DE69934269T2 - Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Viren, aus Pflanzenquellen - Google Patents

Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Viren, aus Pflanzenquellen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation und Reinigung von in Pflanzen erzeugten Viren. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung in großem Umfang anwendbar.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Pflanzenproteine und -enzyme werden seit langem für viele Zwecke benutzt, die von brauchbaren Nahrungsquellen bis zu biokatalytischen Reagenzien oder therapeutischen Wirkstoffen reichen. Im letzten Jahrzehnt hat die Entwicklung von transgenen und transfizierten Pflanzen und die Verbesserung der genetischen Analyse diesen Anwendungen eine erneute wissenschaftliche Bedeutung und wirtschaftliche Anreize verschafft. Die Konzepte der molekularen Pflanzenzucht und molekularen Pflanzenwirtschaft, bei denen ein Pflanzensystem als Bioreaktor zur Erzeugung von rekombinanten bioaktiven Materialien verwendet wird, wurden mit großer Aufmerksamkeit verfolgt.
  • Viele Beispiele in der Literatur haben die Nützlichkeit von Pflanzen oder Kulturpflanzenzellen zur Erzeugung von aktiven, von Säugetieren stammenden Proteinen, Enzymen, Vakzinen, Antikörpern, Peptiden und anderen bioaktiven Arten gezeigt. Es wurde ein Verfahren zur Erzeugung von antiviralen Vakzinen durch Expression eines viralen Proteins in transgenen Pflanzen beschrieben (Mason u.a., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 5335–5340 (1996)). Es wurde gezeigt, dass das Kapsidprotein des Norwalk-Virus, einem Virus, das beim Menschen eine epidemische akute Gastroenteritis verursacht, sich bei Expression in transgenem Tabak und Kartoffeln selbst zu virusartigen Partikeln zusammensetzt. Sowohl die gereinigten virusähnlichen Partikel als auch die transgenen Kartoffelknollen stimulierten beim Verfüttern an Mäuse die Antikörperproduktion gegen das Nor walk-Virus-Kapsidprotein. Alternativ kann die Produktion und Reinigung eines Vakzins durch Konstruktion eines Pflanzenvirus, das ein pathogenes Säugetierepitop trägt, erleichtert werden. Durch Verwendung eines Pflanzenvirus wird die zufällige Ausbreitung eines virulenten Virus über das Vakzin ausgeschaltet und dasselbe Pflanzenvirus kann zur Vakzinierung von mehreren Wirten verwendet werden. Zum Beispiel waren malariaverseuchte Epitope an der Oberfläche eines rekombinanten Tabakmosaikvirus (TMV) vorhanden (Turpen u.a. BioTechnology 13: 53–57 (1995)). Ausgewählte B-Zell-Epitope wurden entweder in den Oberflächenschleifenbereich des TMV-Hüllproteins eingesetzt oder in den C-Terminus fusioniert. Nach der Infektion enthalten Tabakpflanzen hohe Titer an rekombinanten Viren, die als Vakzinuntereinheiten ausgebildet und ohne weiteres vergrößert werden können.
  • Es wurden auch im Bereich der Entwicklung von geeigneten Vektoren zur Expression von genetischem Fremdmaterial in Pflanzenwirten Anstrengungen unternommen. Ahlquist, US-Patent 4,885,248 und US-Patent 5,173,410, beschreibt den vorausgehenden Aufwand, der unternommen wird, um Transfervektoren zu entwickeln, die zum Übertragen von genetischem Fremdmaterial in Pflanzenwirtszellen zum Zwecke der Expression darin nützlich sein könnten. Zusätzliche Aspekte der Hybrid-RNA-Viren und RNA-Transformationsvektoren werden von Ahlquist u.a. in den US-Patenten 5,466,788, 5,602,242, 5,627,060 und 5,500,360 beschrieben. Donson u.a., US-Patent 5,316,931 und US-Patent 5,589,367 zeigen zum ersten Mai Pflanzenvirusvektoren, die zur systemischen Expression von genetischem Fremdmaterial in Pflanzen geeignet sind. Donson u.a. beschreiben Pflanzenvirusvektoren mit heterologen subgenomischen Promotoren für die systemische Expression von Fremdgenen.
  • Es werden gegenwärtig in schneller Folge aufwändige Pflanzengenetikverfahren entwickelt, die das Versprechen erfüllen, die Transformation von praktisch jeder Pflanzenart und die Expression einer großen Vielfalt von Genen zu ermöglichen. Damit aber die Pflanzenmolekularzucht und -wirtschaft im gewerblichen Bereich umfassend akzeptiert wird, muss ein kostenwirksames und großtechnisches Reinigungssystem für die bioaktiven, in den Pflanzen erzeugten Arten, insbesondere Viruspartikel, insbesondere genetisch manipulierte Viren, entwickelt werden.
  • Einige Verfahren zur Isolation von Viren aus Pflanzen sind in der Literatur beschrieben worden (Johal, US-Patent 4,400,471, Johal, US-Patent 4,334,024, Wildman u.a., US-Patent 4,268,632, Wildman u.a., US-Patent 4,289,147, Wildman u.a., US-Patent 4,347,324. Die sukkulenten Blätter von Pflanzen, wie beispielsweise Tabak, Spinat, Sojabohne und Alfalfa, bestehen typischerweise aus 10–20% Feststoffen, wobei der restliche Teil Wasser ist. Der feste Teil besteht aus einem wasserlöslichen und einem wasserunlöslichen Teil, wobei letzterer hauptsächlich aus dem faserförmigen Strukturmaterial des Blatts besteht. Der wasserlösliche Teil umfasst Verbindungen mit relativ niedrigem Molekulargewicht (MG), wie beispielsweise Zucker, Vitamine, Alkaloide, Aromen, Aminosäuren, und andere Verbindungen mit relativ hohem MG, wie beispielsweise natürliche und rekombinante Proteine.
  • Die Proteine im löslichen Teil der Pflanzenbiomasse können weiter in zwei Fraktionen geteilt werden. Eine Fraktion umfasst hauptsächlich ein photosynthetisches Protein, Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase (oder RuBisCO), dessen Untereinheits-Molekulargewicht etwa 550 kD beträgt. Diese Fraktion wird üblicherweise als „Protein der Fraktion 1" bezeichnet. RuBisCO ist reichlich vorhanden und umfasst bis zu 25% des gesamten Proteingehalts eines Blatts und bis zu 10 des Feststoffs eines Blatts. Die andere Fraktion enthält ein Gemisch aus Proteinen und Peptiden, deren Untereinheits-Molekulargewichte typischerweise im Bereich von etwa 3 kD bis 100 kD liegen, und weitere Verbindungen, einschließlich Zucker, Vitamine, Alkaloide, Aromen, Aminosäuren. Diese Fraktion wird insgesamt als „Proteine der Fraktion 2" bezeichnet. Proteine der Fraktion 2 können natürliche Wirtsmaterialien oder rekombinante Materialien, einschließlich Proteine und Peptide, sein, die mittels Transfektion oder transgener Transformation erzeugt werden. Transfizierte Pflanzen können auch Viruspartikel mit einer molekularen Größe von über 1.000 kD enthalten.
  • Das grundlegende Verfahren zur Isolation von Pflanzenproteinen beginnt generell mit dem Abbau von Blattbiomasse und dem Pressen des sich ergebenden Faserstoffs zur Erzeugung von „grünem Saft". Das Verfahren wird üblicherweise in Gegenwart eines Reduktionsmittels oder Antioxidationsmittels durchgeführt, um eine unerwünschte Oxidation zu unterdrücken. Der pH-Wert des grünen Safts, der verschiedene Proteinkomponenten und aus feinen Teilchen bestehendes, grün pigmentiertes Material enthält, wird eingestellt und der Saft erwärmt. Der typische pH-Wertbereich für den grünen Saft liegt nach dem Einstellen zwischen 5,3 und 6,0. Dieser Bereich wurde für die Isolierung des Proteins der Fraktion 1 (oder der Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase) optimiert. Ein Erwärmen, das die Koagulation von grün pigmentiertem Material bewirkt, wird typischerweise um 50°C herum geregelt. Das koagulierte, grün pigmentierte Material kann dann durch mäßige Zentrifugation entfernt werden, um einen „braunen Saft" zu ergeben. Der braune Saft wird anschließend gekühlt und bei einer Temperatur bei oder unter Raumtemperatur gelagert. Nach einer ausgedehnten Zeit, z.B. 24 Stunden, kristallisiert Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus dem braunen Saft aus. Das kristallisierte Protein der Fraktion 1 kann dann durch Zentrifugation aus der Flüssigkeit ausgeschieden werden. Proteine der Fraktion 2 bleiben in der Flüssigkeit, und sie können nach weiterer Säuerung bis zu einem pH-Wert von etwa 4,5 gereinigt werden. Alternativ kann die Kristallbildung von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus dem braunen Saft durch Zugabe von ausreichenden Mengen an Polyethylenglycol (PEG) an Stelle einer Kühlung bewirkt werden.
