DE69928379T2 - Verfahren zur reinigung und isolierung von wasserlöslichen peptiden und proteinen aus pflanzenquellen - Google Patents

Verfahren zur reinigung und isolierung von wasserlöslichen peptiden und proteinen aus pflanzenquellen Download PDF

Info

Publication number
DE69928379T2
DE69928379T2 DE69928379T DE69928379T DE69928379T2 DE 69928379 T2 DE69928379 T2 DE 69928379T2 DE 69928379 T DE69928379 T DE 69928379T DE 69928379 T DE69928379 T DE 69928379T DE 69928379 T2 DE69928379 T2 DE 69928379T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
peptide
pellet
proteins
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69928379T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69928379D1 (de
Inventor
J. Stephen GARGER
Barry R. Holtz
J. Michael McCULLOCH
H. Thomas TURPEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kentucky Bioprocessing LLC
Original Assignee
Large Scale Biology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Large Scale Biology Corp filed Critical Large Scale Biology Corp
Publication of DE69928379D1 publication Critical patent/DE69928379D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69928379T2 publication Critical patent/DE69928379T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/13—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00051—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von löslichen Proteinen und Peptiden, die in Pflanzen erzeugt werden. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung in großem Umfang anwendbar.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Pflanzenproteine und -enzyme werden seit langem für viele Zwecke benutzt, die von brauchbaren Nahrungsquellen bis zu biokatalytischen Reagenzien oder therapeutischen Wirkstoffen reichen. Im letzten Jahrzehnt hat die Entwicklung von transgenen und transfizierten Pflanzen und die Verbesserung der genetischen Analyse diesen Anwendungen eine erneute wissenschaftliche Bedeutung und wirtschaftliche Anreize verschafft. Die Konzepte der molekularen Pflanzenzucht und molekularen Pflanzenwirtschaft, bei denen ein Pflanzensystem als Bioreaktor zur Erzeugung von rekombinanten bioaktiven Materialien verwendet wird, wurden mit großer Aufmerksamkeit verfolgt.
  • Viele Beispiele in der Literatur haben die Nützlichkeit von Pflanzen oder Kulturpflanzenzellen zur Erzeugung von aktiven, von Säugetieren stammenden Proteinen, Enzymen, Vakzinen, Antikörpern, Peptiden und anderen bioaktiven Arten gezeigt. Ma u.a. (Science 268:716–719 (1995)) haben als erste die Erzeugung von funktionellem sekretorischem Immunglobulin in transgenem Tabak beschrieben. Gene, die für die schweren und leichten Ketten eines Maus-Antikörpers, einer Maus-Verbindungskette und einer sekretorischen Kaninchenkomponente kodieren, wurden in einzelne transgene Pflanzen eingebracht. Durch eine Kreuzbestäubung wurden Pflanzen erhalten, die alle Komponenten koexprimieren und einen funktionellen aktiven sekretorischen Antikörper erzeugen. In einer anderen Studie wurde ein Verfahren zur Erzeugung von antiviralen Vakzinen durch Ex pression eines viralen Proteins in transgenen Pflanzen beschrieben (Mason u.a., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 5335–5340 (1996)). Es wurde gezeigt, dass das Kapsidprotein des Norwalk-Virus, einem Virus, das beim Menschen eine epidemische akute Gastroenteritis verursacht, sich bei Expression in transgenem Tabak und Kartoffeln selbst zu virusartigen Partikeln zusammensetzt. Sowohl die gereinigten virusähnlichen Partikel als auch die transgenen Kartoffelknollen stimulierten beim Verfüttern an Mäuse die Antikörperproduktion gegen das Norwalk-Virus-Kapsidprotein. Alternativ kann die Produktion und Reinigung eines Vakzins durch Konstruktion eines Pflanzenvirus, das ein pathogenes Säugetierepitop trägt, erleichtert werden. Durch Verwendung eines Pflanzenvirus wird die zufällige Ausbreitung eines virulenten Virus über das Vakzin ausgeschaltet und dasselbe Pflanzenvirus kann zu Vakzinierung von mehreren Wirten verwendet werden. Zum Beispiel waren malariaverseuchte Epitope an der Oberfläche eines rekombinanten Tabakmosaikvirus (TMV) vorhanden (Turpen u.a. BioTechnology 13:53–57 (1995)). Ausgewählte B-Zell-Epitope wurden entweder in den Oberflächenschleifenbereich des TMV-Hüllproteins eingesetzt oder in den C-Terminus fusioniert. Nach der Infektion enthalten Tabakpflanzen hohe Titer an rekombinanten Viren, die als Vakzinuntereinheiten ausgebildet und ohne weiteres vergrößert werden können. In einer anderen Studie, die auf die Verbesserung des Ernährungszustands von Weideleguminosen abzielt, wurde ein schwefelreiches Sonnenblumensamenalbumin in den Blättern von transgenem unterirdischem Klee exprimiert (Khan u.a. Transgenic Res. 5:178–185 (1996)). Durch Richten des rekombinanten Proteins auf das endoplasmatische Retikulum der transgenen Pflanzenblattzellen konnte eine Anreicherung von transgenem Sonnenblumensamenalbumin von bis zu 1,3 % des gesamten extrahierbaren Proteins erzielt werden.
  • Es wurden auch im Bereich der Entwicklung von geeigneten Vektoren zur Expression von genetischem Fremdmaterial in Pflanzenwirten Anstrengungen unternommen. Ahlquist, US-Patent 4,885,248 und US-Patent 5,173,410, beschreibt den vorausgehenden Aufwand, der unternommen wird, um Transfervektoren zu entwickeln, die zum Übertragen von genetischem Fremdmaterial in Pflanzenwirtszellen zum Zwecke der Expression darin nützlich sein könnten. Zusätzliche Aspekte der Hybrid-RNA-Viren und RNA-Transformationsvektoren werden von Ahlquist u.a. in den US-Patenten 5,466,788, 5,602,242, 5,627,060 und 5,500,360 beschrieben. Donson u.a., US-Patent 5,316,931 und US-Patent 5,589,367 zeigen zum ersten Mal Pflanzenvirusvektoren, die zur systemischen Expression von genetischem Fremdmaterial in Pflanzen geeignet sind. Donson u.a. beschreiben Pflanzenvirusvektoren mit heterologen subgenomischen Promotoren für die systemische Expression von Fremdgenen. Die Verfügbarkeit von solchen rekombinanten Pflanzenvirusvektoren macht es möglich, interessante Proteine und Peptide rekombinant in Pflanzenwirten zu erzeugen.
  • Es werden gegenwärtig in schneller Folge aufwändige Pflanzengenetikverfahren entwickelt, die das Versprechen erfüllen, die Transformation von praktisch jeder Pflanzenart und die Expression einer großen Vielfalt von Genen zu ermöglichen. Damit aber die Pflanzenzucht und -wirtschaft im gewerblichen Bereich umfassend akzeptiert wird, muss ein kostenwirksames und großtechnisches Reinigungssystem für die bioaktiven, in den Pflanzen erzeugten Arten, entweder Proteine oder Peptide, insbesondere rekombinante Proteine oder Peptide, oder Viruspartikel, insbesondere genetisch manipulierte Viren, entwickelt werden.
  • Einige Verfahren zur Isolierung von Proteinen, Peptiden und Viren aus Pflanzen sind in der Literatur beschrieben worden (Johal, US-Patent 4,400,471, Johal, US-Patent 4,334,024, Wildman u.a., US-Patent 4,268,632, Wildman u.a., US-Patent 4,289,147, Wildman u.a., US-Patent 4,347,324, Hollo u.a., US-Patent 3,637,396, Koch, US-Patent 4,233,210 und Koch, US-Patent, 4,250,197).
  • Die sukkulenten Blätter von Pflanzen, wie beispielsweise Tabak, Spinat, Sojabohne und Alfalfa, bestehen typischerweise aus 10–20 % Feststoffen, wobei der restliche Teil Wasser ist. Der feste Teil besteht aus einem wasserlöslichen und einem wasserunlöslichen Teil, wobei letzterer hauptsächlich aus dem faserförmigen Strukturmaterial des Blatts besteht. Der wasserlösliche Teil umfasst Verbindungen mit relativ niedrigem Molekulargewicht (MG), wie beispielsweise Zucker, Vitamine, Alkaloide, Aromen, Aminosäuren, und andere Verbindungen mit relativ hohem MG, wie beispielsweise natürliche und rekombinante Proteine.
  • Die Proteine im löslichen Teil der Pflanzenbiomasse können weiter in zwei Fraktionen geteilt werden. Eine Fraktion umfasst hauptsächlich ein photosynthetisches Protein, Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase (oder RuBisCO), dessen Untereinheits-Molekulargewicht etwa 550 kD beträgt. Diese Fraktion wird üblicherweise als „Protein der Fraktion 1" bezeichnet. RuBisCO ist reichlich vorhanden und umfasst bis zu 25 % des gesamten Proteingehalts eines Blatts und bis zu 10 des Feststoffs eines Blatts. Die andere Fraktion enthält ein Gemisch aus Proteinen und Peptiden, deren Untereinheits-Molekulargewichte typischerweise im Bereich von etwa 3 kD bis 100 kD liegen, und weitere Verbindungen, einschließlich Zucker, Vitamine, Alkaloide, Aromen, Aminosäuren. Diese Fraktion wird insgesamt als „Proteine der Fraktion 2" bezeichnet. Proteine der Fraktion 2 können natürliche Wirtsmaterialien oder rekombinante Materialien, einschließlich Proteine und Peptide, sein, die mittels Transfektion oder transgener Transformation erzeugt werden. Transfizierte Pflanzen können auch Viruspartikel mit einer molekularen Größe von über 1.000 kD enthalten.
  • Das grundlegende Verfahren zur Isolierung von Pflanzenproteinen beginnt generell mit dem Abbau von Blattbiomasse und dem Pressen des sich ergebenden Faserstoffs zur Erzeugung von „grünem Saft". Das Verfahren wird üblicherweise in Gegenwart eines Reduktionsmittels oder Antioxidationsmittels durchgeführt, um eine unerwünschte Oxidation zu unterdrücken. Der pH-Wert des grünen Safts, der verschiedene Proteinkomponenten und aus feinen Teilchen bestehendes, grün pigmentiertes Material enthält, wird eingestellt und der Saft erwärmt. Der typische pH-Wertbereich für den grünen Saft liegt nach dem Einstellen zwischen 5,3 und 6,0. Dieser Bereich wurde für die Isolierung des Proteins der Fraktion 1 (oder der Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase) optimiert. Ein Erwärmen, das die Koagulation von grün pigmentiertem Material bewirkt, wird typischerweise um 50°C herum geregelt. Das koagulierte, grün pigmentierte Material kann dann durch mäßige Zentrifugation entfernt werden, um einen „braunen Saft" zu ergeben. Der braune Saft wird anschließend gekühlt und bei einer Temperatur bei oder unter Raumtemperatur gelagert. Nach einer ausgedehnten Zeit, z.B. 24 Stunden, kristallisiert Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus dem braunen Saft aus. Das kristallisierte Protein der Fraktion 1 kann dann durch Zentrifugation aus der Flüssigkeit ausgeschieden werden. Proteine der Fraktion 2 bleiben in der Flüssigkeit, und sie können nach weiterer Säuerung bis zu einem pH-Wert von etwa 4,5 gereinigt werden. Alternativ kann die Kristallbildung von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus dem braunen Saft durch Zugabe von ausreichenden Mengen an Polyethylenglycol (PEG) an Stelle einer Kühlung bewirkt werden.
