DE60125170T2

DE60125170T2 - In pflanzen erzeugte rekombinante proteinuntereinheit eines parvovirus vom schwein

Info

Publication number: DE60125170T2
Application number: DE60125170T
Authority: DE
Inventors: Robert Rymerson; Jim Brandle; Lorne Babiuk
Original assignee: Vaccine & Infectious Disease O; Vaccine & Infectious Disease Organization Saskatoon; Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Current assignee: Vaccine & Infectious Disease O; Vaccine & Infectious Disease Organization Saskatoon; Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Priority date: 2000-06-05
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2021-06-06
Also published as: WO2001094392A2; US20040093644A1; CA2410938A1; EP1290201A2; EP1290201B1; ATE348180T1; DE60125170D1; AU2001267189A1; DK1290201T3; WO2001094392A3

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von rekombinanten viralen Proteinen in Pflanzen und speziell die Expression von Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Proteinen in Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Schweine-Parvovirus ist ein autonom replizierendes Virus, welches ein einzelsträngiges DNA-Molekül von ungefähr 5100 Nukleotiden enthält (Molitor et al., 1984). Nur der Negativstrang der DNA wird in Virionen verpackt. Das Genom des Virus kodiert drei Kapsid-Proteine (VP1, VP2, VP3) und ein Nicht-Strukturprotein (NS1). Das Kapsid des Parvovirus weist ungefähr 22-25 Nanometer Durchmesser auf und besteht aus VP1- und VP2-Untereinheiten. Diese Proteine leiten sich von alternativ gespleißten Versionen desselben RNA-Moleküls ab und überlappen folglich in der Sequenz. Ferner zeigt Schweine-Parvovirus ein hohes Ausmaß an Sequenzähnlichkeit zu dem Panleukopenie-Virus von Katzen, den Hunde-Parvoviren und dem Nager-Parvovirus (Ranz et al., 1989). Schweine-Parvovirus ist mit fötalem Tod und Mummifikation, fehlender Fortpflanzung bei Säuen, Diarrhöe bei jungen Ferkeln und einer verzögerten Rückkehr zum Östrus in Verbindung gebracht worden (Dunne et al., 1965; Joo und Johnson, 1976; Mengeling, 1978). Bestimmte Isolate oder Stämme des Virus können auch Hautläsionen bei Schweinen verursachen.
Serologische Untersuchungen zeigen, dass Schweine-Parvovirus in allen Schweine produzierenden Regionen der Welt weit verbreitet ist, wobei bis zu 80% der Tiere eine Serokonversion zeigen. Obwohl es Unterschiede bei den Schweine-Parvovirus-Stämmen gibt, wobei einige extrem pathogen sind und andere weniger pathogen oder vollständig nicht-pathogen sind, scheinen die pathogenen Stämme, wenn das Virus in einem Land sich etabliert oder endemisch wird, in der Population zu zirkulieren.
Es ist bekannt, dass VP2-Proteine sich selbst zu virusartigen Partikeln (VIPs) zusammenlagern, wenn sie in einem Baculovirus-Expressionssystem produziert werden (Martinez et al., 1992). Die VLPs weisen hohe immunogene Aktivität auf und sind in der Lage, eine schützende Immunität auszulösen, wenn sie Schweinen systemisch verabreicht werden (Martinez et al., 1992, und EP 0 551 449 ). Jedoch ist die Produktion von Protein in Baculovirus-Expressionssystemen komplex und muss in einem Labor oder einer ähnlichen Einrichtung ausgeführt werden. Ferner muss das Protein aus Baculoviren gereinigt werden. Die Reinigung von Protein aus Baculoviren erhöht die Kosten der Proteinherstellung.
Das „Molecular-Farming" bietet das Potential für eine unter geringen Kosten erfolgende Produktion von großen Mengen von Protein, das sowohl hinsichtlich Konformation als auch biologischer Aktivität stark jenem des ursprünglichen Wirtsorganismus ähnelt. In Pflanzen sind mehrere Proteine produziert worden, einschließlich γ-Interferon in Tabak ( U.S.-Pat. Nr.5,625,175 ), des Norwalk-Virus-Kapsidproteins in transgenen Tabak- und Kartoffelpflanzen (Mason et al., 1996), des B-Untereinheit-Toxins von Vibrio cholerae in Kartoffelpflanzen (Arakawa et al., 1998) und antigener Peptide von sowohl Tollwutvirus als auch Nerz-Enteritis-Virus in Alfalfa. WO 9420135 beschreibt die Herstellung von Pflanzen, welche Proteine von tierischen Pathogenen, die unter anderem als essbare Impfstoffe verwendet werden sollen, exprimieren.
Das Exprimieren von transgenen Proteinen in Pflanzen bietet viele Vorteile gegenüber einem Exprimieren von transgenen Proteinen in anderen Organismen, wie Bakterien. Erstens sind Pflanzen höhere eukaryotische Organismen und haben dementsprechend die gleiche(n) oder eine ähnliche intrazelluläre Maschinerie und Mechanismen, die Proteinfaltung, -zusammenlagerung und -glycosylierung steuern, wie dies Säugetier-Systeme aufweisen. Ferner wird, anders als bei auf Fermentation basierenden bakteriellen und Säugetierzell-Systemen, die Proteinproduktion in Pflanzen nicht durch reale Einrichtungen beschränkt. Es ist beispielsweise wahrscheinlich, dass die Produktion von rekombinanten Proteinen in landwirtschaftlichem Maßstab durch Pflanzen signifikant höher ist als von jenen, die durch auf Fermentation basierende bakterielle und Säugetierzell-Systeme produziert werden. Zusätzlich können die Kosten einer Produktion von rekombinanten Proteinen in Pflanzen 10- bis 50-fach geringer sein als bei herkömmlichen bakteriellen Bioreaktor-Systemen (Kusnadi et al., 1997). Auch produzieren Pflanzensysteme pathogenfreie rekombinante Proteine. Ferner ermöglicht die Fähigkeit, biologisch aktive rekombinante Proteine in essbaren Pflanzengeweben oder -extrakten zu produzieren, eine unter geringen Kosten erfolgende orale Abgabe von Proteinen, wie Antigenen, als Futterzusätze und beseitigt potentiell die Notwendigkeit für teure nachgeschaltete Reinigungsverfahren des Proteins.
Es gibt in diesem Fachgebiet einen Bedarf an Proteinen, die einen Schutz gegen das Schweine-Parvovirus und die durch Schweine-Parvovirus hervorgerufenen Krankheiten verleihen. Ferner gibt es in diesem Fachgebiet einen Bedarf an Proteinen, die einen Schutz gegen Schweine-Parvovirus und die durch Schweine-Parvovirus hervorgerufenen Krankheiten verleihen und die in großen Mengen in Pflanzen hergestellt werden können. Es gibt auch einen Bedarf an transgenen Pflanzen, die ein immunreaktives Antigen des Schweine-Parvovirus, das in relativ großen Mengen produziert und gereinigt werden kann, exprimieren.
Es ist ein Ziel der Erfindung, Nachteile im Stand der Technik zu überwinden.
Das obige Ziel wird erreicht durch eine Kombination der Merkmale der Hauptansprüche. Die Unteransprüche offenbaren weitere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Herstellung von rekombinanten viralen Proteinen in Pflanzen und speziell die Expression von Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Proteinen in Pflanzen.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins in einer Pflanze bereitgestellt, umfassend:

i) Transformieren der Pflanze mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein (SEQ ID NO: 1) oder ein Fragment oder ein Derivat davon exprimiert; und
ii) Kultivieren der transformierten Pflanze.

