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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von Viren und die
Ernte und Reinigung von Viruspräparaten
aus virusinfizierten Zellkulturen, beispielsweise für experimentelle
und therapeutische Zwecke, z.B. zur Herstellung pharmazeutischer
Formulierungen wie etwa Virusvakzinen. In speziellen Aspekten betrifft
die Erfindung Verfahren und Anordnungen für die Herstellung von Präparaten
aus Herpesviren. Andere Aspekte der Erfindung werden aus der nachstehenden
Beschreibung ersichtlich.
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Hintergrund
der Erfindung und Stand der Technik
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Mehrere
Verfahren sind zur Herstellung von Lebendviruspräparaten, z.B. Herpesvirus-Präparaten,
als Vakzinen und zu anderen Zwecken bekannt.
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Die
US 3.985.615 (Osaka Res
Foundation: T. Kubo et al.) beschreibt beispielsweise die Herstellung
von Lebend-Varizellavirus zur Verwendung als Vakzine durch Kultivierung,
die das Überimpfen
in Meerschweinchen-Primärembryonalgewebezellen umfasst.
Die
US 5.024.836 (Merck:
WJ McAleer et al.) betrifft die Herstellung von darauf basierenden
lyophilisierten Vakzinenpräparaten.
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Die
DD-209.738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu) veranschaulicht die
Herstellung eines anderen Herpesvirus-Typs zur Verwendung als Vakzine
gegen die Marek'sche
Krankheit, der durch (a) Kultivieren spezifischer, pathogenfreier
Hühnerembryonalzellen
auf Dextranmikroperlen; (b) Inokulieren von Puten-Herpesvirusstamm
FC-126 (Klon 1, IIIb) in die Kultur bei 80 % Konfluenz; (c) Sammeln
der infizierten Zellen in SPGA-Medium (Saccharose, Phosphat, Glutamat,
Rinderalbuminfraktion V), wenn die zytopathische Wirkung 80 % beträgt; (d)
Aussetzen der Suspension gegenüber
drei Ultraschallimpulsen von 1-minütiger Dauer in 2-Minuten-Intervallen
und Zentrifugieren der Suspension, um eine erste Ausbeute an Vakzine
zu erhalten; (e) Resuspendieren des Sediments in SPGA-Medium und
Wiederholen von Schritt (d), um eine zweite Ausbeute an Vakzine
zu erhalten (um die Vakzinenausbeute um beinahe 20 % zu erhöhen); (f)
Einfrieren der kombinierten Vakzinen bei –100 °C vor der Bestimmung des Virustiters;
und (g) Verdünnen
mit SPGA-Medium und Gefriertrocknen hergestellt wird.
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Die
JP06234659-A (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) beschreibt in einem
Beispiel die Herstellung von Herpesvirusvakzine an menschlichen
diploiden Fibroblasten-MRC-5-Zellen, kultiviert in MEM-Medium bei
37 °C; umfassend
die Inokulation von Varicellavirus-Oka-Stamm-Impfgut-Virus mit einer
MOI von 0,03 in MRC-5-Zellen und das Kultivieren bei 37 °C, 2 Tage
lang. Das Virus wird dann in einer Lösung suspendiert, die 6,4 g
NaCl, 0,16 g KCl, 2,3 g Na2HPO4,
12H2O, 0,16 g KH2PO4, 50,0 g Saccharose, 1,0 g Na-L-Glutamat,
2,0 g Gelatine, 25,0 g Gelatine-Hydrolysat und 0,1 g EDA-3Na pro
Liter enthält.
