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Wachstumsmedium für Zellkulturen, Verfahren zu seiner
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Herstellung, Zellkultivierungs verfahren und Virusimpfstoff.
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Vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von Viren in einer Gewebekultur
unter Verwendung eines chemisch definierten Mediums. Unter dem Begriff "chemisch
definiertes Medium't wird in der Virologie und Gewebekultivierung ein Kulturmedium
von bekannter chemischer Zusammensetzung, sowohl in quantitativer als auch qualitativer
Hinsicht, verstanden, im Gegensatz zu natürlichen oder undefinierten Medien, welche
natürliche Produkte, wie z.B. tierisches Serum, Embryoextrakte, Hefehydrolysate
etc. von unbekannter oder unvollständig bekannter chemischer Zusammensetzung.
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Eine Anzahl von chemisch definierten Medien ist bekannt.
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Die meisten derselben sind Lösungen von Nährstoffen, wie z.B. Kohlenhydraten,
Lipiden und Aminosäuren, mit Vitaminen, Salzen und Mineralstoffen; sie enthalten
oft andere Nährstoffe, wie z.B. Purinbasen, Adenosintriphosphat usw.
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Die Medien werden in der Regel als Lösung in einer ausgewogenen Salzlösung
(nachfolgend abgekürzt als "BSS" bezeichnet verwendet, d.i. eine Lösung, die hinsichtliche
Menge und Verhältnis von ionischen Arten so ausgewogen ist, daß sie bezüglich des
pH-Wertes, Mineralstoffgehalts, osmotischen Drucks usw. physiologisch verträglich
ist. Eine Anzahl von ausgewogenen Salzlösungen erfreuen sich einer weitverbreiteten
Anwendung, z.B. die BSS nach Hank und nach Earle; die mit Phosphat gepufferte Dulbecco-Kochsalzlösung,
die Kochsalzlösung nach Puck und dergleichen. Eine Anzahl von chemisch definierten
Medien werden ebenfalls in großem Umfang verwendet, wie z.B. das Medium 199 nach
Morgan, Morton und Parker [vgl. Proc. Soc. Exper. Biol. & Med., Bd. 73, s. 1
- 8 (1950)J; das Grundmedium ("Basal Medium") nach Eagle [vgl. Science)Bd. 122,
s. 501 - 504 (1955); Science, Bd. 123, s. 845 - 847 (1956); J. Biol. Chem., Bd.
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226, s. 191-206 (1957)3; das "Minium Essential Medium" nach Eagle
[vgl. Science, Bd. 130, S. 432 - 437 (1959)3; das "Medium T8" nach Trowell [vgl.
Exper. Cell Res., Bd. 16, S. 118 - 147 (1959)3; das Medium "MB 752/1" nach Waymouth
[vgl. J. Nat. Cancer Inst., Bd. 22, S. 1003 - 1017 (1959)3; das Medium "N 16" nach
PuckLvgl. J. Exper. Med., Bd. 108, s. 945 - 959 (1958) und Neumann und Tytell, Proc.
Soc. Exptl.
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Biol. Med., Bd. 104, S. 252 - 256 (1960)3. Nähere Angaben zur Herstellung
und Formulierung derartiger Medien können in der Fachliteratur, wie z.B. im "Handbook
of Cell and Organ Culture" von Merchant, Kahn und Murphy, Burgess Publ.
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Co., Minneapolis (1960) und in "In Vitro-Monograph Nr. 1, A,
Survey
of Commercially Available Tissue Culture Media", von Helen C. Morton, In Vitro (J.
Tissue Culture Association) Bd. 6, Nr. 2, S. 89 - 108 (1970) gefunden werden.
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Zusätzlich zur Klassifikation von Medien als "definierte" oder "undefinierte"
Medien können sie auch im breiten Rahmen aufgrund ihrer Fähigkeit charakterisiert
werden, den Zellstoffwechsel und die Zellproliferation zu unterstützen.
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Medien, welche einenStoffwechsel von Zellen bei Konzentrationen, welche
für viele Zwecke, einschließlich die Virusgewinnung, ausreichend sind, erlauben,
welche jedoch weder eine signifikante Zellproliferation überhaupt oder lediglich
eine begrenzte Randproliferation erlauben, werden als t'Aufrechterhaltungsmedien"
bezeichnet. Medien, welche die Zellproliferation unterstützen, werden in der Regel
als "Wachstumsmedien" bezeichnet. Den meisten Wachstumsmedien liegen eine BSS oder
ein chemisch definiertes Medium zugrunde, welche durch ein oder mehrere natürliche
Produkte, gewöhnlich tierisches Serum, ergänzt sind. Beispiele für typische Wachstumsmedien
sind sowohl das "Basal-Medium" oder das "Medium 199" nach Eagle, ergänzt mit 10
bis 20 % vollständigem tierischen Serum; BSS mit 40 % Serum; und 40 % BSS mit 40
% Serum und 20 % Embryoextrakt. Manche chemisch definierten, proteinfreien Medien
können als Wachstumsmedien für eine begrenzte Anzahl von Zellarten benutzt werden
(vgl. Katsuta und Takaoka, "Methods in Cell Biologytt, Bd. VI, herausgegeben von
Prescott, Academic Press,1973, Kap. 1). Für das Wachstum von Primärzellen in Gewebekulturen
und für die meisten Gewebekulturen zur technischen Impfstoffherstellung ist jedoch
ein Serumzusatz erforderlich.
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Die Nachteile einer Anwendung von Serum bei der Impfstoffherstellung
sind wohlbekannt. Ein geeignetes Serum ist schwierig und nur mit hohen Kosten erhältlich,
lagerfähig und
anwendbar; es ist eine Quelle von unerwünschte Fremdproteinen,
welche in das Impfstoffendprodukt eingeschleppt werden können; seine Zusammensetzung
schwankt von Ansatz zu Ansatz und es ist eine mogliche Quelle der Verunreinigung
der Viren oder Mycoplasmen [vgl. J. National Cancer Institute, Bd. 50, S. 559 -
562 (1973); Proc. Soc.Exp.
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Biol. Med., Bd. 138, S. 432 - 437 (1971) und In Vitro, Bd. 8 S. 91
- 93 (1972)3.
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Erfindungsgemäß wird ein Medium5 welches Insulin enthält, verwendet.
Verschiedene Insulin enthaltende Medien sind bekannt und wurden auch schon angewandt.
Das ein Serum enthaltende Wachstumsmedium enthält in der Regel etwas Insulin, welches
im Serum in unkontrollierbaren, schwankenden Mengen natürlich vorliegt. Andere Medien
schließen die zuvor genannten Medien "T8" nach Trowell, das "Serum Free Medium"
nach Neuman und Tytell ein, ferner das Medium nach Frenkel Cvgl. Am. J. Vet. Res.,
Bd. XI, S. 371 - 373 (1950) und Bd.
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XII, S. 187 - 190 (1951)3 oder das Medium "MAB 87/3" nach Waymouth
[vgl. Tissue Culture, Herausg. Ramakrishnan, funk, Den Haag (1965) S. 168 sowie
ferner die US-PSn 3 196 077 und 3 655 873 und die zuvorgenannte Monographie Katsuka
und Takaoka, Tabelle 113.
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Das Medium nach Frenkel enthält etwa 0,9 Insulin-Einheiten pro Liter;
das Medium nach Trowell etwa 50 mg/l und weist einen minimalen Zinkgehalt auf; das
Medium nach Waymouth enthält 8 mg/l. Das Medium nach Neuman und Tytell enthält 1
mg Insulin pro Liter. ( 1 mg Insulin entspricht huber 20 Einheiten, - vgl. Britisches
Arzneimittelbuch 1973, S. 246). Während derartige Medien verschiedene Anwendungen
fanden, erwiesen sie sich jedoch nicht völlig zufriedenstellend für Anwendungen
im technischen Maßstab, wie z.B.
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zur Impfstoffherstellung oder zur Primärgewebekultur in
großem
Maßstab.