Die Erfindung betrifft auch ein chimäres Konstrukt, welches erforderlich ist, um das obige Verfahren auszuführen, und eine Pflanze, Pflanzensamen, Pflanzenzelle oder daraus hergestellte Nachkommenschaft, welche eine Nukleotidsequenz umfassen, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein (SEQ ID NO: 1) oder ein Fragment oder ein Derivat davon kodiert, hergestellt durch das obige Verfahren, und deren Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhütung einer Schweine-Parvovirus-Infektion in einem Schwein.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, wie oben beschrieben, welches ferner umfasst, die Pflanze zu ernten und das Protein zu reinigen, das zu einer Dosierungsform formuliert und einem Tier verabreicht werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Merkmale der Erfindung werden besser ersichtlich aus der folgenden Beschreibung, in der Bezug genommen wird auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
1 die allgemeine Struktur eines binären Transformationsvektors (pCAVP), welcher für die Einführung eines AMV-VP2-Gens in Pflanzen nützlich ist, zeigt.
2 die kodierende DNA-Sequenz des AMV-VP2-Gens zeigt (SEQ ID NO: 1).
3 den Nachweis der VP2 kodierenden Region in Pflanzen durch PCR unter Verwendung von untransformierter Kontroll-DNA (81V9), pCAVP-Plasmid-DNA (C) und DNA aus mutmaßlichen transgenen Pflanzen (1-13) veranschaulicht.
4 eine reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)-Analyse von transgenen Pflanzen, welche ein AMV-VP2-Transgen enthalten, zeigt. Produkte von RT-PCR-Reaktionen wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und das VP2-spezifische Produkt war ungefähr 1 kb groß. Die Zahlen geben die VP2 enthaltende Pflanze an, wobei „+" und „–" die Zugabe oder das Weglassen von reverser Transkriptase in der erster Strang-Reaktion angibt. „C" enthielt RNA, die aus einer untransformierten Pflanze isoliert worden ist. „P" steht für die positive Plasmid-Kontrolle für die PCR. „W" enthielt Wasser anstelle von Matrize.
5 eine Transmissions-Elektronenmikrographie einer VP2 exprimierenden Tabakpflanze zeigt. Virusartige Partikel von ungefähr 25 nm Durchmesser, die sich im Zytoplasma anhäufen, sind mit einem Pfeil angegeben. Der Balken repräsentiert 50 nm.
6 eine Western-Analyse von transgenen Pflanzen, die ein AMV-VP2-Gen tragen (Bahnen 1, 2, 5, 7, 9, 11, 13 und 14), und von einer untransformierten Kontrollpflanze (81V9) zeigt.
7 die Ergebnisse eines Serumneutralisationsassays unter Verwendung von fötalen Schweinehodenzellen, Schweine-Parvovirus und Serum aus immunisierten Mäusen zeigt. Die Mäuse in den Gruppen VP2-9-1 und VP-9-2 wurden mit Pflanzenextrakt von einer VP2 exprimierenden Pflanze immunisiert, während die Gruppen 81V9-1, 81V9-2 und 81V9-3 Pflanzenextrakt aus untransformierten Kontrollpflanzen erhielten.
BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die Erfindung betrifft die Herstellung von rekombinanten viralen Proteinen in Pflanzen und speziell die Expression von Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Proteinen in Pflanzen.
Gemäß einem Aspekt einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins in einer Pflanze bereitgestellt, umfassend i) Transformieren der Pflanze mit einer Nukleotidsequenz, die ein Schweine-Parvovirus-VP-2-Untereinheit-Protein (SEQ ID NO: 1), ein Fragment oder Derivat davon exprimiert, und ii) Kultivieren der transformierten Pflanze. Unter einem anderen Aspekt einer Ausführungsform kann die transformierte Pflanze geerntet und das Protein teilweise oder vollständig gereinigt und dann gegebenenfalls zu einer Dosierungsform formuliert und an ein Tier verabreicht werden. Es ist denkbar, die Pflanze zu ernten und diese an ein Tier zu verfüttern, aber in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Pflanze geerntet und es wird ein Extrakt erhalten, der an ein Tier verabreicht werden kann, um Resistenz gegen Schweine-Parvovirus zu verleihen. In einer weiteren Ausführungsform wird das Schweine-Parvovirus-VP-2-Protein, Fragment oder Derivat davon teilweise oder vollständig gereinigt, zu einer Dosierungsform umformuliert, um als Impfstoff in einem Tier verwendet zu werden, um spezifisch eine mukosale Immunantwort zu induzieren, die ein Tier immun gegenüber einer Parvovirus-Penetration an einer Schleimhautstelle macht.
Das Schweine-Parvovirus-VP-2-Protein, Fragment oder Derivat davon kann durch das Immunsystem eines Tiers als fremd erkannt werden und kann in der Lage sein, eine Immunantwort in dem Tier auszulösen, so dass das Tier Immunität gegenüber nachfolgenden Expositionen oder Provokationen durch ein Virus oder durch ein Bakterien oder andersartiges Agens, welches das Schweine-Parvovirus-VP2-Protein oder Fragment oder Derivat davon umfasst, erwirbt.
Ein „Derivat" umfasst eine jegliche Substitution, Deletion oder Hinzufügung zu der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz des Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Proteins (im Folgenden VP2), beispielsweise, aber nicht beschränkt auf das chimäre AMV-VP2-Konstrukt, vorausgesetzt, dass das Derivat davon die Eigenschaft, Resistenz gegen eine Schweine-Parvovirus-Infektion zu verleihen, beibehält. Ein „Fragment" umfasst ein jegliches Derivat des Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Proteins, in welchem ein oder mehrere Aminosäurereste von dem Aminoterminus, dem Carboxyterminus oder sowohl von dem Aminoterminus als auch dem Carboxyterminus des Volllängen-Proteins deletiert worden sind, vorausgesetzt, dass das Fragment die Fähigkeit, Resistenz gegen eine Schweine-Parvovirus-Infektion zu verleihen, beibehält.
Mit dem Begriff „Resistenz zu verleihen" ist eine Stimulation des Immunsystems eines Tiers in Reaktion auf fremdes Material, wie beispielsweise ein Protein, jedoch nicht darauf beschränkt, so dass das fremde Material neutralisiert und durch das Immunsystem eines Tiers während einer nachfolgenden Provokation oder Exposition abgebaut wird, gemeint. Die Stimulation des Immunsystems kann eine Erhöhung der Produktion eines spezifischen Antikörpers gegen ein Antigen oder eine allgemeine Erhöhung der Produktion von vielen Antikörpern, eine erhöhte Produktion von Immunzellen, wie beispielsweise Makrophagen und Lymphozyten, jedoch nicht darauf beschränkt, oder eine erhöhte Produktion von Immunmodulatoren, wie beispielsweise von Interferonen und Interleukinen, aber nicht darauf beschränkt, oder eine Kombination davon umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich kann die Immunantwort an einer speziellen Stelle auftreten, beispielsweise, aber ohne die Absicht einer Einschränkung, an einer Schleimhautmembran, die ein Eintrittsort für fremdes Material sein kann.
Die Erfindung stellt ein wirksames Verfahren für die verlässliche Produktion von VP2 (oder eines Fragments oder Derivats davon) bereit. Um die Expression des fremden Gens innerhalb von Pflanzen zu optimieren, kann das native oder ein synthetisches Gen verwendet oder verändert werden, wie erforderlich, so dass das entsprechende Protein in einem größeren Ausmaß als das native Gen produziert wird. Beispielsweise, was nicht als Einschränkung angesehen werden soll, kann das Gen ein synthetisches Gen sein, welches hinsichtlich der Codon-Verwendung innerhalb einer Pflanze optimiert worden ist, umfassend wenigstens ungefähr 80% Homologie zu dem nativen VP2, wie bestimmt unter Verwendung von Sequenzvergleichstechniken, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf den BLAST-Algorithmus (GenBank: www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/) unter Verwendung von vorgegebenen Parametern (Programm: blastn; Datenbank: nr; Expect 10; Filter: geringe Komplexität; Alignment: paarweise; Wortgröße: 11).