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Die
EP 0.573.107 , die
US 5.360.736 und die
US 5.607.852 (Merck: PA
Friedman et al.) beschreiben Verfahren zur Herstellung von Varizella-Zoster-Virus-Lebendvakzinen,
einschließlich
eines Verfahrens zur Herstellung einer abgeschwächten, zellfreien Varicella-Zoster-Virus-
(VZV-) Lebendvakzine, das die folgenden Schritte umfasst: (a) das
Kultivieren von VZV-Infektions-anfälligen Zellen, ausgewählt aus
menschlichen diploiden Zellen, bis zur Konfluenz in Monolayer-Kultur
unter Bedingungen ausreichend hoher Nährstoffkonzentration, um einen
hohen Grad an Zellreplikation zu erzielen, und unter Zufuhr eines nicht
metabolisierbaren Disaccharids; (b) das Infizieren der gemäß Schritt
(a) kultivierten Zellen möglichst nahe
dem Konfluenzpunkt mit einer praktisch durchführbaren Infektionsmultiplizität von VZV-infizierten Zellen;
(c) das Halten der VZV-infizierten Kultur in einem Zustand hoher
Ernährung über einen
Zeitraum von etwa 22-96 h hinweg und das Ernten zum Zeitpunkt des
Maxumums der infektiösen
VZV-Produktion; (d) das Waschen der VZV-infizierten Kultur mit einer
physiologischen Lösung,
die gegebenenfalls ein lysosomotropes Mittel wie Ammoniumchlorid
oder Chloroquin enthält,
vor dem Ernten der VZV-infizierten Zellen; (e) das Ernten der VZV-infizierten
Zellen in ein Mindestvolumen einer stabilisierenden Lösung und
entweder den Aufschluss der Zellen unmittelbar danach oder das Einfrieren
der Zellen für
späteren Zellaufschluss;
(f) den Aufschluss der VZV-infizierten Zellen, um gegebenenfalls
zellassoziiertes VZV freizusetzen, und das Entfernen von Zelltrümmern, um ein
zellfreies VZV-Präparat
bereitzustellen. Das Verfahren offenbart die Verwendung von Zelldichten
bis zu etwa 500.000 Zellen/cm
2 in herkömmlichen
Kulturgefäßen. Das
Verfahren wird für
die Massenproduktion von Lebendvakzinen vorgeschlagen. Geeignetes Nährmedium
zum Züchten
von Zellen in Monolayer-Kultur
in dieser Verbindung wird als eines beschrieben, das im Wesentlichen
aus SFRE-2-Medium, ergänzt
mit zwischen 0,2 mg/ml und 0,4 mg/ml Sojabohnenflüssigkeit,
besteht, wobei die Zellen aus MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen und Vero-Zellen
ausgewählt
werden.
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Die
WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC Inglis et al.) und die WO 94/21807
(Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis et al.) sind Beispiele
für die
Bereitstellung von rekombinanten Zellen und Kulturverfahren zur
Herstellung von genetisch deaktiviertem Herpesvirus wie Herpes-Simplex-Virus
zur Verwendung als Vakzine.
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Es
ist bekannt, dass sich Herpes-Simplex-Virus an Zelloberflächen-Heparansulfat
binden kann (E. Lycke et al., J. Gen Virol 72, 1131–1137 (1991)).
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Für Viren
wurde darüber
hinaus gezeigt, dass sie sich an sulfonierte Polysaccharide wie
Dextransulfat, Heparin- und Heparansulfat binden (M. Baba et al.,
PNAS 85, 6132–6136
(1988); E. Lycke et al., s.o.; und H. Mitsuya et al., Science 240,
646–649 (1988)).
Auch ist bekannt, dass sie Affinitätsbindung und Reinigung von
Katzen-Herpesvirus an einem sulfonierten Derivat von perlenförmiger,
regenerierter Cellulose mit einer Teilchengröße von 80 μm und einer Porenstruktur, von
der angenommen wird, dass sie Viruspartikel abweist, durchführen (P.F.
O'Neil und E.S.
Balkovic, Bio-Technology
11(2), 173–178 (1993)).
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Es
bleibt wünschenswert,
Verfahren zur Behandlung von Herpesvirus-hältigen Präparaten bereitzustellen, insbesondere
weitere Reinigungsverfahren, die in der Lage sind, zur Herstellung
infektiöser
Viruspräparate
mit guter Ausbeute und Reinheit, z.B. jene, die in Vakzinen einzusetzen
sind, beizutragen.
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ZUSAMMENFASSUNG
UND BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung können Herpesvirus-Präparate auf
nützliche
Weise durch Affinitätsreinigung
an einer Festphase (Affinitätsbindungsreagens),
die Materialien mit Affinität
zu Heparin kompetitiv binden kann, gereinigt werden. Die Erfindung
ist beispielsweise besonders gut an infektiösen Präparaten menschlicher Herpesviren
wie Herpes-Simplex-Virus (HSV), z.B. HSV vom Typ 2, das beim Züchten in
Kultur stark dazu neigen kann, zellassoziiert zu bleiben, anwendbar.
Das das Virus tragende Affinitätsreagens,
das aus einer Trägerflüssigkeit
aufgebracht werden kann, die Salz (z.B. Natriumchlorid oder ein
anderes, pharmazeutisch annehmbares Salz über etwa 0,4 M) enthält oder
Heparin oder ein anderes, sulfatiertes oder sulfoniertes Polysaccharid
(z.B. im Bereich von etwa 10–250,
wie beispielsweise 50, μg/ml)
enthält,
kann dann in geeigneter Weise gewaschen werden, und das Virus kann
in aktiv infektiöser
Form durch Elution, z.B. mit hochkonzentrierter Salzlösung oder
mit sulfatiertem oder sulfoniertem Polysaccharid, gewonnen werden.