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Protamin-Zink-Insulin (im nachfolgenden meistens als "PZI" abgekürzt
bezeichnet) ist im allgemeinen als eine sterile Lösung von Insulin in einem wässrigen
Puffer erhältlich, welche durch Zinkchlorid und Protamin modifiziert ist. Die Suspension
von Protamin-Zink-Insulin enthält etwa 0,2 bis etwa 0,25 mg Zink und etwa 1,0 bis
etwa 1,7 mg Protamin pro 100 Insulin-Einheiten; sie hat einen pH-Wert von etwa 6,9
bis 7,4 (vgl. z.B. US-Arzneimittelbuch XVIII, 1970, Den 335 bis 336, sowie Britisches
Arzneimittelbuch, 1973, Seite 246). Das Material ist in einer zur Injektion beimMenschen
geeigneten Form im Handel erhältlich, und diese Form wird erfindungsgemäß bevorzugt
verwendet. Protamin-Zink-Insulin unterscheidet sich bekanntlich hinsichtlich seiner
biologischen Wirkung von anderen Formen des Insulins beträchtlich [vgl. Remington,
"Pharmaceutical Sciences", 13. Aufl., Mack Pub. Co., Easton, Pa.,Kap. 62, S. 1048
- 1049 (1965); ferner Merck Index, 8. Aufl., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J.,
S. 879 (1968); J. Pharmacol. Exptl. Therap., Bd. 58, S. 78 (1936) und US-PSn 2 143
591 und 2 179 3843.
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Vorliegende Erfindung betrifft Gewebekulturen und die Virusvermehrung
in Gewebekulturen, insbesondere in chemisch definierten Medien. Sie betrifft vor
allem Gewebekulturen und die Vermehrung von Viren in Gewebekulturen, in denen tierische
Zellen wachsen gelassen werden, unter Anwendung eines die Gewebekultur aufrechterhaltenden
Mediums, in dem eine geringe, das Wachstum erhöhende Menge von Protamin-Zink-Insulin
enthalten ist. Die Erfindung betrifft ferner ein neues Medium, welches eine das
Wachstum erhöhende Menge von Protamin-Zink-Insulin enthält, sowie einen nach diesem
Verfahren hergestellten Impfstoff.
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Es wurde gefunden, daß der Zusatz von Protamin-Zink-Insulin zu Gewebekulturmedien,
insbesondere chemisch definierten Medien zu unerwartet vorteilhaften Ergebnissen
führt, und zwar zu einer erhöhten Zellenhaftung, einem quantitativ und qualitativ
erhöhten Zellenwachstum,einer erhöhten Lebensdauer der Zellenmonoschichten von Gewebekulturen
(tissue culture cell monolayers) in hervorragendem Zustand, und zur Verbesserung
bei der Herstellung von Virusimpfstoffen in derartigen Gewebekulturzellen. Die Erfindung
ermöglicht die Gewinnung von tierischen Zellen und Virusimpfstoffen in Gewebekultur
in völliger Abwesenheit von chemisch undefinierten Zusatzstoffen, wie z.B. tierisches
Serum, Embryoextrakte und dergleichen; sie führt zu durchweg verbesseren Ergebnissen,
welche kommerzielle Herstellungsverfahren ermöglichen.
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Das erfindungsgemäße Medium ist ein steriles, chemisch definiertes,
die Gewebekultur aufrechterhaltendes Medium, welches Protamin-Zink-Insulin (im folgenden
abgekürzt als "PZI" bezeichnet) enthält, das im Medium in einer Menge dispergiert
ist, die wirksam genug ist, um das Wachstum tierischer Zellen in der Gewebekultur
signifikant zu erhöhen. Die optimale Menge an PZI, welche in speziellen Situationen
zuzugeben ist, kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie z.B. Zellart, Art
des chemisch definierten Mediums, pH-Wert (der auch die Löslichkeit von PZI beeinflußt),
Inkubationsbedingungen usw., schwanken. In bestimmten Fällen können die zu besten
Ergebnissen führenden Mengen leicht nach klassischen Verfahren zur Bereichsermittlung
unter Bestimmung der statistisch signifikanten Wachstumserhöhung ermittelt werden.
Beispielsweise kann ein Vergleich der Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen
an PZI zum Aufrechterhaltungsmedium allein angewandt werden. In der Regel wird ein
erhöhtes Wachstum bei Konzentrationen an PZI
von etwa 0,05 bis
etwa 0,5 Einheiten PZI pro ml des Gewebekulturendmediums erhalten. Wesentlich geringere
Mengen an PZI, z.B. 0,01 Einheiten/l>sind im allgemeinen unzureichend, um das
Wachstum zu erhöhen, und wesentlich höhere Mengen, wie z.B. 0,7 Einheiten oder mehr
pro l>ergeben gewöhnlich keine zusätzliche Erhöhung, und der zusätzliche überschuß
an PZI kann schädlich sein. Bevorzugt wird eine PZI-Konzentration von etwa 0,075
bis etwa 0,1 bis etwa 0,2 bis etwa 0,3 Einheiten pro ml.
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Bei einer Ausführungsform enthält das Medium auch eine erglänzende,
das Wachstum erhöhende Menge an Glukose zusätzlich zu PZI. Die ergänzende Glukosemenge,
die angewandt wird, ist im allgemeinen diejenige Menge, welche erforderlich ist,
um die Glukose-Endkonzentration (umfassend die Glukose in dem Aufrechterhaltungsmedium
sowie der Ergänzung) von etwa 1150 bis etwa 2000 mg pro 1, oder mehr, zu erreichen.
Bei einer anderen Ausführungsform enthält das Medium eine geringere Menge an einem
Salz der Brenztraubensäure (pyruvate), und zwar etwa 5,50 Fg/ml.
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Das Aufrechterhaltungsmedium kann ein beliebiges, die Gewebekultur
aufrechterhaltendes Medium sein, wie z.B. das zuvor genannte Medium 199"> das
"Basal-Medium" nach Eagle, das "Minimum Essential Medium" nach Eagle und dergleichen,
zahlreiche Modifikationen derartiger Medien oder auch ein speziell formuliertes
Medium. Während es wesentlich ist, daß das Medium ein solches ist, welches genügend
Nährstoffe (Salze, Vitamine, Kohlenhydrate , Lipide, Aminosäuren usw.) liefert,
um einen kontinuierlichen Zellstoffwechsel
zu erlauben, ist es
nicht wesentlich, daß das Medium eine schnelle Proliferation der in Frage stehenden
Zellen unterstützt. Das heißt, daß das Medium, ohne PZI, selbst ausreichen sollte,
um die Funktion eines Aufrechterhaltungsmediums für die infragestehenden Zellen
auszuüben, obgleich es nicht ausreichen muß, um allein als Wachstumsmedium für die
gleichen Zellen zu dienen. Das Medium kann auch ein solches sein, das das Wachstum
ausreichend unterstützt; in derartigen Fällen führt die Erfindung zu verbesserten
Ergebnissen. Das Medium sollte weniger als etwa 0,05 Einheiten es pro ml ein/ anderen
insulinhaitigen Materials als PZI enthalten, und es enthält vorzugsweise PZI als
die alleinige wesentliche, nachweisbare Insulinquelle.
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Obwohl die Erfindung mit einem chemisch undefinierten Medium durchführbar
ist, werden dann viele der erfindungsgemäß erhaltenen Vorteile preisgegeben oder
verkleinert. Beispielsweise treten bei Verwendung von undefinierten Substanzen,
wie z.B. Serum, die mit einem chemisch definierten System erreichbaren Vorteile
der Zellen- und Virusproduktion nicht auf. Demgemäß sollte das Medium ein solches
sein, welches von biologischen Flüssigkeiten chemisch nicht definierter Zusammensetzung,
wie z.B. Serum, Plasma, Fruchtwasser, Embryoextraktenund dergleichen, frei ist;
es sollte vorzugsweise ein chemisch definiertes Medium sein. Die chemische Identität
und die Menge aller Komponenten im Medium sind dann vorbestimmbar.