  • Es gibt Protokolle zur Isolation und Reinigung von löslichen Pflanzenproteinen und -peptiden, die allerdings viele Probleme bereiten. Erstens wird eine Proteinisolation aus Pflanzenquellen zum Großteil für die Gewinnung des Proteins der Fraktion 1 durchgeführt, nicht aber für andere biologisch aktive lösliche Proteinkomponenten. Die bekannten Verfahren für die großtechnische Extraktion von F1-Proteinen erfolgten zur Herstellung von Protein als Zusatz zu Tierfutter oder anderen Nährsubstanzen. Säurefällung zur Gewinnung von Proteinen der Fraktion 2 ist im Stand der Technik nicht erfolgreich, da die meisten Proteine in der Pelletform denaturieren. Dies ist besonders für die Isolierung von Proteinen und Peptiden, die durch rekombinante Nukleinsäureverfahren erzeugt werden, störend, weil sie nach Säurefällung für eine Denaturierung empfänglicher sein können. Zweitens beruhen die bestehenden Trennungsverfahren auf der Verwendung von Lösungsmitteln, wie beispielsweise n-Butanol, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, um Chloroplastmembranfragmente, Pigmente und andere wirtsbezogene Materialien zu beseitigen. Obwohl sie für die Virusreinigung in kleinem Umfang nützlich und wirksam sind, ist die Verwendung von Lösungsmitteln bei einer großtechnischen Reinigung problematisch. Es treten häufig Probleme, wie Lösungsmittelbeseitigung, spezielle, mit entzündlichen Flüssigkeiten kompatible Anlagenausführungen, Anlagenbelüftung und Arbeiterbelastungsschutz sowie Überwachung, auf. Es gibt Virusreinigungsverfahren, die nicht auf einem Lösungsmittel beruhen und in kleinem Umfang durchgeführt werden, diese sind aufgrund der Anlagen und Verarbeitungseinschränkungen und Endproduktreinheit aber für großtechnische, kommerzielle Vorgänge nicht praktikabel (Brakke, Adv. Virus Res. 7:193–224 (1960) und Brakke u.a., Virology 39:516–533 (1969)). Schließlich ermöglichen die existierenden Protokolle keinen rationalisierten Betrieb in der Art, dass eine Isolation und Reinigung von unterschiedlichen Proteinen und Peptiden bei minimaler Modifikation eines allgemeinen Reinigungsverfahrens erzielt werden kann.
  • Es gibt auf dem Fachgebiet einen Bedarf an einem wirksamen, nicht denaturierenden und lösungsmittelbeschränkten, großtechnischen Verfahren zur Isolation und Reinigung von löslichen Proteinen. Dieser Bedarf ist besonders offensichtlich in den Fällen, in denen Proteine und Peptide, die rekombinant in Pflanzenwirten erzeugt werden, isoliert werden sollen. Die Eigenschaften dieser Proteine und Peptide unterscheiden sich häufig von den natürlichen Pflanzenproteinen. Protokolle des Standes der Technik sind nicht zur Isolation von interessanten rekombinanten Proteinen und Peptiden geeignet. Außerdem erfordern die große Vielfalt an rekombinanten Proteinen und Peptiden aus Pflanzen und die strikten Reinheitserfordernisse für diese Proteine und Peptide in industriellen und medizinischen Anwendungen ein wirksames und wirtschaftliches Verfahren zur ihrer Isolation und Reinigung. In einigen Situationen können interessante Proteine und Peptide an ein Virus angebracht oder mit natürlichen viralen Proteinen (Fusionsprotein) integriert werden, so dass die Isolation des interessanten Proteins oder Peptids tatsächlich die Isolation des Virus als solches umfassen kann.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation und Reinigung von interessanten Proteinen und Peptiden aus einem Pflanzenwirt, der in großem Umfang angewendet werden kann. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein wirksameres Verfahren zur Isolation von interessanten Proteinen und Peptiden als die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Verfügung.
  • Im Allgemeinen umfasst das vorliegende Verfahren zur Isolation von interessanten Proteinen und Peptiden die Schritte des Homogenisierens einer Pflanze zur Erzeugung eines grünen Safts, das Einstellen des pH-Werts des grünen Safts und dessen Erwärmen, das Trennen der Zielgattung (Protein/Peptid) aus anderen Komponenten des grünen Safts mittels einem oder mehr Zyklen einer Zentrifugation, die Resuspension und Ultrafiltration und abschließend das Reinigen von Proteinen und Peptiden durch Verfahren wie Chromatographie, einschließlich Affinitätsverfahren, und/oder Salzpräzipitation.
  • In einer Ausführungsform wird der pH-Wert des grünen Safts auf einen Wert zwischen etwa 4,0 und 5,2 eingestellt und der Saft für mindestens etwa eine Minute auf eine Temperatur zwischen etwa 45–50°C erwärmt. Dieses Gemisch wird dann einer Zentrifugation unterworfen. Der dadurch erzeugte Überstand enthält bei Transfektion einen Virus und Proteine der Fraktion 2, einschließlich rekombinante Produkte. Proteine der Fraktion 2 können vom pelletierten Protein der Fraktion 1 und anderen Wirtsmaterialien durch mäßige Zentrifugation abgetrennt werden. Proteine der Fraktion 2 können dann weiter durch eine Aufeinanderfolge von Ultrafiltration, Chromatographie, Salzpräzipitation und anderen Verfahren, einschließlich Affinitätstrennungsprotokolle, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt werden. Einer der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Proteine der Fraktion 2 einer Ultrafiltration unterworfen werden können, während dies bei bekannten Verfahren nicht der Fall ist.
  • In einer zweiten Ausführungsform wird nach der pH- und Wärmebehandlung das Pellet von der Zentrifugation, welches das Virus, das Protein der Fraktion 1 und andere Wirtsmaterialien enthält, in Wasser oder einer Pufferlösung resuspendiert und auf einen pH-Wert von etwa 5,0–8,0 eingestellt. Das Gemisch wird einer zweiten Zentrifugation unterworfen. Die Resuspension ermöglicht, dass die Mehrzahl der Viren nach der zweiten Zentrifugation im Überstand bleibt, und das Protein der Fraktion 1 und andere Wirtsmaterialien können in dem sich ergebenden Pellet gefunden werden.
  • In einer dritten Ausführungsform ist das Hüllprotein eines Virus ein Fusionsprotein, wobei das interessante rekombinante Protein oder Peptid in das Hüllprotein eines Virus integriert wird. Während der Virusreplikation oder während des Verfahrens der Virusisolation und -reinigung kann sein Hüllprotein vom Virusgenom als solches gelöst werden oder als nicht assembliertes Virus-Hüllprotein anfallen oder die Hüllfusion wird auch nie eingearbeitet. Nach der Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert kann das Pellet das Virus, die nicht assemblierten Fusionsproteine, das Protein der Fraktion 1 und andere Wirtsmaterialien enthalten. Das Pellet wird dann in Wasser oder einer Pufferlösung resuspendiert und anschließend an eine zweite Zentrifugation auf einen pH-Wert von etwa 2,0–4,0 eingestellt. Das Protein bleibt im sich ergebenden Über stand. Das nicht assemblierte Protein kann weiter gemäß herkömmlicher Verfahren, einschließlich Ultrafiltration, Salzpräzipitation, Affinitätstrennung und Chromatographie, gereinigt werden. Das interessante Peptid oder Protein kann durch chemische Spaltung des Fusionsproteins erhalten werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
  • In einer bevorzugten vierten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen eines Proteins oder Peptids aus einer Pflanze, umfassend die aufeinander folgenden Schritte:
    • (a) Homogenisieren einer Pflanzen oder eines Pflanzengewebes zur Erzeugung eines grünen Safts;
    • (b) Einstellen des pH-Werts des grünen Safts auf unter oder gleich 5,2;
    • (c) Erwärmen des grünen Safts auf eine minimale Temperatur von 45°C;
    • (d) Zentrifugieren des grünen Safts zur Erzeugung eines Überstands und eines Pellets; und
    • (e) Reinigen des Proteins oder Peptids vom Überstand und Pellet;
    wobei im Schritt (d) das Protein der Fraktion 1 durch die Zentrifugation pelletiert wird und die Proteine der Fraktion 2 im Überstand von Überstand und Pellet verbleiben. In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert des grünen Safts auf zwischen 4,0 und 5,2 eingestellt. In einer noch anderen Ausführungsform wird der grüne Saft auf eine Temperatur zwischen 45°C und 50°C erwärmt. In noch anderen Ausführungsformen kann das Protein oder Peptid durch rekombinante Verfahren erzeugt werden.
  • In einer besonders bevorzugten fünften Ausführungsform ist das Protein oder Peptid löslich und im Schritt (e) des Verfahrens wird das lösliche Protein oder Peptid aus der Überstandsfraktion (S1) von Überstand und Pellet, die im Schritt (d) erzeugt wurden, gereinigt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der pH-Wert des grünen Safts auf etwa 5,0 eingestellt, die Überstandsfraktion (S1) wird weiter einer Ultrafiltration unterworfen, die ein Permeat erzeugen kann, das ein oder mehr Moleküle umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Polysacchariden, Vitaminen, Alkaloiden, Geschmacks- oder Aromaverbindungen und Peptiden ausgewählt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Reinigens eines Konzentrats, das aus der zweiten Ultrafiltration resultiert. Das Reinigen wird vorzugsweise mittels Chromatographie, eines auf Affinität beruhenden Reinigungsverfahrens oder Salzpräzipitation durchgeführt. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, bei denen der pH-Wert des grünen Safts auf etwa 5,0 eingestellt ist und das lösliche Protein oder Peptid ein antimikrobielles Protein oder Peptid ist und aus der Gruppe bestehend aus Protegrinen, Magaininen, Cecropinen, Melittinen, Indolicidinen, Defensinen, β-Defensinen, Cryptdinen, Clavaininen, Pflanzendefensinen, Nicin und Batenecinen oder aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, II-12, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Faktor VIII, Faktor IX, tPA, Rezeptoren, Rezeptorantagonisten, Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern, Enzymen, Neuropolypeptiden, Insulin, Antigenen, Impfstoffen, Peptidhormonen, Calcitonin und menschlichem Wachstumshormon ausgewählt ist.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten sechsten Ausführungsform ist das Protein oder Peptid ein Fusionsprotein oder -peptid und im Schritt (e) des Verfahrens wird das Fusionsprotein oder Fusionspeptid aus dem Pellet vom im Schritt (d) erzeugten Überstand und Pellet gereinigt, wobei der Schritt (e) die nachstehenden, aufeinander folgenden Schritte umfasst:
    • (i) Resuspendieren des Pellets in einer flüssigen Lösung;
    • (ii) Einstellen des pH-Werts der flüssigen Lösung, umfassend das resuspendierte Pellet, auf zwischen pH 2,0 und pH 4,0;
    • (iii) Zentrifugieren der flüssigen Lösung, enthaltend das resuspendierte Pellet;
    • (iv) Reinigen des Fusionsproteins oder Fusionspeptids.
