DE60222296T2

DE60222296T2 - Impfstoff von umhüllten viren und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE60222296T2
Application number: DE60222296T
Authority: DE
Inventors: Otfried Kistner; Manfred Reiter; Axel Bruehmann; Noel Barrett; Wolfgang Mundt; Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter Healthcare SA
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 2001-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2022-12-11
Also published as: ATE372129T1; AU2002361382B2; US20070141617A1; WO2003049765A2; US20130078261A1; EP1453535A2; WO2003049765A3; EP1453535B1; US7195905B2; NZ533869A; US20030108859A1; AU2002361382A1; US20170035874A9; DE60222296D1; US20160199478A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Herstellung eines gereinigten umhüllten Virus-Antigens, zum Beispiel eines Ross River Virus (RRV)-Antigens, und auf einen Impfstoff gerichtet, welcher aufgereinigtes, deaktiviertes Ross River Virus (RRV)-Antigen umfasst, wobei das RRV-Antigen frei von heterologer Nukleinsäure- und Protein-Verunreinigungen aus den Zellen und der Zellkultur ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine sichere Impfstoffherstellung, insbesondere für eine Verabreichung an Menschen, erfordert das Züchten von großen Mengen des Virus, welches in hohen Erträgen von einem Wirtsystem hergestellt wird, sowie effiziente Reinigungs- und Deaktivierungsverfahren. Serum oder von Serum abgeleitete Substanzen, wie Albumin, Transferrin und Insulin und/oder Proteine aus tierischen oder menschlichen Quellen, welche zu einem Zellkulturmedium hinzugefügt werden, können unerwünschte Mittel enthalten, welche die Kultur und das daraus hergestellte biologische Material verunreinigen können. Eines der Hauptbedenken bei der Herstellung von biologischen Produkten, wie Impfstoffen oder rekombinanten Produkten, liegt in dem potenziellen Risiko von Verunreinigungen, wie boviner spongioformer Enzephalopathie (BSE). Weiterhin empfiehlt die Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Verwendung von Mitteln, welche eine deaktivierende Wirkung auf die biologische Aktivität von DNA aufweisen. Auf der Grundlage einer Studie über die potenziellen Risiken, welche mit biologischen Produkten verbunden sind, die in Tierzellen hergestellt wurden, folgerte die WHO-Studiengruppe, dass Mengen von bis zu 10 ng Nukleinsäure pro gereinigter Dosis als verträglich angesehen werden können (1998, WHO, Technical Report Series Nr. 878), aber Mengen von weniger als 100 pg pro Dosis bevorzugt werden würden. Die meisten Viren, welche für die Impfstoffherstellung verwendet werden, wurden jedoch nicht aufgereinigt, um ihre sensible biologische Aktivität zu erhalten, welche entscheidend für die Wirksamkeit des Impfstoffes ist, da effiziente Reinigungsverfahren die Immunogenität und Antigenität des Virus zu beeinflussen scheinen. Außerdem entfernen die derzeit verfügbaren Reinigungsverfahren für Viren oder Virus-Antigen die Zellkultur-Verunreinigungen nicht immer effizient. Daher muss für jedes besondere Virus ein geeignetes Verfahren entwickelt und an einen großen Maßstab angepasst werden.
Weiterhin beschreibt die WO 01/92552 A2 Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Alphavirus-Replikon-Teilchen, und die WO 96/17072 A2 beschreibt Alphavirus-Vektor-Konstrukte und Alphavirus-Teilchen, sowie Verfahren zum Herstellen und Verwenden derselben.
Ross River Virus (RRV) ist ein Alphavirus aus Mücken, welches eine Krankheit im Menschen verursacht, die als epidemische Polyarthritis (EPA) bekannt ist. Sie ist in Australien endemisch, mit mehr als 5000 Fällen, die jedes Jahr auftreten. Zur Zeit gibt es keinen Impfstoff, und Mücken Kontrollprogramme wiesen keine merkliche Wirkung beim Reduzieren der Inzidenz der Erkrankung auf.
Für einen von Yu et al. (1994, Vaccine 12: 1118-1124) und Aaskov et al. (1997, Vaccine 15: 1396-1404) kürzlich entwickelten experimentellen Kandidaten-RRV-Impfstoff wurde gezeigt, dass er Mäuse bei einer Provokation mit lebendem Virus schützt. Dieser Impfstoff wird aus dem Überstand von infizierten VERO-Zellen erhalten, die in kleinem Maßstab in Roller-Flaschen in Serum enthaltendem Medium kultiviert wurden. Der Virus enthaltende Überstand wird zentrifugiert, um zelluläre Rückstände zu entfernen, und der Überstand wird für eine Virus-Deaktivierung mit binärem Ethylenimin (BEI) unter alkalischen Bedingungen bei pH-Wert 8,5-9,0 inkubiert. Die deaktivierte Virussuspension wird einer Sucrosegradientenzentrifugation unterzogen, die aus der Gradientengrenzfläche gewonnene Virusbande wird in Salzlösungspuffer resuspendiert und für Immunisierungsstudien in Mäusen verwendet. In der Zubereitung, welche einzig einer Sucrosegradientenreinigung ohne irgendeine andere Behandlung unterzogen wurde, können noch zelluläre Verunreinigungen, wie zelluläre DNA oder Proteine, in der Virus-Zubereitung anwesend sein.
