WO2002004020A2 - Pathogenresistenz in organismen - Google Patents

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    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to the use of a polypeptide which binds a cyclic ketone derived from oxazole for the production of pathogen resistance in organisms, in particular plants and animals.
  • Plants and animals are a variety of pathogens, i.e. Exposed to pathogens that can cause disease.
  • pathogens are e.g. Fungi, bacteria and viruses.
  • the pathogens are often absorbed through the leaves, tubers and roots, while in animals this is often via the skin, breathing and food. Many strategies are followed to help with these organisms
  • the present invention is therefore based on the technical problem of providing a means with which resistance to pathogens can be generated in organisms, in particular plants and animals.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that plants and animals which contain a polypeptide which binds a cyclic ketone derived from oxazole have resistance to pathogens.
  • transgenic potato plants that contain 2-phenyloxazol-5-one express binding antibody, have resistance to pathogens, for example the phytopathogenic fungus Phytophthora infestans or the bacterial pathogen Erwinia carotovora.
  • pathogens for example the phytopathogenic fungus Phytophthora infestans or the bacterial pathogen Erwinia carotovora.
  • transgenic mice that express such an antibody have resistance to pathogens, for example the bacterium Staphylococcus aureus. It will refer to the following
  • these findings of the applicant are used for the use of a polypeptide for generating pathogen resistance in organisms, in particular plants, animals and humans, the polypeptide binding a cyclic ketone derived from oxazole.
  • polypeptide includes a (poly) peptide of any kind and origin which can bind a cyclic oxazole-derived ketone, in particular 3-phenyloxazol-5-one, the ketone being present as such or within a compound.
  • the polypeptide can be an antibody or a fragment thereof, e.g. a Fab, an Fv or a single chain (sc) antibody, in particular an scFv antibody and very particularly those with the amino acid sequence of FIG. 1.
  • the polypeptide can be provided by various methods. A method is favorable in which a polypeptide or antibody expression library is screened with the above ketone or a compound containing it (e.g. HuCAL, Morphosys, Germany).
  • the polypeptide can be used to generate pathogen resistance in organisms, in particular plants, animals and humans.
  • the use of the polypeptide in plants is first described below.
  • the polypeptide has a signal peptide, as a result of which it can be transported into certain cell compartments of a plant cell.
  • Suitable signal peptides and methods for linking the signal peptides to a desired protein, for example the present polypeptide, are known to the person skilled in the art.
  • the signal peptide of the barley ⁇ -amylase with regard to the apoplast (Düring et al., Plant Journal 3 (1993), 587-598), a mouse signal peptide, the combination of a Mouse signal peptide and the KDEL-ER retention signal for the ER (Artsaenko et al., Molecular Breeding 4 (1998), 313-319) for the targeting signal of a mammalian ⁇ -2,6-sialyltransferase for the Golgi apparatus (Wee et al., Plant Cell IV (1998), 1759-1768) on the vacuole localization signal of a vacuolar chitinase from cucumber with regard to the vacuoles (Neuhaus et al., Proc. Natl.
  • the polypeptide can be processed by various methods e.g. via media, such as culture media, a plant or
  • Parts of these, in particular plant cells, are administered.
  • polypeptide can be in the form of a nucleic acid encoding it, e.g. DNA or RNA, administered to plants or parts thereof.
  • a nucleic acid e.g. DNA or RNA
  • the nucleic acid is present in an expression vector or with
  • the expression vectors can be based on a plasmid, cosmid, virus, bacteriophage or another vector customary in genetic engineering. These vectors can have further functional units that stabilize the vector in the
  • Effect plant Furthermore, they can contain "left border” and “right border” sequences of agrobacterial T-DNA, which enables stable integration into the genome of plants. Furthermore, a termination sequence can be be present, which serves the correct termination of the transcription and the addition of a poly-A sequence to the transcript. Such elements are described in the literature (cf. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) and can be exchanged as desired.
  • suitable promoters are known to the person skilled in the art and these include, for example, the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter (Odell et al., Nature 313 (1995), 810-812), the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthesis promoter and the mannopine Synthase promoter (Harpster et al., Molecular and General Genetics 212 (1988), 182-190).
  • the one for the desired protein, e.g. the gene encoding the present polypeptide may also be linked to an inducible promoter, e.g. controlling the synthesis of the desired protein e.g.
  • Suitable promoters are known to the person skilled in the art and include, for example, the anaerobically inducible gap C4 promoter from maize (Bülow et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (1999), 182-188), PR promoters such as L-phenylalanine ammonium lyase. , Chalcon synthase and "hydroxyproline rieh glycoprotein” promoters inducible by ethylene (Ecker and Davies, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a large number of cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells are available for producing the expression vectors for introduction into plants.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pA-
  • the desired sequence can be inserted into the vector at an appropriate restriction site.