  • Das grundlegende Verfahren zur Isolation von Viruspartikeln wird in Gooding u.a. (Phytopathological Notes 57: 1285 (1967)) beschrieben. Um das Tabakmosaikvirus (TMV) aus Pflanzenquellen in großen Mengen zu reinigen, werden infizierte Blätter homogenisiert und dann n-Butanol zugesetzt. Das Gemisch wird dann zentrifugiert, und das Virus im Überstand zurückgehalten. Polyethylenglycol (PEG) wird danach dem Überstand und später einer Zentrifugation zugesetzt. Das Virus kann aus dem sich ergebenden PEG-Pellet gewonnen werden. Das Virus kann weiter durch einen anderen Resuspensions-, Zentrifugations- und PEG-Präzipitationszyklus gereinigt werden.
  • Es gibt Protokolle zur Isolation und Reinigung von Pflanzenviren, die allerdings viele Probleme bereiten. Die bestehenden Trennungsverfahren beruhen auf der Verwendung von Lösungsmitteln, wie beispielsweise n-Butanol, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, um Chloroplastmembranfragmente, Pigmente und andere wirtsbezogene Materialien zu beseitigen. Obwohl sie für die Virusreinigung in kleinem Umfang nützlich und wirksam sind, ist die Verwendung von Lösungsmitteln bei einer großtechnischen Reinigung problematisch. Es treten häufig Probleme, wie Lösungsmittelbeseitigung, spezielle, mit entzündlichen Flüssigkeiten kompatible Anlagenausführungen, Anlagenbelüftung und Arbeiterbelastungsschutz sowie Überwachung, auf. Es gibt Virusreinigungsverfahren, die nicht auf einem Lösungsmittel beruhen und in kleinem Umfang durchgeführt werden, diese sind aufgrund der Anlagen und Verarbeitungseinschränkungen und Endproduktreinheit aber für großtechnische, kommerzielle Vorgänge nicht praktikabel (Bracke, Adv. Virus Res. 7: 193–224 (1960) und Brakke u.a., Virology 39: 516–533 (1969)). Schließlich ermöglichen die existierenden Protokolle keinen rationalisierten Betrieb in der Art, dass eine Isolation und Reinigung von unterschiedlichen Viren bei minimaler Modifikation eines allgemeinen Reinigungsverfahrens erzielt werden kann.
  • Es gibt auf dem Fachgebiet einen Bedarf an einem wirksamen, nicht denaturierenden und lösungsmittelbeschränkten, großtechnischen Verfahren zur Isolation und Reinigung von Viren. Eine wirksame Virusisolation ist wegen der Nützlichkeit der Viren als Transfektionsvektoren und Vakzine besonders nützlich. In einigen Situationen können interessante Proteine und Peptide an ein Virus angebracht oder mit natürlichen viralen Proteinen (Fusionsprotein) integriert werden, so dass die Isolation des interessanten Proteins oder Peptids tatsächlich die Isolation des Virus als solches umfassen kann.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation und Reinigung von interessanten Viren aus einem Pflanzenwirt, der in großem Umfang angewendet werden kann. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein wirksameres Verfahren zur Isolation von interessanten Viren als die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Verfügung.
  • Im Allgemeinen umfasst das vorliegende Verfahren zur Isolation von interessanten Viren die Schritte des Homogenisierens einer Pflanze zur Erzeugung eines grünen Safts, das Einstellen des pH-Werts des grünen Safts und dessen Erwär men, das Trennen des Zielvirus aus anderen Komponenten des grünen Safts mittels einem oder mehr Zyklen einer Zentrifugation, die Resuspension und Ultrafiltration und abschließend das Reinigen von Viruspartikeln durch ein solches Verfahren wie die PEG-Präzipitation.
  • In einer Ausführungsform wird der pH-Wert des grünen Safts auf einen Wert zwischen etwa 4,0 und 5,2 eingestellt und der Saft für mindestens etwa eine Minute auf eine Temperatur zwischen etwa 45–50°C erwärmt. Dieses Gemisch wird dann einer Zentrifugation unterworfen. Der dadurch erzeugte Überstand enthält bei Transfektion einen Virus und Proteine der Fraktion 2, einschließlich rekombinante Produkte. Proteine der Fraktion 2 können vom pelletierten Protein der Fraktion 1 und anderen Wirtsmaterialien durch mäßige Zentrifugation abgetrennt werden. Viruspartikel und Proteine der Fraktion 2 können dann weiter durch eine Aufeinanderfolge von Ultrafiltration, Chromatographie, Salzpräzipitation und anderen Verfahren, einschließlich Affinitätstrennungsprotokolle, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt werden. Einer der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Viruspartikel einer Ultrafiltration unterworfen werden.
  • In einer zweiten Ausführungsform wird nach der pH- und Wärmebehandlung das Pellet von der Zentrifugation, welches das Virus, das Protein der Fraktion 1 und andere Wirtsmaterialien enthält, in Wasser oder einer Pufferlösung resuspendiert und auf einen pH-Wert von etwa 5,0–8,0 eingestellt. Das Gemisch wird einer zweiten Zentrifugation unterworfen. Die Resuspension ermöglicht, dass die Mehrzahl der Viren nach der zweiten Zentrifugation im Überstand bleibt, und das Protein der Fraktion 1 und andere Wirtsmaterialien können in dem sich ergebenden Pellet gefunden werden. Die Viruspartikel können weiter mittel PEG-Präzipitation oder Ultrafiltration, falls notwendig, vor der PEG-Präzipitation gereinigt werden.
  • In einer dritten Ausführungsform ist das Hüllprotein eines Virus ein Fusionsprotein, wobei das interessante rekombinante Protein oder Peptid in das Hüllprotein eines Virus integriert wird. Während der Virusreplikation oder während des Verfahrens der Virusisolation und -reinigung kann sein Hüllprotein vom Virusgenom als solches gelöst werden oder als nicht assembliertes Virus-Hüllprotein anfallen oder die Hüllfusion wird auch nie eingearbeitet. Nach der Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert kann das Pellet das Virus, die nicht assemblierten Fusionsproteine, das Protein der Fraktion 1 und andere Wirtsmaterialien enthalten.
  • In einer vierten Ausführungsform können Zucker, Vitamine, Alkaloide, Aromen und Aminosäuren aus einer Pflanze auch in geeigneter Weise isoliert und gereinigt werden. Nach der Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert enthält der Überstand die Proteine der Fraktion 2, Viren und andere Materialien, wie beispielsweise Zucker, Vitamine, Alkaloide und Aromen. Der dadurch erzeugte Überstand kann vom pelletierten Protein der Fraktion 1 und anderen Wirtsmaterialien durch moderate Zentrifugation getrennt werde. Zucker, Vitamine, Alkaloide und Aromen können dann weiter durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich Ultrafiltration und andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt werden.
  • In einer bevorzugten fünften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen eines Virus aus einer Pflanze, umfassend die aufeinander folgenden Schritte:
    • (a) Homogenisieren einer Pflanzen oder eines Pflanzengewebes zur Erzeugung eines grünen Safts;
    • (b) Einstellen des pH-Werts des grünen Safts auf unter oder gleich 5,2;
    • (c) Erwärmen des grünen Safts auf eine minimale Temperatur von 45°C;
    • (d) Zentrifugieren des grünen Safts zur Erzeugung eines Überstands und eines Pellets; und
    • (e) Reinigen des Virus aus dem Überstand und Pellet. In einer weiteren sechsten Ausführungsform wird im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts auf zwischen 4,0 und 5,2 eingestellt und im Schritt (c) wird der grüne Saft für mindestens eine Minute auf eine Temperatur zwischen 45°C und 50°C erwärmt.
  • In einer bevorzugten siebten Ausführungsform des Virusreinigungsverfahrens der Erfindung wird im Zentrifugationsschritt (d) des Verfahrens des Proteins der Frak tion 1 der fünften Ausführungsform pelletiert und die Proteine der Fraktion 2 bleiben im Überstand des „Überstands und Pellets".
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird im Schritt (e) das Virus aus der Überstandsfraktion des im Schritt (d) erzeugten „Überstands und Pellets" von jeder der Ausführungsformen fünf bis sieben gereinigt. Bevorzugte Varianten dieser Ausführungsform umfassen solche, bei denen im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts auf zwischen 4,0 und 5,2, zwischen 5,0 und 5,2 oder etwa 5,0 eingestellt wird.