Der beschriebene BEI-deaktivierte Ross River-Kandidatenimpfstoff, supra, wird bei verschiedenen Konzentrationen eines Adjuvans und ohne Adjuvans in Mäusen getestet. Ein größerer Schutz wird bei dem Impfstoff in einer höheren Dosis ohne Adjuvans, als in jenem mit einem Adjuvans, gefunden. Selbst bei niedriger Dosis induzierte der nicht adjuvierte Impfstoff signifikant höhere Antikörper-Titer, verglichen mit dem adjuvierten. Vergleichende Studien über neutralisierende Antikpörper-Titer nach einer zweiten Injektion der Mäuse mit niedrigen Antigenkonzentrationen von 0,2 oder 2,0 μg Impfstoff mit und ohne Adjuvans ließen die Forscher folgern, dass das Adjuvans bei niedrigen Konzentrationen den schützenden Bestandteil einer zweiten Immunantwort auf den BEI-deaktivierten Impfstoff unterdrücken kann.
Aufgrund des Bedarfs an einem sicheren und wirksamen Ross River Virus-Impfstoff für eine Verabreichung an Menschen, werden eine Herstellung des Virus in großem Maßstab und effiziente Reinigungs- und Deaktivierungsverfahren benötigt. Die vorliegende Erfindung ist auf die Herstellung von Ross River Virus in großem Maßstab gerichtet, welches für die Herstellung eines Impfstoffs zur Verabreichung an Menschen geeignet ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von gereinigtem Ross River Virus-Antigen bereitzustellen.
Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereitzustellen, welcher gereinigtes Ross River Virus umfasst, das für eine Verabreichung an Menschen geeignet ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Western Blot-Analyse zur Wirksamkeit des Filtrierens der Ross River Virus-Ernte zum Entfernen zellulärer Proteine, die aus der Zellkultur stammen. A: Nachweis von VERO-Zellprotein mit Anti-VERO Proteinantikörpern und B: Nachweis von Ross River Virus-Antigen mit Anti-RRV-Antikörpern. Gezeigt ist in Spur 1: VERO-Zelllysat als Kontrolle, Spur 2: RRV-Ernte nach Zentrifugation, Spur 3: nach Filtration, Spur 4: nach Benzonase Behandlung, Spur 5: nach Zuckergradienten Reinigung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Ziel der Erfindung ist, ein gereinigtes RRV-Antigen bereitzustellen, welches im Wesentlichen frei von Verunreinigungen ist, die aus dem Zellkulturmedium und den Zellen der Zellkultur stammen, wie zelluläre Proteine und zelluläre Nukleinsäure, wobei das gereinigte Antigen in einem Impfstoff verwendet wird, welcher insbesondere für die klinische Verwendung beim Menschen in einer den Wirt schützenden Menge geeignet ist.
Der Begriff "zelluläre Nukleinsäure" bedeutet eine heterogene DNA oder RNA, die aus den Zellen stammt, welche mit dem Virus infiziert wurden, um das Virus zu vermehren.
"Gereinigtes Ross River Virus-Antigen" bedeutet mehr als ungefähr 97% Reinheit, wie durch SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse mit spezifischen anti-zellulären Protein-Antikörpern und Quantifizierung verbleibender zellulärer Nukleinsäure bestimmt wird.
Der Begriff "im Wesentlichen frei" bedeutet, dass die Menge der verunreinigenden Proteine, welche aus den Zellen oder der Zellkultur stammen oder der verunreini genden zellulären Nukleinsäure unter der Nachweisgrenze des Nachweisverfahrens des Standes der Technik liegt. Western Blot-Analyse und densitometrische Bestimmung werden verwendet, um die Menge der verunreinigenden zellulären Proteine zu überprüfen. Ein hochsensibles PCR-Verfahren, wie in der US 5,858,658 beschrieben, zur Quantifizierung von Nukleinsäure, insbesondere für genomische VERO-Zell-DNA, wird verwendet, um verbleibende zelluläre Nukleinsäure in der Zubereitung zu quantifizieren.
Der Begriff "geeignet für klinische Verwendung bei Menschen" bedeutet, dass der Endotoxingehalt von 10 μg Antigen weniger als ungefähr 2 IU beträgt, wie durch den chromogenen LAL-Test bestimmt wird. Zusätzlich beträgt die Menge der DNA/μg Protein-Antigen in der Impfstoffdosis weniger als ungefähr 50 pg, vorzugsweise weniger als ungefähr 20 pg, weiter bevorzugt weniger als ungefähr 10 pg/μg Antigen. Weiterhin beträgt die Menge der zellulären Verunreinigungen pro Dosis des Virusantigens weniger als ungefähr 0,1% des Gesamtproteingehalts, vorzugsweise weniger als ungefähr 0,05%, vorzugsweise unter der Nachweisgrenze eines hochsensiblen Analyseverfahrens, wie einer Western Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern oder einer HPLC-Analyse.