  • In einer alternativen, besonders bevorzugten, siebten Ausführungsform werden die Schritte (i) und (ii) von Schritt (e) des vorstehenden Verfahrens zu einem Schritt kombiniert, bei dem das Pellet in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 2,0 und 4,0 resuspendiert wird. Besonders bevorzugte Ausführungsformen beinhalten die Merkmale der Verfahren der sechsten oder siebten Ausführungsform, wobei das Reinigen durch mindestens ein Verfahren ausgeführt wird, das aus der Gruppe bestehend aus Chromatographie, eines auf Affinität beruhenden Reinigungsverfahrens oder Salzpräzipitation ausgewählt wird. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen die Merkmale der Verfahren der sechsten oder siebten Ausführungsform, wobei das Reinigen wahlweise wie im vorange henden Satz durchgeführt wird and das Fusionsprotein oder Fusionspeptid aus der Gruppe bestehend aus Protegrinen, Magaininen, Cecropinen, Melittinen, Indolicidinen, Defensinen, β-Defensinen, Cryptdinen, Clavaininen, Pflanzendefensinen, Nicin und Bactenecinen oder aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, II-12, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Faktor VIII, Faktor IX, tPA, Rezeptoren, Rezeptorantagonisten, Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern, Enzymen, Neuropolypeptiden, Insulin, Antigenen, Impfstoffen, Peptidhormonen, Calcitonin und menschlichem Wachstumshormon ausgewählt ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
  • 1 stellt ein Fließdiagramm dar, das das vorliegende Verfahren zur Isolation und Reinigung von Viren und löslichen Proteinen und Peptiden aus Pflanzenquellen zeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolation und Reinigung von interessanten Proteinen und Peptiden aus einem Pflanzenwirt. Außerdem sieht die vorliegende Erfindung ein wirksameres Verfahren zur Isolation von interessanten Proteinen und Peptiden als die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren vor. Darüber hinaus ist das vorliegende Verfahren auf die Herstellung in großem Umfang anwendbar.
  • Im Allgemeinen umfasst das vorliegende Verfahren zur Isolation von interessanten Proteinen und Peptiden die Schritte des Homogenisierens einer Pflanze zur Erzeugung eines grünen Safts, das Einstellen des pH-Werts und Erwärmen des grünen Safts, das Trennen der Zielarten (Protein/Peptid) von anderen Komponenten des grünen Safts durch einen oder mehr Zyklen der Zentrifugation, Resuspension und Ultrafiltration und abschließend das Reinigen von Proteinen und Peptiden durch Verfahren wie Chromatographie, einschließlich Affinitätstrennung, und/oder Salzpräzipitation.
  • Eine Darstellung der vorliegenden Erfindung ist in der 1 gezeigt. Allerdings soll diese Figur nur die vorliegende Erfindung veranschaulichen und nicht dahingehend interpretiert werden, dass sie die Verfahren oder die Reihenfolgen ihres Auftretens, wie darin angegeben, einschränkt.
  • Ein erster Schritt des vorliegenden Verfahrens betrifft die Homogenisierung der vorliegenden Pflanze. Pflanzenblätter können mittels einer geeigneten Apparatur oder eines zur Verfügung stehenden Verfahrens zersetzt werden. Zum Beispiel wird ein Waring-Mischer bei einem kleinen Umfang oder ein Reitz-Desintegrator bei einem großen Umfang erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet. Das homogenisierte Gemisch kann dann mittels einer geeigneten Apparatur oder eines zur Verfügung stehenden Verfahrens gepresst werden. Zum Beispiel wird eine Spindelpresse bei einem großen Umfang oder ein Seihtuch bei einem kleinen Umfang erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet. Der Homogenisierungsschritt kann in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels oder Oxidationsmittels durchgeführt werden, um eine unerwünschte Oxidation zu unterdrücken. Natriummetabisulfit (Na2S2O5) wird erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet. Die anschließenden Schritte zum Isolieren und Reinigen der löslichen Proteine/Peptide können generell gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt werden.
  • pH-Werteinstellung und Wärmebehandlung von grünem Saft
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert des anfänglichen grünen Safts auf einen Wert von unter oder gleich 5,2 eingestellt und dann bei einer Temperatur von mindestens etwa 45°C erwärmt. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert des grünen Safts auf zwischen etwa 4,0 und 5,2 eingestellt und dann für mindestens eine Minute auf eine Temperatur zwischen etwa 45–50°C erwärmt. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird erfolgreich eine Wärmebehandlung zwischen 10 und 15 Minuten verwendet. Der Fachmann wird ohne weiteres anerkennen, dass die für die Wärmebehandlung zugewiesene Zeit je nach der Gewinnung der ge wünschten Art variiert. Daher kann nach der pH-Werteinstellung die Erwärmungszeit von etwa einer Minute bis über 15 Minuten variieren. Die Wärme kann auf jede geeignete Weise angelegt werden, und die Erfindung soll diesbezüglich nicht einschränkend sein. Der Fachmann wird anerkennen, dass der pH-Wert mittels vieler geeigneter Säuren oder Basen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingestellt werden kann. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hat sich Phosphorsäure als wirksam erwiesen. Der pH-Wert des grünen Safts beeinflusst die Verteilung von Viren, Proteinen und Peptiden im Überstand oder Pellet während der anschließenden Zentrifugationen. Ein optimaler Wert für die Zielart kann durch Testen der Isolation und Reinigung des interessanten Proteins oder Peptids in kleinem Umfang erhalten werden. Bei bereits in der Literatur für die Nicht-Virusreinigung beschriebenen Verfahren wird der pH-Wert des grünen Safts auf einen Wert zwischen 5,3 und 6,0 eingestellt und eine Wärmebehandlung bei einer Temperatur von etwa 48–52°C verwendet.
  • Der wärmebehandelte grüne Saft mit eingestelltem pH-Wert ist insofern recht einzigartig, als der pH-Wert des grünen Safts die Verteilung von Viren, Proteinen und Peptiden im Überstand oder Pellet während anschließender Zentrifugationen beeinflusst. Je nach der interessanten Art kann der pH-Wert des grünen Safts ohne weiteres gesteuert werden, um die Isolation und Reinigung des gewünschten Produkts, der Proteine und Peptide, zu erleichtern. Es stellt daher einen rationellen Betrieb zur Verfügung, so dass die Isolation und Reinigung von verschiedenen Proteinen und Peptiden mittels kleiner Modifikationen eines allgemeinen Reinigungsverfahrens optimiert werden kann. Solche Modifikationen liegen im routinemäßigen Können des Fachmanns und erfordern kein übermäßiges Experimentieren. Durch das einzigartige Merkmal von grünem Saft ist es möglich, diesen in einer Auswahl von nachfolgend beschriebenen Reinigungsschritten zu verarbeiten.
  • Zentrifugation von grünem Saft
  • Der pH-Wert- und wärmebehandelte grüne Saft kann dann einer Zentrifugation unterworfen werden. Der Fachmann kann ohne weiteres geeignete Bedingungen für die Zentrifugation bestimmen, einschließlich Zeitintervall und G-Kraft. Es wird allgemein in Betracht gezogen, dass die Zentrifugation von ausreichender G-Kraft und Zeit sein sollte, um im Wesentlichen das ganze Protein der Fraktion 1, Chloroplast und andere Wirtsmaterialien zu pelletieren, während die gewünschte Zielart in der Überstandsfraktion zurückbleibt, oder von ausreichender Drehzahl und Zeit sein sollte, um die Zielart mit dem Protein der Fraktion 1, dem Chloroplast und anderen Wirtsmaterialien zu pelletieren. Zum Beispiel ist in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine Zentrifugation bei 3000 × G für zwei Minuten oder bei 6000 × G für drei Minuten wirksam auf den grünen Saft angewendet worden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Mehrheit von Protein der Fraktion 1, nicht assemblierten Fusionsproteinen und -peptiden, Chloroplast und anderen Wirtsmaterialien durch Zentrifugation pelletiert (P1), während Proteine der Fraktion 2, die rekombinante Proteine und Peptide aufweisen, nach dieser Zentrifugation allgemein im Überstand (S1) bleiben (siehe 1). Das Virus kann aber nach der Zentrifugation zwischen Pellet und Überstand aufgeteilt werden, je nach dem pH-Wert des grünen Safts, der Virusart, dem Virus-Nukleinsäurekonstrukt, der Pflanzenart, dem Pflanzenalter und der Pflanzengewebequelle usw. Bei einem niedrigen pH-Wert, vorzugsweise unterhalb einem pH von etwa 5,0, wird das Virus hauptsächlich im Pellet (P1) zurückgehalten. Bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 5,2 liegt das Virus auch im Überstand (S1) vor. Je nach der interessanten Art können der pH-Wert des grünen Safts und die anschließenden Zentrifugationsbedingungen ohne weiteres so gesteuert werden, dass die Isolation und Reinigung des gewünschten Produkts, der Proteine und Peptide, erleichtert wird. Daher stellt das vorliegende Verfahren ein rationelles Verfahren zur Verfügung, mit dem die Isolation und Reinigung von unterschiedlichen Proteinen und Peptiden mit kleinen Modifikationen eines allgemeinen Reinigungsverfahrens erzielt werden kann, wobei die Modifikationen dem Fachmann kein übermäßiges Experimentieren abverlangen.
  • Resuspension eines Pellets in einem mittels pH-Wert gesteuerten Puffer
  • Das durch Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert erhaltene Pellet enthält typischerweise ein Protein der Fraktion 1, nicht assemblierte Fusionsproteine und -peptide, Viren und andere Wirtsmaterialien. Es kann in Wasser oder in einer Pufferlösung mit dem gewünschten pH-Bereich oder ei nem pH-Wert, der an diesen Bereich angepasst ist, resuspendiert werden. Der optimale pH-Wert wird durch die interessante Endart bestimmt. In einigen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der pH-Wertbereich der Resuspension etwa 2,0 bis 4,0, wenn das gewünschte Produkt ein Fusionsprotein/peptid ist (siehe 1). Der Fachmann kann ohne weiteres eine geeignete Pufferlösung oder Säuren oder Basen auswählen, um den bestimmten pH-Wertbereich ohne übermäßiges Experimentieren zu erreichen. Je nach dem prozentualen Anteil an Feststoffen des Pellets, das als Ergebnis des ersten Zentrifugationsverfahrens gebildet wird, kann ein Resuspensionsvolumen auf eine Fraktion des anfänglichen grünen Saftvolumens eingestellt werden, typischerweise in Mengen der 10 bis 100-fachen Reduktion des ursprünglichen grünen Saftvolumens.
  • Isolation und Reinigung von löslichen Proteinen und Peptiden
  • Die Proteine der Fraktion 2 einschließlich rekombinante Proteine und Peptide bleiben nach der pH-Werteinstellung und Wärmebehandlung und Zentrifugation von grünem Saft löslich (siehe 1). Der das Protein der Fraktion 2 enthaltende Überstand hat genügend Proteine der Fraktion 1, Chloroplast und andere Wirtsmaterialien entfernt, um eine wirksame Isolation und Reinigung von Proteinen der Fraktion 2, besonders rekombinanten Proteinen und Peptiden, mittels Größenfraktionierung durch Ultrafiltration, Konzentration und Diafiltration, zu ermöglichen. Die Ultrafiltration wird typischerweise mittels einer MWCO (Molekulargewichtstrenngrenzen)-Membran im Bereich von etwa 1 bis 500 kD gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zuerst eine große MWCO-Membran verwendet, um die restlichen Viren und anderen Wirtsmaterialien herauszufiltern. Komponenten mit großem Molekulargewicht können in den Konzentraten bleiben. Filtrate, die die interessanten Proteine/Peptide enthalten, können wahlweise durch eine andere Ultrafiltrationsmembran hindurchgeleitet werden, typischerweise von kleinerem MWCO, so dass die Zielverbindung in den Konzentraten gesammelt werden kann. Zusätzliche Ultrafiltrationszyklen können falls notwendig ausgeführt werden, um die Reinheit der Zielverbindung zu verbessern. Die Wahl der MWCO-Größe und Ultrafiltrationsbedingungen hängt von der Größe der Zielverbindung ab und ist für den Fachmann eine offensichtliche Variation. Der Ultra filtrationsschritt führt generell zu einer etwa 10- bis 30-fachen oder höheren Reduktion des Verfahrensvolumens und ermöglicht, dass eine Diafiltration weiter unerwünschte molekulare Arten entfernt. Schließlich können interessante Proteine oder Peptide mittels Standardverfahren, wie beispielsweise Chromatographie, Salzpräzipitation, Lösungsmittelextraktionen einschließlich superkritische Fluide, wie beispielsweise CO2 und andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden.
