNA-Abschnitt von Ti-Plasmid.
Insert: Eine DNA-Sequenz, die fremd zur rDNA ist und aus einem Strukturgen und fakultativ zusätzlichen DNA-Sequenzen besteht.
Strukturgen: Ein Gen, das für ein Polypeptid kodiert und mit einem geeigneten Promotor, einer Terminierungssequenz und, fakultativ, anderen regulatorischen Sequenzen ausgestattet ist und ein passendes Leseraster aufweist.
Signalsequenz: Eine DNA-Sequenz, die für eine am Polypeptid angebrachte Aminosäuresequenz kodiert, die Polypeptid an das endoplasmatische Reticulum bindet und für die Proteinausscheidung wichtig ist.
(Selektiver) Genetischer Marker: Eine DNA-Sequenz, die für ein phänotypisches Merkmal kodiert, mit dem transformierte Zellen aus untransformierten Zellen gewählt werden können.
Promotor: Eine Erkennungsstelle auf einer DNA-Sequenz oder Gruppe von DNA-Sequenzen, der ein Expressionskontrollelement für ein Gen bereitstellt und an den RNA-Polymerase spezifisch bindet und RNA-Synthese (Transkription) dieses Gens initiiert.
Induzierbarer Promotor: Ein Promotor, bei dem die Bindungsrate der RNA-Polymerase und die Initiierung durch externe Stimuli moduliert werden. Solche Stimuli umfassen Licht, Wärme, anaerobe Spannung, Veränderung der Ernährungsbedingungen, Anwesenheit oder Fehlen von Metabolit, Anwesenheit eines Liganden, mikrobielle Angriffe, Verletzung und dergleichen.
Viraler Promotor: Ein Promotor, dessen DNA-Sequenz im Wesentlich gleich der des Promotors ist, der am 5'-Ende eines viralen Gens zu linden ist. Ein typischer viraler Promotor befindet sich am 5'-Ende des Gens, das für das p21-Protein von MMTV kodiert, wie beschrieben von Huang et al., Cell, 27:245 (1981). Andere Beispiele umfassen die Promotoren, die im 35S Transkript des Blumenkohl-Mosaik-Virus zu finden sind, wie beschrieben von Benfey et al., Science, 250:959 (1990).
Synthetischer Promotor: Ein Promotor, der chemisch synthetisiert anstatt biologisch abgeleitet ist. Gewöhnlich umfassen synthetische Promotoren Sequenzänderungen, die die Effizienz der RNA-Polymeraseinitiierung optimieren.
Konstitutiver Promotor: Ein Promotor, bei dem die Bindungsrate der RNA-Polymerase und die Initiierung konstant und relativ unabhängig von externen Stimuli sind. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen das Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S und 19S-Promotoren, beschrieben von Poszkowski et al., EMBO J., 3:2719 (1989) und Odell et al., Nature, 313:810 (1985).
Regulierter Promotor: Ein Promotor, bei dem die Bindungsrate der RNA-Polymerase und die Initiierung zu einem spezifischen Zeitpunkt während der Entwicklung oder in einer spezifischen Struktur eines Organismus moduliert werden, oder bei dem beide Typen von Modulation stattfinden. Beispiele für regulierte Promotoren sind angeführt in: Chua et al., Science, 244:174–181 (1989).
Einkettiges Antigenbindeprotein (scab-Protein): Ein Polypeptid, das zusammengesetzt ist aus einer Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Immunglobulin-Kette (V_L), die angebunden ist an eine Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Immunglobulin-Kette (V_H) durch ein Peptid, das den Carboxylterminus der VL-Sequenz mit dem Aminoterminus der VH-Sequenz verknüpft. Gewöhnlich kann jede Kombination der Antigenbindungsdomänen der schweren Kette und leichten Kette in dasselbe Polypeptid unter Anwendung eines Linker-Polypeptids eingesetzt werden, um den Bindungsdomänen zu ermöglichen, eine geeignete Konformation anzunehmen. Solche Kombinationen umfassen V_H-Linker-V_L, V_H-linear-leichte Kette oder V_L-linear-Fd.
Kodierendes Gen für einkettiges Antigenbindeprotein (scab-Protein): Ein rekombinantes Gen, das für ein einkettiges Antigenbindeprotein (scab-Protein) kodiert.
Polypeptid und Peptid: Eine lineare Serie von Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxygruppen an angrenzenden Resten miteinander verbunden sind.
Protein: Eine lineare Serie von mehr als etwa 50 Aminosäureresten, die, wie in einem Polypeptid, miteinander verbunden sind.
Immunglobulinprodukt: Ein Polypeptid oder Protein, das mindestens den immunologisch aktiven Teil einer schweren Immunglobulin-Kette enthält und somit zu einer spezifischen Kombination mit einem Antigen fähig ist. Beispielhafte Immunglobulinprodukte sind eine schwere Immunglobulin-Kette, Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle, jeder beliebige Teil eines Immunglobulins, der das Paratop aufweist, einschließlich solcher, die dem Fachmann als Fab-Fragmente, Fab'-Fragment, F(ab')₂-Fragment und Fv-Fragment bekannt sind.
Immunglobulinmolekül: Ein Protein, das die immunologisch aktiven Teile einer schweren Immunglobulin-Kette und einer leichten Immunglobulin-Kette, die kovalent aneinandergekoppelt sind und die Fähigkeit zu einer spezifischen Kombination mit Antigen besitzen.
Von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette: Ein Polypeptid, das mindestens einen Teil der Antigenbindungsdomäne eines Immunglobulins und mindestens einen Teil der variablen Region einer schweren Immunglobulin-Kette oder mindestens einen Teil der konstanten Region einer schweren Immunglobulin-Kette enthält. Demzufolge weist die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette signifikante Regionen von Aminosäuresequenz-Homologie mit einem Mitglied der Immunglobulin-Gen-Superfamilie auf. Zum Beispiel handelt es sich bei der schweren Kette in einem Fab-Fragment um eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette.
Von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette: Ein Polypeptid, das mindestens einen Teil der Antigenbindungsdomäne eines Immunglobulins und mindestens einen Teil der variablen Region einer leichten Immunglobulin-Kette oder mindestens einen Teil der konstanten Region einer leichten Immunglobulin-Kette enthält. Demzufolge weist die von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette signifikante Regionen von Aminosäuresequenz-Homologie mit einem Mitglied der Immunglobulin-Gen-Superfamilie auf.
Antigenbindungsdomäne: Der Teil eines Immunglobulin-Polypeptids, der spezifisch an das Antigen bindet. Dieses Antigen ist typischerweise durch Antigenbindungsdomänen der schweren und leichten Immunglobulin-Ketten gebunden. Antigenbindungsdomänen können allerdings bei einem einzelnen Polypeptid vorhanden sein.
J-Kette: Ein Polypeptid, das an der Polymerisierung der Immunglobuline und am Transport von polymerisierten Immunglobulinen durch epitheliale Zellen beteiligt ist. Siehe: The Immunglobulin Helper: The J Chain in Immunoglobulin Genes, auf Seite 345, Academic Press (1989). Die J-Kette ist zu finden in pentamerem IgM und dimerem IgA und typischerweise über Disulfidbindungen angehängt. Die J-Kette ist bei sowohl Maus als auch Mensch untersucht worden.
Fab-Fragment: Ein Protein bestehend aus dem Teil eines Immunglobulinmoleküls, der die immunologisch aktiven Teile einer schweren Immunglobulin-Kette und einer leichten Immunglobulin-Kette, die kovalent aneinandergekoppelt sind und die Fähigkeit zu einer spezifischen Kombination mit Antigen besitzen. Fab-Fragmente werden typischerweise zubereitet durch proteolytischen Verdau von im Wesentlichen intakten Immunglobulinmolekülen mit Papain mithilfe von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Ein Fab-Fragment kann jedoch auch durch Expression der erwünschten Anteile der schweren Immunglobulin-Kette und einer leichten Immunglobulin-Kette in eine geeignete Wirtszelle nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren zubereitet werden.
F_v-Fragment: Ein Protein bestehend aus den immunologisch aktiven Teilen der variablen Region einer schweren Immunglobulin-Kette und der variablen Region einer leichten Immunglobulin-Kette, die kovalent aneinandergekoppelt sind und die Fähigkeit zu einer spezifischen Kombination mit Antigen besitzen. Fv-Fragmente werden typischerweise durch Expression der erwünschten Anteile der variablen Region der schweren Immunglobulin-Kette und der variablen Region der leichten Immunglobulin-Kette in eine geeignete Wirtszelle nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren zubereitet.
Asexuelle Vermehrung: Produktion von Nachkommen durch Regeneration einer ganzen Pflanze durch Blattstecklinge, Stammstecklinge, Wurzelstecklinge, einzelne Pflanzenzellen (Protoplasten) oder Callus.
Selbstbestäubung: Die Übertragung von Pollen von männlichen Blütenteilen auf weibliche Blütenteile bei derselben Pflanze. Dieser Vorgang produziert typischerweise Samen.
Kreuzbestäubung: Die Übertragung von Pollen von den männlichen Blütenteilen einer Pflanze auf die weiblichen Blütenteile einer anderen Pflanze. Dieser Vorgang produziert typischerweise Samen, von dem lebensfähige Nachkommen gezüchtet werden können.
Epitop: Ein Abschnitt eines Moleküls, der von einem Immunglobulinprodukt spezifisch erkannt wird. Epitope werden auch als Determinante oder antigene Determinante bezeichnet.
Chimäre schwere Immunglobulin-Kette: Eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, bei der mindestens ein Teil ihrer Aminosäuresequenz von einer schweren Immunglobulin-Kette von einem anderen Isotypen oder Subtypen oder einem anderen Peptid, Polypeptid oder Protein abgeleitet ist. Typsicherweise ist bei der chimären schweren Immunglobulin-Kette die Aminosäurerestsequenz von mindestens zwei verschiedenen Isotypen oder Subtypen von schwerer Immunglobulin-Kette abgeleitet.
Transgen: Ein Gen, das in die Keimbahn eines Tiers eingebracht worden ist. Das Gen kann in einer frühen Entwicklungsstufe in das Tier eingebracht worden sein. Allerdings kann das Gen auch in einer späteren Stufe, zum Beispiel durch einen retroviralen Vektor in die Zellen eines Tiers eingebracht werden.
Mehrfachmolekül: Ein Molekül, das sich aus mehr als einem Peptid oder Polypeptid zusammensetzt, die durch ein beliebiges Mittel, einschließlich chemischer Bindung, assoziiert sind.

B. Schutzproteine enthaltende Immunglobuline
Neuartige Verfahren zur Produktion von Immunglobulinmolekülen, die Schutzproteine enthalten, werden beschrieben. Die Immunglobuline enthalten ein Schutzprotein, das mit einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette assoziiert ist, welche mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne aufweist.
Die Schutzproteine können eine Aminosäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen den Resten 1 bis 627 der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors 20 (SEQ ID NO:2) des Kaninchens entspricht oder analog zu diesem ist oder von einem Vorläuferprotein abgeleitet ist, das nicht die Aminosäurerestsequenz enthält, die größer ist als der Aminosäurerest 627 oder analog zum Aminosäurerest 627 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens. Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens werden hier und sind beschrieben von Mostov et al., Nature, 308:37 (1984) und EMBL/Gene Bank K01291. Die Nukleotidsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors ist SEQ ID NO. 1, und die entsprechende Aminosäurerestsequenz ist SEQ ID NO. 2.
Die Polyimmunglobulinrezeptoren von einer beliebigen Säugerart können als ein Schutzprotein verwendet werden, und diese Schutzproteine enthalten kein Vorläuferprotein, das keine Aminosäuren mit höheren Nummern als die Aminosäurenummer analog zu Aminosäuren 1–627 der Immunglobulinsequenz des Kaninchens enthält, sind aber davon abgeleitet. In bevorzugten Ausführungsformen sind das Schutzprotein abgeleitet von einer beliebigen Art und einem beliebigen Vorläuferprotein, das Aminosäuren analog zu Aminosäuren 1–606 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens enthält, und das keine Aminosäurereste analog zu den Resten 607–755 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens enthält.
Die Polyimmunglobulinrezeptorsequenz vom Menschen ist bestimmt und berichtet worden von Krajci et al., Eur. J. Immunol., 22:2309–2315 (1992) und Krajci et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 158:783–789 (1989) und EMBL/Gene Bank Accession No. X73079. Die Nukleotidsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors vom Menschen ist SEQ ID No. 3, und die entsprechende Aminosäurerestsequenz ist SEQ ID No. 4. Der Polyimmunglobulinrezeptor vom Menschen zeigt umfangreiche Sequenzhomologie und hat eine Domänstruktur, die analog zu der des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens ist. Siehe: Kraehenbuhl et al., Trends in Cell Biol., 2:170 (1992). Die Anteile des Polyimmunglobulinrezeptors vom Menschen, die analog zu den Domänen und/oder der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens ist, sind in Tabelle 1 angegeben.
Die Polyimmunglobulinrezeptorsequenz der Ratte ist bestimmt und berichtet worden von Banting et al., FEBS Lett., 254:177–183 (1989) und EMBL/Gene Bank Accession No. X15741. Das Nukleotid der Polyimmunglobulinrezeptornukleotidsequenz der Ratte ist SEQ ID No. 9, und die entsprechende Aminosäurerestsequenz ist SEQ ID No. 10. Der Polyimmunglobulinrezeptor der Ratte zeigt umfangreiche Sequenzhomologie und hat eine Domänstruktur, die analog zu der des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens und vom Menschen ist. Siehe: Kraehenbuhl et al., Trends in Cell Biol., 2:170 (1992). Die Anteile des Polyimmunglobulinrezeptors der Ratte, die analog zu den Domänen und/oder der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens ist, sind in Tabelle 1 angegeben.
Die Polyimmunglobulinrezeptorsequenz des Rinds ist bestimmt und berichtet worden in EMBL/Gene Bank Accession No. X81371. Die Polyimmunglobulinrezeptornukleotidsequenz des Rinds ist SEQ ID No. 5, und die entsprechende Aminosäurerestsequenz ist SEQ ID No. 6. Der Polyimmunglobulinrezeptor des Rinds zeigt umfangreiche Sequenzhomologie und hat eine Domänstruktur, die analog zu der des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens und vom Menschen ist. Die Anteile des Polyimmunglobulinrezeptors des Rinds, die analog zu den Domänen und/oder der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens ist, sind in Tabelle 1 angegeben.
Die Polyimmunglobulinrezeptorsequenz der Maus ist bestimmt und berichtet worden von Piskurich et al., J. Immunol., 150:38 (1993) und EMBL/Gene Bank U06431. Das Polyimmunglobulinrezeptornukleotid der Maus ist SEQ ID No. 7, und die entsprechende Aminosäurerestsequenz ist SEQ ID No. 8. Der Polyimmunglobulinrezeptor der Maus zeigt umfangreiche Sequenzhomologie und hat eine Domänstruktur, die analog zu der des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens und des Menschen ist. Die Anteile des Polyimmunglobulinrezeptors der Maus, die analog zu den Domänen und/oder der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens ist, sind in Tabelle 1 angegeben.

Zusätzlich zu der vorstehend identifizierten Nukleinsäure und den entsprechenden Aminosäurerestsequenzen des Polyimmunglobulinrezeptors von verschiedenen Säugerarten kann ein Teil eines Polyimmunglobulinrezeptors von jeder beliebigen Säugerart verwendet werden. Die konservierte Domänstruktur des Polyimmunglobulinrezeptors zwischen Arten gestattet die Wahl analoger Aminosäurerestsequenzen innerhalb jedes Polyimmunglobulinrezeptors von unterschiedlichen Arten. Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung solcher analoger Aminosäurerestsequenzen von jedem beliebigen Polyimmunglobulinrezeptor vor. Die analogen Sequenzen von verschiedenen Polyimmunglobulinrezeptoraminosäuresequenzen gehen aus Tabelle 1 hervor. Tabelle 1 Analoge Regionen der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors verschiedener Arten. Die Nukleotidsequenzkoordinaten definieren ungefähr die Grenzen der Domänen von Molekülen.

	Kaninchen	Rind	Mensch	Ratte	Maus
	(SEQ ID	(SEQ ID	(SEQ ID	(SEQ ID	(SEQ ID
	NO.2)	NO.6)	NO.4)	NO. 10)	NO.8)
Immunglobulin
Bindungsreste von
Domäne I	21–43	-13–45	-13–45	-13–45	-13–45
Domäne I	1–118	1–120	1–120	1–120	1–120
Domäne II	119–223	110–230	110–230	110–230	110–230
Domäne III	224–332	210–340	210–340	210–340	210–340
Domäne IV	333–441	320–450	320–450	320–450	320–450
Domäne V	442–552	440–570	440–550	440–550	440–550
Externe Anteile von	553–606	550–606	550–606	550–606	550–606
Domäne VI	&	&	&	&	&
	553–627	550–627	550–627	550–627	550–627
Transmembran	630–652	625–660	625–660	625–660	625–660
segment
Intrazellulärer	653–755	650–Ende	650–Ende	653–Ende	653–Ende
Anteil

Die Schutzproteine können im Wesentlichen weniger als die gesamte Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Schutzprotein die Aminosäurereste 1 bis 666 des nativen Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens. Im Gegensatz zum nativen Polyimmunglobulinrezeptor sind die Schutzproteine von Vorläuferproteinen abgeleitet, die nicht die gesamte Aminosäurerestsequenz enthalten, die größer ist als der Aminosäurerest 627, der vom nativen Polyimmunglobulinrezeptor abgeleitet ist und somit mehr Aminosäuren oder weniger Aminosäuren als sekretorische Komponenten enthalten kann. Die Schutzproteine dürfen nicht die gesamte Aminosäurerestsequenz enthalten, die größer ist als der Aminosäurerest 606 des nativen Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens. Nur Teile der nativen Polyimmunglobulinrezeptorsequenz dürfen als Schutzprotein verwendet werden. Das Schutzprotein darf an jeder Aminosäure zwischen Aminosäurerest 606 bis 627 enden, einschließlich jeder Aminosäurenposition zwischen 606 und 627, wie zum Beispiel 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626.
Wenn das Schutzprotein aus Teilen gebildet wird, können diese Teile eine Aminosäuresequenz aufweisen, die einem oder mehreren der folgenden Aminosäuresegmente entspricht:

1) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 21–43 von Domäne I des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
2) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 1–118 von Domäne I des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
3) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 119–223 von Domäne 11 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
4) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 224–332 von Domäne III des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
5) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 333–441 von Domäne IV des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
6) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 442–552 von Domäne V des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
7) Aminosäuren (AA) entsprechend AA von 553 bis 606 oder 553 bis 627 von Domäne VI des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens; und enthält keine Aminosäurereste entsprechend den AA-Resten 607 bis 755 oder 628 bis 755 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens.

Es ist zu beachten, dass die exakte Grenze einer Domäne innerhalb von ungefähr 20 Aminosäuren schwanken kann. Die Domänstruktur und Grenzen sind dem Fachmann jedoch verständlich.
Wenn das Schutzprotein aus Teilen gebildet wird, können diese Teile eine Aminosäuresequenz aufweisen, die der Aminosäuresequenz eines Polyimmunglobulinrezeptors für eine spezifische Säugerart entspricht und analog zu den folgenden Aminosäuresegmenten ist:

1) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 21–43 von Domäne I des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
2) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 1–118 von Domäne I des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
3) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 119–223 von Domäne II des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
4) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 224–332 von Domäne III des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
5) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 333–441 von Domäne IV des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
6) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 442–552 von Domäne V des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
7) Aminosäuren (AA) entsprechend AA von 553 bis 606 oder 553 bis 627 von Domäne VI des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens; und enthält keine Aminosäurereste analog zu den AA-Resten 607 bis 755 oder 628 bis 755 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens.

Wenn aus Teilen gebildet, kann das Schutzprotein die Domänen I, IV, V und AA 550–606 oder 550–627 von Domäne VI des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens oder die Aminosäuresequenz von analogen Domänen und Regionen eines Polyimmunglobulinrezeptors einer anderen Art umfassen.
Das Schutzprotein kann eine Aminosäurerestsequenz haben, die im Wesentlichen den Aminosäureresten des Polyimmunglobulinrezeptors einer Art entspricht, die analog zu den Aminosäureresten 1–627 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens sind. Dieser Teil der Aminosäuresequenz würde mindestens einem Teil der extrazellulären Domänen des Rezeptors dieser Art entsprechen.
Das Schutzprotein kann eine Aminosäurerestsequenz haben, die im Wesentlichen den Aminosäureresten des Polyimmunglobulinrezeptors einer Säugerart entspricht, die analog zu den Aminosäureresten 1–606 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens sind.
Das Schutzprotein kann eine Aminosäurerestsequenz haben, die im Wesentlichen den folgenden Aminosäurerestsequenzen entspricht oder (wenn von einer anderen Säugerart als Kaninchen) analog zu diesen ist:

1) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 21–43 von Domäne I des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
2) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 1–118 von Domäne I des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
3) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 119–223 von Domäne II des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
4) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 224–332 von Domäne III des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
5) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 333–441 von Domäne IV des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
6) Aminosäuren (AA) entsprechend AA 442–552 von Domäne V des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens;
7) Aminosäuren (AA) entsprechend AA von 553 bis 606 oder 553 bis 627 von Domäne VI des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens; und enthält keine Aminosäurereste entsprechend AA 628 bis 755 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens.