  • the vector obtained is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E.coli cells are in grown in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the vector is then recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as analysis methods for characterizing the vector DNA obtained. After each manipulation, the vector DNA can be cleaved and DNA
  • Fragments can be linked to other DNA sequences.
  • Each vector DNA sequence can be cloned in the same or different vectors.
  • Transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and other possibilities.
  • neomycin phosphotransferase II gene from E. coli (Beck et al., Gene 19 (1982), 327-336), the sulfonamide resistance gene (EP-369637) and the hygromycin resistance gene (EP -186,425).
  • additional DNA sequences may be required. E.g. for the transformation of E. coli
  • the plant cell uses the Ti or Ri plasmid, at least the right border, but often the right and left border of the Ti and Ri plasmid T-DNA must be linked as a flank region with the genes to be introduced.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special vectors, either in an intermediate vector or in a binary vector (cf. also the following examples). play 1 to 3).
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens using a helper plasmid.
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell should contain a plasmid carrying a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • plant explants can advantageously be cocultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • the expression vectors used according to the invention contain localization signals for localization in cell compartments, in particular endoplasmic reticulum (ER), apoplasts, Golgi apparatus, plastids, peroxisomes, mitochondria and / or vacuoles.
  • ER endoplasmic reticulum
  • apoplasts lipid-binding protein
  • Golgi apparatus plastids
  • peroxisomes mitochondria and / or vacuoles.
  • localization signals are the KDEL-ER targeting peptide, the Golgi localization signal of the ⁇ -1,2-N-acetylglucosamine transferase (GnTI), the transit peptide from the small subunit of the ribulose-biphosphate carboxylase and / or that vacuolar targeting signal SKNPIN.
  • GnTI Golgi localization signal of the ⁇ -1,2-N-acetylglucosamine transferase
  • the transit peptide from the small subunit of the ribulose-biphosphate carboxylase and / or that vacuolar targeting signal SKNPIN.
  • the above polypeptide is administered to plants.
  • plants can be plants of any plant species, i.e. both monocot and dicot plants.
  • the term "plant” used here also includes Gramineae, Chenopodia, leguminous plants, Brasicaceae, Solanaceae, fungi, mosses and algae. They are preferably useful plants, e.g. plants like wheat, barley, rice, corn, sugar beet, sugar cane, rapeseed, mustard, turnip, flax, pea, bean lupine, tobacco and potato.
  • the parts of the plants desired for the expression of the polypeptide in principle relate to any part of the plant, in any case propagation material of these plants, for example seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings etc.
  • the present invention also relates to plant seeds, a plant cell or a plant which expresses a polypeptide above.
  • the above polypeptide can be administered as such or in combination with a signal peptide to animals, humans or cells thereof.
  • a signal peptide can e.g. a mouse signal peptide, a combination of a mouse signal peptide and the KDEL-ER retention signal or the targeting signal of a mammalian alpha-2,6
  • the polypeptide can be administered in the form of a nucleic acid encoding it, for example DNA or RNA, to animals, humans or cells thereof.
  • a nucleic acid For administration in the form a nucleic acid must be present in an expression vector or be ligated to sequences of such. Reference is made to the general statements above regarding expression vectors and their preparation. We also refer to vectors suitable for gene therapy in 'animals.
  • the nucleic acid can be under the control of an inducible or tissue-specific promoter, such as metal detailothionein I or polyhedrin promoter.
  • Preferred vectors are, for example, viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses or vaccinia viruses.
  • retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MUMTV, RSV or GaLV.
  • nucleic acid coding for the polypeptide can be in the form of colloidal dispersions
  • Target cells are transported. These include e.g. Liposomes and lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
  • the above polypeptide is administered to animals, humans and cells thereof.
  • animals humans and cells thereof.
  • it can be any animal
  • Trade animal species It is preferably useful and domestic animals, e.g. Cattle, horses, sheep, pigs, goats, dogs, cats, etc.
  • the present invention also relates to animals and cells thereof which express the above polypeptide.
  • the present invention is characterized in that a resistance to pathogens can be generated in plants and animals or in humans.
  • pathogens includes any pathogens which can cause diseases in the organisms mentioned. Examples of such pathogens are
  • Bacteria Bacteria, "fungi and viruses.
  • plants are in particular phytopathogenic fungi such as Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, Alternaria alternate, Fusarium oxysporum, Ustilago maydis, and bacterial pathogens such as Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Clavi- bacter
  • the diseases such as candidamycoses, cryptococcoses, aspergilloses, dermatomycoses, hystopolasmoses, coccidiomycoses and blastomycoses, and bacterial pathogens such as Micrococcaceae (for example Staphy- lococci), Lactobacteriaceae (e.g.
  • Neisseriaceae e.g. Neisseriae
  • Corynebacteriaceae Spirillaceae
  • Listeria bacteriae Mycobacteriaceae
  • Enterobacteriaceae e.g. Escherichia bacteriae
  • Salmonellae Brucellacoreneae (e.g. Pasteobe anaerobacteria) Bacillaceae, Clostridia) and Rickettsiales.