Analoga oder Derivate davon umfassen auch jene Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisieren, vorausgesetzt, dass die Sequenzen die Eigenschaft, wie hier beschrieben, zeigen. Die stringenten Hybridisierungsbedingungen werden in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 387-389, beschrieben und sind: Inkubation für 12-16 h in einer Hybridisierungslösung aus 6 × SSC, 0,01 M EDTA, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 68°C, gefolgt von einem 5-minütigen Waschen in einer 2 × SSC und 0,5% SDS-Lösung bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 15-minütigen Inku bation bei Raumtemperatur in einer 2 × SSC und 0,1% SDS-Lösung, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation bei 68°C in einer 0,1 × SSC und 0,5% SDS-Lösung und gefolgt von einer weiteren 30-minütigen Inkubation bei 68°C in einer 0,1 × SSC und 0,5% SDS-Lösung.
Es wird auch daran gedacht, dass Fragmente oder Abschnitte von VP2 oder Derivate davon, die nützliche biologische Eigenschaften zeigen, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf antigene Eigenschaften, innerhalb von Pflanzengeweben exprimiert werden können. Vorzugweise zeigen Fragmente oder Abschnitte von VP2 oder Derivate davon Eigenschaften, die einen Beitrag zu der Gesundheit und Produktivität von Tieren leisten ähnlich zu jenen, die bei Verabreichung von nativem VP2 beobachtet werden.
Darüber hinaus können andere Modifizierungen des nativen VP2 oder eines synthetischen VP2 (sVP2)-Gens auftreten, so dass die Expression des Gens und die Stabilität oder Reinigung des Proteins optimiert werden können. Es kann beispielsweise eine Modifizierung der 5'- oder 3'-Region dieser Gene ausgeführt werden, um die Expression des Gens zu verstärken und das Produkt zu einem geeigneten interzellulären Kompartiment zu dirigieren, um Stabilität sicherzustellen. Ein Beispiel einer 5'-Modifizierung kann ein Signalpeptid (Signalsequenz) umfassen, um das Protein zu einem speziellen zellulären Kompartiment zu dirigieren, beispielsweise, was in keiner Weise als Einschränkung angesehen werden soll, die Signalsequenz aus einem mit Tabak-Pathogenese in Zusammenhang stehenden („pathogenesis related"; PR)-Protein (Cornelissen et al., 1986, Nature 321:531-532) oder die Alfalfa-Mosaikvirus (AMV)-Leadersequenz (Jobling und Gehrke, 1987, Nature 325:622-625). Ein Beispiel einer 3'-Modifizierung umfasst eine Histidin-Markierung (Histidin-Tag), welche verwendet werden kann, um die Reinigung des kodierten Proteins zu unterstützen. Es können jedoch andere Veränderungen an den 5'-, 3'-Regionen oder interne Modifizierungen eingesetzt werden, um die Expression, Stabilität und gegebenenfalls Reinigung des exprimierten Proteins zu optimieren. Es ist bevorzugt, dass das synthetische Gen, sVP2, welches das reife Protein kodiert, eine Codonpräferenz ähnlich jener, die stark exprimierte Gene, die in Pflanzen gefunden werden, aufweisen, umfasst und, sofern gewünscht, ein Motiv umfasst, das eine einfache Extraktion ermöglicht, beispielsweise eine Affinitätsmarkierung, wie, aber nicht beschränkt auf eine His-Markierung (His-Tag), wie sie im Stand der Technik bekannt ist. Die Affinitätsmarkierung des Proteins kann für die Reinigung des Proteins unter Verwendung von Chromatographie verwendet werden; beispielsweise kann eine Ni²⁺-Säule für die Reinigung von eine His-Markierung enthaltenden Proteinen verwendet werden. Es wird auch daran gedacht, dass das Protein modifiziert werden kann, so dass das unreife Protein zu einem Kompartiment der Zelle dirigiert wird, um die Stabilität des Produkts zu erhöhen, beispielsweise zu der Plastide oder dem Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER). Es können jedoch auch andere Stellen zielgerichtet angesteuert werden, beispielsweise eine extrazelluläre Sekretion, um Extraktionsprotokolle zu vereinfachen, oder das Mitochondrien-Kompartiment.
Mit dem Ausdruck „Expression" ist die Produktion einer funktionsfähigen RNA, eines funktionsfähigen Proteins oder von beidem ausgehend von einem Gen oder Transgen gemeint.
Mit „Gen" ist eine bestimmte Sequenz von Nukleotiden, welche die kodierende Region oder ein Fragment davon und gegebenenfalls die Promotor- und Terminatorregionen, die die Expression des Gens regulieren, wie auch andere Stellen, die für eine Genexpression erforderlich sind, beispielsweise ein Polyadenylierungssignal, welches die Termination der Transkription reguliert, umfasst, gemeint. Mit „kodierende Region" oder „Strukturgen" ist eine jegliche Region von DNA gemeint, die die Primärstruktur eines Polypeptids nach genetischer Transkription und Translation bestimmt. Darüber hinaus können auch Fragmente, welche Regionen von Interesse einer kodierenden Region oder eines Strukturgens umfassen, eingesetzt werden, wie benötigt. Mit „Transgen" sind Gene gemeint, die in eine Wirtszelle oder einen Wirtsorganismus eingeführt worden sind, die in der Wirtszelle oder dem Wirtsorganismus normalerweise nicht vorhanden sein würden, insbesondere Nukleinsäuren, die durch Techniken der in vitro-DNA-Rekombination modifiziert worden sind. Der Begriff „Transgen" umfasst auch Wirtszelle, die beispielsweise unter die Kontrolle einer neuen Promotor- oder Terminatorsequenz gestellt worden sind. Mit „synthetisches Gen" ist eine DNA-Sequenz eines Strukturgens gemeint, die unter Verwendung von Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf chemische Synthese, ortsgerichtete Mutagenese oder PCR und verwandte Techniken, synthetisiert wird. Ein synthetisches Gen kann ein Fragment oder die gesamte kodierende Region von VP2 umfassen. Darüber hinaus kann ein synthetisches Gen auch regulatorische Elemente umfassen, die die Expression des Gens verstärken, oder Motive, die zu der Stabilität oder dem zellulären Targeting des Proteinprodukts beitragen. Es wird auch daran gedacht, dass ein synthetisches Gen gegebenenfalls Regionen umfasst, die für die Isolierung und Reinigung des Proteins oder des Proteinfragments, das durch das synthetische Gen kodiert wird, nützlich sind, wie eine Affinitätsmarkierung.
Mit „Codon-Optimierung„ ist die Auswahl von geeigneten DNA-Nukleotiden für die Synthese von Oligonukleotid-Bausteinen und deren nachfolgenden enzymatischen Zusammenbau zu einem Strukturgen oder einem Fragment davon, um sich der Codon-Verwendung innerhalb von Pflanzen anzunähern, gemeint.
Um Expressionsniveaus und die Transgen-Protein-Produktion von VP2 oder einem Fragment oder von Derivaten oder Fragmenten davon zu maximieren, wird die Nukleinsäuresequenz von VP2 untersucht und die kodierende Region modifiziert, um sie für eine Expression des Gens in Pflanzen zu optimieren, unter Verwendung einer Vorgehensweise ähnlich zu jener, die von Sardana et al. (Plant Cell Reports 15:677-681; 1996) erläutert worden ist. Eine Tabelle der Codon-Verwendung ausgehend von hochgradig exprimierten Genen von dikotyledonen Pflanzen ist unter Verwendung der Daten von Murray et al. zusammengestellt worden (Nuc. Acids Res. 17:477-498; 1989). Diese Information wird verwendet, um eine synthetische Sequenz für sVP2 zusammenzustellen.
