DE69023648T3 - Herstellung eines virusimpfstoffes - Google Patents
Herstellung eines virusimpfstoffes Download PDFInfo
- Publication number
- DE69023648T3 DE69023648T3 DE69023648T DE69023648T DE69023648T3 DE 69023648 T3 DE69023648 T3 DE 69023648T3 DE 69023648 T DE69023648 T DE 69023648T DE 69023648 T DE69023648 T DE 69023648T DE 69023648 T3 DE69023648 T3 DE 69023648T3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- virus
- glycoprotein
- piv
- proteins
- purified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 62
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 9
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 16
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 claims description 2
- 101000926057 Human herpesvirus 2 (strain G) Envelope glycoprotein C Proteins 0.000 claims 2
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 22
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 18
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 8
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 8
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 230000003141 anti-fusion Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000144290 Sigmodon hispidus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- -1 octyl glycoside Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
- C12N2760/18622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von Hüll-Glycoproteinen, insbesondere aus der Familie der Paramyxoviridaefamilie von humanpathogenen Viren, sowie die Formulierung eines Gemisches der gereinigten Glycoproteine unter Bildung eines wirksamen und sicheren Impfstoffes zur Vrwendung bei Babies und kleinen Kindern zum Schutz gegen die durch die Viren verursachten Krankheiten.
- Hintergrund der Erfindung
- Viren vom humanen Parainfluenzatyp 3 (PIV-3) und der Respiratory Syncytial Untergruppen A und B (RSV-A, B), die Vertreter der Paramyxoviridae sind, wurden als die hauptsächlichen Pathogenen identifiziert, die für schwere Atemwegserkrankungen bei Babies und kleinen Kindern verantwortlich sind. Es wurde gezeigt, daß sowohl Formaldehyd-inaktivierte und Lebend-attenuierte Impfstoffe keinen geeigneten Schutz gegen diese Erkrankungen in klinischen Versuchen geben können. Derzeit sind keine sicheren und wirksamen Impfstoffe für den Schutz gegen diese viralen Infektionen verfügbar. Daher ist die Entwicklung von wirksamen PIV-3 und RSV Impfstoffen dringend erforderlich.
- Die hauptsächlich immunogenen Proteine von RSV und PIV-3 wurden identifiziert und gaben so einen wissenschaftlichen Ansatzpunkt für einen Versuch, auf der Basis von Untereinheiten einen Impfstoff zu entwickeln. Es wurde gezeigt, daß eine schützende in vivo Reaktion von der Induktion neutralisierender Antikörper gegen die hauptsächlichen,viralen Oberflächenglycoproteine abhängt. Für PIV-3 sind diese schützenden Immunogene das HN Protein, das ein Molekulargewicht von 72 kDa aufweist und sowohl Hämagglutinin- als auch Neuraminidaseaktivität besitzt, und das F-Protein (Fusionsprotein), das ein Molekulargewicht von 65 kDa aufweist und sowohl für die Fusion des Virus mit der Wirtszellmembran als auch für die Weitergabe des Virus von Zelle zu Zelle verantwortlich ist. Immunogenitätsuntersuchungen in Hamstern zeigten, daß Antikörper sowohl gegen das HN-Protein als auch gegen das F-Protein für einen Schutz gegen einen Befall mit PIV-3 essentiell sind. Zusätzlich wurde berichtet, daß das Vorkommen der Antikörper gegen beide Hüll-Glycoproteine mit dem Schutz von Kindern zusammenhängt, die auf natürliche Weise mit PIV-3 infiziert wurden. R. Ray und R.W. Compans, J. Gen. Virol. (1987) 68: 409-418 isolierten und reinigten die HN- und F-Glycoproteine des humanen PIV-3. Die Reinigung der Glycoproteine wurde mit einer Immunaffinitätssäule erreicht.-Die Antikörper auf den Säulen waren monoklo nale Antikörper, die gegen die Glycoproteine erzeugt wurden. Die Viruspartikel für die Reinigung wurden in Nierenzellen vom Rhesusaffen (LLC-MK2) hergestellt, die in Dulbecco's Medium angezogen wurden, das 10 % hitzeinaktiviertes Serum von neugeborenen Kälbern enthielt. Das Antiserum wurde in Kaninchen gegen die immunaffinitätsgereinigten Glycoproteine HN und F erzeugt. Die Antiseren waren zur Hemmung der biologischen Aktivitäten des Virus fähig.