  • Eine achte bevorzugte Ausführungsform ist die von der siebten Ausführungsform oder seine bevorzugt beschriebenen Varianten, wobei im Schritt (c) der grüne Saft auf eine Temperatur von zwischen 45°C und 50°C erwärmt wird. Eine neunte bevorzugte Ausführungsformen umfasst die achte Ausführungsform und weiter das Unterwerfen des Überstands des Schritts (d) einer Ultrafiltration, wobei davon auszugehen ist, dass in einer zehnten Ausführungsform diese Ultrafiltration ein Permeat erzeugt, das ein oder mehr Moleküle umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Zucker, Alkaloide, Aromaverbindungen, Pigmente und Proteine der Fraktion 1 und 2 ausgewählt sind. Die elfte Ausführungsform umfasst die neunte und weiter den Schritt des Zusetzens von Polyethylenglycol zu einem Konzentrat, das aus der Ultrafiltration resultiert.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten zwölften Ausführungsform schließt das Verfahren nach einer der Ausführungsformen fünf bis sieben an den Schritt (d) an, aber im Schritt (e) wird das Virus aus dem Pellet des „Überstands und Pellets", das im Schritt (d) erzeugt wurde, gereinigt und wobei der Schritt (e) die nachstehenden aufeinander folgenden Schritte umfasst:
    • (i) Resuspendieren des Pellets in einer flüssigen Lösung;
    • (ii) Einstellen des pH-Werts der flüssigen Lösung, umfassend das resuspendierte Pellet, auf zwischen pH 5,0 und pH 8,0;
    • (iii) Zentrifugieren der flüssigen, das resuspendierte Pellet enthaltenden Lösung zur Erzeugung eines Überstands; und
    • (iv) Reinigen des Virus aus dem im Schritt (iii) erzeugten Überstands.
  • In einem alternativen Verfahren einer besonders bevorzugten, dreizehnten Ausführungsform werden die Schritte (i) und (ii) von Schritt (e) des vorstehenden Verfahrens zu einem Schritt kombiniert, bei dem das Pellet in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 5,0 und 8,0 resuspendiert wird. Weiter beinhalten zugehörige Ausführungsformen die Merkmale der Verfahren entweder der zwölften oder der dreizehnten Ausführungsform, wobei die Virusreinigung durch mindestens ein Verfahren ausgeführt wird, das aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycolpräzipitation oder Ultrafiltration (vierzehnte Ausführungsform) ausgewählt ist, oder eine Kombination, bei der Polyethylenglycol einem Konzentrat zugesetzt wird, das aus der Ultrafiltration resultiert (fünfzehnte Ausführungsform). Eine sechzehnte bevorzugte Ausführungsform umfasst die Merkmale der vierzehnten Ausführungsform, wobei die Ultrafiltration ein Permeat erzeugt, das ein oder mehr Moleküle umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Alkaloiden, Aromaverbindungen, Pigmenten und Proteinen der Fraktion 1 und 2 ausgewählt sind.
  • Das Virus nach einer der fünften bis sechzehnten Ausführungsform oder der oben beschriebenen Varianten kann ein Plus-Sense-Virus sein: Das Virus dieser Ausführungsformen kann aus der Gruppe bestehend aus einem Potyvirus, einem Tobamovirus, einem Bromovirus, einem Carmovirus, einem Luteovirus, einem Marafivirus, der MCDV-Gruppe, einem Necrovirus, der PYFV-Gruppe, einem Sobemovirus, einem Tombusvirus, einem Tymovirus, einem Capillovirus, einem Closterovirus, einen Carlavirus, einem Potexvirus, einem Comovirus, einem Dianthovirus, einem Fabavirus, einem Nepovirus, einem PEMV, einem Furovirus, einem Tobravirus, einem AMP, einem Tenuivirus und einem Reisnekrosevirus ausgewählt sein.
  • Das Virus der fünften bis sechzehnten Ausführungsformen oder der oben beschriebenen Varianten kann auch aus der Gruppe bestehend aus einem Caulimovirus, einem Geminivirus, einem Reovirus, der Commelina Yellow Mottle Virus-Gruppe und einem Cryptovirus ausgewählt werden, oder das Virus kann aus einem Rhabdovirus und einem Bunyavirus ausgewählt werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
  • 1 stellt ein Fließdiagramm dar, das das vorliegende Verfahren zur Isolation und Reinigung von Viren und löslichen Proteinen und Peptiden aus Pflanzenquellen zeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolation und Reinigung von interessanten Viren aus einem Pflanzenwirt. Außerdem sieht die vorliegende Erfindung ein wirksameres Verfahren zur Isolation von interessanten Viren als die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren vor. Darüber hinaus ist das vorliegende Verfahren auf die Herstellung in großem Umfang anwendbar.
  • Im Allgemeinen umfasst das vorliegende Verfahren zur Isolation von interessanten Viren die Schritte des Homogenisierens einer Pflanze zur Erzeugung eines grünen Safts, das Einstellen des pH-Werts und Erwärmen des grünen Safts, das Trennen der Zielarten, entweder Virus oder Protein/Peptid, von anderen Komponenten des grünen Safts durch einen oder mehr Zyklen der Zentrifugation, Resuspension und Ultrafiltration und abschließend das Reinigen von Viruspartikeln durch solche Verfahren wie PEG-Präzipitation.
  • Eine Darstellung der vorliegenden Erfindung ist in der 1 gezeigt. Allerdings soll diese Figur nur die vorliegende Erfindung veranschaulichen und nicht dahingehend interpretiert werden, dass sie die Verfahren oder die Reihenfolgen ihres Auftretens, wie darin angegeben, einschränkt. Alle Modifikationen der vorliegenden Erfindung, die funktionell den hier offenbarten Verfahren und Bedingungen äquivalent sind, liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung Ein erster Schritt des vorliegenden Verfahrens betrifft die Homogenisierung der vorliegenden Pflanze. Pflanzenblätter können mittels einer geeigneten Apparatur oder eines zur Verfügung stehenden Verfahrens zersetzt werden. Zum Beispiel wird ein Waring-Mischer bei einem kleinen Umfang oder ein Reitz-Desintegrator bei einem großen Umfang erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet. Das homogenisierte Gemisch kann dann mittels einer geeigneten Apparatur oder eines zur Verfügung stehenden Verfahrens gepresst werden. Zum Beispiel wird eine Spindelpresse bei einem großen Umfang oder ein Seihtuch bei einem kleinen Umfang erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet. Der Homogenisierungsschritt kann in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels oder Oxidationsmittels durchgeführt werden, um eine unerwünschte Oxidation zu unterdrücken. Natriummetabisulfit (Na2S2O5) wird erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet. Die anschließenden Schritte zum Isolieren und Reinigen von Viren können generell gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt werden.
  • pH-Werteinstellung und Wärmebehandlung von grünem Saft
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert des anfänglichen grünen Safts auf einen Wert von unter oder gleich 5,2 eingestellt und dann bei einer Temperatur von mindestens etwa 45°C erwärmt. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert des grünen Safts auf zwischen etwa 4,0 und 5,2 eingestellt und dann für mindestens eine Minute auf eine Temperatur zwischen etwa 45–50°C erwärmt. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird erfolgreich eine Wärmebehandlung zwischen 10 und 15 Minuten verwendet. Der Fachmann wird ohne weiteres anerkennen, dass die für die Wärmebehandlung zugewiesene Zeit je nach der Gewinnung der gewünschten Art variiert. Daher kann nach der pH-Werteinstellung die Erwärmungszeit von etwa einer Minute bis über 15 Minuten variieren. Die Wärme kann auf jede geeignete Weise angelegt werden, und die Erfindung soll diesbezüglich nicht einschränkend sein. Der Fachmann wird anerkennen, dass der pH-Wert mittels vieler geeigneter Säuren oder Basen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingestellt werden kann. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hat sich Phosphorsäure als wirksam erwiesen. Der pH-Wert des grünen Safts beeinflusst die Verteilung von Viren, Proteinen und Peptiden im Überstand oder Pellet während der anschließenden Zentrifugationen. Ein optimaler Wert für die Zielart kann durch Testen der Isolation und Reinigung des interessanten Virus in kleinem Umfang erhalten werden.
  • Der wärmebehandelte grüne Saft mit eingestelltem pH-Wert ist insofern recht einzigartig, als der pH-Wert des grünen Safts die Verteilung von Viren, Proteinen und Peptiden im Überstand oder Pellet während anschließender Zentrifugationen beeinflusst. Je nach der interessanten Art kann der pH-Wert des grünen Safts ohne weiteres gesteuert werden, um die Isolation und Reinigung der gewünschten Viruspartikel zu erleichtern. Es stellt daher einen rationellen Betrieb zur Verfügung, so dass die Isolation und Reinigung von verschiedenen Viren (und auch Proteinen und Peptiden) mittels kleiner Modifikationen eines allgemeinen Reinigungsverfahrens optimiert werden kann. Solche Modifikationen liegen im routinemäßigen Können des Fachmanns und erfordern kein übermäßiges Experimentieren. Durch das einzigartige Merkmal von grünem Saft ist es möglich, diesen in einer Auswahl von nachfolgend beschriebenen Reinigungsschritten zu verarbeiten.