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Beispiele
für zur
Verwendung in diesem Zusammenhang geeignete Festphasen umfassen
eine Heparin-tragende Festphase und Festphasen mit ähnlicher
Bindungsfunktionalität,
z.B. vorzugsweise mit einer sulfatierten (oder sulfonierten) Polysaccharid-Bindungsfunktionalität. Geeignete
Affinitätsbindungsreagenzien
können
Bindungsgruppen tragen, die Sulfat oder Sulfonat zusammen mit nichtionischen
polaren Gruppen enthalten. Die sulfatierten Polysaccharide enthalten
beispielsweise Sulfatgruppen und Hydroxygruppen. Beispiele für Festphasen, die
sulfatiertes Polysaccharid tragen, umfassen Dextransulfat oder Heparinsulfat.
Vorzugsweise können die
sulfatierten oder sulfonierten Gruppen an Seitenketten, z.B. Polymerseitenketten,
in Bezug auf das Material der Festphase getragen werden und können somit
auch andere Gruppen als Harze und vernetzte Polymerperlen sein,
die direkt mit solchen sauren Gruppen derivatisiert wurden. Festphasen,
die andere sulfathältige
oder sulfonathältige
Bindungsreagenzien als jene, die bereits erwähnt wurden, tragen, wie z.B.
Disulfon- und Harnstoff-Copolymere oder Protaminsulfat, können verwendet
werden.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst ein bevorzugtes Mittel
zur Freisetzung von Herpesvirus aus Zellkulturen von virusinfizierten
Zellen, z.B. Vero-Zellen, Dextransulfat. Ein Beispiel für ein Dextransulfat-Präparat, das
zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet ist, weist beispielsweise
ein Molekulargewicht von etwa 5.000 auf, wobei jedoch zahlreiche
verschiedene Präparate
ausgewählt
werden können.
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Ein
Beispiel für
eine geeignete Form von Heparin-tragender Festphase für den Affinitätsreinigungsschritt
umfasst Pharmacia Heparin HP-Säulenchromatographiematerial
(basierend auf hochvernetztem Agarosegel) (z.B. mit einem Durchmesser von
etwa 34 μm),
das bei Pharmacia Biotech in Form von HiTrapTM-
vorbereiteten Säulen
erhältlich
ist. Zahlreiche andere Festphasenpräparate, die von Heparin oder
Heparinsulfat abgeleitet sind, können auch
als geeignet in Betracht gezogen werden.
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Ein
weiteres und zur Zeit bevorzugtes Beispiel für ein Affinitätsbindungsreagens
zur Verwendung in der Erfindung trägt Polyacrylamidseitenketten,
die mit Sulfoisobutylgruppen substituiert sind, und umfasst z.B.
Gruppierungen wie -CO-NH-C(CH3)2-CH2SO3-. Ein geeignetes und bevorzugtes Beispiel
für solch
ein Affinitätsreagens
ist beispielsweise im Handel bei Merck (Darmstadt, Deutschland)
unter der Namen FractogelTM EMD SO3 650 (M) erhältlich und basiert auf Polyacrylamidperlen,
die derivatisiert wurden, um, daran kovalent gebunden, Polyacrylamidseitenketten
bereitzustellen, in denen zahlreiche der Amidgruppen durch Sulphoisobutylgruppen
substituiert sind. Ein weiteres Beispiel für ein nützliches Affinitätsbindungsreagens
ist ein Präparat
aus Sephacryl- (TM: Pharmacia) Perlen mit Dextransulfatgruppen von
etwa 10^6 MG, tentakelförmig
daran angebunden, d.h. dass die Gruppen daran kovalent gebunden
sind und von der Oberfläche
der Perlen vorstehen.
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Somit
können
Herpesvirus-Präparate
durch Affinitätsreinigung
an einer Heparin-tragenden Festphase oder einer Festphase, die eine
Sulfat oder Sulfonat umfassende Bindungsgruppe trägt, vorzugsweise
mit einer sulfatierten Polysaccharid-Bindungsfunktionalität, d.h.
eine Festphase, die Materialien mit Affinität für Heparin kompetitiv binden
kann, auf nützliche
Weise gereinigt werden. Beispiele für solche Festphasen sind jene,
die Polysaccharid, z.B. Dextransulfat oder Heparan- (Heparin-) Sulfat,
tragen. Alternativ dazu können
Festphasen, die andere sulfathältige
Bindungsmittel wie Biphenyldisulfonsäure-Harnstoff-Copolymere oder
Protaminsulfat tragen, verwendet werden.