- Bei RSV sind die zwei immunogenen Oberflächenglycoproteine das 80-90 kDa Glycoprotein (G) und das 70 kDa Fusionsprotein (F). Die G-und F-Proteine dürften jeweils zu den HN- und F-Proteinen von PIV-3 funktionell analog sein. Beim Menschen sind Antikörper gegen beide virale Oberflächenglycoproteine von PIV-3 zum Schutz gegen die PIV-3 Infektion notwendig, während anti-Fusionsproteinantikörper ausreichen, um eine über Kreuz schützende Reaktion gegen eine RSV Infektion hervorzurufen.
- Eine detaillierte Diskussion über das Gebiet der Erfindung findet man im Lehrbuch Virology, B.N. Fields et al., Raven Press N.Y. (1985). Insbesondere Kapitel 52 Seiten 1241-1253 "Parainfluenza Viruses" von R.M. Chanock und K. McIntosh und Kapitel 54 Seiten 1285-1305 "Respiratory Syncytial Virus" von K. McIntosh und R.M. Chanock.
- Die Erfinder haben ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung der PIV-3 und RSV Viren wie auch ein allgemeines Verfahren zur Reinigung von viralen Hüll-Oberflächenglycoproteinen entwickelt. Dieses Verfahren führt zu Präparationen, die potente PIV-3 Immunogene in Versuchstieren sind und könnten zur Verwendung als Impfstoffe bei Kindern annehmbar sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Impfstoffes gegen ein komplexes Virus bereitgestellt, umfassend das Züchten eines komplexen Virus, bei dem mindestens ein Hüll-Glycoprotein in der Lage ist, eine immunogene Antwort hervorzurufen, in einer Gewebekultur, die im wesentlichen frei ist von exogenen Wachstumsfaktoren und Serumproteinen, auf einem Zellsubstrat, das geeignet ist zur Verwendung bei der Bildung eines Humanimpfstoffes, Isolieren des Virus von der Gewebekultur, Löslichmachen des mindestens einen Hüll-Glycoproteins von dem Virus und Isolieren des mindestens einen Hüll-Glycoproteins und Zubereiten des Glycoproteins zu einem Impfstoff. Dieses Verfahren ist direkt auf die Herstellung von Viren und die Reinigung von Oberflächenglycoproteinen jedes Hüllvirus, wie Infuenza, anwendbar, bei dem die Haupthüllproteine beim Hervorrufen einer Immunantwort wichtig sind.
- Bei der vorliegenden -Erfindung werden Hüllviren, wie PIV-3 und RSV Viren in einer Gewebekultur auf Zellsubstraten angezogen, die leicht zur Verwendung bei der humanen Impfstoffherstellung annehmbar sind, wie die humane diploide Zellinie MRC-5 in einem Medium, das im wesentlichen frei ist von exogenen Serumproteinen. Überraschenderweise setzen die Zellen unter diesen Bedingungen die Bildung von PIV-3 für mehr als drei Wochen fort, wobei exogen zugegebene Faktoren gänzlich abwesend sind. Dieses Verfahren ermöglicht mehrfache Virusgewinnungen mit ähnlicher Antigenzusammensetzung, welche aus der selben Zellgruppe gewonnen werden können. Die Abwesenheit von exogenen Serumproteinen erleichtert das Reinigungsverfahren stark.
- Virale Überstände werden entweder filtriert oder bei niedrigen Dreh zahlen zentrifugiert, um den Zelldebris zu entfernen und erforderlichenfalls durch Ultrafiltration konzentriert. Das Virus wird dann durch Ultrazentrifugation pelletiert. Das Virus kann auch isoliert werden, indem man das Ultrafiltrationsretentat über eine Affinitätsmatrix führt, wie Cellufine-Sulfat. Die viralen Hüllglycoproteine werden dann mit einem geeigneten Detergenz aufgelöst (beispielsweise Triton X-100 oder Octylglycosid). Unlösliche virale Nukleokapside werden aus dem gelösten Material durch Zentrifugation entfernt. Wir zeigten, daß dieser Schritt, obwohl er brauchbar ist, nicht durchgeführt werden muß. Die viralen Oberflächenglycoproteine werden aus der Glycoprotein-angereicherten Fraktion durch Affinitätschromatographie gereinigt. Mögliche Affinitätsmatrizes beinhalten Linsenlektin und Concanavalin A, das kovalent an quevernetzte SepharoseR oder celluloseartige mikroporöse Membranen gebunden ist. Kontaminierende zelluläre und verbleibende virale Matrixproteine werden im Durchfluß und in Waschschritten mit hohem Salzgehalt eliminiert. Die viralen Oberflächenglycoproteine werden dann von der Säule in Gegenwart eines geeigneten konkurrierenden Zuckers, wie Methyl-α-D-Mannopyranosid in Gegenwart oder Abwesenheit von Salz eluiert. Hochgereinigte Glycoproteinpräparationen (Beurteilt durch SDS Polyacrylamidgele, die mit Coomassie-Blau oder Silber gefärbt sind) werden in diesem Verfahren erhalten. Virale Oberflächenglycoproteine können auch durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Glycoprotein-spezifischen monoklonalen Antikörpern gereinigt werden.