  • Invention best to be used in plant and animal breeding as well as in human medicine.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition which contains a polypeptide as above, in combination with a signal peptide or in the form of a nucleic acid encoding it, and customary auxiliaries, such as diluents, solvents, preservatives, extenders, etc.
  • the composition can also be in various forms, e.g. as an ointment, paste, cream, gel or aqueous solution. Depending on its shape, the composition can be injected or applied externally.
  • FIG. 1 shows the DNA and amino acid sequence of an scFv antibody used according to the invention, which binds 2-phenyloxazol-5-one.
  • FIG. 2 shows the proportion of the leaf surface with disease symptoms after infection of potato leaves with Phytophthora infestans (mixture of
  • Fig. 3 shows remaining intact potato tuber tissue after inoculation of tuber slices with 2000 Erwinia carotovora ssp. atroseptica
  • Lines 9/7, 9/49, 9/51, 9/52 contain the gene coding for the antibody that binds 2-phenyloxazol-5-one (fused to the
  • Line DK1 contains only the nptll marker gene; Desiree: non-transgenic parent variety as a control.
  • Example 1 Generation of resistance in transgenic potato plants against Phytophthora infestans
  • round leaf disks with a diameter of 20 mm were produced from potato leaves. These leaf disks were laid out on a moist filter paper which was spread out in a translucent plastic can on a stainless steel grid and inoculated with a 20 l drop of spore suspension (approx. 200 sporangia) from Phytophthora infestans race 1-11.
  • the sporangia suspension was prepared from leaf disks that had already been infected and, prior to the " inoculation to stimulate the zoospores hatching, cooled for about 15 minutes to 4 ° C. The incubation takes place in illuminated incubators with a day period of 14 hours and a day / night temperature of 17 10 ° C After five and six days, evaluations were carried out, the percentage of the infested area of the total leaf disk area being determined
  • Example 2 Generation of resistance in transgenic potato tubers to Erwinia carotovora
  • Example 1 The potato plants described in Example 1 were grown in greenhouses. After the potato plants had ripened, the tubers were harvested and stored for phytopathological testing.
  • mice About 20 female CB6F1 mice aged 4-5 weeks were superovulated by intra peritoneal injection of 5 U PMS (pregnant mare's serum) on day 1 and another intra peritoneal injection of 5 U hCG (human chorionic gonadotropin) on day 3 and in the evening same day with male CB6F1 animals mated. On the morning of the 4th day, the animals were examined for the presence of a vaginal plug, positive animals were killed by cervical dislocation and the oviducts were removed.
  • PMS pregnant mare's serum
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the egg cells were emptied from the oviduct in M2 medium, the cumulus cells detached by brief incubation with hyaluronidase, the egg cells washed thoroughly and in the incubator (5% C0 2 , 85% humidity, 37 °) in M16 medium coated with paraffin oil until microinjection C) kept.
  • Fig. 1 a DNA of Fig. 1 was injected into the male pre-nucleus of fertilized egg cells, which is under the control of the WAP promoter (whey acidic protein), i.e. this promoter is induced by lactotropic hormones released by mammals during pregnancy or the lactation period. Injected eggs were then incubated in the incubator until retransfer the following day. About 25 female B6CBAF1 were used the evening before the microinjection to provide pseudopregnant Foster mice
  • mice aged 8 to 12 weeks mated with vasectomized male mice. On the morning of the 5th day, the animals with vaginal plugs were selected for retransfer of the injected eggs. The cells, which were cultured overnight and proliferated and microinjected to the two-cell stage, were re-implanted on the 5th day. 10-15 embryos were washed into the infundibulum of an oviduct of an anesthetized Foster mouse. The implanted embryos were born 19-20 days after retransfer. 9 transgenic mice were obtained which express the scFv antibody shown in FIG. 1. A cut of approx. 1 cm in length was added to the back of these mice. A suspension of Staphylococcus aureus was placed in the wound and the mice were examined for the development of disease symptoms, i.e. Pus formation, observed.
  • Pus formation i.e. Pus formation
  • Polypeptide the disease symptoms could be significantly reduced compared to controls, which underlines the generation of pathogen resistance in animals.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids, das ein cyclisches sich von Oxazol ableitendes Keton bindet, zur Erzeugung von Pathogenresistenz in Organismen, insbesondere Pflanzen und Tieren.

Description

Pathogenresistenz in Organismen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids, das ein cyclisches sich von Oxazol ableitendes Keton bindet, zur Erzeugung von Pathogenresistenz in Organismen, insbesondere Pflanzen und Tieren.