Die "den Wirt schützende Menge" bedeutet die kritische schützende Dosis des viralen Antigens im Impfstoff, wobei die Menge wirksam ist, um ein empfängliches Säugetier gegen eine Ross River Virus-Infektion zu immunisieren und eine schützende Immunantwort im Wirt induziert.
Um diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen, wird in einem Aspekt der Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von gereinigtem Ross River Virus-Antigen bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte des Infizierens einer Zellkultur von Zellen mit Ross River Virus, des Inkubierens der Zellkultur, um das Virus zu vermehren, des Erntens des erzeugten Virus und des Filtrierens des geernteten Virus durch einen ersten Filter mit einer Porengröße von zwischen 0,3 und 1,5 μm und umfassend eine positiv geladene Matrix, und des Filtrierens des Filtrats aus dem ersten Filterschritt durch einen zweiten Filter mit einer Porengrö ße von zwischen 0,1 und 0,5 μm, und umfassend eine hydrophile Matrix, wodurch ein gereinigtes Ross River Virus-Antigen nach dem zweiten Filtrierungsschritt erhalten wird, welches mindestens 97% rein ist, wie durch SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse mit spezifischen Anti-zelluläres Protein-Antikörpern und Quantifizierung verbleibender zellulärer Nukleinsäure bestimmt wird.
Weiterhin werden in einer Ausführungsform der Erfindung die Zellen und zellulären Rückstände nach dem Ernten des Virus aus dem Überstand entfernt.
Die Zellen, die für eine Infektion mit dem Virus verwendet werden, können irgendeine Zelle darstellen, die empfänglich für RRV ist. Gemäß einem Aspekt der Erfindung stellen die Zellen eine kontinuierliche Zelllinie von Affennierenzellen dar, wie VERO-Zellen oder CV-1-Zellen. VERO-Zellen sind von der American Tissue Cell Culture erhältlich, hinterlegt als ATCC CCL81.
Einige Substanzen, wie Serum und aus Serum abgeleitete Zusatzstoffe, welche das am Ende geerntete virale Antigen verunreinigen können, können entweder aus dem Zellkulturmedium oder den Zellen stammen. Gängige Zellkulturmedien umfassen Serum oder Proteinzusatzstoffe, wie Albumin, Transferrin oder Insulin, und andere Proteine oder Polypeptide, welche aus dem Serum stammen oder während des Zellwachstums zu dem Zellkulturmedium hinzugefügt wurden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen in einem Serumfreien Medium gezüchtet. Das Medium kann ein Minimalmedium darstellen, wie DMEM oder DMEM HAM's F12 und andere im Stand der Technik bekannte Minimalmedien, welche keine Serumzusatzstoffe umfassen, wie in Kistner et al. (1998, Vaccine 16:960-968) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen vor der Infektion in einem Serum- und Protein-freiem Medium gezüchtet, wie in der WO 96/15213 , der WO 00/0300 oder der WO 01/23527 beschrieben, wobei das Minimalmedium mit Hefeextrakten oder Sojapepton ergänzt sein kann.
Die Zellen können während des Zellkulturwachstums an Mikroträger gebunden werden. Der Mikroträger kann ein Mikroträger sein, welcher aus der Gruppe der Mikroträger ausgewählt ist, die auf Dextran, Kollagen, Plastik, Gelatine und Zellulose und anderen basieren, wie in Butler (1988, In: Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303) beschrieben. Daher werden gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die Serum-freien oder Serum- und Protein-freien Zellen auf Mikroträgern kultiviert und infiziert. Vorzugsweise ist der Mikroträger ausgewählt aus der Gruppe mit glatter Oberfläche, wie Cytodex I^®, Cytodex II^® und Cytodex III^®, Cytopore^® und Cytoline^® (alle Pharmacia).
Die an einen Mikroträger gebundenen Zellen werden bei einer Multiplizität der Infektion (m.o.i. für engl.: multiplicity of infection) zwischen ungefähr 0,001 und ungefähr 5 mit RRV infiziert.
Verschiedene gängige Verfahren, wie Chromatographie, Gradientenzentrifugation usw. sind im Stand der Technik bekannt, um verunreinigende Proteine aus dem biologischen Produkt zu entfernen, welches wünschenswerterweise isoliert und gereinigt werden soll. Effiziente Reinigungsverfahren umfassen häufig mehrere Schritte und Kombinationen von Filtration, Ionenaustauschchromatographie und Gradientenzentrifugation. Die verschiedenen Verfahren können jedoch den Virusliter und die Antigenausbeute während jedem Reinigungsschritt reduzieren.
Im Stand der Technik wird eine Filtration verwendet, um biologisches Material zu reinigen, z.B. um verunreinigende Mittel zu entfernen oder während der Herstellung von Virus-freien Blutprodukten, um mögliche verunreinigende Viren zu entfernen, wobei Viren, insbesondere umhüllte Viren, im Retenat verbleiben, und der Virus-Titer im Filtrat reduziert wird.