- Gemäß dem vorliegenden Verfahren werden HN und F aus PIV-3 und F und G Proteine aus RSV affinitätsgereinigt. Die PIV-3 HN- und F-Proteine sind hochimmunogen, wenn sie in drei getrennten Tiermodellen, nämlich Meerschweinchen, Hamster und Baumwollratte getestet werden. Die Immunisierung von Tieren mit variierenden Dosen von HN und F rief eine starke anti-Glycoprotein-Antikörperreaktion hervor. Wenn sie mit den geeigneten Adjuvantien verabreicht werden, wie Freund s oder Aluminiumphosphat, kann die minimale immunschützende Dosis signifikant reduziert werden. Daher kann die schließliche Impfstoffpräparation, wenn sie mit Aluminiumphosphat als Adjuvans formuliert wird, -als leicht injizierbare Präparation zur Verwendung beim Menschen verwendet werden.
- Die Effektivität der Erfindung ist nicht nur auf die Präparation der von PIV-3 und RSV erhaltenen Glycoproteine beschränkt, sondern ist auf Hüllproteine von allen Paramyxoviridae und anderen Viren anwendbar. Unsere Erfindung umfaßt auch die Verwendung von ähnlichen Isolierungsverfahren und die Verwendung von anderen Adjuvantien, als die, die erwähnt werden.
- BEISPIELE
- Verfahren zur Bestimmung der Hämagglutination (HA), der Infektionsdosis50 für die Gewebekultur (TCID50), der Hämagglutinationshemmung (HAI), der Neutralisations- und Antifusionstiter, welche in dieser Beschreibung nicht explizit beschrieben sind, sind ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt.
- Beispiel I
- Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von PIV-3 durch eine Säugerzellinie.
- Eine Stammlösung des humanen PIV-3 Virus wird zur Infektion von MRC-5 Zellen verwendet, die auf Mikroträgerkügelchen in einer Bellco Kulturflasche angezogen werden. Eine 35 Liter Kultur von konfluent-wachsenden MRC-5 Zellen, die in einem Medium angezogen wurden, das 10 % fetales Rinderserum enthält, wurde abgekippt und die MRC-5 Zellen wurden dreimal jeweils mit 15 Litern CMRL 1969 Medium gewaschen, das 0,14 % NaHCO3 enthielt. Die Zellen wurden dann mit PIV-3 Virus in einem Endvolumen von 10 Litern CMRL 1969 infiziert, das 0,14 % NaHCO3 enthielt und das Virus konnte für 2 Stunden bei 37°C unter Rühren an die Zellen adsorbieren. Nach der Adsorption wurden 25 Liter Medium in die Kulturflasche gegeben. Diese Bedingungen reduzierten die Serumproteine um das etwa 5000fache, was zu einer Endkonzentration von weniger als 0,002 % führte. Die Zellen wurden bei 37°C für 5 Tage inkubiert und der Virusüberstand wurde gewonnen. Etwa 35 Liter Medium CMRL 1969, das 0,2 % NaHCO3 enthielt, wurde zu den Zellen gegeben und die Kultur wurde für weitere 3 Tage inkubiert und es wurde eine zweite Virusgewinnung erhalten. Dann wurden zusätzliche 35 Liter Medium zugegeben und die Zellen wurden für weitere 4 Tage vor der letzten Gewinnung inkubiert. Aliquots aller drei Virusüberstände wurden auf Infektiosität und HA Aktivität getestet. Die Infektiosität wurde in einem Standard-TCID50-Test mittels VERO-Zellen bestimmt, während die HA Aktivität mittels roter Blutkörperchen vom Meerschweinchen bei 37°C bestimmt wurde. Die Ergebnisse, in Tabelle 1 zusammengefaßt, zeigen deutlich, daß MRC-5 Zellen wesentliche Mengen an Virus bilden, wenn sie in relativer Abwesenheit von exogenen Serumproteinen kultiviert werden und daß dieselbe Gruppe der MRC-5 Zellen fähig ist, drei Virusgewinnungen zu liefern, wobei jede beträchtliche Virusmengen enthält. Das Verfahren wurde auch erfolgreich auf 150 Liter Bioreaktoren übertragen.
- BEISPIEL II
- Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von gereinigtem PIV-3.