Pflanzen und Tiere sind einer Vielzahl von Erregern, d.h. Pathogenen, ausgesetzt, die Krankheiten auslösen können. Solche Pathogene sind z.B. Pilze, Bakterien und Viren. Bei Pflanzen werden die Pathogene häufig über die Blätter, Knollen und Wurzeln aufgenommen, während dies bei Tieren oft über die Haut, Atmung und Nahrung erfolgt. Viele Strategien werden verfolgt, um bei diesen Organismen
Resistenzen gegen die Pathogene zu erzeugen. Beispielsweise wird bei Pflanzen versucht, Resistenzgene über klassische Züchtungs- bzw. gentechnologische Verfahren in aktuellen Pflanzensorten zu integrieren. Bei Tieren sind hierfür insbesondere aktive und passive Immunisierungs-Verfahren zu nennen, mittels derer aktivierte Pathogene bzw. dagegen gerichtete Antikörper an die Tiere verabreicht werden können. Diese Verfahren erfordern jedoch vielfach große finanzielle und zeitliche Aufwendungen. Des weiteren führen sie oft auch nicht zum erhofften Erfolg.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit das technische Problem zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem in Organismen, insbesondere Pflanzen und Tieren eine Resistenz gegen Pathogene erzeugt werden kann.
Dieses technische Problem wird durch die Gegenstände in den Patentansprüchen gelöst.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß Pflanzen und Tiere, die ein Polypeptid enthalten, das ein cyclisches sich von Oxazol ableitendes Keton bindet, eine Resistenz gegen Pathogene aufweisen. Insbesondere hat er gefunden, daß transgene Kartoffelpflanzen, die einen 2-Phenyloxazol-5-on bindenden Antikörper exprimieren, eine Resistenz gegen Pathogene, z.B. den phytopathogenen Pilz Phytophthora infestans oder das bakterielle Pathogen Erwi- nia carotovora, aufweisen. Ferner hat er gefunden, daß auch transgene Mäuse, die einen solchen Antikörper exprimieren, eine Resistenz gegen Pathogene z.B. das Bakterium Staphylococcus aureus, aufweisen. Es wird auf die nachstehenden
Beispiele verwiesen.
Erfindungsgemäß werden diese Erkenntnisse des Anmelders zur Verwendung eines Polypeptids zur Erzeugung von Pathogenresistenz in Organismen, insbeson- dere Pflanzen, Tieren und dem Menschen genutzt, wobei das Polypeptid ein cyclisches sich von Oxazol ableitendes Keton bindet.
Der verwendete Ausdruck "Polypeptid" umfaßt ein (Poly)peptid jeglicher Art und Abstammung, das ein cyclisches sich von Oxazol ableitendes Keton, insbesondere 3-Phenyloxazol-5-on, binden kann, wobei das Keton als solches oder innerhalb einer Verbindung vorliegt. Insbesondere kann das Polypeptid ein Antikörper oder ein Fragment davon, z.B. ein Fab-, ein Fv- oder ein Single chain (sc)-Antikörper, insbesondere ein scFv-Antikörper und ganz besonders jener mit der Aminosäuresequenz von Fig. 1 sein. Das Polypeptid kann durch verschiedene Verfahren bereit- gestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, bei dem mit dem vorstehenden Keton oder einer es enthaltenden Verbindung eine Polypeptid- bzw. Antikörper-Expressions-Bibliothek gescreent wird (z.B. HuCAL, Morphosys, Deutschland).
Erfindungsgemäß kann das Polypeptid zur Erzeugung von Pathogenresistenz in Organismen, insbesondere Pflanzen, Tieren und dem Menschen, verwendet werden. Nachstehend wird zunächst die Verwendung des Polypeptids bei Pflanzen beschrieben. Hierzu kann es günstig sein, wenn das Polypeptid ein Signalpeptid aufweist, wodurch es in bestimmte Zellkompartimente einer Pflanzenzelle transportiert werden kann. Geeignete Signalpeptide und Verfahren zur Verknüpfung der Signalpeptide mit einem gewünschten Protein, z.B. dem vorliegenden Polypeptid sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird auf das Signalpeptid der α- Amylase aus Gerste hinsichtlich des Apoplasten (Düring et al., Plant Journal 3 (1993), 587 - 598), auf ein Maus-Signalpeptid, auf die Kombination aus einem Maus-Signalpeptid und dem KDEL-ER-Retentionssignal hinsichtlich des ER (Artsa- enko et al., Molecular Breeding 4 (1998), 313-319), auf das Targeting-Signal einer Säuger-α-2,6-Sialyltransferase hinsichtlich des Golgi-Apparats (Wee et al., Plant Cell IV (1998), 1759 - 1768, auf das Vakuolen-Lokalisierungssignal einer vakuolä- ren Chitinase aus Gurke hinsichtlich der Vakuolen (Neuhaus et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 88 (1991), 10362 - 10366), auf das Ferredoxin-Transitpeptid hinsichtlich der Chloroplasten und Piastiden, und auf das Transitpeptid von Trypto- phanyl-t RNA-Snthetase aus Hefe hinsichtlich der Mitochondrien (Schmitz and Lonsdale, Plant Cell 1 (1989), 783-791) verwiesen. Das Polypeptid kann mittels verschiedener Verfahren z.B. über Medien, wie Kulturmedien, einer Pflanze bzw.