  • Zentrifugation von grünem Saft
  • Der pH-Wert- und wärmebehandelte grüne Saft kann dann einer Zentrifugation unterworfen werden. Der Fachmann kann ohne weiteres geeignete Bedingungen für die Zentrifugation bestimmen, einschließlich Zeitintervall und G-Kraft. Es wird allgemein in Betracht gezogen, dass die Zentrifugation von ausreichender G-Kraft und Zeit sein sollte, um im Wesentlichen das ganze Protein der Fraktion 1, Chloroplast und andere Wirtsmaterialien zu pelletieren, während die gewünschte Zielart in der Überstandsfraktion zurückbleibt, oder von ausreichender Drehzahl und Zeit sein sollte, um die Zielart mit dem Protein der Fraktion 1, dem Chloroplast und anderen Wirtsmaterialien zu pelletieren. Zum Beispiel ist in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine Zentrifugation bei 3000 × G für zwei Minuten oder bei 6000 × G für drei Minuten wirksam auf den grünen Saft angewendet worden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Mehrheit von Protein der Fraktion 1, nicht assemblierten Fusionsproteinen und -peptiden, Chloroplast und anderen Wirtsmaterialien durch Zentrifugation pelletiert (P1), während Proteine der Fraktion 2, die rekombinante Proteine und Peptide aufweisen, nach dieser Zentrifugation allgemein im Überstand (S1) bleiben (siehe 1). Das Virus kann aber nach der Zentrifugation zwischen Pellet und Überstand aufgeteilt werden, je nach dem pH-Wert der Virusart des grünen Safts, dem Virus-Nukleinsäurekonstrukt, der Pflanzenart, dem Pflanzenalter und der Pflanzengewebequelle usw. Bei einem niedrigen pH-Wert, vorzugsweise unterhalb einem pH von etwa 5,0, wird das Virus hauptsächlich im Pellet (P1) zurückgehalten. Bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 5,2 liegt das Virus auch im Überstand (S1) vor. Je nach der interessanten Art können der pH-Wert des grünen Safts und die anschließenden Zentrifugationsbedingungen ohne weiteres so gesteuert werden, dass die Isolation und Reinigung des gewünschten Produkts, entweder des Virus oder der Proteine und Peptide, erleichtert wird. Daher stellt das vorliegende Verfahren ein rationelles Verfahren zur Verfügung, mit dem die Isolation und Reinigung von unterschiedlichen Proteinen und Peptiden mit kleinen Modifikationen eines allgemeinen Reinigungsverfahrens erzielt werden kann, wobei die Modifikationen dem Fachmann kein übermäßiges Experimentieren abverlangen.
  • Resuspension eines Pellets in einem mittels pH-Wert gesteuerten Puffer
  • Das durch Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert erhaltene Pellet enthält typischerweise ein Protein der Fraktion 1, nicht assemblierte Fusionsproteine und -peptide, Viren und andere Wirtsmaterialien. Es kann in Wasser oder in einer Pufferlösung mit dem gewünschten pH-Bereich oder einem pH-Wert, der an diesen Bereich angepasst ist, resuspendiert werden. Der optimale pH-Wert wird durch die interessante Endart bestimmt. In einigen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der pH-Wertbereich der Resuspension etwa 5,0 bis 8,0 zum Isolieren und Reinigen von Viruspartikeln (siehe 1). Der Fachmann kann ohne weiteres eine geeignete Pufferlösung oder Säuren oder Basen auswählen, um den bestimmten pH-Wertbereich ohne übermäßiges Experimentieren zu erreichen. Je nach dem prozentualen Anteil an Feststoffen des Pellets, das als Ergebnis des ersten Zentrifugationsverfahrens gebildet wird, kann ein Resuspensionsvolumen auf eine Fraktion des anfänglichen grünen Saftvolumens eingestellt werden, typischerweise in Mengen der 10 bis 100-fachen Reduktion des ursprünglichen grünen Saftvolumens.
  • Isolation und Reinigung des Virus
  • Viren können nach der Zentrifugation des grünen Safts abhängig vom pH-Wert und dem Ausmaß der Virusaufteilung entweder aus dem Pellet (P1) allein, dem Überstand (S1) oder sowohl dem Überstand (S1) als auch dem Pellet (P1) gewonnen werden.
  • Wenn der pH-Wert des grünen Safts auf einen niedrigen Wert, zum Beispiel etwa 4,0 eingestellt wird, wird das Virus im Allgemeinen quantitativ zusammen mit dem Protein der Fraktion 1, dem Chloroplast und anderem Wirtsmaterial nach der Zentrifugation des grünen Safts im Pellet zurückgehalten (siehe 1). Nach der Resuspension in einer Lösung mit einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 8,0 kann das Gemisch einem anderen Zentrifugationsschritt unterworfen werden. Viruspartikel werden hauptsächlich im Überstand (S2) zurückgehalten und können aus dem Protein der Fraktion 1, aus Chloroplastfragmenten und anderen Wirtsmaterialien in den Pellets getrennt werden. Gewöhnlich bleibt nur etwa 5–10% des grünen Ausgangssaftproteins im S2. Der das Virus enthaltende Überstand kann dann ultrafiltriert werden, falls notwendig, und zwar mittels einer Molekulargewichtstrenngrenze (MWCO) im Bereich einer etwa 1–500 kD Membran gemäß einem der Ultrafiltrationsverfahren, die dam Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel wird eine 100 kD MWCO-Membran erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet, um die Viruspartikel in den Konzentraten zurückzuhalten, während kleinere Proteinkomponenten durchfiltriert werden. Der Ultrafiltrationsschritt führt zu einer im Wesentlichen weiteren Reduktion des Verfahrensvolumens. In einigen Ausführungsformen sind weitere Reduktionen im Verfahrensvolumen von 1- bis 30-fach oder mehr erzielbar. Aus der Ultrafiltration oder Zentrifugation kann eine Endreinigung des Virus durch bekannte Verfahren, wie beispielsweise PEG-Präzipitation, Zentrifugation, Resuspension und Klärung erzielt werden.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Viruspartikel auch aus dem Überstand (S1) nach der Zentrifugation des grünen Safts erhalten werden. Diese Überstandsfraktion enthält normalerweise Fraktion 2 Proteine und Peptide (siehe 1). In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der pH-Wert des grünen Safts auf einen Wert zwischen etwa 5,0 und 5,2, vorzugsweise um pH 5,0, eingestellt werden. Ein wichtiger Viruspartikelteil kann aus dem Überstand (S1) zusätzlich zu dem Pellet (P1) nach der Zentrifugation des grünen Safts gewonnen werden. Der das Virus enthaltende Überstand kann ultrafiltriert werden, einschließlich, falls notwendig, Diafiltration mittels der Molekulargewichtstrenngrenzenmembran im Bereich von etwa 1 bis 500 kD gemäß einem der Ultrafiltrations- und Diafiltrationsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel wird eine 100 kD MWCO-Membran erfolgreich in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet, um die Viruspartikel in den Konzentraten zurückzuhalten, während kleinere Proteinkomponenten, z.B. Protein der Fraktion 2 durchfiltriert werden. Der Ultrafiltrationsschritt führt zu einer wesentlichen weiteren Verringerung des Verfahrensvolumens. Aus der Ultrafiltration oder Zentrifugation kann eine Endreinigung des Virus durch bekannte Verfahren erreicht werden, wie beispielsweise PEG-Präzipitation, Zentrifugation, Resuspension und Klärung.
  • Ein Isolations- und Reinigungsverfahren gemäß den hier beschriebenen Methoden wird verwendet, um die TMV-bezogenen Viren aus den drei Tabaksorten (Ky8959, Tn86 und MD609) und Nicotiana benthamiana zu isolieren. Eine Anzahl von TMV-bezogenen Viren wird gemäß der Figur erhalten, einschließlich TMV204 (Wildtyp, SEQ ID NO:1:), TMV261 (Hüllprotein „readthrough", SEQ ID. NO:2:), TMV291 (Hüllprotein-Schleifenfusion, SEQ ID NO:3:), TMV811 (SEQ ID NO:4:) und TMV861 (Hüllprotein „readthrough", SEQ ID NO:5:). Es ist gezeigt worden, dass TMV261 und TMV291 während einiger Isolationsverfahren instabil sind, allerdings während des vorliegenden Verfahrens intakt bleiben. Diese Virusvektoren werden nur als Virusbeispiele verwendet, die durch die vorliegende Erfindung gewonnen werden können und nicht den Umfang der Erfindung einschränken sollen. Ein Fachmann wird in der Lage sein, die vorliegende Erfindung zur Gewinnung anderer Viren zu verwenden. Das interessante Virus kann ein Potyvirus, ein Tobamovirus, eine Bromovirus, ein Carmovirus, ein Luteovirus, ein Marafivirus, die MCDV-Gruppe, ein Necrovirus, die PYFV-Gruppe, ein Sobemovirus, ein Tombusvirus, ein Tymovirus, ein Capillovirus, ein Closterovirus, ein Carlavirus, ein Potexvirus, ein Comovirus, ein Dianthovirus, ein Fabavirus, ein Nepovirus, ein PEMV, ein Furovirus, ein Tobravirus, ein AMV, ein Tenuivirus, ein Reisnekrosevirus, ein Caulimovirus, ein Geminivirus, ein Reovirus, die Commeli na Yellow mottle Virus-Gruppe und ein Cryptovirus, ein Rhabovirus oder ein Bunyavirus sein.