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Die
Affinitätsreinigung
kann beispielsweise unter Verwendung eines Kochsalzlösungsgradienten-Eluenten,
z.B. von 0,1 M bis 1,5 M gepufferter NaCl, durchgeführt werden.
Alternativ dazu kann das Virusmaterial in relativ hohen Salzkonzentrationen, z.B.
etwa 0,8 M, oder in Gegenwart von Heparin oder Dextransulfat verwendet
werden, und das Verfahren kann einen Waschschritt bei etwa 0,7 M
NaCl umfassen, gefolgt von einem Elutionsschritt bei etwa 1,5 M NaCl.
Häufig
ist es nicht erforderlich, ein salzreiches Viruspräparat vor
dem Auftragen auf die Heparinsäule
zu dialysieren. Die exakten Salzkonzentrationen selbst sind oft
nicht maßgeblich
und können
entsprechend den Details der anderen Reagenzien und Bedingungen
leicht eingestellt und optimiert werden.
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Die
Affinitätsreinigung
kann typischerweise an einem Viruspräparat durchgeführt werden,
das aus einer Kultur von geeignet infizierten Wirtszellen wie Vero-Zellen
gewonnen wurde. Das anfängliche Ernten
der Viren aus der Kultur erfolgt ohne nennenswerten Zellbruch unter
Verwendung von Elution durch Heparin- oder Dextransulfat oder einem
entsprechenden Mittel oder unter Verwendung von Elution mit Kochsalzlösung.
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Es
kann praktisch sein, solch ein anfänglich geerntetes Viruspräparat durch
ein Membranfilter zu filtrieren, z.B. durch ein etwa 5-μm-Membranfilter oder
feiner, um vor der Affinitätsreinigung
eine geklärte
Virussuspension zu erhalten.
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Unter
Anwendung von Beispielen der Erfindung, z.B. wie nachstehend beschrieben,
ist es möglich,
Virusfraktionen zu bilden, die nützlich
reduzierte-Konzentrationen von DNA und Protein in Bezug auf den
Virustiter enthalten.
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Das
Virusprodukt der Affinitätsreinigung kann,
sofern erwünscht,
jeglichen weiteren ausgewählten
Reinigungsschritten unterzogen werden. Besonders nützlich kann
es sein, um einen Filtersterilisierungsschritt, z.B. mit einem Feinporenfilter
in der Größenordnung
von etwa 0,22 μm
Porengröße, einzubinden.
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In
zur Zeit bevorzugten Beispielen der vorliegenden Erfindung kann
Affinitätsreinigung
am Produkt einer Zellkultur, die mit einem Herpesvirus infiziert
ist, nach vorangehender Behandlung der Kultur durch eine Ernte-Inkubation
mit einem Polysaccharidsulfat, z.B. mit Dextransulfat oder Heparinsulfatlösung, um
eine Virussuspension zu erhalten, durchgeführt werden. Die Polysaccharidsulfatlösung kann
mit der Zellkultur, z.B. bei einer Konzentration in der Größenordnung
von etwa 50 μg/ml
für Heparinsulfat
oder etwa 100 μg/ml
für Dextransulfat,
z.B. in pH7-Citratpuffer, über
eine Kontaktzeitspanne von etwa drei Stunden hinweg kontaktiert
werden, um eine Flüssigkeit
zu erlangen, die einen nützlichen
Virusgehalt und einen im Vergleich zum Produkt aus dem Ultraschallaufschluss
(z.B.) sehr stark reduzierten Gehalt an Zellen oder Zelltrümmern enthält. Dieses
Verfahren kann beispielsweise besonders gut einsetzbar sein, um
eine verbesserte Ausbeute an Virus für die Herstellung von Lebendvirusvakzinen
zu erhalten.
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Alternativ
dazu, jedoch nach dem aktuellen Stand weniger bevorzugt, kann hypertonische
wässrige
Salzlösung
in dieser Phase verwendet werden, z.B. Natriumchlorid, Natriumsulfat,
Kaliumchlorid und dergleichen. Vorzugsweise kann solch eine Salzlösung Natriumchlorid
bei einer Konzentration von beispielsweise etwa 0,8 bis 0,9 M oder
darüber
umfassen. Wird Natriumsulfat verwendet, so kann die Konzentration
vorzugsweise etwa 0,4 M oder mehr betragen. Andere Salze können, sofern
erwünscht,
bei einer ähnlichen
Osmolarität
oder Ionenstärke
wie im Fall der oben genannten Konzentrationen verwendet werden.