Teilen dieser, insbesondere Pflanzenzellen, verabreicht werden.
Des weiteren kann das Polypeptid in Form einer es kodierenden Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA, an Pflanzen oder Teile dieser verabreicht werden. Hierzu ist es notwendig, daß die Nukleinsäure in einem Expressionsvektor vorliegt bzw. mit
Sequenzen eines solchen ligiert ist, wobei es günstig sein kann, wenn dieser bzw. diese eine Expression der Nukleinsäure in Zellkompartimenten ermöglichen. Solche Expressionsvektoren bzw. Sequenzen dieser sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird auf Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 8526 - 8530; Khan and Maliga, Nature Biotechnology 17 (1999), 910 - 915; Sidorov et al.,
Plant Journal 19 ( 1999), 209 - 216 verwiesen.
Verfahren zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die das gewünschte Gen, z.B. für das vorliegende Polypeptid, in exprimierbarer Form enthalten, sind dem Fach- mann bekannt und beispielsweise auch in gängigen Standardwerken beschrieben
(vgl. z.B. Sämbrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die Expressionsvektoren können auf einem Plasmid, Cosmid, Virus, Bacteriophagen oder einem anderen in der Gentechnik üblichen Vektor basieren. Diese Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des Vektors in der
Pflanze bewirken. Ferner können sie "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten, wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird. Des weiteren kann eine Terminationssequenz vor- handen sein, die der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition einer Poly-A-Sequenz an das Transkript dient. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und beliebig austauschbar.
Für die Expression des für das gewünschte Protein, z.B. des vorliegenden Polypeptids kodierenden Gens, geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise der Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor (Odell et al., Nature 313 (1995), 810 - 812), der Agrobacterium tumefaciens Nopalin Syn- thase Promotor und der Mannopin Synthase Promotor (Harpster et al., Molecular and General Genetics 212 (1988), 182 - 190). Das für das gewünschte Protein, z.B. das vorliegende Polypeptid kodierende Gen kann auch mit einem induzierbaren Promotor verknüpft sein, was z.B. die Steuerung der Synthese des gewünschten Proteins z.B. in einer transgenen Pflanze, zu einem gewünschten Zeitpunkt erlaubt. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise der anaerob induzierbare Gap C4 Promotor aus Mais (Bülow et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (1999), 182 - 188), PR-Promotoren, wie L-Phenylalanin Ammonium Lyase-, Chalcon Synthase- und "Hydroxyproline rieh glycoprotein"-Promotoren induzierbar durch Ethylen (Ecker and Davies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 5202 - 5210) und durch Dexamethason induzierbares chimäres Transkriptions-Induktionssystem (Kunkel et al., Nature Biotechnology 17 (1990), 916 - 918), IncW-Promotor aus Mais, induzierbar durch Sucrose oder D- Glucose (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (1999), 10512 - 10517. Ergänzend wird auf Datla et al., Biotechnology Annual Review 3 (1997), 269 - 290 und Gatz and Denk, Trends in Plant Science 3 (1998), 352 - 358 verwiesen.
Zur Herstellung der Expressionsvektoren zur Einführung in Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pA-
CYC184, etc.. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Der erhaltene Vektor wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Der Vektor wird dann wiedergewonnen. Als Analysemethoden zur Charakterisierung der gewonnenen Vektor-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Vektor-DNA gespalten und gewonnene DNA-
Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Vektor- DNA-Sequenz kann in den gleichen oder in anderen Vektoren Moniert werden.
Für die Einführung der vorstehenden Expressionsvektoren in eine Pflanzenzelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die
Transformation von Pflanzenzellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacteri- um tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Vektoren gestellt. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein. Geeignete selektierbare Marker sind dem
Fachmann bekannt und dazu zählen beispielsweise das Neomycinphosphotrans- ferase Il-Gen aus E. coli (Beck et al., Gene 19 (1982), 327 - 336), das Sulfonamid- Resistenzgen (EP-369637) und das Hygromycin-Resistenzgen (EP-186425). Je nach Einführungsmethode für die gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird z.B. für die Transformation der
Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch müssen die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Vektoren kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor (vgl. dazu auch die nachstehenden Bei- spiele 1 bis 3). Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sje enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium sollte ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen- zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269 - 273). Wäh- rend die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels auf Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäß verwendeten Expressionsvektoren Lokalisierungssignale für die Lokalisierung in Zellkomparti- menten, insbesondere endoplasmatischem Retikulum (ER), Apoplasten, Golgi- Apparat, Plastiden, Peroxisomen, Mitochondrien und/oder Vakuolen. Es wird auf vorstehende Ausführungen hinsichtlich Signalpeptide verwiesen. Besonders bevorzugt sind als Lokalisierungssignale das KDEL-ER-Targeting-Peptid, das Golgi- Lokalisierungssignal der ß-1 ,2-N-Acetylglucosamintransferase (GnTI), das Transit- peptid aus der kleinen Untereinheit der Ribulose-Biphosphat-Carboxylase und/oder das vakuoläre Targeting-Signal SKNPIN.