Das Immunglobulin kann ein Schutzprotein haben, das eine erste Aminosäuresequenz hat, die im Wesentlichen den Aminosäureresten 1 bis 606 oder 1 bis 627 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens entspricht, und eine zweite Aminosäurerestsequenz, die an die erste Aminosäuresequenz angrenzt, wobei die zweite Aminosäurerestsequenz dem Transmembransegment des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens entspricht.
Die zweite Aminosäurerestsequenz kann mindestens einen Anteil einer Aminosäuresequenz haben, die den Aminosäureresten 655 bis 755 eines Polyimmunglobulinrezeptors entspricht. Die zweite Aminosäurerestsequenz darf mindestens eines oder mehrere der Folgenden sein: eine intrazelluläre Domäne eines Polyimmunglobulinmoleküls, eine Domäne eines Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Superfamilie, ein Enzym, ein Toxin oder ein Linker.
Die Schutzproteine haben keinen Aminosäurerest entsprechend dem Transmembransegment des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens, aber sie dürfen Aminosäurereste entsprechend der intrazellulären Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens haben und sind somit Deletionsmutanten des Rezeptors.
Schutzproteine dürfen eine Aminosäuresequenz haben, die im Wesentlichen mindestens einer der extrazellulären Domänen des Polyimmunglobulinrezeptors einer spezifischen Säugerart entspricht. Das Schutzprotein darf eine Aminosäuresequenz haben, von der ein Segment dieser Aminosäuresequenz im Wesentlichen einer extrazellulären Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors einer Art entspricht, und ein anderes Segment dieser Aminosäuresequenz darf von einer zweiten Art sein und im Wesentlichen einer extrazellulären Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors von einer anderen Art entsprechen. Es sind Schutzproteine denkbar, die eine Aminosäuresequenz haben, die ein Aminosäuresequenz-Segment hat, das der Aminosäuresequenz des Polyimmunglobulinrezeptors von einer Art entspricht, und eine zweite Aminosäuresequenz innerhalb der gleichen Domäne, die der Aminosäure und Sequenz des Polyimmunglobulinrezeptors von einer anderen Art entspricht. Dadurch kann das Schutzprotein individuelle Domänen oder Teile einer spezifischen Domäne haben, die Aminosäuresequenzen enthalten, die dem Polyimmunglobulinrezeptor von verschiedenen Arten entsprechen.
Andere Ausführungsformen sind vorgesehen, bei denen das Schutzprotein Teile seiner Aminosäuresequenz aufweist, die von einem Molekül abgeleitet sind, das ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie ist. Siehe: Williams and Barclay, "The Immunoglobulin Superfamily." In Immunoglobulin Genes, S. 361, Academic Press (Honjo Alt and Rabbits Hrsg. 1989). Diese abgeleiteten Teile können Aminosäuresequenzen enthalten, die Peptide, Domänen oder mehre Domänen von einem Molekül der Immunglobulin-Superfamilie kodieren.
Eine Nukleotidsequenz, die ein Schutzprotein kodiert, kann eine erste Nukleotidsequenz haben, die Aminosäuren 1–606 oder 1–627 der Nukleotidsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens kodiert, und die keine Nukleotidsequenz hat, die ein funktionales Transmembransegment 3' der ersten Nukleotidsequenz kodiert. Eine zweite Nukleotidsequenz kann 3' der ersten Nukleotidsequenz liegen, die die Aminosäuren 1–606 oder 1–627 des Polyimmunglobulinrezeptorsequenz des Kaninchens kodiert. Diese zweite Nukleotidsequenz kann eine Vielfalt von Molekülen einschließlich der Teile der intrazellulären Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens oder eines anderen Polyimmunglobulinrezeptors oder eines Teils eines Moleküls der Immunglobulin-Superfamilie. Diese zweite Nukleotidsequenz kann verschiedene Effektormoleküle, -enzyme, Toxine und dergleichen kodieren. Eine zweite Nukleotidsequenz kann Aminosäurereste kodieren, die den Aminosäureresten 655 bis 775 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens oder eines anderen Polyimmunglobulinrezeptors von einer anderen Art entsprechen.
Expressionsvektoren, die eine Nukleotidsequenz enthalten, welche ein Schutzprotein kodieren, das operativ für Expression verknüpft ist, sind ebenfalls vorgesehen. Diese Expressionsvektoren platzieren die zu exprimierende Nukleotidsequenz in einer spezifischen Zelle 3' von einer Promotorsequenz, was eine Transkription und Expression der Nukleotidsequenz bewirkt. Der Expressionsvektor kann auch verschiedene Enhancersequenzen enthalten, durch die die Effizienz dieser Transkription verbessert wird. Darüber hinaus können solche Sequenzen wie Terminatoren, Stellen mit Polydenylation (Poly A) und andere 3'-Ende-Verarbeitungssignale enthalten sein, um die Menge der innerhalb einer spezifischen Zelle transkribierten Nukleotidsequenz zu verbessern.
Das Schutzprotein kann Teil eines Immunglobulins sein, das mit einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne enthält, assoziiert ist. Von Immunglobulin abgeleitete schwere Ketten, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne enthalten, sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel beschrieben von Huse et al., Science, 246:1275 (1989), und von Lerner und Sorge, PCT-Anmeldung WO 90/14430 , veröffentlicht am 29. November 1990.
Die Immunglobuline können ein Schutzprotein und eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette enthalten, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsstelle in Verbindung mit der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette enthält. Von Immunglobulin abgeleitete leichte Ketten, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne enthalten, sind dem Fachmann bekannt und in verfügbaren Quellen beschrieben. Siehe zum Beispiel: Early and Hood, Genetic Engineering, Setlow & Hollaender, (Hrsg.), Vol. 3, Plenum Publishing Corp., New York (1981), Seiten 157–188; und Kabat et al., Sequences of Immunologic Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987).
Die Immunglobulinbestandteile des Komplexes (alpha, J, kappa oder lambda) können alle oder einen Teil des Volllänge-Polypeptids enthalten. Teile dieser Ketten können als Substitution für die gesamte Kette benutzt werden. Zum Beispiel kann die gesamte schwere alpha-Immunglobulin-Kette durch die variable Region und nur einen Teil alpha-konstanten Region, der für ein Zusammenfügen mit den anderen Bestandteilen ausreichend ist, ersetzt werden. Auf gleiche Weise kann eine trunkierte kappa- oder lambda-Kette, die nur eine kleine Sektion der konstanten Region enthält, die kappa- oder lambda-Ketten in Volllänge ersetzen. Als Voraussetzung für jeden Komplex gilt die Fähigkeit, das Schutzprotein zu binden.
Zusätzlich zu trunkierten Bestandteilen sind Kombinationen verschiedener Typen von Immunglobulinen möglich. Zum Beispiel kann eine schwere Kette der konstanten Region, die die C_H1- und C_H2-Regionen des IgG gefolgt von den von einem IgA abgeleiteten C_H2- und C_H3-Regionen einen stabilen Komplex bilden, der das Schutzprotein aufweist. Dies ist spezifisch als ein Beispiel beschrieben.
Immunglobuline, die Schutzproteine enthalten, enthalten vorzugsweise mindestens einen Teil einer schweren IgM- oder IgA-Kette, der es der schweren Immunglobulin-Kette ermöglicht, an die Immunglobulin-J-Kette zu binden und dadurch an das Schutzprotein zu binden. Es ist vorgesehen, dass die schwere Immunglobulin-Kette aus individuellen Domänen zusammengesetzt sein kann, die ausgewählt werden aus der schweren IgA-Kette und der schweren IgM-Kette oder einem anderen Isotypen einer schweren Kette. Eine Immunglobulindomäne, die von einer anderen schweren Immunglobulin-Kette, die nicht IgA oder IgM ist, kann molekular gestaltet werden, um die Immunglobulin-J-Kette zu binden, und sie kann demzufolge für eine Produktion von Immunglobulinen verwendet werden.
Der Fachmann ist verständlich, dass Immunglobuline aus Domänen bestehen, die ungefähr 100–110 Aminosäurereste sind. Diese verschiedenen Domänen sind dem Fachmann bekannt und haben bekannte Grenzen. Das Entfernen einer einzelnen Domäne und deren Ersatz durch eine Domäne von einem anderen Antikörpermolekül lassen sich mit moderner Molekularbiologie einfach ausführen. Die Domänen sind globulare Strukturen, die durch Disulfidbindungen innerhalb der Ketten stabilisiert sind. Dies verleiht den Domänen eine eigenständige Form und macht sie zu eigenständigen Einheiten, die durch andere, ähnlich geformte Domänen ersetzt oder gegen solche ausgetauscht werden können. Die konstanten Regionen der schweren Ketten der Immunglobuline vermitteln verschiedene Eigenschaften, die als Antikörper-Effektorfunktionen auf einem spezifischen Molekül, das diese Domäne enthält, bekannt sind. Beispielhafte Effektorfunktionen umfassen Komplementfixierung, plazentalen Transfer, Binden an Staphylokokken-Protein, Binden an Streptokokken-Protein G, Binden an mononukleare Zellen, Neutrophile oder Mastzellen und Basophile. Die Assoziation spezifischer Domänen und Immunglobulinisotypen zu diesen Effektorfunktionen ist dem Fachmann bekannt und zum Beispiel beschrieben in Immunology, Roitt et al., Mosby St. Louis, Mo. (1993 3rd Ed.).
Immunglobuline können, zusätzlich zum Schutzprotein, schwere Immunglobulin-Ketten, leichte Immunglobulin-Ketten oder Immunglobulin-J-Kette, die an die von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten gebunden ist, enthalten. Das Immunglobulin kann zwei oder vier von Immunglobulin abgeleitete schwere Ketten zusammen mit zwei oder vier von Immunglobulin abgeleiteten leichten Ketten und einer Immunglobulin-J-Kette, die mindestens an eine der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten gebunden ist, enthalten. Die Immunglobulin-J-Kette ist beschrieben und dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel: M. Koshland, The Immunoglobulin Helper: The J Chain, in Immunoglobulin Genes, Academic Press, London, S. 345, (1989) und Matsuuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:456–460 (1986). Die Sequenz der Immunglobulin-J-Kette ist bei verschiedenen Datenbanken in USA verfügbar.
Immunglobuline können ein Schutzprotein aufweisen, das mit mindestens einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette assoziiert ist. Diese Assoziation kann auftreten in Form von Wasserstoffbindungen, Disulfidbindungen, kovalenter Bindungen, ionischer Interaktionen oder Kombinationen dieser verschiedenen Bindungen. Typischerweise werden Immunglobulinmoleküle durch Disulfidbindungen zwischen den schweren Immunglobulin-Ketten und den leichten Immunglobulin-Ketten zusammengehalten. Die Interaktion des Schutzproteins mit dem Immunglobulin erfolgt durch eine nicht-kovalente oder Disulfidbindung.
Immunglobuline, die das Schutzprotein enthalten, die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette und, fakultativ, eine von Immunglobulin abgeleiteten leichte Kette und eine J-Kette werden typischerweise durch eine der folgenden Bindungen zusammengehalten: Wasserstoffbindungen, Disulfidbindungen, kovalente Bindungen, ionische Interaktionen oder Kombinationen dieser Bindungen. Moleküle, in denen die erforderlichen Anteile von schwerer, leichter und/oder J-Kette in einem einzelnen Polypeptid platziert worden sind, funktionieren zur Bindung von Antigen und Schutzprotein. Beispiele für solche Proteine sind einkettige Antigenbindeproteine (scab-Proteine).
Ein Verfahren zum Zusammenfügen eines multimeren Immunglobulins umfasst die folgenden Schritte: Einbringen eines DNA-Segments, das die gesamte oder einen Teil einer Immunglobulin-J-Kette kodiert, und eines DNA-Segments, das die gesamte oder einen Teil einer Immunglobulin-alphakette kodiert, und ein DNA-Segment, das die gesamte oder einen Teil entweder einer Immunglobulin-kappa-Kette oder Immunglobulin-lambda-kette kodiert, in einen Organismus; und Einbringen eines Schutzproteins in den gleichen Organismus, dabei enthält das Schutzprotein mindestens ein Segment der Aminosäurereste 1 bis Rest 606 der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens (pIgR) oder analoger Aminosäurereste von anderen Arten, die nicht die Aminosäurereste enthalten, auf solche Weise, dass das Segment abgeleitet ist von einem Vorläuferprotein, das nicht die Aminosäurereste enthält, die eine funktionale Transmembranregion umfassen, und nicht das von einem Vorläuferprotein abgeleitete Segment ist, in dem die Sequenz von Aminosäureresten ab dem Beginn der Transmembranregion (ungefähr Rest 630 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens) bis zum Ende des Proteins (ungefähr Rest 755 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens) vollständig intakt ist. Das Vorläuferprotein enthält keine Aminosäurereste größer als 606 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens oder analoge Aminosäurereste von anderen Arten.
Dem Fachmann ist bekannt, dass eine Transmembranregion oder ein funktionales Transmembransegment aus einer benachbarten Sektion von Aminosäureresten besteht, die von etwa 20 bis etwa 30 Aminosäuren enthalten, in denen keiner der Reste geladen ist, so gut wie alle Reste hydrophob oder unpolar sind, und wobei das Segment eine alpha-Helix bildet. Ein funktionales Transmembransegment ist in der Lage, eine Biomembran durchzuspannen. Transmembranregionen können durch geladene Reste gebunden werden. Ein Beispiel für eine Transmembranregion von pIgR sind die Reste 630 bis 653 der Aminosäurerestsequenz des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens.
Die Ketten, die das Immunglobulin umfassen, welches das Schutzprotein aufweist, können von Vorläufern abgeleitet sein, die eine Signalsequenz am Aminoterminus des Proteins enthalten. Jeder Bestandteil kann dabei in ein Endomembransystem synthetisiert werden, wo das Zusammenfügen stattfindet. Zusätzlich zu einer Signalsequenz können die verschiedenen Bestandteile des Komplexes zusätzliche Signale für N-terminale Glycosylierung oder für verschiedene andere Modifikationen, die die Struktur des Komplexes beeinflussen können, enthalten oder nicht enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Signale für Glycosylierung (d. h. Asparagin-X-Serin oder -Threonin oder die Signale für O-gebundene Glycosylierung) an mehreren oder wenigeren Loci innerhalb der Nukleotidsequenz vorhanden oder nicht vorhanden sein. Der resultierende Antikörper würde deshalb kein Kohlenhydrat enthalten, was bei Anwendungen, bei denen Kohlenhydrate eine Immunantwort hervorrufen, von Vorteil sein kann.
Das Immunglobulin kann ein Schutzprotein enthalten, das mit einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette assoziiert ist, und das Schutzprotein ist frei von N-gebundenen und/oder O-gebundenen Oligosacchariden. Der Fachmann wird verstehen, dass ein Gen, das für ein Polypeptid kodiert, das innerhalb des eigenen Aminosäurerests das N-gebundenen Glycosylierungssignal Asparagin-X-Serin/-Threonin hat, wo X jeder beliebige Aminosäurerest außer möglicherweise Polin und Asparaginsäure sein kann, beim Einbringen in eine Pflanzenzelle über Oligosaccharide, die mit dem Asparaginrest der Sequenz (N-gebunden) verknüpft sind, glycosylisiert wird. Siehe: Marshall, Ann. Rev. Biochem., 41:673 (1972) und Marshall, Biochem. Soc. Symp., 40:17 (1974) bezüglich einer allgemeinen Übersicht über die Polypeptidsequenzen, die als Glycosylierungssignale funktionieren. Diese Signale sind sowohl in Säugerzellen als auch in Pflanzenzellen zu erkennen. Der Fachmann versteht, dass das N-gebundene Glycosylierungssignal mithilfe von einfachen Mutageneseverfahren einfach entfernt werden kann, um die DNA-Sequenz, die das Schutzprotein kodiert, zu ändern. Diese Mutagenese bezieht typischerweise die Synthese von Oligonukleotid ein, wobei das N-gebundene Glycosylierungssignal entfernt wird und dann ein DNA-Strang hergestellt wird, in das diese Oligonukleotidsequenz eingefügt wird. Solche Mutageneseverfahren und -Reagenzien sind von vielen Quellen erhältlich, wie Stratagene (La Jolla, CA., USA).
Das Zusammenfügen der einzelnen Polypeptide, die ein Multipeptidmolekül (zum Beispiel Immunglobulin) bilden, kann erreicht werden durch Exprimieren in eine einzelne Zelle durch direktes Einbringen aller Transgene, die die individuellen Polypeptide in diese Zelle entweder sequenziell oder in einem Vorgang kodieren. Die Transgene, die die Polypeptide kodieren, können auf individuellen Konstrukten oder DNA-Segmenten vorhanden oder in einem DNA-Segment oder Konstrukt zusammen mit einem oder mehreren anderen Transgenen enthalten sein.
Das Zusammenfügen dieser Bestandteile kann durch Kreuzpollination, wie ursprünglich von Mendel beschrieben, erfolgen, um eine Population von Segreganten, die alle Ketten exprimieren, zu erzeugen. Frühere Offenbarungen haben gezeigt, dass dies ein adäquates Verfahren für das Zusammenfügen und eine Cosegregation von multimeren Glykokonjugaten ist. Die Offenbarung des US-Patents Nr. 5,202,422 beschreibt diese Verfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die Antikörpermoleküle eine reduzierte Anzahl von Glykanen, und Antikörpermoleküle ohne Glykane sind vorgesehen.
Die Immunglobuline, die das Schutzprotein, die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette und, fakultativ, eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette und J-Kette enthalten, können ein Schutzprotein enthalten, das frei von N-gebundenen Oligosacchariden ist.
Die Immunglobuline, die das Schutzprotein enthalten, sind vorzugsweise therapeutische Immunglobuline, die anwendbar sind für ein Vorbeugen von Krankheiten bei einem Tier. Die Immunglobuline können therapeutische Immunglobuline sein, die in der Lage sind, pathogene Schleimhautparasiten zu binden. Bestimmte therapeutische Immunglobuline sind in der Lage, Zahnkaries vorzubeugen, z. B. ist ein Immunglobulin, das das Schutzprotein aufweist, das eine Antigenbindungsdomäne enthält, in der Lage, an ein Antigen von S. mutans Serotypen a, c, d, e, f, g und h (S. mutans c, e und f und S. sobrinus Serotypen d und g nach neuer Nomenklatur) zu binden. Solche Antigenbindungsdomänen sind dem Fachmann bekannt und umfassen, zum Beispiel, die Bindungsdomänen, die beschrieben sind in US-Patent Nr. 5,352,446 , J. K-C. Ma et al., Clin. Exp. Immunol. 77:331 (1989); und J. K-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 24:131–138 (1994); US-Patent Nr. 5,352,446 ; US-Patent Nr. 4,594,244 ; und Europäische Patentveröffentlichung 371 017 B1 . Immunglobuline können ein Teil einer Zusammensetzung sein, die eine therapeutische Wirkung bei entweder Tieren oder Menschen haben. Es gibt eine Vielzahl von Beispielen für therapeutische Immunglobuline, aber wir sehen die zweckmäßigste therapeutische Wirkung in der Prophylaxe gegen Schleimhaut- und Enteropathogene durch direkte orale Verabreichung der von einer Nahrungspflanze abgeleiteten Zusammensetzung.
Die Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung kann vor oder nach der Extraktion aus der Pflanze oder einem anderen transgenen Organismus stattfinden. Wenn extrahiert, können die Immunglobuline außerdem durch konventionelle Verfahren wie Größenausschluss-, Innenaustausch- oder Affinitäts-Chromatographie weiter gereinigt werden. Der transgene Organismus ist eine Nahrungspflanze, und die Verabreichung des Komplexes erfolgt durch Einnahme nach teilweiser Reinigung. Pflanzenmoleküle können gleichzeitig mit dem Komplex verabreicht werden.
Der relative Anteil der von Pflanzen abgeleiteten Molekülen und von Tieren abgeleiteten Molekülen kann variieren. Die Mengen spezifischer Pflanzenproteine, wie RuBisCo oder Chlorophyll kann so gering wie 1 % der Masse oder ganze 99,9 % der Masse des Extrakts ohne Wasser sein.