  • Das vorliegende Isolationsverfahren wird dazu verwendet, erfolgreich einen sekretorischen IgA-Antikörper und a-Trichosanthin zu isolieren und zu konzentrieren. Die Verwendung soll auch speziell Ausführungsformen umfassen, wobei das interessante Peptid und Protein aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Faktor VIII, Faktor IX, tPA, Rezeptoren, Rezeptorantagonisten, Antikörper, einsträngige Antikörper, Enzyme, Neuropolypeptide, Insulin, Antigene, Vakzine, Peptidhormone, Calcitonin und humanes Wachstumshormon ausgewählt wird. In noch anderen Ausführungsformen kann das interessante lösliche Protein oder Peptid ein antimikrobielles Peptid oder Protein sein, das aus Protegrinen, Magaininen, Cecropinen, Melittinen, Indolicidinen, Defensinen, β-Defensinen, Cryptdinen, Clavaininen, Pflanzendefensinen, Nicin und Bactenecinen besteht. Diese und weitere interessante Proteine und Peptide können natürlich erzeugt oder durch rekombinante Verfahren in einer Pflanze erzeugt werden.
  • Das vorliegende Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Proteinen der Fraktion 2 stellt gegenüber den bekannten Verfahren wichtige Vorteile dar. Zuerst erfordert es keine Säurepräzipitation von F2-Proteinen. Die Säurepräzipitation im Stand der Technik kann unerwünscht sein, da viele Proteine denaturiert sein können oder ihre enzymatische oder biologische Wirksamkeit verlieren. Proteine der Fraktion 2 einschließlich rekombinante Proteine und Peptide werden in der vorliegenden Erfindung nicht in Pelletform zurückgehalten, wodurch das Risiko einer Proteindenaturierung minimiert wird. Das vorliegende Verfahren minimiert dadurch die Denaturierung von interessanten Proteinen und Peptiden. Weil die reichlichere Komponente, das Protein der Fraktion 1, während der frühen Reinigungsstufen ausgeschaltet wird, ermöglicht zweitens der nachgeschaltete Pro zess die Ultrafiltration von Proteinen der Fraktion 2. Die Ultrafiltration von Proteinen der Fraktion 2 erlaubt eine signifikante Reduktion des Verarbeitungsvolumens und ermöglicht eine schnelle Konzentration und Reinigung von Proteinen und Peptiden. Erwünschte Proteine und Peptide können durch das Molekulargewicht angereichert werden. Die schnelle Konzentration und Reinigung reduziert auch den Abbau oder die Denaturierung aufgrund von endogenen Proteaseaktivitäten oder schaltet diese aus. Die Ultrafiltration von Proteinen der Fraktion 2 ist mit den Verfahren des Standes der Technik nicht anwendbar. Schließlich erfordert die Konzentration von Proteinen der Fraktion 2 einschließlich rekombinanten Proteinen und Peptiden keine Lösungsmittel und keine zusätzlichen Chemikalien. Pflanzenprotein- und -peptidisolationsverfahren des Standes der Technik verwenden häufig Lösungsmittel, wie beispielsweise n-Butanol, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff, um Chloroplastmembranfragmente, Pigmente und andere wirtsbezogene Materialien auszuschalten. Solche Verfahren lassen sich nicht leicht im großen und kommerziell wertvollen Maßstab durchführen, da diese Verfahren Probleme bei der Sicherheit und Lösungsmittelentsorgung bereiten, was oft die Konstruktion von bestimmter Ausrüstung, die mit entzündlichen Fluiden kompatibel ist und daher die Anlagenlüftung und Schutzausrüstung für die Arbeiter bedingt.
  • Isolation und Reinigung von nicht assemblierten Fusionsproteinen und Fusionspeptiden
  • Während der Virusreplikation oder während des Verfahrens zur Isolation und Reinigung eines Virus kann sein Hüllprotein vom Virusgenom selbst abgelöst werden oder sich als nicht assembliertes Virus-Hüllprotein anreichern oder das Hüllprotein kann nie aufgenommen werden. Der Durchschnittsfachmann kann sich vergegenwärtigen, dass das Hüllprotein mittels eingerichteter rekombinanter Nukleinsäureprotokolle ausgebildet werden kann, um zur kommerziellen Gewinnung von Proteinen mit einer Mehrzahl von biochemischen Merkmalen absichtlich nicht assembliert zu werden. Dieses Hüllprotein kann eine rekombinante Komponente, die in das native Hüllprotein integriert ist, oder Fusionsproteine enthalten. Diese nicht assemblierten Fusionsproteine werden typischerweise im Pellet (P1) nach der Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert mit Protein der Fraktion 1 zusammen isoliert (siehe 1). Das Pellet kann dann erneut in Wasser oder in einem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis 4,0 und anschließender weiterer Zentrifugation suspendiert werden. Das nicht assemblierte Protein kann weiter gemäß herkömmlichen Verfahren einschließlich einer Aufeinanderfolge von Ultrafiltrations-, Zentrifugations- und Chromatographie-Schritten gereinigt werden. Das Fusionspeptid kann erhalten werden und sich daran eine chemische Spaltung des gewünschten Peptids oder Proteins vom Fusionspeptid (Fusionsproteine) anschließen. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
  • Das vorliegende Isolationsverfahren wird verwendet, um erfolgreich a-Amylase-Indolicidin-Fusionsprotein zu isolieren und konzentrieren. Die Erfindung soll auch speziell Ausführungsformen umfassen, wobei das Fusionsprotein oder -peptid ein Peptid oder Protein enthalten kann, das aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Faktor VIII, Faktor IX, tPA, Rezeptoren, Rezeptorantagonisten, Antikörper, einsträngige Antikörper, Enzyme, Neuropolypeptide, Insulin, Antigene, Vakzine, Peptidhormone, Calcitonin und humanes Wachstumshormon ausgewählt ist. In noch anderen Ausführungsformen kann das Protein oder Peptid, das im Fusionsprotein oder -peptid vorhanden ist, ein antimikrobielles Peptid oder Protein sein, das aus Protegrinen, Magaininen, Cecropinen, Melittinen, Indolicidinen, Defensinen, β-Defensinen, Cryptdinen, Clavaininen, Pflanzendefensinen, Nicin und Bactenecinen besteht.
  • Verteilung von Zuckern, Vitaminen, Alkaloiden und Aromen
  • Nach der Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert enthält der Überstand die Proteine der Fraktion 2, Viren und andere Materialien, einschließlich Zucker, Vitamine, Alkaloide und Aromen. Der dadurch erzeugte Überstand kann von dem pelletierten Protein der Fraktion 1 und anderen Wirtsmaterialien durch Zentrifugation abgetrennt werden.
  • Definitionen
  • Die folgenden Definitionen sollen zum noch klareren und einheitlicheren Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich des hier solchen Begriffen gegebenen Umfangs beitragen.
  • Ein „Virus" wird hier so definiert, dass es die Gruppe bestehend aus einem Virion aufweist, wobei das Virion eine infektiöse Nukleinsäuresequenz in Kombination mit einem oder mehr viralen Strukturproteinen umfasst; ein nicht infektiöses Virion, wobei das nicht infektiöse Virion eine nicht infektiöse Nukleinsäure in Kombination mit einem oder mehr viralen Strukturproteinen umfasst; und Aggregate von viralen Strukturproteinen, wobei es keine Nukleinsäuresequenz gibt oder in Kombination mit dem Aggregat gibt und wobei das Aggregat virusartige Partikel (VLPs) aufweisen kann. Die Viren können entweder natürlich vorkommen oder von rekombinanten Nukleinsäureverfahren abgeleitet sein und jede viral abgeleitete Nukleinsäure sein, die ob durch Konstruktion oder Auswahl zur Replikation in ganzen Pflanzen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen übernommen werden kann.
  • Eine „Viruspopulation" wird hier so definiert, dass sie ein oder mehr Viren umfasst, wie oben definiert, wobei die Viruspopulation aus einer homogenen Auswahl von Viren besteht oder wobei die Viruspopulation aus einer heterogenen Auswahl besteht, die eine Kombination und einen Anteil der Viren umfasst.
  • „Virusähnliche Partikel" (VLPs) werden hier als selbst assemblierende Strukturproteine definiert, wobei die Strukturproteine durch ein oder mehr Nukleinsäuresequenzen kodiert sind, wobei die Nukleinsäuresequenz(en) in das Genom eines viralen Wirtsvektors eingeführt wird.
  • „Protein und Peptide" sind als entweder natürlich vorkommende Proteine und Peptide oder rekombinante Proteine und Peptide definiert, die durch Transfektion oder transgene Transformation erzeugt werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter. Diese Beispiele sollen die vorliegende Erfindung nur veranschaulichen und sind nicht als einschränkend auszulegen. Die Beispiele sollen speziell die Gewinnung eines interessanten Virus, Proteins und Peptids veranschaulichen, die mittels des Verfahrens im Umfang der vorliegenden Erfindung erreicht werden können.
  • BEISPIEL 1
  • Protein der Fraktion 1 aus grünem Saft bei niedrigem pH-Wert pelletiert
  • Eine Tabakpflanze der Abart MD609 wurde 27 Tage nach dem Aussäen mit TMV 811 inokuliert. 40 Tage nach der Inokulation wurde die Pflanze geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (150 g) wurde mit 0,04 % Natriummetabisulfitlösung (150 ml) in einem 1 l Waring-Mischer vereinigt. Das Pflanzengewebe wurde mit hoher Drehzahl über einen Zeitraum von zwei Minuten gemahlen. Das sich ergebende Homogenat wurde durch vier Schichten Seihtuch gepresst und die gepresste Faser wurde verworfen. Das gesammelte Saftvolumen betrug 240 ml und sein pH-Wert war 5,57.
  • Unter ständigem Rühren wurde der pH-Wert langsam mit verdünnter Phosphorsäure (H3PO4) nach unten eingestellt. Eine Saftprobe (35 ml) wurde bei jedem der folgenden pH-Werte entnommen: pH 5,4, pH 5,3, pH 5,2, pH 5,1 und pH 5,0. Anschließend wurden alle Proben auf 45°C in einem Wasserbad erwärmt und 10 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Die Proben wurden dann auf 25°C in einem kalten Wasserbad gekühlt. Die gekühlten Proben wurden bei 10.000 × G 15 Minuten lang zentrifugiert.
  • Die Überstände (S1 in 1) wurden dekantiert und durch den Bradford-Assay und SDS-PAGE auf das Proteinniveau der Fraktion 1 analysiert. Das Virus wurde mit PEG präzipitiert und durch das Verfahren von Gooding, supra aus einem Teil jedes Überstands (25 ml) isoliert. Die Viruskonzentrationen wurden durch spektrophotometrische Analyse bei 260 nm bestimmt.
  • Tabelle 1. Gesamtproteinkonzentrationen und Virusausbeuten im S1-Teil nach dem Einstellen der grünen Säfte auf einen niedrigen pH-Wert und 10-minütigen Erwärmen auf 45°C.