  • Die vorliegenden Verfahren zur Isolation und Reinigung von Viruspartikeln stellen wichtige Vorteile gegenüber die bekannten Verfahren dar. Sie ermöglichen die Ultrafiltration von Virus enthaltendem Überstand (S1 und/oder S2), der das Verfahrensvolumen deutlich verringert und Pflanzenkomponenten, wie beispielsweise Zucker, Alkaloide, Aromen und Pigmente und Proteine der Fraktion 1 und 2, entfernt, Die gewünschten Viruspartikel können als partikulär angereichert werden. Die Konzentration und Reinigung von Viruspartikeln erfolgt daher schnell und effektiv.
  • Verteilung von Zuckern, Vitaminen, Alkaloiden und Aromen
  • Nach der Zentrifugation des erwärmten grünen Safts mit eingestelltem pH-Wert enthält der Überstand die Proteine der Fraktion 2, Viren und andere Materialien, einschließlich Zucker, Vitamine, Alkaloide und Aromen. Der dadurch erzeugte Überstand kann von dem pelletierten Protein der Fraktion 1 und anderen Wirtsmaterialien durch Zentrifugation abgetrennt werden.
  • Definitionen
  • Die folgenden Definitionen sollen zum noch klareren und einheitlicheren Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich des hier solchen Begriffen gegebenen Umfangs beitragen.
  • Ein „Virus" wird hier so definiert, dass es die Gruppe bestehend aus einem Virion aufweist, wobei das Virion eine infektiöse Nukleinsäuresequenz in Kombination mit einem oder mehr viralen Strukturproteinen umfasst; ein nicht infektiöses Virion, wobei das nicht infektiöse Virion eine nicht infektiöse Nukleinsäure in Kombination mit einem oder mehr viralen Strukturproteinen umfasst; und Aggregate von viralen Strukturproteinen, wobei es keine Nukleinsäuresequenz gibt oder in Kombination mit dem Aggregat gibt und wobei das Aggregat virusartige Partikel (VLPs) aufweisen kann. Die Viren können entweder natürlich vorkommen oder von rekombinanten Nukleinsäureverfahren abgeleitet sein und jede viral abgeleitete Nukleinsäure aufweisen, die ob durch Konstruktion oder Auswahl zur Replikation in ganzen Pflanzen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen übernommen werden kann.
  • Eine „Viruspopulation" wird hier so definiert, dass sie ein oder mehr Viren umfasst, wie oben definiert, wobei die Viruspopulation aus einer homogenen Auswahl von Viren besteht oder wobei die Viruspopulation aus einer heterogenen Auswahl besteht, die eine Kombination und einen Anteil der Viren umfasst.
  • „Virusähnliche Partikel" (VPLs) werden hier als selbst assemblierende Strukturproteine definiert, wobei die Strukturproteine durch ein oder mehr Nukleinsäuresequenzen kodiert sind, wobei die Nukleinsäuresequenz(en) in das Genom eines viralen Wirtsvektors eingeführt wird.
  • „Protein und Peptide" sind als entweder natürlich vorkommende Proteine und Peptide oder rekombinante Proteine und Peptide definiert, die durch Transfektion oder transgene Transformation erzeugt werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter. Diese Beispiele sollen die vorliegende Erfindung nur veranschaulichen und sind nicht als einschränkend auszulegen. Die Beispiele sollen speziell die Gewinnung eines interessanten Virus veranschaulichen, das mittels des Verfahrens im Umfang der vorliegenden Erfindung erzielt werden kann.
  • BEISPIEL 1
  • Protein der Fraktion 1 aus grünem Saft bei niedrigem pH-Wert pelletiert
  • Eine Tabakpflanze der Abart MD609 wurde 27 Tage nach dem Aussäen mit TMV 811 inokuliert. 40 Tage nach der Inokulation wurde die Pflanze geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (150 g) wurde mit 0,04% Natriummetabisulfitlösung (150 ml) in einem 1 l Waring-Mischer vereinigt. Das Pflanzengewebe wurde mit hoher Drehzahl über einen Zeitraum von zwei Minuten gemahlen. Das sich ergebende Homogenat wurde durch vier Schichten Seihtuch gepresst und die gepresste Faser wurde verworfen. Das gesammelte Saftvolumen betrug 240 ml und sein pH-Wert war 5,57.
  • Unter ständigem Rühren wurde der pH-Wert langsam mit verdünnter Phosphorsäure (H3PO4) nach unten eingestellt. Eine Saftprobe (35 ml) wurde bei jedem der folgenden pH-Werte entnommen: pH 5,4, pH 5,3, pH 5,2, pH 5,1 und pH 5,0. Anschließend wurden alle Proben auf 45°C in einem Wasserbad erwärmt und 10 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Die Proben wurden dann auf 25°C in einem kalten Wasserbad gekühlt. Die gekühlten Proben wurden bei 10.000 × G 15 Minuten lang zentrifugiert.
  • Die Überstände (S1 in 1) wurden dekantiert und durch den Bradford-Assay und SDS-PAGE auf das Proteinniveau der Fraktion 1 analysiert. Das Virus wurde mit PEG präzipitiert und durch das Verfahren von Gooding, supra aus einem Teil jedes Überstands (25 ml) isoliert. Die Viruskonzentrationen wurden durch spektrophotometrische Analyse bei 260 nm bestimmt.
  • Tabelle 1. Gesamtproteinkonzentrationen und Virusausbeuten im S1-Teil nach dem Einstellen der grünen Säfte auf einen niedrigen pH-Wert und 10-minütigen Erwärmen auf 45°C.
    Figure 00180001
  • Ergebnisse:
  • Das durch das Verfahren von Bradford bestimmte Gesamtprotein, das im löslichen Teil (S1) zurückgehalten wurde, wie durch das Verfahren von Bradford nach Zentrifugation bestimmt, wird allmählich reduziert, wenn der pH-Wert des grünen Safts von 5,4 auf 5,0 nach unten eingestellt wird. Insbesondere zeigt bei einem pH-Wert des grünen Safts von 5,0 und anschließender Wärmebehandlung bei 45°C für 10 Minuten (als das „pH 5,0/45°C-Verfahren" bezeichnet) die Menge an Protein der Fraktion 1, die in S1 verbleibt, eine über 5-fache Reduktion im Vergleich zum pH 5,5/45°C-Verfahren. Mehr Protein der Fraktion 1 wird bei einem niedrigen pH-Wert des grünen Safts pelletiert. Die Löslichkeit des Virus in S1 bleibt jedoch unbeeinflusst.
  • Die folgenden Beispiele zeigen auch, dass, während das Protein der Fraktion 1 in diesem pH-Bereich pelletiert wird, die Mehrheit der Proteine der Fraktion 2 im Überstand verbleibt. Ein herkömmliches Verfahren zur Isolierung von löslichen Pflanzenproteinen stellt den pH-Wert von grünem Saft im Bereich von 5,3–6,0 ein, wodurch das Protein der Fraktion 1 nach der Zentrifugation zum Überstand dirigiert wird. Die pH-Werteinstellung von grünem Saft auf einen Wert unter 5,2 und anschließende mäßige Erwärmung ermöglicht im vorliegenden Verfahren daher die Trennung von Protein der Fraktion 1 und Fraktion 2 nach der Zentrifugation von grünem Saft. Das Ausschalten des reichlichen Proteins der Fraktion 1 vom Überstand/löslichen Teil vereinfacht die anschließende Isolation und Reinigung eines Virus, der in den Überstand aufgeteilt ist.
  • BEISPIEL 2
  • Verteilung des Virus von grünem Saft bei unterschiedlichen pH-Werten
  • In einem Gewächshaus gezogenes Nicotiana tabacum (KY8959) wurde mit einem TMV-Derivat (Hüllprotein-Schleifenfusion), TMV291, sieben Wochen nach der Saatkeimung inokuliert. Die Pflanzen wurden zwei ein halb Wochen nach der Inokulation nach dem systemischen Verbreiten des Virus geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (150 g) wurde in einem 1 l Waring-Mischer 2 Minuten bei großer Einstellung mit 0,04% Na2S2O5 (150 ml) mazeriert. Das mazerierte Material wurde durch vier Schichten Seihtuch geseiht, um faseriges Material zu entfernen.
  • Der verbleibende grüne Saft wurde mit H3PO4 auf die pH-Werte 5,0, 4,8, 4,6, 4,4, 4,2 und 4,0 eingestellt. Grüne Saftaliquote von 30 ml wurden bei jedem pH-Wert zur Weiterverarbeitung entnommen. Alle grünen Saftproben mit eingestelltem pH-Wert wurden 15 Minuten bei 45°C in einem Wasserbad wärmebehandelt und dann auf 15°C gekühlt. Die Proben wurden in einem JS-13.1-Rotor bei 10.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert, was zu zwei Fraktionen führte, dem Überstand (S1) und das Pellet (P1) (siehe 1). Die Pellets wurden erneut in 15 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 suspendiert und in einem JS-13.1-Rotor bei 10.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert, was zu zwei Fraktionen führte, dem Überstand (S2) und das Pellet (P2), siehe 1. Das Virus wurde aus beiden Überstandsfraktionen durch PEG-Präzipitation (8.000 Molekulargewicht PEG) gewonnen, wie von Gooding, supra beschrieben, und mittels spektrophotometrische Analyse bei 260 nm quantifiziert.