Der Zusammenbau des sVP2-Gens dieser Erfindung wird ausgeführt unter Verwendung von Standardtechniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Das Gen kann enzymatisch, innerhalb eines DNA-Vektors, beispielsweise unter Verwendung von PCR, zusammengebaut werden oder ausgehend von chemisch synthetisierten Oligonukleotid-Doppelstrang-Segmenten synthetisiert werden. Mit dem synthetischen VP2-Gen werden dann Pflanzengenome unter Verwendung von Methoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, transformiert. Eine Expression des Gens kann bestimmt werden unter Verwendung von Methoden die in diesem Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise einer Northern-Analyse oder eines ELISA.
Dementsprechend zieht die Erfindung ein Gen für VP2 in Betracht, welches für eine Expression in Pflanzen optimiert ist. Das sVP2 wird so synthetisiert, dass es eine geeignete Signalsequenz, beispielsweise die AMV-Leadersequenz, und einen 6 × Histidin-Schwanz enthält.
Unter einem Aspekt einer Ausführungsform betrifft das Verfahren der Erfindung das Transformieren einer Pflanze mit einem chimären Konstrukt, welches ein Schweine-Parvovirus-VP-2-Untereinheit-Protein, ein Fragment oder ein Derivat davon in einer Pflanze exprimiert. Das chimäre Konstrukt umfasst eine Nukleotidsequenz, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein (SEQ ID NO: 1), ein Fragment oder ein Derivat davon kodiert, in funktionsfähiger Assoziierung mit regulatorischen Sequenzen. Es kann eine jegliche regulatorische Sequenz verwendet werden, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf eine konstitutive Sequenz.
Eine konstitutive Sequenz dirigiert die Expression eines Gens innerhalb der gesamten verschiedenen Teile einer Pflanze und kontinuierlich während der gesamten Pflanzenentwicklung. Beispiele von bekannten konstitutiven Sequenzen umfassen Promotoren, die mit dem CaMV-35S-Transkript-Gen (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), dem Reis-Aktin 1-Gen (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3:1155-1165) und dem Triosephosphatisomerase I-Gen (Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), dem Mais-Ubiquitin 1-Gen (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), den Arabidopsis-Ubiquitin 1- und 6-Genen (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646) und dem Translationsinitiationsfaktor 4A-Gen aus Tabak (Mandel et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004) assoziiert sind. Der Begriff „konstitutiv", wie er hier verwendet wird, gibt nicht notwendigerweise an, dass ein Gen unter der Kontrolle der konstitutiven Sequenz in demselben Ausmaß in allen Zellarten exprimiert wird, aber dass das Gen in einem breiten Spektrum von Zellarten exprimiert wird, sogar obwohl oftmals Variationen bei der Reichlichkeit des Vorhandenseins beobachtet werden.
Eine regulatorische Sequenz kann auch umfassen, ist aber nicht beschränkt auf Promotorelemente, Promotor-Grund- (Kern-) -elemente, Elemente, die in Reaktion auf einen äußerlichen Stimulus induzierbar sind, Elemente, die Promotoraktivität vermitteln, wie negative regulatorische Sequenzen oder Transkriptionsverstärker oder -Enhancer Regulatorische Sequenzen können auch Elemente umfassen, die nach einer Transkription aktiv sind, beispielsweise regulatorische Sequenzen, die die Genexpression modulieren, wie Translations- und Transkriptions-Enhancer, Translations- und Transkriptionsrepressoren, strangaufwärts gelegene Aktivierungssequenzen und mRNA-Instabilitätsdeterminanten. Mehrere von diesen letztgenannten Elementen können proximal zu der kodierenden Region gelegen sein. In dem Kontext dieser Offenbarung bezieht sich die regulatorische Sequenz typischerweise auf eine Sequenz von DNA, welche üblicherweise, aber nicht immer strangaufwärts (5') von der kodierenden Sequenz eines Strukturgens gelegen ist, welche die Expression der kodierenden Region kontrolliert, indem die Erkennung für RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren, welche erforderlich sind, damit die Transkription an einer bestimmten Stelle beginnt, ermöglicht wird. Es versteht sich jedoch, dass andere Nukleotidsequenzen, die innerhalb von Introns oder 3' von der Sequenz gelegen sind, ebenfalls zu der Regulation der Expression einer kodierenden Region von Interesse beitragen können. Ein Beispiel für eine regulatorische Sequenz, die die Erkennung für RNA-Polymerase oder andere Transkriptionsfaktoren ermöglicht, um eine Initiation an einer bestimmten Stelle sicherzustellen, ist eine Promotorsequenz. Eine Promotorsequenz umfasst eine Promotor-Grundsequenz, welche für die Initiation der Transkription verantwortlich ist, wie auch andere regulatorische Sequenzen (wie oben aufgelistet), die die Genexpression modifizieren.
Es gibt auch mehrere Arten von regulatorischen Sequenzen, einschließlich jene, die entwicklungsbezogen reguliert, induzierbar und konstitutiv sind. Eine regulatorische Sequenz, die entwicklungsbezogen reguliert wird oder die unterschiedliche Expression eines Gens unter deren Kontrolle kontrolliert, wird innerhalb von bestimmten Organen oder Geweben zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung von jenem Organ oder Gewebe aktiviert. Einige regulatorische Sequenzen, die entwicklungsbezogen reguliert werden, können jedoch präferentiell innerhalb von bestimmten Organen oder Geweben in bestimmten Entwicklungsstufen aktiv sein, sie können auch in einer entwicklungsbezogen regulierten Weise oder ebenso im Umfang eines Grundniveaus in anderen Organen oder Geweben innerhalb der Pflanze aktiv sein.
Eine induzierbare regulatorische Sequenz ist eine, die in der Lage ist, die Transkription von einer oder mehreren DNA-Sequenzen oder von einem oder mehreren Genen in Reaktion auf einen Induktor direkt oder indirekt zu aktivieren. In Abwesenheit eines Induktors werden die DNA-Sequenzen oder Gene nicht transkribiert werden. Typischerweise kann der Proteinfaktor, der spezifisch an eine induzierbare Sequenz bindet, um die Transkription zu aktivieren, in einer inaktiven Form vorhanden sein, die dann direkt oder indirekt in die aktive Form durch den Induktor umgewandelt wird. Der Proteinfaktor kann jedoch auch abwesend sein. Der Induktor kann ein chemisches Mittel, wie ein Protein, Metabolit, Wachstumsregulator, Herbizid oder eine phenolische Verbindung oder ein physiologischer Stress, der direkt durch Hitze, Kälte, Salz oder toxische Elemente oder indirekt durch die Wirkung eines Pathogens oder eines Krankheitsagens, wie eines Virus, bewirkt wird, sein. Eine Pflanzenzelle, die eine induzierbare Sequenz enthält, kann einem Induktor ausgesetzt werden, indem der Induktor von außen auf die Zelle oder Pflanze aufgebracht wird, wie durch Sprühen, Bewässern, Erwärmen oder ähnliche Methoden. Induzierbare Elemente können von entweder Pflanzen- oder Nicht-Pflanzengenen abgeleitet werden (z.B. Gatz, C., und Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; welches durch Bezugnahme aufgenommen wird). Beispiele von potentiellen induzierbaren Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf durch Tetracyclin induzierbare Promotoren (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; welches durch Bezugnahme aufgenommen wird), Steroid-induzierbare Promotoren (Aoyama, T., und Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404; welches durch Bezugnahme aufgenommen wird) und durch Ethanol induzierbare Promotoren (Salter, M.G., et al., 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al., 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, welches durch Bezugnahme aufgenommen wird), die durch Cytokinin induzierbaren IB6- und CK11-Gene (Brandstatter, I., und Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; welche durch Bezugnahme aufgenommen werden) und das durch Auxin induzierbare Element DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; welches durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Die Nukleotidsequenz, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, umfasst dementsprechend die DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 1 (siehe auch 2) und Fragmente oder ein Derivat davon wie auch Analoga davon oder Nukleinsäuresequenzen, welche ungefähr 80% Ähnlichkeit mit den Nukleinsäuren, wie in SEQ ID NO: 1 definiert, umfassen. Analoga umfassen jene DNA-Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (oben beschrieben, siehe Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 387-389) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisieren, vorausgesetzt, dass die Sequenzen zumindest eine Eigenschaft der Aktivität des Gens, wie hier definiert, beibehalten.
In einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann die kodierende Region des VP2-Untereinheit-Proteins angefügt werden als Teil an beispielsweise, aber nicht beschränkt auf die Alfalfa-Mosaikvirus-Leadersequenz und die fusionierte Sequenz kann in einen Vektor, der für eine Expression in einer Pflanze geeignet ist, kloniert werden, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf einen binären pCAVP-Vektor (1), welcher eine gewünschte regulatorische Region, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf einen Tandem-35S-CaMV-Promotor und einen nos-Terminator, umfasst. Der binäre pCAVP-Vektor, welcher das klonierte AMV-VP2-Gen umfasst, kann in einen transformierenden Stamm, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf einen Agrobacterium tumefaciens-Stamm, welcher ein entschärftes Ti-Plasmid enthält, eingeführt werden und Pflanzen können unter Verwendung von Methoden, die in diesem Fachgebiet beschrieben werden, transformiert werden. Wie jedoch ein Fachmann auf diesem Gebiet verstehen wird, existieren viele andere Vektoren, Promotoren, Terminatoren und Transformationssysteme, die anstelle von jenen, die hier beschrieben werden, verwendet werden können. Bei spielsweise, aber ohne die Absicht einer Einschränkung können die Konstrukte der Erfindung in Pflanzenzellen eingeführt werden unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirus-Vektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation u.s.w. Für zusammenfassende Übersichten über solche Techniken siehe beispielsweise Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, S. 521-463 (1988); Geierson und Corey, Plant Molecular Biology, 2. Aufl. (1988); und Miki und Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2. Aufl., DT Dennis, DB Turpin, DD Lefebrve, DV Layzell (Hrsg). Addison Wesly, Langmans Ltd. London, S. 561-579 (1997). Die Erfindung umfasst ferner einen geeigneten Vektor, welcher das chimäre Genkonstrukt umfasst.
Um die Identifizierung von transformierten Pflanzenzellen zu unterstützen, können die Konstrukte dieser Erfindung weiter manipuliert werden, so dass sie in Pflanzen selektierbare Marker umfassen. Nützliche selektierbare Marker umfassen Enzyme, die eine Resistenz gegen Chemikalien, wie Antibiotika, beispielsweise Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin, oder Herbizide, wie Phosphinothrycin, Glyphosat, Chlorsulfuron und dergleichen, bereitstellen. In ähnlicher Weise sind Enzyme, die die Produktion einer Verbindung ermöglichen, welche durch Farbveränderung identifizierbar ist, wie GUS (β-Glucuronidase), oder durch Lumineszenz identifizierbar ist, wie Luciferase oder GFP, nützlich.
Das Verfahren der Erfindung kann in einer jeglichen Pflanze ausgeführt werden, einschließlich Futterpflanzen, Nahrungsmittel-Feldfrüchten oder anderen Pflanzen, abhängig von dem Erfordernis. Die Erfindung kann beispielsweise, aber ohne die Absicht einer Einschränkung, in Tabak, Korn/Mais, Gerste, Alfalfa und Kartoffel praktisch ausgeführt werden. Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise in Tabakpflanzen mit niedrigem Nikotingehalt praktisch ausgeführt.
Die Erfindung umfasst Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzensamen, welche eine Nukleotidsequenz umfassen, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein (SEQ ID NO: 1), ein Fragment oder ein Derivat davon kodiert.
Das durch das Verfahren der Erfindung produzierte Protein kann Volllängen-Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein oder ein Fragment oder Derivat davon umfassen. Wie sich für einen Fachmann auf diesem Gebiet versteht, ist möglicherweise ein vollständiges Protein nicht erforderlich, um ein Tier gegenüber nachfolgenden Provokationen bzw. Expositionen durch das Protein oder ein infektiöses Agens, welches das Protein umfasst, zu immunisieren, sondern es kann vielmehr möglich sein, dass ein kleineres Fragment des Proteins ein Tier gegenüber nachfolgenden Provokationen bzw. Expositionen durch das Volllängen-Protein oder ein infektiöses Agens, welches das Volllängen-Protein umfasst, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf ein Bakterium oder ein Virus, immunisieren kann. Ferner, wie ein Fachmann auf diesem Gebiet verstehen wird, erfahren Viren oftmals Mutationen in Genen, die es dem Virus erlauben, der Immundetektion in einem Tier zu entrinnen. Dementsprechend zieht das Verfah ren der Erfindung auch in Betracht, dass unterschiedliche Schweine-Parvovirus-Stämme unterschiedliche VP2-Untereinheit-Proteinsequenzen haben können, und dementsprechend ist beabsichtigt, dass natürliche Varianten oder durch Menschen hergestellte Varianten des Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Proteins oder ein Fragment oder Derivat davon vollständig von der Erfindung mit umfasst werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung können die transgenen Pflanzen, welche das Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein (SEQ ID NO: 1) exprimieren, wie auch Pflanzensamen, Pflanzenzellen oder Nachkommenschaft, welche daraus hergestellt werden, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Verhütung einer Schweine-Parvovirus-Infektion in einem Tier, speziell einem Schwein, verwendet werden.
Zu diesem Zweck ist es denkbar, dass die Pflanze selbst direkt zu dem Futter, welches durch das Schwein verzehrt wird, zugesetzt wird. Die Pflanze oder Pflanzengewebe kann geerntet und direkt an das Tier verfüttert werden oder das geerntete Gewebe kann vor dem Verfüttern getrocknet werden oder man kann das Tier an der Pflanze grasen lassen, ohne dass ein vorheriges Ernten stattfindet. Die geernteten Pflanzengewebe könnten als ein Futterzusatz innerhalb von Tierfutter verwendet werden. Wenn das Pflanzengewebe an ein Tier mit wenig oder gar keiner Weiterverarbeitung verfüttert wird, sollte das Pflanzengewebe essbar sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das VP2-Protein, welches durch Pflanzen der Erfindung produziert wird, entweder in einem Extrakt der Pflanze enthalten oder wird teilweise oder vollständig gereinigt und zu einer gewünschten Dosierungsform umformuliert. Die Dosierungsformen können eine orale Dosierungsform, in welcher das Protein in einem geeigneten Träger, beispielsweise Wasser, gelöst ist, umfassen.
Zusätzlich kann das Protein zu einer injizierbaren Dosierungsform formuliert werden. Eine injizierbare Dosierungsform kann andere Adjuvantien oder Hilfsstoffe, die wirken können, um die Immunogenität des Proteins zu verstärken, umfassen. Beispielsweise, aber ohne die Absicht einer Einschränkung, kann das Protein oder teilweise gereinigte Protein mit Freund'-Adjuvans kombiniert werden. Dementsprechend verleiht das durch das Verfahren der Erfindung produzierte Protein Immunität gegen Parvovirus in Tieren, die nicht zuvor mit dem Virus provoziert worden sind, wenn eben diesen Tieren eine Dosierungsform einer Proteinzusammensetzung, welche das teilweise oder vollständig gereinigte Protein, das durch das Verfahren der Erfindung produziert wird, umfasst, injiziert wird. Beispielsweise, aber ohne die Absicht einer Einschränkung wird, wenn Mäusen eine Dosierungsform eines Pflanzenextrakts, umfassend das Protein, das durch das Verfahren der Erfindung produziert wird, injiziert wird, eine Immunantwort ausgelöst, so dass aus den injizierten Mäusen gesammeltes Serum in der Lage ist, Resistenz gegen Schweine-Parvovirus in einem in vitro-Assay zu verleihen, unabhängig davon, ob das durch das Verfahren der Erfindung produzierte Protein Volllängen-VP2-Untereinheit-Protein, ein Fragment oder ein Derivat davon enthält.