Das therapeutische Pflanzenextrakt, das Immunglobuline enthält, die ein Schutzprotein enthalten, kann ohne weitere Reinigung der spezifischen therapeutischen Bestandteile, z. B. des Antikörpers, verwendet werden. Die Verabreichung kann in Form von topischer Anwendung, oraler Einnahme oder eines anderen Verfahrens, das für das Abgeben des Antikörpers an den pathogenen Ziel-Schleimhautparasiten geeignet ist, erfolgen. Diese Form der Verabreichung unterscheidet sich distinkt von parenteralen Anwendungen, die ein direktes Injizieren in den oder Vermischen des therapeutischen Pflanzenextrakts mit dem Blutstrom.
Das therapeutische Pflanzenextrakt, das Immunglobuline enthält, die ein Schutzprotein enthalten, kann nach Manipulation des Geschmacks oder der Textur des Extrakts verwendet werden. Geeignete Mengen von Geliermitteln oder Geschmackstoffen können hinzugefügt werden, um den Kontakt des Antikörpers mit dem Zielerreger bei zum Beispiel direkten oralen Anwendungen zu verbessern.
Immunglobuline können für ein passives Immunisieren eines Tieres gegen einen vorgewählten Liganden verwendet werden, indem eine Zusammensetzung, die ein Immunglobulin umfasst, das ein Schutzprotein der vorliegenden Erfindung enthält, das in der Lage ist, einen vorgewählten Liganden zu binden, mit einer Schleimhautoberfläche eines Tieres in Kontakt gebracht wird. Eine passive Immunisierung erfordert große Mengen Antikörper, und für eine weit verbreitete Anwendung muss dieser Antikörper preiswert sein.
Immunglobulinmoleküle, die Schutzproteine enthalten, die in der Lage sind, vorgewähltes Antigen zu binden, lassen sich in Pflanzenzellen effizient und ökonomisch erzeugen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Immunglobulinmolekül entweder ein IgA, IgM, sekretorisches IgM oder sekretorisches IgA oder ein Immunglobulin, das eine chimäre von Immunglobulin abgeleitete schwere oder leichte Kette aufweist.
Die Immunglobulinmoleküle, die Schutzproteine enthalten, sind widerstandsfähiger gegen Proteolyse und Denaturierung und deswegen für die Anwendung in rauen Umgebungen erwünscht. Als raue Umgebungen werden säurehaltige Umgebungen, Protease enthaltende Umgebungen, Umgebungen mit hohen Temperaturen und andere harten Umgebungen betrachtet. Zum Beispiel wird der Magen-Darm-Trakt eines Tieres, wo sowohl Proteasen als auch Säure vorhanden sind, als raue Umgebung betrachtet. Siehe: Kobayashi et al., Immunochemistry, 10:73 (1973).
Eine passive Immunisierung des Tieres durch Anwendung dieser widerstandsfähigeren Immunglobuline wird erzielt, indem das Immunglobulin, welches das Schutzprotein aufweist, mit einer Schleimhautoberfläche des Tieres in Kontakt gebracht wird. Tiere haben verschiedene Schleimhautoberflächen, einschließlich der Lungen, des Magen-Darm-Trakts, der Nasenrachenhöhle, des Urogenitalsystems und dergleichen. Diese Schleimhautoberflächen enthalten typischerweise Zellen, die verschiedene Sekretionen erzeugen, einschließlich Speichel, Tränenflüssigkeit, Nasensekret, Tracheobronchialsekret, Darmsaft, Galle, Gebärmuttersekret und dergleichen.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Immunglobuline, die das Schutzprotein enthalten, immunspezifisch für ein vorgewähltes Antigen. Typischerweise ist dieses Antigen vorhanden auf einem Erreger, der eine Krankheit verursacht, die mit der Schleimhautoberfläche assoziiert wird, wie zum Beispiel nekrotisierende Enterocolitis, Durchfallerkrankungen, Geschwüre und Krebs infolge einer karzinogenen Absorption im Darm. Siehe zum Beispiel: McNabb and Tomasi, Ann. Revl. Microbiol., 35:477 (1981) und Lawrence et al., Science, 243:1462 (1989). Typische Erreger, die Krankheiten verursachen, die mit einer Schleimhautoberfläche assoziiert werden, umfassen sowohl bakterielle als auch virale Erreger, wie E. coli., S. typhimurium, V. cholera, H. pylori und S. mutans. Siehe auch: Europäische Patentanmeldung 484 148 A1 , veröffentlicht am 6. Mai 1992 und durch diese Bezugnahme einbezogen. Die Immunglobuline der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, an diese Erreger zu binden und sie an einem Verursachen von mit Schleimhaut assoziierten Krankheiten zu hindern.
Immunglobuline mit der Fähigkeit, S. mutans zu binden und Zahnkaries vorzubeugen, sind beschrieben in der Europäischen Patentschrift 371 017 . Außerdem gibt es das US-Patent US-A-5.352.440 .
Therapeutische Immunglobuline der vorliegenden Erfindung, die Schutzproteine enthalten, welche wirksam gegen bakterielle Infektion oder Karzinome sind, sind vorgesehen. Monoklonale Antikörper mit therapeutischer Aktivität sind beschrieben in den US-Patenten Nr. 4,652,448 , 4,443,549 und 5,183,756 .
Immunglobuline können Bestandteil einer Zusammensetzung sein, die mit der Schleimhautoberfläche des Tieres in Kontakt gebracht werden, und die Pflanzenmaterial und ein Immunglobulin, das in der Lage ist, einen vorgewählten Liganden zu binden, umfasst. Das vorhandene Pflanzenmaterial kann Folgendes sein: Pflanzenzellwände, Pflanzenorganellen, Pflanzenzytoplasmen, intakte Pflanzenzellen, lebensfähige Pflanzen oder dergleichen. Dieses Pflanzenzellenmaterial ist in einem Verhältnis von etwa 10.000 Gramm Pflanzenmaterial zu etwa 100 Nanogramm Immunglobulin bis etwa 100 Nanogramm Pflanzenmaterial zu etwa 10 Gramm vorhandenes Immunglobulin vorhanden. Das Pflanzenmaterial kann in einem Verhältnis von etwa 10.000 Gramm Pflanzenmaterial je 1 Gramm Immunglobulin bis etwa 100 Nanogramm vorhandenes Pflanzenmaterial je Gramm vorhandenes Immunglobulin vorhanden sein. Das Pflanzenmaterial kann in einem Verhältnis von etwa 10.000 Gramm Pflanzenmaterial je Milligramm vorhandenes Immunglobulin bis etwa 1 Milligramm vorhandenes Pflanzenmaterial je 500 Milligramm vorhandenes Immunglobulin vorhanden sein.
Die Zusammensetzung, die die Immunglobuline enthält, kann eine therapeutische Zusammensetzung sein. Die Zubereitung therapeutischer Zusammensetzungen, die Polypeptide oder Proteine als Wirkstoffe enthalten, ist dem Fachmann bekannt. Therapeutische Zusammensetzungen können flüssige Lösungen oder Suspensionen, Feststoffe in solcher Form, dass sie sich für Auflösen oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Einnahme eignen, können auch zubereitet werden. Das therapeutische Mittel kann auch emulgiert werden. Der therapeutische Wirkstoff wird typischerweise mit anorganischen und/oder organischen Trägern, die pharmazeutisch unbedenklich und mit dem Wirkstoff verträglich sind, vermischt. Die Träger sind typischerweise physiologisch unbedenkliche Hilfsstoffe, die mehr oder weniger inerte Substanzen umfassen, wenn sie der therapeutischen Zusammensetzung hinzugefügt werden, um der Zusammensetzung geeigneten Konsistenzen und Form zu verleihen. Geeignete Träger sind zum Beispiel Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin und dergleichen und Kombinationen davon. Darüber hinaus kann, falls erwünscht, die Zusammensetzung geringere Mengen von sonstigen Bestandteilen wie Netzmitteln oder Emulgatoren und pH-Puffermitteln enthalten, die die Wirksamkeit der Wirkstoffe verbessern. Therapeutische Zusammensetzungen, die Träger enthalten, die einen Nährwert haben, sind ebenfalls vorgesehen.
Wenn eine Zusammensetzung, die ein Immunglobulin enthält, das ein Schutzprotein umfasst, auf den Zähnen oder im Maul eines Säugers aufgetragen werden soll, kann jedes geeignete Verfahren zur Anwendung kommen. Verfahren zum Auftragen eine solche Zusammensetzung auf den Zähnen sind dem Fachmann bekannt, und es werden verschiedene Materialien für eine Vielzahl von Zwecken verwendet. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung direkt auf dem Zahn aufgetragen werden, indem die Oberfläche des Zahns mit dieser Zusammensetzung bestrichen wird. Alternativ kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in eine Zahnpasta, ein Mundwasser, einen Kaugummi, eine Lutschtablette oder ein Gel eingebracht sein, was darin resultiert, dass sie auf die Zähne aufgetragen wird. Bei einigen Formulierungen kann es erwünscht sein, den Kontakt der Zusammensetzung und damit des Immunglobulins, das das Schutzprotein aufweist, mit der Zahnoberfläche zu verlängern. Formulierungen für diesen Zweck sind dem Fachmann bekannt und umfassen solche Formulierungen, die in verschiedenen Zahnschienen angebracht werden, die zur Abdeckung des Zahns benutzt werden, und in anderen Dentalvorrichtungen, die für die Korrektur verschiedener Zuständen bei den Zähnen benutzt werden.
Die exakte Menge einer Zusammensetzung, die bei jeder spezifischen Anwendung auf die Zähne aufgetragen werden muss, ist nicht entscheidend, da eine derartige Behandlung einfach nach einem bestimmten Intervall wiederholt werden kann. Zum Beispiel würden Zusammensetzungen, die in Zahnpasta vorhanden sind, jedes Mal bei Verwenden der Zahnpasta aufgetragen, was typischerweise zweimal am Tag erfolgt. Zum Beispiel können in der Größenordnung von 10 bis 100 Mikrogramm eines Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist, bei jeder Gelegenheit, wenn die Zusammensetzung auf den Zahn aufgetragen wird, auf jeden Zahn aufgetragen werden. Dies darf jedoch in keiner Weise als eine Begrenzung einer Größenordnung, die während irgendeiner spezifischen Anwendung aufgetragen werden darf, betrachtet werden, da Anwendungen einer Zusammensetzung, die mehr oder weniger Immunglobulin der vorliegenden Erfindung enthält, ohne nachteilige Wirkungen eingesetzt werden können. Die Anwendung wesentlich geringerer Konzentrationen eines Immunglobulins der vorliegenden Erfindung würde früher oder später zu einer Reduzierung des Schutzes führen, der durch eine solche Formulierung bereitgestellt wird.
Die genaue Formulierung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann variieren und ist abhängig vom Auftragsverfahren, das zur Anwendung kommen soll, und von der Häufigkeit der Anwendung. Gewöhnlich kann jede Formulierung in Frage kommen, die einen adäquaten pH-Wert aufweist und frei von Stoffen ist, die bewirken können, dass das Immunglobulin, das das Schutzprotein der vorliegenden Erfindung enthält, unwirksam wird. Zum Beispiel können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als einfache wässrige Lösung aufgetragen werden, in der die Zusammensetzung eingebracht ist mit beliebigem Anteil von 0,1 bis 10 Milligramm Immunglobulin je 100 Mikroliter dieser Lösung. Im Allgemeinen würde eine solche Lösung während einer Zahnchirurgie in einer Menge von 1 bis 10 Mikroliter Lösung je Zahn aufgetragen werden.
Die Formulierungen der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen, die für eine Selbstverabreichung vorgesehen sind, können variieren und werden unter Berücksichtigung der Anwendungshäufigkeit des spezifischen Produkts, in dem sie verwendet werden, formuliert.
Eine Zusammensetzung, die ein Immunglobulin enthält, kann ein Immunglobulinmolekül umfassen, das immunspezifisch für ein pathogenes Antigen ist. Als Erreger wird jeder Organismus bezeichnet, der eine Krankheit in einem anderen Organismus hervorruft. Besonders anwendbar sind Immunglobuline, die immunspezifisch für einen pathogenen Schleimhautparasiten sind. Ein Schleimhautparasitantigen ist auf einem Erreger vorhanden, der durch Schleimhautgewebe einen Organismus invadiert oder mit Schleimhaut assoziierte Krankheiten hervorruft. Pathogene Schleimhautparasiten umfassen Lungenpathogene, nasale Pathogene, intestinale Pathogene, orale Pathogene und dergleichen. Für eine allgemeine Diskussion über Pathogene, einschließlich pathogener Schleimhautparasiten, siehe: Davis et al., Microbiology, 3rd ed., Harper and Row, Hagerstown, Md. (1980).
Antikörper, die immunspezifisch für einen Erreger sind, können mithilfe von standardmäßigen monoklonalen Antikörperproduktionstechniken hergestellt werden. Siehe: Antibodies: A Laborstory Manual, Harlow et al., Hrsg., Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Die Gene, die für die variablen Regionen der leichten Kette und der schweren Kette kodieren, können dann unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion und entsprechend ausgewählter Primer isoliert werden. Siehe: Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833 (1989) und Huse et al., Science, 246:1275 (1989). Die variablen Regionen werden dann in Pflanzenexpressionsvektoren eingefügt, wie die Expressionsvektoren, die beschrieben sind von Hiatt et al., Nature, 342:76–78 (1989).
Das Immunglobulin kann immunspezifisch für einen pathogenen Darmerreger sein. Besonders anwendbar sind Immunglobuline, die immunspezifisch für solche Darmpathogene sind wie Bakterien, Viren und Parasiten, die Krankheiten im Magen-Darm-Trakt verursachen, wie E. coli, Salmonellae, Vibrio cholerae, Salmonellae typhimurium, Shigella und H. pylori.
Das Immunglobulin, das das Schutzprotein aufweist, welches in der Zusammensetzung vorhanden ist, kann ein Immunglobulinmolekül sein, das immunspezifisch für ein dentales Pathogen wie Streptococcus mutans und dergleichen ist. Besonders anwendbar sind Immunglobuline, die immunspezifisch für ein Streptococcus mutans-Antigen wie das von Immunglobulin erzeugte Hybridom 15B2 (ATCC No. HB 8510); das als European Collection of Animal cells als Deposit No. 86031901 hinterlegte Hybridom; und der monoklonale Antikörper Guy's 13, der beschrieben ist von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131 (1994) und Smith and Lehner, Oral Micro. Immunol., 4:153 (1989).
Eine passive Immunität kann in einem Tier, wie einem Wirbeltier, z. B. Fischen, Vögeln, Reptilien, Amphibien, oder in Säugern, wie einem Menschen, einem Haustier, wie einem Wiederkäuer, einer Kuh, einem Schwein, einem Pferd, einem Hund, einer Katze, und dergleichen, erzeugt werden. Eine passive Immunität kann in einem erwachsenen oder jungen Säuger erzeugt werden.
Eine passive Immunität kann in einem Tier, wie einem Säuger, erzeugt werden, das abgestillt ist und deshalb nicht länger säugt. um Milch von seiner Mutter zu erhalten. Die passive Immunität wird bei einem solchen Tier erzeugt durch Verabreichung and das Tier einer ausreichenden Menge von Zusammensetzung, die ein Immunglobulin e enthält, die ein Schutzprotein aufweist, das immunspezifisch für einen vorgewählten Liganden ist, um eine prophylaktische Konzentration des Immunglobulins im Tier zu ergeben. Eine prophylaktische Konzentration eines Immunglobulins ist eine Menge, die ausreicht, um einen vorhandenen Erreger zu binden und zu verhindern, dass der Erreger eine erkennbare Krankheit im Tier hervorruft. Die Menge der Zusammensetzung, die das Immunglobulin enthält, das erforderlich ist, um prophylaktische Konzentrationen zu ergeben, variiert, wie dem Fachmann bekannt ist, in Abhängigkeit von der Größe des Tieres, der Menge an vorhandenem Erreger, der Affinität des besonderen Immunglobulins zum Erreger, der Effizienz, mit der das besondere Immunglobulin an seinen aktiven Locus im Tier abgegeben wird und dergleichen.
C. Pflanzenzellen, die ein Schutzprotein enthaltende Immunglobuline enthalten
Der Fachmann versteht, dass die Nukleotidsequenzen, die das Schutzprotein und die einzelnen von Immunglobulin abgeleiteten schweren und leichten Ketten und die J-Kette kodieren, typischerweise operativ verknüpft sind mit einem Promotor und als Teil eines Expressionsvektors oder einer Expressionskassette vorhanden sind.
Nachdem die Gene der von Immunglobulin abgeleiteten schweren und leichten Kette und J-Kette isoliert sind, werden sie typischerweise operativ verknüpft mit einem transkriptionalen Promotor in einem Expressionsvektor.
Die Expression der Bestandteile der gewählten Pflanze kann von einem unabhängig replizierenden Plasmid erfolgen oder von einem permanenten Bestandteil des Chromosoms oder von einem beliebigen Abschnitt von DNA, der vorübergehend Transkripte ergibt, die die Bestandteile kodieren. Das Einbringen der Bestandteile des Komplexes kann durch direkte DNA-Transformation erfolgen, durch ballistische Transformation oder vermittelt durch einen anderen Organismus, wie zum Beispiel durch die Wirkung rekombinanter Agrobakterien, erfolgen. Die Expression von Proteinen in transgenen Pflanzen erfordert in der Regel ein gleichzeitiges Einbringen eines adäquaten Promotorelements und Polyadenylierungssignals. In einer Ausführungsform der Erfindung führt das Promotorelement potenziell zu einer konstitutiven Expression der Bestandteile in allen Zellen der Pflanze. Eine konstitutive Expression, die in den meisten oder allen Zellen auftritt, stellt sicher, dass Vorläufer das gleiche zelluläre Endomembransystem belegen können, wie erforderlich sein kann, damit ein Zusammenfügen stattfindet.
Expressionsvektoren, die mit den Pflanzenzellen kompatibel sind, werden für die Expression der Gene der vorliegenden Erfindung benutzt. Typische Expressionsvektoren, die für die Expression von Genen in Pflanzen anwendbar sind, sind dem Fachmann bekannt und umfassen Vektoren, die von Tumor-induzierendem (Ti-)Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, wie beschrieben von Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153:253–277 (1987). Es sind jedoch auch mehrere andere Expressionsvektorsysteme bekannt, die in Pflanzen funktionieren. Siehe zum Beispiel: Verma et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/00551 ; und Cocking and Davey, Science, 236:1259–1262 (1987).
Die Expressionsvektoren gemäß der vorstehenden Beschreibung enthalten Expressionskontrollelemente einschließlich des Promotors. Die zu exprimierenden Gene sind operativ mit dem Expressionsvektor verknüpft, um die RNA-Polymerasebindung und Synthese des gewünschten Polypeptid kodierenden Gens zu lenken. Anwendbar bei der Expression der Gene sind Promotoren, die induzierbar, viral, synthetisch, konstitutiv und reguliert sind. Die Wahl des Expressionsvektors und schließlich, mit welchem Promotor eine Nukleotidsequenz kodierender Teil des Immunglobulins der vorliegenden Erfindung operativ verknüpft ist, ist, wie dem Fachmann bekannt ist, direkt abhängig von den erwünschten funktionalen Eigenschaften, z. B. der Lokalisierung und der zeitlichen Abstimmung der Expression und der zu transformierenden Wirtszelle, denn dies sind mit der Technik der Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle einhergehenden Einschränkungen. Jedoch ist ein Expressionsvektor, der bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, in der Lage zur Steuerung der Replikation und vorzugsweise auch der Expression des Polypeptid kodierenden Gens, das in dem DNA-Segment enthalten ist, mit dem es operativ verknüpft ist.
Der Expressionsvektor, der zur Expression der Gene verwendet wird, umfasst einen Selektionsmarker, der in einer Pflanzenzelle wirksam ist, vorzugsweise einen Medikamentenresistenzmarker. Ein bevorzugter Medikamentenresistenzmarker ist das Gen, dessen Expression in einer Kanamycinresistenz resultiert, d. h. das chimäre Gen, das den Nopalinsynthasepromotor, Tn5 Neomycin-Phosphotranserferase II und Nopalinsynthase 3' nicht-translatierte Region enthält, wie beschrieben von Rogers et al., in Methods For Plant Molecular Biologe, a Weissbach and H. Weissbach, Hrsg., Academic Press Inc., San Diego, CA, USA (1988). Ein anwendbarer Pflanzenexpressionsvektor ist im Handel erhältlich von Pharmacia, Piscataway, N.J., USA.
Expressionsvektoren und Promotoren für die Expression fremder Proteine in Pflanzen sind beschrieben in den US-Patenten Nr. 5,188,642 ; 5,349,124 ; 5,352,605 und 5,034,322 .