  • Tabelle 2. Verteilung von Virus in S1 und S2 bei unterschiedlichen grünen Saft pH-Werten
    Figure 00200001
  • Ergebnisse:
  • Dieses Beispiel untersucht die relative Virusverteilung im Überstand, S1 und S2, während der ersten bzw. zweiten Zentrifugation. S1 wird nach der pH-Werteinstellung von grünem Saft von 5,0 auf 4,0 und anschließender Wärmebehandlung und Zentrifugation erhalten. Das Pellet (P1) wird in einem Puffer (pH 7,2) resuspendiert und anschließend einer zweiten Zentrifugation unterworfen, die den Überstand (S2) erzeugt. Die Menge an Virus, das vom S1- und S2-Anteil gewonnen wird, ist bei einem pH-Wert von 5,0 für grünen Saft in Tabelle 2 ähnlich. Nach dem Senken des pH-Werts wandert aber das Virus allmählich vom Überstandsteil (S1) zum Pelletteil (P1) und taucht wieder in S2 auf. Bei einem pH-Wert von 4,0 in der Tabelle 2 ist die Menge an Virus, das aus dem S2-Teil isoliert wurde, über 100-fach höher als im S1-Teil. Der pH-Wert von grünem Saft und der pH-Wert der Resuspensionspuffers haben, wie gezeigt wurde, eine große Wirkung auf die relative Verteilung des Virus im Überstand oder Pellet während der Zentrifugation. Bei einem niedrigen pH-Wert, z.B. pH 4,0/45°C-Verfahren und pH 7,2 Suspensionspuffer, kann das Virus quantitativ allein aus dem S2-Teil gewonnen werden. Dieses Verfahren konzentriert das Virus in einer Fraktion. Das führt zu einer Fraktion, die ultrafiltriert werden kann, wodurch das Verfahrensvolumen und die Gesamtwirksamkeit der Virusreinigung deutlich reduziert werden kann. Das Einstellen des pH-Werts des grünen Safts und des Suspensionspuffers bietet ein Verfahren zur Steuerung der Verteilung von Virus an und erleichtert daher die Virusisolation mit großen Ausbeuten.
  • BEISPIEL 3
  • Virusisolation in kleinem Umfang aus S2 mittels des pH 4,2/45°C-Verfahrens
  • Eine Tabakpflanze der Abart MD609 wurde mit TMV 811 inokuliert. Elf Wochen nach dem Säen wurde die Pflanze geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (250 g) wurden mit einer 0,04%igen Natriummetabisulfitlösung (250 ml) in einem 1-Liter Waring-Mischer kombiniert. Das Pflanzengewebe wurde mit hoher Drehzahl für einen Zeitraum von zwei Minuten gemahlen. Das sich ergebende Homogenat wurde durch ein vierschichtiges Seihtuch gepresst und die gepresste Faser verworfen. Das gesammelte Saftvolumen betrug 408 ml und sein pH-Wert war 5,4.
  • Unter konstantem Rühren wurde der pH-Wert mit verdünnter Phosphorsäure auf 4,2 eingestellt.
  • Ein Teil des Safts (285 ml) wurde in einem Wasserbad auf 45°C erwärmt und 10 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten. Der Saft wurde ohne Kühlung bei 10.000 × G 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und verworfen, und das Pellet wurde in zweifach destilliertem deionisiertem Wasser (142) resuspendiert. Der H des resuspendierten Pellets wurde mit verdünntem Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt.
  • Das resuspendiert Pellet mit eingestelltem pH-Wert wurde in acht Aliquots (jeweils 15 ml) unterteilt. Diese Aliquots wurden bei unterschiedlichen Drehzahl in einem JA-20 Rotor in einer Beckman J2-21 Zentrifuge zentrifugiert. Die zweiten Überstände (S2) wurden dekantiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Das Virus wurde mit PEG präzipitiert und aus dem verbleibenden Überstands(S2)-Teil gemäß dem Verfahren von Gooding, supra isoliert. Die Klarheit des Überstands wurde auch visuell beurteilt.
  • Tabelle 3. Virus- und Proteinausbeuten von S2 bei unterschiedlichen Zentrifugationsbedingungen.
    Figure 00220001
  • Ergebnisse:
  • Beispiel 2 zeigt, dass bei niedrigem pH-Wert des grünen Safts und einem neutralen pH-Wert des Suspensionspuffers das meiste Virus in den löslichen Teil der zweiten Zentrifugation (S2) gelangt. Beispiel 3 testet weiter die optimale Bedingung für die zweite Zentrifugation. Wenn die Zielart ein Virus ist, ist es bevorzugt, wenn der Überstand S2 so wenig Protein wie möglich enthält. Eine solche Bedingung kann allgemein bei einer Zentrifugation mit hoher Drehzahl über einen langen Zeitraum erreicht werden, wie im Aliquot 1 in der Tabelle 3 gezeigt ist. Eine solche Bedingung, die zwar wirksam ist, verursacht höhere Kosten und ein längeres Verfahren. Eine optimale Bedingung liefert eine niedrigere UpM-Rate über einen kürzeren Zeitraum, ohne die gewünschte Ausbeute und Reinheit besonders zu gefährden. Obwohl die Aliquots 2–5 bei einer viel niedrigeren Zentrifugationsgeschwindigkeit und über eine kürzere Zeit behandelt werden, ist der Proteinausschluss schlecht, wie durch die größere lösliche Proteinkonzentration und eine trübe Lösung (ein Zeichen für einen hohen Proteingehalt) gezeigt wird. Die Aliquots 6–8 lassen viel Protein aus dem Überstand heraus (eine fast klare Lösung), die im S2-Teil gewonnen Virusmenge ist mit der von Aliquot 1 vergleichbar, benötigt aber nur eine mäßige Zentrifugationsgeschwindigkeit und ein kürzeres Zeitintervall im Vergleich zu Aliquot 1.
  • Obwohl es aus dem vorliegenden Beispiel ersichtlich ist, dass keine Gefahr einer Überzentrifugation besteht (Aliquot 1), ist für ein kostenwirksames Virusreinigungsverfahren eine Zentrifugation bei einer mäßigen Drehzahl und einem vernünftigen Zeitintervall, das ausreicht, um die störenden Protein auszuschalten, bevorzugt. Der Fachmann kann ohne weiteres die optimale Zentrifugationsbedingung, die für die Isolation des interessanten Virus geeignet ist, bestimmen.
  • BEISPIEL 4
  • Wirkung der Wirtskomponenten und des Suspensionsvolumens auf die Virusgewinnung aus S2 mittels des pH 4,2/45°C-Verfahrens
  • In einem Gewächshaus gezogenes Nicotiana tabacum MD609 wurde mit einem TMV Derivat (Hüllprotein „leaky-stop"), TMV811, sechs Wochen nach der Saat keimung inokuliert. Die Pflanzen wurden fünf Wochen nach der Inokulation nach dem systemischen Verbreiten des Virus geerntet. Blatt- und Stängelgewebe (150 g) wurde in einem 1 l Waring-Mischer 2 Minuten bei großer Einstellung mit 0,04 Na2S2O5 (150 ml) mazeriert. Das mazerierte Material wurde durch vier Schichten Seihtuch geseiht, um faseriges Material zu entfernen. Der verbleibende grüne Saft wurde mit H3PO4 auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt. Der grüne Saft mit eingestelltem pH-Wert wurde unter heißem Leitungswasser auf 45°C erwärmt und 10 Minuten lang in einem Wasserbad von 45°C inkubiert. Der wärmebehandelte grüne Saft wurde in 30 ml Aliquots geteilt und dann in einem JS-13.1-Rotor bei 10.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert. Das pelletierte Material wurde entweder auf 10 oder 20% des 30 ml Ausgangsvolumens durch Zugabe von Überstand eingestellt und dann weiter auf ¼, ½ oder 1 Volumen des 30 ml Ausgangsvolumens durch Zugabe von deionisiertem H2O eingestellt. Das durchschnittliche Pelletvolumen von 30 ml des grünen Safts betrug 1,7 ml.
  • Alle Pellets wurden in dem zugegebenen Überstand und deionisierten H2O resuspendiert und dann auf einen pH-Wert von 7,5–7,7 durch Zugabe von NaOH eingestellt. Die resuspendierten Proben wurden in einem JS-13.1-Rotor bei 10.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert. Das Virus wurde aus den Überständen durch PEG-Präzipitation (8.000 Molekulargewicht PEG) gewonnen, wie von Gooding, supra beschrieben.
  • Tabelle 4. Virusausbeute bei unterschiedlichem Resuspensionsvolumen.
    Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Ergebnisse:
  • Wenn Pellets aus der Zentrifugation erhalten werden, sind sie häufig mit Restüberstand verunreinigt, welcher die anschließende Gewinnung der Zielart beeinträchtigen kann oder auch nicht. Darüber hinaus kann auch das Resuspensionsvolumen eine Wirkung auf die Gewinnung der Zielart ausüben. Dieses Beispiel soll die Virusgewinnung unter der Bedingung testen, unter der ein definiertes Überstandsvolumen dem Pellet wieder beigegeben wird und das Resuspensionsvolumen systematisch variiert wird, um seine Wirkung auf die Virusgewinnung zu bewerten.