Es wurde überraschenderweise durch die vorliegende Erfindung gefunden, dass durch Filtrieren des Zellkulturüberstandes, der von Zellen abgeleitet ist, welche mit umhüllten Viren (z.B. dem Ross River Virus) infiziert sind, das umhüllte Virus das Filtersystem ohne Reduktion des Virus-Titers passiert, während zelluläre Verunreinigungen, wie Proteine und Nukleinsäure effizient entfernt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine Reinigung einer Virus-Zubereitung mit hohem Titer durch Filtration bereit, wobei dieses Verfahren für eine Reinigung im großen Maßstab einfach anwendbar ist und einen Großteil des Proteins, welches aus den Wirtszellen stammt, sowie zelluläre Nukleinsäure effizient entfernt. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher ein Verfahren zum Reinigen von Virus-Antigen durch Filtrieren bereit, ohne bemerkenswerten Verlust des Virus-Titers und Virus-Antigens.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um irgendwelche umhüllten Viren zu reinigen. Beispielhafte Viren schließen Alphaviren (z.B. Ross River Virus, Östliches Pferdeenzephalitis Virus, Venezuelanische Pferdeenzephalitis, Westliche Pferdeenzephalitis, Sindbis Virus, Semiliki Forest Virus), Flaviviren (z.B. St. Louis Enzephalitis Virus, Japanisches Enzephalitis Virus, Dengue Virus, Gelbfieber Virus, Zeckenenzephalitis Virus), Orthomyxoviren (z.B. Influenza Virus) und Paramyxoviren (z.B. Virus der New Castle Erkrankung) ein.
Das Filtrieren durch eine Kombination von Filtern kann entweder in einer Reihe oder in getrennten Schritten durchgeführt werden. Der Filter kann ein Filter, wie ein positiv geladener Tiefenfilter mit einer Porengröße von ungefähr 0,3 bis ungefähr 1,5 μm sein, und ein hydrophiler Filter mit einer Porengröße von ungefähr 0,22 μm. Ebenso kann irgendein im Stand der Technik bekanntes Filtrationssystem verwendet werden. Durch Filtrieren während der Virus-/Virus-Antigenreinigung wird im Wesentlichen die gesamte zelluläre Proteinverunreinigung entfernt. Die verunreinigende zelluläre Nukleinsäure wird auch effizient mit einem Faktor von mindestens 35 entfernt, und eine mittelmäßig reine Zubereitung mit einer Reinheit von mindestens ungefähr 97% verglichen mit der anfänglichen Virusernte wird durch diesen Reinigungsschritt erhalten.
Der verwendete Filter kann auf einer Zellulosefasermatrix basieren, hydrophile Filter, wie auf einer Polyvinylidenfluoridmembran basierend, oder Filter, basierend auf einer Polypropylenmembran darstellen. Solche Filter sind kommerziell verfügbar, z.B. ZetaPlus^® (CUNO), Durapore^®, Millipak^® oder Millidisk^TM (Millipore) oder Filter von Pall.
Das wie oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren stellt daher ein gereinigtes Ross River Virus-Antigen bereit, welches im Wesentlichen frei von verunreinigenden Proteinen und Nukleinsäure aus den Zellen oder der Zellkultur ist. Die Zubereitung weist eine Reinheit von mindestens ungefähr 97% verglichen mit dem Ausgangsmaterial auf.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Ross River Virus, umfassend die Schritte des Infizierens einer Zellkultur von Zellen mit Ross River Virus, des Inkubierens der Zellkultur, um das Virus zu vermehren, des Erntens des erzeugten Virus, des Filtrierens des geernteten Virus, das Behandelns des filtrierten Virus mit einem Nukleinsäurezersetzenden Mittel und des Reinigens des Virus.
Die nach dem Filtrieren erhaltene Virus-Zubereitung wird mit einem Nukleinsäurezersetzenden Mittel behandelt, um die strukturelle Unversehrtheit der Nukleinsäure durch Abbauen der verbleibenden Nukleinsäure, welche durch das Filtrieren nicht entfernt wurde, zu zerstören. Das Zersetzen der Nukleinsäure stellt sicher, dass Nukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht zu Molekülen mit niedrigerem Molekulargewicht abgebaut werden, die anschließend während des abschließenden Reinigungsschrittes entfernt werden.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäure-zersetzende Mittel kann ein Enzym sein, welches Nukleinsäure zersetzt, vorzugsweise ein Nukleinsäure-zersetzendes Enzym, wie eine Nuklease, welche eine DNase- und RNase-Aktivität aufweist, oder eine Endonuklease, wie aus Serratia marcescens, kommerziell verfügbar als Benzinase^® (Benzon Pharma A/S). Am meisten bevorzugt ist das Nukleinsäurezersetzende Mittel Benzonase^®.
Das mit einem Nukleinsäure-zersetzenden Mittel behandelte Virus kann weiterhin mit einem Deaktivierungsmittel behandelt werden. Das Deaktivierungsmittel kann irgendein Mittel mit deaktivierender Aktivität sein, welches im Stand der Technik bekannt ist, wie z.B. Formalin, BEI, Laserlicht, UV-Licht, chemische Behandlung, wie Methylenblau, Psoralen, Carboxyfulleren (C60) oder eine Kombination von irgendwelchen davon, wie im Stand der Technik beschrieben (Rowland et al. (1972). Arch. Ges. Virusforsch. 39:274-283; Mowat et al. (1973). Arch. Ges. Virusforsch. 41:365-370, Rweyemamu et al. (1989). Rev. Sci. tech. Off. Int. Epiz. 8:747-767 und die WO 01/46390 ). Andere im Stand der Technik bekannte Verfahren zum Deaktivieren von Viren können ebenso verwendet werden.