Für die operative Verknüpfung von DNA mit Vektoren über komplementäre über kohäsive Enden ist eine Vielfalt von Verfahren entwickelt worden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymerspuren dem einzusetzenden DNA-Segment der Vektor-DNA hinzugefügt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden danach durch Wasserstoffbindung zwischen den homopolymeren Schwänzen verbunden, um rekombinante DNA-Moleküle zu bilden.
Alternativ können synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsendonuklease-Stellen enthalten, für die Verbindung des DNA-Segments mit dem Expressionsvektor verwendet werden. Die synthetischen Linker werden durch Inkubation der stumpfendigen DNA-Segmente mit einem großen Überschuss an synthetischen Linkermolekülen in Anwesenheit eines Enzym, das in der Lage ist, die Ligation stumpfendiger DNA-Moleküle, wie Bakteriophage T4 DNA-Ligase zu katalysieren, an den stumpfendigen DNA-Segmenten angebracht. Somit handelt es sich bei den Reaktionsprodukten um DNA-Segmente, die synthetische Linkersequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden anschließend mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease gespalten und in einen Expressionsvektor ligiert, der mit einem Enzym gespalten worden ist, das Enden erzeugt, die mit denen des synthetischen Linkers kompatibel sind. Synthetische Linker, die eine Vielfalt von Restriktionsendonuklease-Stellen enthalten, sind im Handel erhältlich von verschiedenen Quellen einschließlich New England BioLabs, Beverly, MA., USA.
Die Nukleotidsequenzen, die das Schutzprotein und alle anderen der Immunglobuline kodieren, werden in die gleiche Pflanzenzelle eingebracht, und zwar entweder direkt oder durch Einbringen jedes der Bestandteile in eine Pflanzenzelle und Regenerieren einer Pflanze und Kreuzhybridisieren der verschiedenen Bestandteile, um die endgültige Pflanzenzelle zu erzeugen, die alle erforderlichen Bestandteile enthält.
Das Einbringen der Nukleotidsequenzen, die die Bestandteile der Immunglobuline der vorliegenden Erfindung kodieren, kann nach jedem beliebigen Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel umfassen die Verfahren zum Einbringen von Genen in Pflanzen eine von Agrobacterium vermittelte Transformation, Protoplasttransformation, Gentransfer in Pollen, Injektion in reproduktive Organe und Injektion in unreife Keime. Jedes dieser Verfahren weist ausgeprägte Vorteile und Nachteile auf. Daraus ergibt sich, dass ein besonderes Verfahren für das Einbringen von Genen in eine spezifische Pflanzenart nicht notwendigerweise das effizienteste Verfahren bei einer anderen Pflanzenart sein muss.
Durch Agrobacterium tumefaciens vermittelter Transfer ist ein viel angewendetes System für das Einbringen von Genen in Pflanzenzellen, das die DNA in das gesamte Pflanzengewebe eingebracht und die Notwendigkeit einer Regeneration einer intakten Pflanzen von einem Protoplasten umgangen werden kann. Die Anwendung von durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Expressionsvektoren für Einbringen von DNA in Pflanzenzellen ist dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel die Verfahren, die beschrieben sind von: Fraley et al., Biotechnology, 3:629 (1985) und Rogers et al., Methods in Enzymology, 153:253–277 (1987). Darüber hinaus ist die Integration von Ti-DNA ein relativ exaktes Verfahren, das in einer geringen Anzahl von Änderungen resultiert. Die Region der DNA, die transferiert werden soll, wird durch die Grenzsequenzen definiert, und die Insertion der intervenierenden DNA in das Pflanzengenom erfolgt in der Regel wie von Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205:34 (1986) und Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207:471 (1987) beschrieben. Moderne Agrobacterium-Transformationsvektoren sind fähig zur Replikation in Escherichia coli ebenso wie in Agrobacterium, was eine komfortable Bearbeitung gestattet, wie von Klee et al., in Plant DNA Infectious Agents, T. Hohn and J. Schell, Hrsg., Springer-Verlag, New York (1985) S. 179–203, beschrieben. Neuerliche technologische Fortschritte in Bezug auf Vektoren für von Agrobacterium vermittelten Gentransfer haben zu Verbesserungen der Anordnung von Genen und Restriktionsstellen in den Vektoren geführt und dadurch die Konstruktion von Vektoren mit der Fähigkeit zur Expression verschiedener Polypeptid kodierender Genen erleichtert. Die Vektoren, die von Rogers et al., Methods in Enzymology, 153:253 (1987) beschrieben sind, haben praktische Multi-Linker-Regionen, die seitlich einen Promotor haben, und eine Polyadenylierungsstelle für direkte Expression insertierter Polypeptid kodierender Gene und eignen sich für die gegenwärtigen Zwecke.
Die von Agrobacterium vermittelte Transformation von Blattscheiben und anderen Gewebeteilen scheint auf Pflanzenarten beschränkt zu sein, die Agrobacterium tumefaciens natürlich infiziert. Demzufolge hat die von Agrobacterium vermittelte Transformation ihre größte Effizienz in zweikeimblättrigen Pflanzen. Allerdings lässt sich auch eine Transformation von Asparagus mithilfe von Agrobacterium durchführen. Siehe zum Beispiel: Bytebier, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:5345 (1987).
Bei den Pflanzen, bei denen die von Agrobacterium vermittelte Transformation wirksam ist, ist dieses Verfahren die richtige Wahl aufgrund der einfachen und definierten Art des Gentransfers. Allerdings scheinen nur wenige einkeimblättrige Pflanzen natürliche Wirte für Agrobacterium zu sein, obwohl transgene Pflanzen mithilfe von Agrobacterium-Vektoren in Asparagus erzeugt worden sind, wie von Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:5345 (1987) beschrieben. Deshalb müssen kommerziell wichtige Getreide wie Reis, Mais und Weizen durch die Anwendung anderer Verfahren transformiert werden. Die Transformation von Pflanzenprotoplasten kann mithilfe von Verfahren durchgeführt werden, die auf Calciumphosphatfällung, Polyethylenglycolbehandlung, Elektroporation und Kombinationen dieser Verfahren basieren. Siehe zum Beispiel: Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985); Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178 (1985); Fromm et al., Nature, 319:791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204:204 (1986); Callis et al., Genes and Development, 1:1183 (1987); und Marcotte et al., Nature, 335:454 (1988).
Die Anwendung dieser Systeme bei verschiedenen Pflanzenarten richtet sich nach der Fähigkeit zur Regeneration der spezifischen Pflanzenart von Protoplasten. Anschauliche Verfahren für die Regeneration von Getreide aus Protoplasten sind beschrieben in: Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2:74 (1985); Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73:16 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep., 4:85 (1986) und Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087 (1986).
Für die Transformation von Pflanzenarten, die sich nicht mit Erfolg von Protoplasten regenerieren lassen, können andere Verfahren zum Einbringen von DNA in intakte Zellen oder Gewebe in Frage kommen. Zum Beispiel kann die Regeneration von Getreide aus unreifen Keimen oder Explantaten wie von Vasil, Biotechnology, 6:397 (1988). beschrieben, durchgeführt werden. Darüber hinaus kann auch die Partikelpistolen-Technik oder ein Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektil-Beschuss angewendet werden. Bei der Anwendung einer solchen Technik wird die DNA auf kleinen (0,525 μm) Metallpartikeln, die auf Geschwindigkeiten von einem bis zu mehreren Hundert Meter pro Sekunde beschleunigt werden, durch die Zellwand in das Zytoplasma transportiert, wie von Klein et al., Nature, 327:70 (1987); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8502 (1988); und McCabe et al., Biotechnology, 6:923 (1988) beschrieben. Die Metallpartikel durchdringen mehrere Schichten von Zellen und ermöglichen dadurch die Transformation von Zellen innerhalb der Gewebeexplantaten. Metallpartikel sind mit Erfolg für die Transformation von Maiszellen und zur Erzeugung fertiler, stabiler Tabak- und Sojabohnenpflanzen benutzt worden. Die Transformation von Gewebeexplantaten eliminiert die Notwendigkeit eines Wegs durch eine Protoplaststufe, und dadurch beschleunigt sich die Produktion transgener Pflanzen.
DNA kann auch durch direkten DNA-Transfer in Pflanzen eingebracht werden, wie von Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); und Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988) beschrieben. Die Expression von Polypeptid kodierenden Genen kann durch Injektion der DNA in reproduktive Organe einer Pflanze erfolgen, wie von Pena et al., Nature, 325:274 (1987) beschrieben. DNA kann auch direkt in die Zellen unreifer Keime injiziert werden, und die Rehydrierung der ausgetrockneten Keime wie beschrieben von Neuhaus et al., Theor. Apl. Genet., 75:30 (1987); und Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, MA, S. 27–54 (1986).
Die Regeneration von Pflanzen von sowohl Einzelpflanzenprotoplasten als auch verschiedenen Explantaten ist dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel: Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA (1988). Dieser Regenerations- und Züchtungsprozess umfasst die Schritte einer Auswahl von Transformant-Zellen und -Sprossen, Bewurzelung der Transformant-Sprosse und Züchtung der Pflänzchen in Erde.
Die Regeneration von Pflanzen, die das mithilfe von Agrobacterium tumefaciens von Blattexplantaten eingebrachte Fremdgen enthalten, kann durchgeführt werden, wie von Horsch et al., Science, 227:1229–1231 (1985) beschrieben. Bei diesem Vorgang erfolgt ein Züchten der Transformanten in Anwesenheit eines Selektionsmittels und in einem Medium, das die Regeneration von Sprossen in den Pflanzenarten, die transformiert werden, induziert, wie beschrieben von Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Dieser Vorgang ergibt typischerweise Sprosse innerhalb von zwei bis vier Wochen, und diese Transformant-Sprosse werden dann auf ein entsprechendes Wurzelbildung-induzierendes Medium übertragen, das das Selektionsmittel und ein Antibiotikum, um ein Bakterienwachstum zu verhindern, enthält. Transformant-Sprosse, die in Anwesenheit des Selektiermittels bewurzelt werden, um Pflänzchen zu bilden, werden danach in Erde transplantiert, um eine Produktion von Wurzeln zu ermöglichen. Diese Vorgänge variieren in Abhängigkeit von der jeweils eingesetzten Pflanzenart, und solche Variationen sind dem Fachmann bekannt.
Die Immunglobuline können in jeder beliebigen Pflanzenzelle erzeugt werden, einschließlich Pflanzenzellen, die von Pflanzen abgeleitet sind, die zweikeimblättrig oder einkeimblättrig, Solanaceen-, Alfalfa-, Leguminosen- oder Tabakpflanzen sind.
Transgene Pflanzen können aus allen sexuell kreuzbaren Pflanzenarten erzeugt werden, die nach einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren transformiert werden können. Anwendbare Pflanzenarten sind zweikeimblättrige (dikotyle) Pflanzen, einschließlich Tabak, Tomate, Leguminosen, Alfalfa, Eiche und Ahorn; einkeimblättrige (monokotyle) Pflanzen, einschließlich Gräsern, Mais, Getreide, Hafer, Weizen und Gerste; und niedere Pflanzen, einschließlich Nacktsamern, Koniferen, Schachtelhalmen, Bärlappen, Lebermoosen, Hornmoosen, Algen, Gametophyten, Sporophyten von Pteridophyten.
Die Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung können, zusätzlich zum Schutzprotein und der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette, auch eine Nukleotidsequenz enthalten, die eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette kodiert, welche mindestens einen Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne hat.
Die Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung können eine Antigenbindungsdomäne aufweisen, die in der Lage ist, an ein Antigen von S. mutans Serotypen a, c, d, e, f, g und h (S. mutans c, e und f und S. sobrinus Serotypen d und g nach neuer Nomenklatur) auf den von Immunglobulin abgeleiteten schweren und leichten Ketten zu binden. Die Antigenbindungsdomäne, die in diesen Pflanzenzellen vorhanden ist, kann auch fähig sein, an die zuständigen pathogenen Schleimhautparasiten zu binden und Zahnkaries vorzubeugen.
Die Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung können Bestandteil einer Pflanze sein und von einem der folgenden Pflanzentypen stammen: zweikeimblättrige, einkeimblättrige, Solanaceen-, Alfalfa-, Tabak- oder anderem Pflanzentyp.
D. Zusammensetzungen, die Schutzproteine enthaltende Immunglobuline enthalten
Zusammensetzungen von Bedeutung, die Immunglobuline der vorliegenden Erfindung und Pflanzenmakromoleküle enthalten, werden beschrieben. Typischerweise sind diese Pflanzenmakromoleküle abgeleitet von jeder beliebigen Pflanze, die in der vorliegenden Erfindung anwendbar ist. Die Pflanzenmakromoleküle sind zusammen mit einem Immunglobulin zum Beispiel in einer Pflanzenzelle, in einem Extrakt aus einer Pflanzenzelle oder in einer Pflanze vorhanden. Typische Pflanzenmakromoleküle die mit Immunglobulinen in einer Zusammensetzung assoziiert sind, sind Ribulosebiphosphatcarboxylase, Lichtsammelkomplex, (LH6)-Farbstoffe, sekundäre Metaboliten oder Chlorophyll. Die Zusammensetzungen können ein Immunglobulin enthalten, das in einer Konzentration von zwischen 1 % und 99 % der Masse ohne Wasser vorhanden ist. Andere bevorzugte Zusammensetzungen umfassen Zusammenzusammensetzungen, in denen die Immunglobuline in einer Konzentration von zwischen 1 % und 50 % der Masse ohne Wasser vorhanden sind. Weitere Zusammensetzungen umfassen Immunglobuline in einer Konzentration von zwischen 1 % und 15 % der Masse ohne Wasser.
Die Zusammensetzungen können Pflanzenmakromoleküle in einer Konzentration von zwischen 1 % und 99 % der Masse ohne Wasser enthalten. Typischerweise besteht die in der Zusammensetzung vorhandene Masse, aus Pflanzenmakromolekülen und Immunglobulinen. Wenn die Immunglobuline in einer höheren oder niedrigeren Konzentration vorhanden sind, variiert die Konzentration der Pflanzenmakromoleküle umgekehrt. Die Zusammensetzung von Pflanzenmakromolekülen kann in einer Konzentration von zwischen 50 % und 99 % der Masse ohne Wasser vorhanden sein. In einigen Zusammensetzungen sind die Makromoleküle in einer Konzentration von zwischen 75 % und 99 % der Masse ohne Wasser vorhanden.
Eine Zusammensetzung von Bedeutung kann Alles oder einen Teil von Folgendem umfassen: eine schwere IgA-Kette, eine kappa- oder lambda-Kette, eine J-Kette. Diese Bestandteile bilden einen Komplex und sind, wie vorstehend definiert, am Schutzprotein angebracht. Die Zusammensetzung enthält auch von einer Pflanze abgeleitete Moleküle. Diese Zusammensetzung kann auch nach einem Extraktionsvorgang, der einen funktionalen Antikörper und von Pflanze abgeleitete Moleküle ergibt, erhalten werden.
Das Extraktionsverfahren umfasst die Schritte des Anbringens einer Kraft bei einer Pflanze, die den Komplex enthält, wobei der apoplastische Raum der Pflanze aufgebrochen wird und den Komplex freigibt. Die Kraft umfasst Scheren, ausgedrückt in dyn/cm², als primäres Verfahren für das Freisetzen der apoplastischen Flüssigkeit.
Die ganze Pflanze oder das Pflanzenextrakt enthält eine Beimischung von Antikörper und verschiedenen anderen Makromolekülen der Pflanze. Die Makromoleküle, die in der Beimischung enthalten sind, umfassen Ribulosebiphosphatcarboxylase (RuBisCo) oder Fragmente von RuBisCo. Ein anderes Makromolekül ist LHCP. Ein anderes Molekül ist Chlorophyll.
Scherkraft ist eine anwendbare Komponente der Gesamtkraft, die an der Pflanze zum Aufbrechen der apoplastischen Räume angebracht wird. Andere Typen von Kräften können auch einbezogen werden, um die Scherwirkung zu optimieren. Direkter Druck, zum Beispiel, gemessen in lbs/in², kann die Wirkung des für die Anbringung der Scherkraft benutzten Gerätes verstärken. Gewöhnlich angewandte Homogenisiertechniken, die nicht für die Extraktion von Antikörpern geeignet sind, arbeiten mit schnell laufenden Flügeln oder Zylindern, die schlagartig alle Pflanzenstrukturen zerstören.
Zusammensetzungen können ein Immunglobulin und von einer zweikeimblättrigen oder einkeimblättrigen, Solanaceen-, Alfalfa-, Tabak- oder anderen Pflanze abgeleitete Pflanzenmoleküle enthalten. Die in den Zusammensetzungen vorhandenen Pflanzenmoleküle können Ribulosebiphosphatcarboxylase, Lichtsammelkomplex, Farbstoffe, sekundäre Metaboliten, Chlorophyll oder andere Pflanzenmoleküle sein.
Andere anwendbare Verfahren für die Zubereitung einer Zusammensetzung, die ein Schutzprotein enthaltende Immunglobuline enthält, umfassen eine Extraktion von Schutzprotein mithilfe verschiedener Lösungsmittel und ein Beaufschlagen des Pflanzenmaterials mit Vakuum. Die Zusammensetzungen können Pflanzenmakromoleküle in einer Konzentration von zwischen 1 % und 99 % der Masse ohne Wasser enthalten.
Therapeutische Zusammensetzungen, die Immunglobuline und Pflanzenmakromoleküle enthalten, können erzeugt werden durch Bearbeitung einer Pflanze in Form von Scheren eines Teils dieser Pflanze unter Druck, so dass eine Pulpe produziert wird, die das therapeutische Immunglobulin und Pflanzenmakromoleküle in einer vom Apoplast oder Symplast abgeleiteten Flüssigkeit, die auch das von der festen Pflanze abgeleitete Material enthält, enthält. Die weitere Bearbeitung kann durch Trennen des von der festen Pflanze abgeleiteten Materials von der von der Pflanze abgeleiteten Flüssigkeit, die die Immunglobuline enthält, erfolgen. Das Ausgangsmaterial für einen solchen Vorgang kann Pflanzenblätter, -stiele, -wurzeln, -knollen, -samen oder die ganze Pflanze umfassen. Typischerweise erfolgt diese Bearbeitung in einer mechanischen Vorrichtung, die Flüssigkeit aus dem Apoplast oder Symplast der Pflanze herauslöst. Zusätzliche Bearbeitungsschritte können Trennen des von der ganzen Pflanze abgeleiteten Materials von der Flüssigkeit mittels Zentrifugieren, Ablagerung, Ausflockung oder Filtration. Der Fachmann versteht, dass diese Trennverfahren in einem Entfernen des von der ganzen Pflanze abgeleiteten Materials aus der Flüssigkeit einschließlich der Immunglobuline. Die Verfahren können Immunglobuline produzieren, die ein Schutzprotein und eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, die Domänen oder Abschnitte von Immunglobulin-alphakette und Immunglobulin-gamma-Kette umfasst, umfasst. Die Verfahren können Immunglobuline produzieren, die ein Schutzprotein und eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, die Domänen oder Abschnitte von Immunglobulin-kappa-Kette und Immunglobulin-lambda-Kette umfasst, umfasst.
Die Verfahren sind einsetzbar bei Pflanzenzellen oder Teilen einer Pflanze. Die Verfahren können auch Verfahren enthalten, die ein Züchten der Pflanze umfassen. Die Verfahren können bei jeder Pflanze einschließlich zweikeimblättrigen oder einkeimblättrigen Pflanzen, Solanaceen, Leguminosen, Alfalfa oder Tabak eingesetzt werden. Die Verfahren können benutzt werden für die Extraktion von Immunglobulinen aus einem Teil einer Pflanze, wie einem Blatt, Stiel, einer Wurzel, Knolle, Samen, einer Frucht oder aus einer ganzen Pflanze. Die Verfahren können eine mechanische Vorrichtung zum Scheren der Pflanzen einbeziehen, um Flüssigkeit aus dem Apoplast oder Symplast der Pflanze herauszulösen. Die Pflanzenpulpe kann durch eine Anwendung einer der folgenden Verfahren: Zentrifugieren, Ablagerung, Ausflockung oder Filtration, getrennt werden, um festes Pflanzenmaterial zu entfernen.
E. Verfahren zur Produktion von Schutzproteinen enthaltenden Immunglobulinen
Verfahren zur Produktion von Immunglobulinen, die ein Schutzprotein enthalten, können folgende Schritte umfassen:

(a) Einbringen eines Expressionsvektors, der eine Nukleotidsequenz enthält, die ein operativ mit einem transkriptionalen Promotor verknüpftes Schutzprotein kodiert, in eine Pflanzenzelle; und
(b) Einbringen eines Expressionsvektors, der eine Nukleotidsequenz enthält. die eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, die mindestens einen Teil einer operativ mit einem transkriptionalen Promotor verknüpften Antigenbindungsdomäne enthält, kodiert, in die gleiche Pflanzenzelle.

Die Verfahren können ein Einbringen einer Nukleotidsequenz, die eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, die mindestens einen Teil einer operativ mit einem transkriptionalen Promotor verknüpften Antigenbindungsdomäne kodiert, in die Pflanzenzelle, die den Expressionsvektor mit den Nukleotidsequenzen für das Schutzprotein und die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette enthält, umfassen. Die Verfahren können auch ein Einbringen eines mit einer Nukleotidsequenz, die eine J-Kette kodiert, operativ verknüpften Promotors in eine Zelle, die bereits Nukleotidsequenzen und für ein Kodieren eines Schutzproteins und einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette und einer von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette operativ verknüpften Promotors umfassen. Dies resultiert in einer Zelle, die die Nukleotidsequenzen enthält, die mit Promotoren für eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette und eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, J-Kette und ein Schutzprotein operativ verknüpft sind.
Die Pflanzenzellen können als Teil einer wachstumsfähigen Pflanze vorhanden sein. Besonders anwendbare Pflanzen für diese Erfindung umfassen zweikeimblättrige, einkeimblättrige, Solanaceen-, Leguminosen-, Alfalfa-, Tomaten- und Tabakpflanzen.
Die Verfahren umfassen eine Produktion eines zusammengefügten Immunglobulins, das schwere, leichte und J-Ketten und ein Schutzprotein innerhalb einer eukaryotischen Zelle aufweist. Diese eukaryotische Zelle wird durch Einbringen von Nukleotidsequenzen, die für Expression operativ verknüpft sind, die eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, welche mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne aufweist, eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, welche mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne aufweist, eine von Immunglobulin abgeleitete J-Kette und ein Schutzprotein kodieren, in diese Zelle produziert. Diese Nukleotidsequenzen sind operativ verknüpft für Expression durch Anbringen geeigneter Promotoren an jeder individuellen Nukleotidsequenz oder an mehr als einer Nukleotidsequenz, wobei zwei Nukleotidsequenzen, die verschiedene Moleküle kodieren, hintereinander platziert werden.
Die eukaryotische Zelle, nach den gegenwärtigen Verfahren produziert, die diese von Immunglobulin abgeleiteten schweren, leichten und J-Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen enthält, wird unter Bedingungen erhalten, die diesen Molekülen ein Reproduzieren und Zusammenfügen zu einem Immunglobulin, das Schutzproteine der vorliegenden Erfindung enthält, ermöglicht.
Verfahren zur Produktion eines besonderen Immunglobulins oder einer Antigenbindungsdomäne oder von Domänen eines gegen Umgebungsbedingungen resistenten und stabileren Immunglobulins können realisiert werden, indem eine Nukleotidsequenz, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne, die von einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette abgeleitet ist, in eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die mindestens eine von Immunglobulin abgeleitete α- oder μ-Kette abgeleitete Domäne kodiert, um eine Nukleotidsequenz zu bilden, die eine chimäre von Immunglobulin abgeleitete Kette kodiert. Diese Nukleotidsequenz, die die chimäre von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette kodiert, wird in eine eukaryotischen Zelle exprimiert, die außerdem mindestens ein anderes Molekül enthält, wie ein Schutzprotein, eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne aufweist, und eine von Immunglobulin abgeleitete J-Kette enthält. Die Zelle kann alle diese Moleküle enthalten, einschließlich einer von Immunglobulin abgeleiteten Kette, die eine Antigenbindungsdomäne aufweist, welche komplementär zu der Antigenbindungsdomäne ist, die auf der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette vorhanden ist. Dieses Verfahren ermöglicht ein Zusammenfügen der chimären von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette und mindestens einem anderen Molekül, zum Beispiel der von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette, die die komplementäre Antigenbindungsdomäne aufweist, und einer von Immunglobulin abgeleiteten J-Kette und dem Schutzprotein, um ein Immunglobulin zu bilden, das das Schutzprotein aufweist, das resistent gegen Umgebungsbedingungen ist.
Diese Immunglobuline sind resistent gegen Umgebungsbedingungen und somit stabiler, wenn sie höheren oder niedrigeren Temperaturen, hohem oder niedrigem pH-Wert, proteolytischen Enzymen von hohen oder niedrigen Innenkonzentrationen oder anderen rauen Bedingungen ausgesetzt werden. Solche rauen Bedingungen sind typischerweise zu finden in natürlichen Wasserquellen, im menschlichen Körper, zum Beispiel im Darm und auf Schleimhautoberflächen, und auf der Oberfläche eines Tieres wie eines Säugers.
F. Chimäre, Schutzproteine enthaltende Immunglobuline
Immunglobuline können ein Schutzprotein enthalten, in dem die Immunglobulindomänen, die schwere und leichte Ketten aufweisen, von verschiedenen Isotopen von entweder Schwer- oder Leichtketten-Immunglobulinen abgeleitet sind. Der Fachmann versteht, dass durch Anwendung von Molekulartechniken diese Domänen eine ähnliche Domäne substituieren und ein Immunglobulin produzieren können, das ein Hybrid zwischen zwei verschiedenen Immunglobulinmolekülen ist. Diese chimären Immunglobuline gestatten eine Konstruktion von Immunglobulinen, die eine Auswahl verschiedener und erwünschter Eigenschaften, die von verschiedenen Immunglobulindomänen vermittelt werden, besitzen.
Chimäre Immunglobuline können schwere, leichte und J-Ketten umfassen, die weniger als eine ganze von einem verschiedenen Modul abgeleitete Domäne enthalten. Die gleichen Molekulartechniken können angewendet werden, um solche chimären Immunglobuline zu produzieren.
Immunglobuline können mindestens die C_H1-, C_H2-, C_H3-Domäne des IgG, IgG1, IgG2A, Ig2GB, IgG3, IgA, IgE oder IgD der Maus enthalten. Immunglobuline umfassen mindestens die Cμl-, Cμ2-, Cμ3- oder Cμ4-Domäne des IgM des Maus-Immunglobulins können Immunglobuline umfassen, die die Domänen Cε2, Cε3 und Cε4 von Maus-Immunglobulin IgE umfassen.
Chimäre Immunglobuline können von menschlichen Immunglobulinen abgeleitet sein. Diese chimären Immunglobuline enthalten Domänen von zwei verschiedenen Isotopen des menschlichen Immunglobulins. Solche Immunglobuline können Immunglobuline umfassen. die Immunglobulindomänen einschließlich der C_H1-, C_H2- oder C_H3-Domäne des IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 oder IgD des Menschen umfassen. Andere Immunglobuline können Immunglobuline umfassen, die Domänen von mindestens der Cμ1-, C_H2-, C_H3- oder G_H4-Domäne des IgM oder IgE des Menschen umfassen. Immunglobuline können Immunglobulindomänen enthalten, die von mindestens zwei verschiedenen Isotopen von Säuger-Immunglobulinen abgeleitet sind. Im Allgemeinen kann jedes der Säuger-Immunglobuline verwendet werden, wie die folgenden Isotopen: jeder beliebige Isotyp des IgG, jeder beliebige Isotyp des IgA, IgE, OgD oder IgM. Die Immunglobuline der vorliegenden Erfindung enthielten mindestens eine der Domänen der konstanten Region von zwei verschiedenen Isotopen von Säuger-Immunglobulin.
Immunglobuline können Immunglobulindomänen enthalten, die von zwei verschiedenen Isotopen von Nagerimmunglobulin abgeleitet sind. Die Isotopen von Nagerimmunglobulin sind dem Fachmann bekannt. Die Immunglobuline können von Immunglobulin abgeleitete schwere Ketten enthalten, die mindestens eine der folgenden Immunglobulindomänen aufweisen: die Domänen C_H1, C_H2 oder C_H3 des IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE oder IgD der Maus; die Domäne C_H1, C_H2, C_H3, C_H4 des IgE oder IgM der Maus; die Domäne C_H1, C_H2 oder C_H3 des IgG, IgG1, IgG2, IgG3, Ig4, IgA1, IgA2 oder IgD des Menschen; die Domäne C_H1-, C_H2-, C_H3-, C_H4 des IgM oder IgE des Menschen; die Domäne C_H1, C_H2 oder C_H3 eines Isotypen des Säuger-IgG, eines Isotypen von IgA, IgE oder IgD; die Domäne C_H1-, C_H2-, C_H3-, C_H4 des IgE oder IgM des Säugers; die Domäne C_H1, C_H2 oder C_H3 eines Isotypen des IgG, IgA, IgE oder IgD des Nagers; die Domäne C_H1-, C_H2-, C_H3-, C_H4 des IgE oder IgM des Nagers; die Domäne C_H1, C_H2 oder C_H3 eines IgG des Tiers, eines Isotypen des IgA, IgE oder IgD; und die Domäne des IgE oder IgM des Tiers. Ein Versetzen oder Hinzufügen von Proteindomänen, die abgeleitet sind von Molekülen, die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie sind, ist möglich. Die Moleküle, die zur Immunglobulin-Superfamilie gehören, haben Aminosäurerestsequenz- und Nukleinsäuresequenzhomologie mit den Immunglobulinen. Die Moleküle, die Teil der Immunglobulin-Superfamilie sind, können durch Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzhomologie identifiziert werden. Siehe zum Beispiel: S. 361 in Immunoglobulin Genes, Academic Press (1989).
Tetratransgene Pflanzen:
Eine tetratransgene Pflanze besteht aus Zellen, bei denen in die Nukleinsäure dieser Zelle oder Pflanze innerhalb der Zelle vier verschiedene Transgene, von denen jedes ein unterschiedliches Polypeptid kodiert, eingefügt sind. Diese Transgene unterscheiden sich voneinander darin, dass die Boten-RNA und die von diesem Transgen produzierten Polypeptide sich von den anderen der vier Transgene unterscheiden. Demzufolge beinhaltet die Anzahl der Transgene, auf die Bezug genommen wird, keine Vielzahl von Kopien des gleichen Transgens, wie normalerweise in transgenen Organismen vorgefunden wird. Transgene Pflanzen haben vier Transgene, die keine identischen Kopien von anderen Transgenen sind. Nicht ausgeschlossen ist die Möglichkeit, dass jedes der vier verschiedenen Transgene in mehrfachen Kopien vorhanden sein kann. Dennoch sind mindestens vier separate Transgene, die verschieden sind, in den Zellen der transgenen Pflanze vorhanden.
Es wird insofern auf vier verschiedene Transgene Bezug genommen, als diese Transgene ein Polypeptid kodieren, das Bestandteil eines Multipolypeptidmoleküls ist. Deshalb würde jede individuelle Polypeptidkette eines Multipeptidmoleküls auf einem Transgen innerhalb einer Zelle der transgenen Pflanze vorhanden sein. Die Expression jedes individuellen, unterschiedlichen Polypeptids des Multipeptidmoleküls gestattet den verschiedenen Polypeptiden eine Assoziierung, um zusammen das Multipeptidmolekül innerhalb der transgenen Zellen vom Tier zu bilden. Demzufolge werden von den vier verschiedenen Transgenen in jeder individuellen Zelle keine Transgene umfasst, die Polypeptide kodieren, die nicht miteinander assoziieren, um ein Multipeptidmolekül durchzuführen, Beispiele für solche Transgene, die Moleküle kodieren, die nicht miteinander assoziieren, sind Polypeptide für antibiotische Resistenz, wie Kanamycin oder Neomycin oder Thymidinkinase.
Die Transgene, die in einer transgenen Pflanze vorhanden sind, können die folgenden vier verschiedenen Polypeptide kodieren: ein Schutzprotein; eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne aufweist; eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette, die mindestens einen Teil einer Antigenbindungsdomäne aufweist; und eine von Immunglobulin abgeleitete J-Kette. Eines der Transgene, die in der transgenen Pflanze vorhanden sind, kann eine chimäre von Immunglobulin abgeleitete schwere, leichte oder J-Kette kodieren. Ein Transgen der transgenen Pflanzen kann eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette, die mindestens zu einem Teil von entweder einem IgA- oder einem IgM-Immunglobulin abgeleitet ist, kodieren. Transgene Pflanzen, die Transgene enthalten, können mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz kodieren, die von einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette abgeleitet ist, welche von einer entweder von IgA- oder IgM-Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette abgeleitet ist.
Verfahren zur Erzeugung transgener Organismen sind dem Fachmann bekannt. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 4,736,866 ; 4,607,388 ; 4,870,009 und 4,873,191 .
Immunglobuline, die Immunglobulindomänen enthaltende von Immunglobulin abgeleitete schwere oder von Immunglobulin abgeleitete leichte Ketten enthalten, können so modifiziert werden, dass die diese Domänen weniger immunogen in einer spezifischen Art machen. Typischerweise wird das Immunglobulinmolekül so modifiziert, dass es insofern „humanisiert" ist, als es als Immunglobulin des Menschen erscheint, obwohl es von verschiedenen anderen Arten abgeleitet ist.
Beispiele
Die nachstehenden Beispiele erläutern die offenbarte Erfindung. Diese Beispiele sind in keiner Weise als Einschränkung der aus den Ansprüchen hervorgehenden Erfindung zu betrachten.
Beispiel 1. Konstruktion von DNA-Vektoren für Expression von Antikörpern in Pflanzen
a. Isolierung der Nukleotidsequenzen, die das Immunglobulin Guy's 13 kodieren
Eine molekulare Klonierung der gamma- und kappa-Ketten des Anti-S. mutans-Antikörpers Guy's 13 wurde mithilfe der von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131 (1994) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Kurz dargestellt, wurde mRNA aus der Hybridom-Zelllinie Guy's 13 extrahiert und durch Standardverfahren in die cDNA konvertiert. Die cDNA wurde dann mithilfe eines Paars von Oligonukleotiden, die spezifisch entweder zur gamma- oder zur kappa-cDNA komplementär waren, amplifiziert. Die Amplifikation wurde mit Taq 1 Polymerase unter Einsatz eines Thermozyklers wie beschrieben katalysiert. Die amplifizierten cDNA wurden danach mithilfe der geeigneten Restriktionsendonukleasen aufgeschlossen und in einen Standard-Pflanzenexpressionsvektor in die entsprechenden Restriktionsstellen ligiert. Im Schrifttum ist eine große Anzahl von Beispielen über solche Vektoren genannt, und die Vektoren sind allgemein zugänglich. Ein Beispiel für einen Vektor, der benutzt werden kann, ist der Vektor pBIN19.
In einer weiteren Serie von Untersuchungen wurde die cDNA in den bakteriellen Vektor Bluescript kloniert. Dieses Konstrukt wurde benutzt, um die Sequenz der gamma- und kappa-cDNA mithilfe der Methoden von Maxam und Gilbert zu bestimmen.
Die Vorgänge zum Klonieren der Antikörper-cDNA unter Einbeziehung von PCR-Verfahren oder durch Konstruktion von cDNA-Bibliotheken und nachfolgender Ligierung der erhaltenen cDNA in entsprechende Vektoren sind übliche Verfahren, die dem Fachmann mit gewöhnlichen Kenntnissen auf diesem Gebiet geläufig sind.
b. Hybrid-cDNA, die die variable Region einer schweren Kette Guy's 13, einen Teil der konstanten Region der gamma-Kette und einen Teil der konstanten Region der alpha-Kette, kodieren
Diese Konstrukte wurden gemäß Beschreibung in Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131 (1994) synthetisiert und in die entsprechenden Pflanzenexpressionsvektoren ligiert, wie vorstehend beschrieben. Das fertige Konstrukt hatte folgende Struktur: Variable Region von Guy's 13-(IgG1 C_H1)-(IgG1 C_H2)-(IgA C_H2)-(IgA C_H3), bezeichnet als IgG2A-Schwerkette, und variable Region von Guy's 13-(IgG1CH₁)-(IgACH2)-(IgACH3).
c) Das Schutzprotein und die J-Kette
Der klonierte Kaninchen-Polyimmunglobulinrezeptor (pIgR) cDNA ist beschrieben von Mostov, Nature, 308:37 (1984) und in 8 gezeigt. Der Schutzproteinteil wurde durch PCR-Amplifizierung eines Teils der Nukleotidsequenz, die für den (pIgR) kodiert, und Ligieren in entsprechende Pflanzenexpressionsvektoren, wie vorstehend beschrieben, erlangt. Der Schutzproteinteil des in diesen Konstrukten verwendeten pIgR umfasste das Codon für Aminosäure Nummer 1 bis zum Codon für die Aminosäure Nummer 606. Das Verfahren für die Durchführung dieser Konstruktion ist dem Fachmann bekannt, und die Oligonukleotide können durch Verwenden der pIgR-Nukleinsäuresequenz gewählt werden.
d) cDNA, die aglycosylierte Ableitungen von konstanten Regionen von schweren Ketten kodieren
Mutagenesevorgänge wurden nach einem der beiden Stratagene-Protokolle durchgeführt. In jedem Fall (d. h. konstante alpha-Region oder Schutzprotein) wurde das Codon für das Asparagin, das als Attachment-Site für Kohlenhydrate benutzt wurde, gegen ein Codon für Histidin ausgetauscht.
Beispiel 2. Produktion von transgenen Pflanzen, die therapeutische Antikörper exprimieren
Pflanzen und Pflanzenzellen, die ein Schutzprotein enthaltende Immunglobuline enthalten, wurden auf folgende Weise produziert.
a) Transfer von Vektoren an Agrobacterium tumefaciens
Die Pflanzentransformation wurde mithilfe von Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. E. coli DH5α, die den rekombinanten pMON530 Pflanzenexpressionsvektor trugen, wurden mit Agrobacterium in Anwesenheit eines Hilfsstamms (pRK2013) gepaart, um Transferfunktionen bereitzustellen. Alternativ wurde pMON530 Plasmid DNA durch direkte Transformation in Agrobakterien eingebracht. Bei diesem Vorgang wurde der Agrobakterienstamm zuerst über Nacht bei 28 °C in YEP-Medium kultiviert. 2 ml der Übernachtkultur wurde zur Animpfung von 50 ml YEP verwendet und bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 kultiviert. Die Zellen wurden danach auf 4 °C gekühlt, durch Zentrifugieren pelletiert und in 1 ml eiskaltem 20 mM CaCl2 resuspendiert. Etwa 1 μg DNA wurde zu Teilmengen von 0,1 ml der eiskalten Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden dann durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff oder in ein Trockeneis-Ethanolbad rasch gefroren. Die Zellen wurden durch Inkubation bei 37 °C während 5 Minuten aufgetaut, im Anschluss daran wurde 1 ml YEP-Medium hinzugefügt. Die Zellen durften während 2–4 Stunden bei schonendem Durchschütteln inkubieren. Individuelle Kolonien, die den rekombinanten Vektor enthielten, wurden durch Inkubation auf YEP-Agarplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthielten, isoliert.
Agrobakterien, die pMON530 enthielten, wurden in Kanamycin, Spectinomycin und Chloramphenicol enthaltenden Medien kultiviert. Danach wurden kleine Segmente von Tabakblättern mit dem Agrobacterium während 2 Tagen co-kultiviert, wonach die Blattsegmente auf Platten transferiert wurden, die Carbenicillin enthielten, um das Agrobacterium zu töten. Die Regeneration der transformierten Blattzellen zu ganzen Pflanzen konnte in Anwesenheit einer Kanamycin-Auswahl stattfinden, bis die Pflanzen fähig waren, in Erde zu wachsen.
b) Regeneration von transformierten Tabak- und Petunienpflanzen
Blätter von im Treibhaus gezüchteten Tabak- oder Petunienpflanzen wurden in 20 Vol.-% Chlorox-Bleiche, 0,1 % Natriumdodecylsulfat bei Raumtemperatur während 8 Minuten sterilisiert. Die Blätter wurden danach kurz in 70-%-Ethanol abgespült und danach in sterilen Petriplatten trocknen gelassen.
Blattscheiben von ungefähr 0,5 cm Durchmesser wurden mit einem sterilen Locher entfernt und auf Agarplatten, die MS 10-Medium (MS 10-Medium/l: 4,4 g „Murashige and Skoog Basal Salts with minimal Organics" (Sigma #M68991, 30 g Sukrose, 0,2 mg Naphthalenessigsäure, 2 mg Benzylaminopurin, 0,1 mg Nikotinsäure, 0,1 mg Pyridoxin, 0,1 mg Thiamin, 10 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)) platziert.
Eine 2 ml-Teilmenge einer Suspension aus Agrobacterium in LB (ungefähr 1 × 102 Agrobakterien/ml) wurde danach den Blattstücken hinzugefügt. Alle Flächen der Blattscheiben wurden mit Agrobakterien in Berührung gebracht, überschüssige Flüssigkeit wurde von der Platte abgegossen, und die Scheiben wurden mit den Bakterien während 2 Tagen bei Raumtemperatur co-kultiviert. Danach wurden die Scheiben auf Agarplatten, die MS10-Medium, (MS10-KC) enthielten, übertragen. Die Regeneration wurde andauern gelassen, mit wöchentlichem Transfer von Scheiben auf frische MS10-KC-Platten, bis Regenerationssprosse sichtbar waren. Die Sprosse wurden danach auf Agarplatten, die MSO-KC-Medium enthielten (MSO-KC/l: 4,4 g „Murashige and Skoog Basal Salts with minimal Organics" (Sigma #M68991, 30 g Sukrose, 1 mg Nikotinsäure, 1 mg Pyridoxin, 0,1 mg Thiamin, 50 μg/ml Kanamycin und 250 μg/ml Carbenicillin, 10 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)) übertragen.
Nach Bewurzelung, wurden die Pflänzchen in Erde übertragen und bis zur Reife kultiviert.
c) Regeneration von transformierten Alfalfapflanzen
Alfalfa-Trifoliate wurden von einer im Treibhaus kultivierten Pflanze geschnitten und in 20 % Chlorox-Bleiche, 0,1 % Natriumdodecylsulfat bei Raumtemperatur während 8 Minuten sterilisiert. Die Trifoliate wurden danach kurz in 70-%-Ethanol abgespült und danach in sterilen Petriplatten trocknen gelassen.
Blattstücke von ungefähr 1 cm × 4 cm wurden mit einem sterilen Skalpell geschnitten und auf Agarplatten, die B5H-Medium (B5H-Medium/l: 3,1 g „Gamborg's powdered medium" (Sigma #G5893), 500 mg KNO3, 250 mg MgSO4 7H20, 30 g Sukrose, 500 mg Prolin, 1 mg 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 100 μg Kinetin, 100 mg Inositol, 1 mg Nikotinsäure, 1 mg Pyridoxin, 10 mg Thiamin, 10 g Agar, 30 ml Stamm-Aminosäuren, pH-Wert 5,7 mit KOH; Stamm-Aminosäuren bestehen aus 26,6 g L-Glutamin, 3,32 g Serin, 16,8 mg Adenin, 333 mg Glutathion/l und werden nach dem Autoklavieren, wenn das Medium eine Temperatur von ungefähr 50 °C hat, hinzugefügt.
Den Blattstücken wurde danach 2 ml einer Suspension von Agrobacterium in LB (ungefähr 1 × 10⁸ Agrobacteria/ml) hinzugefügt. Alle Flächen der Blattstücke wurden mit Agrobakterien in Berührung gebracht, überschüssige Flüssigkeit wurde von der Platte abgegossen, und die Blätter wurden mit den Bakterien während 2 Tagen bei Raumtemperatur co-kultiviert. Danach wurden die Blattstücke auf Agarplatten, die B5H-Medium, 25 μg/ml Kanamycin und 250 μg/ml Carbenicillin (B5H-KC) enthielten, übertragen. Die Regeneration wurde andauern gelassen, mit wöchentlichem Transfer von Blattstücken auf frische B5H-KC-Platten, bis somatische Keime sichtbar waren. Die Keime wurden danach auf Agarplatten, die BI02Y- Medium (BI02Y-KC/ml: 25 ml Makronutrienten, 10 ml Mikronutrienten, 25 ml Eisen, 1 ml Vitamine, 1 ml Aminosäuren, 2 g Hefeextrakt, 100 mg Myo-Inositol, 30 g Sukrose, 10 g Agar, 25 mg Kanamycin, 250 mg Carbenicillin, pH-Wert 5,9 mit KOH; Makronutrienten bestehen aus 40 g KNO3, 40 g NH4NO3, 13,88 g Ca(NO3)2-FUO, 1,4 g MgSO4-7H20, 2,6 g KCl, 12 g Kh2PO4/l, was einen 4OX-Stamm ergibt; Vitamine bestehen aus 100 mg Thiamin HCL, 500 mg Nikotinsäure, 100 mg Pyroxidin-HCl/l, was einen 100OX-Stamm ergibt, Aminosäuren bestehen aus 2 g/l Glycin, was einen 100OX-Stamm ergibt; Mikronutrienten bestehen aus 580 mg MnSO4-4H20, 1550 mg ZnSO4-7H20, 160 mg H3BO3, 80 mg KI/l, was eine 100X-Stamm ergibt; Eisen besteht aus 1,28 g NaFeEDTA/l, was einen 4OX-Stamm ergibt.)
Nach Bewurzelung, wurden die Pflänzchen in Erde übertragen und bis zur Reife kultiviert.
d) Regeneration von transformierten Tomatenpflanzen
Keimblätter von 7 Tage alten Setzlingen von Tomatenpflanzen wurden in 20 Vol.-% Chlorox-Bleiche, 0,1 % Natriumdodecylsulfat bei Raumtemperatur während 8 Minuten sterilisiert. Die Blatter wurden danach kurz in 70-%-Ethanol abgespült und danach in sterilen Petriplatten trocknen gelassen.
Keimblattstücke von ungefähr 0,5 cm Durchmesser wurden mit einem sterilen Skalpell geschnitten und auf Agarplatten, die MS4-Medium (MS4-Medium/l: 4,4 g „Murashige and Skoog Basal Salts with minimal Organics" (Sigma #M68991, 30 g Sukrose, 0,2 mg Zeatinribosid, 5 mg Nikotinsäure, 0,5 mg Pyridoxin, 0,5 mg Thiamin, 1 mM Acetosyringon, 10 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)) platziert.
Den Blattstücken wurde danach 2 ml einer Suspension von Agrobacterium in LB (ungefähr 1 × 10⁸ Agrobacteria/ml) hinzugefügt. Alle Flächen der Blattstücke wurden mit Agrobakterien in Berührung gebracht, überschüssige Flüssigkeit wurde von der Platte abgegossen, und die Blätter wurden mit den Bakterien während 2 Tagen bei Raumtemperatur co-kultiviert. Danach wurden die Scheiben auf Agarplatten, die MS4-Medium minus Acetosyringon, enthaltend 50 μg Kanamycin und 250 μg/l Carbenicillin (MS4-KC) enthielten, übertragen. Die Regeneration wurde andauern gelassen, mit wöchentlichem Transfer von Blattstücken auf frische B5H-KC-Platten, bis regenerierende Sprosse sichtbar waren. Die Sprosse wurden danach auf Agarplatten, die MSO-KC-Medium enthielten (MSO-KC/l: 4,4 g „Murashige and Skoog Basal Salts with minimal Organics" (Sigma #M68991, 30 g Sukrose, 1 mg Nikotinsäure, 1 mg Pyridoxin, 10 mg Thiamin, 50 μg/ml Kanamycin und 250 μg/ml Carbenicillin, 10 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)) übertragen.
Nach Bewurzelung, wurden die Pflänzchen in Erde übertragen und bis zur Reife kultiviert.
e) Regeneration von transformierten Arabidopsispflanzen
Von Arabidopsis thalliana abgeleitete, intakte Wurzeln, die in steriler Kultur gezüchtet worden waren, wurden zuerst während 3 Tagen bei 28 °C im Dunkeln auf Kallusinduzierendem Medium (CIM) (CIM/l: 3,1 g Gamborg's powdered Medium (Sigma #5893), 30 g Sukrose, 1 mg 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 100 μg Kinetin, 1 mg Inositol, 0,1 mg Nikotinsäure, 0,1 mg Pyridoxin, 0,1 mg Thiamin, 8 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)) vorbehandelt.
Den intakten Wurzeln wurde danach 2 ml einer Suspension von Agrobacterium in LB (ungefähr 1 × 10⁸ Agrobacteria/ml) hinzugefügt. Alle Flächen der Wurzeln wurden mit Agrobakterien in Berührung gebracht, überschüssige Flüssigkeit wurde von der Platte abgegossen. Die intakten Wurzeln wurden in 5 mm-Segmente geschnitten und mit den Agrobakterien während 2 Tagen bei 28 °C auf CIM-Platten co-kultiviert. Danach wurden die Wurzel auf Agarplatten, die Sprosse-induzierendes Medium (SIM), das 50 μg Kanamycin und 250 μg Carbenicillin enthielt (SIM/l: 3,1 g Gamborg's powdered Medium (Sigma #5893), 30 g Sukrose, 5 mg N⁶-(2-Isopentenyl)-Adin, 150 μg Indol-3-Essigsäure, 1 mg Inositol, 0,1 mg Nikotinsäure, 0,1 mg Pyridoxin, 0,1 mg Thiamin, 8 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)), übertragen.
Die Regeneration wurde andauern gelassen, mit wöchentlichem Transfer von Scheiben auf frische SIM-Platten, bis grüne Regenerationssprosse sichtbar waren. Die Sprosse wurden danach auf Agarplatten, die EM-Medium enthielten (MSO-KC/l: 4,4 g „Murashige and Skoog Basal Salts with minimal Organics" (Sigma #M6899, 10 g Sukrose, 1 mg Indol-3-Buttersäure, 1 mg Nikotinsäure, 0,1 mg Pyridoxin, 0,1 mg Thiamin, 250 μg/ml Carbenicillin, 8 g Agar, pH-Wert 5,7 mit KOH)), übertragen.
Nach Wurzelbildung, wurden die Pflänzchen in Erde übertragen und bis zur Reife kultiviert.
Beispiel 3. Identifikation von transgenen Pflanzen
Kanamycinresistente Transformanten, die individuelle Immunglobulin-Ketten exprimieren, werden durch ELISA identifiziert, wie beschrieben. Weitere Analysen der Transformanten umfasste eine Auswertung der RNA mit Northern Blotting und Auswertung mit Western Blotting, beide wie beschrieben in Maniatis et al.
Für jede Immunglobulin-Kette wurden antigenes Material, RNA oder Protein beim jeweiligen Assay nachgewiesen. Transformanten, die als diejenigen mit dem höchsten Niveau von Immunglobulin-Ketten identifiziert wurden, wurden in den Kreuzpollinationsprotokollen verwendet.
Beispiel 4. Zusammenfügen von Antikörpern durch Kreuzpollination von Transformanten