- Der PIV-3 Überstand Nr. 2, der wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde mittels Techniken verarbeitet, die leicht auf die Impfstoffproduktion in großem Maßstab anwendbar sind. Der Virusüberstand wurde zuerst durch Filtration geklärt. Es wurde eine Tangentialflußfiltration mit einer Sartorius Sartocon Mini Einheit verwendet, in die 0,3 m² einer 0,45 µm Celluloseacetatmembran eingebaut waren. Nach der Klärung wurde das Virus durch Tangentialflußultrafiltration mittels eines Millipore Pellicon Systems konzentriert, worin 4 ft2 einer PTHK Membran mit einer nominalen Molekulargewichtsausschlußgrenze von 100 000 eingebaut war. Das Pellicon-Retentat wurde dann durch eine 0,22 µm Millipore Millipak 20 Einheit filtriert und das Virus wurde durch Ultrazentrifugation bei 100 000 × g für 1 Stunde bei 4°C pelletiert. Das gereinigte Virus wurde in Puffer resuspendiert. Die HA und Infektiositätsergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Es wurde eine im wensentlichen vollständige Gewinnung der HA Aktivität und wesentliche Gewinnung der Virusinfektiosität während der anschließenden Verarbeitung erhalten. Die Ergebnisse zeigen die Tauglichkeit dieses Verfahrens für die PIV-3 Reinigung.
- BEISPIEL III
- Dieses Beispiel erläutert die Reinigung der HN- und F-Proteine von PIV-3 durch Linsenlektin- oder Concanavalin-A-Sepharose-4B-Affinitätschromatographie.
- Das pelletierte Virus wurde bei einer Proteinkonzentration von 1,5 mg/ml bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden mit 2 % V/V TritonR X-100 behandelt. Alternativ dazu können andere Detergenzien, wie Octylglucosid oder eine Detergenzienkombination (2 % TritonR X-100 + 2 % G/V Octylglucosid) zur Proteinextraktion verwendet werden. Falls erforderlich werden diese Präparationen anschließend gegen 0,02 % TritonR X-100 dialysiert. Die unlöslichen Nukleokapsidkerne wurden dann durch Zentrifugation bei 15000 × g für 1 Stunde bei 4°C entfernt. Die HN- und F-Proteine wurden aus dem Glycoprotein-angereicherten Überstand durch Affinitätschromatographie entweder auf einer Linsenlektin- oder Concanavalin-A-SepharoseR-Säule gereinigt. Die Säule wurde dann zuerst mit 10 Bettvolumina PBS gewaschen, worin 0,02 % V/V TritonR X-100 enthalten waren. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit 10 Volumina PBS gewaschen, worin 0,02 % TritonR X-100 enthalten waren. Danach folgte ein Hochsalzwaschschritt, der aus 10 Bettvolumina 0,35 M NaCl in PB5 bestand, worin 0,02 % V/V TritonR X-100 enthalten waren. Die HN- und F- Proteine wurden mit 5 Bettvolumina PBS eluiert, worin 0,02 % V/V TritonR X-100 und 0,3 M Methyl-a-D-Mannopyranosid enthalten waren. Die eluierten Oberflächenglycoproteine wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Färben der Polyacrylamidgele mit CoomassieR-Blau und Silber und Densitometrie zu mehr als 95 % sauber befunden.
- BEISPIEL IV
- Dieses Beispiel erläutert die Reinigung der F- und G-Proteine von RSV unter Verwendung von Linsenlektin- oder Concanavalin-A-Sepharose-4B.
- Pelletierte RSV (langer Stamm) wurden bei einer Proteinkonzentration von etwa 800 µg/ml bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden mit 2 % V/V TritonR x-100 behandelt. Die unlöslichen Nukleokapsidkerne wurden dann durch Zentrifugation bei 15000 × g für 1 Stunde bei 4°C entfernt. Die F- und G-Proteine wurden aus dem Glycoprotein-angereicherten Überstand durch Affinitätschromatographie entweder auf einer Linsenlektin- oder Concanavalin-A-SepharoseR-Säule gereinigt. Das zur Proteinreinigung verwendete Verfahren war im wesentlichen zu dem identisch, was zur Reinigung der HN- und F-Proteine von PIV-3 verwendet wurde, wie dies in Beispiel III beschrieben wurde.
- Die eluierten Oberflächenglycoproteine wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Färben der Polyacrylamidgele mit Silber zu mehr als 80 % sauber befunden.
- BEISPIEL V
- Dieses Beispiel erläutert die Immunogenität der Linsenlektin-gereinigten PIV-3 Glycoproteine in Hamstern.