Die Behandlung des Virus mit dem Nukleinsäure-zersetzenden und Deaktivierungsmittel kann durch eine aufeinanderfolgende Behandlung oder in einer kombinierten/gleichzeitigen Weise durchgeführt werden, wobei das gereinigte Virus-Antigen mit einer Kombination aus Benzonase als Nukleinsäure-zersetzendem Mittel und Formalin oder UV oder BEI oder einer Kombination aus Formalin/BEI oder Formalin/UV als Deaktivierungsmittel behandelt wird. Das Nukleinsäurezersetzende Mittel wird vorzugsweise vor dem Hinzufügen des Deaktivierungsmittels und während des Verlaufes des Deaktivierungsverfahrens zu der Virus-Zubereitung hinzugefügt, das Nukleinsäure-zersetzende Mittel kann weiterhin nachfolgend hinzugefügt werden, wenn nötig.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das deaktivierte Virus weiter gereinigt. Das Verfahren umfasst daher nach dem Schritt der Nukleinsäure-Zersetzungs-/Virus-Deaktivierungs-Behandlung einen weiteren Schritt, um das Nukleinsäure-zersetzende Mittel und das Deaktivierungsmittel aus der Virus-Zubereitung zu entfernen. Dies kann mit irgendeinem im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie Chromatographie, Gelfiltration oder Gradientenzentrifugation durchgeführt werden. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist eine Gradientenreinigung, wie Sucrosegradientenzentrifugation, bevorzugt. Dieser abschließende Reinigungsschritt entfernt auch die Abbauprodukte der Nukleinsäurebehandlung mit dem Nukleinsäure-zersetzenden Mittel und ent fernt die verbleibende/n Nukleinsäure und Proteine, welche nicht durch das Filtrieren entfernt wurden.
Die mit diesem Verfahren erhaltene Zubereitung umfasst Ross River Virus-Antigen, wobei die Zubereitung im Wesentlichen frei von verunreinigenden Proteinen ist, die aus den Zellen oder der Zellkultur stammen, und weniger als ungefähr 50 pg zelluläre Nukleinsäure/μg Virus-Antigen, vorzugsweise weniger als ungefähr 20 pg und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 10 pg zelluläre Nukleinsäure/μg Virus-Antigen aufweist. Erhaltenes gereinigtes Ross River Virus-Antigen ist frei von verunreinigenden Proteinen und Nukleinsäure, ist geeignet für eine klinische Verwendung bei Menschen und ist stabil.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, umfassend gereinigtes, deaktiviertes Ross River Virus-Antigen, umfassend die Schritte des Infizierens einer Zellkultur von Zellen mit Ross River Virus, des Inkubierens der Zellkultur, um das Virus zu vermehren, des Erntens des erzeugten Virus, des Filtrierens des geernteten Virus, des Behandelns der filtrierten Virus-Zubereitung mit einem Nukleinsäure-zersetzenden Mittel und einem Virus-Deaktivierungsmittel, des Reinigens des Virus und des Formulierens des gereinigten und deaktivierten Virus in einer Impfstoffzusammensetzung. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung stellt das Verfahren einen Impfstoff bereit, welcher gereinigtes Ross River Virus-Antigen umfasst und im Wesentlichen frei von verunreinigenden Proteinen und Nukleinsäuren ist.
Diese und andere hier offenbarten Aspekte der Erfindung werden dem Fachmann angesichts der hier enthaltenen Offenbarung deutlich werden.
BEISPIEL 1:
Herstellung von gereinigtem, deaktivierten Ross River Virus-Antigen
a) Herstellung von Ross River Virus mit einer Serum- und Protein-freien VERO-Zellkultur
VERO-Zellen (Afrikanische Grüne Meerkatze, Cercopthecus aethiops, Niere) werden als Herstellungszelllinie verwendet. Die Zellen werden von der American Type Cell Culture Collection, Rockville, Maryland mit einer Passagenzahl von 124 unter der Bezeichnung ATCC CCL 81 erhalten. Die Zellen werden adaptiert, um in Serum- oder Protein-freiem Medium zu wachsen, wie in Kistner et al., 1998 (supra) oder der WO 96/15231 beschrieben. Zum Wachstum in Serum-freiem Medium wird ein DMEM HAM's F12 Basismedium, ergänzt mit anorganischen Salzen, Aminosäuren, Natriumbicarbonat und Hefeextrakt verwendet. Die Arbeitszellbank wird ohne Verwendung irgendwelcher von Tieren abgeleiteter Medium-Bestandteile hergestellt. Die Zellen der Arbeitszellbank werden in T-Flaschen und Roller-Flaschen mit einem Split-Verhältnis von 1:6 expandiert. Die weitere Vermehrung der Zellen wird in einem gerührten Bioreaktortank unter Verwendung von Cytodex^®-Mikroträger als Anheftungssubstrat durchgeführt. Die Zellen werden bei 37°C gezüchtet. Die Kulturbedingungen der Sauerstoffsättigung, 20% +/– 10% und pH-Wert 7,25 +/– 0,35, werden während des Virus-Vermehrungsverfahrens konstant gehalten. Ein Serum-freies Zellkultursystem von VERO-Zellen, wie von Kistner et al., (Vaccine 16:960-968 (1998)) beschrieben, wird mit Ross River Virus bei einer Multiplizität der Infektion (m.o.i.) von 0,001 infiziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen bei 37°C wird der Fermenter geerntet, und das Virus wird aus dem Zellkulturüberstand gewonnen. Das geerntete Virus ergab einen Titer von 8,0 TCID₅₀/ml nach dem Entfernen der Mikroträger und der Zellrückstände durch Zentrifugation (ungefähr 9000 g).