Solche Arzneimittel können verwendet werden, um Immunität gegen Schweine-Parvovirus Schweinen, die zuvor mit dem Virus nicht provoziert worden sind, zu verleihen.
Die Immunität kann induziert werden an Schleimhautmembranen, wie Nasenschleimhautmembranen und Schleimhautmembranen des Gastrointestinaltrakts. Das Induzieren von Immunität an Schleimhautmembranen kann eine Neutralisation des Virus an der Eintrittsstelle des Tiers ermöglichen. Ferner können Serumantikörper-Isotope bestimmt werden, um zu bestimmen, ob getötetete VLPs Immunzellen, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Makrophagen, T-Helferzellen, zytotoxische T-Zellen, Neutrophile oder Kombinationen davon, stimulieren können. Zusätzlich kann das Vorhandensein von Zytokinen, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Interferone und Interleukine, bestimmt werden. Ergebnisse legen nahe, dass es eine Korrelation zwischen den Konzentrationen von Zytokinen, den Konzentrationen von Immunzellen oder dem Vorhandensein von Serumantikörpern in Tieren, die mit dem durch das Verfahren der Erfindung produzierten Protein behandelt wurden, geben könnte.
Nach einer Immunisierung können trächtige Säue, ohne die Absicht einer Einschränkung, oral provoziert werden, und das Ausmaß des Schutzes kann bestimmt werden. Das Ausmaß des Schutzes kann bestimmt werden, indem klinische Anzeichen überwacht werden und die Fähigkeit des Virus bestimmt wird, die Placenta zu durchqueren und den Fötus zu infizieren. Im Fötus kann das Vorhandensein von viralen Antigenen durch immunhistochemische Untersuchungen und durch Virusisolierung bestimmt werden.
Das durch das Verfahren der Erfindung produzierte Protein, welches virale rekombinante VP2-Untereinheit-Proteine und Fragmente davon umfasst, kann verschiedene Verwendungen haben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Herstellung von immunogen aktiven Untereinheit-Proteinen für eine Verwendung als orale Proteine, die Herstellung von immunogen aktiven Untereinheit-Proteinen für die Verwendung als systemisch verabreichte Proteine, die Herstellung von Antikörpern für eine veterinärmedizinische diagnostische Verwendung, für allgemeine Forschungszwecke oder Kombinationen davon. Ferner kann das durch das Verfahren der Erfindung produzierte Protein in großen Mengen in Pflanzen produziert, isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden bei potentiell verringerten Kosten verglichen mit anderen herkömmlichen Verfahren zum Produzieren von Proteinen, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf jene, die Fermenationsverfahren einsetzen. Es wird auch daran gedacht, dass das VP2-Protein, Fragmente oder Derivate davon verwendet werden können, um Epitope aus anderen Antigenen zu tragen. Ein solches hybrides Protein kann auch verwendet werden, um bei dem Tier eine schützende Immunität auszulösen.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht. Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele allein Veranschaulichungszwecken dienen und nicht verwendet werden sollten, um den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel 1: Konstruktion von VP2-Pflanzenexpressionsvektoren
Die Alfalfa-Mosaikvirus (AMV)-Leadersequenz (Jobling und Gehrke, 1987) wird zu dem VP2-Gen durch PCR hinzugefügt (1). Es wird ein 70 Nukleotide-Primer (AMVVP, SEQ ID NO: 2):
5'GGGTCTAGAGTTTTTATTTTTAATTTTTCTTTCAAA
TACTTCCATCATGAGTGAAAATGTGGAACAACAC-3'
synthetisiert. Eine PCR-Amplifizierung wird ausgeführt unter Verwendung von 5,25 Einheiten Expand DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim), 350 μmol dNTPs, 1,75 mM MgCl₂, 10 pmol von AMVVP- und T7-Primern und 5 ng Matrize (pBluescript KS+, enthaltend das VP2-Gen). Es werden gemäß den Anweisungen des Herstellers dreißig PCR-Zyklen unter Verwendung einer Hybridisierungs-(Annealing-)-Temperatur von 65°C ausgeführt. Das amplifizierte DNA-Fragment wird unter Verwendung von Standardmethoden in diesem Fachgebiet gereinigt, die Enden werden aufgefüllt und das DNA-Fragment wird in die SmaI-Restriktionsstelle von pBluescript KS+ eingeführt. Das resultierende Plasmid (pBSAVP) wird mit BamHI- und KpnI-Restriktionsenzymen verdaut und das AMV-VP2-Fragment, das in 2 gezeigt ist, wird in den binären Vektor pCamter X, der zuvor mit den gleichen Enzymen verdaut worden war, eingeführt. Dieser binäre Vektor enthält einen duplizierten 35S-Promotor (Kay et al., 1987), eine Mehrfachklonierungsregion, den nos-Terminator und umfasst des Weiteren Neomycinphosphotransferase II (npt II) als selektierbaren Marker zwischen den T-DNA-Randsequenzen. Ähnliche Ergebnisse können unter Verwendung des tCUP-Promotors (Miki et al., 1998) erhalten werden.
Beispiel 2: Transformation von Pflanzen mit dem VP2-Expressionsvektor
Der binäre pCAVP-Vektor wird in Agrobacterium tumefaciens (EHA 105, welches das entschärfte Ti-Plasmid pEHA 104 enthält) unter Verwendung von Standardprotokollen innerhalb dieses Fachgebiets (Horsch et al., 1985) eingeführt. Tabakpflanzen mit niedrigem Nikotingehalt aus dem Kultivar 81-V9 werden aseptisch für eine Transformation kultiviert. Die Mittelrippe des Blattmaterials wird herausgeschnitten und das Blattmaterial wird unter Verwendung eines Skalpells in 1 cm²-Fragmente geschnitten. Die Fragmente werden mit der epidermalen Seite nach unten 2 Tage auf festem Medium, bestehend aus MS (Murashige und Skoog)-Salzen, B5-Vitaminen, 3% Sucrose, 1 mg/l 6-Benzylaminopurin (BA) und 0,1 mg/l α-Naphthalinessigsäure (NAA), vorkultiviert.
Die Infektion von Blatt-Explantaten mit transgenen Agrobacterium aus über Nacht in LB (Luria-Brühe)-Medium vemehrten Kulturen wird erzielt, indem Blatt-Explantate in die Agrobacterium-Kulturen, die zu ungefähr 50% verdünnt worden waren, eingetaucht wurden, gefolgt von einem Trocknen auf Whatman Nr. 2-Filterpapier, um überschüssige Bakterien zu entfernen. Die Explantate wurden auf das oben beschriebene feste Medium zurückgelegt und man ließ sie 2 Tage wachsen. Nachfolgend wurde Bakterienvermehrung gehemmt und eine Selektion auf Transformanten initiiert, indem Explantate auf Medium, welches 500 μg/ml Timentin und 100 μg/ml Kanamycin enthielt, transferiert wurden. Die Explantate wurden alle 2-3 Wochen auf frisches Medium transferiert, bis Triebe erschienen.
Nachdem die Explantate gut definierte Stiele entwickelt haben, werden die Triebe herausgeschnitten und zu Magenta-Boxen, welche festes Medium enthielten, transferiert. Das feste Medium umfasst MS-Salze, B5-Vitamine, 3% Sucrose, 500 μg/ml Timentin und 100 μg/ml Kanamycin. Man ließ ausgehend von den mutmaßlichen transgenen Pflanzen sich Wurzeln entwickeln, zu welchem Zeitpunkt die Pflanzen in eine erdfreie Eintopf-Mischung in einem 15 cm-Kunststofftopf gesetzt und in das Gewächshaus transferiert werden. Um sicherzustellen, dass jede Pflanze aus einem unabhängigen Transformationsereignis hervorgegangen war, werden die Explantate frühzeitig in der Prozedur in separate Fragmente aufgeteilt und ausgehend von jedem Fragment wurden nur 1 Trieb ausgewählt.