  • Die Tabelle 4 zeigt das umgekehrte Verhältnis des Resuspensionsvolumens zur Virusausbeute. Wenn das Resuspensionsvolumen von ¼ auf ½ und ½ auf 1 Äquivalent des Ausgangsvolumens (30 ml) steigt, wird die Virusgewinnung erhöht (vergleiche 1 bis 3 und 4 bis 6). Daher sollte mit steigendem prozentualem Anteil an Pelletvolumen das Resuspensionsvolumen auch steigen, um die Virusgewinnung zu maximieren. Für die Wirkung des Restüberstands ist die Ausbeute der Virusgewinnung höher, wenn weniger Überstand dem Pellet wieder beigegeben wird (vergleiche 1 und 4, 2 und 5, 3 und 6). Wirtskomponente(n) im Überstand können die Fähigkeit, Virionen aus dem Pellet zu resuspendieren/dissoziieren beeinflussen. Daher ist ein kleineres Pelletvolumen mit weniger Restüberstand nach der Zentrifugation erwünscht. Insgesamt können solche Faktoren, wie das Resuspensionsvolumen und die Trockenheit des Pellets optimiert werden, um die Ausbeute und Reinheit der Zielart zu maximieren.
  • BEISPIEL 5
  • Wirkung der Zuführrate auf die Virusisolation in großem Umfang mittels des pH 5,0/47°C-Verfahrens
  • Auf dem Feld gezogener Tabak der Abart KY8959 wurde mit TMV 291 inokuliert und zehn Wochen nach dem Ansetzen geerntet. Das Pflanzengewebe (3761 kg) wurde in einem Reitz® Desintegrator gemahlen und die mittels einer Spindelpresse entfernt. Dem Desintegrator wurde Wasser mit einer Rate von 0,501 l kg–1 Tabak zugesetzt. Der Saft aus der Presse wurde in einem Rührtank gesammelt, in dem der pH-Wert mit Phosphorsäure auf 5,0 eingestellt war. Der Saft mit eingestelltem pH-Wert wurde kontinuierlich durch einen Wärmetauscher gepumpt, so dass die Temperatur des Safts 47°C erreichte. Der erwärmte Saft wurde dann durch Halteröhren gepumpt, wodurch sichergestellt war, dass diese Temperatur für mindestens zehn Minuten beibehalten wurde.
  • Der behandelte Saft wurde dann einer Westfalia® SAMR 15037 Teller-Zentrifuge mit einer Zuführrate von 19 Liter pro Minute bis 76 Liter pro Minute zugeführt. Konzentratproben wurden bei jeder Zuführrate genommen und auf die Viruskonzentration analysiert.
  • Tabelle 5. Virusausbeute gegenüber Zuführrate
    Figure 00260001
  • Ergebnisse:
  • Die Virusausbeute wurde mittels unterschiedlicher Zuführraten überprüft. Die Tabelle 5 zeigt, dass die Virusgewinnung mit einer niedrigen Zuführrate des grünen Safts zur Zentrifuge gesenkt wurde. Da die Zuführrate umgekehrt proportional zur Verweilzeit des grünen Safts in der Zentrifuge ist, zeigen diese Daten, dass Virus verloren geht, wenn es einer zu starken Zentrifugation unterworfen wird (niedrige Zuführrate). Daher kann die Zuführrate auch optimiert werden, um die Ausbeute und Reinheit der Zielart in einer großtechnischen Isolation und Reinigung zu maximieren.
  • BEISPIEL 8
  • Virusverteilung in kleinem Umfang mittels des pH 5,0/45°C-Verfahrens und Ultrafiltration
  • Auf dem Feld gezogener Tabak der Abart MD609, der mit TMV 261 infiziert war, wurde geerntet und bis zur Verwendung bei –20°C eingefroren. Das gefrorene Gewebe wurde in vier Chargen in einem 4-Liter Waring-Mischer gemahlen. In jeder Charge wurde das Pflanzengewebe (1500 g) drei Minuten lang bei hoher Drehzahl in 0,04%iger Natriummetabisulfitlösung (1500 ml) gemahlen. Die Homogenate wurden durch vier Schichten Seihtuch geseiht und die Säfte vereinigt, um ein Volumen von etwa 10 Litern zu ergeben.
  • Der pH-Wert des Safts wurde von einem Ausgangswert von 5,8 mittels konzentrierter Phosphorsäure (H3PO4) auf 5,0 eingestellt. Der Saft wurde dann mittels einer rostfreien Stahlspule, die mit heißem Leitungswasser erwärmt wurde, auf 45°C erwärmt. Nach dem Halten des Safts bei 45°C für 10 Minuten wurde er mit gekühltem Wasser mittels der Spule auf 25°C gekühlt. Der wärmebehandelte Saft wurde bei 12.000 × G fünf Minuten lang zentrifugiert und der sich ergebende Überstand wurde durch Miracloth® dekantiert.
  • Dieser Überstand wurde mit einer 100 kD regenerierten MWCO-Cellulose-Spiralultrafiltrationsmembran von 1 Qudratfuß (0,09 m2) verarbeitet. Bei einem Einlassdruck von 50 psi (3,45 bar) und einer Rezirkulationsrate von fünf Litern pro Minute wurde der Überstand auf etwa 5% des Ausgangsvolumens konzentriert. Die Endkonzentration wurde aus der Ultrafiltrationsvorrichtung abgeleitet, und das System mit einem kleinen Wasservolumen gespült. Proben des Ausgangsüberstands, der Endkonzentration, Wasserspülung und des kombinierten Permeats wurden mittels Bradford-Analyse auf Proteine untersucht. Sie wurden auch mit PEG gemäß dem Verfahren nach Gooding, supra präzipitiert, um jedes vorhandene Virus zu isolieren. Die Viruskonzentrationen wurden spektrophotometrisch bestimmt.
  • Tabelle 8. Proteinkonzentration und Virusausbeute im Überstand (S1) und anschließende Ultrafiltration
    Figure 00280001
  • Ergebnisse:
  • Bei diesem Beispiel wurde eine Virusisolation in kleinem Umfang erfolgreich durchgeführt. Der pH-Wert des grünen Safts wurde auf 5,0 eingestellt und der Saft wärmebehandelt und anschließend zentrifugiert. Der Virus (1,94 g) enthaltende Überstand wurde durch eine 100 kD MWCO-Membran gegeben. Das Virus (1,64 g) wurde quantitativ aus dem Konzentrat gewonnen. Proteine von kleinerer Größe wurden im Permeat gesammelt. Nur eine kleine Menge an Virus geht durch Ultrafiltration mittels einer 100 kD Membran verloren.
  • BEISPIEL 9
  • Virusisolation in großem Umfang mittels des pH 4,0/47°C-Verfahrens
  • Auf dem Feld gezogener Tabak der Abart KY8959 wurde mit TMV 291 inokuliert und zehn Wochen nach dem Ansetzen geerntet. Das Pflanzengewebe (3802 kg) wurde in einem Reitz® Desintegrator gemahlen und die mittels einer Spindelpresse entfernt. Dem Desintegrator wurde Wasser mit einer Rate von 0,501 l kg–1 Tabak zugesetzt. Der Saft aus der Presse wurde in einem Rührtank gesammelt, in dem der pH-Wert mit Phosphorsäure auf 4,0 eingestellt war. Der Saft mit eingestelltem pH-Wert wurde kontinuierlich durch einen Wärmetauscher gepumpt, so dass die Temperatur des Safts 47°C erreichte. Der erwärmte Saft wurde dann durch Halteröhren gepumpt, wodurch sichergestellt war, dass diese Temperatur für mindestens zehn Minuten beibehalten wurde.
  • Der behandelte Saft wurde dann einer Westfalia® SAMR 15037 Teller-Zentrifuge mit einer Zuführrate von 38 Liter pro Minute zugeführt. Insgesamt wurden wäh rend der Zentrifugation 4240 Liter Überstand und 757 Liter Pellet erzeugt. Ein Volumen von 1439 Liter Wasser wurde dem Pellet zugesetzt, und der pH-Wert des resuspendierten Pellets wurde durch Zugabe von KOH auf 7,12 eingestellt. Das resuspendierte Pellet mit eingestelltem pH-Wert wurde dann einer Westfalia® SAMR 15037 Teller-Zentrifuge mit einer Zuführrate von 19 Litern pro Minute zugeführt, was zur Gewinnung von 1647 Liter Überstand (S2) führte. Der Überstand (1647 Liter) wurde auf 93,9 Liter mittels Ultrafiltration durch eine 100 kD MWCO-Spiralmembran aus Celluloseacetat von 92,9 Quadratmetern (SETEC, Livermore, CA) konzentriert. Nach dem Entfernen des Konzentrats wurden die Membranen mit 119 Litern Wasser gewaschen. Virus (158 g) wurde aus dem 100 kD MWCO-Konzentrat gereinigt und dann weiter konzentriert und mittels PEG-Präzipitation (8.000 Molekulargewicht PEG) gewaschen, wie von Gooding, supra beschrieben. Diese gewonnene Virusmenge ist um zwei Größenordnungen größer als je zuvor isoliert.