    Figure 00200001
  • Ergebnisse:
  • Das durch das Verfahren von Bradford bestimmte Gesamtprotein, das im löslichen Teil (S1) zurückgehalten wurde, wie durch das Verfahren von Bradford nach Zentrifugation bestimmt, wird allmählich reduziert, wenn der pH-Wert des grünen Safts von 5,4 auf 5,0 nach unten eingestellt wird. Insbesondere zeigt bei einem pH-Wert des grünen Safts von 5,0 und anschließender Wärmebehandlung bei 45°C für 10 Minuten (als das „pH5,0/45°C-Verfahren" bezeichnet) die Menge an Protein der Fraktion 1, die in S1 verbleibt, eine über 5-fache Reduktion im Vergleich zum pH5,5/45°C-Verfahren. Mehr Protein der Fraktion 1 wird bei einem niedrigen pH-Wert des grünen Safts pelletiert. Die Löslichkeit des Virus in S1 bleibt jedoch unbeeinflusst.
  • Die folgenden Beispiele zeigen auch, dass, während das Protein der Fraktion 1 in diesem pH-Bereich pelletiert wird, die Mehrheit der Proteine der Fraktion 2 im Überstand verbleibt. Ein herkömmliches Verfahren zur Isolierung von löslichen Pflanzenproteinen stellt den pH-Wert von grünem Saft im Bereich von 5,3–6,0 ein, wodurch das Protein der Fraktion 1 nach der Zentrifugation zum Überstand dirigiert wird. Die pH-Werteinstellung von grünem Saft auf einen Wert unter 5,2 und anschließende mäßige Erwärmung ermöglicht im vorliegenden Verfahren daher die Trennung von Protein der Fraktion 1 und Fraktion 2 nach der Zentrifu gation von grünem Saft. Das Ausschalten des reichlichen Proteins der Fraktion 1 vom löslichen Teil vereinfacht die anschließende Isolation und Reinigung von Proteinen der Fraktion 2. Ein Ultrafiltrationsverfahren kann jetzt erfolgreich auf die Reinigung von Proteinen der Fraktion 2 angewendet werden. Dies ist ein merklicher Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, wo Protein der Fraktion 1 bis zur abschließenden Kristallisation oder Präzipitation vorzugsweise im löslichen Teil gehalten wird. Die Ultrafiltration in Gegenwart einer großen Menge an Protein der Fraktion 1 und anderer Wirtsmaterialien ist nicht effizient.
  • BEISPIEL 2
  • Verteilung des Virus von grünem Saft bei unterschiedlichen pH-Werten
  • In einem Gewächshaus gezogenes Nicotiana tabacum (KC8959) wurde mit einem TMV-Derivat (Hüllproteinschleifenfusion), TMV291, sieben Wochen nach der Saatkeimung inokuliert. Die Pflanzen wurden zwei ein halb Wochen nach der Inokulation nach dem systemischen Verbreiten des Virus geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (150 g) wurde in einem 1 l Waring-Mischer 2 Minuten bei großer Einstellung mit 0,04 % Na2S2O5 (150 ml) mazeriert. Das mazerierte Material wurde durch vier Schichten Seihtuch geseiht, um faseriges Material zu entfernen. Der verbleibende grüne Saft wurde mit H3PO4 auf die pH-Werte von 5,0, 4,8, 4,6, 4,4, 4,2 und 4,0 eingestellt. Grüne Saftaliquote von 30 ml wurden bei jedem pH-Wert zur Weiterverarbeitung entnommen. Alle grünen Saftproben mit eingestelltem pH-Wert wurden 15 Minuten bei 45°C in einem Wasserbad wärmebehandelt und dann auf 15°C gekühlt. Die Proben wurden in einem JS-13.1-Rotor bei 10.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert, was zu zwei Fraktionen führte, dem Überstand (S1) und das Pellet (P1) (siehe 1). Die Pellets wurden erneut in 15 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 suspendiert und in einem JS-13.1-Rotor bei 10.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert, was zu zwei Fraktionen führte, dem Überstand (S2) und das Pellet (P2), siehe 1. Das Virus wurde von beiden Überstandsfraktionen durch PEG-Präzipitation (8.000 Molekulargewicht PEG) gewonnen, wie von Gooding, supra beschrieben, und mittels spektrophotometrische Analyse bei 260 nm quantifiziert.
  • Tabelle 2. Verteilung von Virus in S1 und S2 bei unterschiedlichen grünen Saft pH-Werten
    Figure 00220001
  • Ergebnisse:
  • Dieses Beispiel untersucht die relative Virusverteilung im Überstand, S1 und S2, während der ersten bzw. zweiten Zentrifugation. S1 wird nach der pH-Werteinstellung von grünem Saft von 5,0 auf 4,0 und anschließender Wärmebehandlung und Zentrifugation erhalten. Das Pellet (P1) wird in einem Puffer (pH 7,2) resuspendiert und anschließend einer zweiten Zentrifugation unterworfen, die den Überstand (S2) erzeugt. Die Menge an Virus, das vom S1- und S2-Anteil gewonnen wird, ist bei einem pH-Wert von 5,0 für grünen Saft in Tabelle 2 ähnlich. Nach dem Senken des pH-Werts wandert aber das Virus allmählich vom Überstandsteil (S1) zum Pelletteil (P1) und taucht wieder in S2 auf. Bei einem pH-Wert von 4,0 in der Tabelle 2 ist die Menge an Virus, das aus dem S2-Teil isoliert wurde, über 100-fach höher als im S1-Teil. Der pH-Wert von grünem Saft und der pH-Wert der Resuspensionspuffers haben, wie gezeigt wurde, eine große Wirkung auf die relative Verteilung des Virus im Überstand oder Pellet wäh rend der Zentrifugation. Bei einem niedrigen pH-Wert, z.B. pH4,0/45°C-Verfahren und pH 7,2 Suspensionspuffer, kann das Virus quantitativ allein aus dem S2-Teil gewonnen werden. Dieses Verfahren konzentriert das Virus zu einer Fraktion. Das Einstellen des pH-Werts des grünen Safts und des Suspensionspuffers bietet ein Verfahren zur Steuerung der Verteilung von Virus an.
  • BEISPIEL 6
  • Isolation von rekombinantem Protein α-Trichosanthin mittels des pH5,0/45°C-Verfahrens
  • In einem Gewächshaus gezogenes Nicotiana benthamiana wurde mit TMV, das das für α-Trichosanthin kodierende Gen enthält, inokuliert. Die Pflanzen wurden zehn Tage nach der Inokulation nach systemischer Verbreitung des Virus geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (150 g) wurde in einem 1 l Waring-Mischer zwei Minuten lang bei großer Einstellung mit 0,04 % Na2S2O5 (150 ml) mazeriert. Das mazerierte Material wurde durch vier Schichten von Seihtuch geseiht, um faseriges Material zu entfernen. Der verbleibende grüne Saft wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Der grüne Saft mit eingestelltem pH-Wert wurde bei 45°C zehn Minuten lang in einem Wasserbad wärmebehandelt und dann auf 28°C gekühlt. Der wärmbehandelte Saft wurde in einem KA-12-Rotor (Kompspin, Sunnyvale, CA) bei 10.000 UpM (15,600 × G) 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand (S1) (50 ml Aliquote) wurde mittels 100 und 10 kD regenerierte MWCO-Cellulosemembranen in einer mittels Amicon® gerührten Zelle bei 50 PSI [3,4475 bar] einer Ultrafiltration unterworfen. Die 100 kD Permeatfraktion wurde dann über Filtration durch eine 10 kD Membran konzentriert und dreimal diafiltriert. Das α-Trichosanthin wird vom 10 kD Konzentrat gesammelt. Das 10 kD Permeat enthält die Zucker, Alkaloide, Aromen, Vitamine und Peptide unter 10 kD MG. Die relative Menge an α-Trichosanthin in grünem Saft, Überstand, 100 kD und 10 kD Konzentrate und die 100 bis 10 kD Fraktion wurde durch Western-Analyse mittels α-Trichosoanthin-Antikörper bestimmt.
  • Tabelle 6. α-Trichosanthinausbeute in einem pH 5,0/45°C-Verfahren
    Figure 00240001
  • Ergebnisse:
  • Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit, ein lösliches F2-Protein, α-Trichosanthin, mittels des pH5,0/45°C-Verfahrens und Ultrafiltration zu extrahieren und zu reinigen. Das α-Trichosanthin wurde quantitativ in der Überstands(S1)-Fraktion bezüglich der im grünen Saft vorhandenen Mengen (basierend auf Western Analyse) gehalten. Darüber hinaus wurde α-Trichosanthin, das im S1 vorhanden war, 6-fach bezüglich des grünen Safts (beruhend auf dem Bradford-Protein und Western Analyse) gereinigt.
  • In der S1-Fraktion vorhandenes α-Trichosanthin wurde quantitativ zurückgehalten und 4-fach durch Ultrafiltration mittels einer 10 kD MWCO-Membran konzentriert (50 ml S1 wurde auf 13,5 ml konzentriert und 96 % des α-Trichosanthins war im 10 kD Konzentrat auf der Basis einer Western Analyse vorhanden).
  • α-Trichosanthin wurde auch aus Proteinen mit großem Molekulargewicht und Viren mittels Ultrafiltration mit einer 100 kD MWCO-Membran gereinigt. Die 100 kD Konzentratfraktion wurde dreimal diafiltriert, um die Gewinnung von zusätzlichem α-Trichosanthin zu ermöglichen. Nach der 100 kD Konzentration und Dia filtration blieben nur 40,8 % des α-Trichosanthins im 100 kD Konzentrat zurück, was anzeigt, dass 59,2 % des α-Trichosanthins in der 100 kD Permeatfraktion vorhanden war. Die 100 kD Permeatfraktion wurde mittels einer 10 kD MWCO-Membran konzentriert. Das sich ergebende 10 kD Konzentrat (das vom 100 kD Permeat stammt) enthielt 34 % α-Trichosanthin bezüglich der Menge an α-Trichsoanthin, die in 50 ml der anfänglichen S1-Fraktion vorhanden war. Das in der 100-10 kD Fraktion vorhandene α-Trichosanthin wurde so bemessen, dass es bezüglich des grünen Safts (beruhend auf Bradford-Protein und Western Analyse) 8-fach gereinigt und 12,5-fach konzentriert wurde (50 ml S1 wurde auf 4,0 ml 100-10 kD Fraktion konzentriert).
  • BEISPIEL 7
  • Isolation von sekretorischem IgA-Antikörper von transgenen Pflanzen mittels des pH5,0/47°C-Verfahrens
  • Blatt- und Stängelgewebe (50 g Frischgewicht) von im Gewächshaus gezogenem, transgenem Tabak, der vier sekretorische IgA (SIgA)-Proteinkomponenten exprimiert, wurde in einem Virtis-Mischer zwei Minuten lang bei großer Einstellung mit 0,04 % Na2S2O5 (75 ml) mazeriert. Das mazerierte Material wurde durch vier Schichten Seihtuch geseiht, um faseriges Material zu entfernen. Der verbleibende grüne Saft wurde mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Der grüne Saft mit eingestelltem pH-Wert wurde bei 47°C zehn Minuten lang in einem Wasserbad wärmebehandelt und dann auf 28°C gekühlt. Der wärmebehandelte Saft wurde in einem JA-13.1-Rotor bei 3.000 UpM drei Minuten lang zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde mittels 10 kD regenerierter MWCO-Cellulosemembran (Amicon®, Centriprep®) einer Ultrafiltration unterworfen. Die relative Menge an SIgA im grünen Saft, Überstand und dem 10 kD Konzentrat wurde durch Western Analyse mittels eines mit der schweren Kette reaktionsfähigen Antikörpers bestimmt.