Erfindungsgemäß wird das vorstehende Polypeptid an Pflanzen verabreicht. Dabei kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Der hier verwendete Begriff "Pflanze" umfaßt auch Gramineen, Chenopodien, Leguminosen, Brasicaceen, Solana- ceen, Pilze, Moose und Algen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, z.B. um Pflanzen wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rübsen, Flachs, Erbse, Bohne Lupine, Tabak und Kartoffel. Die für die Expression des Polypeptids gewünschten Pflanzenteile betreffen im Prinzip jedes beliebige Pflanzenteil, jedenfalls Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, beispielsweise Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Pflanzensamen, eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze, die ein vorstehendes Polypeptid exprimiert.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, eine Pathogenresistenz in
Tieren und dem Menschen zu erzeugen. Hierfür kann das vorstehende Polypeptid als solches oder in Kombination mit einem Signalpeptid an Tiere, dem Menschen oder Zellen dieser verabreicht werden. Ein solches Signalpeptid kann z.B. ein Maus-Signalpeptid, eine Kombination aus einem Maus-Signalpeptid und dem KDEL-ER-Retentionssignal oder das Targeting-Signal einer Säuger-alpha-2,6
Sialyltransferase hinsichtlich des Golgi-Apparats sein. Ferner kann das Polypeptid in Form einer es kodierenden Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA, an Tiere, dem Menschen oder Zellen dieser verabreicht werden. Für die Verabreichung in Form einer Nukleinsäure ist es notwendig, daß diese in einem Expressionsvektor vorliegt, bzw. mit Sequenzen eines solchen ligiert ist. Es wird auf die vorstehenden allgemeinen Ausführungen hinsichtlich Expressionsvektoren und ihre Herstellung verwiesen. Ergänzend wird auf Vektoren verwiesen, die sich für die Gentherapie bei' Tieren eignen. In diesen kann die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines induzierbaren oder gewebespezifischen Promotors, wie Metailothionein I- oder Polyhedrin-Promotors, stehen. Bevorzugte Vektoren sind z.B. Viren, wie Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren oder Vaccinia-Viren. Beispiele von Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MUMTV, RSV oder GaLV. Des weiteren kann die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure in Form von kolloidalen Dispersionen zu den
Zielzellen transportiert werden. Hierzu zählen z.B. Liposomen und Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Erfindungsgemäß wird das vorstehende Polypeptid an Tiere, dem Menschen und Zellen dieser verabreicht. Dabei kann es sich prinzipiell um Tiere jeder beliebigen
Tierspezies handeln. Vorzugsweise handelt es sich um Nutz- und Haustiere, z.B. Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, etc.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Tiere und Zellen dieser, die das vorstehende Polypeptid exprimieren.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß in Pflanzen und Tieren bzw. dem Menschen eine Resistenz gegen Pathogene erzeugt werden kann. Der verwendete Ausdruck "Pathogene" umfaßt jegliche Pathogene, die bei den genann- ten Organismen Krankheiten auslösen können. Beispiele solcher Pathogene sind
Bakterien," Pilze und Viren. Bezüglich Pflanzen sind insbesondere phytopathogene Pilze, wie Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum, Ustilago maydis, und bakterielle Pathogene, wie Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Clavi- bacter michiganense, zu nennen. Hinsichtlich Tiere und des Menschen sind insbesondere tierpathogene Pilze, die Erkrankungen, wie Candidamycosen, Crypto- coccosen, Aspergillosen, Dermatomycosen, Hystopolasmosen, Coccidiomycosen und Blastomycosen, und bakterielle Pathogene, wie Micrococcaceae (z.B. Staphy- lococci), Lactobacteriaceae (z.B. Streptococci), Neisseriaceae (z.B. Neisseriae), Corynebacteriaceae, Spirillaceae, Listeria bacteriae, Mycobacteriaceae, Enter- obacteriaceae (z.B. Escherichia bacteriae), Salmonellae, Brucellaceae (z.B. Pasteu- rella bacteriae), anaerobe and aerobe Sporenbildner (e.g. Bacillaceae, Clostridia) und Rickettsiales, zu nennen. Insgesamt gesehen eignet sich die voriiegende
Erfindung bestens, in der Pflanzen- und Tierzüchtung sowie in der Humanmedizin eingesetzt zu werden.