  • Dieses Beispiel zeigt eine wirksame Virusisolation in großem Umfang mittels des pH 4,0/47°C-Verfahrens. Beispiel 2 oben zeigt, dass das pH 4,0/47°C-Verfahren die Viruskonzentration im Überstand, S2, in einem kleinen Umfang ermöglicht. Das Virus kann weiter mittels Ultrafiltration konzentriert werden, indem der Überstand (S2) durch eine 100 kD MWCO-Membran geleitet wird. Die Viruspartikel können mit hoher Ausbeute gewonnen werden, wie in diesem Beispiel gezeigt.
  • BEISPIEL 11
  • Physikalisch-chemische Eigenschaften der gereinigten Viruspartikel die mit dem pH 5,0/47°C- oder pH 4,0/47°C-Verfahren erzeugt wurden
  • Wildtyp-Tabakmosaikvirus (TMV204, Probe 960808) wurde aus auf dem Feld gezogenen Tabak (Abart KY8959, 5390 kg) mittels des großtechnischen pH 4,0/47°C-Verfahrens wie im Beispiel 9 beschrieben extrahiert. Rekombinantes TMV291 (Probe 960829) wurde aus auf dem Feld gezogenen Tabak (Abart KY8959, 6758 kg) mittels des pH 5,0/47°C-Extraktionsverfahrens, wie im Beispiel 10 beschrieben, extrahiert. Die Virionen wurden nach der PEG-Präzipitation verschiedenen Analysen unterworfen, um die biochemischen und Reinheitsprofile zu ermitteln. Tabelle 9. Virionreinheitsprofile nach der großtechnischen Isolation mittels der pH 4,0/47°C- und pH 5,0/47°C-Verfahren.
    Figure 00300001
    • * Matrixgestützte Laserdesorptionsionisierungs-Flugzeit, Massenspektrometrie.
    Tabelle 10. Elementaranalyse von Virionen nach der großtechnischen Isolation mittels der pH 4,0/47°C- und pH 5,0/47°C-Verfahren
    Figure 00300002
    • ** Die Endotoxinniveaus wurden durch den chromogenen Limulus-Amöbozytenlysattest bestimmt.
    Tabelle 11. Aminosäureanalyse der Virionen nach großtechnischer Isolation mittels der pH 4,0/47°C- und pH 5,0/47°C-Verfahren.
    Figure 00310001
    • *** Menge an analysierter Probe, Nassgewicht (960808: 537,47 mg, 960829: 554,28 mg).
  • Ergebnisse:
  • Die Analyse der mit PEG gereinigten Virionpräparate, die über die großtechnischen pH 5,0/47°C- und pH 4,0/47°C-Verfahren erzeugt wurden, zeigen einen hohen Reinheitsgrad und keinen detektierbaren TMV-Hüllproteinabbau. Die Absorptionsfähigkeitsverhältnisse von 1,20 bei 260/280 nm (Tabelle 9) sind ein Beispiel für stark gereinigtes TMV. Darüber hinaus liegen die MALDI-TOF-Massen von beiden Viruspräparaten (Tabelle 9) im experimentellen Bereich für das vorhergesagte Hüllprotein-Molekulargewicht. Beide Viruspräparate enthielten niedrige Niveaus an Lipiden, Nikotin und Endotoxin, was wiederum die Nützlichkeit dieser Verfahren bei der Isolation und Reinigung von Virionen und Virusfusions-Hüllprotein zeigt. Die Elementaranalysen der Virusextrakte (Tabelle 10) sind ein Beispiel für die stark gereinigten Proteine, wie durch die relativen Verhältnisse der verschiedenen Elemente bestimmt. Die Aminosäureprofile der Virusproben (Tabelle 11) spiegeln die relative Fülle an jeder vorhergesagten Aminosäure wider und reflektieren auch die vorhergesagten Unterschiede der Aminosäuren zwischen den beiden Testproben.
  • Es wurde gezeigt, dass beide Virusproben beim Übertragen auf Wirtspflanzen infektiös waren, was zeigt, dass die beschriebenen Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Virionen führten. Die RT-PCR Analyse der Virusextrakte erzeugte die vorhergesagten Nukleinsäurefragmente, was auf intakte RNA-Genom hinweist.
  • Obwohl die Erfindung mit Bezug auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen beschrieben ist, ist davon auszugehen, dass verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen. Demgemäß wird die Erfindung nur durch die anschließenden Ansprüche beschränkt.

Claims (20)

  1. Verfahren zum Gewinnen eines Virus aus einer Pflanze, umfassend die sequenziellen Schritte des: (a) Homogenisierens einer Pflanze oder eines Pflanzengewebes zur Erzeugung eines grünen Safts; (b) Einstellens des pH-Werts des grünen Safts auf unter oder gleich 5,2; (c) Erwärmens des grünen Safts auf eine minimale Temperatur von 45°C; (d) Zentrifugierens des grünen Safts zur Erzeugung von Überstand und Pellet; und (e) Reinigens des Virus aus dem Überstand und Pellet.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts zwischen 4,0 und 5,2 eingestellt wird und im Schritt (c) der grüne Saft für mindestens eine Minute auf eine Temperatur zwischen 45°C und 50°C eingestellt wird.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei im Schritt (d) Protein der Fraktion 1 durch das Zentrifugieren pelletiert wird und Proteine der Fraktion 2 im Überstand von Überstand und Pellet verbleiben.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei im Schritt (e) das Virus aus der Überstandsfraktion von im Schritt (d) erzeugtem Überstand und Pellet gereinigt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts zwischen 4,0 und 5,2 eingestellt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts zwischen 5,0 und 5,2 eingestellt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei im Schritt (b) der pH-Wert des grünen Safts auf etwa 5,0 eingestellt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der grüne Saft auf eine Temperatur zwischen 45°C und 50°C erwärmt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die Überstandsfraktion von im Schritt (d) erzeugtem Überstand und Pellet weiter einer Ultrafiltration unterworfen wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Ultrafiltration ein Permeat erzeugt, das ein oder mehr Moleküle umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Alkaloiden, Aromaverbindungen, Pigmenten und Proteinen der Fraktion 1 und 2 ausgewählt sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend den Schritt der Zugabe von Polyethylenglycol zu einem Konzentrat, das aus der Ultrafiltration resultiert.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei im Schritt (e) das Virus aus dem Pellet von im Schritt (d) erzeugtem Über stand und Pellet gereinigt wird und wobei Schritt (e) die folgenden sequenziellen Schritte umfasst: (i) Resuspendieren des Pellets in einer flüssigen Lösung; (ii) Einstellen des pH-Werts der flüssigen Lösung, umfassend das resuspendierte Pellet, zwischen pH 5,0 und pH 8,0; (iii) Zentrifugieren der flüssigen Lösung, enthaltend das resuspendierte Pellet zur Erzeugung eines Überstands; und (iv) Reinigen des Virus aus dem im Schritt (iii) erzeugten Überstand.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei im Schritt (e) das Virus aus dem Pellet von im Schritt (d) erzeugtem Überstand und Pellet gereinigt wird und wobei Schritt (e) die folgenden sequenziellen Schritte umfasst: (i) Resuspendieren des Pellets in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen pH 5,0 und pH 8,0; (ii) Zentrifugieren der flüssigen Lösung, die das resuspendierte Pellet enthält, zur Erzeugung eines Überstands; und (iii) Reinigen des Virus aus dem im Schritt (ii) erzeugten Überstand.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei das Reinigen durch Polyethylenglycolpräzipitation oder Ultrafiltration durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, weiter umfassend den Schritt der Zugabe von Polyethylenglycol zu einem Konzentrat, das aus der Ultrafiltration resultiert.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Ultrafiltration ein Permeat erzeugt, das ein oder mehr Moleküle umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, Alkaloiden, Aromaverbindungen, Pigmenten und Proteinen der Fraktion 1 und 2 ausgewählt sind.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Virus ein plus-Sense-RNA-Virus ist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Virus aus der Gruppe bestehend aus einem Potyvirus, einem Tobamovirus, einem Bromovirus, einem Carmovirus, einem Luteovirus, einem Marafivirus, der MCDV-Gruppe, einem Necrovirus, der PYFV Gruppe, einem Sobemovirus, einem Tombusvirus, einem Tymovirus, einem Capillovirus, einem Closterovirus, einem Carlavirus, einem Potexvirus, einem Comovirus, einem Dianthovirus, einem Fabavirus, einem Nepovirus, einem PEMV, einem Furovirus, einem Tobravirus, einem AMV, einem Tenuivirus und einem Reisnekrosevirus ausgewählt ist.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Virus aus der Gruppe bestehend aus einem Caulimovirus, einem Geminivirus, einem Reovirus, der commelina yellow mottle Virusgruppe und einem Cryptovirus ausgewählt ist.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Virus aus einem Rhabdovirus und einem Bunyavirus ausgewählt ist.
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