b) Reinigung von RRV
Das geerntete Virus wird durch Filtrieren mit einer Kombination aus einem 1,2 μm Filter (ZetaPlus^®, CUNO) und einem 0,22 μm Filter (Durapore^®, Millipore) gereinigt. Die Wirksamkeit des Filtrierens, um lösliche Proteine zu entfernen, welche aus der Zellkultur, insbesondere aus den VERO-Zellen, stammen, wird durch eine Western Blot-Analyse mit spezifischen VERO-Zellprotein Antikörpern bestimmt (1A). 1 zeigt in beeindruckender Weise, dass das Filtrieren im Wesentlichen alle aus den VERO-Zellen stammenden Proteine aus der Virus-Zubereitung entfernt.
Die Bestimmung des Virus-Titers der Virusernte vor dem Filtrieren beträgt 8,0 TCID₅₀/ml und nach dem Filtrieren 7,4 TCID₅₀/ml (Tabelle 1) und macht deutlich, dass während des Filtrierungsschrittes im Wesentlichen kein Virus-Antigen verloren wird. Ein Nachweis von RRV-Antigen durch eine Western Blot-Analyse mit spezifischen RRV-Antikörpern derselben Proben, die für den Nachweis des VERO-Zellproteins (1B) verwendet wurden, zeigte, dass ähnliche Mengen des Virus-Antigens in allen Proben, die während der verschiedenen Reinigungsschritte überprüft wurden, gefunden wurden, was darauf hinweist, dass es zu keinem Verlust des Virus-Antigens während der Reinigung kommt.
Die Menge der VERO-Zell-DNA wird, wie in der US 5,858,658 beschrieben, durch eine PCR nach jedem Reinigungsschritt bestimmt und ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass während des Filtrierungsschrittes die verunreinigende zelluläre Nukleinsäure mit einem Faktor von mindestens 35 entfernt wird.

Nach dem Filtrieren wird Benzonase^® (2000 U/I) zu der Virusernte hinzugefügt, um verbleibende VERO-Zell- und virale Nukleinsäure zu spalten. Während der folgenden Benzonase Behandlung werden die verbleibenden Verunreinigungen mit einem Faktor von mindestens 2 entfernt. TABELLE 1 Bestimmung des Virus-Titers und der verunreinigenden Nukleinsäure während des Ross River Virus-Antigen Reinigungsverfahrens

Reinigungsschritt	Virus-Titer (TCID₅₀/ml)	Gesamt-Proteinmenge (μg/ml)	VERO-Zell-DNA (pg/ml)	DNA/Protein (pg/μg)
Ernte	8,0	86	54 × 10⁴	6.300
Abscheider	7,6	81	34 × 10⁴	4.200
Filtration 1,2 μm/0,2 μm	7,2	80	14 × 10³	175
Benzonase	7,4	85	7 × 10³	82
Zuckergradient	deaktiviert	180	1 × 10³	5,5

Nach 1 h Inkubation bei 37°C mit Benzonase, wird Formalin als ein Virus-Deaktivierungsmittel mit einer Endkonzentration von 0,1% (w/v) für eine Gesamtdeaktivierungszeit von 120 h bei 37°C hinzugefügt. 24 Stunden nach dem Hinzufügen von Formalin wird erneut Benzonase^® (1000 U/I) hinzugefügt. Die Filtrationsschritte auf einem 0,22 μm sterilem Filter (Millipore) werden bei 0, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 und 192 Stunden durchgeführt, und die Proben für die Virus-Titration und die Sicherheitsexperimente werden parallel entnommen.
Die Virus-Titration wird mit VERO-Zellen durch Bestimmen der Gewebekultur Infektionsdosis 50 (TCID₅₀ für engl.: tissue culture infectious dose 50) durchgeführt. Die Sicherheitstests zum Zeigen der vollständigen Virus-Deaktivierung werden mit C6-36-Zellen durchgeführt, da sie ungefähr 10- bis 100-mal empfindlicher für eine Infektion mit RRV sind als VERO-Zellen.