Beispiel 3: Analyse der AMV-VP2-Insertionen in transgenen Pflanzen
Jede der mutmaßlichen transgenen Tabakpflanzen, welche aus der Agrobacterium-Transformation resultierten, wird auf das Vorhandensein des VP2-Gens unter Verwendung von PCR gescreent. Die für die PCR-Amplifizierung ausgewählten Primer sind VP1060F:
GGTGGACCATTTCTAACTC (SEQ ID NO: 3)
und nos:
CCGGCAACAGGATTCAATCTTAA (SEQ ID NO: 4).
Aus Pflanzengewebe wird unter Verwendung von Standardmethoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, DNA extrahiert und diese wird 35 Amplifizierungszyklen unter Verwendung von 10 pMol von beiden Primern, 100 mM dNTPs, 2 mM MgCl₂, 1 E Taq-Polymerase und ungefähr 50 ng Pflanzen-DNA unterworfen. Anhand von PCR wurden dreizehn Pflanzen als positiv bestätigt, wie in 3 gezeigt.
Transgene Tabakpflanzen wurden hinsichtlich der Expression von VP2-RNA durch RT-PCR analysiert. Für die RT-PCR wurden 10 Mikrogramm RNA mit RNase-freier DNase behandelt und 5 μg davon wurden für eine cDNA-Synthese verwendet. Oligo-dT (12-18) (0,05 μg) wurde mit der RNA gemischt, bei 70°C inkubiert und auf Eis abgekühlt. Die Synthese des ersten Strangs erfolgte für 50 min bei 42°C in einem Puffer, enthaltend 10 mM DTT, 0,5 mM dNTP, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂ und 200 Einheiten Superscript II reverse Transkriptase (Gibco BRL Life Technologies). Das Enzym wurde bei 70°C 15 min hitzeinaktiviert. Als Negativkontrolle wurden für jede Probe reverse Transkriptase-Reaktionen, die keinerlei reverse Transkriptase enthielten, ausgeführt. Dann erfolgte eine PCR, wie oben beschrie ben, mit 2 μl der Umkehrtranskriptionsreaktion als Matrize und für VP2 spezifischen Primern. Die Synthese des ersten Strangs wurde bestätigt, indem dieser als Matrize für eine PCR mit Primern für das Aktin-Gen getestet wurde. Das Transkript für VP2 wurde in fünf der getesteten Pflanzen nachgewiesen, wie in 4 gezeigt.
Beispiel 4: Nachweis des VP2-Proteins in transgenen Pflanzen
Transmissionselektronenmikroskopie
Gewebeproben von einer transgenen Pflanze, CAVP12-9, welche VP2 exprimiert, wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie analysiert. Sie wurden in Kunststoff eingebettet und davon Schnitte erstellt. Strukturen von ungefähr 25 nm Durchmesser, welche mit der Größe und der Gestalt von virusartigen Partikeln konsistent waren, wurden im Zytoplasma der Pflanzenzellen beobachtet, wie in 5 gezeigt.
Immundetektion des VP2-Proteins in Pflanzenextrakten
Lösliches Protein wird aus 2 g Blattgewebe aus jeder transgenen Pflanze extrahiert. Das Gewebe wird in einem gekühlten Mörser mit Pistill mit einer geringen Menge von mit Säure gewaschenem Sand als Schleifmittel zu einer Paste verrieben. 4 ml Extraktionspuffer, umfassend 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5% Glycerol, 0,1 M KCl, 2 mM EDTA, 2 μg/ml Leupeptin, Pepstatin und 1,5% Polyvinylpolypyrrolidon, werden zugesetzt und das Gewebe zu einem Homogenisat verrieben. Das Homogenisat wird durch Miracloth^TM filtriert, um große Partikel zu entfernen, und dann bei 10000 × g bei 4°C 20 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, in kleine Aliquots aufgeteilt und bei –20°C eingefroren, bis er benötigt wird.
An den Proteinextrakten wird unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörpers, der in der Lage ist, VP2-Protein zu binden, unter Verwendung von Standardmethoden eine Western-Blot-Analyse ausgeführt. Proteine wurden durch SDS-PAGE an einem 10%-igen Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Membran wird 45 min bei Raumtemperatur in TBS, enthaltend 10% Rinderserumalbumin (BSA), blockiert, dann einmal 5 min und dann zweimal 15 min in TEST, enthaltend 5% Magermilch, gewaschen und mit einem gegen VP2-Protein gerichteten primären Antikörper (Verdünnung 1/20) inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht wird die Membran gewaschen, mit einem sekundären Antikörper (Verdünnung 1/1000) 45 min inkubiert und dann dreimal für jeweils 5 min in TEST gewaschen. Nach der Entwicklung des Blots wurde ein Protein von ungefähr 64 kDa, welches mit dem VP2-spezifischen Antikörper kreuzreagierte, in vier der transgenen Pflanzen detektiert, wie in 6 gezeigt.
Beispiel 5: Kleintierversuche
Versuche an kleinen Tieren durch Injektion einer VP2 umfassenden Proteinzusammensetzung
Von primären Transformanten gesammeltes Saatgut wurde auf MS-Medium, enthaltend 300 mg/ml Kanamycin, ausplattiert und man ließ dieses keimen und drei Wochen wachsen. Aus den gekeimten Samen wurden grüne transgene Sämlinge in erdlose Eintopfmischung gepflanzt und ungefähr sechs Wochen in einem Gewächshaus kultiviert. Dann wurde Blattgewebe gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder frisch verwendet. Blätter wurden mit einer Rasierklinge grob gehackt und mit zwei Volumen Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 M KCl; 1 mM EDTA; 15 mg/ml PVPP; 5% Glycerol) in einem vorgekühlten Waring-Blender zu einer breiigen Masse zerkleinert. Das Homogenisat wurde durch eine Lage Miracloth filtriert, um große Partikel zu entfernen, und dann zentrifugiert (8000 × g, 20 min, 4°C). Der Überstand wurde dekantiert und unter Verwendung derselben Bedingungen erneut zentrifugiert. Der endgültige Überstand wurde in Aliquots aufgeteilt und eingefroren. Die gleiche Vorgehensweise wurde mit untransformiertem 81V9-Pflanzengewebe wiederholt.
Die rohen Proteinextrakte wurden aufgetaut, zentrifugiert und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert. Gruppen von 3 bis 4 Swiss-Mäusen wurde Pflanzenextrakt injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt 125 μg Pflanzenextrakt aus untransformierten Pflanzen pro Maus, während die Versuchsgruppe 450 μg Pflanzenextrakt aus der Pflanze CAVP12-9 pro Maus erhielt. Die Proteinextrakte wurden mit gleichen Volumen von komplettem Freund'-Adjuvans für die erste Injektion auf ein Gesamtvolumen von 100 μl und mit unvollständigem Freund'-Adjuvans für die zweite und die dritte Injektion gemischt. Subkutane Injektionen erfolgten an den Tagen 0, 21 und 42 in die Hinterläufe der Mäuse, wobei die Hälfte des Volumens in jeden Lauf injiziert wurde. Blut wurde abgenommen vor der ersten Injektion am Tag 0 und am Tag 52.