  • Tabelle 7. Sekretorisches IgA und andere, mit dem pH5,0/47°C-Verfahren gewonnene Proteine
    Figure 00260001
  • Ergebnisse:
  • Sekretorischer IgA-Antikörper, der in transgenen Pflanzen rekombinant erzeugt wurde, wurde erfolgreich in diesem Beispiel gewonnen. Nach der Einstellung des pH-Werts und der Wärmebehandlung wurde das Gesamtprotein im Überstand durch Zentrifugation um 85 % reduziert. Das SIgA im Überstand wurde gewonnen und ultrafiltriert, was zu einer 12-fachen Konzentration des Gesamtproteins und den SIgA-Komponenten führte.
  • BEISPIEL 8
  • Virusverteilung in kleinem Umfang mittels des pH5,0/45°C-Verfahrens und Ultra filtration
  • Auf dem Feld gezogener Tabak der Abart MD609, der mit TMV 261 infiziert war, wurde geerntet und bis zur Verwendung bei –20°C eingefroren. Das gefrorene Gewebe wurde in vier Chargen in einem 4-Liter Waring-Mischer gemahlen. In jeder Charge wurde das Pflanzengewebe (1500 g) drei Minuten lang bei hoher Drehzahl in 0,04%iger Natriummetabisulfitlösung (1500 ml) gemahlen. Die Homogenate wurden durch vier Schichten Seihtuch geseiht und die Säfte vereinigt, um ein Volumen von etwa 10 Litern zu ergeben.
  • Der pH-Wert des Safts wurde von einem Ausgangswert von 5,8 mittels konzentrierter Phosphorsäure (H3PO4) auf 5,0 eingestellt. Der Saft wurde dann mittels einer rostfreien Stahlspule, die mit heißem Leitungswasser erwärmt wurde, auf 45°C erwärmt. Nach dem Halten des Safts bei 45°C für 10 Minuten wurde er mit gekühltem Wasser mittels der Spule auf 25°C gekühlt. Der wärmebehandelte Saft wurde bei 12.000 × G fünf Minuten lang zentrifugiert und der sich ergebende Überstand wurde durch Miracloth® dekantiert.
  • Dieser Überstand wurde mit einer 100 kD regenerierten MWCO-Cellulose-Spiralultrafiltrationsmembran von 1 Qudratfuß (0,09 m2) verarbeitet. Bei einem Einlassdruck von 50 psi (3,45 bar) und einer Rezirkulationsrate von fünf Litern pro Minute wurde der Überstand auf etwa 5 % des Ausgangsvolumens konzentriert. Die Endkonzentration wurde aus der Ultrafiltrationsvorrichtung abgeleitet, und das System mit einem kleinen Wasservolumen gespült. Proben des Ausgangsüberstands, der Endkonzentration, Wasserspülung und des kombinierten Permeats wurden mittels Bradford-Analyse auf Proteine untersucht. Sie wurden auch mit PEG gemäß dem Verfahren nach Gooding, supra präzipitiert, um jeden vorhandenen Virus zu isolieren. Die Viruskonzentrationen wurden spektrophotometrisch bestimmt.
  • Tabelle 8. Proteinkonzentration und Virusausbeute im Überstand (S1) und anschließende Ultrafiltration
    Figure 00270001
  • Ergebnisse:
  • Der pH-Wert von grünem Saft wurde auf 5,0 eingestellt und der Saft wärmebehandelt und anschließend zentrifugiert. Der Virus (1,94 g) enthaltende Überstand wurde durch eine 100 kD MWCO-Membran gegeben. Das Virus (1,64 g) wurde quantitativ aus dem Konzentrat gewonnen. Proteine von kleinerer Größe wurden im Permeat gesammelt. Nur eine kleine Menge an Virus geht durch Ultrafiltration mittels einer 100 kD Membran auf das Permeat über.
  • BEISPIEL 10
  • Isolation von Virus und Protein der Fraktion 2 in großem Umfang mittels des pH5,0/47°C-Verfahrens
  • Auf dem Feld gezogener Tabak der Varietät KY8959 wurde mit TMV 291 inokuliert und zehn Wochen nach dem Aussetzen geerntet. Das Pflanzengewebe (8.093 Ibs [3.671 kg]) wurde in einem Reitz®-Desintegrator gemahlen und die Faser mittels einer Spindelpresse entfernt. Wasser wurde dem Desintegrator mit einer Rate von 120 Gallonen (530 l) pro Tonne (0,9 t) Tabak zugesetzt. Der Saft aus der Presse wurde in einem Rührbehälter gesammelt, wo der pH-Wert mit Phosphorsäure auf 5,0 eingestellt wurde. Der Saft mit eingestelltem pH-Wert wurde kontinuierlich durch einen Wärmetauscher gepumpt, so dass die Temperatur des Safts 47°C erreichte. Der erwärmte Saft wurde dann durch Halterohre gepumpt, wodurch sichergestellt ist, dass diese Temperatur mindestens 10 Minuten lang aufrechterhalten wurde.
  • Der behandelte Saft wurde dann einer Westfalia® SAMR 15037 Zentrifuge vom Scheibenstapeltyp bei einer Zuführrate von zehn Gallonen (37,9 l) pro Minute zugeführt. Insgesamt 760 Gallonen (2877 l) der 990 Gallonen (3748 l) Überstand, die während der Zentrifugation erzeugt wurden, wurden mittels Ultrafiltration durch eine 100 kD MWCO-Celluloseacetat-Spiralmembran von 1.000 Quadratfuß (92,9 m2) auf 32 Gallonen (121 l) konzentriert. Das Virus (213 g) wurde aus der 100 kD Konzentratfraktion mittels PEG(8.000 Molekulargewicht)-Präzipitation, wie von Gooding, supra beschrieben, gereinigt. Die löslichen Proteine der Fraktion 2 (< 100 kD), die sich im 100 kD Filtrationspermeat befanden, wurden mittels Ultrafiltration durch 10 kD regenerierte Cellulose-MWCO-Spiralmembran von 40 Quadratfuß (3,72 m2) konzentriert. Insgesamt 60 Gallonen (227 l) 100 kD Per meat wurde auf 3,5 Gallonen (13,3 l) konzentriert, was 1,69 g lösliche Proteine der Fraktion 2 ergab.
  • Dieses Beispiel zeigt erfolgreich ein groß angelegtes Verfahren zur Isolation und Reinigung von Proteinen der Fraktion 2 und Virus mittels eines pH5,0/47°C-Verfahrens. In der ersten Zentrifugation wird eine Überstandsfraktion erzeugt, die sowohl das Virus als auch andere lösliche Proteine enthält. Es ist möglich, eine Ultrafiltration anzuwenden, um das Virus und die löslichen Proteine der Fraktion 2 zu konzentrieren und trennen, wobei das Virus im Konzentrat einer MWCO-Membran mit großem Molekulargewicht und die Proteine der Fraktion 2 im Permeat verbleiben. Proteine der Fraktion 2 können weiter dadurch gereinigt und konzentriert werden, dass sie durch eine WMCO-Membran mit kleinerem Molekulargewicht gegeben werden, wo unterschiedliche Größen von Proteinen der Fraktion 2 einzeln erhalten werden können. Das Protein der Fraktion 2 und das Virus können mit hohen Ausbeuten mittels des vorliegenden Verfahrens in großem Umfang gewonnen werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001

Claims (19)

  1. Verfahren zum Erhalten eines Proteins oder Peptids aus einer Pflanze, umfassend die aufeinander folgenden Schritte: (a) Homogenisieren einer Pflanze oder eines Pflanzengewebes zur Erzeugung eines grünen Safts; (b) Einstellen des pH-Werts des grünen Safts auf unter oder gleich 5,2; (c) Erwärmen des grünen Safts auf eine minimale Temperatur von 45°C; (d) Zentrifugieren des grünen Safts zur Erzeugung eines Überstands und eines Pellets; und (e) Reinigen des Proteins oder Peptids von dem Überstand und Pellet; wobei im Schritt (d) das Protein der Fraktion 1 durch die Zentrifugation pelletiert wird und die Proteine der Fraktion 2 im Überstand von Überstand und Pellet verbleiben.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts auf zwischen 4,0 und 5,2 eingestellt wird.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der grüne Saft auf eine Temperatur zwischen 45°C und 50°C erwärmt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Protein oder Peptid durch rekombinante Verfahren erzeugt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein oder Peptid ein lösliches Protein oder Peptid ist und wobei im Schritt (e) das lösliche Protein oder Peptid aus der Überstandsfraktion von Überstand und Pellet, die im Schritt (d) erzeugt wurden, gereinigt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts auf etwa 5,0 eingestellt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei die Überstandsfraktion von Überstand und Pellet, die im Schritt (d) erzeugt wurden, weiter einer Ultrafiltration unterworfen wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Ultrafiltration ein Permeat erzeugt, das ein oder mehr Moleküle umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Polysacchariden, Vitaminen, Alkaloiden, Geschmacksverbindungen und Peptiden ausgewählt sind.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 8, weiter umfassend den Schritt des Unterwerfens eines durch die Ultrafiltration erzeugten Permeats einer zweiten Ultrafiltration.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zweite Ultrafiltration ein Permeat erzeugt, das Moleküle enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Polysacchariden, Vitaminen, Alkaloiden, Geschmacksverbindungen und Peptiden ausgewählt sind.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, weiter umfassend den Schritt des Reinigens eines Konzentrats, das aus der zweiten Ultrafiltration resultiert.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Reinigen eines Konzentrats mittels Chromatographie, eines auf Affinität beruhenden Reinigungsverfahrens oder Salzpräzipitation durchgeführt wird.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, wobei das lösliche Protein oder Peptid aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, II-12, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Faktor VIII, Faktor IX, tPA, Rezeptoren, Rezeptorantagonisten, Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern, Enzymen, Neuropolypeptiden, Insulin, Antigenen, Impfstoffen, Peptidhormonen, Calcitonin und menschlichem Wachstumshormon ausgewählt ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, wobei das lösliche Protein oder Peptid ein antimikrobielles Peptid oder Protein ist und aus der Gruppe bestehend aus Protegrinen, Magaininen, Cecropinen, Melittinen, Indolicidnen, Defensinen, β-Defensinen, Cryptdinen, Clavaininen, Pflanzendefensinen, Nicin und Bactenecinen ausgewählt ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein oder Peptid ein Fusionsprotein oder Fusionspeptid ist, wobei im Schritt (e) das Fusionsprotein oder Fusionspeptid aus dem Pellet von Überstand und Pellet, die im Schritt (d) erzeugt wurden, gereinigt wird und wobei der Schritt (e) die nachstehenden, aufeinander folgenden Schritte umfasst: (i) Resuspendieren des Pellets in einer flüssigen Lösung; (ii) Einstellen des pH-Werts der flüssigen Lösung, umfassend das resuspendierte Pellet, auf zwischen pH 2,0 und pH 4,0; (iii) Zentrifugieren der flüssigen Lösung, enthaltend das resuspendierte Pellet; und (iv) Reinigen des Fusionsproteins oder Fusionspeptids.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein oder Peptid ein Fusionsprotein oder Fusionspeptid ist, wobei im Schritt (e) das Fusionsprotein oder Fusionspeptid aus dem Pellet von Überstand und Pellet, die im Schritt (d) erzeugt wurden, gereinigt wird und wobei der Schritt (e) die nachstehenden, aufeinander folgenden Schritte umfasst: (i) Resuspendieren des Pellets in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen pH 2,0 und pH 4,0; (ii) Zentrifugieren der flüssigen Lösung, enthaltend das resuspendierte Pellet; und (iii) Reinigen des Fusionsproteins oder Fusionspeptids.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, wobei das Reinigen mit mindestens einem Verfahren durchgeführt wird, das aus der Gruppe bestehend aus Chromatographie, Ultrafiltration, einem auf Affinität beruhenden Reinigungsverfahren und Salzpräzipitation ausgewählt wird.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Fusionsprotein oder Fusionspeptid ein Peptid oder Protein umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, II-12, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Faktor VIII, Faktor IX, tPA, Rezeptoren, Rezeptorantagonisten, Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern, Enzymen, Neuropolypeptiden, Insulin, Antigenen, Impfstoffen, Peptidhormonen, Calcitonin und menschlichem Wachstumshormon ausgewählt ist.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Fusionsprotein oder Fusionspeptid ein antimikrobielles Peptid oder antimikrobielles Protein umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Protegrinen, Magaininen, Cecropinen, Melittinen, Indolicidinen, Defensinen, β-Defensinen, Cryptdinen, Clavaininen, Pflanzendefensinen, Nicin und Bactenecinen ausgewählt ist.