- Vier Wochen alten weiblichen Hamstern (speziell pathogenfrei) wurden 1,0, 0,5 oder 0,1 µg der Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Proteine intramuskulär injiziert, die wie in Beispiel III beschrieben präpariert wurden, und entweder alleine oder in Kombination mit Aluminiumphosphat oder Freund's Adjuvans verabreicht wurden. Unmittelbar nach der Blutentnahme nach 4 Wochen wurden die Tiere mit einer äquivalenten Dosis der Antigenformulierung nochmals immunisiert. Es wurden auch Serumproben 6 und 8 Wochen nach der ersten Injektion entnommen. HAI, Neutralisations- und Anti-Fusions-Titer wurden bestimmt (zusammengefaßt in Tabelle 3). Die Daten aus der ersten Blutentnahme (4 Wochen nach der ersten Dosis entnommen) zeigten, daß alle getesteten HN- und F-Formulierungen eine primäre Immunreaktion auslösen können. Die Einarbeitung von Aluminiumphosphat oder Freund's Adjuvans erhöhte die HAI und Neutralisationsantikörperreaktionen jeweils etwa 10 und 30fach. Die Tiere reagierten auf eine Dosis-abhängige Weise auf die Immunisierung mit 1,0, 0,5 oder 0,1 µg Antigen im Adjuvans. Die erneute Immunisierung zur Reaktionsverstärkung der Tiere nach 4 Wochen mit einer ägivalenten Dosis der Antigenformulierung führte zu einem deutlichen Anstieg der HAI, Neutralisations- und anti-Fusionstiter. Bei der Dosis von 1 µg Antigen waren die immunpotentierenden Effekte des Aluminiumphosphats und des Freund's Adjuvans deutlich. Daher wurde die Immunogenität der Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Proteine deutlich gezeigt. Die Antikörperreaktionen in Meerschweinchen und Baumwollratten waren ähnlich.
- BEISPIEL VI
- Dieses Beispiel erläutert die Immunogenität von Concanavalin A-gereinigten PIV-3 Glycoproteinen in Hamstern.
- Hamstern (speziell pathogenfrei) wurden 1,0, 0,1, 0,05 oder 0,01 µg Concanavalin-gereinigte HN- und F-Proteine, wie in Beispiel III beschrieben hergestellt, in Gegenwart von Aluminiumphosphat injiziert. Die Tiere wurden gemäß dem in Beispiel IV dargelegten Plan immunisiert. Die Tiere, die mit Adjuvansversetztem Concanavalin A-gereinigten Proteinen immunisiert wurden (die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt) reagierten auf eine Dosis-abhängige Weise auf die Primärinjektion von 1,0, 0,1, 0,05 oder 0,01 µg Antigen. Die minmal immunogene Dosis von mit Adjuvans-versetztem Concanavalin A-gereinigten Proteinen betrug 0,01 µg. Diese Ergebnisse betätigen die Immunogenität der Concanavalin Agereinigten HN- und F-Proteine.
- BEISPIEL VII
- Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit der verschiedneen HN- und F-Formulierungen zur Auslösung einer schützenden Reaktion bei immunisierten Hamstern und Baumwollratten.
- Hamster, die mit 1,0, 0,5, 0,1 oder 0,01 µg der Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Präparationen, wie sie in Beispiel III beschrieben wurden, immunisiert wurden, wurden mit lebenden PIV-3 Viren unmittelbar nach der Blutentnahme der achten Woche provoziert, um die Fähigkeit der verschiedenen HN- und F-Formulierungen zur Verleihung einer schützenden Immunität auszutesten. Die Hamster wurden 3 Tage nach der Provokation getötet und ihre Lungen wurden entnommen und homogenisiert. Die Viruslungentiter sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Kontrolltiere, verdünnter Elutionspuffer injiziert wurde, wiesen 5,0 log10 TCID50 Einheiten Virus pro Gramm Lungengewebe auf. Bei Abwesenheit von Adjuvans wiesen 75 der Tiere, die mit 1 µg HN- und F-Proteinen immunisiert wurden, eine detektierbare Virusmenge in ihren Lungen auf. Wenn HN und F mit Aluminiumphosphat oder Freund's Adjuvans verabreicht wurden, schützten zwei 0,1 µg Antigendosen alle Hamster gegen die Provokation mit dem lebenden Virus. Es wurde kein Virus in den Lungenhomogenaten detektiert. Ähnliche Ergebnisse wurden in Baumwollratten erhalten.
- Concanavalin A-gereinigte HN- und F-Proteine waren ebenfalls zur Auslösung einer schützenden Reaktion in immunisierten Hamstern fähig. Zwei 0,01 µg Dosen von Concanavalin A-gereinigten Proteinen, hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, (kombiniert mit Aluminiumphosphat) schützten 80 % der Tiere gegen die Provokation mit dem lebenden Virus. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit sowohl von Linsenlektin-gereinigten als auch Concanavalin A-gereinigten HN- und F-Proteinen den unteren Respirationstrakt der Tiere gegen eine Provokation mit lebendem Virus zu schützen.