Die Zubereitung, welche das deaktivierte Virus umfasst, wird einer Fluss-Zonal-Zentrifugation im großen Maßstab über einen 0-50% Sucrosegradienten unterzogen, um verbleibendes Formalin, verbleibende Benzonase und Nukleinsäure Abbauprodukte, die aus der Benzonase-Behandlung stammen, zu entfernen. Die Sucrosegradientenreinigung des deaktivierten Virus führte zu einem Höchstwert bzw. Peak bei einer Sucrosekonzentration zwischen 40% und 42%, was eine reine und homogene Antigen-Zubereitung zeigt. Die Fraktionen, welche das Virus enthalten, werden vereinigt und einem sterilen 0,2 μm Filtrationsschritt unterzogen.
Die Gesamtreduktion während des Reinigungsverfahrens nach dem Sucrosegradienten erlaubte daher eine Reduktion der verunreinigenden Nukleinsäure um mindestens 4 Log-Schritte. Die endgültige gereinigte RRV-Zubereitung enthielt ungefähr 5,5 pg zelluläre DNA/μg Virus-Antigen. Die isolierte Zubereitung des RRV-Antigens weist eine Reinheit von mindestens 98% bezüglich der zellulären Verunreinigungen auf. Die endgültige Reinheit dieser Zubereitung bezüglich der Nukleinsäure ist auch in Tabelle 1 angegeben.
BEISPIEL 2:
Charakterisierung von RRV
Die deaktivierte RRV-Zubereitung aus Beispiel 1 wird auf eine Proteinkonzentration von 10 μg/ml eingestellt. Der Endotoxingehalt, durch einen LAL-Assay bestimmt, beträgt weniger als 1,50 EU/ml. Der Pyrogenizitätstest wird gemäß der Eurpoäischen Pharmacopoeia 2001, 2.6.8. durchgeführt. Ein Temperaturanstieg von mehr als 2,65°C wird als pyrogen angesehen, und von weniger als 1,15°C als pyrogenfrei. Die Menge der VERO-Zell-DNA wird durch eine PCR, wie in der US 5,858,658 beschrieben, bestimmt. Die Menge der verbleibenden VERO-Zell-DNA in der Zubereitung liegt weit unter der Grenze, welche von der WHO für biologische Produkte gefordert wird, die in kontinuierlichen Zelllinien (CCLs für engl.: continuous cell lines) hergestellt werden, d.h. 10 ng pro Dosis (1998, WHO, Technical Report Series No. 878). Die Ergebnisse der Charakterisierung der Reinheit der deaktivierten RRV-Zubereitung sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2: Analyse des RRV-Impfstoffs

Test Ergebnis

Dosis/Antigen 10 μg

LAL < 1,50 EU/ml

Pyrogenizität 0,50°C (pyrogenfrei)

VERO-Zell-DNA 50 pg
BEISPIEL 3:
Immunogenität des RRV-Impfstoffs
Die Bestimmung der wirksamen Dosis (ED₅₀ für engl.: Effective Dose) des Antigens wird durch Einstellen der RRV-Antigen-Konzentration auf 10 μg/Dosis, ohne und mit Al(OH)₃ als Adjuvans bei einer Konzentration von 0,05%, 0,1% und 0,2% (w/v), durchgeführt. Die Kandidatenimpfstoffzubereitung wird anschließend in 4-fachen Schritten verdünnt. Jede Verdünnung wird in eine Gruppe von 10 CD1-Mäusen injiziert. Nach 4 Wochen werden die Mäuse mit der entsprechenden Menge des Antigens aufgefrischt. Blutproben werden nach 4 Wochen, vor der Auffrischung und 6 Wochen nach der Auffrischung entnommen. Die Seren der Proben werden durch einen RRV-Antikörper ELISA analysiert, und die ED₅₀ wird berechnet. Tabelle 3 zeigt die ED₅₀ des Impfstoffs mit und ohne Adjuvans. Um eine Immunantwort mit ähnlichen Antikörper-Titern zu induzieren, wird bei dem Impfstoff, welcher ein Adjuvans umfasst, nur 1/5 bis 1/20 der Menge des Antigens des Impfstoffes mit Adjuvans benötigt, abhängig von der verwendeten Adjuvanskonzentration. Ein Erhöhen der Adjuvanskonzentration in der endgültigen Zubereitung erlaubt eine Reduktion der Virus-Antigenmenge im Impfstoff. Dies steht im Gegensatz zu Ergebnissen des Standes der Technik von Yu et al. und Aaskov et al. (supra), welche einen negativen Einfluss des Adjuvans auf eine schützende Antikörperinduktion gezeigt haben. TABELLE 3: Wirksame Dosis (ED₅₀) und schützende Dosis (PD₅₀ für engl.: Protective Dose) des RRV-Impfstoffs in Mäusen

ED₅₀ Antigen (ng) 4 Wochen ED₅₀ Antigen (ng) Auffrischung 6 Wochen PD₅₀ Antigen (ng) 6 Wochen Adjuvans Al(OH)₃

413 150 1250 -

83 2 20 0,05%

74 9 20 0,1%

20 7 20 0,2%
Die Seren der Mäuse, die zur Bestimmung der ED₅₀ verwendet wurden, werden auch auf ihre Neutralisierungsaktivität analysiert. Der Neutralisierungsassay wird durch Verdünnen von infektiösem Virus in 10-fach-Schritten durchgeführt, und entweder mit Puffer oder mit Hitze deaktivierten 1:10 Verdünnungen des Mäuseserums für 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Virusverdünnungen werden einem Plaque-Assay mit VERO-Zellen unterzogen, um den Virus-Titer zu bestimmen. Der Neutralisierungsindex oder das Verhältnis von Virus-Titer in Puffer als Kontrolle im Vergleich zu dem Virus-Titer, welcher mit Mäuseserum inkubiert wurde, wird berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass weniger Antigen in der Impfstoffzusammensetzung, die ein Adjuvans umfasst, benötigt wird, um höhere Neutralisierungstiter (NT) zu induzieren, verglichen mit dem Impfstoff, welcher ein Adjuvans enthält.