DE69928379T 1998-03-10 1999-03-09 Verfahren zur reinigung und isolierung von wasserlöslichen peptiden und proteinen aus pflanzenquellen Expired - Fee Related DE69928379T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/037,751 US6037456A (en) 1998-03-10 1998-03-10 Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US37751 1998-03-10
PCT/US1999/005056 WO1999046288A2 (en) 1998-03-10 1999-03-09 A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69928379D1 DE69928379D1 (de) 2005-12-22
DE69928379T2 true DE69928379T2 (de) 2006-08-03

Family

ID=21896116

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69928379T Expired - Fee Related DE69928379T2 (de) 1998-03-10 1999-03-09 Verfahren zur reinigung und isolierung von wasserlöslichen peptiden und proteinen aus pflanzenquellen
DE69934269T Expired - Fee Related DE69934269T2 (de) 1998-03-10 1999-03-09 Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Viren, aus Pflanzenquellen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69934269T Expired - Fee Related DE69934269T2 (de) 1998-03-10 1999-03-09 Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Viren, aus Pflanzenquellen

Country Status (9)

Country Link
US (5) US6037456A (de)
EP (2) EP1062235B1 (de)
JP (1) JP2002506080A (de)
KR (1) KR20010034565A (de)
AT (2) ATE346861T1 (de)
AU (1) AU747647B2 (de)
CA (1) CA2322616C (de)
DE (2) DE69928379T2 (de)
WO (1) WO1999046288A2 (de)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660500B2 (en) * 1988-02-26 2003-12-09 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US6846968B1 (en) * 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US6639050B1 (en) 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US7378506B2 (en) * 1997-07-21 2008-05-27 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US20020197249A1 (en) * 2001-04-10 2002-12-26 Renal Tech International Devices, systems, and methods for reducing levels of pro-inflammatory or anti-inflammatory stimulators or mediators in blood products
US6303848B1 (en) 1998-01-16 2001-10-16 Large Scale Biology Corporation Method for conferring herbicide, pest, or disease resistance in plant hosts
US20020164585A1 (en) * 1998-01-16 2002-11-07 Sean Chapman Method for enhancing RNA or protein production using non-native 5' untranslated sequences in recombinant viral nucleic acids
US20030027173A1 (en) * 1998-01-16 2003-02-06 Della-Cioppa Guy Method of determining the function of nucleotide sequences and the proteins they encode by transfecting the same into a host
US6426185B1 (en) 1998-01-16 2002-07-30 Large Scale Biology Corporation Method of compiling a functional gene profile in a plant by transfecting a nucleic acid sequence of a donor plant into a different host plant in an anti-sense orientation
US6906172B2 (en) * 1998-03-10 2005-06-14 Large Scale Biology Corporation Flexible processing apparatus for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US6037456A (en) * 1998-03-10 2000-03-14 Biosource Technologies, Inc. Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US6303575B1 (en) * 1998-05-12 2001-10-16 The Regents Of The University Of California Indolicidin analogs and methods of using same
WO2001019969A1 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Large Scale Biology Corporation A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US6730306B1 (en) 2000-03-08 2004-05-04 Large Scale Biology Corporation Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions
US20020061309A1 (en) * 2000-03-08 2002-05-23 Garger Stephen J. Production of peptides in plants as N-terminal viral coat protein fusions
JP3936661B2 (ja) 2001-01-18 2007-06-27 アイコン・ジェネティクス，インコーポレイテッド タンパク質を検出または精製するためのウィルスの使用
WO2002099067A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Oishi Karen K Gene expression and production of tgf-b proteins including bioactive mullerian inhibiting substance from plants
EP1461620A4 (de) * 2001-12-05 2005-02-02 Large Scale Biology Corp Flexibles verfahren und gerät zur produktion und reinigung mehrerer proteine mit hohem durchsatz
US8277852B2 (en) 2002-01-25 2012-10-02 Akzo Nobel Surface Chemistry Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
US7442391B2 (en) 2002-01-25 2008-10-28 Integrated Botanical Technologies, Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
AU2003237528A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Kentucky Bioprocessing, Llc Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
US6920521B2 (en) * 2002-10-10 2005-07-19 International Business Machines Corporation Method and system of managing virtualized physical memory in a data processing system
EP1629090B1 (de) * 2002-11-06 2014-03-05 iBio, Inc. Expression von fremdsequenzen in pflanzen unter verwendung eines trans-aktivierungssystems
US7692063B2 (en) * 2002-11-12 2010-04-06 Ibio, Inc. Production of foreign nucleic acids and polypeptides in sprout systems
US7683238B2 (en) * 2002-11-12 2010-03-23 iBio, Inc. and Fraunhofer USA, Inc. Production of pharmaceutically active proteins in sprouted seedlings
US7491509B2 (en) 2003-02-03 2009-02-17 Fraunhofer Usa, Inc. System for expression of genes in plants
CN103074316B (zh) 2003-05-22 2015-10-21 美国弗劳恩霍夫股份有限公司 用于表达、传递及纯化目标多肽的重组载体分子
EP1722805B1 (de) * 2004-01-12 2014-03-26 Akzo Nobel Surface Chemistry LLC Bioaktive zusammensetzungen aus theacea-pflanzen sowie verfahren zu deren produktion und verwendung
US20060148680A1 (en) * 2004-01-14 2006-07-06 Kieliszewski Marcia J Glycoproteins produced in plants and methods of their use
AU2005216133A1 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Fraunhofer Usa, Inc. Systems and methods for clonal expression in plants
CA2573918A1 (en) * 2004-04-19 2005-11-24 Ohio University Cross-linkable glycoproteins and methods of making the same
US20060288449A1 (en) * 2004-10-12 2006-12-21 Garger Stephen J Process for purifying target compounds from plant sources using ceramic filtration
US7157644B2 (en) * 2004-12-16 2007-01-02 General Cable Technology Corporation Reduced alien crosstalk electrical cable with filler element
MX2007008132A (es) 2004-12-30 2007-07-20 Schering Plough Ltd Vacuna para aumentar el crecimiento basada en epitopes neutralizantes.
US20080242834A1 (en) * 2005-07-08 2008-10-02 Ohio University Methods of Predicting Hyp-Glycosylation Sites For Proteins Expressed and Secreted in Plant Cells, and Related Methods and Products
EP1919504B1 (de) * 2005-08-03 2013-10-16 iBio, Inc. Antikörper gegen bacillus anthracis protektiv antigen
CN101454347B (zh) * 2006-02-13 2013-07-24 美国弗劳恩霍夫股份有限公司 流感抗原、疫苗组合物和相关方法
EP1984388B1 (de) * 2006-02-13 2016-07-06 iBio, Inc. Hpv-antigene, impfstoffzusammensetzungen und zugehörige verfahren
US8277816B2 (en) * 2006-02-13 2012-10-02 Fraunhofer Usa, Inc. Bacillus anthracis antigens, vaccine compositions, and related methods
GB0605684D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Sicor Biotech Uab Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor
EP2839837B1 (de) * 2006-09-15 2019-05-08 Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. Onkolytisches farmington rhabdovirus
WO2008100578A2 (en) * 2007-02-14 2008-08-21 Amgen Inc. Method of isolating antibodies by precipitation
BRPI0810865A2 (pt) * 2007-04-28 2017-05-09 Fraunhofer Usa Inc antígenos de tripanossoma, composições vacinais, e métodos relacionados
US8404252B2 (en) 2007-07-11 2013-03-26 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
BRPI0815662A2 (pt) * 2007-08-20 2016-09-27 Fraunhofer Usa Inc vacinas, antígenos, composições, e métodos profilácticos e terapêuticos para gripe
WO2010037046A1 (en) 2008-09-28 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
WO2011041391A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods
WO2011130119A2 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Millipore Corporation Methods of producing high titer, high purity virus stocks and methods of use thereof
US9220295B2 (en) * 2010-12-01 2015-12-29 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco separation process for extracting tobacco-derived materials, and associated extraction systems
JP6007463B2 (ja) * 2011-04-18 2016-10-12 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 薬剤送達粒子及びその製造方法
US9315831B2 (en) 2012-03-30 2016-04-19 Danisco Us Inc. Direct starch to fermentable sugar as feedstock for the production of isoprene, isoprenoid precursor molecules, and/or isoprenoids
CA2865618A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Danisco Us Inc. Direct starch to fermentable sugar
US9301544B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 R.J. Reynolds Tobacco Company Protein-enriched tobacco-derived composition
US9175052B2 (en) * 2013-05-17 2015-11-03 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived protein compositions
CN103543264B (zh) * 2013-11-05 2015-10-07 广西大学 淮山药x病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
PT3201336T (pt) 2014-10-01 2021-10-27 Impossible Foods Inc Método e aparelho para a produção de uma placa de gesso
US20170165252A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Niconovum Usa Inc. Protein-enriched therapeutic composition
US11612183B2 (en) 2015-12-10 2023-03-28 R.J. Reynolds Tobacco Company Protein-enriched tobacco composition
US10499684B2 (en) 2016-01-28 2019-12-10 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived flavorants
US10155176B1 (en) 2016-11-03 2018-12-18 Healer, LLC Process for the production of a concentrated cannabinoid product
US11091446B2 (en) 2017-03-24 2021-08-17 R.J. Reynolds Tobacco Company Methods of selectively forming substituted pyrazines
US20180362957A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 R. J. Reynolds Tobacco Company RuBisCO Protein-Based Films
US10745682B2 (en) 2017-06-14 2020-08-18 R.J. Reynolds Tobacco Company Method of producing RuBisCO protein fibers
US10757964B2 (en) 2017-07-20 2020-09-01 R.J. Reynolds Tobacco Company Purification of tobacco-derived protein compositions
US11051532B2 (en) 2017-09-22 2021-07-06 Impossible Foods Inc. Methods for purifying protein
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
EP3806629A4 (de) 2018-06-12 2022-05-04 Kentucky Bioprocessing, Inc. Virus- und antigenreinigung und -konjugation
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
EP3911167A1 (de) 2019-01-18 2021-11-24 R. J. Reynolds Tobacco Company Reinigung von rubisco-protein aus pflanzen

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2593540A (en) 1945-09-01 1952-04-22 American Viscose Corp Semipermeable membrane
US2610932A (en) 1950-07-27 1952-09-16 Laval Separator Co De Clarification of sugar cane juice
BE608328A (de) 1960-09-19