- Die Fähigkeit der Affinitäts-gereinigten HN- und F-Proteine, den oberen Respirationstrakt immunisierter Tiere gegen eine Provokation mit einem lebenden Virus zu schützen, wurde ebenfalls getestet. Die Virustiter aus nasalen Waschungen sind in Tabelle 6 gezeigt. Der obere Respirationstrakt von Tieren, die mit 1 µg Dosen der mit Adjuvans-versetzten Concanavalin A-gereinigten Proteine, hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, immunisiert wurden, war gegen die PIV-3 Infektion geschützt. Es wurde kein Virus in nasalen Waschungen von dieser Tiergruppe detektiert. Dies war die einzige getestete Tiergruppe, die einen signifikanten Schutz im oberen Respirationstrakt nach einer Provokation mit einem lebenden Virus zeigte. Daher können Concanavalin A-gereinigte HN- und F-Proteine, die in einer Dosis von 1 µg mit Aluminiumphosphat verabreicht werden, eine immunologische Reaktion hervorrufen, die zum Schutz sowohl des oberen als auch des unteren Respirationstrakts von Hamstern gegen eine Provokation mit lebendem Virus fähig ist.
- BEISPIEL VIII
- Dieses Beispiel erläutert, daß die verschiedenen HN- und F-Formulierungen keine "verstärkte" Histopathologie in den Lungen von immunisierten Baumwollratten nach einer PIV-3 Provokation verursachen.
- Baumwollratten wurden mit 1,0 oder 0,1 µg Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Proteinen, hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, entweder alleine oder mit Aluminiumphosphat immunisiert. Die Tiere wurden intranasal mit 100 mittelinfektiösen Dosen PIV-3 direkt nach der Blutentnahme der achten Woche provoziert. vier Tage nach der Virusprovokation wurden die Baumwollratten getötet und die Lungenschnitte wurden zur histopathologischen Analyse präpariert. Die Lungenschnitte aus immunisierten Tieren und Kontrolltieren wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, durch Doppelblindtechnik untersucht und auf Histopathologie geprüft. Die beobachteten histopathologischen Veränderungen korrelierten im allgemeinen mit den Lungenvirustitern und variierten entgegengesetzt zu HAI und neutralisierenden Antikörpermengen. Tiere, die mit einem Plazebo immunisiert wurden und dann mit PIV-3 provoziert wurden, hatten die erwähnenswertesten hi stopathologischen Veränderungen. Schnitte der Lungen aus diesen Tieren zeigten moderate bis deutliche peribronchiale und peribronchioläre Lymphozyteninfiltration, die mit polymorphnukleären Leukozyten und Makrophagen durchsetzt waren. Viele der untersuchten Bronchien und Bronchiolen waren teilweise enthäutet und das Lumen dieser Luftwege enthielt oft ein Gemisch aus Debris, Leukozyten und serösem Exsudat. Teilweise wurden vereinzelte Mikroareale an interstitieller Pneumonie und perivaskulärer Auskleidung beobachtet. Im Gegensatz dazu waren die pathologischen Veränderungen bei Tieren minimal, die mit schützenden Antigendosen immunisiert wurden. Am wichtigsten war, daß keine Evidenz für eine verstärkte Pathologie in Lungenschnitten aller immunisierter Tiergruppen gegeben war, wenn sie vier Tage nach der Virusprovokation untersucht wurde. In keinem Fall war die Histopathologie größer in immunisierten, provozierten Tieren, als in Kontrolltieren, die mit Plazebo immunisiert und dann mit PIV-3 provoziert wurden. Es kann daher gefolgert werden, daß der Impfstoff der Affinitäts-gereinigten HN- und F-Untereinheiten keine kurzzeitigen immunpathologischen Effekte hat.
Claims (11)
- Verfahren zur Erzeugung eines Impfstoffes gegen ein komplexes Virus, umfassend das Züchten eines komplexen Virus, bei dem mindestens ein Hüll-Glycoprotein in der Lage ist, eine immunogene Antwort hervorzurufen, in einer Gewebekultur, die im wesentlichen frei ist von exogenen Wachstumsfaktoren und Serumproteinen, auf einem Zellsubstrat, das geeignet ist zur Verwendung bei der Bildung eines Humanimpfstoffes, Isolieren des Virus von der Gewebekultur, Löslichmachen des mindestens einen Hüll-Glycoproteins von dem Virus und Isolieren des mindestens einen Hüll-Glycoproteins und Zubereiten des Glycoproteins zu einem Impfstoff.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zellsubstrat eine diploide Zelllinie ist.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei die diploide Zelllinie eine menschliche diploide Zelllinie ist.
- Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Zellsubstrat die menschliche diploide Zelllinie ist.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virus eines aus der Paramyxoviridae-Familie ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Virus PIV-3 ist.
- Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Hüll-Glycoprotein Glycoprotein HN und Glycoprotein F ist, die getrennt isoliert werden.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Virus RSV ist.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei das mindestens eine Hüll-Glycoprotein Glycoprotein F und Glycoprotein G ist, die getrennt isoliert werden.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine virale Hüll-Glycoprotein in einer immunogen-aktiven Form isoliert wird durch Affinitätschromatographie.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das mindestens eine virale Hüll-Glycoprotein in einer immunogen-aktiven Form isoliert wird durch Immuno-Affinitätschromatographie.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB898914968A GB8914968D0 (en) | 1989-06-29 | 1989-06-29 | Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use |
GB8914968 | 1989-06-29 | ||
PCT/CA1990/000205 WO1991000104A1 (en) | 1989-06-29 | 1990-06-28 | Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69023648D1 DE69023648D1 (de) | 1995-12-21 |
DE69023648T2 DE69023648T2 (de) | 1996-05-02 |
DE69023648T3 true DE69023648T3 (de) | 2005-02-03 |
Family
ID=10659282
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69023648T Expired - Lifetime DE69023648T3 (de) | 1989-06-29 | 1990-06-28 | Herstellung eines virusimpfstoffes |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6455050B1 (de) |
EP (1) | EP0480949B2 (de) |
JP (1) | JP2599503B2 (de) |
AT (1) | ATE130198T1 (de) |
CA (1) | CA2056437C (de) |
DE (1) | DE69023648T3 (de) |
DK (1) | DK0480949T4 (de) |
ES (1) | ES2078971T5 (de) |
GB (1) | GB8914968D0 (de) |
WO (1) | WO1991000104A1 (de) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0714306T3 (da) | 1993-08-06 | 1998-10-19 | Connaught Lab | Inaktiveret respiratorisk syncytialvirus-vacciner |
US7223410B1 (en) | 1994-08-05 | 2007-05-29 | Sanofi Pasteur Limited | Inactivated respiratory syncytial viral vaccines |
US6764682B1 (en) | 1994-06-16 | 2004-07-20 | Aventis Pasteur Limited | Adjuvant compositions containing more than one adjuvant |
DK0784486T3 (da) * | 1994-10-05 | 2006-08-14 | Univ Vanderbilt | Interleukin-12 som en adjuvans til Paramyxoviridae-vacciner |
US6290971B1 (en) | 1995-06-15 | 2001-09-18 | Aventis Pasteur Limited | Adjuvant compositions comprising a mineral salt and another immunostimulating compound |
JPH11513372A (ja) * | 1995-09-22 | 1999-11-16 | コノート ラボラトリーズ リミテッド | パラインフルエンザウイルスの糖タンパクおよびワクチン |
US6020182A (en) | 1996-07-12 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation |
US8012736B2 (en) | 2002-04-26 | 2011-09-06 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
US7465456B2 (en) | 2002-04-26 | 2008-12-16 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
US20060110406A1 (en) | 2003-02-25 | 2006-05-25 | Medimmune Vaccines, Inc. | Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions |
AU2004263813B8 (en) | 2003-02-25 | 2008-09-11 | Medimmune, Llc | Methods of producing influenza vaccine compositions |
EP1697521B1 (de) | 2003-12-23 | 2010-06-02 | MedImmune, LLC | Multiplasmid-system zur erzeugung des grippevirus |
JP5666905B2 (ja) | 2007-06-18 | 2015-02-12 | メディミューン,エルエルシー | ヘマグルチニンポリペプチド中に変化を有するインフルエンザbウイルス |
US11446374B2 (en) | 2008-12-09 | 2022-09-20 | Novavax, Inc. | Modified RSV F proteins and methods of their use |
AU2009333484B2 (en) | 2008-12-09 | 2014-12-11 | Novavax, Inc. | Modified RSV F proteins and methods of their use |
JP2013523175A (ja) | 2010-04-14 | 2013-06-17 | イーエムディー・ミリポア・コーポレーション | 高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4699785A (en) * | 1984-09-18 | 1987-10-13 | The Regents Of The University Of California | Cell line producing feline leukemia virus |
DE3878468T2 (de) * | 1987-12-23 | 1993-06-09 | Upjohn Co | Chimarenglykoproteine, enthaltend immunogene segmente des humanen respiratorischen synzytialvirus. |