Das Virus kann häufig
einer Salzkonzentration von 1 M oder 2 M standhalten, doch in jedem
Fall wird bevorzugt, nicht weit über
die angegebene Konzentration hinaus zu gehen, sodass überschüssiges zelluläres Protein
in der Kochsalzlösung
vermieden wird. Puffer und andere Bestand teile können in geeigneter Weise gemäß der normalen
Praxis im Umgang mit den betroffenen Viren ausgewählt werden.
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Die
Ernte-Inkubation kann unter leichtem Rühren durchgeführt werden
und erfolgt in solcher Weise, dass kein oder nur minimaler Zellaufschluss eingebunden
ist. Die mittels Ernte-Inkubation zu behandelnde Kultur kann beispielsweise
eine Monolayer-Kultur
oder eine Mikroträgerkultur
oder eine Rollflaschenkultur sein.
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Das
Ernte-Polysaccharidsulfat, z.B. Dextransulfat, oder die Salzlösung, kann
gepuffert und bei einem pH und einer Temperatur gehalten werden,
die als solche für
die Kultur der virusinfizierten Zellen geeignet sind, z.B. bei einem
pH von etwa 7 mit Citratpuffer und vorteilhafterweise bei einer
Temperatur von etwa 34 °C
für Herpesvirus
wie z.B. Herpes-Simplex-Virus.
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Die
Kontaktdauer zwischen den kultivierten Zellen und der Ernteflüssigkeit
ist nicht besonders maßgeblich
und kann beispielsweise im Bereich von etwa 2–24 h liegen. In Verbindung
mit bestimmten Beispielen wurde erkannt, dass beispielsweise etwa 4
Stunden Kontaktdauer zu bevorzugen ist, da dies eine gute Ausbeute
mit annehmbar niedrigen Konzentrationen von zellulärem Protein
liefern kann.
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Nach
dem Kontakt zwischen den kultivierten infizierten Zellen und der
Ernteflüssigkeit
kann die Flüssigkeit,
die die geernteten Viruspartikel enthält, durch Dekantieren oder
jedes andere geeignete Verfahren abgetrennt werden: Die kultivierten
Zellen selbst können
an die Oberfläche,
auf der sie kultiviert wurden, gebunden bleiben und können nach
der Abtrennung der Ernteflüssigkeit
verworfen werden.
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Die
Ernteflüssigkeit
kann anschließend,
sofern erwünscht,
durch Filtration und/oder Zentrifugation behandelt werden, um übrige Zellen
zu entfernen.
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Sollte
es erwünscht
sein, das Medium, in dem das geerntete Viruspräparat enthalten wurde, zu wechseln,
so kann dies durch Verdünnung
oder Diafiltration, z.B. auf etwa isotonische Konzentration, z.B.
auf etwa 138 mM in gepuffertem Natriumchlorid, erfolgen.
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Gemäß einem
weiteren Merkmal, das in einem Verfahren gemäß der Erfindung angewandt werden
kann, kann das auf diese Weise geerntete Viruspräparat mit Nucleaseenzym entweder
vor (oder weniger bevorzugt nach) der Affinitätsreinigung behandelt werden,
um jeglichen Gehalt an kontaminierender Nucleinsäure auf ein annehmbares Niveau
zu reduzieren.
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Die
virushältige
Flüssigkeit
kann beispielsweise mit BenzonaseTM-Nucleaseenzym
behandelt werden, um freie Nucleinsäuren (vor allem DNA, und üblicherweise
auch RNA) auf bis zu etwa 50 Einheiten/ml in Gegenwart von etwa
2–10 mM
Magnesiumionen, jeweils etwa 1 h lang bei etwa 4 °C bis Raumtemperatur
h, abzubauen.
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Die
Konzentration an Nucleaseenzym und anderen Proteinen kann dann beispielsweise
entweder durch den hierin beschriebenen Affinitätsreinigungsschritt oder auf
andere Weise, z.B. durch Diafiltration gegen einen geeigneten Formulierungspuffer
durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 500 kD, verringert
werden.
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Nach
solchen Behandlungen kann das geerntete Virus in eine erwünschte Trägerflüssigkeit transferiert
und eingefroren, gefriergetrocknet/lyophilisiert oder auf beliebige
andere geeignete Weise stabilisiert werden. Im Allgemeinen kann
das Herpesvirus zur Verwendung als Vakzine mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
oder Arzneimittelträger
formuliert und gegebenenfalls sterilisiert und eingefroren oder
gefriergetrocknet, z.B. bei etwa –80 °C eingefroren, werden. Somit
kann die Erfindung zur Herstellung stabilisierter Vakzinen, die
infektiöses Herpesvirus,
wie z.B. menschliches Herpes-Simplex-Virus, z.B. HSV vom Typ 2,
z.B. in Form einer genetisch deaktivierten Mutante eines solchen
Virus, enthält,
verwendet werden.