GB1128336A (en) * 1964-09-28 1968-09-25 Budapesti Mueszaki Egyetem Plant extract
US3342729A (en) 1964-12-09 1967-09-19 Dow Chemical Co Permeability separatory cell and apparatus and method of using the same
US4083732A (en) 1965-01-11 1978-04-11 Paley Lewis A Sugar juice treatment
US3298865A (en) 1966-04-18 1967-01-17 Bode Harold Eli Crude sugar liquor defecation process
GB1350261A (en) 1970-10-16 1974-04-18 Hitachi Shipbuilding Eng Co Sugar refining process
SU654149A3 (ru) 1971-05-28 1979-03-25 Kohler George O Способ получени протеиновой кормовой добавки из зеленой массы
US3914410A (en) 1972-06-13 1975-10-21 Bristol Myers Co Method for preparing sucrose composition containing chromium III salt
ZA752191B (en) 1974-04-17 1976-11-24 Dorr Oliver Inc Treatment of raw sugar juice
US4006078A (en) 1974-07-08 1977-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Preparation of soluble edible protein from leafy green crops
JPS5912278B2 (ja) 1976-04-01 1984-03-22 三井製糖株式会社 甘庶汁から栄養糖を製造する方法
US4006633A (en) 1976-04-22 1977-02-08 Bethlehem Steel Corporation Method and apparatus for determining heat removal from a continuous caster
HU174943B (hu) * 1976-06-30 1980-04-28 Vepex Foevallalkozasi Iroda Rt Sposob poluchenija koncentratov rastitel'nogo belka i pigmenta
US4156618A (en) 1976-09-07 1979-05-29 Asahi-Dow Limited Process for separating ketoses and aldoses
CA1028552A (en) 1976-09-30 1978-03-28 Edward D. Murray Protein product and process for preparing same
US4250197A (en) * 1976-10-25 1981-02-10 Vepex Fovallalkopasi Iroda Rt. Method for processing plant protein
US4130553A (en) * 1977-01-05 1978-12-19 Batley Jr William R Process for improving the nutritional value of green plant protein
US4234350A (en) 1979-05-07 1980-11-18 Davies Hamakua Sugar Co., A Division Of Theo. H. Davies, Ltd. Process for the purification of evaporated sugar solutions
US4268632A (en) * 1979-09-24 1981-05-19 Leaf Proteins, Inc. Process for isolation of ribulose 1,5-diphosphate carboxylase from plant leaves
US4347324A (en) * 1979-09-24 1982-08-31 Leaf Proteins, Inc. Process for isolation of proteins from plant leaves
US4289147A (en) * 1979-11-15 1981-09-15 Leaf Proteins, Inc. Process for obtaining deproteinized tobacco freed of nicotine and green pigment, for use as a smoking product
US4359530A (en) 1980-09-08 1982-11-16 Aluminum Company Of America Protein extraction from green crops
FR2490676B1 (fr) * 1980-09-19 1985-07-19 Rhone Poulenc Spec Chim Procede d'epuration des jus de canne a sucre
US4400471A (en) * 1980-11-03 1983-08-23 Johal Sarjit S Preparation and crystallization of Fraction I protein from plant sources
US4334024A (en) * 1980-11-03 1982-06-08 Sarjit Johal Preparation and crystallization of fraction I protein from plant sources
US4396763A (en) * 1981-01-14 1983-08-02 Meiji Milk Products Company Limited High molecular polysaccharide MPS-80
FI61988C (fi) 1981-01-28 1982-11-10 Vehnae Ab Oy Foerfarande foer fraktionering av spannmaolsmjoel till fraktioner av livsmedelskvalitet
SU946488A1 (ru) * 1981-02-27 1982-07-30 Центральный Научно-Исследовательский И Проектно-Технологический Институт Механизации И Электрификации Животноводства Южной Зоны Ссср Способ получени протеинового концентрата из сока зеленых растений
US4370267A (en) * 1981-08-10 1983-01-25 A. E. Staley Manufacturing Company Fractionation and isolation of 7S and 11S protein from isoelectrically precipitated vegetable protein mixtures
US4430849A (en) 1981-11-03 1984-02-14 Powell Manufacturing Co. Harvester for tea or the like
US5320953A (en) * 1982-08-12 1994-06-14 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Process for synthesizing human H1-prorelaxin, H1-relaxin and fusion proteins thereof
US4963356A (en) 1982-10-13 1990-10-16 Minnesota Mining And Manufacturing Company Stable antigenic extracts methods
US4885248A (en) * 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US5173410A (en) * 1984-02-15 1992-12-22 Lubrizol Genetics Inc. Transfer vector
DE3407364A1 (de) 1984-02-29 1985-08-29 Pfeifer & Langen, 5000 Köln Naturbelassener vollrohrzucker und verfahren zu seiner herstellung
US5466788A (en) * 1985-03-07 1995-11-14 Mycogen Plant Science, Inc. Subgenomic promoter
CA1288073C (en) * 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
JPS61212217A (ja) 1985-03-18 1986-09-20 日本たばこ産業株式会社 タバコ葉収穫用脱葉装置
US5597945A (en) * 1986-07-25 1997-01-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Plants genetically enhanced for disease resistance
ES2060646T3 (es) * 1987-02-09 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Virus rna hibrido.
US5316931A (en) * 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US4950332A (en) 1988-03-17 1990-08-21 The Dow Chemical Company Process for decolorizing aqueous sugar solutions via adsorbent resins, and desorption of color bodies from the adsorbent resins
US4871397A (en) 1988-05-09 1989-10-03 The Dow Chemical Company Process for decolorizing aqueous sugar solution
US4968353A (en) 1988-07-15 1990-11-06 C. Itoh Sugar Co., Ltd. Method for refining sugar liquor
US5498544A (en) 1988-11-10 1996-03-12 Regents Of The University Of Minnesota Method and an acetyl CoA carboxylase gene for conferring herbicide tolerance
US5077390A (en) * 1989-04-04 1991-12-31 Genelabs, Incorporated Purified trichosanthin and method of preparation
PT92072B (pt) 1989-10-23 1995-06-30 Rar Refinarias Acucar Reunidas Processo para descoloracao e descalcificacao de solucoes de acucar
US5281279A (en) 1991-11-04 1994-01-25 Gil Enrique G Process for producing refined sugar from raw juices
US5301694A (en) * 1991-11-12 1994-04-12 Philip Morris Incorporated Process for isolating plant extract fractions
ATE166158T1 (de) * 1992-07-24 1998-05-15 Us Health Peptide brauchbar als microsequezierungsstandard und verfahren zu ihrer anwendung
US5605919A (en) * 1993-02-26 1997-02-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Treatment for viral diseases
FR2707997B1 (fr) 1993-07-19 1995-09-29 Applexion Ste Nle Rech Applic Procédé de raffinage d'un sucre brut, notamment de sucre roux provenant de l'industrie sucrière de la canne à sucre.
US5554227A (en) 1993-11-12 1996-09-10 Societe Nouvelle De Recherches Et D'applications Industrielles D'echangeurs D'ions Applexion Process of manufacturing crystal sugar from an aqueous sugar juice such as cane juice or sugar beet juice
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US5468300A (en) 1994-04-07 1995-11-21 International Food Processing Incorporated Process for producing refined sugar directly from sugarcane
US6096136A (en) 1996-10-18 2000-08-01 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method for producing white sugar
RU2114177C1 (ru) 1997-06-02 1998-06-27 Товарищество с ограниченной ответственностью Центр содействия развитию новых технологий "Кантэк" Способ производства сахарного сиропа из сахаросодержащего сырья
US6037456A (en) 1998-03-10 2000-03-14 Biosource Technologies, Inc. Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
JPH11313634A (ja) 1998-03-12 1999-11-16 Internatl Flavors & Fragrances Inc <Iff> 呈味剤とその製造方法
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6174378B1 (en) 1999-08-19 2001-01-16 Tate Life Industries, Limited Process for production of extra low color cane sugar
US6730306B1 (en) * 2000-03-08 2004-05-04 Large Scale Biology Corporation Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions
US6479636B1 (en) 2000-04-11 2002-11-12 Honiron Corporation (A Louisiana Corporation) Sugarcane fractioning system
WO2002083715A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Honiron Corporation Method and apparatus for fractional separation of proteins from plant material

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002506080A (ja) 2002-02-26
DE69934269T2 (de) 2007-09-20
WO1999046288A2 (en) 1999-09-16
EP1561758B1 (de) 2006-11-29
DE69928379D1 (de) 2005-12-22
US6740740B2 (en) 2004-05-25
EP1561758A1 (de) 2005-08-10
US20030049813A1 (en) 2003-03-13
WO1999046288A3 (en) 2000-01-20
US20040171813A1 (en) 2004-09-02
CA2322616C (en) 2008-05-27
US6303779B1 (en) 2001-10-16
AU747647B2 (en) 2002-05-16
DE69934269D1 (de) 2007-01-11
EP1062235A2 (de) 2000-12-27
US6037456A (en) 2000-03-14
CA2322616A1 (en) 1999-09-16
EP1062235B1 (de) 2005-11-16
US6033895A (en) 2000-03-07
KR20010034565A (ko) 2001-04-25
ATE346861T1 (de) 2006-12-15
ATE310017T1 (de) 2005-12-15
AU3072599A (en) 1999-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69928379T2 (de) Verfahren zur reinigung und isolierung von wasserlöslichen peptiden und proteinen aus pflanzenquellen
DE60221051T2 (de) Herstellung von peptiden und proteinen durch anhäufung in vom endoplasmatischen reticulum abgeleiteten proteinkörpern
DE69535557T2 (de) Verfahren zur herstellung von schutzproteine enthaltende immunoglobuline und ihre verwendung
DE69533964T2 (de) Orale immunisierung durch verwendung von transgenen pflanzen
DE69535314T2 (de) Modifizierte Pflanzenviren als Vektore für Heterologe Peptide
EP0011243B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Membranproteinen aus Neisseria meningitidis und diese enthaltende Vaccine
EP1427817B1 (de) Vermehrung von viren in zellkultur
EP0267159A2 (de) Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
JPS63500425A (ja) 分子ファ−ミング
US6414124B1 (en) Methods for the isolation of proteinase inhibitor proteins from potato tubers
WO2016204120A1 (ja) 竹発酵抽出物の製造方法及び免疫賦活剤
ES2336861T3 (es) Produccion de il-10 en biorreactor de planta de cultivo no alimenticia.
DE4313620A1 (de) Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
DE60125170T2 (de) In pflanzen erzeugte rekombinante proteinuntereinheit eines parvovirus vom schwein
CN113354748B (zh) 一种铁皮石斛叶多糖及其制备和应用
DE112006000559T5 (de) Verfahren zur Expression und Anreicherung eines Peptids in einer Pflanze
EP0787804B1 (de) Verfahren zur Synthese von löslichen, rekombinanten Proteinen aus Bakterienzellen
CN114634948A (zh) 利用枸杞作为烟草花叶病毒瞬时表达外源蛋白的生物反应器
WO2001019969A1 (en) A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
EP0321606A1 (de) Zelluläre amphipatische Proteine in aggregierten Formen und Verfahren zur Herstellung und Reinigung diese Proteine
KR102677058B1 (ko) 식물 발현 바이러스유사입자를 이용한 바리과 신경괴사증 예방백신 조성물
DE967241C (de) Verfahren zum Trennen von lebendem Virus von virusfremden Eiweissstoffen
DE102016204033A1 (de) Maßnahmen und Methoden zur Schadtierbekämpfung
AU2006203434A1 (en) A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
EP0149430A1 (de) Verfahren zur Herstellung chimärer DNS

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: KENTUCKY BIOPROCESSING LLC, OWENSBORO, KY, US

8339 Ceased/non-payment of the annual fee