AU611784B2 (en) * | 1988-04-22 | 1991-06-20 | Pharmacia & Upjohn Company | Chimeric glycoproteins containing immunogenic segments of human parainfluenza virus type 3 |
-
1989
- 1989-06-29 GB GB898914968A patent/GB8914968D0/en active Pending
-
1990
- 1990-06-28 ES ES90909595T patent/ES2078971T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 JP JP2509687A patent/JP2599503B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-28 EP EP90909595A patent/EP0480949B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 CA CA002056437A patent/CA2056437C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 DK DK90909595T patent/DK0480949T4/da active
- 1990-06-28 WO PCT/CA1990/000205 patent/WO1991000104A1/en active IP Right Grant
- 1990-06-28 DE DE69023648T patent/DE69023648T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 AT AT90909595T patent/ATE130198T1/de not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-04-26 US US08/427,837 patent/US6455050B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 US US08/482,812 patent/US6306637B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2078971T3 (es) | 1996-01-01 |
EP0480949B2 (de) | 2004-08-04 |
US6455050B1 (en) | 2002-09-24 |
DE69023648D1 (de) | 1995-12-21 |
GB8914968D0 (en) | 1989-08-23 |
DE69023648T2 (de) | 1996-05-02 |
JPH04502410A (ja) | 1992-05-07 |
US6306637B1 (en) | 2001-10-23 |
ATE130198T1 (de) | 1995-12-15 |
EP0480949A1 (de) | 1992-04-22 |
JP2599503B2 (ja) | 1997-04-09 |
EP0480949B1 (de) | 1995-11-15 |
WO1991000104A1 (en) | 1991-01-10 |
CA2056437C (en) | 1996-02-06 |
CA2056437A1 (en) | 1990-12-30 |
DK0480949T3 (da) | 1995-12-18 |
ES2078971T5 (es) | 2005-03-16 |
DK0480949T4 (da) | 2004-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69023648T3 (de) | Herstellung eines virusimpfstoffes | |
DE69732407T3 (de) | Verfahren für die Replikation von Influenza in Zellkultur und die bei diesem Verfahren hergestellten Influenza-Viren | |
DE19612966B4 (de) | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren | |
DE3878468T2 (de) | Chimarenglykoproteine, enthaltend immunogene segmente des humanen respiratorischen synzytialvirus. | |
DE69731659T3 (de) | Impfstoffzubereitung bestehend aus untereinheiten des respiratorischen synzytialvirus (rsv) | |
KR100593235B1 (ko) | 인플루엔자백신 | |
DE69929612T2 (de) | Purifikation von viruspräparaten | |
DE69327307T2 (de) | Herstellung von antigenen und impfstoffen vom mysterie-disease-virus, antigene und erworbene impfstoffe zur verhinderung dieser krankheit | |
DE3853210T2 (de) | Verwendung eines viralen glykoprotein-impstoffes für intranasale immunisierung gegen eine virusinfektion. | |
DE69626022T2 (de) | Verfahren zur industriellen herstellung eines japanischen enkephalitis impfstoffes, und so erhaltener impfstoff | |
US6165774A (en) | Parainfluenza virus glycoproteins and vaccines | |
EP2216400A1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines aktiven Bestandteils eines Arznei- oder Diagnosemittels in MDCK-Zell-Suspensionskultur | |
EP0864646A2 (de) | Verfahren zur Inaktivierung von lipidumhüllten Viren | |
DE4407489A1 (de) | Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines | |
DE3689622T2 (de) | Impfstoffe gegen menschliche respiratorische viren. | |
DE69005908T2 (de) | Monoklonale Antikörper zur Behandlung nach einem Kontakt mit Tollwutvirus. | |
DE60222296T2 (de) | Impfstoff von umhüllten viren und verfahren zu seiner herstellung | |
DE3152621C2 (de) | ||
US6245549B1 (en) | Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use | |
DE2456636A1 (de) | Influenza-vakzine und verfahren zu ihrer herstellung | |
DE69409243T2 (de) | Inaktivierte respiratorische synzytial-virus-impfstoffe | |
DE2950004C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus(FSME-Virus)-Vakzinen | |
EP0491125B1 (de) | Impfstoffe gegen equine Herpesviren und ihre Herstellung | |
EP0203909B1 (de) | Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus(FSME-Virus)-Vakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE68927380T2 (de) | Impfstoff |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8363 | Opposition against the patent | ||
8366 | Restricted maintained after opposition proceedings | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: AVENTIS PASTEUR LTD., TORONTO, ONTARIO, CA |