Kreuzpollinationen wurden durchgeführt, um Pflanzen zu erhalten, die die verschiedenen Bestandteile der gewünschten Antikörper coexprimieren. Diese Kreuzungen ergaben Alfalfa-, Tomaten-, Tabak- und Arabidopsispflanzen, die die folgenden zusammengefügten Bestandteile enthielten, die alle auch in der Antigenbindungsdomäne von Guy's 13 enthalten sind.

Typ von Antikörper	Immunoglobulin-Bestandteile
1	G1 schwere Kette, kappa-Kette, leichte Kette
2	G2/A schwere Kette, kappa-Kette, leichte Kette
3	G2/A schwere Kette, kappa-Kette, leichte Kette, J-Kette
4	G1/A schwere Kette, kappa-Kette, leichte, J-Kette, Schutzprotein
5	G1/A schwere Kette, kappa-Kette, leichte Kette

Beispiel 5. Extraktion und Auswertung von Antikörpertypen 1, 2 und 3 & 4 von Guy's 13 von transgenen Pflanzen
a) Extraktion und Anreicherung von in Blatt enthaltenem Antikörper
Blattstücke wurden in ungefähr 1 cm² große Stücke zerhackt. Die Stücke wurden danach einer kalten Lösung von TBS, enthaltend 10 μg Leupeptin (1 ml TBS/g Blatt), in einem gekühlten Porzellanmörser, beide bei ungefähr 4 °C, hinzugefügt. Pflanzenflüssigkeit wurde extrahiert durch Pulverisieren der Stücke mit einem kalten Stößel unter kreisförmigen Bewegungen und Druck von Hand. Das Pulverisieren wurde fortgesetzt, bis die Stücke eine annähernd gleichförmige Pulpe geworden waren (ungefähr 3 Minuten Pulverisieren). Die Pulpe wurde bei 4 °C und bei etwa 50.000 × g zentrifugiert, um einen Überstand ohne feste Pflanzenstücke zu ergeben. Alternativ wurde die Pulpe durch ein Kunststoffsieb mit einer Porengröße von ungefähr 100 Mikrometer gefiltert.
Abhängig vom Titer des in der spezifischen Pflanze vorhandenen Antikörpers war der Überstand entweder direkt für eine Exposition gegenüber einem Antigen geeignet, oder er erforderte eine Anreicherung bis zu einer geeigneten Konzentration. Die Ausbeuten von IgG1 oder IgG/A im Rohextrakt betrugen routinemäßig weniger als 10 μg/ml und im Durchschnitt ungefähr 5 μg/l. Für Anwendungen eines Antikörpers von Guy's 13 auf Schleimhautoberflächen dürfte eine Konzentration auf 1 bi 4 mg/ml erforderlich sein. Als Konstrukt vom Typ 1, 2 oder 3 erforderte der Antikörper Guy's 13 eine zehn- bis vierzigfache Anreicherung, um die gewünschte Konzentration zu ergeben. Diese wurde erreicht durch entweder Affinitätsadsorption (Verwendung von entweder Protein A oder Protein G) oder durch Lyophilisierung zur Beseitigung von Wasser. Für die Anreicherung wurde auch mit Größenausschlusschromatographie gearbeitet, diese erforderte jedoch eine komplette Fraktionierung des Rohextrakts, um einen Antikörper der erforderlichen Konzentration zu ergeben. Durch ELISA-Assay und Polyacrylamidgelelektrophorese fügten sich die coexprimierten Ketten zu einem Komplex von ungefähr 180–200 kDa bei den Typen 1 & 2 und ungefähr 400 kDa beim Typ 3 zusammen. Rohextrakte wurden routinemäßig mit einem Gehalt von ungefähr 5–10 μg/ml erhalten.
Ein dramatischer Anstieg der Antikörperanhäufung wurde festgestellt, wenn das Schutzprotein in eine Pflanze, die einen Antikörper vom Typ 3 enthielt, gekreuzt wurde, und es ergab sich eine Pflanze, die einen Antikörper vom Typ 4 enthielt. Durch ELISA-Assay und Polyacrylamidgelelektrophorese fügten sich die coexprimierten Ketten zu einem Komplex von ungefähr 470.000 Da zusammen. Rohextrakte wurden routinemäßig mit einem Gehalt von über 200 μg/ml und im Durchschnitt von ungefähr 250 μg/ml erhalten. Deshalb erforderte das SIgA-Konstrukt des Antikörpers von Guy's 13 eine minimale Anreicherung, um die Zielkonzentration zu erreichen. Diese Anreicherung konnte mithilfe der vorstehend beschriebenen Techniken erzielt werden. Alternativ zeigte sich, dass der Antikörper durch einen Ultrafiltrationsschritt, bei dem eine Membran mit einem Molekularausschluss von 200.000 Da verwendet wurde, einfach abgeschieden wird.
b. Funktionalität des Antikörpers Typ 4 von Guy's 13
Untersuchungen funktionaler Antikörper wurden mithilfe von ELISA durchgeführt. Alle Pflanzen, die leichte und schwere Antikörperketten exprimierten, fügten einen funktionalen Antikörper zusammen, der spezifisch das Streptokokken-Antigen (SA I/II) erkannte. Die Höhen der Bindungs- und Titrierkurven waren ähnlich denen der Überstände von Maushybridomzellen. Keine SA I/II-Bindung wurde bei Pflanzen, die nur J-Kette oder nur Schutzprotein exprimierten, nachgewiesen. Gleichermaßen zeigten Wildtyp-Pflanzen, die kein Immunglobulin exprimierten, keine nachweisbaren Niveaus von Bindung.
Bei einer ähnlichen Versuchsreihe wurde eine Bindung von Antikörper an immobilisiertes gereinigtes Streptokokkenantigen oder natives Antigen auf der Oberfläche der Bakterienzelle durch Anwendung eines Antiserums mit antisekretorischen Bestandteilen nachgewiesen. Bei diesen Assays wurde nur ein Binden des Antikörpers des Typs 4 nachgewiesen. Die funktionalen Antikörper der Typen 1, 2 oder 3 banden das Antiserum mit antisekretorischen Bestandteilen nicht. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das Schutzprotein mit Antikörper in den Pflanzen, die Konstrukte vom Typ 4 exprimieren, zusammengefügt wird, und zwar auf eine Weise, die die Antigenbindung nicht beeinträchtigte.
Beispiel 6. Expression von chimären Immunglobulinen
Die Gene, die die schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Mausantikörpers (mAb Guy's 13) kodieren, sind in Nicotiana tabacum cloniert und exprimiert worden. Transgene Pflanzen sind regeneriert worden, die Antikörper von Guy's 13 in Volllänge absondern. Durch Modifikation der Gensequenz der schweren Kette wurden Domänen der konstanten Region von der von Immunglobulin abgeleiteten schweren alpha-Kette eingebracht, und Pflanzen, die mAb von Guy's 13 mit chimären schweren gamma-/alpha-Ketten absondern, sind ebenfalls produziert worden. Für jeden Pflanzenantikörper sind leichte und schwere Ketten mit Western Blot nachgewiesen und durch Untersuchungen der Antigenbindung die Genauigkeit des Zusammenfügens bestätigt worden durch den Nachweis, dass der Antikörper voll funktional ist. Außerdem behielten die Pflanzenantikörper die Fähigkeit zur Anhäufung von Streptokokken bei, was bestätigt, dass die bivalente Antigenbindungsfähigkeit der Volllängen-Antikörper intakt ist.
a. Klonieren von Schwer- und Leichtkettengenen
Boten-RNA wurde von Guy's 13 und einer Maushybridom-Zelllinie IgA (MOPC315) mithilfe einer Säure-Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion. Komplementäre DNA wurde mithilfe der Moloney-Murine Leukemia Virus Reverse Transkriptasen (Promega, GB) produziert. Die DNA-Kodierung der gamma- und kappa-Ketten von Guy's 13 wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die degenerierten Oligonukleotide, die bei der PCR verwendet wurden, waren designiert für die Aufnahme eines 5'-Ende XhoI und einer 3'-Ende EcoRI Restriktionsstelle in den amplifizierten DNA-Fragmenten. Nach einem Restriktionsenzymverdau wurde die DNA kodierende Immunglobulin-Kette in einen konstitutiven Pflanzenexpressionsvektor (pMON 530) ligiert, der eine Mausimmunglobulin-Leitsequenz stromaufwärts der Klonierstelle enthält. Der rekombinante Vektor wurde benutzt, um E. coli (DH5-α, Gibco BRL) zu transformieren, und ein Screening wurde mithilfe von Western Blotting unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA-Sonden abgeleitet von originären PCR-Produkten. Plasmid-DNA wurde von positiven Transformanten aufgereinigt und in Agrobacterium tumefaciens eingebracht.
Eine ähnliche Herangehensweise wurde angewendet, um zwei Formen einer schweren Hybridkette von Guy's 13 zu konstruieren. Die synthetischen Oligonukleotide, abgebildet in 1, wurden in PCR für eine Amplifizierung der Regionen verwendet: (a) Signalsequenz von Guy's 13 zum 3' Ende der Cτ1-Domäne (J1–J5), (b) Signalsequenz von Guy's 13 zum 3' Ende der Cτ2-Domäne (J1–J2) und (c) 5' Ende von Cα2-Domäne zum 3'-Terminus von DNA von MOPC 315 Hybridom (J3–J4). Die Fragmente wurden aufgereinigt (Geneclean II, Bio 101, La Jolla, CA, USA) und mit HindIII während 1 h bei 37 °C gespalten. Die Fragmente von Guy's 13 wurden mit T4 DNA Ligase (Gibco, BRL) während 16 h bei 16 °C mit dem MOPC315 Fragment ligiert, und eine Teilmenge der Reaktionsmischung wurde als Template-DNA für eine weitere PCR verwendet, bei die das 5' Terminal Oligonukleotid von Guy's 13 (1) und das 3' Terminal Oligonukleotid von MOPC 315 (J4) verwendet wurden. Amplifizierte DNA-Fragmente wurden aufgereinigt und in den pMON 530 Vektor ligiert, wie vorstehend beschrieben. Der bei diesem Vorgang verwendete Vektor hatte keine früher insertierte Maus-Leitsequenz, wie in diesem Fall wurde die DNA, die die native Leitsequenz von Guy's 13 kodiert, in der PCR-Amplifikation enthalten.
b. Transformation und Regeneration von Pflanzen
Blattscheiben von etwa 6 mm Durchmesser wurden aus oberflächensterilisierten Tabakblättern (Nicotiana tabacum, Var. Xanthii) geschnitten und über Nacht bei 28 °C mit einer Kultur des rekombinanten A. tumefaciens, das Immunglobulin-cDNA-Inserts enthielt, inkubiert. Die Scheiben wurden auf Kulturplatten übertragen, die ein Mittel enthielten, das die Regeneration von Sprossen induziert, ergänzt mit Kanamycin (200 mg/l) und Carbenicillin (500 mg/l). Sprosse, die sich nach diesem Schritt entwickelt hatten, wurden herausgeschnitten und auf ein Wurzel-induzierendes Medium, ergänzt mit Kanamycin (200 mg/l), verpflanzt. Die Pflänzchen so schnell wie möglich nach dem Erscheinen von Wurzeln in Erde verpflanzt. Die Pflanzen wurden auf Expression von Immunglobulin-Ketten gescreent, wie nachstehend beschrieben. Die Pflanzen, die schwere Ketten exprimierten, wurden durch Kreuzpollination mit denen gekreuzt, die leichte Ketten exprimierten. Die erlangten Samen wurden in Erde gesät und keimen gelassen. Zweiundzwanzig transgene Pflanzen wurden von Transformationen mit Leicht- oder Schwerkettenkonstruktion gemäß Bestimmung mit ELISA regeneriert. Ein Kreuzen der leichte und schwere Ketten absondernden Pflanzen resultierte in 3/10 F1 Pflanzennachkömmlinge, die kappa- und gamma-Ketten zusammen exprimierten, 4/17 der Pflanzen exprimierten sowohl kappa- als auch die schwere Pflanzenkette G1/A, und 3/8 der Pflanzen exprimierten sowohl kappa- als auch die schwere Pflanzenkette G2/A zusammen.
Die drei verschiedenen Formen des monoklonalen Antikörpers von Guy's 13, die in den Pflanzen exprimiert wurden, enthalten demzufolge alle die identische leichte (kappa-)Kette, aber unterschiedliche schwere Ketten. Diese werden in diesem Bericht wie folgt abgekürzt (1): Guy's 13 IgG1 mit ursprünglicher schwerer gamma-Kette, Pflanze G13; Guy's 13 mit IgG/IgA mit schwerer Hybridkette, bestehend aus var-τ1-τ2-α2-α3-Domänen, Pflanze G2/A. Der Guy's 13 Hybridom-Zellkulturüberstand, der als positive Kontrolle benutzt wurde, wird abgekürzt als Maus G13 bezeichnet. Negative Kontrollpflanzen waren solche, die mit dem Vektor pMON 530, der ein irrelevantes Mausprotein kodierendes Insert enthielt, transformiert worden waren.
c. Nachweis von Antikörperkette
Die Produktion von sowohl gamma- als auch kappa- oder von gamma-/alpha-Kettenhybriden wurde mit ELISA nachgewiesen. Mikrotiterwells wurden mit einem Goat Anti-mouse, schwer- oder leichtkettenspezifischen IgG (Fisher, USA; Sigma, GB; Nordic Pharmaceuticals, GB) in 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8) (TBS) beschichtet. Blocking erfolgte in 5-%-iger fettfreier Trockenmilch in TBS bei 4 °C über Nacht. Die Pflanzenblätter wurden in TBS mit Leupeptin (10 μg/ml) (Calbiochem, USA) homogenisiert. Der Überstand wurde in seriellen zweifachen Verdünnungen auf der Mikrotiterplatte hinzugefügt, und eine Inkubation erfolgt über Nacht bei 4 °C. Nach Waschen mit TBS mit 0,05 % Tween 20, wurden gebundene Immunglobulin-Ketten mit dem entsprechenden Goat Anti-mouse schwer- oder leichtkettenspezifischen Antikörper, während 2 h bei 37 °C mit Meerrettich-Peroxidase (Fisher; Sigma; Nordic Pharmaceuticals) nachgewiesen. Der Nachweis erfolgte mit 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) (Boehringer, Deutschland).
Ein ähnlicher Assay wurde zur Bestimmung der Konzentrationen der Maus- und Pflanzenantikörper von Guy's 13 angewendet. Diese Antikörper wurden mit einem Maus-IgG1 mAb (MOPC 21) und einem Maus-IgA mAb (TEPC 21), verwendet bei bekannten Konzentrationen (Sigma) verglichen. ELISA-Platten wurden mit einem Anti-Mouse-kappa-Serum beschichtet. Nach Blocking wurde gebundener Antikörper mit Anti-Maus-gamma- oder -alpha-Serum, mit Meerrettich-Peroxidase-Markierung, nachgewiesen. Die Antikörperkonzentration wurde durch Vergleich der Bindungskurven für jeden Antikörper bestimmt.
Auch der Nachweis der Bindefunktion des zusammengefügten Antikörpers wurde mithilfe von ELISA nachgewiesen. Das Binden an das SA I/II wurde mithilfe von Mikrotiterplatten nachgewiesen, die mit aufgereinigtem SA I/II bei einer optimierten Konzentration von 2 μg/ml beschichtet worden waren. Der ELISA-Vorgang wurde nach vorstehender Beschreibung durchgeführt. Die Fähigkeit zur Bindung von S. mutans- oder E. coli-Zellen wurde durch Anwendung intakter Zellen (Stämme von Guy c, S. mutans und DH5-α, E. coli), die während 18 h bei 37 °C bis zur stationären Phase kultiviert und in 10-%-igem Formalin fixiert worden waren, nachgewiesen. Alle Antikörperlösungen wurden auf eine Ausgangskonzentration von 1,5 μg/ml eingestellt und in seriellen zweifachen Verdünnungen verwendet. Extrakte von Pflanzen, die jeweils nur verschwindende schwere oder leichte Ketten nach Guy's 13 exprimieren, waren ebenfalls von diesen Assays umfasst, um festzustellen, ob die einzelnen Immunglobulin-Ketten irgendwelche Antigenbindungsaktivität zeigten. Antikörper, die an entweder Zellen oder aufgereinigtes SA I/II gebunden waren, wurde mithilfe eines Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Goat Anti-Mouse-Leicht- oder Schwerketten-Antiserums (Nordic Pharmaceuticals) nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung von Wertepaaren von drei separaten Assays ausgedrückt.
Ein vergleichender ELISA wurde auf Mikrotiterplatten, die mit aufgereinigtem SA I/II wie oben beschichtet waren, durchgeführt. Die Platten wurden mit Pflanzenextrakten von Guy's 13 Hybridom-Überstand bei 1,5 μg/ml und seriellen zweifachen Verdünnungen bei 37 °C während 1 h und bei 4 °C über Nacht inkubiert. Nach Waschen wurde ¹²⁵I-markierte Maus von Guy's 13 hinzugefügt und während 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden erneut gewaschen, und die gebundene Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler (Hydragamma 16, Innotec, GB) gezählt. Die Ergebnisse wurden in Prozent Inhibierung der markierten Maus Guy's 13 Bindung ausgedruckt, bei der 100 % der radioaktiven Zählung von Wells, bei denen keine Blockinglösung hinzugefügt worden war, entsprechen.
d. Western Blot-Analyse
Teilmengen von 10 μl von Blatthomogenisaten wurde mit 75 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8), 2 % SDS unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen gekocht. Eine SDS-PAGE-Analyse in 19 % Acrylamid wurde durchgeführt, und die Gels wurden auf Nitrocellulose geblottet. Die Blots wurden während 16 h in TBS mit 0,05 % Tween 20 und 1 % fettfreier Trockenmilch inkubiert, darauf folgten Goat Anti-mouse IgG1, kappa (Nordic Pharmaceuticals) oder alphakettenspezifische Sera (Sigma) und eine Inkubation während 2 h bei 37 °C. Nach Waschen wurde der Sekundär-Antikörper, ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Kaninchen-Anti-goat IgG (Sigma) für 2 Stunden bei 37 C aufgetragen. Die Antikörperbindung wurde durch Inkubation mit 300 μg/ml Nitroblau-Tetrazolium und 15p μg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat (Promega) nachgewiesen.
e. DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenz jedes klonierten Immunglobulingeninserts bestätigte, dass keine Mutationen während der PCR-Amplifikation oder den Kloniervorgängen aufgetreten waren. Das Einbringen der HindIII-Stelle in die schweren λ/γ Hybridketten resultierte in dem vorausgesagten Hinzufügen des Leucinrests zwischen den Domänen Cγ2 und Cα2 in Pflanze G2/A und Leucin-Lysin zwischen den Domänen Cγ1 und Cα2 in Pflanze G1/A. Der zusätzlichen Domäne Cγ2 im Konstrukt von Pflanze G2/A vorausgesagt, dass sie die Länge der schweren Kette um 141 Aminosäurereste (ungefähr 12000 Da) vergrößert. Der schweren Kette von Pflanze G1/A wird vorausgesagt, dass sie geringfügig größer ist als die native schwere Kette von Guy's 13, um 33 Aminosäuren, ungefähr 3000 Da.
Plasmid-DNA, die von positiven Transformanten in E. coli aufgereinigt worden war, wurde sequenziert. Die Immunglobulingeninserts wurden herausgeschnitten und in Bluescript (Stratagene, USA) subkloniert. Die DNA-Sequenz wurde durch einen Dideoxy-Termination-Vorgang (Sequenase, USB, USA) bestimmt.
f. Expression von zusammengefügtem Antikörper
Eine Western Blot Analyse der Extrakte von drei repräsentativen F1 Pflanzennachkömmlingen wurde durchgeführt und berichtet in 2 von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131–138 (1994). Proben, die unter reduzierenden Bedingungen analysiert worden waren, zeigten eine Anwesenheit von leichter (kappa-)Kette bei ungefähr 25 kDa sowohl bei Maus Guy's 13 als auch bei den drei transgenen Pflanzen, jedoch nicht bei der Kontrollpflanze. Die schwere (gamma-)Kette von Guy's 13 wurde auch in Pflanze G13 bei ungefähr 57 kDa, aber nicht im Extrakt der Kontrollpflanze nachgewiesen. Eine einzelne Proteinart wurde nachgewiesen, im Gegenteil zu den Hybridom die den Zellkulturüberstand von Guy's 13 Antikörper produzieren, in dem zwei Proteinarten regelhaft feststellbar sind. Der Unterschied in der Molekülgröße der schweren Ketten der Maus beruht wahrscheinlich auf Unterschieden bei der Glycosylierung, und das Ergebnis deutet darauf hin, dass bei Pflanzen die beiden schweren Ketten auf die gleiche Weise glycosyliert werden können. Die schweren Ketten von Pflanze G1/A und G2/A wurden mit einem Anti-alpha-Ketten-Antiserum nachgewiesen. Im Vergleich zur schweren Kette der Maus von Guy's 13 (ungefähr 57 kDa) weist die schwere Kette von Pflanze G1/A eine geringfügig höhere Molekülmasse (ungefähr 60 kDa) auf, und die schwere Kette von Pflanze G2/A ist viel größer (ungefähr 70 kDa). Dies stimmt mit den Molekülmassen überein, die von der Sequenzanalyse vorausgesagt waren. Mehrere andere Proteinarten wurden in den transgenen Pflanzenextrakten nachgewiesen. Diese sind vermutlich proteolytische Fragmente von entweder Leicht-/Schwerkettenkomplexen oder der schweren Kette, da keine Banden im Extrakt von der transgenen Kontrollpflanze nachgewiesen wurden. Die Anti-alpha-Kette-Antiserum zeigte keine Kreuzreaktion mit dem Maus Guy's 13, das nur gamma-Kettendomänen enthält.
Proben wurden auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht, um das Zusammenfügen schwerer und leichter Ketten zu einem Immunglobulinmolekül zu bestätigen, und berichtet in 3 von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131–138 (1994). Der Nachweis erfolgte mit einem markierten Anti-kappa-Antiserum, und alle drei transgene Pflanzen hatten zusammengefügtes Immunglobulin am korrekten Mr von oberhalb 150 kDa für Volllängen-Antikörper. Der Antikörper von Pflanze G13 hat den gleichen M_r-Wert wie Maus G13, aber die Antikörper der Pflanzen G2/A und G1/A haben höhere M_r-Werte, wie vorausgesagt. Eine Anzahl kleinerer proteolytischer Fragmente wurde ebenfalls nachgewiesen, was sich mit den früheren Feststellungen deckt und mit der Tatsache, dass eine Anzahl von Proteasen während des Antikörperextraktionsvorgangs von den Pflanzen freigesetzt werden. Dass diese Antikörperfragmente sind, wird durch das Fehlen jeglicher nachweisbarer Banden im Extrakt der Kontrollpflanze bestätigt.
g. Antigenbindung
Insgesamt zehn Pflanzen, die Immunglobulin produzierten, wurden hergestellt, und die Konzentration von Immunglobulin in den Pflanzenextrakten variierte zwischen 1 und 10 μg/ml (Mittelwert 4,5 g/ml). Für den Maus-Antikörper und die bei dieser Studie verwendeten repräsentativen Pflanzen betrugen die von ELISA geschätzten Konzentrationen: Maus IgG – 15,4 μg/ml, Pflanzen IgG – 7,7 μg/ml, Pflanze G1/A – 1,5 μg/ml und Pflanze G2/A – 2,1 μg/ml. Die Konzentrationen, die für schwere Hybridketten enthaltende Pflanzen-Antikörper ermittelt wurden, sind möglicherweise unterbewertet, da sie, verglichen mit dem verwendeten Standard mAb IgA, nicht alle Determinanten der konstanten Region tragen.
Titrationskurven für Extrakte von den drei repräsentativen transgenen Pflanzen, die an SA I/II binden, wurden erzeugt und berichtet in 4 von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131–138 (1994). Spezifischer Antikörper konnte in allen drei transgenen Pflanzenextrakten nachgewiesen werden, und die Kurven waren ähnlich denen des Maus-Hybridom-Zellenüberstands, der in der gleichen Konzentration verwendet wurde. Die Bindung des Antikörpers der Pflanze G1/A erwies sich als etwas geringer als die der anderen Antikörper, obwohl die Titrationskurve einen ähnlichen Verlauf aufwies. Keine Bindungsaktivität wurde für SA I/II in der negativen Kontrollpflanze festgestellt, noch hatten die Extrakte von Pflanzen, die individuell leichte oder schwere Ketten exprimierten, eine Bindungsaktivität in Richtung aufgereinigtem SA I/II. Diese Ergebnisse zeigen, dass die transgenen Pflanzen, die sowohl leichte als auch schwere Ketten exprimieren, das Antikörpermolekül korrekt zusammengefügt haben, um eine funktionale Antigenbindungsstelle zu bilden, und dass einzelne leichte oder schwere Ketten nicht fähig sein, das Antigen zu binden.
Die Pflanzenantikörper erkannten auch natives Antigen auf de Oberfläche von Streptokokkenzellen, wie dargestellt in 5 von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131–138 (1994) (S. mutans Serotyp c), was zusätzlich die Integrität der Antigenbindungsstelle in den Pflanzenantikörpern bestätigt. Keine signifikanten Unterschiede gab es bei der Bindung der einzelnen Antikörper. Weder Extrakte von Kontrollpflanzen noch Pflanzen, die nur schwere oder leichte Ketten exprimieren, zeigten eine Bindung an S. mutans-Zellen. Es gab keine Bindung an E. coli-Zellen durch eines der Pflanzenextrakte bei Konzentrationen von 1,0 und 0,5 μg/ml.
Die Pflanzenantikörper konkurrierten mit dem Original Maus mbAb von Guy's 13 beim Binden an SA I/II. Bis zu 85 % Inhibierung von ¹²⁵I-markiertem Maus mAb nach Guy's 13 der Bindung an SA I/II wurde bei Verwendung der Pflanzenantikörper gezeigt, wie dargestellt in 6 von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131–138 (1994). Wie vorher verliefen die Titrationskurven der Pflanzenantikörper ähnlich einander und vergleichbar mit der von Maus Guy's 13, während die Kontrollpflanze keine Inhibierung ergab.
h. Anhäufung von S. mutans
Die Aktion des Immunglobulins, das in Pflanzen erzeugt wurde, die eine Antigenbindungsregion von Guy's 13 auf Bakterien haben, ist untersucht und berichtet worden in 7 von Ma et al., Eur. J. Immunol., 24:131–138 (1994). Pflanzenextrakte wurden durch Filtration durch ein Filter mit 0,22 μm Porengröße sterilisiert und zehnfach mit Todd Hewitt Bouillon verdünnt. Die Proben wurden mit 0,05 Vol. einer Übernacht-S. mutans-Kultur inokuliert und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Proben wurden gramgefärbt und mit Ölimmersionsmikroskopie untersucht. S. mutans, die in Anwesenheit von Maus von Guy's 13, Pflanze von Guy's 13, Pflanze G1/A oder Pflanze G2/A kultiviert worden waren, häuften sich an, und die Zellenverklumpung war offensichtlich. Dagegen zeigte das Kontrollpflanzenextrakt keinen Einfluss auf die Wachstumsrate von S. mutans. Keiner der Pflanzen mAb schien die Wachstumsrate von S. mutans. zu beeinflussen, was bei Züchtung lebensfähiger Organismus nach 8, 12 und 16 h festgestellt wurde. Dieses Ergebnis zeigt nicht nur, dass die Pflanzenantikörper korrekt zusammengefügte Antigenbindungsdomänen aufweisen, sondern auch, dass die Antikörpermoleküle Antigen bivalent binden.
Beispiel 7. Produktion von Immunglobulinen, die Schutzproteine enthalten