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Zur Formulierung des erfindungsgemäßen Mediums wird PZI zu den Komponenten
des Aufrechterhaltungsmediums auf beliebige zweckmäßige Weise, die zur Dispergierung
des PZI in dem Medium führt, zugegeben; hierbei wird selbstverständlich die Sterilität
gewahrt, und Bedingungen, welche zur Denaturierung von PZI führen können, werden
vermieden, Nach einem zweckmäßigen
und bevorzugten Verfahren wird
ein chemisch definiertes Aufrechterhaltungsmedium formuliert, im Autoklaven sterilisiert
und/oder steril filtriert, und das PZI wird in Form der wässrigen, gepufferten,
injizierbaren Suspension nach dem US-Arzneimittelbuch zugegeben.
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Die Zugabe erfolgt zweckmäßigerweise, indem man die PZI-Suspension
zu etwa 5 bis 15 Volumina des Mediums zugibt, das Gemisch wenige (z.B. 1 bis 3)
Stunden bei Temperaturen von etwa 20 bis 40°C rührt, und sodann zusätzliches Aufrechterhaltungsmedium
zugibt, wobei man die gebrauchsfertige Endzusammensetzung erhält.
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Erfindungsgemäß wird das neue Medium verwendet, indem man es mit Zellen,
welche in der Gewebekultur wachsen sollen, inokuliert und die Zellen und das Medium
unter Bedingungen inkubiert, die für das Zellwachstum in einer Gewebekultur förderlich
sind. Die Inkubation wird normalerweise unter Bedingungen des pH-Werts (in der Regel
7,1 oder 7,2 bis 7,5 oder 7,6 ), der Temperatur :(in der Regel etwa 28 bis 40 Cgvorzugsweise
etwa 35 bis 380cm Bestrahlung, Sepsis, Sauerstoffzuführung (Oxygenation) usw. durchgeführt,
welche bekannterweise für die benutzte Zellenart geeignet sind.
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Die Inkubation kann in einem beliebigen, geeigneten Gefäß durchgeführt
werden, wie z.B. in Glasflaschen, Flaschen aus nicht-toxischem Metall oder organischen
Kunststoffen oder in Vorrichtungen zur Vermehrung von Gewebekulturen (Propagatoren).
Es wird eine schnelle Zellenhaftung verhalten, wobei in der Regel zumindest 50 bis
70 % der Zellen an der Oberfläche des Gefäßes nach 15 bis 30minUtiger Inkubationszeit
haften. Innerhalb von 2 bis 5 Tagen nach Impfung, d.h.
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Beginn der Inkubation, zeigt sich in der Regel eine hervorragende
und schnelle Proliferation.
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Wenn eine Virusvermehrung beabsichtigt ist, wie bei der Herstellung
von Virusimpfstoffen, wird die Inkubation der Zellen und des Mediums mit PZI solange
fortgesetzt, bis ein zuvor festgelegter gewünschter Grad des Zellenwachstums (z.B.
das Ende der 'tLogarithmusphase" des Zellwachstums, das Erreichen eines 90 bis 100
%igen Zusammenfließens vor (confluency) der Zellenmonoschichten usw.}/. «as Medium
mit PZI wird sodann nach herkömmlichen Verfahren, wie z.B. durch Dekantieren, Ab
augen oder dergleichen, entfernt und durch ein chemisch definiertes Aufrechterhaltungsmedium
ersetzt, welches kein PZI enthält; die Zellen werden mit dem Impfvirus inokuliert;
die Zellen, das Virus und das PZI-freie Aufrechterhaltungsmedium werden unter Bedingungen
inkubiert, welche für die Virus vermehrung förderlich sind, bis eine wesentliche
Vermehrung des Virus auftritt, wonach das Virus sodann gemäß herkömmlichen Verfahren
gewonnen wird.
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Die Entfernung des PZI enthaltenden Mediums zum Zeitpunkt der Virusimpfung
vermindert die Risiken einer Zellenüberentwicklung und vermindert auch die restliche
Menge an PZIR welche in das Virusimpfstoff-Endprodukt mitgeschleppt wird.
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Obgleich das Ersatzmedium als "PZI-frei" bezeichnet werden kann, liegt
es auf der Hand, daß im allgemeinen bei der Virusgewinnung etwas PZI mit den Zellen
zurückbleibt. Die übrigbleibende PZI-Konzentration liegt in der Regel unterhalb
derjenigen, welche irgendeine signifikante nachteilige Wirkung bei Verabreichung
eines Virusimpfstoffs haben könnte; sie kann ferner durch Waschen oder Spülen der
Zellen mit frischem, PZ 1-freien Medium vor Zugabe des Ersatzmediums und der Impfung
mit dem Virus vermindert werden. In der Regel ist die PZI-Konzentration eine geringe
Menge; sie reicht von einer Menge, die unter derjenigen Menge liegt, welche nach
der Methode mit radioaktiven Isotropen quantitativ bestimmbar ist (und damit auch
unterhalb den normalen Mindestkonzentrationen menschlichen Serums von
etwa
4 Mikroeinheiten oder 0,000004 Einheiten/ml) bis zu Mengen von etwa 0,05 bis 0,5
Einheiten/ml im frisch zubereiteten PZI-Medium; sie fällt um etwa 25 bis 75 % nach
24 bis 72 Stunden Zellenwachstums und abermals, während der Virusvermehrung und
-gewinnung, auf einen Wert, der von unterhalb der quantitativ bestimmbaren Menge
liegenden Minimalkonzentrationen bis zu etwa 50, 400 und etwa 1000 Mikroeinheiten
(0,000050 bis 0,0004 Einheiten) pro ml reicht.
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Ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellter Impfstoff kann
etwa 4 oder weniger bis etwa 1000 Mikroeinheiten PZI pro ml enthalten, wobei die
Zellen nach Entfernung -des PZI-Mediums und vor Impfung mit dem Virus gegebenenfalls
gewaschen werden. Obgleich dieser Konzentrationsbereich über die normalen Insulinspiegel
menschlichen Serums (etwa 4 bis 25 Mikroeinheiten pro ml) hinausgeht, liegt er weit
unterhalb der Konzentrationen, welche in PZI-Suspensionen zur Injektion vorliegen,
nämlich 40, 80 oder 100 Einheiten/ml, und ereicht nicht aus, um signifikante physiologische
Wirkungen zu zeigen, wenn er in einem injizierbaren Impfstoff Anwendung findet.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Virusimpfstoffe enthalten vorzugsweise
- zusätzlich zu einer wirksamen immunisierenden Dosis des Virus -den physiologisch
tolerierbaren, bei der Gewinnung anfallenden Rest an Gewebekulturzellen und an Aufrechterhaltungsmedium
sowie gewünschtenfalls ferner Stabilisatoren oder Hilfsmittel, eine Menge an PZI,
die von derjenigen Menge) welche nach der Methode mit radioaktiven Isot open oder
nach einem äquivalenten Verfahrne,rbSedsetimmbar ist, bis zu einer bei der Injektion
physiologisch akzeptablen Maximalkonzentradaß tion reicht, ohnexdem PZI signifikante
nachteilige physiologische Wirkungen zugeschrieben werden können. Zweckmäßigerweise
liegt diese Konzentration zwischen etwa 4 oder weniger und 1000 Mikroeinheiten PZI
pro ml der Enddosierungsform des Impfstoffs.