Für diesen Einsatz stellt die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein vorstehendes Polypeptid als solches, in Kombination mit einem Signalpeptid oder in Form einer es kodierenden Nukleinsäure und übliche Hilfsstoffe, wie Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Konservierungsmittel, Streckungsmittel, etc. enthält. Auch kann die Zusammensetzung in verschiedenen Formen, z.B. als Salbe, Paste, Creme, Gel oder wässriger Lösung, vorliegen. Entsprechend ihrer Form kann die Zusammensetzung injiziert oder äußerlich aufgetragen werden.
Kurze Beschreibung der Figuren:
Fig. 1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäß verwendeten scFv-Antikörpers, der 2-Phenyloxazol-5-on bindet.
Fig. 2 zeigt den Anteil der Blattfläche mit Krankheitssymptomen nach Infek- tion von Kartoffelblättern mit Phytophthora infestans (Gemisch aus
~ Rassen 1-11 , ca 200 Sporen pro 20 μl) und Inkubation für 3 Tage. Die transgenen Linien enthalten das Gen, kodierend für den Antikörper, der 2-Phenyloxazol-5-on bindet (fusioniert mit dem KDEL-Lokali- sierungspeptid für das endoplasmatische Retikulum); Linie Dk1 ent- hält nur das nptll-Markergen; Desiree: nicht-transgene Ausgangssorte als Kontrolle. Säulen mit * unterscheiden sich signifikant zu Desiree (Wilcoxon-Test, p = 0,05). Fig. 3 zeigt verbleibendes intaktes Kartoffelknollengewebe nach Inokulation von Knollenscheiben mit 2000 Erwinia carotovora ssp. atroseptica
Bakterien in 2 μ\ und Inkubation für 3 Tage nach Düring et al. (1993), supra. Linien 9/7, 9/49, 9/51 , 9/52 enthalten das Gen, kodierend für den Antikörper, der 2-Phenyloxazol-5-on bindet (fusioniert mit dem
KDEL-Lokalisierungspeptid für das endoplasmatische Retikulum); Linie DK1 enthält nur das nptll-Markergen; Desiree: nicht-transgene Ausgangssorte als Kontrolle.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Erzeugung von Resistenz bei transgenen Kartoffelpflanzen gegen Phytophthora infestans
Transgene Kartoffelpflanzen, die einen scFv-Antikörper mit einem KDEL-Signalpep- tid exprimieren, wobei der Antiköper 2-Phenyloxazolon-5-on bindet (Artsaenko et al., supra, wurden im Gewächshaus angebaut und einer phytopathologischen
Prüfung unterzogen.
Dazu wurden mit Hilfe einer Stanze aus Kartoffelblättern runde Blattscheiben mit einem Durchmesser von 20 mm hergestellt. Diese Blattscheiben wurde auf einem feuchten Filterpapier, das in einer lichtdurchlässigen Kunststoffdose auf einem Edelstahlgitter ausgebreitet war, ausgelegt und mit einem 20 l-Tropfen Sporensuspension (ca. 200 Sporangien) von Phytophthora infestans Rasse 1-11 inokuliert. Die Sporangiensuspension wurde von bereits infizierten Blattscheiben hergestellt und vor der" Inokulation zur Anregung des Zoosporenschlupfs für ca. 15 Minuten auf 4°C abgekühlt. Die Inkubation erfolgt in beleuchteten Kühlbrutschränken bei einer Tagperiode von 14 Stunden und einer Tag/Nachttemperatur von 17 10°C. Nach fünf und sechs Tagen wurden Bonituren durchgeführt, wobei der prozentuale Anteil der Befallsfläche an der gesamten Blattscheibenfläche bestimmt wurde. Die
Ergebnisse von 8 transgenen Linien sind in Fig. 2 dargestellt.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäße Verwendung des vorstehenden Polypeptids die Krankheitssymptome entscheidend vermindert werden konnten, was eine Erzeugung von Pathogenresistenz in Pflanzen unterstreicht.
Beispiel 2: Erzeugung von Resistenz bei transgenen Kartoffelknollen gegen Erwinia carotovora
Die in_ Beispiel 1 beschriebenen Kartoffelpflanzen wurden in Gewächshäusern angebaut. Nach Abreifen der Kartoffelpflanzen wurden die Knollen geerntet und für die phytopathologische Prüfung gelagert.