Die Bestimmung der schützenden Dosis (PD₅₀) wird mit der Hälfte der immunisierten Mäuse jeder Gruppe durchgeführt, die in dem vorigen Experiment verwendet wurden, welche in Woche 6 und 2 Wochen nach einer Auffrischung mit 10⁶ TCID₅₀ des infektiösen RRV provoziert wurden. Die Ergebnisse des Experiments zeigen, dass 50% der Mäuse, die mit infektiösen RRV infiziert wurden, keine Virämie bei der entsprechenden Antigendosis entwickelt haben. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit eines Adjuvans im Impfstoff die Induktion einer schützenden Immunantwort nicht beeinflusste. Die erfindungsgemäße Impfstoffzubereitung erlaubte sogar eine drastische Reduktion des Antigengehalts in der Impfstoffdosis von bis zu 1/20 in der Anwesenheit eines Adjuvans, verglichen mit dem Impfstoff ohne Adjuvans. Daher unterscheidet sich die erfindungsgemäße Impfstoffzubereitung bezüglich der Reinheit und Möglichkeit, eine schützende Immunantwort in der Anwesenheit eines Adjuvans zu induzieren von jenen, welche im Stand der Technik bekannt sind.
Demgemäß wird die Menge der schützenden Dosis für ein größeres Säugetier im Bereich zwischen 0,1 und 50 μg Antigen/schützender Dosis liegen, abhängig von dem durchschnittlichen Körpergewicht des Säugetiers.
Die oben genannten Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung darzustellen, aber nicht, um ihren Schutzumfang zu begrenzen. Andere erfindungsgemäße Varianten werden dem Fachmann einfach offensichtlich sein und sind durch die beigefügten Ansprüche eingeschlossen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Ross River Virus-Antigens, umfassend die Schritte des Infizierens einer Zellkultur von Zellen mit Ross River Virus, des Inkubierens der Zellkultur, um das Virus zu vermehren, des Erntens des erzeugten Virus im Zellkulturüberstand, und des Filtrierens des Überstandes, welcher das geerntete Virus enthält, durch einen ersten Filter mit einer Porengröße von zwischen 0,3 und 1,5 μm, und umfassend eine positiv geladene Matrix, und des Filtrierens des Filtrats von dem ersten Filterschritt durch einen zweiten Filter mit einer Porengröße von zwischen 0,1 und 0,5 μm, und umfassend eine hydrophile Matrix, wodurch ein gereinigtes Ross River Virus-Antigen nach dem zweiten Filtrierungsschritt erhalten wird, welches mindestens 97% rein ist, wie durch SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse mit spezifischen anti-zelluläres Proteinantikörpern und Quantifizierung verbleibender zellulärer Nukleinsäure bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen VERO-Zellen sind, welche in Serum-freiem Medium gezüchtet wurden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Filtrieren Nukleinsäure-Verunreinigungen um mindestens das 35-fache verringert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter umfassend den Schritt des Behandelns des filtrierten Antigens mit einem Nukleinsäure-zersetzenden Mittel und das Reinigen des Antigens, um eine gereinigte Ross River Virus- Zubereitung zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Nukleinsäure-zersetzende Mittel ein Enzym mit DNase- und RNase-Aktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das filtrierte Antigen weiter mit einem Virus-Deaktivierungsmittel behandelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Zubereitung frei von verunreinigenden Proteinen von den Zellen oder der Zellkultur ist und weniger als etwa 10 pg zellulärer Nukleinsäure/μg Virus-Antigen aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, umfassend gereinigtes, deaktiviertes Ross River Virus, umfassend die Schritte des Infizierens einer Zellkultur von Zellen mit Ross River Virus, des Inkubierens der Zellkultur, um das Virus zu vermehren, des Erntens des erzeugten Virus im Zellkulturüberstand, des Filtrierens des Überstands, welcher das geerntete Virus enthält, durch einen ersten Filter mit einer Porengröße von zwischen 0,3 und 1,5 μm, und umfassend eine positiv geladene Matrix, des Filtrierens des Filtrats von dem ersten Filterschritt, durch einen zweiten Filter mit einer Porengröße von zwischen 0,1 und 0,5 μm, und umfassend eine hydrophile Matrix, des Behandelns der Virusernte mit einem Nukleinsäure-zersetzenden Mittel und einem Virus-Deaktivierungsmittel, des Reinigens des Virus, und des Formulierens des gereinigten Virus in eine Impfstoffzusammensetzung.