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Virus-Impfstoffe, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt
sind, enthalten (1) das Virus, in der Regel ein aktives (lebendes), geschwächtes
(attenuated) Virus, welches ansprechbare Subjekte zu irmunisieren vermag ohne das
signifikante Symtome der Krankheit, gegen welche immunisiert wurde, oder ein signifikanter
Grad an Nebenwirkungen auftreten; (2) wahlweise zugesetzte, pharmazeutisch brauchbare
Hilfsmittel, wie z.B. Puffer, Stabilisatoren, wie z.B. Laktose-glutamat (vgl. US-PS
3 133 861), Zucker, Albumin-oder Glutaminphosphat (vgl. US-PSn 3 401 084 und 3 555
149) sowie im injektionsbereiten Zustand eine pharmazeutisch brauchbare Injektionsflüssigkeit,
wie z.B. steriles, von Temperatur-erhöhenden Stoffen freies Wasser, oder isotonische
Kochsalzlösung, und (3) einen pharmazeutisch tolerierbaren Rückstand aus der Gewinnung
und Aufarbeitung des Impfstoffs. Dieser Rückstand ist in der Regel ein chemisch
undefiniertes Gemisch, welches als Komponenten Stoffwechselprodukte aus dem die
Zellkultur aufrechterhaltenden Medium, das während der Virusgewinnung verwendet
wurde, stammen; Zellstoffwechselprodukte; eine kleine Menge an Cellularsedimenten,
welche bei der Impfstoffgewinnung und den Klärungsverfahren nicht entfernt wurden>
sowie restliches Insulin enthält, das aus der Anfangsphase des Zellwachstums in
dem PZI-Medium zurückblieb. Der erfindungsgemäße Impfstoff ist im wesentlichen von
exogenem, chemisch undefiniertem Material frei. Das heißt, der Impfstoff enthält
kein anderes analytisch nachweisbares, chemisch undefiniertes biologisches Material
als dasjenige, welches aus dem Wachstum und Stoffwechsel der Zellen und aus der
Virusvermehrung stammt. So ist beispielsweise ein Impfstoff, welcher in einer Hühnerembryogebewebekultur
hergestellt wurde, frei von nachweisbaren Rinderserumkomponenten.
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Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, daß die vorliegende
Erfindung leicht an die Gewinnung von Impfstoffen und Zellen in einer Gewebekultur
in den verschiedensten Situationen angepaßt werden kann, wobei herkömmliche -Verfahren
der Gewebekultivierung und Impfstoffgewinnung angewandt werden. Die Erfindung ist
besonders gut zur Herstellung von neuen aktiven Virusimpfstoff-Zusammensetzungen
geeignet, welche restliches PZI, wie weiter oben gezeigt, enthalten; es ist zur
Verwendung sowohl in Systemen für Säugetier- als auch Geflügelzellen anpaßbar, wie
nachfolgend gezeigt wird.
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Nachfolgende Beispiele erläutern die Anwendung der Erfindung näher,
wobei primäre Hühnerembyozellen in Gewebekultur und das aktive, abgeschwächte Rubeola-Virus
(Stamm Schwarz) als Virusimpfstoff verwendet werden. Weitere Beispiele erläutern
die Verwendung anderer Zellen, nämlich Entenembryo-> Kaninchennieren- und Affennierenzellen,
sowie anderer Viren, nämlich Mumps-, Rubella- sowie Polioviren usw. Als chemisch
definiertes Aufrechterhaltungsmedium wird in den Beispielen in der Regel das vollständige
Medium "M-199" nach Morgan, Morton und Parker tvgl. Proc. Soc. Exp. Biol, &
Med., Bd. 73, S. 1 bis 8 (1950)3 mit HanksBSS verwendet. Die Hühnerembr o-Gewebekulturzellen
werden aus RIF-freien (RIF = Rous interfering factor) Eiern klassischen Verfahren
hergestellt, z.B.
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durch Entfernen der Augen, Schnäbel und rückseitigen Gliedmaßen, Waschen,
Zerstückeln, Behandeln mit Trypsin, Filtrieren, Zentrifugieren zur Abtrennung der
Zellen von der Trypsinlösung und Suspendieren der Zellen im frischen Medium. Andere
Zellsysteme werden nach klassischen Verfahren zubereitet. Da die Verfahren zur Herstellung
der Zellen und Medien wohlbekannt sind, werden sie nicht detailliert beschrieben.
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Beispiel 1 Zellkultivierung und -wachstum Unter Verwendung von 12
Tage alten Hühnerembryos wurde eine Zellsuspension hergestellt, 2 Stunden bei 370C
mit Trypsin behandelt und in der ausgewogenen Salzlösung (BSS) nach Hank bei einer
Konzentration von etwa 3 x 105 Zellen/ml suspendiert. Eine Reihe von ca. 940 ccm
Glas flaschen zur Gewebekultur wurde vorbereitet. In jede Flasche wurden 75 ml des
sterilen Mediums M-199 gegeben. Zu verschiedenen Testgruppen von Flaschen wurden
verschiedene Testzusätze gegeben, wobei jede Gruppe 3 Flaschen umfaßte, und die
Flaschen wurden sodann mit der Zellensuspension geimpft.
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Die Zellen wurden bei 36,5 bis 370C inkubiert. Nach 48 Stunden wurde
das Medium abdekantiert und durch frisches Medium M-199 mit BSS nach Hank, jedoch
ohne Testzusatz, ersetzt. Die Zellen wurden täglich beobachtet. Das allgemeine Aussehen
der Zellen (wobei "E" hervorragend, "G" gut, "F" mittelmäßig, und tlplt schlecht
bedeutet) und das Ausmaß der zusammenfließenden Monoschicht (confluent monolayer),
ausgedrückt als Prozentsatz der bedeckten Oberfläche, sind nachfolgend zusammengestellt.
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Ergebnisse nach ..... Inkubationstagen Testzusatz 1 2 3 4 5 6 7 8
9 Ohne; (allein Medium M-199) G/30 G/30 F/40 F/50 F/60 F-G/70 G/90 G/90 E/100 2%
Kalbfbetusserum G/50 G/70 G/90 E/100 E/100 E/100 E/100 E/100+) E/100+) 0,2 Einheiten/ml
PZI G/50 G/70 G-E/90 E/100 E/100 E/100 E/100 E/100 E/100 PZI: 0,2 µ/ml + am 2. Tag
zugegebene 0,2 µ/ml G/70 F/80 G/80 F/80 F/80 F-G/90 F-G/90 F-G/90 ohne F/20 F/30
F/30 F/30 F/50 F/60 F/70 F/70 2% Kalbfestusserum G/60 G/70 E/95 E/100 E/100+) 0,2
µ/ml PZI G/50 G/70 E/90 G/95 E/100 E/100 E/100 E/100 0,2 µ/ml Insulin F/20 F/30
G/40 G/50 G/70 G/70 G/75 G/90 +)Zurückziehung (Abtrennung der Zellenmonoschicht
von der Oberfläche der Gewebekulturflasche).
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Die ersten 4 Serien wurden mit 1,5 ml Zellsuspension pro Flasche geimpft.
Die zweiten 4 Serien wurden 24 Stunden später mit 2,0 ml der gleichen Suspension
pro Flasche geimpft.
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Die obigen Ergebnisse zeigen die Verbesserung des erfindungsgemäß
erreichbaren Zellenwachstums, und zwar hinsichtlich eines frühen Erreichens von
ausgezeichneten, vollständigen zusammenfließenden Monoschichten und der Aufrechterhaltung
der Monoschicht während mehreren Tagen ohne jede Zurückziehung. Sie zeigen ferner
auch die Verbesserung hinsichtlich einem Medium M-199 allein oder diesem mit regulärem
Insulin.
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Beispiel 2 Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurde eine Reihe von
Kulturflaschen vorbereitet, welche jeweils 75 ml des Mediums M-199 enthielten. Zu
den Testgruppen der Flaschen wurden verschiedene Zusätze zugegeben, und die Testmedien
wurden sodann mit 1,7 ml pro Flasche einer Hühnerembryozellsuspension geimpft, welche
3 x io5 Zellen/ml enthielt.
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Danach wurden die Flaschen bei 370C inkubiert und täglich während
10 Tagenßdanach in längeren Zeitabständen weitere 10 Tage beobachtet.
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Das Medium M-199 mit 0,1 % Glukose ergab ein langsames Wachstum mit
Bewertungen G/30 und F/30 an den Tagen 1 und 2, eine auf E/90 am Tage 9 ansteigende
Bewertung, die schließlich an den Tagen 12, 14 und 20 den Wert E/100 erreichte.