Vier transgene Nicotiana tabacum-Pflanzen wurden erzeugt, um (1) eine murine monoklonale Immunglobulin-kappa-Kette, die die Antigenbindungsstelle der leichten Kette von Guy's 13 aufweist, (2) eine hybride IgA/G murine schwere Immunglobulin-Kette, die Cγ- und Cα-Kettendomänen und die Antigenbindungsstelle der schweren Kette von Guy's 13 aufweist, (3) eine murine J-Kette und (4) Schutzprotein, das Aminosäuren 1–606 des Kaninchen-Polyimmunglobulinrezeptors umfasste und nicht die Aminosäuren 627–675 des Kaninchen-Polyimmunglobulinrezeptors enthielt, zu exprimieren. Siehe Beispiel 1. Sukzessive sexuelle Kreuzungen unter diesen Pflanzen resultierten in gleichzeitige Expression aller vier Proteinketten in den Pflanzennachkömmlingen. In einigen Fällen wurde ein Rückkreuzen angewendet, um homozyge Pflanzen zu produzieren. Die vier rekombinanten Polypeptide wurden in ein funktionales Immunglobulin von großer Molekülmasse und ein Schutzprotein von ungefähr 470.000 kDa enthaltend zusammengefügt. Das Zusammenfügen des Schutzproteins mit dem Immunglobulin war abhängig von der Anwesenheit einer J-Kette, da keine Assoziierung des Schutzproteins nachweisbar war, wenn Pflanzen, die nur Antikörper exprimierten, mit solchen gekreuzt wurden, die das Schutzprotein exprimieren. Eine mikroskopische Auswertung von Pflanzen, die Immunglobuline exprimieren, die das Schutzprotein aufwiesen, zeigte eine zusammentreffende Expression von Schutzprotein und schweren Immunglobulin-Ketten in einzelnen Zellen. Einzelne Zellen sind fähig, Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist, in transgenen Pflanzen zu erzeugen, während zwei Zellen erforderlich sind für die natürliche Produktion von sekretorischem Immunglobulin in Säugern. Die Ergebnisse zeigen, dass sexuelles Kreuzen transgener Pflanzen, die rekombinante Untereinheiten exprimieren, sich für eine großtechnische Produktion von Immunglobulin, das ein Schutzprotein für passive Immuntherapie enthält, ebenso wie für ein Exprimieren anderer komplexer Proteinmoleküle eignet.
Das Immunglobulin, das das Schutzprotein aufweist, hat die Antigenbindungsdomänen der schweren und leichten Ketten von monoklonalen Antikörper nach Guy's 13, die spezifisch das an Zelloberflächen adhäsive Molekül SA I/II eines oralen Streptokokkus erkennen, wie dargestellt von Smith, R. & Lehner, T. Oral Microbiol. Immunol. 4, 153–158 (1989). Transgenes Immunglobulin dieses Typs, das nur schwere und leichte Ketten enthält, ist in Pflanzen von Nicotiana tabacum erzeugt worden, wie in Beispiel 6 beschrieben. Ein J-Kettenkonstrukt der Maus, das die kodierende Länge cDNA enthielt, wurde mithilfe von synthetischen Oligonukleotid-Primern entsprechend dem N-Terminus MKTHLL und dem C-Terminus SCYPD der J-Kette der Maus amplifiziert, wie beschrieben von Matsuuchi, L., Cann, G. M. & Koshland, M. E. PNAS 83, 456–460 (1986). Diese amplifizierte Nukleotidsequenz wurde ligiert in einen konstitutiven Pflanzenexpressionsvektor, pMON 530, der den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus enthält und beschrieben ist von Rogers, S. G., Klee, H. J., Horsch, R. B. & Fraley, R. T. Meth. Enzymol. 153, 253–276 (1987). Gewebe von Tabakblatt wurde mithilfe von Agrobacterium, das das rekombinante Plasmid enthielt, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben transformiert. Regenerierte Pflanzen wurden in Bezug auf die Produktion von Boten-RNA, die die J-Kette kodiert, gescreent, und positive Transformanten waren selbstbefruchtend, um homozygote Nachkömmlinge zu erzeugen. Die J-Kette exprimierenden Pflanzen wurden anfänglich mit solchen, die chimäre von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette und kappa-Kette exprimieren, gekreuzt. Eine Western Blot-Analyse des Pflanzenextrakts von Pflanzen, die die chimäre von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette und kappa-Kette unter nicht-reduzierenden Bedingungen exprimieren, offenbarten eine Proteinart von ungefähr 210 kDa, was der Anwesenheit der zusätzlichen Domäne der konstanten Region entspricht, die, im Gegensatz zum ursprünglichen IgG1-Antikörper, in der chimären von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette vorhanden ist. Die Nachkommen von der Kreuzung aus Pflanzen, die das Immunglobulin exprimieren, und einer J-Ketten-Pflanze resultierten im Auftreten einer größeren Immunglobulinbande bei ungefähr der zweifachen relativen Molekülmasse von ungefähr 400 kDa, was zeigt, dass das Zusammenfügen der 3 Polypeptide erfolgt war, um dimeres Immunglobulin (dIgA/G) zu bilden.
Das Schutzprotein-Konstrukt bestand aus einer kodierenden Länge cDNA, die unter Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Primer entsprechend dem N-Terminus MALFLL und AVQSAE bei Aminosäuren 1–606 des C-Terminus des Kaninchen-Polyimmunglobulinrezeptors amplifiziert worden war. Die Oligonukleotidsequenz des Kaninchen-Polyimmunglobulinrezeptors ist berichtet worden von Mostov, K. E., Friedlander, M. & Blobel, G. Nature 308, 37–43 (1984). Das Schutzprotein wurde gemäß vorstehender Beschreibung in transgenen Pflanzen erzeugt, und positive Transformanten, die das Schutzprotein exprimieren, wurden durch Western Blot-Analyse identifiziert.
Pflanzen, die J-Kette exprimieren, die mit dem Immunglobulin zusammenfügt war, das die von IgA/G abgeleiteten schweren Ketten aufwies, wurden danach mit einem homozygoten Pflanze gekreuzt, die das Schutzprotein exprimiert. Die Pflanzennachkömmlinge, die das Immunglobulin exprimieren, das das Schutzprotein aufweist, enthielten eine Proteinart von größerer Molekülmasse bei ungefähr 470 kDa, wie durch die Western Blot-Analyse unter nicht-reduzierenden Bedingungen festgestellt worden war. Diese Molekülgröße entsprach der, die für ein Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist, erwartet worden war. Dieses Protein von großer Molekülmasse enthielt das Schutzprotein, wie durch Western Blotting unter Verwendung von Antiserum, das spezifisch das Schutzprotein erkennt, festgestellt. Die Pflanzenextrakte enthielten auch eine Proteinart von ungefähr 400 kDa, was den Dimeren von IgA/G entspricht, und eine Proteinart von ungefähr 210 kDa, entsprechend dem Immunglobulin mit der chimären schweren Kette, aber diese wurden nur mit Anti-kappa-Antiserum nachgewiesen und nicht mit Anti-Schutzprotein-Antiserum. In der transgenen Pflanze, die nur das Schutzprotein produzierte, gab es keinen Beweis dafür, dass das Schutzprotein, das mit endogenen Pflanzenproteinen oder gebildeten Multimeren, wie Proteinen, die keine große Molekülmassen aufweisen, zusammengefügt ist, durch Western Blotting unter nicht-reduzierenden Bedingungen erkannt wurde. Die Western Blot-Analyse zeigte, dass die Extrakte von den Pflanzen, die die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette exprimieren (IgA/A, dimeres IgA/G und das Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist), aber nicht die Pflanzen, die nur das Schutzprotein oder J-Kette enthielten, oder Wildtyp-Pflanzen identische von Immunglobulin abgeleitete schwere und leichte Ketten enthielten. Außerdem exprimierten nur die Pflanzen, die Schutzproteine enthielten, und die Pflanzen, die das IgG/A-Immunglobulin, das das Schutzprotein aufwies, Proteine, die von dem Antiserum erkannt wurden, das spezifisch das Schutzprotein erkannte. Keine Kreuzreaktionsproteine wurden in den Extrakten von der Wildtyp-Kontrollpflanze festgestellt.
Bei Säugern erfordert das Zusammenfügen sekretorischer Bestandteile mit dem Immunglobulin eine Anwesenheit von J-Kette, wie von Brandtzaeg, P. & Prydz, H. Nature 311, 71–73 (1984) beschrieben. Pflanzen, die Immunglobuline exprimieren, die eine chimäre schwere Kette (IgA/G) enthalten, wurde mit Pflanzen gekreuzt, die Schutzprotein exprimieren. Keine de 10 resultierenden Nachkommen, die Immunglobulin und das Schutzprotein ohne J-Kette exprimierten, produzierte zusammengefügte Komplexe gegenüber den 10/10 Pflanzen, die von J-Kette dimerisiertes Immunglobulin und das Schutzprotein ohne J-Kette, die das M_r, 470 kDa Immunglobulin, enthaltend das Schutzprotein, zusammenfügen, coexprimieren. Dies bestätigt, dass eine J-Kette erforderlich ist für die Assoziierung des Schutzproteins zum Immunglobulin, wie bei Säugern festgestellt. Nur die ungefähr 210 kDa große monomere Form des Immunglobulins wurde von Anti-kappa-Antiserum und den Antisera, die spezifisch das Schutzprotein binden, als freies Schutzprotein erkannt, aber keine Immunglobulin-Schwer- oder -Leichtkettenproteine.
Funktionale Studien unter Anwendung des in 5 Pflanzenkonstrukten erzeugten Immunglobulins wurden mithilfe des ELISA-Verfahrens durchgeführt. Alle Pflanzen, die Immunglobulin-Leicht- und -Schwerketten exprimieren, fügten funktionales Immunglobulin zusammen, das spezifisch Streptokokken-Antigen (SA I/II) erkannte. Die Bindungsniveaus und Titrationskurven waren ähnlich denen von nativem Maus-Hybridom-Zellen-Überstand. Keine SA I/II-Bindung wurde in Pflanzen nachgewiesen, die nur J-Ketten- oder nur Schutzprotein exprimierten oder in Wildtyp-Pflanzen. Das Binden von Immunglobulinen and immobilisiertes aufgereinigtes Streptokokken-Antigen oder an natives Antigen auf der Oberfläche der Bakterienzelle wurde bei Verwendung des Antiserums, das spezifisch das Schutzprotein bindet, ebenfalls nachgewiesen. Bei diesen Assays wurde spezifisch das Binden des Immunglobulins, das das Schutzprotein aufweist, an das Streptokokken-Antigen nachgewiesen. Diese Ergebnisse bestätigten, dass sich das Schutzprotein mit dem Immunglobulin zusammenfügte, um ein Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist, auf eine Weise zu erzeugen, die die Antigenbindung nicht beeinträchtigt.
Das Zusammenfügen von schweren und leichten Ketten in funktionalen Immunglobulinmolekülen in Pflanzen ist sehr effizient, wie von Hiatt, A. C., Cafferkey, R. & Bowdish, K. Nature 342, 76–78 (1989) gezeigt. Ein Signalpeptid muss sowohl auf dem schweren als auch dem leichten Kettenkonstrukt vorhanden sein, um die rekombinanten Proteine zum Antikörper des endoplasmatischen Retikulums zu lenken, damit das Zusammenfügen stattfindet, wie vorher gezeigt von Hiatt, A. C., Cafferkey, R. & Bowdish, K. Nature 342, 76–78 (1989). Diese Studie hat die Genauigkeit des Zusammenfügens von Immunglobulin, das eine Dimerisierung von monomerem Antikörper durch J-Kette in den transgenen Pflanzen umfasst, unter Beweis gestellt. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass in Pflanzen die dimere Immunglobulin-Population einen größeren Anteil (ungefähr 57 %) des gesamten Antikörpers repräsentiert. Diese Ergebnisse erklären auch die Produktion eines zusammengefügten Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist, welches das entsprechende Antigen bindet, ebenso wie den parentalen murinen monoklonalen Antikörper, der einen größeren Anteil des gesamten Antikörpers darstellt, wenn das Schutzprotein eingebracht ist (ungefähr 45 %).
Die Coexpression von dimerem Immunglobulin mit dem Schutzprotein in Pflanzen hat zum Zusammenfügen eines funktionalen Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist, geführt.
Alle vier Transgene für dieses komplexe Protein wurden mit der identischen pMON 530 Expressionskassette und nativen Leitsequenzen in die Pflanzen eingebracht. Dieser Vektor enthält eine Promotorsequenz, die vom 35S Transkript des Blumenkohl-Mosaik-Virus abgeleitet ist, die die Expression von Transgenen in eine Vielzahl von Zelltypen der meisten Pflanzenorgane lenkt, wie beschrieben von Benfey, P. N. & Chua, N-H. Science 250, 959–966 (1990); and Barnes, W. M. PNVAS 87, 9183–9187 (1990). Ein Lenken der Expression aller vier Transgene durch den gleichen Promotor maximierte die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Expression in einer gewöhnlichen Pflanzenzelle. Mikroskopbetrachtungen von Pflanzen, die ein Immunglobulin exprimieren, das ein Schutzprotein aufweist, ließen erkennen, dass viele Zelltypen der Blätter die individuellen Proteinbestandteile enthalten, die das Immunglobulin bilden. Diese Proteine kumulierten sich bis zu ihrer höchsten Konzentration in Bündelscheidenzellen und waren durch die Zellwände dieser und anderer Zellen abgegrenzt, sie waren jedoch nicht in anderen Zwischenzellräumen zu finden. Die Restriktion der größten Immunglobulinbestandteile, des Schutzproteins und der chimären schweren Immunglobulin-Kette, innerhalb der engen Grenzen eines protoplastischen oder apoplastischen Kompartiments individueller Zellen würde das Zusammenfügen des sekretorischen Immunglobulins zu solchen Zellen, in denen die Moleküle aller Bestandteile synthetisiert sind, beschränken. Die subzelluläre Stelle bzw. die subzellulären Stellen und der Mechanismus des Zusammenfügens müssen noch festgelegt werden, das Zusammenfügen von IgG Heterotetrameren in Pflanzen erfordert ein Targeting von beider Proteine zum Endomembransystem, wie bereits dargestellt von Hiatt, A. C., Cafferkey, R. & Bowdish, K. Nature 342, 76–78 (1989); und Hein, M. B., Tang, Y., McLeod, D. A., Janda, K. D. & Matt, A. C. Biotechnol Prog. 7, 455–461 (1991).
Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass ein Schutzprotein, das von einem reifen sekretorischen Bestandteil ohne Signale für Membranintegration, Transzytose oder anschließende Proteolyse abgeleitet ist, mit chimärer schwerer Immunglobulin-Kette, die Immunglobulin-gamma- und -alpha-Domänen enthält, zusammengefügt werden kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass die inhärenten Funktionen der konstanten Regionen von IgG (Protein-A-Bindung, Komplementbindung, Fc-Rezeptor-Aktivität) in einem dimeren Immunglobulin, das in der Lage ist, an ein Schutzprotein zu binden, erhalten bleiben kann. Diese Fähigkeit kann ausgenutzt werden, um die Funktion eines für passive Immuntherapie verwendeten Immunglobulins zu verbessern, und die Entwicklung von Pflanzen, die fähig sind, ein funktionales Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist, zu erzeugen, wird eine beachtliche Tragweite für die passive Immuntherapie haben. Die Stärke der Expression des Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist, ist groß, und die Produktion kann maßstäblich bis zur landwirtschaftlichen Größe ausgebaut werden, um eine wirtschaftliche Produktion monoklonaler Antikörper zu ermöglichen.
Verfahren
Folgende Verfahren sind bei der Zubereitung und Analyse des Immunglobulins dieses Beispiels zum Einsatz gekommen.
i) Zusammenfügen von Antikörpern in transgener Nicotiana tabacum
Blattsegmente wurden in 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI (pH-Wert 8) (TBS) mit Leupeptin (10 μg/ml) homogenisiert. Die Extrakte wurden 3 Minuten lang in 75 mM Tris-HCI (pH-Wert 6,8), 2 % SDS, unter nicht-reduzierenden Bedingungen gekocht, und eine SDS-PAGE wurde in 4 % Acrylamid durchgeführt. Die Gels wurden auf Nitrocellulose geblottet. Die Blots wurden während 2 h in TBS mit 0,05 % Tween 20 und 1 % fettfreier Trockenmilch inkubiert, danach folgten das entsprechend Antiserum und eine weitere Inkubation während 2 h bei 37 °C. Nach Waschen wurde als Sekundärschicht mit alkalischer Phosphatase konjugierter Antikörper während 2 h bei 37 °C aufgetragen. Die Antikörperbindung wurde durch Inkubation mit 300 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium und 150 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat nachgewiesen.
Diese Extrakte wurden analysiert, um festzustellen, ob die Immunglobuline in die Immunglobulin-Moleküle zusammengefügt wurden – durch Western Blot von Pflanzenextrakten, die unter nicht-reduzierenden Bedingungen zubereitet worden waren, unter Verwendung von Anti-kappa-Antiserum (Bradsure, UK) und einem Antiserum, das spezifisch das Schutzprotein erkennt, die in den Pflanzen produzierten Immunglobuline wurden mit dem monoklonalen IgG1 von Guy's 13 Immunglobulin verglichen, das von Smith, R. & Lehner, T. Oral Microbiol. Immunol. 4, 153–158 (1989) beschrieben worden ist.
ii) Western-Analyse
Eine Western-Analyse wurde bei jedem Pflanzenextrakt, das unter nicht-reduzierenden Bedingungen zubereitet worden war, mit dem Ziel durchgeführt, die individuellen Proteinbestandteile des Immunglobulins zu identifizieren. Proben der verschiedenen Pflanzenextrakte wurde gemäß vorstehender Beschreibung zubereitet, jedoch mit einem Zusatz von 5-%-igem β-Mercaptoethanol. Eine SDS-PAGE-Analyse in 10 % Acrylamid wurde durchgeführt, und das Protein in den Gels wurde auf Nitrocellulose übertragen. Individuelle Proteine wurden mithilfe von Anti-Maus γ1-Schwerkette (Sigma, UK), Anti-Maus-kappa-Kette (Bradsure, UK) oder einem Antiserum, das spezifisch das Schutzprotein erkennt, gefolgt von einem mit entsprechender alkalischer Phosphatase konjugiertem Antikörper, nachgewiesen.
iii) Western-Analyse zur Darstellung der Produktion von Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist
Eine Western-Analyse von transgenem Pflanzenextrakt wurde gemäß vorstehender Beschreibung unter ii) durchgeführt. Die Pflanzenextrakte von Pflanzen, die das Immunglobulin exprimieren, das das Schutzprotein aufweist, wurden mit SDS-PAGE unter sowohl nicht-reduzierenden als auch reduzierenden Bedingungen analysiert, und die Proteine wurden auf Nitrocellulose übertragen. Die Immunglobulin-Bestandteile wurden mit einem Anti-kappa-Antiserum oder einem Schaf-Antiserum, das spezifisch das Schutzprotein erkennt, gefolgt von einem mit entsprechender alkalischer Phosphatase markierten 2° Antikörper, nachgewiesen.
iv) Expression von antigen-spezifischem Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist, in transgenem Nicotiana tabacum
Zur Vorführung, dass die Pflanzen antigen-spezifisches Immunglobulin produzierten, wurde Pflanzenextrakt, das an aufgereinigtes Streptokokken-Antigen (SA) I/II mit Anti-kappa-Kette-Antiserum, das mit Meerrettich-Peroxidase markiert war, nachgewiesen. Die Anwesenheit eines Schutzproteins im antigen-spezifischen Immunglobulin wurde nachgewiesen durch Pflanzenextrakt, das an aufgereinigtes Streptokokken-Antigen I/II bindet, und Streptokokkenzellen wurden mit einem Schaf-Antiserum, das immunspezifisch für ein Schutzprotein ist, gefolgt von einem mit alkalischer Phosphatase markierten Esel-Anti-Schaf-Antiserum, nachgewiesen. Diese Tests auf antigen-spezifisches Immunglobulin wurden auf Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit aufgerenigtem SA I/II (2 μg/ml) mit TBS oder log-Phase, Wachstumsphase, Strep. mutans (NCTC 10449) in Bicarbonatpuffer (pH-Wert 9,8) beschichtet waren. Das Blocking erfolgte mit 5 % fettfreier Trockenmilch in TBS bei Raumtemperatur während 2 Stunden. Die Pflanzenblätter wurden in TBS mit 10 μg/ml Leupeptin (Calbiochem, USA) homogenisiert. Der Überstand der Maus-Hybridom-Zellkultur von Guy's 13 (IgG) wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Überstände wurden in seriellen zweifachen Verdünnungen der Mikrotiterplatte hinzugefügt, und es folgte eine Inkubation während 2 Stunden. Nach Waschen mit TBS mit 0,05 % Tween 20, wurden gebundene Immunglobulinketten entweder mit einem Goat-Anti-mouse-Leichtkettenspezifischen Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase (Nordic Pharmaceuticals, UK) konjugiert war, oder mit einem Schaf-Anti-SC-Serum, gefolgt von einem mit alkalischer Phosphatase markiertem Esel-Anti-Schaf-Antiserum während 2 Stunden bei Raumtemperatur, nachgewiesen. Der Nachweis erfolgte mit 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) (Boehringer, Deutschland) für mit HRPO konjugierten Antikörper oder Dinatrium-p-Nitrophenylphosphat (Sigma, UK) für mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper.
v) Lokalisierung von Immunglobulin-Bestandteilen in Pflanzen
Mikroaufnahmen von transgenen Pflanzen, die Immunglobuline, die Schutzproteine enthalten, exprimieren, und von Kontrollblättern von Nicotiana tabacum wurde mithilfe von Immunogold-Nachweis von muriner alpha-Kette angefertigt. Kurz beschrieben wurden die Blätter in 2 mm × 10 mm große Segmente geschnitten und in 3 Gew.-% Parafomaldehyd, 0,5 Gew.-% Glutaraldehyd, 5 Gew.-% Sukrose in 100 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,4) fixiert. Nach Entwässerung in wasserfreiem Ethanol wurden die Blattsegmente mit Xylol infiltriert, in Paraffin eingebettet und in 3 mm große Abschnitte geschnitten und auf Objektträger für immunchemische Färbung aufgezogen. Die Blattabschnitte wurden mit primären Antikörpern, affinitätsgereinigter Kaninchen-Anti-Maus-alpha-Kette (die mit der A/G-Hybrid-Schwerkette reagiert) oder Schaf-Anti-Kaninchen-SC und danach mit sekundärem Antikörper, Goat-Anti-Kaninchen-10 mn Gold oder Kaninchen-Anti-Schaf-10 mn Gold inkubiert. Das Immunogold-Signal wurde durch Silberverstärkung intensiviert. Die Pflanzen wurden sowohl mit Phasenkontrast- als auch mit Hellfeldmikroskopie beim gleichen Querschnitt visualisiert. Die Immunolokalisation des Schutzproteins über serielle Abschnitte wurde angewendet, um die gleiche zelluläre Lokalisation für schwere Kette und Immunglobulin darzustellen. Die Analyse wurde bei folgenden Zellen und Zellkompartimenten durchgeführt:
spongiösen Mesophyll-Zellen, epidermalen Zellen, Zwischenzellräumen, Palisaden-Parenchym-Zellen und Leitbündeln.
Zur weiteren Analyse der genauen Lokalisation der Immunglobulin-Bestandteile erfolgte eine Analyse der seriellen Abschnitte des Leitbündels bei Nicotiana tabacum und des Leitbündels der Nicotiana tabacum-Kontrollpflanze mit Immunogoldnachweis für jeden Bestandteil des Immunglobulins. Serielle Abschnitte von transgenen Pflanzenblättern, die sekretorisches Immunglobulin exprimieren, wurden mit einem Antikörper, der spezifisch das Schutzprotein erkennt, oder mit Anti-IgA-Antikörper, gefolgt vom entsprechenden Gold-markierten sekundären Antikörper, inkubiert. Ein Kontrollblattabschnitt von einer transgenen Pflanze, die keine Immunglobulin kodierenden Sequenzen enthielt, wurde ebenfalls mit Anti-IgA-Antikörper, gefolgt von Gold-markiertem Goat-Anti-Kaninchen-Antiserum oder nur mit den Gold-markierten sekundären Antikörpern, inkubiert und bestätigte die Spezifizität der Färbung. Sowohl Phasenkontrast-Beleuchtung eines kleineren Leitbündels als auch Hellfeld-Beleuchtung der gleichen Felder wurden angewendet, um die Immunogold-Lokalisation des Schutzproteins zu zeigen. Die Hellfeld-Beleuchtung eines Querschnitts des Leitbündels von einem seriellen Blatt zeigte die gleiche Immunogold-Lokalisation der schweren Immunglobulinkette wie für das Schutzprotein erhalten worden war.
Beispiel 8. Produktion eines anwendbaren Pflanzenextrakts, das Immunglobuline enthielt. die ein Schutzprotein aufwiesen
Pflanzenstücke (entweder Blatt oder Stiel, Blüte, Wurzel oder Kombinationen davon) von Pflanzen, die Immunglobuline produzieren, die ein Schutzprotein enthalten, wurden mit Homogenisierungspuffer (2 ml Puffer/g Pflanzenmaterial; Homogenisierungspuffer: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5) vermischt, in einem Waring-Mischer zu einer Pulpe homogenisiert und bei 10.000 × g zentrifugiert, um Ablagerungen zu entfernen. Der Überstand wurde danach mit einem gleichen Volumen von HPLC-grade Ethylacetat durch Schütteln bei Raumtemperatur, gefolgt von Zentrifugieren bei 10.000 × g extrahiert. Die wässrige Phase wurde in ein anderes Gefäß übertragen, das restliche Ethylacetat wurde durch Platzieren der Lösung in Vakuum aus der wässrigen Phase entfernt. Das resultierende Rohextrakt enthielt gleichmäßig 100 μg Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufwies, pro Milliliter. Dieses Verfahren ist anwendbar bei jeder Pflanze, die ein Immunglobulin enthält, da" ein Schutzprotein aufweist.
Für die Homogenisierung wurde eine Reihe von Verfahren angewendet, einschließlich Anwendung eines Mörsers und Stößels oder eines Polytron-Geräts, und die Homogenisierung kann entweder in Kälte oder bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Das Extrakt kann durch Delipidation, durch Extraktion mit Hexan oder anderen organischen Lösemitteln weiter aufgereinigt werden. Die Delipidation ist nicht wesentlich für die Ableitung eines anwendbaren Produkts aus dem Pflanzenextrakt, aber sie ist vorteilhaft in Fällen, wenn das Endprodukt ein aufgereinigtes Immunglobulin ist, das ein Schutzprotein aufweist. In vielen Fällen enthält das Rohextrakt eine ausreichend große Menge von Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist (d. h. 100 mg/ml), um ohne weitere Aufreinigung oder Anreicherung anwendbar zu sein. Für eine orale Anwendung wäre das Extrakt mit gewöhnlich verwendeten Geschmacksstoffen und Stabilisatoren zu vermischen. Für eine dentale Anwendung wäre das Extrakt zusätzlich mit einem Geliermittel zu vermischen, um den Kontakt des Extrakts mit den Zähnen zu erhalten. Für eine gastrische Anwendung kann das mit Geschmacksstoff vermischte Extrakt direkt eingenommen werden.
Beispiel 9. Stabilität eines Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist
Zwei Sätze von Pflanzenrohextrakt wurden gemäß vorstehender Beschreibung zubereitet. Das erste Extrakt war von einer Pflanze abgeleitet, die einen IgA-Antikörper exprimiert, und das zweite Extrakt war von einer Pflanze abgeleitet, die ein Immunglobulin, das ein Schutzprotein aufweist, exprimiert. Von derartigen Rohextrakten ist bekannt, dass sie eine Vielfalt an proteolytischen Enzymen enthalten. Eine verlängerte Inkubation von Extrakten bei Raumtemperatur oder bei 37 C kann daher einen proteolytischen Verdau darstellen.