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Verfahren
gemäß den Beispielen
der Erfindung können
einen besonderen Vorteil in Verbindung mit stark zellassoziierten
Viren bieten, d.h. mit jenen Viren, die einen besonders hohen Grad
an Zellassoziation in Kultur aufweisen, beispielsweise Herpes- Simplex-Virus vom
Typ 2 (HSV-2), Rinderherpesvirus (BHV), Putenherpesvirus und Varicella-Zoster-Virus
(VZV), manchmal auch Pseudorabies-Virus.
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Die
Erfindung kann unter Durchführung
jeglicher geeigneter Detailanpassungen, wie dies für Fachleute
ersichtlich ist, für
Herpesviren verschiedener Typen angewandt werden, einschließlich beispielsweise
Wildtyp-Herpes-Simplex-Virus und genetisch deaktivierter Herpesviren
wie Herpes-Simplex-Virus und beispielsweise auch anderer Herpesviren,
wie sie in den hierin zitierten Dokumenten angeführt werden.
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Die
durch die Anwendung von hierin beschriebenen Verarbeitungsschritten
erhaltenen Viruspräparate
können
weiter verarbeitet und beispielsweise zusammen mit an sich bekannten
Bestandteilen von Virusvakzinen Teile von pharmazeutischen Zusammensetzungen
sein.
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Die
Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher beschrieben und veranschaulicht.
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BEISPIEL:
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Ein
Verfahren gemäß einem
Beispiel der Erfindung zum Ernten und Reinigen von Viruspartikeln kann
eine Kultur von Vero-Zellen verwenden, die mit HSV-2 (z.B. einer
gH-deletierten Mutante von HSV2, wie in der WO 94/21807 für zur Verwendung
als Vakzine beschrieben) infiziert sind und im Wesentlichen auf
bekannte Weise in herkömmlichem
Kulturmedium, das in Rollflaschen mit etwa 100 ml Medium pro Flasche
enthalten ist, gezüchtet
wurden. Das Kulturmedium, der Zelltyp und die Kulturbedingungen
können
beispielsweise wie folgt festgelegt sein:
Die Vero-Zellen können mit
2 × 107 Zellen pro Rollflasche überimpft werden. Die Kultivieung
kann unter Verwendung von DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glucose ohne Natriumpyruvat
und mit Glutamax-1TM (L-Alanyl-L-glutamin),
862 mg/l, erfolgen. Inkubation kann beispielsweise bei etwa 37 °C und etwa
120 h lang (5 Tage lang) durchgeführt werden. Konfluente Zellkulturen
können
dann mit HSV-2 mit einer Infektions multiplizität von etwa 0,01 durch Verdünnen des
Virus in DMEM auf eine Konzentration, von der 1 ml zu jeder Rollflasche
zugesetzt wird, infiziert werden, wobei die Flasche anschließend in
die Roll-Inkubationsvorrichtung bei etwa 34–37 °C zurückgegeben wird. Wird eine zytopathische
Wirkung von 80 bis 100 % beobachtet, z.B. 65–72 h nach Infektion, so können die Rollflaschen
als für
die Virusernte bereit angesehen und behandelt werden.
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Das
Kulturmedium kann aus jeder Flasche dekantiert und durch 10 ml pro
Flasche einer gepufferten Erntelösung,
die 0,01 M Natriumcitrat, pH 7,0, und entweder etwa 50 μg/ml Heparinsulfat
oder etwa 100 μg/ml
Dextransulfat enthält,
ersetzt werden. Die Zellen in der Rollflasche in Kontakt mit dieser
gepufferten Erntelösung
können
gerollt und bei etwa 34 °C etwa
4 h lang inkubiert werden.
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Die
kultivierten Zellen selbst in der Rollflasche können im Grunde an der Flaschenoberfläche gebunden
bleiben und können
nach Abtrennen der Flüssigkeit,
die die geernteten Viruspartikel enthält, verworfen werden.
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Die
Flüssigkeit
in der Flasche, die die gepufferte Erntelösung und Material aus der Zellkultur
in Suspension einschließlich
des Virus umfasst, kann mittels einer Pipette entfernt und bei etwa
3.000 U/min in einer Sorvall-RT6000TM-Zentrifuge
etwa 10 min lang (z.B. bei RCFmax von etwa 1876) zentrifugiert werden.