Das Medium M-199 mit 2 % Kalbsfoetusserum wurde mit E/90 am 3. Tag, E/100 an den
Tagen 4 bis 8 bewertet, wobei eine Zurückziehung der Zellen am Tage 9 begann>
und das Ablösen der Zellen von der Flaschenoberfläche zu ausgedehnt war, um eine
Bewertung an den Tagen 12, 14 und 20 zu ermöglichen.
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Hervorragende Ergebnisse, welche am Tage 4 (in einigen Flaschen schon
am 2. und 3. Tage) begannen, sich den ganzen Test hindurch fortsetzten und mit E/1O0
bewertet wurden, wurden mit dem Medium M-199 mit 10 Protamin-Zink-
Insulin-Einheiten
pro Flasche (0,13 Einheiten PZI/ml) und 0,25 Gew.-% Glukosezusatz erhalten. Ein
identisches Medium mit einem Gehalt an 0,267 Einheiten PZI/ml und 0,25 % Glukose
erhielt die Bewertungen G/100 an den Tagen 5 bis 7 und E/100 am Tag 8 und danach.
Bei 0,40 Einheiten PZI/ml und 0,25 % Glukosezusatz war die Bewertung G/100 für die
Tage 5 bis 7, G-E/100 für die Tage 8 bis 10, 12 und 14, wobei ein Abfall auf F-G/90
am Tage 20 eintrat. Mit 0,53 Einheiten PZI/ml und 0,25 % Glukosezusatz war die Bewertung
F/100 am Tag 5, die sich auf G/100 an den Tagen 6 bis 10, 12 und 14 verbesserte,
jedoch am Tag 20 auf G/95 abfiel. Das Zellenwachstum im Medium M-199, welches lediglich
mit 0,26 Einheiten PZI/ml ergänzt war, wurde an den Tagen 4 und 5 mit G/95, den
Tagen 6 und 7 mit G/100 und am Tag 8 und danach mit E/100 bewertet. Das Zellenwachstum
im Medium M-199, welches lediglich mit 0,267 Einheiten Insulin pro ml ergänzt war,
erhielt die Bewertung E/95 an den Tagen 5 und 6 sowie E/100 am Tage 7 und danach.
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Bei gleicher Menge an Insulinzusatz und Zugabe von 2,5 /ug Protaminsulfat
pro ml war die Bewertung G/100 ader G-E/100 an den Tagen 5 bis 9 und E/100 danach.
Höhere Mengen an Protaminsulfat erwiesen sich als nicht besonders vorteilhaft; Konzentrationen
von 5 und 10 Fg/ml und die gleiche Insulinmenge, wobei 100 % der Oberfläche bedeckt
war, führten zur Bewertung E/100 oder G/100 erst nach dem 10. Tag. Bei einem ähnlichen
Verfahren mit dem Medium M-199 plus Protaminsulfat allein schien das Medium gegenüber
Hühnerembryogewebekulturzellen toxisch zu sein.
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Beispiel 3 Bei der Durchführung der Bewertungen gemäß Beispiel 2 wurden
zwei Gruppen zusätzlicher Kulturflaschen vorbereitet und mit Zellen geimpft. Die
veniendeten Testmedien waren (A) M-199 + 2 % Kälberfoetusserum sowie (B) M-199 +
0,267 Einheiten PZI
pro ml. Diese Gruppen A und B wurden 24 Stunden
bei 370C inkubiert, sodann wurden die Testmedien von den anhaftenden Zellen entfernt
und durch das Medium M-199, welches kein zusätzliches Serum oder PZI enthielt, ersetzt.
Die Inkubation erfolgte bei 320C. Am 2. Tag nach der Zellkultivierung und 24 Stunden
nach dem Austausch des Mediums wurden die Zellen mit Rubeola-Virus (aktiv, abgeschwächter
Schwarz-Stamm) geimpft. An den Tagen 7, 8, 9 und 10 wurde aus jeder Flasche ein,jeder
Gruppe das Virus gewonnen. Tägliche Ausbeuten von jeder Gruppe A oder B wurden vereint,
und die vereinten Viren wurden filtriert. Für die Gruppe A betrugen die täglichen
Titer 4,1; 4,4; 4,8 und 5,0. Für die Gruppe B waren die entsprechenden täglichen
Titer 3,9; 4,6; 4,6 und 5,5. (Der Virus-Titer wird ausgedrückt als gemeiner Logarithmus
10 der Anzahl der 50 %igew Gewebekultur-Infektionsdosen (TCID50) pro ml).
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Beispiel 4 Zellenwachstum in technischem Maßstab Es wurde ein Protamin-Zink-Insulin-Vorgemisch
hergestellt, indem man 180 ml des Mediums M-199 mit 20 ml (100 Einheiten pro ml)
PZI versetzte, und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 250C) rührte. Die
Endkonzentration an PZI in dem Vorgemisch betrug 10 Einheiten pro ml.
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Ein Hühnerembryozellenkonzentrat (CEC-Konzentrat) wurde aus 11 Tage
alten Embryos hergestellt, wobei bei 37 0C die Behandlung mit Trypsin und das Waschen
mit dem Medium M-199 vorgenommen wurde. 330 ml Suspension mit einem Gehalt an etwa
3,0 x 107 Zellen pro ml wurden hergestellt.
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Das PZI-Vorgemisch, CEC-Konzentrat und das Medium M-199 wurden in
getrennten 4 l-Abfüllbehälter nach getrennten Verfahren vermischt, sodann wurden
aus Jedem Behälter gleiche Teile zu je 75 ml in ca. 940 ccm Glasflaschen abgefUlltJund
und die Zellen wurden bei 370C inkubiert. Sie wurden hinsichtlich der Zellmorphologie
und des prozentualen Zusammenfließens der Zellschicht beobachtet. Unter Verwendung
von M-l99 und M-199 + 2 % Kalbsfoetusserum wurden auch Kontrollen durchgeführt.
In allen Fällen wurde das Verhältnis der Komponenten so ausgewählt, daß 1,5 ml CEC-Konzentrat
(4,5 x 107 Zellen) pro 75 ml und 1 ml PZI-Konzentrat (10 Einheiten) pro 75 ml Flascheninhalt
zur Verfügung standen, so daß eine PZI- Endkonzentration von 0,133 Einheiten pro
ml erhalten wurde.
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Mit dem Medium M-l99 allein war die Zellmorphologie fortgesetzt schlecht,
und das Zusammenfließvermögen stieg lediglich von 10 % am Tag 1 auf 40 % am Tag
4 an. Beim Medium M-199 + 2 % Kalbfoetusserum war die Morphologie am ersten Tag
befriedigend, wobei das Zusammenfließvermögen 20 % betrug, und es stieg auf 30 bis
40 % am Tag 2 und auf 60 % am Tag 3. Am 4. Tag war die Morphologie befriedigend
bis gut, während die Zusammenfließfähigkeit der Zellschicht zu 75 bis 85 % vollständig
war. Beim Vermischen der Komponenten in einem 4 l-PyreGlasgefäß, wobei das Medium
M-l99 mit dem CEC-Konzentrat versetzt, und sodann das PZI-Vorgemisch zum Gemisch
zugegeben wurde; wurde ein 75 %iges Zusammenfließen bei guter Zellmorphologie am
ersten Tag nach Abfüllen unter Einfluß der Schwerkraft beobachtet. Dieselbe Bewertung
setzte sich am 2. Tag fort.
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Ähnliche Ergebnisse wurden beim Abfüllen unter Druck in die Kultivierungs-Glasflaschen
erhalten, wobei ein 60 %iges Zusammenfließen bei guter Morphologie 1 Tag nach Ab
füllen in Falcon@-Kunststofflaschen erhalten wurde.