Der Serumneutralisationsassay erfolgte unter Verwendung von fötalen Schweinehodenzellen (ATCC #CRL 1746). Schweinehodenzellen wurden 18 h bei 37°C, 5% CO₂, in MEM in einer Gewebekulturplatte mit 48 Vertiefungen kultiviert. Mäuseserum aus den Kontroll- und Versuchsmäusen wurde 30 min bei 56°C hitzeinaktiviert. Reihenverdünnungen des Mäuseserums erfolgten in MEM plus zwei Prozent fötales Rinderserum im Verhältnis von 1/300, 1/900, 1/2700 und 1/8100. Schweine-Parvovirus wurde verdünnt, so dass 50 Plaque-bildende Einheiten/ml erhalten wurden. Gleiche Volumen des verdünnten PPV und der Verdünnungen der Mäuseseren wurden gemischt und 1,5 h bei 37°C inkubiert. Die PPV plus Serum-Mischungen wurden dann zu den Vertiefungen der konfluenten Platte von Schweinehodenzellen (400 μl/Vertiefung, Doppelproben) hinzugegeben und bei 37°C 18 h inkubiert. Das Volumen in den Vertiefungen wurde mit MEM auf 1 ml erhöht und die Inkubation wurde 4 bis 5 Tage fortgesetzt. Die Anzahl von Plaques wurde gezählt und der Neutralisationstiter wurde bestimmt, indem die Verdünnung berechnet wurde, die die Plaque-Anzahl um 50% verringerte.
Es gab bei den Kontrollgruppen keine Unterschiede bei der Serumneutralisation zwischen der vorab erfolgten Blutabnahme und der abschließenden Blutabnahme (7). Je doch waren in den Gruppen, denen VP2 enthaltendes Pflanzengewebe injiziert worden war, die Serumneutralisationstiter für die abschließende Blutabnahme beträchtlich höher als für die vorab erfolgte Blutabnahme. Diese Ergebnisse zeigen die Produktion von neutralisierenden Antikörpern in Mäusen nach Immunisierung mit in Pflanzen produziertem VP2 an.
Versuche an kleinen Tieren durch orale Fütterung
Von primären Transformanten gesammeltes Saatgut wird auf MS-Medium, umfassend 300 mg/l Kanamycin, ausplattiert und man lässt dieses keimen und drei Wochen wachsen. Von den gekeimten Samen werden 100 grüne transgene Sämlinge in erdlose Eintopfmischung in Anzuchtschalen (Formplatten) für kleine Pflanztöpfe gepflanzt und in ein Gewächshaus gestellt. Man ließ die Pflanzen sechs Wochen wachsen, wonach das Blattgewebe geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurde. Dieses Blattmaterial kann verwendet werden, um reines Protein zur Injektion oder als Zusatz für ein Verfüttern herzustellen. Transgene Blattextrakte werden hergestellt, indem die Blätter geerntet und diese schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Blattmaterial wird mit einer geringen Menge Sand gemischt und mit Mörser und Pistill vermahlen. Nachdem das Material zu einem feinen Pulver vermahlen worden ist, werden zwei Volumen Puffer (50 mM Tris-Puffer, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 15 mg/ml PVPP in 5% Glycerol) zugegeben. Die größeren Partikel des Homogenisats werden durch Filtrieren durch Micracloth entfernt und die Lösung wird zentrifugiert, um das Virus zu sammeln. Das pelletierte Virus wird durch Bandenbildung auf einem Sucrose-Gradienten weiter gereinigt. Nach der Bandenbildung auf einem Sucrose-Gradient wird die virale Bande in VSA-Adjuvans für eine intramuskuläre Injektion emulgiert oder für eine orale Immunisierung in PBS eingemischt. Bei einigen oralen Fütterungsversuchen kann das Blattmaterial direkt an Mäuse als pelletiertes Futter verfüttert werden.
Das Futter wird hergestellt unter Verwendung von transgenem oder Kontroll-Blattmaterial und wird in einer Konzentration von 10 Gew.-% in eine Diät aufgenommen. Bei Annahme von VP2-Proteinkonzentrationen von 5 μg/g in dem transgenen Blattmaterial und täglichen Futteraufnahmen von ungefähr 5 g könnte eine orale Dosis von 25 μg erwartet werden. Die Tiere wurden mit Futter, welches entweder transgenes oder Kontroll-Blattmaterial enthielt, viermal an den Tagen 0, 4, 21 und 25 gefüttert. Nach der Immunisierung wurde den Tieren an den Tagen 10, 24 und 38 durch die Schwanzvene Blut abgenommen. Die Antikörper-Konzentrationen werden durch Virusneutralisation und Western-Blots bestimmt.
Beispiel 6: Versuche an großen Tieren
Ferkel werden mit unterschiedlichen Konzentrationen von gereinigten VLPs durch orale Abgabe (2 μg, 10 μg oder 50 μg/Ferkel) in Kochsalzlösung immunisiert. Kontrollgruppen von Ferkeln werden intramuskulär mit äquivalenten Konzentrationen von VLPs in VSA-Adjuvans immunisiert. Die Tiere werden 4 Wochen nach dem Erhalt der ersten Dosis geboostet.
Nach der Immunisierung werden Immunantworten überwacht, indem die Konzentration von Serumantikörper, der 2, 4 und 6 Wochen nach der Impfung oder dem Boosten vorhanden ist, bestimmt wurde. Antikörperkonzentrationen werden unter Verwendung eines Enzymimmunassays, der in diesem Fachgebiet wohlbekannt ist (ELISA-Assays), bestimmt. Das Ausmaß von mukosalen Immunantworten wird unter Verwendung eines ELISPOT-Assays oder eines ELISA auf das Vorhandensein von Antikörper in Schleimhautsekreten bestimmt werden.
Die Erfindung ist in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden. Für Fachleute auf diesem Gebiet wird es jedoch offensichtlich sein, dass eine Anzahl von Variationen und Modifizierungen vorgenommen werden kann, ohne von dem Umfang der Erfindung, wie hier beschrieben, abzuweichen.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Proteins in einer Pflanze, umfassend: i) Transformieren der Pflanze mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein exprimiert, wobei die Nukleotidsequenz eine Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 definiert wird, oder eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen damit hybridisiert, umfasst und funktionsfähig (operativ) mit einer regulatorischen Region, die in der Pflanze aktiv ist, verknüpft ist; und ii) Kultivieren der transformierten Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren das Ernten der Pflanze und das Reinigen des Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine Tabakpflanze mit niedrigem Nicotingehalt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren das Extrahieren des VP2-Untereinheit-Proteins aus der transformierten Pflanze und das Reinigen oder teilweise Reinigen des Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren das Ernten der Pflanze und das Reinigen des Proteins für die Herstellung eines Arzneimittels umfasst.
Extrakt aus einer transgenen Pflanze, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein exprimiert, wobei der Extrakt das VP2-Untereinheit-Protein, welches durch eine durch SEQ ID NO: 1 definierte Nukleinsäuresequenz kodiert wird, umfasst.
Extrakt nach Anspruch 6, wobei der Extrakt, wenn er einem Tier durch Injektion verabreicht wird, in der Lage ist, Immunität gegen Schweine-Parvoviren in dem Tier zu verleihen.
Verwendung des Extrakts nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Impfstoffs für die Verhütung einer Infektion durch Schweine-Parvoviren bei einem Schwein.
Transgene Pflanze, transgener Pflanzensamen, transgene Pflanzenzelle oder ausgehend davon hergestellte Nachkommenschaft, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein exprimiert, wobei die Nukleotidsequenz eine durch SEQ ID NO: 1 definierte Nukleinsäuresequenz umfasst.
Chimäres Konstrukt, welches eine regulatorische Region in funktionsfähiger Assoziation mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Schweine-Parvovirus-VP2-Untereinheit-Protein kodiert, umfasst, wobei die Nukleotidsequenz eine durch SEQ ID NO: 1 definierte Nukleinsäuresequenz umfasst und die regulatorische Region in einer Pflanze aktiv ist.
Transgene Pflanze, transgener Pflanzensamen oder transgene Pflanzenzelle oder ausgehend davon hergestellte Nachkommenschaft, umfassend das chimäre Konstrukt nach Anspruch 10.
Verwendung der transgenen Pflanze, des transgenen Pflanzensamens, der transgenen Pflanzenzelle oder von ausgehend davon hergestellter Nachkommenschaft nach Anspruch 9 oder 11 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Verhütung von Schweine-Parvoviren bei einem Schwein.