Die Zellen im Pellet und jene, die in der Flasche zurückbleiben,
werden (unter geeigneten Virus-Sicherheitsbedingungen) verworfen,
und der Überstand
wird durch die Pipette zur nächsten
Stufe übertragen,
die kontinuierliche Durchflusszentrifugation sein kann.
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Vorfiltrieren
kann z.B. mit einem Filter durchgeführt werden, das eine Porengröße im Bereich
von 0,8–5 ηm (nicht
maßgeblich)
aufweist, um vor der Affinitätsreinigung
eine geklärte
Virussuspension zu ergeben. Die Überstandsflüssigkeit
vom Zentrifugieren kann auf eine Endkonzentration (in Bezug auf
Natriumionen) von 138 mM verdünnt
oder diafiltriert werden.
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(In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung kann, sofern erwünscht,
die verdünnte
Flüssigkeit
gegebenenfalls mit BenzonaseTM-Nucleaseenzym
behandelt werden, um freie Nucleinsäuren (das zur Zeit sehr stark
bevorzugte Enzym weist DNase-Aktivität auf und
wird üblicherweise
auch, wie BenzonaseTM, RNase-Aktivität aufweisen)
auf bis zu etwa 50 Einheiten/ml in Gegenwart von etwa 2–10 mM Magnesiumionen,
z. B. bis zu etwa 1 h lang bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis zu
Raumtemperatur, abzubauen. Es kommt jedoch auch häufig vor, dass
der Affinitätsreinigungsschritt
den Gehalt von DNA im Material ausreichend reduziert, sodass ein separater
DNase-Behandlungsschritt nicht mehr erforderlich ist. Darüber hinaus
ist, wenn Benzonase oder ein ähnliches
Enzym verwendet wird, in Bezug auf die Affinität des Enzyms für Heparin
und Heparinsäulen
und ähnliche
Materialien gewisse Vorsicht angebracht, und es ist in solch einem
Fall wünschenswert,
die Bedingungen so festzulegen, dass das endgültige Viruseluat aus der Affinitätssäule im Wesentlichen
frei von Benzonase-Enzym ist.)
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Die
virushältige
Flüssigkeit
als Zwischenprodukt kann an Pharmacia Heparin HP-Säulenchromatographiematerial
(basierend auf hochvernetztem Agarosegel; z.B. mit einem Durchmesser
von etwa 34 μm),
das bei Pharmacia Biotech in Form von fertigen HiTrapTM-Säulen erhältlich ist,
gereinigt werden. Die Zufuhrrate für das Virus kann beispielsweise
pro 5 ml Säulenmaterial
etwa 300 ml mit einer Viruskonzentration von etwa 8 × 106 pfu/ml, zugeführt mit einer Durchflussgeschwindigkeit
von etwa 1,3 ml/min, betragen. Unter Verwendung dieser Form von
Säule in
einem Beispiel für
diesen Reinigungsschritt mit einem Kochsalzlösungsgradienten, der bei etwa
138 mM NaCl beginnt und bis zu 1,5 M NaCl z.B. über etwa 10 Säulenvolumina
ansteigt, trat viraler Durchbruch im Eluat nach etwa 230 min Durchfluss
auf, einem Zeitpunkt, zu dem 3,5 × 109 pfu
die Säule
bereits passiert hatten und etwa 1,2 × 108 pfu
im Eluat aufgetreten waren. Es wird angenommen, dass theoretisch
bis zu etwa 103 pfu/ml, und praktisch bis
zu etwa 1–2 × 109 pfu/ml, Virus an diesem Adsorptionssäulenmaterial
untergebracht werden können.
Alternativ dazu kann das Affinitätsreagens
Perlen von FractogelTM EMD SO3 650
M von Merck (Darmstadt) wie zuvor beschrieben sein, verwendet in
im Allgemeinen gleicher Weise, z.B. kann das Virus in einer Trägerflüssigkeit,
die z.B. etwa 0,8 M Natriumchlorid oder 50 μg/ml Heparin enthält, eingesetzt und
nach dem Waschen mit einem Eluenten, der 1,5 M Natriumchlorid enthält, eluiert
werden.