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Wenn die Reihenfolge der Zugabe des PZI-Vorgemisches und des CEC-Konzentrats
umgekehrt wurde (d.h. PZI vor CEC) wurde nach einem Tag,sowohl bei Entnahme unter
Schwerkraft als auch unter Druck, eine befriedigende bis gute Morphologie mit einem
60 bis 70 %igen Zusammenfließen erhalten.
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Am 3. Tag wurden diese Gewebekulturflaschen als70 bis 75 % zusammenfließend
bei guter Morphologie bewertet.
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Bei 2 anderen Verfahrensweisen wurden die Komponenten durch Zugabe
von zuletzt der Zellen vermischt. Bei einem Verfahren wurde ein 4 l-Gefäß aus rostfreiem
Stahl verwendet, während bei dem anderen das Vermischen in einem Kunststoffgefäß
aus Falcon vorgenommen wurde. In beiden Fällen zeigte sich nach einem Inkubationstag
eine befriedigende bis gute Morphologie und ein Zusammenfließen von 45 bis 65 %.
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Bei anderen Verfahren wurden Hühnerembryozellen in einer Vorrichtung
zur Gewebekulturvermehrung geimpft, welche eine innere Platte aus Polystyrol in
spiralförmiger Anordnung als primäre Oberfläche für die Zellhaftung und das Zellwachstum
aufwies (Hersteller: Dyna Cell, Cooke Laboratory Products, Alexandria, Virginia).
Man ließ die Zellen in dem Medium M-l99 mit einem Gehalt an 0,13 Einheiten PZI pro
ml bis zu einem praktisch vollständigen Zusammenfließen wachsen, impfte dann mit
Masern-Virus und inkubierte mit dem Medium M-199 (ohne PZI). Die Virus-Replikation
war hervorragend.
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Beispiel 5 Masern-Virus-Gewinnung Zur Herstellung eines Masern-Virus-Impfstoffs
in Hühnerembryo
-Fibroblasten, welche in serumfreien Medium gewachsen
waren, wurden folgende Medien bzw. Lösungen zubereitet: A) M-199-Wachstumsmedium:
Medium M-199 mit der "Basel Salt Solution" nach Hank + 0,350 g Natriumbicarbonat
pro Liter; B) M-199-Aufrechterhaltungsmedium: Medium M-199 mit "Basal Salt Solution"
nach Hank + 1 g Natriumbicarbonat pro Liter; C) L-Glutaminlösung; 10 mg L-Glutamin
pro Liter der Lösung B; D) Lösung des Natriumsalzes der Brennztraubensäure; 5,5
mg des Natriumsalzes pro Liter der Lösung B; E) L-Thyroxinlösung; 12,5 µg L-Thyroxin
pro Liter der Lösung B; F) PZI-Vorgemisch, 10 Einheiten Protamin-Zink-Insulin pro
ml, hergestellt wie in Beispiel 4; G) D-Glukose: 20 %ige Lösung in 2-fach destilliertem
Wasser, bei 121 0C im Autoklaven 15 Minuten sterilisiert; H) Hühnerembryo-Fibroblasten-Suspension
im Medium M-199, 2,7 x 107 Zellen pro ml.
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Es wurden 3 Vorratszellsuspensionen hergestellt und in ca.
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930 ccm Glasflaschen wie folgt abgefüllt: Suspension Nr. 1: ("FCS";
Kalbfoetusserum als Medium) 2450 ml A mit 50 ml Kalbsfoetusserum und 60 ml H. Vor
dem Abfüllen wurde 15 Minuten gelinde gerührt.
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Suspension Nr. 2: ("PZI"; Protamin-Zink-Insulin-Medium) 2400 ml A;
18,75 ml G;42,5 ml C;12,5 ml D; 60,0 ml H sowie 33,3 ml F (PZI-Vorgemisch). Vorbfüllen
wurde 15 Minuten gelinde gerührt. Der Glukosezusatz führte zu einer Glukose-Endkonzentration
von etwa 0,25 Gew.-%.
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Suspension Nr. 3: ("PZIT"; PZI-Medium mit Thyroxin) 2400 ml A; 18,75
ml G; jeweils 12,5 ml C und D; 50,0 ml E; 60 ml H sowie 33,3 ml F. Vor dem Abfüllen
wurde 15 Minuten gelinde gerührt.
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Die Zellen wurden bei 370C inkubiert, bis eine zu 95 bis 100 % zusammenfließende
Zellschicht in jeder Flasche erhalten wurde, was in allen Fällen nach 24 Stunden
erreicht war. Flaschen mit der Suspension Nr. 1 wurden mit dem Virus nach 24 Stunden,
diejenigen mit der Suspension Nr. 2 und Nr. 3 nach 48 Stunden geimpft. Die Impfung
mit dem Virus wurde ausgeführt, indem man das Medium von der Zellschicht absaugte,
es durch 100 ml der Lösung B mit einem Gehalt an 105,4 TCID50 von aktivem, abgeschwächtem
Masern-Virus ersetzte und danach die Flaschen bei 32 0C inkubierte. Das Virus wurde
7 Tage später gewonnen, und eine zweite Ausbeute wurde aus den Flaschen der Gruppe
Nr. 1 und Nr.5 3 Tage nach der ersten Ausbeute gewonnen.
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Beispiel 6 Nach einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren
wurde das Masern-Virus in einer im FCS-, PZI- und PZIT-Medium gewachsenen Hühnerembryo-Fibroblast-Gewebekultur
vermehrt. Etwa zu 95 bis 100 % zusammenfließende Monoschichten wurden 48 Stunden
nach Inkubation bei 36,5 bis 37 0C erhalten. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Medien
durch Absaugen entfernt, und 100 ml des M-199-Aufrechterhaltungsmediums (Lösung
B des Beispiels 5) wurden zusammen mit dem Impf-Masern-Virus zugegeben. Die infizierten
Flaschen wurden bei 32°C inkubiert und hisichtlich cytopatischer Wirkungen und des
Virustiters beobachtet.
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Die Ergebnisse einer Reihe derartiger Verfahrensweisen sind nachfolgend
wiedergegeben. Verschiedene Flaschengruppen wurden mit verschiedenen Masernviren
infiziert, welche als 1 und S2 in der Tabelle angegeben sind. Der Titer wird ausgedrückt
als der gemeine Logarithmus 10 der Anzahl von Gewebekulturinfektionsdosen (TCID50)
pro 0,5 ml.
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Die cytopatische Wirkung "CPE" wird numerisch mittels einer von 0-
(keine sichtbare Wirkung) bis 4- (Zerstörung der Zellschicht) reichenden Skala angegeben.
Wo zwei Bewertungen für den gleichen Tag angegeben sind, wurden diese etwa im Abstand
von 7 Stunden vorgenommen.
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Tabelle zu Beispiel 6 Wachstums- Impf- 5 Tage 6 Tage 7 Tage 8 Tage
9 Tage 10 Tage 11 Tage 12 Tage medium virus FCS S1 Titer 4,6 4,5 4,7 5,0 5,0 4,7
4,5 4,5 CPE 1- 1- 1- 1- 1- 2+ 3 4 FCS S2 Titer 3,8 4,3 4,5 5,5 5,1 4,7 4,6 3,8 CPE
0 1- 1- 1 1 2 3 4 PZI S1 Titer 4,7 5,4 5,6 5,9 6,4 6,3 6,4 CPE 1- 1 2 2 3 3 4 PZI
S2 Titer 3,6 4,2 4,3 5,2 5,5 5,5 5,5 5,2 5,4 5,8 5,6 5,7 CPE 0 1- 1- 1- 1- 1 2-
2 3 3 3 4 PZIT S1 Titer 4,8 5,4 5,5 5,7 CPE 1 2 3 3+ PZIT S2 Titer 3,8 4,3 4,4 5,4
5,2 5,8 5,7 CPE 0 1- 1- 1-2 2 3 4
Aus der obigen Tabelle ergibt
sich, daß die Virus-Impfstofftiter, welche mit Zellen, die in dem serumfreien PZI-und
PZIT-Medium gewachsen waren, erhalten wurden, durchschnittlich etwa 1 Logarithmus
(d.h. um das 10-fache) höher sind als die im FCS-Medium erhaltenen Titer. Die Tabelle
zeigt ferner, daß die unter Verwendung der serumfreien Medien erhaltenen maximalen
Impfstofftiter in der Regel gleich den aus dem FCS-System erhaltenen Titern oder
größer als diese sind, und daß die maximalen Titer in der Regel länger aufrecht
erhalten werden als in dem FCS-Zellsystem.