Die Resistenzeigenschaften der transgenen Kartoffel knollen gegenüber dem bakteriellen Pathogen Erwinia carotovora wurden in einem Knollenscheibentest geprüft. Dazu wurden Knollen geschält und 1 cm dicke Zylinder ausgestochen. Diese wurden wiederum in 3 mm dicke Scheiben geschnitten. Die grundsätzliche experimentielle Verfahrensweise ist bei Düring et al. (Plant Journal (1993) 3, 587-
598) beschrieben. Die auf einem nassen Filterpapier ausgelegten Knollenscheiben wurden in der Mitte frisch angestochen und eine Suspension von 2000 Erwinia carotovora ssp. atroseptica Bakterien wurde in 2 μ\ Volumen aufgetragen. Nach drei Tagen wurde das mazerierte Gewebe abgespült und das verbleibende feste Kartoffelgewebe nach Abtrocknen gewogen. Die Ergebnisse von 4 transgenen
Linien sind in Fig. 3 dargestellt.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäße Verwendung des vorstehenden Polypeptids die Krankheitssymptome entscheidend vermindert werden konnten, was eine Erzeugung von Pathogenresistenz in Pflanzen unterstreicht.
Beispiel 3: Erzeugung von Resistenz bei transgenen Mäusen gegen Staphy- lococcus aureus
Etwa 20 weibliche CB6F1 Mäuse im Alter von 4-5 Wochen wurden durch intra peritoneale Injektion von 5 U PMS (pregnant mare's serum) am Tag 1 und eine weitere intra peritoneale Injektion von 5 U hCG (humanes Choriongonadotropin) am Tag 3 superovuliert und am Abend desselben Tages mit männlichen CB6F1 Tieren verpaart. Am Morgen des 4. Tages wurden die Tiere auf das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens untersucht, positive Tiere durch zervikale Dislokation getötet und die Ovidukte entnommen. Die Eizellen wurden aus den Ovidukten in M2 Medium entleert, die Cumuluszellen durch kurze Inkubation mit Hyaluronidase abgelöst, die Eizellen gründlich gewaschen und bis zur Mikroinjektion in mit Paraffinöl über- schichtetem M16 Medium im Brutschrank (5 % C02, 85 % Luftfeuchtigkeit, 37°C) aufbewahrt.
Am 4. Tag wurde in den männlichen Vorkern befruchteter Eizellen eine DNA von Fig. 1 injiziert, die unter der Kontrolle des WAP-Promotors (whey acidic protein) steht, d.h. dieser Promotor wird durch laktotrope Hormone, die von Säugetieren in der Schwangerschaft bzw. Laktationsperiode ausgeschüttet werden, induziert. Injizierte Eizellen wurden anschließend im Brutschrank bis zum Retransfer am darauffolgenden Tag inkubiert. Zur Bereitstellung von pseudoschwangeren Foster- mausen wurden am Abend vor der Mikroinjektion etwa 25 weibliche B6CBAF1
Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen mit vasektomierten männlichen Mäusen verpaart. Am Morgen des 5. Tages wurden die Tiere mit Vaginalpfropfen für den Retransfer der injizierten Eizellen ausgewählt. Die über Nacht kultivierten und zum Zweizellstadium proliferierten und mikroinjizierten Eizellen wurden am 5. Tag reimplantiert. Dabei wurden 10-15 Embryonen in das Infundibulum eines Oviduktes einer narkotisierten Fostermaus eingespült. 19-20 Tage nach Retransfer wurden die implantierten Embryonen geboren. Es wurden 9 transgene Mäuse erhalten, die den in Fig. 1 angegebenen scFv-Antikörper exprimieren. Diesen Mäusen wurde am Rücken ein Schnitt von ca. 1 cm Länge zugefügt. In die Wunde wurde eine Sus- pension von Staphylococcus aureus gegeben und die Mäuse wurden hinsichtlich der Entwicklung von Krankheitssymptomen, d.h. Eiterbildung, beobachtet.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäße Verwendung des vorstehenden
Polypeptids die Krankheitssymptome entscheidend gegenüber Kontrollen ver- mindert werden konnten, was eine Erzeugung von Pathogenresistenz in Tieren unterstreicht.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Polypeptids, das ein cyclisches sich von Oxazol ableitendes Keton bindet, zur Erzeugung von Pathogenresistenz in Organismen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Organismen Pflanzen sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Organismen Tiere und der Mensch sind.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Keton innerhalb einer Verbindung vorliegt.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid ein 2- Phenyloxazol-5-on bindet.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 - 5, wobei das Polypeptid ein für eine Lokalisierung in Zellkompartimenten geeignetes Lokalisierungssignal umfaßt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Zellkompartiment das endoplas- matische Retikulum ist.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Lokalisierungssignal KDEL ist.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polypeptid ein
Antikörper ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein scFv-Antikörper ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 - 10, wobei der Antikörper die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 - 11 , wobei das Polypeptid in Form einer es kodierenden Nukleinsäure vorliegt.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäure in einem Expressionsvektor vorliegt.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 13, wobei die Pflanzen
Gramineen, Chenopodien, Leguminosen, Brasicaceen, Solanaceen, Pilze, Moose und Algen umfassen.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 13, wobei die Pflanzen Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rübsen,
Flachs, Erbse, Bohne, Lupine, Tabak und Kartoffel umfassen.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 - 13, wobei die Tiere Haus- und Nutztiere sind.
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