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In
einem weiteren Beispiel von diesem Schritt wurde ein HSV-2-Viruspräparat, das
aus Vero-Zellkultur in Heparin (MonoporinTM injizierbares Heparin
mit pharmazeutischer Reinheit, niedermolekular, 50 μg/ml in Phosphat
pH 7, 10 mM und NaCl, 138 mM) freigesetzt wurde, bei etwa 3.000
U/min (c.1000 g) 10 min lang zentrifugiert und anschließend durch
ein 5-μm-Filter
filtriert. Eine Heparinsäule
wie bereits erwähnt
wurde durch Waschen mit 5 Säulenvolumina
von phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Etwa 100
ml Virusfiltrat (etwa 7.107 pfu/ml) wurden
auf die Säule
geladen. Nach Waschen mit 5–10
Säulenvolumina
an gepufferter 0,7 M Kochsalzlösung
wurde das Virus Fraktion für
Fraktion mit gepufferter 1,5 M Kochsalzlösung eluiert, und die Fraktionen,
die den bei Absorption bei 280 nm auftretenden Peak enthielten,
wurden gesammelt. Das resultierende Produkt wies (pro 107 pfu Virus) weniger als 2 ng DNA und weniger
als 1 μg
Protein auf und wurde mit einer Konzentration von etwa 2 × 109 pfu/ml gesammelt. Es konnte auf isotonische
Konzentration bei etwa 108 pfu/ml verdünnt und
eingefroren oder auf andere Weise gelagert oder verwendet werden.
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Es
zeigt sich, dass eine gute Wiederfindung des Virus aus der Säule erzielt
werden kann.
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In
bestimmten (zur Zeit weniger bevorzugten) Zusammenhängen der
Verwendung kann als ein optionaler weiterer Reinigungsschritt, sofern
erwünscht,
die virushältige
Lösung
als Zwischenprodukt tangentialer Kreuzstromfiltration (Diafiltration), z.B.
unter Verwendung eines Filters/einer Membran mit einer Ausschlussgrenze
von 500 kD in einem FiltronTM oder einer
anderen tangentialen Kreuzstromvorrichtung unter Verwendung einer
Umlaufrate von 1.000 ml/min, einer Filtrationsrate von 100 ml/min und
einer Rückspülung von
100 ml Natriumcitrat, 0,01 M, pH 7,25, das 138 mM Natriumchlorid
enthielt, unterzogen werden.
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Der
Filterrückstand
aus dem Kreuzstrom-Ultrafiltrationsschritt kann gegebenenfalls,
sofern erwünscht,
durch Diafiltration gegen 5–10
Volumina von Citrat-/Kochsalzlösungspuffer
behandelt werden, und der Filterrückstand kann schließlich 0,2 μm (sterilisierender)
Filtration, der gegebenenfalls Filtration mit einem Filter von etwa
0,45 μm
bis 5 μm
vorangeht, unter Verwendung desselben Puffers unterzogen werden.
Sofern erwünscht
kann dieser Schritt verwendet werden, um die das Viruspräparat enthaltende
Flüssigkeit
auf 20 mg/ml in einem geeigneten Stabilisator, wie z.B. einem stabilisierendem
Protein, z.B. menschlichem Serumalbumin bei etwa 20 mg/ml, zu bringen.
Manchmal kann es nützlich
sein, die Filter mit einer Flüssigkeit
vorzuwaschen, die denselben Stabilisator in demselben Puffer enthält, bevor
die Filter verwendet werden, um das Viruspräparat zu bilden.
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Das
resultierende Produkt kann in Form einer Suspension von Viruspartikeln
in Kochsalzlösungspuffer
und Stabilisator wie stabilisierendem Protein, in der die Konzentration
von Rest-DNA zufrieden stellend gering ist, erhalten werden.
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Die
Ausbeute aus Verfahren wie jenen, die soeben beschrieben wurden,
wurde z.B. im Vergleich mit Verfahren, die Ultraschall-Zellaufschluss,
um Viruspartikeln freizusetzen, gefolgt von Abtrennung von Viruspartikeln
von Zelltrümmern
einbanden, als ausreichend gut beurteilt.
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Die
Erfindung kann beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform,
die gemäß dem oben beschriebenen
Beispiel durchgeführt
wird, zum Kultivieren und Ernten von genetisch deaktiviertem HSV-2-Virus
zur Verwendung als Vakzine in nützlicher
Weise eingesetzt werden, wobei dieses Virus eine Deletion in Bezug
auf das gH-Gen, das für
die Produktion von neuen infektiösen
Viruspartikeln wesentlich ist, aufweist und in einer Zelllinie kultiviert werden
kann, die auf Vero-Zellen basiert, die rekombinant hergestellt wurden
und in der Lage sind, das virale gH-Gen zu exprimieren, das im viralen
Genom fehlt, wie beispielsweise in den Beschreibungen der WO 92/05263
und der WO 94/21807 beschrieben wird (siehe auch A. Forrester et
al., J. Virol. 66, 341–348
(1992), sowie H.E. Farrell et al., J. Virol. 68, 927–932 (1994)
und C. McLean et al., J. Infect. Dis. 170, 1100–1109 (1994)).