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Beispiel 7 Unter Verwendung von ühnerembryo-Fibroblasten von 9 bis
11 Tage alten Embryos, welche bei 370C 30 Minuten mit Trypsin behandelt worden waren,
des PZI-Mediums und des Impfvirus 2 des Beispiels 6 und eines dritten Impfvirus
S3 wurde das Verfahren gemäß Beispiel 6 wiederholt. Mit dem Impfvirus S2 und den
Zellen von 11 Tage alten Embryos wurde ein Virustiter von 4,3 am 6. Tag und täglich
bis zum 10. Tag Titer von 4,2 bis 4,9 erreicht. Mit dem Impfvirus S3 wurden vom
6. bis zum 10. Tag Titer zwischen 4,2 und 4,6 erhalten.
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Bei Zellen von 9 Tage alten Embryos wurde mit dem Impfvirus ein Titer
von 4,4 am 6. Tag und Titer von 4,8 bis 5,3 an den Tagen 7 bis 9 erhalten. Am Tag
12 wurde ein Titer von 5,2 erhalten; mit ähnlichen Zellen und dem Impfvirus 53 wurden
Titer von 4,6 nach 5 Tagen erhalten, welche am 6.
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und 7. Tag auf 5,2 bis 5,9 und am 8. Tag, wenn eine weitere Kultivierung
beendet wurde, auf 6,0 anstiegen.
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Ähnliche Ergebnisse können unter Verwendung von aktivem Mumps-Virus
(Stamm Jeryl Lynn) anstelle von Masern-Virus erhalten werden (vgl. US.PS 3 555 149).
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Beispiel 8 Unter Verwendung des zuvor beschriebenen PZI-Mediums wurde
das Masern-Virus, Stamm Schwarz, in einer CEC-Gewebekultur vermehrt. Es wurden 3
Gruppen unter Verwendung von 3 Impfvirusgruppen benutztvund in verschiedenen Verfahrensstufen
wurden Proben zur Insulin-Analyse nach der Methode mit radioaktiven Isotropen entnommen.
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Es erwies sich, daß das Medium 199, das chemisch definierte Aufrechtserhaltungsmedium,
allein oder geimpft mit Hühnerembryozellen, und die Impfviren alle weniger als 4
Mikroeinheiten Insulin pro ml enthielten. Das PZI enthaltende Medium M-l99, geimpft
mit Hühnerembryozellen, enthielt etwa 0,15 Einheiten pro ml; nach 48 Stunden Inkubation
fiel dieser Wert auf etwa 0,07 Einheiten pro ml. Im Vergleich hierzu wurde gefunden,
daß 2 Ansätze von Rinderfoetusserum 5,3 bzw. 7,3 Mikroeinheiten pro ml enthielten,
während ein chemisch undefiniertes Medium M-l99 + 2 % Kalbsserum weniger als 4 Mikroeinheiten
pro ml enthielt.
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Die Impfstoffe von der Endgewinnung enthielten etwa 374, 95 und 357
Mikroeinheiten Insulin pro ml (Durchschnitt zweier Bestimmungen). Eine typische
Dos bei den erhaltenen Titern ist 0,5 ml.
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Beispiel 9 In diesem Beispiel wurde die Erfindung zur Erzeugung von
Rubella-Virus in Entenembryos gemäß einem ähnlichen Verfahren herangezogen (vgl.
US-PS 3 401 084).
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Es wurden 10 Tage alte Entenembryos zubereitet, 50 Minuten bei 3700
mit Trypsin behandelt, zentrifugiert, gewaschen und im Medium M-l99 zusammen mit
0,007 % NaHCO3 suspendiert.
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Unter Verwendung von 901 ml gleichem M-199, 13 ml eines PZI-Vorgemisches
gemäß Beispiel 4 und 61 ml der Zellsuspension wurde ein PZI-Medium hergestellt.
Die Suspension aus den Zellen und dem PZI-Medium wurden in Gewebekulturflaschen
aus Glas mit einem Inhalt von ca, 430 ccm und 75 cm² Gewebekulturgefäße aus Polystyrol
abgefüllt und bei 37°C inkubiert.
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Mindestens 75 % der Zellen hafteten innerhalb etwa 3 Stunden an der
Gefäßoberfläche. Im Gegensatz hierzu zeigte eine Kontrollinkubation in dem Medium
M-l99 + 2 % Kalbsserum zu dieser Zeit lediglich eine 25 %ige Haftung.
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Nach 18 stündiger Inkubation zeigten die Entenembryozellen in dem
PZI-Medium eine 80 bis 90 %iges- Zusammenfließen mit einer sehr einheitlichen Verteilung,
und die Zellen in der Kontrolle aus Kalbsserum als Medium zeigten eine solche von
60 bis 70 %. 42 Stunden nach Kultivierung zeigten die Entenembryozellen in dem PZI-Medium
ein 100 %iges Zusammenfließen.
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Das Medium wurde dekantiert und durch das Medium M-199 mit der "Basal
Salt Solution" nach Earle sowie 2200 mg NaHCO3 pro 1 vom pH-Wert 7,6 ersetzt. 5
Flaschen wurden mit einem im Handel erhältlichen Rubella-Virus-Impfstoff (MeruvaP
der Firma Merck Sharp & Dohme) (an Entenzellen akkomodierter Stamm HPV-77, Durchgang
5) infiziert, während 4 Flaschen mit Rubella-Virus-Impfstoff vom Stamm Cendehill
(normalerweise in einer Kaninchennieren-Gewebekultur vermehrt) geimpft wurden.
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Die Virusimpfung wurde durchgeführt, indem man den aus gefriergetrocknetem
Entenembryovirus bestehenden Inhalt von 5 Einzeldosen-Ampullen in 2,5 ml Aufrechterhaltungsmedium
wiederherstellte und das erhaltene Gemisch mit 500 ml des Aufrechterhaltungsmediums
vermischte. 100 ml der Virusverdünnung wurde pro Flasche verwendet. Die Impfung
mit dem Cendehill-Virus wurde in ähnlicher Weise durchgeführt. Das Virus wurde täglich
vom 4. bis zum 8. Tag gewonnen.
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Beispiel 10 Das erfindungsgemäße Medium wurde für eine Kaninchennieren-Gewebekultur,
die zur Erzeugung des Cendehill-Stamms aktiven Rubella-Virus-Impfstoffs verwendet
wird, herangezogen. 21 Tage alten Kaninchen wurden die Nieren aseptisch entnommen,
gespült, in M-l99-Aufrechterhaltungsmedium gewaschen, mit Trypsin behandelt und
zentrifugiert. Die zentrifugierten Zellen wurden zweimal im Medium M-199 gewaschen
und in diesem Medium nach herkömmlichen Verfahren suspenfliert.
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2 Die Zellen wurden in 75 cm Polystyrolflaschen zur Zellkultivierung
bei einer Konzentration von etwa 1,6 x 107 Zellen pro Flasche mit dem Medium M-199,
ergänzt durch Hank's BSS und 1 g NaHC03 pro 1, mit Glukose bis zu einer Endkonzentration
von 2,5 g/l, 28 sg Natriumsalz der Brenztraubensäure und 150 >ig L-Glutamin pro
ml kultiviert. Die Zellen-Impfsuspension im Medium hatte eine Endkonzentration von
5 x 105 Zellen pro ml. Ein gemäß Beispiel 4 hergestelltes PZI-Vorgemisch wurde zugegeben,
wobei eine PZI-Endkonzentration von 0,13 Einheiten pro ml erhalten wurde.