Mithilfe von ELISA wurde die Menge der Gamma-Komplexe in den beiden Extrakten als Funktion der Zeit bei sowohl Raumtemperatur als auch 37 °C festgestellt. Bei diesen Assays wurde ein Anti-kappa-Ketten-Antikörper zur Beschichtung der Platte verwendet, worauf eine Inkubation mit dem Pflanzenextrakt während 1 h bei 37 °C folgte. Ein mit HRPO konjugierter Anti-kappa-Ketten-Antikörper wurde verwendet, um von der Pflanze abgeleitetes Immunglobulin nachzuweisen. Die Menge des unmittelbar nach der Zubereitung im Extrakt enthaltenen Immunglobulins, das ein Schutzprotein aufweist, wurde mit 100 % gleichgesetzt. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur betrug der IgG1 40 %, und das Immunglobulin, das das Schutzprotein aufweist, enthielt > 95 %. Nach 6 Stunden betrug der verbliebene IgG1-Antikörper 20 %, und das das Immunglobulin, das die Schutzproteinmenge aufweist, enthielt weiterhin 95 %. Nach 12 Stunden war kein IgG1 nachweisbar, während –90 % des Immunglobulins, das das Schutzprotein aufweist, verblieben war. Ein signifikanter Rückgang der Menge geschützten Antikörpers wurde bis zu 48 Stunden nach der Zubereitung des Extrakts nicht festgestellt.
Beispiel 10. Eukaryotische transgene Zellen, die Immunglobuline exprimieren, die Schutzprotein aufweisen
Die vier Ketten, die das Immunglobulin umfassen, das ein Schutzprotein aufweist, können auch in anderen Zelltypen entweder in vitro (Zellkulturen) oder in vivo (transgene Tiere) exprimiert werden. Siehe: Manipulating the Mouse Embryo; A Laborstory Manual, B. Hogan et al., Cold Spring Harbor Laborstory (1986). Im Fall der transgenen Tiere wurden aufgereinigte Präparationen von geeignetem Vektor-DNA für eine Endkonzentration von 2 ng/μl in 10 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH-Wert 7,4, eingestellt. Pronukleäre Injektionen mit Verwendung von Zygoten, die von Inzuchttieren zubereitet waren, wurden durchgeführt. Injizierte Eier wurden dann in Standardverfahren auf pseudogravide Weibchen übertragen. Lebend geborene Tiere werden dann auf die Anwesenheit von Transgenen gescreent, wozu eine der vielen allgemein angewendeten Techniken, wie PCR und ELISA, benutzt werden können. Mitglieder des Stammbaums, die verschiedene Bestandteile des Immunglobulins, das das Schutzprotein aufweist, exprimieren, werden dann gepaart, um multitransgene Tiere produzieren. Nachkommen dieser Kreuzungen werden danach gescreent, um diejenigen zu identifizieren, die alle vier Ketten exprimieren. Je nach dem Typ von Vektor, der für die zygotischen Injektionen verwendet wird, können in den transgenen Tieren verschiedene Zelltypen identifiziert werden, die das komplette Immunglobulin zusammenfügen, das ein Schutzprotein aufweist. Diese Vektor-DNA können aus spezifischen Promotorelementen bestehen, die eine Transkription der Transgene in besonderen Zelltypen oder Geweben ermöglichen. Jeder Vektor könnte einen einzelnen Bestandteil des geschützten Antikörpers (IgG/A1, J-Kette, Schutzprotein oder kappa-Kette) exprimieren, oder er könnte potenziell mehr als einen Bestandteil exprimieren. In dieser Situation könnte der Vektor eine entsprechende Anzahl von Promotorregionen und Restriktionsstellen enthalten, um eine Transkription jedes Transgens zu ermöglichen.
Eine Expression aller vier Ketten in einem Zellkultursystem kann erhalten werden durch Verwenden eines DNA-Vektors, von dem jeder einzelne Bestandteil individuell promotiert werden kann. Dies würde vier Expressionskassetten (enthaltend Promotor, multiple Klonierstelle und Polyadenylationsregion) auf der gleichen Vektor-DNA erfordern. Alternativ können individuelle Zelllinien sequenziell mit individuellen Vektoren, die Einzelketten von solcher Länge exprimieren, dass jeder Vektor der Zelllinie einen selektiven Widerstand vermittelt, transfektiert werden.
Allgemein verfügbare Vektoren, wie pMAMneo (Clontech), können entweder für multiple Expression angepasst werden oder als eine Serie von Vektoren, die distinkt wählbare Marker exprimieren.
Die Transfektion jeglicher eukaryotischer Zellen, wie Fibroblasten, wird mit herkömmlichen Techniken durchgeführt. Kurz ausgedrückt: Die Zellen werden am Tag vor der Transfektion im Verhältnis 1:20 gesplittet und bei etwa 30 % Konfluenz unter Verwendung von 125 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 25 mM Hepes, 0,75 mM NaHPO4, pH-Wert 7,05, und 5 μg DNA/10 cm Schale transfektiert. Nach 16 Stunden DNA-Inkubation werden die Zellen mit 10 % Dimethylsulfoxid während 3 Minuten geschockt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion werden die Zellen anhand des Wachstums im entsprechenden Medium, das ein Antibiotikum oder ein anderes zytotoxisches Reagens enthält, ausgewählt,
Die resultierenden Zellen produzieren sämtliche Bestandteile für das Immunglobulin, das das Schutzprotein aufweist. Diese Bestandteile sind einwandfrei zusammengefügt, um ein funktionales Immunglobulin zu bilden, das ein Schutzprotein aufweist.
Beispiel 11. Engineering eines Schutzproteins, das mit einem Teil der zytoplasmatischen Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens fusioniert
Die Konstruktion von DNA-Segmenten, die ein Schutzprotein kodieren, das mit einem Segment fusioniert ist, das ein Segment der zytoplasmatischen Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens wird wie folgt durchgeführt. Das Schutzprotein cDNA, das von der ersten Aminosäure der Signalsequenz (MET_-18) bis GLU₆₀₆ kodiert, wird in irgendeinen Pflanzenexpressionsvektor, wie den pMON530 Vektor (aufgeschlossen mit Bgl II und Xho I) als ein Bgl II – Xho I Fragment ligiert. Dieses Schutzproteinderivat wird erhalten durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der entsprechenden Oligenukleotid-Primer, die entweder eine Bgl II oder Xho I Erkennungssequenz enthalten und die außerdem komplementär zu DNA-kodierenden Resten -18 bis -13 bzw. Resten 601 bis 606 des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens sind. Der gleiche Vorgang wird durchgeführt, um ein Schutzprotein cDNA zu erhalten, das von MET_-18 bis ALA₆₂₈ kodiert, jedoch mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid, das eine Xho-Stelle enthält, auch komplementär zu dem Schutzprotein cDNA ist, das die Reste 623 bis 628 kodiert.
Die cDNA, die das Domänenfragment des Polyimmunglobulinrezeptors des Kaninchens kodiert, wird auch durch PCR-Amplifikation oder als ein Xho I Fragment erhalten. Die verwendeten Oligonukleotide sind komplementär zu DNA, die von ARG₆₂₃ bis ALA₇₅₅ kodiert, die beide Xho I Erkennungssequenzen enthalten. Dieses Fragment wird dann in die pMON530 Vektoren, die eine der Schutzprotein-cDNA gemäß vorstehender Beschreibung enthalten, ligiert. Die entsprechende Orientierung der zytoplasmatischen Domäne der cDNA wird festgestellt durch Restriktionsverdaus und durch Sequenzanalyse der Plasmide, die von transformierten Bakterienkolonien erhalten werden.
Die Oligonukleotide, die für die PCR-Amplifikation eingesetzt werden, enthalten eine entsprechende Anzahl von Nukleotiden, um sicherzustellen, dass die resultierenden cDNA im Rahmen liegen und fähig sind, als ein kontinuierliches Fusionsprotein, das sowohl Schutzprotein als auch zytoplasmatische Domäne enthält, translatiert zu werden.
Die resultierenden Konstrukte in der entsprechenden Orientierung kodieren ein Protein, das direkt mit der zytoplasmatischen Domäne des Polyimmunglobulinrezeptors ohne funktionales Transmembransegment, das operativ mit einem DNA-Segment (Promotor) verknüpft ist, der eine Expression in eine Pflanzenzelle ermöglicht, fusioniert ist. Die Konstrukte kodieren zwei zusätzliche Aminosäuren (SER-TRP), die von dem Einbringen der Restriktionsstelle Xho I abgeleitet sind und als Linker zwischen dem Schutzprotein und der zytoplasmatischen Domäne dienen.
Diese Vektoren werden dann verwendet, um Agrobacterium wie vorstehend beschrieben zu transformieren, das wiederum verwendet wird, um Pflanzenzellen zu transformieren. Die gleichen Techniken, wie die in den vorstehenden Beispielen beschriebenen, werden angewendet, um eine Pflanze zu produzieren, die dieses Protein als Teil eines Immunglobulins exprimiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transgene Pflanzenzelle, die ein Schutzprotein enthält, wobei das Schutzprotein Schutz vor Abbau durch die Umwelt bietet und Aminosäurereste von einem Polyimmunglobulinrezeptor eines Säugers umfasst, die zu den Resten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 analog sind, und wobei Aminosäurereste, die zu den Resten 628–755 von SEQ ID NO: 2 analog sind, fehlen.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, die außerdem mindestens ein zusätzliches Molekül enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette mit einer Antigenbindungsdomäne, einer von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette mit einer Antigenbindungsdomäne oder einer Immunglobulin-J-Kette.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 2, wobei das Immunglobulin weiterhin eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit einer Antigenbindungsdomäne umfasst, die mit der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette assoziiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Immunglobulin weiterhin eine zweite von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mit einer Antigenbindungsdomäne umfasst, die mit dem Schutzprotein assoziiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 4, wobei das Immunglobulin weiterhin eine zweite von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit einer Antigenbindungsdomäne umfasst, die an die zweite von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette gebunden ist.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das Immunglobulin weiterhin eine Immunglobulin-J-Kette umfasst, die an mindestens eine der von Immunglobulin abgeleiteten schweren Ketten gebunden ist.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Immunglobulin ein therapeutisches Immunglobulin ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 7, wobei das therapeutische Immunglobulin an Antigene eines pathogenen Schleimhautparasiten bindet.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 8, wobei das therapeutische Immunglobulin Karies verhindern kann.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei die Antigenbindungsdomäne ein Antigen von den Serotypen c, a und f von S. mutans oder den Serotypen d und g von S. sobrinus binden kann.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei das Schutzprotein die Aminosäurereste 1–606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 enthält.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei der Polyimmunglobulinrezeptor SEQ ID NO: 4 ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 3, wobei das Schutzprotein Folgendes enthält: a) einen ersten Abschnitt, der mindestens eine Domäne umfasst, die von dem Polyimmunglobulinrezeptor eines ersten Tieres stammt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10: Domäne I, Domäne II, Domäne III, Domäne IV, Domäne V und den Aminosäureresten 553–606 bis zu 627 von Domäne VI; und b) einen zweiten Abschnitt, der nicht den ersten Abschnitt umfasst und mindestens eine Domäne umfasst, die von dem Polyimmunglobulinrezeptor eines zweiten Tieres stammt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10: Domäne I, Domäne II, Domäne III, Domäne IV, Domäne V und den Aminosäureresten 553–606 bis zu 627 von Domäne VI, wobei der erste und der zweite Abschnitt zusammen ein Protein bilden, das den Aminosäureresten 1–606 von SEQ ID NO: 2 entspricht.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 13, wobei das erste Tier ein Mensch ist und das zweite Tier ein Kaninchen ist.
Transgene Pflanzenzelle nach den Ansprüchen 2 bis 10, 13 oder 14, wobei die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mindestens einen Abschnitt einer schweren IgM- oder IgA-Kette eines beliebigen Subtyps enthält.
Transgene Pflanzenzelle nach den Ansprüchen 2 bis 10, 13 oder 14, wobei die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette sich aus Immunglobulindomänen von zwei unterschiedlichen Isotypen von Immunglobulin zusammensetzt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16, wobei die Immunglobulindomänen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: a) dem C_H1 eines Maus-IgG1 und dem C_H2 und C_H3 von Maus-IgA und b) dem C_H1 und C_H2 eines Maus-IgG1 und dem C_H2 und C_H3 von Maus-IgA.
Transgene Pflanzenzelle nach den Ansprüchen 2 bis 10 oder 13 bis 17, wobei die Antigenbindungsdomäne im Wesentlichen der variablen Region der schweren Kette 13 von Guy entspricht.
Transgene Pflanzenzelle nach den Ansprüchen 2 bis 10 oder 13 bis 17, wobei die Antigenbindungsdomäne im Wesentlichen der variablen Region der leichten Kette 13 von Guy entspricht.
Transgene Pflanzenzelle, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein wie in Anspruch 1 definiertes Schutzprotein kodiert, wobei das Schutzprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die den Aminosäureresten 1 bis 606 bis zu 627 eines Polypeptids entspricht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 20, die außerdem eine zweite Nukleotidsequenz enthält, die mindestens eines der Moleküle kodiert, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: einer von Immunglobulin abgeleiteten schweren Kette mit einer Antigenbindungsdomäne, einer von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette mit einer Antigenbindungsdomäne oder einer Immunglobulin-J-Kette.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 21, wobei die zweite Nukleotidsequenz eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mit einer Antigenbindungsdomäne kodiert, und die außerdem eine dritte Nukleotidsequenz enthält, die eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit einer Antigenbindungsdomäne kodiert.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 22, die außerdem eine vierte Nukleotidsequenz enthält, die eine Immunglobulin-J-Kette kodiert.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 22, die eine Nukleotidsequenz, die ein wie in Anspruch 1 definiertes Schutzprotein kodiert, wobei das Schutzprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die den Aminosäureresten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 entspricht, und eine Nukleotidsequenz, die eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mit einer Antigenbindungsdomäne kodiert, umfasst.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Pflanzenzelle von einer zweikeimblättrigen oder einkeimblättrigen Pflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Pflanzenzelle von einer Solanaceenpflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Pflanzenzelle von einer Alfalfapflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Pflanzenzelle von einer Tabakpflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Pflanzenzelle Teil einer Pflanze ist.
Verfahren zum Produzieren der transgenen Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 29, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen eines Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle, der eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Schutzprotein kodiert, das von einem Immunglobulinrezeptor abgeleitet ist, die mit einem Transkriptionspromotor operativ verknüpft ist, wobei das Schutzprotein Schutz vor Abbau durch die Umwelt bietet und Aminosäurereste, die zu den Resten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 analog sind, von einem Polyimmunglobulinrezeptor eines Säugers umfasst; und b) Einführen eines Expressionsvektors in die Pflanzenzelle, der eine Nukleotidsequenz enthält, die eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mit einer Antigenbindungsdomäne kodiert, die mit einem Transkriptionspromotor operativ verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 30, das weiterhin den folgenden Schritt umfasst: c) Einführen eines Expressionsvektors in die Pflanzenzelle, der eine Nukleotidsequenz enthält, die eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit einer Antigenbindungsdomäne kodiert, die mit einem Transkriptionspromotor operativ verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, das weiterhin den Schritt des Einführens eines Expressionsvektors in die Pflanzenzelle, der eine Nukleotidsequenz enthält, die eine Immunglobulin-J-Kette kodiert, die mit einem Transkriptionspromotor operativ verknüpft ist, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette eine Immunglobulin-alpha-Kette ist und die von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette eine Immunglobulin-kappa- oder -lambda-Kette ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette sich aus Abschnitten einer Immunglobulin-alpha-Kette und einer Immunglobulin-gamma-Kette zusammensetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei die Pflanzenzellen Teil einer Pflanze sind.
Verfahren nach Anspruch 35, das weiterhin das Züchten der Pflanze umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei die Pflanze eine zweikeimblättrige, einkeimblättrige, Solanaceen-, Leguminosen-, Alfalfa- oder Tabakpflanze ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 37, wobei die von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette eine chimäre schwere Immunglobulin-Kette ist.
Verfahren zum Produzieren einer therapeutischen Immunglobulinzusammensetzung, die Pflanzenmakromoleküle enthält, wobei das Verfahren den Schritt des Scherens eines Teils der Pflanze nach Anspruch 29 unter Druck umfasst, um eine Pulpe produzieren, die ein therapeutisches Immunglobulin und Pflanzenmakromoleküle in einer Flüssigkeit, die von dem Apoplast oder Symplast der Pflanze abgeleitet ist, und festes, von der Pflanze erlangtes Material enthält.
Verfahren nach Anspruch 39, das weiterhin den Schritt des Trennens des festen, von der Pflanze erlangten Materials von der Flüssigkeit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, wobei der Teil der Pflanze ein Blatt, ein Stiel, eine Wurzel, eine Knolle, eine Frucht oder die ganze Pflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Scheren mit einer mechanischen Vorrichtung durchgeführt wird, die Flüssigkeit aus dem Apoplast oder Symplast der Pflanze herauslöst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Trennung mittels Zentrifugierung, Ablagerung, Ausflockung oder Filtration erfolgt.
Verfahren zum Produzieren eines zusammengefügten Immunglobulinmoleküls mit schweren, leichten und J-Ketten und einem Schutzprotein, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen von Nukleotidsequenzen in eine Pflanzenzelle, die zur Expression operativ verknüpft sind und Folgendes kodieren: i) eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mit einer Antigenbindungsdomäne, ii) eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit einer Antigenbindungsdomäne, iii) eine Immunglobulin-J-Kette und iv) ein Schutzprotein, wobei das Schutzprotein Schutz vor Abbau durch die Umwelt bietet und Aminosäurereste, die zu den Resten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 analog sind, von einem Polyimmunglobulinrezeptor eines Säugers umfasst und wobei die Aminosäurereste 628–755 von SEQ ID NO: 2 fehlen; b) Halten der resultierenden transgenen Pflanzenzelle unter Bedingungen, die die Produktion und das Zusammenfügen der von Immunglobulin abgeleiteten schweren und leichten Ketten, der Immunglobulin-J-Kette und des Schutzproteins in einem Immunglobulinmolekül ermöglichen.
Verfahren zum Produzieren eines zusammengefügten Immunglobulinmoleküls mit schweren, leichten und J-Ketten und einem Schutzprotein durch Halten einer transgenen Pflanzenzelle, die gemäß Schritt a) von Anspruch 44 produziert wurde, unter Bedingungen, die die Produktion des Proteins und das Zusammenfügen des Immunglobulins ermöglichen.
Verfahren zum Bewirken, dass ein Immunglobulin gegenüber Umweltbedingungen resistent ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) operatives Verknüpfen einer Nukleotidsequenz, die die Antigenbindungsdomäne kodiert, die von einer schweren Immunglobulin-Kette abgeleitet wurde, mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine Domäne kodiert, die von einer schweren Immunglobulin-alpha-Kette abgeleitet wurde, um eine Nukleotidsequenz zu bilden, die eine chimäre schwere Immunglobulin-Kette kodiert; b) Exprimieren der Nukleotidsequenz, die die chimäre schwere Immunglobulin-Kette kodiert, um die chimäre schwere Immunglobulin-Kette in einer transgenen Pflanzenzelle zu produzieren, die außerdem mindestens ein anderes Molekül enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Schutzprotein, wobei das Schutzprotein Schutz vor Abbau durch die Umwelt bietet und Aminosäurereste, die zu den Resten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 analog sind, von einem Polyimmunglobulinrezeptor eines Säugers umfasst, wobei die Aminosäurereste 628–755 von SEQ ID NO: 2 fehlen; und einer von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette mit einer Antigenbindungsdomäne und einer Immunglobulin-J-Kette; und c) dadurch Ermöglichen, dass die chimäre schwere Immunglobulin-Kette sich mit mindestens einem anderen Molekül zusammenfügt, um das Immunglobulin zu bilden, das gegenüber den Umweltbedingungen resistent ist.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei das andere Molekül ein Schutzprotein ist und die transgene Pflanzenzelle außerdem eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit einer Antigenbindungsdomäne und eine Immunglobulin-J-Kette enthält.
Verfahren zum Produzieren eines Immunglobulins, das gegenüber Umweltbedingungen resistent ist, durch Halten einer transgenen Pflanzenzelle unter Bedingungen, die die Produktion eines Proteins und ein Zusammenfügen des Immunglobulins ermöglichen, wobei die transgene Pflanzenzelle Folgendes enthält: a) eine Nukleotidsequenz, die eine chimäre schwere Immunglobulin-Kette kodiert, bei der eine Nukleotidsequenz, die eine Antigenbindungsdomäne kodiert, die von einer schweren Immunglobulin-Kette abgeleitet wurde, mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine Domäne kodiert, die von einer schweren Immunglobulin-alpha-Kette abgeleitet wurde, operativ verknüpft wird; und b) mindestens ein anderes Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Schutzprotein, wobei das Schutzprotein Schutz vor Abbau durch die Umwelt bietet und Aminosäurereste, die zu den Resten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 analog sind, von einem Polyimmunglobulinrezeptor eines Säugers umfasst und wobei die Aminosäurereste 628–755 von SEQ ID NO: 2 fehlen, einer von Immunglobulin abgeleiteten leichten Kette mit einer Antigenbindungsdomäne und einer Immunglobulin-J-Kette; und dadurch ermöglicht wird, dass die chimäre schwere Immunglobulin-Kette sich mit mindestens einem anderen Molekül zusammenfügt, damit das Immunglobulin gegenüber den Umweltbedingungen resistent ist.
Transgene Pflanze, die sich aus Zellen zusammensetzt, die vier verschiedene Transgene enthalten, die jeweils ein anderes Polypeptid eines Multipeptidmoleküls kodieren, wobei jeweils mindestens eines der verschiedenen Polypeptide in dem Multipeptidmolekül miteinander verbunden sind; wobei mindestens eines der vier Transgene ein Transgen ist, das ein Schutzprotein kodiert, wobei das Schutzprotein Schutz vor Abbau durch die Umwelt bietet und Aminosäurereste, die zu den Resten 1 bis 606 bis zu 627 von SEQ ID NO: 2 analog sind, von einem Polyimmunglobulinrezeptor eines Säugers umfasst und wobei die Aminosäurereste 628–755 von SEQ ID NO: 2 fehlen.
Transgene Pflanze nach Anspruch 49, wobei mindestens eines der vier Transgene ein Transgen ist, das eine von Immunglobulin abgeleitete schwere Kette mit mindestens einem Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne kodiert.
Transgene Pflanze nach Anspruch 49, wobei mindestens eines der vier Transgene ein Transgen ist, das eine von Immunglobulin abgeleitete leichte Kette mit mindestens einem Abschnitt einer Antigenbindungsdomäne kodiert.
Transgene Pflanze nach Anspruch 49, wobei mindestens eines der vier Transgene ein Transgen ist, das eine Immunglobulin-J-Kette kodiert.
Transgene Pflanze nach Anspruch 49, wobei mindestens eines der vier Transgene ein Transgen ist, das eine chimäre schwere Immunglobulin-Kette kodiert.
Transgene Pflanze nach Anspruch 53, wobei die chimäre schwere Immunglobulin-Kette eine Immunglobulindomäne von einer der folgenden schweren Immunglobulin-Ketten enthält: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD; und außerdem eine Schutzproteinbindungsdomäne von IgA oder IgM enthält.
Transgene Pflanze nach Anspruch 53, wobei die schweren Immunglobulin-Ketten schwere Immunglobulin-Ketten vom Menschen, vom Nagetier, vom Kaninchen, vom Rind, vom Schaf, von der Ziege, vom Geflügel, vom Hund, von der Katze oder vom Primaten sind.
Transgene Pflanze nach Anspruch 53, wobei die Schutzproteinbindungsdomäne von dem IgA eines Menschen, eines Nagetiers, eines Kaninchen, eines Rinds, eines Schafs, eines Hunds, einer Katze oder eines Primaten stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 53, wobei die chimäre schwere Immunglobulin-Kette sich aus Immunglobulin-Ketten von Maus-IgG1 zusammensetzt und die Schutzproteinbindungsdomäne von Maus-IgA oder -IgM stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 53, wobei die chimäre schwere Immunglobulin-Kette sich aus Immunglobulindomänen eines humanen IgG, IgM, IgD oder IgE zusammensetzt und die Schutzproteinbindungsdomäne von einem humanen IgA oder IgM stammt.