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Die Zellen und das Medium wurden bei 370C 4Tage inkubiert, wonach
das PZI-Medium durch das identische Aufrechterhaltungsmedium, ohne Zusatz von PZI,
ausgetauscht wurde. Das Aufrechterhaltungsmedium
wurde danach
alle 2 Tage ersetzt. Am 5. Tag war ein völliges Zusammenfließen erreicht, und die
in dem PZI-Medium gewachsenen Zellen behielten während der ganzen 14 Tage der Zellkultivierung
ein reines Aussehen von Epithelen.
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Wenn man Kaninchennierenzellen in der zuvor beschriebenen Gewebekultur
wachsen läßt, das PZI-Medium nach Erhalt eines praktisch vollständigen Zusammenfließens
(etwa am 4. bis zum 7. Tag) dekantiert, die Zellen mit aktivem, abgeschwächtem Rubella-Virus
(Stamm Cendehill) impft, Aufrechterhaltungsmedium als Ersatz zugibt und 3 bis 5
Tage, bis eine gute Virusproliferation auftritt, inkubiert, werden gute Ausbeuten
an Rubella-Virus-Impfstoff erhalten.
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Beispiel 11 Im wesentlichen nach den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen
Verfahren wurden HUhnerembryozellen)das Medium M-199 und ein PZI-Vorgemisch zubereitet.
Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 6 x 105 Zellen pro ml in dem Medium
M-l99 kultiviert, welches eine PZI-Endkonzentration von 0,133 Einheiten/ml enthielt.
In jede einer Reihe von ca. 430 ccm Glasflaschen wurden 75 ml der so erhaltenen
Zellsuspension abgefüllt und 48 bis 72 Stunden bei 370C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt
waren das Zusammenfließvermögen und die Morphologie hervorragend. Die Flaschen wurden
sodann mit aktivem, abgeschwächtem Mumps-Virus (Stamm Jeryl Lynn) geimpft, wobei
2 ml pro Flasche einer 250fachen Verdünnung in dem Medium M-l99 des Impfvirus mit
einem Titer von,4iQ6 TCID50 pro 0,5 -mI verwendet wurden. In einer Reihe von Flaschen
wurde die Virusimpfung direkt nach Entfernung des PZI-Mediums durchgeführt, und
in einer zweiten Reihe
nach Entfernung des PZI-Mediums und nachfolgendem
Spülen der Zellenmonoschicht einmal mit etwa 75 ml Medium M-199 (ohne PZI). Die
infizierten Zellen wurdenl37°C mit frischem Medium M-l99 (ohne PZI) inkubiert. Am
4. Tag nach der Impfung mit dem Virus konnten cytopatologische Wirkungen einer Mumps-Virus-Infektion
festgestellt werden. Das Virus wurde am 4. Tag und zweimal täglich gewonnen,bis
die cytopatologische Wirkung einen Wert von 4+ (einer von 0 bis 4+ reichenden Skala)
erreicht hatte, indem man das Kulturmedium sammelte und es durch frisches Medium
M-199 ersetzte. Die Titer lagen im Bereich von 105,3 bis 106,0 TCID50 pro 0,5 ml.
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Zwischen den nach Entfernung des PZI-Mediums gespülten Zellen und
denjenigen, welche ohne Waschen und Abspülen geimpft worden waren, konnte kein signifikanter
Unterschied festgestellt werden. Wiederholte Verfahren führten zu ähnlichen Ergebnissen,
wobei 3 bis 6 Ausbeuten pro Flasche erhalten wurden.
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Beispiel 12 Unter Verwendung von abgeschwächten Masern-Viren wurde
ein Verfahren durchgefGhrt, welches demjenigen des Beispiels 11 ähnlich war. Ähnlich
hervorragende Ergebnisse wurden in einer Reihe unter Anwendung einer Waschstufe
vor dem Impfen mit dem Virus sowie in einer Reihe ohneWaschstufe erhalten.
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Beispiel 13 Frische Nieren von afrikanischen Affen wurden bei 37 0C
4 Stunden mit Trypsin behandelt und bei einer Konzentration von 3,2 x 105 Zellen
pro ml in dem Medium M-l99 mit 0,13 Einheiten PZI pro ml kultiviert. Das zur Anwendung
gelangende Verfahren war dem in den Beispielen -11 und 12 beschriebenen
Verfahren
ähnlich. 20 Minuten nach Ab füllung in die Flaschen ergab eine durchgeführte mikroskopische
Prüfung, daß zumindest 50 % der Zellen an dem Glas anhafteten. Die Inkubation wurde
bei 37 0C durchgeführt; da primäre Affennierenzellen bekannterweise in Gewebekulturen
wurde nur schwierig wachsen,zdas Medium M-l99 mit PZI durch frisches Medium M-199
und PZI nach 48 Stunden, und abermals 3 Tage später ersetzt. Nach 8 Tagen Inkubation
wurde ein 95 %iges Zusammenfließen beobachtet; zu diesem Zeitpunkt wurde das PZI
enthaltende Medium entfernt. Die Zellen wurden sodann mit aktivem, abgeschwächtem
Poliovirus, Poliovirus (2), und zwar 0,4 ml Impfvirus (lOOfache Verdünnung) pro
Flasche geimpft. Die Zellen und das Virus wurden sodann mit 100 ml des Mediums M-199
(ohne PZI) zur Virusvermehrung und -gewinnung inkubiert. Nach 48 Stunden wurden
Titer von 1,75 bis 1,8 x 105 plaRatildende Einheiten (PFU") pro ml erhalten, welche
nach 72stündiger Inkubation auf 2,3 bis 2,4 x 105 PFU/ml anstiegen.
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Beispiel 14 Nach Verfahren, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind,
ließ man zusammenfließende Monoschichten von Hühnerembryozellen im Medium M-l99
mit PZI 3 Tage lang wachsen. Das Medium M-199 mit dem PZI-Zusatz wurde sodann durch
M-l99 (100 ml pro Flasche) versetzt, und pro Flasche mit 1000 TCID50 vesicularem
Stomatitis-Virus ("VSV") geimpft. Nach 20-stündiger weiteren Inkubation bei 37 0C
konnte durch Beobachtung cytopatologischer Wirkungen eine ausgiebige Virus-Proliferation
festgestellt werden. Der CPE-Wert betrug (auf einer von 0 bis 4+ reichenden Skala)
zu dieser Zeit 4.
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Unter ähnlichen Bedingungen kultivierte ellen, welche mit VSV infiziert
wurden, wobei anstelle des Mediums M-l99 mit PZI-Zusatz das Medium M-l99 + 2 % Kalbsserum
verwendet wurde,
zeigten einen CPE-Wert von 3. Die Titer von VSV
nach 20 Stunden in im Medium M-199 mit PZI gewachsenen Zellen betrugen 1,36 bis
2,36 x 106 PFU/ml.
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Beispiele für andere brauchbare Anwendungen der Erfindung sind die
Produktion des Tollwut-Virus in in Gewebekultur gewachsenen Hühnerembryozellen,
wobei ein serumfreies Medium (vorzugsweise M-l99) mit PZI verwendet wird (vgl.
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US-PS 3 255 080), die Gewinnung von infektiösem Hundehepatitis-Virus
in Schweinenieren- oder Hundenieren-Gewebekulturen (vgl. US-PSn 2 915 436 und 3
000 788), die Gewinnung von infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus, Rinder-Diarrhos-Virus
und Parainfluenza-(PI-3)-Virus in einer Rindernieren-Gewebekultur (vgl. US-PSn 2
941 925 und 2 934 473), die Gewinnung von Influenza-Virus in einer Hühnerembryo-Gewebekultur
sowie die Gewinnung von Tollwut-Virus in einer Rindernieren-Gewebekultur (vgl. US-PS
3 585 266).